磁性粒子を用いた遺伝子導入方法
【課題】新規な遺伝子導入方法の提供
【解決手段】遺伝子導入ベクター（２）と金磁性粒子（１）との複合体（３）を用いて標的細胞（６）に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、磁場（８）を印加して前記複合体（３）を前記標的細胞（６）の表面に誘導する工程を含む遺伝子導入方法である。前記遺伝子導入ベクター（２）は、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、例えば、ウイルスベクターである。前記金磁性粒子（１）は、磁性粒子（５）の表面に金粒子（４）が接合し又は担持された粒子である。
【解決手段】遺伝子導入ベクター（２）と金磁性粒子（１）との複合体（３）を用いて標的細胞（６）に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、磁場（８）を印加して前記複合体（３）を前記標的細胞（６）の表面に誘導する工程を含む遺伝子導入方法である。前記遺伝子導入ベクター（２）は、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、例えば、ウイルスベクターである。前記金磁性粒子（１）は、磁性粒子（５）の表面に金粒子（４）が接合し又は担持された粒子である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子を用いた遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物などの細胞における遺伝子発現の調節機構と遺伝子産物であるタンパク質の機能解析は、現在の医薬学、生物学の中心テーマであり、それらの解析のためには動物細胞に目的遺伝子を導入する技術が不可欠である。遺伝子導入方法は、非ウイルスベクターを用いる物理化学的方法とウイルスベクターを用いる生物学的方法とに大別できる。
【０００３】
前記物理化学的方法としては、現在遺伝子導入方法の主流を占めている正電荷脂質（カチオニックリポソーム：ＣＬ）を用いた「リポフェクション法」があげられる。この方法は、負電荷を帯びたＤＮＡの周りに正電荷を帯びたＣＬを＋／−の静電的相互作用で結合させたＣＬ／ＤＮＡ複合体を利用する。このＣＬ／ＤＮＡ複合体がＣＬを介して負電荷を帯びた細胞表面に吸着され、食作用により細胞内に取り込まれることで遺伝子が導入され、最終的に遺伝子発現に至る。このリポフェクション法は、操作が簡便な上に比較的遺伝子導入効率がよいという利点がある。しかし一方で、血清存在下ではＣＬ／ＤＮＡ複合体が崩壊してしまうため、生物個体への適用が困難であるという問題点がある。
【０００４】
前記生物学的方法であるウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法は、細胞表面のウイルス受容体への吸着、細胞内への侵入といったウイルスの細胞内侵入機構を巧みに利用した方法であって、遺伝子発現効率が極めて高く、また、生体への遺伝子導入にも優れるという利点がある。現在では、細胞や動物個体レベルでの基礎研究を進める上で非常に強力なツールとして用いられている。しかし一方で、ウイルス受容体の発現が無い若しくは少ない細胞、又は、リンパ球、一部の悪性腫瘍及び幹細胞などの重要な標的細胞への遺伝子導入効率が悪いという問題点がある。
【０００５】
その他の遺伝子導入方法として、磁性粒子を利用した遺伝子導入方法が提案されている。この方法は、例えば、正電荷ポリマー又は正電荷化合物でコーティングした磁性粒子にＤＮＡ若しくはウイルスベクターを結合させて複合体を形成し、この複合体を磁力により細胞表面へ集積させて導入を行う方法である（非特許文献１、特許文献１、２）。
【０００６】
他方、前述のような正電荷ポリマー又は正電荷化合物が表面に結合した磁性粒子とは異なり、貴金属粒子が表面に結合した磁性粒子も別途開示されている（特許文献３）。
【非特許文献１】Ｐｌａｎｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．７３７−７４７，２００３
【特許文献１】特開２００４−８１０３９号公報
【特許文献２】特開２００４−１２９６０２号公報
【特許文献３】国際公開２００４／０８３１２４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の磁性粒子を用いた遺伝子導入方法においては、磁性粒子とＤＮＡ又は遺伝子導入ベクターとの結合は、例えば、磁性粒子の表面の正電荷ポリマーとＤＮＡとの結合のように、一般的に、＋／−の静電的相互作用による結合が利用されている。しかしながら、例えば、さまざまな環境下での遺伝子導入を達成するためには、前記静電的相互作用以外の力で磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを結合させた複合体を用いる遺伝子導入方法が存在することが好ましい。
【０００８】
そこで、本発明は、静電的相互作用以外の力で磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを結合させた複合体を用いる新規な遺伝子導入方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体を用いて標的細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、磁場を印加して前記複合体を前記標的細胞表面に誘導する工程を含み、前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者らは、磁性粒子を用いた遺伝子導入方法において静電的相互作用以外の力で磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを結合させる着想を得て鋭意研究を重ねた。その結果、表面に金粒子が結合された磁性粒子であれば、金原子と硫黄原子とのＡｕ−Ｓ結合を利用して前記磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを簡便、安全、安定に複合体化でき、この複合体を用いて遺伝子導入できることを見出し本発明に到達した。
【００１１】
本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入ベクターと結合した磁性粒子を磁力により容易に細胞表面に集積させることができるから、好ましくは、遺伝子導入効率を向上できる。また、本発明の遺伝子導入方法であれば、受容体の欠損などの理由によりウイルスベクター単独では遺伝子導入が困難な細胞に対しても、好ましくは、遺伝子導入が可能となる。さらに、本発明の遺伝子導入方法は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏへの適用が可能である。このように、本発明の遺伝子導入方法は、例えば、前述したリポフェクション法やウイルスベクター法の欠点を補填できる遺伝子導入方法である。
【００１２】
また、静電的相互作用を利用した従来の磁性粒子を用いた遺伝子導入方法では、磁性粒子をコーティングしている正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン；ＰＥＩなど）が、細胞や生体へ傷害性や毒性を示すことが懸念される。それに対し、本発明の遺伝子導入方法は、前述のような正電荷ポリマーを使用せず、静電的相互作用に替えてより安定なＡｕ−Ｓ結合を利用しているため、好ましくは、遺伝子導入の安全性を向上できる。
【００１３】
さらに、本発明の遺伝子導入方法は、金磁性粒子と遺伝子導入ベクターとの複合体は、例えば、両者を混合するだけで形成でき、また、遺伝子導入のための磁場の印加時間も、例えば、短時間とすることができる。よって、本発明の遺伝子導入方法は、好ましくは、極めて簡便・迅速な操作で行うことができる方法である。
【００１４】
さらにまた、本発明の遺伝子導入方法は、好ましくは、硫黄原子を備えるすべての遺伝子導入ベクターに適用できるから、極めて汎用性に優れる。好ましくは、現在使用されているほとんどのウイルスベクターを、本発明の遺伝子導入方法に適用可能できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の遺伝子導入方法において、前記遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであることが好ましい。また、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１６】
本発明は、その他の態様において、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体の製造方法であって、前記遺伝子導入ベクターと前記金磁性粒子とを混合する工程を含み、前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子である前記複合体の製造方法である。本発明の複合体の製造方法において、前記遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであってよい。また、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１７】
本発明は、さらにその他の態様において、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体であるベクター／金磁性粒子複合体であって、前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子である複合体である。本発明のベクター／金磁性粒子複合体において、前記遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであってよい。また、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１８】
本発明は、さらにその他の態様において、本発明の遺伝子導入方法を行うためのキットであって、金磁性粒子を含むキットである。本発明の遺伝子導入キットにおいて、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１９】
本発明は、さらにその他の態様において、ウイルスベクター導入試薬であって、金磁性粒子を含む試薬である。本発明のウイルスベクター導入試薬において、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００２０】
本発明において「遺伝子導入ベクター」とは、ベクター表面に硫黄原子を有するものであれば特に制限されない。すなわち、本発明における遺伝子導入ベクターには、金磁性粒子の金原子とＡｕ−Ｓ結合できる硫黄原子が存在することが必要である。前記遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ウイルスベクターがあげられる。ウイルスベクターのほとんどの外皮タンパク質にはシステイン又はメチオニンが含まれるため、ほとんどのウイルスベクターを本発明の遺伝子導入ベクターとして使用できる。本発明において「ウイルスベクター」とは、特に制限されず、ウイルスの細胞へ感染する機構や細胞に維持される機構を利用した遺伝子導入用のベクターをいい、公知の任意のウイルスベクターを含む。前記ウイルスベクターとしては、これらに制限されないが、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどがあげられる。本発明において遺伝子導入ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。例えば、プラスミドベクターなどであっても、金磁性粒子の金原子とＡｕ−Ｓ結合できる硫黄原子が修飾されていれば使用できる。
【００２１】
本発明において「Ａｕ−Ｓ結合」とは、金（Ａｕ）原子と硫黄（Ｓ）原子との間に生じる結合力による直接的な結合をいう。Ａｕ−Ｓ結合は、安定で強固な結合を好ましく提供できる。また、本発明において「遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体」とは、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子とがＡｕ−Ｓ結合により結合したものをいう。
【００２２】
本発明において「金磁性粒子」とは、磁性粒子の表面に金粒子が接合若しくは結合し又は担持された粒子をいう。前記磁性粒子は、特に制限されないが、例えば、酸化鉄の粒子などがあげられる。前記酸化鉄は、例えば、磁鉱、マグヘマイト、フェライトなどのＦｅ2Ｏ3を主成分とする磁性酸化物、γ‐Ｆｅ2Ｏ3、及び、Ｆｅ3Ｏ4などを含む。前記磁性粒子は、また、コバルト、ニッケルなどの酸化物、これらの金属又はこれらの金属と鉄との金属間化合物（例えば、ＣｏＰｔ，ＦｅＰｔ）の酸化物、これらの金属の合金（例えば、Ｃｏ／Ｎｉ、Ｃｏ／Ｆｅ、Ｎｉ／Ｆｅなどの二元合金、Ｃｏ／Ｆｅ／Ｎｉなどの三元合金）の酸化物であってもよい。前記磁性粒子のサイズは、細胞への遺伝子導入に使用できる範囲であれば特に制限されず、例えば、ナノ粒子サイズである。前記磁性粒子の平均粒子径としては、例えば１μｍ以下であって、好ましくは１ｎｍ〜１μｍであり、より好ましくは１〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは５〜２００ｎｍである。前記磁性粒子の調製方法は、特に制限されず公知の方法で調製できる。例えば、ＰＶＳ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法などがあげられる。また、前記磁性粒子は、市販品を使用することもできる。前記金磁性粒子における金粒子のサイズとしては、特に制限されないが、例えば平均粒径が１μｍ以下であって、好ましくは１〜５００ｎｍであり、より好ましくは、１〜２００ｎｍである。前記平均粒径の測定方法は特に限定されず、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による写真撮影を利用する方法であってもよい。
【００２３】
本発明において「金磁性粒子」は、特に制限されずさまざまな公知の方法で製造できるが、その中でもＷＯ２００４／０８３１２４に開示される方法で製造されることが好ましい。製造が容易であり、また、生体への安全性が高いと考えられるからである。具体的には、金イオン若しくは金錯体を含有する液に磁性粒子を分散させ又は磁性粒子を与える金属イオンを添加し、次いで、前記液に超音波若しくは電離放射線を照射することで金磁性粒子を製造する方法である。前記金イオン含有液としては、例えば、０．１〜１０ｍＭのＨＡｕＣｌ4の水溶液又はアルコール溶液があげられる。この金イオン含有液に、前述の磁性粒子を例えば０．１〜１０重量％の濃度で添加して分散させ、超音波若しくは電離放射線を照射する。前記超音波照射としては、例えば、周波数２００ｋＨｚ、出力２００Ｗで、１〜３００分間照射することがあげられる。前記電離放射線照射としては、例えば、コバルト６０γ線源を用いて、線量率約３ｋＧｙ／ｈで１〜１８時間照射することがあげられる。前記金磁性粒子における金粒子のサイズは、従来公知の方法で制御できる。例えば、前記金イオン濃度を高くすれば、前記金粒子の粒径を大きくでき、また、前記金イオン濃度を低くすれば、前記金粒子の粒径を小さくできる（例えば、［Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉ，Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１２，Ｉｓｓｕｅ３，２００５，ｐ１９１−１９５］参照）。さらに、共存させるポリマーの濃度や、放射線の線量率によっても前記金粒子の大きさを調整できる。
【００２４】
本発明において「標的細胞」とは、特に制限されず、任意の細胞であってよい。例えば、生体の器官又は組織の細胞、及び、各種培養細胞などが標的細胞として含まれうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの標的細胞の場合、前記標的細胞としては、特に制限されず、例えば、接着性細胞でも浮遊細胞でも使用できる。本発明において標的細胞に導入される「遺伝子」とは、特に制限されず、例えば、任意のＤＮＡ又はＲＮＡの配列であって、例えば、タンパク質又は機能性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）を発現可能な配列などがあげられる。
【００２５】
次に、遺伝子導入ベクターとしてウイルスベクターを使用する本発明の遺伝子導入方法の一態様を図１とともに説明する。
【００２６】
まず、金磁性粒子１と所望の発現させたい遺伝子を組み込んだウイルスベクター２との複合体３を準備する。前記金磁性粒子１は、金粒子４が磁性粒子５の表面に接合若しくは結合し又は担持された粒子である。前記金磁性粒子１は、上述の通り、公知の方法によって調製可能である。また、前記ウイルスベクターは２、公知の方法によって調製可能であり、あるいは、市販のキットを用いて調製可能である。前記複合体３は、前記金磁性粒子１と前記ウイルスベクター２とを混合するだけで形成できる。例えば、前記金磁性粒子１の分散液に前記ウイルスベクター２を含む液を添加して撹拌して混合するだけでよい。
【００２７】
前記撹拌又は混合の温度としては特に制限されないが、例えば４〜３７℃であって、好ましくは４〜１６℃である。前記撹拌又は混合の時間としては特に制限されないが、例えば１〜６０分であって、好ましくは５〜１５分である。また、前記金磁性粒子と前記ウイルスベクターとの混合比は特に制限されないが、例えば１μｇ／ｍｌの前記金磁性粒子あたり１〜５０個の前記ウイルスベクターであって、好ましくは１〜５個である。前記複合体３の調製に用いるバッファーは特に制限されず、従来公知のウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法で用いるものを使用できる。
【００２８】
次に、調製した前記複合体３を、標的細胞６の培養液７中に添加し、磁場８を印加し、前記複合体３を前記標的細胞６の表面に誘導して集積させる。前記複合体３の添加量としては、特に制限されないが、例えば、最終添加濃度で、１００〜１００００μｇ／ｍｌであって、好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍｌであって、より好ましくは１００〜１０００μｇ／ｍｌである。印加する磁場８の強さとしては特に制限されないが、前記複合体３を前記細胞表面に集積できる程度であればよく、例えば、永久磁石などを使用して印加できる。前記磁場８を発生させる磁石としては、特に制限されないが、例えば、表面磁束密度が５０〜２０００ｍＴ、好ましくは１００〜１０００ｍＴ、より好ましくは２００〜８００ｍＴの磁石を使用できる。前記磁場８の印加時間としては、例えば、例えば５分〜２４時間であって、好ましくは５〜１２０分であって、より好ましくは５〜３０分である。このようにして、前記ウイルスベクター２に組み込まれた遺伝子が前記標的細胞６へ導入される。
【００２９】
本発明の遺伝子導入方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのみならず、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子導入に使用できる。したがって、本発明はその他の態様として、遺伝子治療方法であって、本発明の遺伝子導入方法で遺伝子導入を行う工程を含む遺伝子治療方法を提供しうる。
【００３０】
さらにその他の態様として、本発明は、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体であるベクター／金磁性粒子複合体を提供する。前記ベクター／金磁性粒子複合体は、上述した本発明の遺伝子導入方法に使用することができる。前記ベクター／金磁性粒子複合体は、上述のとおり、前記遺伝子導入ベクターと前記金磁性粒子とを混合するだけで製造することができる。したがって、さらにその他の態様として、本発明は、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体の製造方法を提供する。
【００３１】
また、さらにその他の態様として、本発明は、本発明の遺伝子導入方法を行うための遺伝子導入キットであって、金磁性粒子を含む遺伝子導入キットを提供する。本発明の遺伝子導入キットは、さらに、本発明の遺伝子導入方法を説明する取扱説明書を含むことが好ましい。また、本発明の遺伝子導入キットは、遺伝子導入ベクター又は遺伝子導入ベクターを調製するための試薬を含んでもよい。
【００３２】
また、上述したとおり、前記金磁性粒子とウイルスベクターとを組み合わせることで、ウイルスベクター単独の遺伝子導入よりも遺伝子効率を向上できる。したがって、さらにその他の態様として、本発明は、ウイルスベクター導入試薬であって、金磁性粒子を含む試薬を提供する。本発明のウイルスベクター導入試薬であれば、ウイルスベクターと混合するだけで前記ベクター／金磁性粒子複合体を形成でき、本発明の遺伝子導入方法により遺伝子導入効率を向上させることができる。
【００３３】
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００３４】
金磁性粒子の調製
磁性粒子として、ＰＶＳ法により製造された市販品Ｆｅ2Ｏ3ナノ粒子（登録商標：ＮａｎｏＴｅｋ、Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ，Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、平均粒径２３ｎｍ）を使用した。１重量％のポリビニルアルコール水溶液５０ｍｌに、磁性粒子を５ｍｇ、ＨＡｕＣｌ4を８．６ｍｇ（Ａｕ重量で５ｍｇ）、２−プロパノールを０．５ｍｌ添加し、前記磁性粒子の分散液を調製した。この分散液をガラス製バイアルビン（容量７０ｍｌ）に封入後、コバルト６０γ線源（約７０００キュリー）を用いて線量率約３ｋＧｙ／ｈで撹拌しながら室温で３時間γ線照射した。次に、前記ガラス製バイアルビンの外部から直径３０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱磁石（表面磁束密度：４４５ｍＴ）により磁場を印加し２４時間静置した。その後、前記バイアルビンの上清を除去したのち、残部に水５０ｍｌを加えて金磁性粒子を分散させた。これに前記円柱磁石を用いて再度磁場を印加し、２４時間静置し、上清を除去した後、残部に水５ｍｌを加えて金磁性粒子の分散液とした。
【００３５】
ウイルスベクターと金磁性粒子との複合体の形成
レポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）を調製し、このＡｄ−ＧＦＰ約２００００個と前記金磁性粒子１００μｇとを混合し、Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体（１００μｇ／ｍｌ）を得た。
【００３６】
遺伝子導入
標的細胞としてＢ１６ＢＬ６細胞を使用した。このＢ１６ＢＬ６細胞は、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入効率が低いことが知られている細胞である。このＢ１６ＢＬ６細胞に、前記Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体を最終濃度が１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、直径３０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱磁石（表面磁束密度：４４５ｍＴ）を用いて２４時間磁場を印加して遺伝子導入を行った。
【００３７】
その結果を図２及び図３に示す。図２は、同図に示す条件で遺伝子を導入した細胞の蛍光顕微鏡写真の一例を示す。図３は、ＧＦＰの蛍光強度、すなわち、遺伝子発現効率を定量した結果の一例である。これらの図に示すとおり、金磁性粒子を使用しないＡｄ−ＧＦＰ単独の場合には、磁力の有無に関らずほとんどＧＦＰの発現を導入できなかった。また、前記Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体の濃度が１０μｇ／ｍｌを添加した場合であっても磁場を印加しない場合には、遺伝子発現の効率はウイルスベクター単独と同程度であった。それに対し、前記複合体に磁場を印加すると、遺伝子発現効率が向上した。前記Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体の濃度が１００μｇ／ｍｌの場合であっても、磁場を印加することでさらに遺伝子発現効率が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上説明したとおり、本発明によれば、例えば、ウイルスベクターを簡便かつ安全に導入できるから、例えば、個体レベルへの応用も可能であり、例えば、遺伝子機能解析や遺伝子治療の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の遺伝子導入方法を説明する概略図である。
【図２】図２は、遺伝子導入した結果の一例を示す写真である。
【図３】図３は、遺伝子導入した結果の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４０】
１・・・金磁性粒子
２・・・ウイルスベクター
３・・・ウイルスベクター／金磁性粒子複合体
４・・・金粒子
５・・・磁性粒子
６・・・細胞
７・・・培養液
８・・・磁場
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子を用いた遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物などの細胞における遺伝子発現の調節機構と遺伝子産物であるタンパク質の機能解析は、現在の医薬学、生物学の中心テーマであり、それらの解析のためには動物細胞に目的遺伝子を導入する技術が不可欠である。遺伝子導入方法は、非ウイルスベクターを用いる物理化学的方法とウイルスベクターを用いる生物学的方法とに大別できる。
【０００３】
前記物理化学的方法としては、現在遺伝子導入方法の主流を占めている正電荷脂質（カチオニックリポソーム：ＣＬ）を用いた「リポフェクション法」があげられる。この方法は、負電荷を帯びたＤＮＡの周りに正電荷を帯びたＣＬを＋／−の静電的相互作用で結合させたＣＬ／ＤＮＡ複合体を利用する。このＣＬ／ＤＮＡ複合体がＣＬを介して負電荷を帯びた細胞表面に吸着され、食作用により細胞内に取り込まれることで遺伝子が導入され、最終的に遺伝子発現に至る。このリポフェクション法は、操作が簡便な上に比較的遺伝子導入効率がよいという利点がある。しかし一方で、血清存在下ではＣＬ／ＤＮＡ複合体が崩壊してしまうため、生物個体への適用が困難であるという問題点がある。
【０００４】
前記生物学的方法であるウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法は、細胞表面のウイルス受容体への吸着、細胞内への侵入といったウイルスの細胞内侵入機構を巧みに利用した方法であって、遺伝子発現効率が極めて高く、また、生体への遺伝子導入にも優れるという利点がある。現在では、細胞や動物個体レベルでの基礎研究を進める上で非常に強力なツールとして用いられている。しかし一方で、ウイルス受容体の発現が無い若しくは少ない細胞、又は、リンパ球、一部の悪性腫瘍及び幹細胞などの重要な標的細胞への遺伝子導入効率が悪いという問題点がある。
【０００５】
その他の遺伝子導入方法として、磁性粒子を利用した遺伝子導入方法が提案されている。この方法は、例えば、正電荷ポリマー又は正電荷化合物でコーティングした磁性粒子にＤＮＡ若しくはウイルスベクターを結合させて複合体を形成し、この複合体を磁力により細胞表面へ集積させて導入を行う方法である（非特許文献１、特許文献１、２）。
【０００６】
他方、前述のような正電荷ポリマー又は正電荷化合物が表面に結合した磁性粒子とは異なり、貴金属粒子が表面に結合した磁性粒子も別途開示されている（特許文献３）。
【非特許文献１】Ｐｌａｎｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．７３７−７４７，２００３
【特許文献１】特開２００４−８１０３９号公報
【特許文献２】特開２００４−１２９６０２号公報
【特許文献３】国際公開２００４／０８３１２４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の磁性粒子を用いた遺伝子導入方法においては、磁性粒子とＤＮＡ又は遺伝子導入ベクターとの結合は、例えば、磁性粒子の表面の正電荷ポリマーとＤＮＡとの結合のように、一般的に、＋／−の静電的相互作用による結合が利用されている。しかしながら、例えば、さまざまな環境下での遺伝子導入を達成するためには、前記静電的相互作用以外の力で磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを結合させた複合体を用いる遺伝子導入方法が存在することが好ましい。
【０００８】
そこで、本発明は、静電的相互作用以外の力で磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを結合させた複合体を用いる新規な遺伝子導入方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体を用いて標的細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、磁場を印加して前記複合体を前記標的細胞表面に誘導する工程を含み、前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者らは、磁性粒子を用いた遺伝子導入方法において静電的相互作用以外の力で磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを結合させる着想を得て鋭意研究を重ねた。その結果、表面に金粒子が結合された磁性粒子であれば、金原子と硫黄原子とのＡｕ−Ｓ結合を利用して前記磁性粒子と遺伝子導入ベクターとを簡便、安全、安定に複合体化でき、この複合体を用いて遺伝子導入できることを見出し本発明に到達した。
【００１１】
本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入ベクターと結合した磁性粒子を磁力により容易に細胞表面に集積させることができるから、好ましくは、遺伝子導入効率を向上できる。また、本発明の遺伝子導入方法であれば、受容体の欠損などの理由によりウイルスベクター単独では遺伝子導入が困難な細胞に対しても、好ましくは、遺伝子導入が可能となる。さらに、本発明の遺伝子導入方法は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏへの適用が可能である。このように、本発明の遺伝子導入方法は、例えば、前述したリポフェクション法やウイルスベクター法の欠点を補填できる遺伝子導入方法である。
【００１２】
また、静電的相互作用を利用した従来の磁性粒子を用いた遺伝子導入方法では、磁性粒子をコーティングしている正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン；ＰＥＩなど）が、細胞や生体へ傷害性や毒性を示すことが懸念される。それに対し、本発明の遺伝子導入方法は、前述のような正電荷ポリマーを使用せず、静電的相互作用に替えてより安定なＡｕ−Ｓ結合を利用しているため、好ましくは、遺伝子導入の安全性を向上できる。
【００１３】
さらに、本発明の遺伝子導入方法は、金磁性粒子と遺伝子導入ベクターとの複合体は、例えば、両者を混合するだけで形成でき、また、遺伝子導入のための磁場の印加時間も、例えば、短時間とすることができる。よって、本発明の遺伝子導入方法は、好ましくは、極めて簡便・迅速な操作で行うことができる方法である。
【００１４】
さらにまた、本発明の遺伝子導入方法は、好ましくは、硫黄原子を備えるすべての遺伝子導入ベクターに適用できるから、極めて汎用性に優れる。好ましくは、現在使用されているほとんどのウイルスベクターを、本発明の遺伝子導入方法に適用可能できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の遺伝子導入方法において、前記遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであることが好ましい。また、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１６】
本発明は、その他の態様において、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体の製造方法であって、前記遺伝子導入ベクターと前記金磁性粒子とを混合する工程を含み、前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子である前記複合体の製造方法である。本発明の複合体の製造方法において、前記遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであってよい。また、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１７】
本発明は、さらにその他の態様において、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体であるベクター／金磁性粒子複合体であって、前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子である複合体である。本発明のベクター／金磁性粒子複合体において、前記遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであってよい。また、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１８】
本発明は、さらにその他の態様において、本発明の遺伝子導入方法を行うためのキットであって、金磁性粒子を含むキットである。本発明の遺伝子導入キットにおいて、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００１９】
本発明は、さらにその他の態様において、ウイルスベクター導入試薬であって、金磁性粒子を含む試薬である。本発明のウイルスベクター導入試薬において、前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径は、１〜５００ｎｍであることが好ましい。また、前記磁性粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【００２０】
本発明において「遺伝子導入ベクター」とは、ベクター表面に硫黄原子を有するものであれば特に制限されない。すなわち、本発明における遺伝子導入ベクターには、金磁性粒子の金原子とＡｕ−Ｓ結合できる硫黄原子が存在することが必要である。前記遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ウイルスベクターがあげられる。ウイルスベクターのほとんどの外皮タンパク質にはシステイン又はメチオニンが含まれるため、ほとんどのウイルスベクターを本発明の遺伝子導入ベクターとして使用できる。本発明において「ウイルスベクター」とは、特に制限されず、ウイルスの細胞へ感染する機構や細胞に維持される機構を利用した遺伝子導入用のベクターをいい、公知の任意のウイルスベクターを含む。前記ウイルスベクターとしては、これらに制限されないが、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどがあげられる。本発明において遺伝子導入ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。例えば、プラスミドベクターなどであっても、金磁性粒子の金原子とＡｕ−Ｓ結合できる硫黄原子が修飾されていれば使用できる。
【００２１】
本発明において「Ａｕ−Ｓ結合」とは、金（Ａｕ）原子と硫黄（Ｓ）原子との間に生じる結合力による直接的な結合をいう。Ａｕ−Ｓ結合は、安定で強固な結合を好ましく提供できる。また、本発明において「遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体」とは、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子とがＡｕ−Ｓ結合により結合したものをいう。
【００２２】
本発明において「金磁性粒子」とは、磁性粒子の表面に金粒子が接合若しくは結合し又は担持された粒子をいう。前記磁性粒子は、特に制限されないが、例えば、酸化鉄の粒子などがあげられる。前記酸化鉄は、例えば、磁鉱、マグヘマイト、フェライトなどのＦｅ2Ｏ3を主成分とする磁性酸化物、γ‐Ｆｅ2Ｏ3、及び、Ｆｅ3Ｏ4などを含む。前記磁性粒子は、また、コバルト、ニッケルなどの酸化物、これらの金属又はこれらの金属と鉄との金属間化合物（例えば、ＣｏＰｔ，ＦｅＰｔ）の酸化物、これらの金属の合金（例えば、Ｃｏ／Ｎｉ、Ｃｏ／Ｆｅ、Ｎｉ／Ｆｅなどの二元合金、Ｃｏ／Ｆｅ／Ｎｉなどの三元合金）の酸化物であってもよい。前記磁性粒子のサイズは、細胞への遺伝子導入に使用できる範囲であれば特に制限されず、例えば、ナノ粒子サイズである。前記磁性粒子の平均粒子径としては、例えば１μｍ以下であって、好ましくは１ｎｍ〜１μｍであり、より好ましくは１〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは５〜２００ｎｍである。前記磁性粒子の調製方法は、特に制限されず公知の方法で調製できる。例えば、ＰＶＳ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法などがあげられる。また、前記磁性粒子は、市販品を使用することもできる。前記金磁性粒子における金粒子のサイズとしては、特に制限されないが、例えば平均粒径が１μｍ以下であって、好ましくは１〜５００ｎｍであり、より好ましくは、１〜２００ｎｍである。前記平均粒径の測定方法は特に限定されず、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による写真撮影を利用する方法であってもよい。
【００２３】
本発明において「金磁性粒子」は、特に制限されずさまざまな公知の方法で製造できるが、その中でもＷＯ２００４／０８３１２４に開示される方法で製造されることが好ましい。製造が容易であり、また、生体への安全性が高いと考えられるからである。具体的には、金イオン若しくは金錯体を含有する液に磁性粒子を分散させ又は磁性粒子を与える金属イオンを添加し、次いで、前記液に超音波若しくは電離放射線を照射することで金磁性粒子を製造する方法である。前記金イオン含有液としては、例えば、０．１〜１０ｍＭのＨＡｕＣｌ4の水溶液又はアルコール溶液があげられる。この金イオン含有液に、前述の磁性粒子を例えば０．１〜１０重量％の濃度で添加して分散させ、超音波若しくは電離放射線を照射する。前記超音波照射としては、例えば、周波数２００ｋＨｚ、出力２００Ｗで、１〜３００分間照射することがあげられる。前記電離放射線照射としては、例えば、コバルト６０γ線源を用いて、線量率約３ｋＧｙ／ｈで１〜１８時間照射することがあげられる。前記金磁性粒子における金粒子のサイズは、従来公知の方法で制御できる。例えば、前記金イオン濃度を高くすれば、前記金粒子の粒径を大きくでき、また、前記金イオン濃度を低くすれば、前記金粒子の粒径を小さくできる（例えば、［Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉ，Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１２，Ｉｓｓｕｅ３，２００５，ｐ１９１−１９５］参照）。さらに、共存させるポリマーの濃度や、放射線の線量率によっても前記金粒子の大きさを調整できる。
【００２４】
本発明において「標的細胞」とは、特に制限されず、任意の細胞であってよい。例えば、生体の器官又は組織の細胞、及び、各種培養細胞などが標的細胞として含まれうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの標的細胞の場合、前記標的細胞としては、特に制限されず、例えば、接着性細胞でも浮遊細胞でも使用できる。本発明において標的細胞に導入される「遺伝子」とは、特に制限されず、例えば、任意のＤＮＡ又はＲＮＡの配列であって、例えば、タンパク質又は機能性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）を発現可能な配列などがあげられる。
【００２５】
次に、遺伝子導入ベクターとしてウイルスベクターを使用する本発明の遺伝子導入方法の一態様を図１とともに説明する。
【００２６】
まず、金磁性粒子１と所望の発現させたい遺伝子を組み込んだウイルスベクター２との複合体３を準備する。前記金磁性粒子１は、金粒子４が磁性粒子５の表面に接合若しくは結合し又は担持された粒子である。前記金磁性粒子１は、上述の通り、公知の方法によって調製可能である。また、前記ウイルスベクターは２、公知の方法によって調製可能であり、あるいは、市販のキットを用いて調製可能である。前記複合体３は、前記金磁性粒子１と前記ウイルスベクター２とを混合するだけで形成できる。例えば、前記金磁性粒子１の分散液に前記ウイルスベクター２を含む液を添加して撹拌して混合するだけでよい。
【００２７】
前記撹拌又は混合の温度としては特に制限されないが、例えば４〜３７℃であって、好ましくは４〜１６℃である。前記撹拌又は混合の時間としては特に制限されないが、例えば１〜６０分であって、好ましくは５〜１５分である。また、前記金磁性粒子と前記ウイルスベクターとの混合比は特に制限されないが、例えば１μｇ／ｍｌの前記金磁性粒子あたり１〜５０個の前記ウイルスベクターであって、好ましくは１〜５個である。前記複合体３の調製に用いるバッファーは特に制限されず、従来公知のウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法で用いるものを使用できる。
【００２８】
次に、調製した前記複合体３を、標的細胞６の培養液７中に添加し、磁場８を印加し、前記複合体３を前記標的細胞６の表面に誘導して集積させる。前記複合体３の添加量としては、特に制限されないが、例えば、最終添加濃度で、１００〜１００００μｇ／ｍｌであって、好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍｌであって、より好ましくは１００〜１０００μｇ／ｍｌである。印加する磁場８の強さとしては特に制限されないが、前記複合体３を前記細胞表面に集積できる程度であればよく、例えば、永久磁石などを使用して印加できる。前記磁場８を発生させる磁石としては、特に制限されないが、例えば、表面磁束密度が５０〜２０００ｍＴ、好ましくは１００〜１０００ｍＴ、より好ましくは２００〜８００ｍＴの磁石を使用できる。前記磁場８の印加時間としては、例えば、例えば５分〜２４時間であって、好ましくは５〜１２０分であって、より好ましくは５〜３０分である。このようにして、前記ウイルスベクター２に組み込まれた遺伝子が前記標的細胞６へ導入される。
【００２９】
本発明の遺伝子導入方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのみならず、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子導入に使用できる。したがって、本発明はその他の態様として、遺伝子治療方法であって、本発明の遺伝子導入方法で遺伝子導入を行う工程を含む遺伝子治療方法を提供しうる。
【００３０】
さらにその他の態様として、本発明は、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体であるベクター／金磁性粒子複合体を提供する。前記ベクター／金磁性粒子複合体は、上述した本発明の遺伝子導入方法に使用することができる。前記ベクター／金磁性粒子複合体は、上述のとおり、前記遺伝子導入ベクターと前記金磁性粒子とを混合するだけで製造することができる。したがって、さらにその他の態様として、本発明は、遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体の製造方法を提供する。
【００３１】
また、さらにその他の態様として、本発明は、本発明の遺伝子導入方法を行うための遺伝子導入キットであって、金磁性粒子を含む遺伝子導入キットを提供する。本発明の遺伝子導入キットは、さらに、本発明の遺伝子導入方法を説明する取扱説明書を含むことが好ましい。また、本発明の遺伝子導入キットは、遺伝子導入ベクター又は遺伝子導入ベクターを調製するための試薬を含んでもよい。
【００３２】
また、上述したとおり、前記金磁性粒子とウイルスベクターとを組み合わせることで、ウイルスベクター単独の遺伝子導入よりも遺伝子効率を向上できる。したがって、さらにその他の態様として、本発明は、ウイルスベクター導入試薬であって、金磁性粒子を含む試薬を提供する。本発明のウイルスベクター導入試薬であれば、ウイルスベクターと混合するだけで前記ベクター／金磁性粒子複合体を形成でき、本発明の遺伝子導入方法により遺伝子導入効率を向上させることができる。
【００３３】
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００３４】
金磁性粒子の調製
磁性粒子として、ＰＶＳ法により製造された市販品Ｆｅ2Ｏ3ナノ粒子（登録商標：ＮａｎｏＴｅｋ、Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ，Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、平均粒径２３ｎｍ）を使用した。１重量％のポリビニルアルコール水溶液５０ｍｌに、磁性粒子を５ｍｇ、ＨＡｕＣｌ4を８．６ｍｇ（Ａｕ重量で５ｍｇ）、２−プロパノールを０．５ｍｌ添加し、前記磁性粒子の分散液を調製した。この分散液をガラス製バイアルビン（容量７０ｍｌ）に封入後、コバルト６０γ線源（約７０００キュリー）を用いて線量率約３ｋＧｙ／ｈで撹拌しながら室温で３時間γ線照射した。次に、前記ガラス製バイアルビンの外部から直径３０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱磁石（表面磁束密度：４４５ｍＴ）により磁場を印加し２４時間静置した。その後、前記バイアルビンの上清を除去したのち、残部に水５０ｍｌを加えて金磁性粒子を分散させた。これに前記円柱磁石を用いて再度磁場を印加し、２４時間静置し、上清を除去した後、残部に水５ｍｌを加えて金磁性粒子の分散液とした。
【００３５】
ウイルスベクターと金磁性粒子との複合体の形成
レポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）を調製し、このＡｄ−ＧＦＰ約２００００個と前記金磁性粒子１００μｇとを混合し、Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体（１００μｇ／ｍｌ）を得た。
【００３６】
遺伝子導入
標的細胞としてＢ１６ＢＬ６細胞を使用した。このＢ１６ＢＬ６細胞は、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入効率が低いことが知られている細胞である。このＢ１６ＢＬ６細胞に、前記Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体を最終濃度が１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、直径３０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱磁石（表面磁束密度：４４５ｍＴ）を用いて２４時間磁場を印加して遺伝子導入を行った。
【００３７】
その結果を図２及び図３に示す。図２は、同図に示す条件で遺伝子を導入した細胞の蛍光顕微鏡写真の一例を示す。図３は、ＧＦＰの蛍光強度、すなわち、遺伝子発現効率を定量した結果の一例である。これらの図に示すとおり、金磁性粒子を使用しないＡｄ−ＧＦＰ単独の場合には、磁力の有無に関らずほとんどＧＦＰの発現を導入できなかった。また、前記Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体の濃度が１０μｇ／ｍｌを添加した場合であっても磁場を印加しない場合には、遺伝子発現の効率はウイルスベクター単独と同程度であった。それに対し、前記複合体に磁場を印加すると、遺伝子発現効率が向上した。前記Ａｄ−ＧＦＰ／金磁性粒子複合体の濃度が１００μｇ／ｍｌの場合であっても、磁場を印加することでさらに遺伝子発現効率が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上説明したとおり、本発明によれば、例えば、ウイルスベクターを簡便かつ安全に導入できるから、例えば、個体レベルへの応用も可能であり、例えば、遺伝子機能解析や遺伝子治療の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の遺伝子導入方法を説明する概略図である。
【図２】図２は、遺伝子導入した結果の一例を示す写真である。
【図３】図３は、遺伝子導入した結果の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４０】
１・・・金磁性粒子
２・・・ウイルスベクター
３・・・ウイルスベクター／金磁性粒子複合体
４・・・金粒子
５・・・磁性粒子
６・・・細胞
７・・・培養液
８・・・磁場
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体を用いて標的細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
磁場を印加して前記複合体を前記標的細胞表面に誘導する工程を含み、
前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、
前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
【請求項４】
遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体の製造方法であって、
前記遺伝子導入ベクターと前記金磁性粒子とを混合する工程を含み、
前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、
前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とするベクター／金磁性粒子の製造方法。
【請求項５】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体であるベクター／金磁性粒子複合体であって、
前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、
前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とするベクター／金磁性粒子複合体。
【請求項８】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求項７記載のベクター／金磁性粒子複合体。
【請求項９】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項７又は８に記載のベクター／金磁性粒子複合体。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子導入方法を行うためのキットであって、金磁性粒子を含むことを特徴とする遺伝子導入キット。
【請求項１１】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項１０記載の遺伝子導入キット。
【請求項１２】
ウイルスベクター導入試薬であって、金磁性粒子を含むことを特徴とするウイルスベクター導入試薬。
【請求項１３】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項１２記載のウイルスベクター導入試薬。
【請求項１】
遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体を用いて標的細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
磁場を印加して前記複合体を前記標的細胞表面に誘導する工程を含み、
前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、
前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
【請求項４】
遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体の製造方法であって、
前記遺伝子導入ベクターと前記金磁性粒子とを混合する工程を含み、
前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、
前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とするベクター／金磁性粒子の製造方法。
【請求項５】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
遺伝子導入ベクターと金磁性粒子との複合体であるベクター／金磁性粒子複合体であって、
前記遺伝子導入ベクターが、ベクター表面に硫黄原子を有するベクターであり、
前記金磁性粒子が、磁性粒子の表面に金粒子が接合し又は担持された粒子であることを特徴とするベクター／金磁性粒子複合体。
【請求項８】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求項７記載のベクター／金磁性粒子複合体。
【請求項９】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項７又は８に記載のベクター／金磁性粒子複合体。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子導入方法を行うためのキットであって、金磁性粒子を含むことを特徴とする遺伝子導入キット。
【請求項１１】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項１０記載の遺伝子導入キット。
【請求項１２】
ウイルスベクター導入試薬であって、金磁性粒子を含むことを特徴とするウイルスベクター導入試薬。
【請求項１３】
前記金磁性粒子における前記金粒子の平均粒子径が１〜５００ｎｍであり、前記磁性粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍである請求項１２記載のウイルスベクター導入試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１８２９２１（Ｐ２００８−１８２９２１Ａ）
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７７５５（Ｐ２００７−１７７５５）
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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