神経幹細胞培養物の調製におけるコラゲナーゼの使用
【課題】継代から継代までの細胞の生存性を増大させること、およびほとんどの最初の細胞をより維持する（最も大きな分化能力および自己再生能力を有して）、改善された培養物を提供すること、およびそのようなプロセスを作成すること。
【解決手段】本発明は、継代の間にニューロスフェアの細胞を解離させるためにコラゲナーゼを使用する、多能性の神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法を提供する。本発明の方法に従うと、コラゲナーゼの使用は、粉砕またはトリプシン化のような他の酵素的処理による解離と比較した場合に、改善された神経幹細胞培養物の生存性、経時的に増大した数のこれらの神経幹細胞培養物中の増殖した細胞、および細胞培養物の改善された維持を生じる。
【解決手段】本発明は、継代の間にニューロスフェアの細胞を解離させるためにコラゲナーゼを使用する、多能性の神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法を提供する。本発明の方法に従うと、コラゲナーゼの使用は、粉砕またはトリプシン化のような他の酵素的処理による解離と比較した場合に、改善された神経幹細胞培養物の生存性、経時的に増大した数のこれらの神経幹細胞培養物中の増殖した細胞、および細胞培養物の改善された維持を生じる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
本発明は、１９９９年２月２６日に出願された米国特許出願番号第０９／２５８，５２９号についての優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的には、インビトロでの増殖のためのプロセスの産生、またはそのようなプロセスを製作することに関し、そして培養された細胞を解離させるためにコラゲナーゼを使用する神経幹細胞培養物の培養に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物の中枢神経システム（ＣＮＳ）の発達は、胎児の発生の初期の段階で開始し、そして生後の期間まで継続する。成熟した哺乳動物のＣＮＳは、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（星状細胞および稀突起神経膠細胞）から構成される。神経の発達の最初の工程は、細胞の誕生である。これは、幹細胞および幹細胞の子孫（すなわち、娘幹細胞および前駆細胞）が増殖する順序は、時間的および空間的に正確である。
【０００４】
幹細胞を識別する１つの特徴は、自己再生を示すその能力であるか、またはそれ自体をさらに生成する能力である。幹細胞の定義は、ＰｏｔｔｅｎおよびＬｏｅｆｆｌｅｒ、１１０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １００１（１９９０）によって提供されている。彼らは、「（ａ）増殖し得、（ｂ）自己維持し得、（ｃ）多数の分化した機能的な子孫を産生し得、（ｄ）損傷後に組織を再生し得、そして（ｅ）これらの選択肢の使用において可撓性であり得る、未分化の細胞」として、幹細胞を定義した。幹細胞の役割は、天然の細胞の死、損傷、または疾患によって欠失される細胞を置きかえることである。
【０００５】
米国特許第５，７５０，３７６号、同第５，８５１，８３２号（両方とも、Ｗｅｉｓｓの名で）、および同第５，７５３，５０６号（Ｊｏｈｅ）（それぞれ、本明細書中で参考として援用されている）は、神経幹細胞を含有しているインビトロ培養物について言及している。Ｗｅｉｓｓの特許は、懸濁物および接着培養物の両方について言及し、一方、Ｊｏｈｅは、特定の接着培養物について言及している。細胞が、懸濁培養物中でニューロスフェアとして増殖される場合には、増殖を誘導する増殖因子の存在下での３〜４日以内に、多能性の神経幹細胞が、「ニューロスフェア」と呼ばれる未分化の細胞のクラスターを生じるように分裂し始める。単一のニューロスフェアの細胞は、それらが単一の神経幹細胞の子孫であるので、事実上クローン性である。１つ以上の増殖を誘導する増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦなど（およびそれらの組合せ））の持続的な存在下では、ニューロスフェア中の細胞は分裂し続け、それによってニューロスフェアの大きさおよび未分化の細胞の数の増加を生じる。ニューロスフェア中の細胞は、多くの型の未分化のＣＮＳ細胞中で見出される中間体フィラメント状タンパク質である、ネスチンについて免疫反応性である。対照的に、神経幹細胞の子孫に由来する成熟した分化した細胞型は、ネスチンについて圧倒的にネガティブである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先行技術においては、クラスター中の細胞は、継代の間に単一の細胞を生じさせるための粉砕によって機械的に解離させられた。粉砕は、それが機械的なプロセスであるので、細胞に対して剪断力を発揮し、それによって継代の間に細胞の生存性を低下させ得る。本発明の目的は、継代から継代までの細胞の生存性を増大させること、およびほとんどの最初の細胞をより維持する（最も大きな分化能力および自己再生能力を有して）、改善された培養物を提供すること、およびそのようなプロセスを作成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、継代の間にニューロスフェアの細胞を解離させるためにコラゲナーゼを使用する、多能性の神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法を提供する。本発明の方法に従うと、コラゲナーゼの使用は、粉砕またはトリプシン化のような他の酵素的処理による解離と比較した場合に、改善された神経幹細胞培養物の生存性、経時的に増大した数のこれらの培養物中の増殖した細胞、および細胞培養物の改善された維持を生じる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞懸濁物中の解離させた神経組織を得る工程であって、該懸濁物が、ニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る１つ以上の多能性神経幹細胞を含有する、工程；
（ｂ）神経幹細胞培養物を生成するために、（ａ）中の神経幹細胞を増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中で細胞懸濁物を培養する工程；および
（ｃ）該培養物中の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して細胞培養物を継代することによって、（ｂ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含する、方法。
（項目２）前記コラゲナーゼ調製物の量が１８〜１８０ｍＵ／ｍｌの間である、項目１に記載の方法。
（項目３）前記コラゲナーゼ調製物の量が５４〜１２６ｍＵ／ｍｌの間である、項目１に記載の方法。
（項目４）前記コラゲナーゼ調製物が、スルフヒドリルプロテアーゼ、クロストリパイン、アミノペプチダーゼ、またはそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの分子をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）前記コラゲナーゼ調製物が実質的に純粋であり、そして最少の二次的なタンパク質分解活性を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）前記増殖を誘導する増殖因子が、上皮増殖因子、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、グリコスタチンＣ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目１に記載のプロセス。
（項目７）前記神経幹細胞培養物が遺伝的に改変された神経幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）星状細胞、ニューロン、稀突起神経膠細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される分化した神経細胞を含む細胞培養物を生じるように、（ｃ）の神経幹細胞培養物を分化させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目９）前記神経幹細胞培養物を生物学的試薬と接触させる工程、および該培養物中の細胞に対する生物学的試薬の影響を決定する工程をさらに包含する、項目１または項目８に記載の方法。
（項目１０）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目１に記載の方法。
（項目１１）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目１に記載の方法。
（項目１２）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）細胞懸濁物中の解離させた神経組織を得る工程であって、該懸濁物が、ニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る１つ以上の多能性神経幹細胞を含有している、工程；
（ｂ）神経幹細胞培養物を生成するために、（ａ）中の神経幹細胞を増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中で細胞懸濁物を培養する工程；および
（ｃ）該培養物中の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して細胞培養物を継代することによって、（ｂ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含し、ここで、培養物中の細胞の生存性パーセントが継代された後に少なくとも６０％である、方法。
（項目１４）前記培養物中の細胞の生存性パーセントが、継代された後に少なくとも７５％である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）前記培養物中の細胞の生存性パーセントが、継代された後に少なくとも８５％である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）前記コラゲナーゼ調製物の量が１８〜１８０ｍＵ／ｍｌの間である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）前記コラゲナーゼ調製物の有効量が５４〜１２６ｍＵ／ｍｌの間である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）前記コラゲナーゼ調製物が、スルフヒドリルプロテアーゼ、クロストリパイン、アミノペプチダーゼ、またはそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの分子をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）前記コラゲナーゼ調製物が実質的に純粋であり、そして最少の二次的なタンパク質分解活性を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）前記神経幹細胞培養物が遺伝的に改変された神経幹細胞を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２１）星状細胞、ニューロン、稀突起神経膠細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される分化した神経細胞を含む細胞培養物を生じるように、（ｃ）の神経幹細胞培養物を分化させる工程をさらに包含する、項目１３に記載の方法。
（項目２２）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目１３に記載の方法。
（項目２３）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目１３に記載の方法。
（項目２４）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２５）項目１３〜２４のいずれか１項に従ってなされた細胞培養物。
（項目２６）神経幹細胞培養物を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）培養物を増殖させるために、少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中で、ニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る１つ以上の多能性神経幹細胞を含む、神経幹細胞培養物を培養する工程；ならびに
（ｂ）該培養物中の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して該細胞培養物を継代することによって、（ａ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含し、ここで、毎週の継代の間に少なくとも３倍に細胞数が増大する、方法。
（項目２７）毎週の継代の間に少なくとも５倍に細胞数が増大する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３１）項目２６〜３０のいずれか１項に従ってなされた細胞培養物。
（項目３２）神経幹細胞培養物を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）培養物を増殖させるために、少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中でニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る、１つ以上の多能性神経幹細胞を含む、神経幹細胞培養物を培養する工程；ならびに
（ｂ）該培養物の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して該細胞培養物を継代することによって、（ａ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含し、ここで、蓄積される細胞数は、４９日未満で１０6個の細胞から少なくとも１０9個の細胞にまで増大され得る、方法。
（項目３３）蓄積される細胞数が、４２日未満で１０6個の細胞から少なくとも１０9個の細胞にまで増大され得る、項目３２に記載の方法。
（項目３４）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３７）項目３２〜３６のいずれか１項に従ってなされた細胞培養物。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、増殖しているヒトのニューロスフェアを解離させる先行技術の粉砕方法と、本発明のコラゲナーゼ方法との間での比較を示す。これは、コラゲナーゼ方法を使用する、生存性の細胞数の経時的な増大を実証する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
（序論）
本発明は、ニューロスフェア（「凝集した」細胞）を解離させるためにコラゲナーゼを使用する、神経幹細胞培養物を増殖させるための新規の作製プロセスを提供する。この方法は、神経幹細胞培養物を解離させるための先行技術の粉砕およびトリプシン化方法と比較した場合に、予想以上に改善された神経幹細胞培養物の生存性を生じ、そして経時的に増大した数の増殖した細胞を生じる。
コラゲナーゼ作製プロセスの１つの実施形態においては、ニューロスフェア細胞が収集され、そして遠心分離（例えば、１０００ｒｐｍで３〜５分間）される。培地の吸引後、ニューロスフェアがコラゲナーゼ溶液（例えば、１ｍｌの予め暖めた（３７℃）、０．５ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁され、そしてコラゲナーゼとともにインキュベートされる。インキュベーション後、細胞懸濁物は培地中で稀釈され、そして培養される。
【００１０】
先行技術の粉砕方法においては、ニューロスフェア細胞が収集され、そして遠心分離された。培地の吸引後、ニューロスフェアは約２００μｌの培地中に再懸濁された。ニューロスフェアは、ピペットを使用することによって粉砕された（例えば、７５μｌの容量のＰ２００ピペットマン、約１００回）。次いで、細胞懸濁物は培地中で稀釈され、そして培養された。
【００１１】
（コラゲナーゼ）
培養物中の神経幹細胞を解離させるために有効な任意のコラゲナーゼが、本発明の作製プロセスにおいて使用され得る。「コラゲナーゼ」は、細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンを消化する酵素である（Ｈａｒｐｅｒ、４９ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６３（１９８０））。コラゲナーゼの１つの供給源は、細菌のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍである。１つのコラゲナーゼアッセイは、Ｍａｎｄｌら、３２ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１３２３（１９５３）の改変である。それによると、コラゲナーゼは、ネイティブなコラーゲンとともに５時間インキュベートされる。コラーゲンの分解の程度は、ＭｏｏｒｅおよびＳｔｅｉｎ、１７６ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ３６７（１９４８）の比色（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）ニンヒドリン方法を使用して決定される。コラゲナーゼユニットの定義については、１ユニットは、３７℃にて５時間、ｐＨ７．５中でコラーゲンから、１μモルのＬ−ロイシン当量を放出する。
【００１２】
粗コラゲナーゼが、細胞解離手順に使用され得る。粗コラゲナーゼ調製物は、いくつかのコラゲナーゼだけではなく、スルフヒドリルプロテアーゼ、クロストリパイン、トリプシン様酵素、およびアミノペプチダーゼをもまた含む。いくつかの実施形態においては、本発明者らは、粗コラゲナーゼ調製物を好む。なぜなら、これらのさらなる活性が存在するからである。コラゲナーゼ分解活性とタンパク質分解活性のこの組合せは、組織の解離の本質的な部分である、細胞間マトリックスを崩壊させる点で有効である。粗コラゲナーゼは、金属キレート剤（例えば、システイン、ＥＤＴＡ、またはｏ−フェナントロリン）によって阻害される。これは、大きな血漿糖タンパク質であるα−２−マクログロブリンによってもまた、阻害される。Ｃａ2+は、酵素活性に必要であると考えられている。
【００１３】
コラゲナーゼの商業的に入手可能な供給源が、本発明の方法において有用である。例えば、精製されたコラゲナーゼは、最少の二次的なタンパク質分解活性を含むが、高いコラゲナーゼ活性を有する。精製されたコラゲナーゼは、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によるコラゲナーゼＨ（カタログ番号 １ ０８７ ７８９）であり得る。０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼのストック溶液は、０．１％のＢＳＡを含有しているＤＰＢＳ中で調製され、そして−２０℃で保存される。他の所業的に入手可能な供給源は、Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、またはコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ）である。使用されるコラゲナーゼの範囲は、１００〜１０００μｇ／ｍｌ（１８〜１８０ｍＵ／ｍｌ）、好ましくは、３００〜７００μｇ／ｍｌ（５４〜１２６ｍＵ／ｍｌ）、もっとも好ましくは、約５００μｇ／ｍｌ（９０ｍＵ／ｍｌ）であり得る。
【００１４】
（多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞の単離およびインビトロでの増殖）
神経生物学者は、ＣＮＳの未分化の細胞を記載するために、種々の用語を互換的に使用してきた。「幹細胞」、「前駆細胞」、および「先祖細胞」のような用語は、科学的な文献において以前に使用された。しかし、異なる特徴および運命を有する種々の型の未分化の神経細胞が存在する。未分化の多能性の神経細胞について使用される用語は、これらの細胞が、本明細書中で「神経幹細胞」と呼ばれるように展開される。米国特許第５，７５０，３７６号は、「制限なく分裂し得、そして特異的な条件下で、最終的にニューロンおよびグリアに分化する娘細胞を産生し得る、オリゴ能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）または多能性の幹細胞」を意味するように、インビトロで増殖させられた「神経幹」細胞を定義する。制限なく分裂し、そしてニューロンおよびグリアに最終的に分化する娘細胞を産生する細胞の能力は、ＣＮＳ幹細胞の特徴である。ＣＮＳ神経幹細胞は、自己維持し得、このことは、それぞれの細胞分裂に伴って、１つの娘細胞がまた幹細胞であることを意味する。ＣＮＳ神経幹細胞は、本発明の方法を使用して増殖するように誘導され得る。
【００１５】
神経幹細胞の幹細胞ではない子孫は、先祖細胞を含み得る。単一の多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞から生成された先祖細胞は、ニューロン、星状細胞（Ｉ型およびＩＩ型）、または稀突起神経膠細胞に分化し得る。対照的に、ＣＮＳ神経幹細胞は、「多能性」である、なぜなら、その子孫は、複数の分化の経路を有するからである。
【００１６】
「神経先祖細胞」は、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞に由来する未分化の細胞であり、そしてそれ自体幹細胞ではない。いくつかの先祖細胞は、１つ以上の細胞型に分化し得る子孫を生じ得る。例えば、Ｏ−２Ａ細胞は、グリア先祖細胞であり、これは、稀突起神経膠細胞およびＩＩ型星状細胞を生じ、従って、「二官能性」の先祖細胞と呼ばれ得る。先祖細胞の識別できる特性は、幹細胞とは異なり、それが、限定された増殖能力を有し、従って、自己維持を示さないことである。これは、特定の分化の経路に約束され、そして適切な条件下で、最終的にグリアまたはニューロンに分化する。
【００１７】
用語「前駆細胞」は、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞の子孫をいい、従って、先祖細胞および娘の両方の、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞を含む。
【００１８】
多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞は、胚性の神経組織、出産後の神経組織、若年性の神経組織、または成体の神経組織から得られ得る。好ましい供給源の神経組織は、哺乳動物であり、好ましくは、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）ならびに霊長類であり、そして最も好ましくは、ヒトに由来する。成体のヒトの神経組織、胚性のヒトの神経組織、成体のサル（Ｒｈｅｓｕｓ）の神経組織、胚性のマウスの神経組織、ならびに若年性および成体のマウスの脳組織に由来する、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞の単離、増殖、および継代の方法（ＣＮＳ神経幹細胞に由来する培養物中での神経幹細胞の確立、およびＣＮＳ神経幹細胞の子孫の分化を含む）は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号（それぞれ、本明細書中で参考として援用されている）に提供されている。しかし、本発明の方法においては、ニューロスフェアは、凝集した細胞を解離させるために、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号、ならびにＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（それぞれ、本明細書中で参考として援用されている）によって使用される方法に従う粉砕またはトリプシン化よりもむしろ、コラゲナーゼ処理される。
【００１９】
多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号、ならびにＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号によって記載されているように、結合している組織の細胞外マトリックスからの個々の細胞の解離によって、ドナー組織から得られ得る。組織は、滅菌手順を使用して神経の領域から取り出され、そして細胞は、トリプシン、コラゲナーゼなどのような酵素での処理を含む、当該分野で公知の任意の方法を使用して、またはＷｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号によって記載されているような、鈍い（ｂｌｕｎｔ）機器を用いるような物理的な解離方法を使用することによって、組織培養培地から解離させられる。解離させられた細胞は、低速で（２００から２０００ｒｐｍの間、通常は、４００から１０００ｒｐｍの間）で遠心分離され、次いで培養培地中に再懸濁される。神経細胞は、懸濁物中で、または固定された基質上で培養され得る。細胞懸濁物は、細胞を維持することが可能な任意の入れ物の中に（詳細には、培養フラスコ、培養プレート、またはローラーボトル、そしてより詳細には、２５ｃｍ2の培養フラスコのような小さな培養フラスコ中に）播種される。懸濁物中で培養された細胞は、約５×１０4から１×１０6細胞／ｍｌ、好ましくは、１×１０6細胞／ｍｌ（２０週のｇ．ｗ．組織について）で再懸濁される。固定された基質上にプレートされた細胞は、約２〜３×１０3１０細胞／ｃｍ2、好ましくは、２．５×１０3細胞／ｃｍ2で、プレートされる。
【００２０】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物（ニューロスフェアの多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞を含む）は、基質上または懸濁物中のいずれかで増殖させられ得、好ましくは、解離された未分化の細胞のクラスターを形成し、これは、「ニューロスフェア」と呼ばれる。基質の非存在下での培養後、増殖しているニューロスフェアが培養ディッシュの底から浮き上がり、そしてニューロスフェアに特徴的な自由に浮遊するクラスターを形成する傾向にある。ニューロスフェアの増殖している前駆細胞は、懸濁物中で増殖し続ける。懸濁物のクラスターのニューロスフェアは、増殖を再び開始するように容易に継代され得る。本発明の方法においては、ニューロスフェア中の個々の細胞は、コラゲナーゼでの処理によって分離させられる。コラゲナーゼ処理されたニューロスフェア細胞は、次いで、増殖を再び開始させるために、所望される密度で再度プレートされる。解離させられたニューロスフェアに由来する単一の細胞が、増殖因子を含有している培養培地中に懸濁され、そしてこれらの細胞の一定の割合が増殖し、そして大部分が未分化の細胞から構成される新規のニューロスフェアを形成する。この作成プロセスは、それぞれの継代での生存可能な細胞の数において、対数関数的な増大を生じるまで、反復され得る。この手順は、所望される細胞の数が得られるまで継続される。
【００２１】
Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８８３号は、「多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有している培養培地」を開示している。しかし、以下を含む種々の基本培地が使用され得るが、それらに制限されない：
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；
Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；
神経先祖基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；または、
上記の基本培地の組合せ。
【００２２】
培養培地は、少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子で補充される。本明細書中で使用される場合は、用語「増殖因子」は、タンパク質、ペプチド、または神経幹細胞および／もしくは神経幹細胞の子孫に対して、成長、増殖、分化、または栄養的な影響を有する他の分子をいう。増殖を誘導するために使用され得る増殖因子として、神経幹細胞および前駆細胞が増殖することを可能にする、任意の栄養的な因子が挙げられる。これには、細胞に対する栄養的な、または増殖を誘導する影響を発揮する、細胞の表面上のレセプターに結合する任意の分子が含まれる。好ましい増殖を誘導する増殖因子として、ＥＧＦスーパーファミリ、ＦＧＦスーパーファミリー、およびＴＧＦαスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＥＧＦ、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、グリコスタチンＣ）、およびそれらの組合せが挙げられる。増殖を誘導する増殖因子の好ましい組合せは、ＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２との、ＥＧＦまたはＴＧＦαである。通常は、増殖因子は、約１ｆｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間の範囲の濃度で培養培地に添加される。約１から１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度が、通常は十分である。単純な滴定実験が、特定の増殖因子の最適な濃度を決定するために容易に行われ得る。
【００２３】
培地処方物の最適化は、確立された初代の脳組織から開始されるニューロスフェアの高い割合を可能にする。本発明者らは、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５培地を好む。培地処方物の最適化はまた、より一貫したニューロスフェアの増殖を可能にする。ニューロスフェアの発達を最大にするためには、コラゲナーゼ処理されたニューロスフェア細胞は、代表的には、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養される。
【００２４】
ヒトの神経幹細胞培養物を培養するための代表的な培地処方物が、表１に提供される
【００２５】
【表１】
。
【００２６】
ＥＧＦは、培地を濾過した後に、ヒトの神経幹細胞培養物についての１００ｍｌの基本培地に添加される。ＥＧＦは、培地中では比較的安定である。ＦＧＦ−２およびＬＩＦは、使用するために培地を準備するときに添加される。補充試薬の最終濃度は以下のとおりである：
【００２７】
【表２】
。
【００２８】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物はまた、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８８３号に記載されているような、分化の典型を使用して分化させられ得る。例えば、（１）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、０．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有している培地中で、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングされたガラスのカバースライド上にプレートされた後の、迅速な分化によって分化させられ得る；（２）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、１％のＦＢＳを含有しているＥＧＦを含有していない完全培地中で、解離させられたニューロスフェアを使用して分化させられ得る；（３）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、ラミニンでコーティングされたガラスのカバースライド上にプレートされた単一のニューロスフェアを使用して分化させられ得る；（４）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、コラゲナーゼ処理されそして３５ｍｍの培養ディッシュ上にプレートされた単一の解離させられたニューロスフェアを使用して、分化させられ得る；（５）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、線条体内の星状細胞と同時に培養されたニューロスフェアを使用して、分化させられ得る。好ましい分化の方法においては、ニューロスフェア細胞は、ＦＢＳの存在下でラミニンでコーティングされた基質上にプレートされる。得られる分化した細胞は、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在について、例えば、ＭＡＰ−２、ｔａｕ−１、神経フィラメント１６８ｋＤａ、β−チューブリン、ＧＡＢＡ、基質Ｐ（ニューロンのマーカー）、ＧＦＡＰ（星状細胞のマーカー）、Ｏ４、およびＭＢＰ（稀突起神経膠細胞のマーカー）に対する抗体を使用して、直接的な免疫細胞化学によってプローブされる。全ての３個の神経細胞の型が同定されると予想される。
【００２９】
（コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物の遺伝的な改変）
本明細書中に記載されている神経幹細胞培養物は、インビトロでの遺伝的な改変、またはトランスジェニック哺乳動物に由来する遺伝的に改変された神経幹細胞培養物の生成を含む、任意の適切な当該分野で公知の方法に従って、遺伝的に改変され得る。神経幹細胞の遺伝的な改変は、組換えレトロウイルスでの感染、または当該分野で公知の形質転換方法のいずれかによって行われる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。遺伝的に改変された神経幹細胞培養物を作成する方法は、例えば、本明細書中で参考として援用されている、Ｗｅｉｓｓの米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。
【００３０】
一般的には、用語「遺伝的な改変」は、外因性のＤＮＡの意図的な導入による前駆細胞の遺伝子型の安定なまたは一時的な変更をいう。ＤＮＡは、合成であり得るかまたは天然に由来し得、そして遺伝子、遺伝子の一部、または他の有用なＤＮＡ配列を含み得る。用語「遺伝的な改変」は、当該分野で公知の種々の遺伝子活性化方法を含む。例えば、本明細書中で参考として援用されている、米国特許第５，７３３，７６１号、および同第５，７３３，７４６号を参照のこと。
【００３１】
特定の実施形態においては、神経幹細胞は、生物学的に活性な分子（ホルモン、酵素、神経伝達物質、抗体、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、栄養的な因子、または生物学的応答の改変因子を含む）を産生するように遺伝的に改変される。あるいは、神経幹細胞は、宿主（好ましくは、ヒト）中での移植の際に、代謝機能または免疫学的な機能を提供するように、遺伝的に改変される。細胞が特定の増殖因子産物を分泌するようにそれらを遺伝的に改変することもまた、所望され得る。用語「増殖因子産物」は、タンパク質、ペプチド、有糸分裂促進物質、または成長、増殖、分化、もしくは栄養的な影響を有する他の分子（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＣＮＴＦ、アンフィレグリン、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、およびインターロイキン）をいう。ニューロスフェアの子孫の細胞はまた、特定の増殖因子レセプター（例えば、ｐ７５低親和性ＮＧＦレセプター、ＣＮＴＦレセプター、ニューロトロフィンレセプターのｔｒｋファミリー、ＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、およびアンフィレグリンレセプター）を発現するように改変され得る。コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、種々の神経伝達物質、神経伝達物質レセプター、または神経伝達物質合成酵素を産生するように操作され得る。
【００３２】
（ヒトの障害を緩和するための神経幹細胞培養物の移植）
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が産生され得、そして哺乳動物宿主（好ましくは、ヒトの患者）に、種々の障害（中枢神経システム（「ＣＮＳ」のものおよび全身的なものの両方）の処置のために、移植される。細胞は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって、被験体に送達される。中枢神経システムに送達される場合は、次いで、細胞は、脳の周辺の領域の完全性を維持する任意の方法を使用して、好ましくは、注射カニューレによって、特定の領域に投与される。Ｄｕｎｃａｎら、１７ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌｏｇｙ ３５１−３６１（１９８８）によって使用されたものによって説明され、そしてスケールアップされ、そしてヒトでの使用のために改変された注射方法が好ましい。ＣＮＳ中への細胞懸濁物（例えば、線維芽細胞）の注射のための方法もまた、神経前駆細胞の注射のために使用され得る。さらなるアプローチおよび方法が、Ｎｅｕｒａｌ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ，ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編（１９８５）に見出され得る。
【００３３】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が産生され得、そして種々の神経変性の障害を処置するための上記の手順を使用して移植され得る。このようなＣＮＳ障害は、神経変性の疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性の脳の損傷（例えば、発作、頭部の損傷、脳性麻痺）、および多数のＣＮＳ不全（例えば、欝状態、癲癇、および精神分裂病）のような多数の苦痛を含む。最近の数年間においては、神経変性の疾患は、これらの障害についてのもっとも大きな危険性を有する高齢者の集団が増大しつつあることに起因して、重要な関心となっている。アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの疾患は、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の退行に関連しており、これによってこれらの細胞またはそれらの意図される機能を実行する脳の領域の不能性を導く。特異的な異なる増殖因子を通じる１つ以上の選択された系統への成熟、増殖、および分化を提供することによって、先祖細胞は、約束された細胞の供給源として使用され得る。１つの一連の実施形態においては、コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が産生され得、そして脱髄疾患の処置のための上記の手順を使用して移植され得る。脱髄した標的の付近の細胞の移植のための任意の適切な方法は、細胞が脱髄した軸索と会合するようになり得るように使用され得る。
【００３４】
本発明に従って作成された神経幹細胞培養物はまた、種々の血液細胞の型（骨髄細胞およびリンパ系細胞、ならびに、初期の造血細胞を含む）を産生するためにも使用され得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ５３４（１９９９）（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【００３５】
（ＣＮＳの発達、機能、および機能不全のインビトロでのモデル、ならびに細胞に対する薬物の影響をスクリーニングするための方法）
インビトロで培養されたコラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、可能性のある神経学的な治療組成物のスクリーニングに使用され得る。これらの組成物は、種々の投与量で培養物中の細胞に対して適用され得、そして細胞の応答が種々の時間の期間についてモニターされる。細胞の物理的な特徴は、細胞および神経突起の成長を顕微鏡で観察することによって分析され得る。酵素、レセプター、および他の細胞表面分子のようなタンパク質の、または神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド、および生命維持に不可欠なアミンの、新規の発現または増大したレベルの発現の誘導は、このような分子のレベルの変更を同定し得る、当該分野で公知の任意の技術を用いて分析され得る。これらの技術として、このような分子に対する抗体を使用する免疫組織化学または生化学的分析が挙げられる。このような生化学的分析として、タンパク質アッセイ、酵素によるアッセイ、レセプター結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動による分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）での分析、ウェスタンブロット、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。核酸の分析（例えば、ノーザンブロット）が、これらの分子またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを試験するために使用される。あるいは、これらの薬学的組成物で処理された細胞が動物中に移植され得、そしてそれらの生存性、ニューロンの連結を形成する能力、ならびに生化学的および免疫学的特徴が、以前に記載されているように試験される。
【００３６】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が、神経細胞に対する生物学的な試薬の影響を決定する方法において使用され得る。用語「生物学的試薬」は、ウイルス、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、薬物、プロドラッグ、または神経細胞に対して影響を有し得る他の物質（このような影響が有害であるかまたは有益であるか、またはそうでないかにはかかわらず）をいう。神経細胞に対して有益である生物学的試薬は、「神経学的な試薬」と本明細書中で呼ばれる。この用語は、ＣＮＳ細胞の増殖、分化、もしくはは機能化、または神経学的な疾患もしくは障害の処置に有用である可能性があると証明され得る、任意の生物学的または薬学的に活性な物質を含む。神経細胞に対する可能性のある生物学的な試薬の影響を決定するために、コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物のクラスターが得られ、そして増殖を誘導する増殖因子の存在下でインビトロで増殖させられる。一般的には、生物学的試薬が可溶化され、そしてそれぞれの用量での試薬の影響を決定するために、種々の濃度で培養培地に対して添加される。培養培地は、試薬の濃度をいくらか一定に維持するような量で、１日おきに生物学的試薬で補充され得る。
【００３７】
従って、移植の目的のために大量の細胞を生成するために有用な、先祖細胞の増殖能力を増大させる生物学的試薬をスクリーニングすることが可能である。コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物を使用して、前駆細胞の増殖を阻害する生物学的試薬をスクリーニングすることもまた可能である。また、分化した神経細胞の数および性質をいくつかの他の方法において増大、減少、または改変するための種々の生物学的試薬の能力が、分化を誘導されているコラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物に対してスクリーニングされ得る。次いで、分化、および分化した神経細胞の生存に対する生物学的試薬または生物学的試薬の組合せの影響が、決定され得る。分化する前にコラゲナーゼ処理した神経幹細胞培養物に対してそれらを適用することによる分化のプロセスに対する生物学的試薬の影響を決定することもまた、可能である。
【００３８】
本発明の他の特徴、目的、および利点が、明細書および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲においては、単数形は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。他に特に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中で参考として援用されている全ての特許および刊行物が、参考として援用されている。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲を限定するようには、いかなる方法においても解釈されないはずである。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
（コラゲナーゼプロトコール）
１．Ｃａ++、Ｍｇ++を含有していないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で組織を数回リンスする。
２．ペトリディッシュ中で、交差させた解剖用メスを使用して組織を１〜２ｍｍの立方体の断片に切断する。組織（閉じ込めた容量 約７．５ｍｌ）およびＰＢＳ（約８８ｍｌ）を５０ｍｌの遠心分離チューブに注ぐ。組織を除去する必要がある場合にはＰＢＳでディッシュをリンスし、そして遠心分離チューブに移す。３．組織および遊離の細胞を沈殿させるために穏やかにチューブを遠心分離する（＜１０００ｒｐｍ）。
４．吸引系統を使用して注意深く上清を取り除く。
５．１．０ｇまでの組織に対して、１．０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有している、Ｃａ++、Ｍｇ++を含有していないＨＢＳＳ中の５．０ｍｌの０．１％のコラゲナーゼ、０．１％のヒアルロニダーゼを添加する。
６．時折軽く攪拌しながら１時間、３７℃の水浴中でインキュベートする。１時間の終わりに、約３秒間ボルテックスし、そして組織の解離の程度を評価する。完全な組織の大きな断片が残っている場合には、さらに３０〜４５分間３７℃でインキュベーションし続ける。大きな細胞の凝集物を完全に処理することを可能にするために、１〜２分間チューブを垂直に立てておく。新しいチューブ（１）に上清を移す。
７．ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡで新しいチューブ（１）の上部まで満たし、そして約９００ｒｐｍで６分間遠心分離する。上清（これは、破片で濁っているはずである）を新しい５０ｍｌの遠心分離チューブ（２）に取り出す。チューブ（１）および（２）を９００ｒｐｍで遠心分離する。
８．チューブ（１）から上清を廃棄し、そしてチューブ（２）に由来するペレットを細胞の生存性について試験する。価値がある場合には、チューブ（２）に由来するペレット化した細胞をチューブ（１）の内容物と混合する。チューブをＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡで満たし、そして６分間９００ｒｐｍで再度スピンさせる。終了すると上清を廃棄する。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、そしてトリパンブルーを用いて計数する。この段階で、細胞懸濁物は、比較的破片を含まないはずであり、そして主に健康な細胞から構成されるはずである。
【００４０】
（実施例２）
（コラゲナーゼの結果）
コラゲナーゼ処理は、コラゲナーゼ方法を使用して、生存可能な神経幹細胞の増大した数を提供した。細胞は、血球計数器上でトリパンブルーで計数する。生の数は、規定された面積中の生存している細胞の数である。
【００４１】
【表３】
コラゲナーゼ処理は、コラゲナーゼ方法を使用して、継時的に増大した数の増殖した神経幹細胞を提供した。
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
上記の記載は、説明の目的だけのためのに示され、そして開示される正確な形態に本発明を限定するようには意図されず、本明細書中に添付される特許請求の範囲によって限定するように意図される。
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
本発明は、１９９９年２月２６日に出願された米国特許出願番号第０９／２５８，５２９号についての優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的には、インビトロでの増殖のためのプロセスの産生、またはそのようなプロセスを製作することに関し、そして培養された細胞を解離させるためにコラゲナーゼを使用する神経幹細胞培養物の培養に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物の中枢神経システム（ＣＮＳ）の発達は、胎児の発生の初期の段階で開始し、そして生後の期間まで継続する。成熟した哺乳動物のＣＮＳは、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（星状細胞および稀突起神経膠細胞）から構成される。神経の発達の最初の工程は、細胞の誕生である。これは、幹細胞および幹細胞の子孫（すなわち、娘幹細胞および前駆細胞）が増殖する順序は、時間的および空間的に正確である。
【０００４】
幹細胞を識別する１つの特徴は、自己再生を示すその能力であるか、またはそれ自体をさらに生成する能力である。幹細胞の定義は、ＰｏｔｔｅｎおよびＬｏｅｆｆｌｅｒ、１１０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １００１（１９９０）によって提供されている。彼らは、「（ａ）増殖し得、（ｂ）自己維持し得、（ｃ）多数の分化した機能的な子孫を産生し得、（ｄ）損傷後に組織を再生し得、そして（ｅ）これらの選択肢の使用において可撓性であり得る、未分化の細胞」として、幹細胞を定義した。幹細胞の役割は、天然の細胞の死、損傷、または疾患によって欠失される細胞を置きかえることである。
【０００５】
米国特許第５，７５０，３７６号、同第５，８５１，８３２号（両方とも、Ｗｅｉｓｓの名で）、および同第５，７５３，５０６号（Ｊｏｈｅ）（それぞれ、本明細書中で参考として援用されている）は、神経幹細胞を含有しているインビトロ培養物について言及している。Ｗｅｉｓｓの特許は、懸濁物および接着培養物の両方について言及し、一方、Ｊｏｈｅは、特定の接着培養物について言及している。細胞が、懸濁培養物中でニューロスフェアとして増殖される場合には、増殖を誘導する増殖因子の存在下での３〜４日以内に、多能性の神経幹細胞が、「ニューロスフェア」と呼ばれる未分化の細胞のクラスターを生じるように分裂し始める。単一のニューロスフェアの細胞は、それらが単一の神経幹細胞の子孫であるので、事実上クローン性である。１つ以上の増殖を誘導する増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦなど（およびそれらの組合せ））の持続的な存在下では、ニューロスフェア中の細胞は分裂し続け、それによってニューロスフェアの大きさおよび未分化の細胞の数の増加を生じる。ニューロスフェア中の細胞は、多くの型の未分化のＣＮＳ細胞中で見出される中間体フィラメント状タンパク質である、ネスチンについて免疫反応性である。対照的に、神経幹細胞の子孫に由来する成熟した分化した細胞型は、ネスチンについて圧倒的にネガティブである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先行技術においては、クラスター中の細胞は、継代の間に単一の細胞を生じさせるための粉砕によって機械的に解離させられた。粉砕は、それが機械的なプロセスであるので、細胞に対して剪断力を発揮し、それによって継代の間に細胞の生存性を低下させ得る。本発明の目的は、継代から継代までの細胞の生存性を増大させること、およびほとんどの最初の細胞をより維持する（最も大きな分化能力および自己再生能力を有して）、改善された培養物を提供すること、およびそのようなプロセスを作成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、継代の間にニューロスフェアの細胞を解離させるためにコラゲナーゼを使用する、多能性の神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法を提供する。本発明の方法に従うと、コラゲナーゼの使用は、粉砕またはトリプシン化のような他の酵素的処理による解離と比較した場合に、改善された神経幹細胞培養物の生存性、経時的に増大した数のこれらの培養物中の増殖した細胞、および細胞培養物の改善された維持を生じる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞懸濁物中の解離させた神経組織を得る工程であって、該懸濁物が、ニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る１つ以上の多能性神経幹細胞を含有する、工程；
（ｂ）神経幹細胞培養物を生成するために、（ａ）中の神経幹細胞を増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中で細胞懸濁物を培養する工程；および
（ｃ）該培養物中の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して細胞培養物を継代することによって、（ｂ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含する、方法。
（項目２）前記コラゲナーゼ調製物の量が１８〜１８０ｍＵ／ｍｌの間である、項目１に記載の方法。
（項目３）前記コラゲナーゼ調製物の量が５４〜１２６ｍＵ／ｍｌの間である、項目１に記載の方法。
（項目４）前記コラゲナーゼ調製物が、スルフヒドリルプロテアーゼ、クロストリパイン、アミノペプチダーゼ、またはそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの分子をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）前記コラゲナーゼ調製物が実質的に純粋であり、そして最少の二次的なタンパク質分解活性を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）前記増殖を誘導する増殖因子が、上皮増殖因子、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、グリコスタチンＣ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目１に記載のプロセス。
（項目７）前記神経幹細胞培養物が遺伝的に改変された神経幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）星状細胞、ニューロン、稀突起神経膠細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される分化した神経細胞を含む細胞培養物を生じるように、（ｃ）の神経幹細胞培養物を分化させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目９）前記神経幹細胞培養物を生物学的試薬と接触させる工程、および該培養物中の細胞に対する生物学的試薬の影響を決定する工程をさらに包含する、項目１または項目８に記載の方法。
（項目１０）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目１に記載の方法。
（項目１１）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目１に記載の方法。
（項目１２）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）神経幹細胞培養物のインビトロでの増殖のための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）細胞懸濁物中の解離させた神経組織を得る工程であって、該懸濁物が、ニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る１つ以上の多能性神経幹細胞を含有している、工程；
（ｂ）神経幹細胞培養物を生成するために、（ａ）中の神経幹細胞を増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中で細胞懸濁物を培養する工程；および
（ｃ）該培養物中の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して細胞培養物を継代することによって、（ｂ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含し、ここで、培養物中の細胞の生存性パーセントが継代された後に少なくとも６０％である、方法。
（項目１４）前記培養物中の細胞の生存性パーセントが、継代された後に少なくとも７５％である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）前記培養物中の細胞の生存性パーセントが、継代された後に少なくとも８５％である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）前記コラゲナーゼ調製物の量が１８〜１８０ｍＵ／ｍｌの間である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）前記コラゲナーゼ調製物の有効量が５４〜１２６ｍＵ／ｍｌの間である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）前記コラゲナーゼ調製物が、スルフヒドリルプロテアーゼ、クロストリパイン、アミノペプチダーゼ、またはそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの分子をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）前記コラゲナーゼ調製物が実質的に純粋であり、そして最少の二次的なタンパク質分解活性を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）前記神経幹細胞培養物が遺伝的に改変された神経幹細胞を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２１）星状細胞、ニューロン、稀突起神経膠細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択される分化した神経細胞を含む細胞培養物を生じるように、（ｃ）の神経幹細胞培養物を分化させる工程をさらに包含する、項目１３に記載の方法。
（項目２２）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目１３に記載の方法。
（項目２３）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目１３に記載の方法。
（項目２４）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２５）項目１３〜２４のいずれか１項に従ってなされた細胞培養物。
（項目２６）神経幹細胞培養物を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）培養物を増殖させるために、少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中で、ニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る１つ以上の多能性神経幹細胞を含む、神経幹細胞培養物を培養する工程；ならびに
（ｂ）該培養物中の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して該細胞培養物を継代することによって、（ａ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含し、ここで、毎週の継代の間に少なくとも３倍に細胞数が増大する、方法。
（項目２７）毎週の継代の間に少なくとも５倍に細胞数が増大する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３１）項目２６〜３０のいずれか１項に従ってなされた細胞培養物。
（項目３２）神経幹細胞培養物を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）培養物を増殖させるために、少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地中でニューロンおよびグリアに分化し得る子孫を産生し得る、１つ以上の多能性神経幹細胞を含む、神経幹細胞培養物を培養する工程；ならびに
（ｂ）該培養物の細胞を解離させるために有効な量のコラゲナーゼ調製物で該培養物を処理すること、および該神経幹細胞培養物をさらに増殖させるための少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子を含有している培養培地に対して該細胞培養物を継代することによって、（ａ）中の細胞培養物を継代する工程、
を包含し、ここで、蓄積される細胞数は、４９日未満で１０6個の細胞から少なくとも１０9個の細胞にまで増大され得る、方法。
（項目３３）蓄積される細胞数が、４２日未満で１０6個の細胞から少なくとも１０9個の細胞にまで増大され得る、項目３２に記載の方法。
（項目３４）前記神経幹細胞培養物が懸濁培養物である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）前記神経幹細胞培養物が接着培養物である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）前記神経幹細胞培養物がヒトの神経幹細胞を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３７）項目３２〜３６のいずれか１項に従ってなされた細胞培養物。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、増殖しているヒトのニューロスフェアを解離させる先行技術の粉砕方法と、本発明のコラゲナーゼ方法との間での比較を示す。これは、コラゲナーゼ方法を使用する、生存性の細胞数の経時的な増大を実証する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
（序論）
本発明は、ニューロスフェア（「凝集した」細胞）を解離させるためにコラゲナーゼを使用する、神経幹細胞培養物を増殖させるための新規の作製プロセスを提供する。この方法は、神経幹細胞培養物を解離させるための先行技術の粉砕およびトリプシン化方法と比較した場合に、予想以上に改善された神経幹細胞培養物の生存性を生じ、そして経時的に増大した数の増殖した細胞を生じる。
コラゲナーゼ作製プロセスの１つの実施形態においては、ニューロスフェア細胞が収集され、そして遠心分離（例えば、１０００ｒｐｍで３〜５分間）される。培地の吸引後、ニューロスフェアがコラゲナーゼ溶液（例えば、１ｍｌの予め暖めた（３７℃）、０．５ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁され、そしてコラゲナーゼとともにインキュベートされる。インキュベーション後、細胞懸濁物は培地中で稀釈され、そして培養される。
【００１０】
先行技術の粉砕方法においては、ニューロスフェア細胞が収集され、そして遠心分離された。培地の吸引後、ニューロスフェアは約２００μｌの培地中に再懸濁された。ニューロスフェアは、ピペットを使用することによって粉砕された（例えば、７５μｌの容量のＰ２００ピペットマン、約１００回）。次いで、細胞懸濁物は培地中で稀釈され、そして培養された。
【００１１】
（コラゲナーゼ）
培養物中の神経幹細胞を解離させるために有効な任意のコラゲナーゼが、本発明の作製プロセスにおいて使用され得る。「コラゲナーゼ」は、細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンを消化する酵素である（Ｈａｒｐｅｒ、４９ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６３（１９８０））。コラゲナーゼの１つの供給源は、細菌のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍである。１つのコラゲナーゼアッセイは、Ｍａｎｄｌら、３２ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１３２３（１９５３）の改変である。それによると、コラゲナーゼは、ネイティブなコラーゲンとともに５時間インキュベートされる。コラーゲンの分解の程度は、ＭｏｏｒｅおよびＳｔｅｉｎ、１７６ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ３６７（１９４８）の比色（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）ニンヒドリン方法を使用して決定される。コラゲナーゼユニットの定義については、１ユニットは、３７℃にて５時間、ｐＨ７．５中でコラーゲンから、１μモルのＬ−ロイシン当量を放出する。
【００１２】
粗コラゲナーゼが、細胞解離手順に使用され得る。粗コラゲナーゼ調製物は、いくつかのコラゲナーゼだけではなく、スルフヒドリルプロテアーゼ、クロストリパイン、トリプシン様酵素、およびアミノペプチダーゼをもまた含む。いくつかの実施形態においては、本発明者らは、粗コラゲナーゼ調製物を好む。なぜなら、これらのさらなる活性が存在するからである。コラゲナーゼ分解活性とタンパク質分解活性のこの組合せは、組織の解離の本質的な部分である、細胞間マトリックスを崩壊させる点で有効である。粗コラゲナーゼは、金属キレート剤（例えば、システイン、ＥＤＴＡ、またはｏ−フェナントロリン）によって阻害される。これは、大きな血漿糖タンパク質であるα−２−マクログロブリンによってもまた、阻害される。Ｃａ2+は、酵素活性に必要であると考えられている。
【００１３】
コラゲナーゼの商業的に入手可能な供給源が、本発明の方法において有用である。例えば、精製されたコラゲナーゼは、最少の二次的なタンパク質分解活性を含むが、高いコラゲナーゼ活性を有する。精製されたコラゲナーゼは、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によるコラゲナーゼＨ（カタログ番号 １ ０８７ ７８９）であり得る。０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼのストック溶液は、０．１％のＢＳＡを含有しているＤＰＢＳ中で調製され、そして−２０℃で保存される。他の所業的に入手可能な供給源は、Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、またはコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ）である。使用されるコラゲナーゼの範囲は、１００〜１０００μｇ／ｍｌ（１８〜１８０ｍＵ／ｍｌ）、好ましくは、３００〜７００μｇ／ｍｌ（５４〜１２６ｍＵ／ｍｌ）、もっとも好ましくは、約５００μｇ／ｍｌ（９０ｍＵ／ｍｌ）であり得る。
【００１４】
（多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞の単離およびインビトロでの増殖）
神経生物学者は、ＣＮＳの未分化の細胞を記載するために、種々の用語を互換的に使用してきた。「幹細胞」、「前駆細胞」、および「先祖細胞」のような用語は、科学的な文献において以前に使用された。しかし、異なる特徴および運命を有する種々の型の未分化の神経細胞が存在する。未分化の多能性の神経細胞について使用される用語は、これらの細胞が、本明細書中で「神経幹細胞」と呼ばれるように展開される。米国特許第５，７５０，３７６号は、「制限なく分裂し得、そして特異的な条件下で、最終的にニューロンおよびグリアに分化する娘細胞を産生し得る、オリゴ能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）または多能性の幹細胞」を意味するように、インビトロで増殖させられた「神経幹」細胞を定義する。制限なく分裂し、そしてニューロンおよびグリアに最終的に分化する娘細胞を産生する細胞の能力は、ＣＮＳ幹細胞の特徴である。ＣＮＳ神経幹細胞は、自己維持し得、このことは、それぞれの細胞分裂に伴って、１つの娘細胞がまた幹細胞であることを意味する。ＣＮＳ神経幹細胞は、本発明の方法を使用して増殖するように誘導され得る。
【００１５】
神経幹細胞の幹細胞ではない子孫は、先祖細胞を含み得る。単一の多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞から生成された先祖細胞は、ニューロン、星状細胞（Ｉ型およびＩＩ型）、または稀突起神経膠細胞に分化し得る。対照的に、ＣＮＳ神経幹細胞は、「多能性」である、なぜなら、その子孫は、複数の分化の経路を有するからである。
【００１６】
「神経先祖細胞」は、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞に由来する未分化の細胞であり、そしてそれ自体幹細胞ではない。いくつかの先祖細胞は、１つ以上の細胞型に分化し得る子孫を生じ得る。例えば、Ｏ−２Ａ細胞は、グリア先祖細胞であり、これは、稀突起神経膠細胞およびＩＩ型星状細胞を生じ、従って、「二官能性」の先祖細胞と呼ばれ得る。先祖細胞の識別できる特性は、幹細胞とは異なり、それが、限定された増殖能力を有し、従って、自己維持を示さないことである。これは、特定の分化の経路に約束され、そして適切な条件下で、最終的にグリアまたはニューロンに分化する。
【００１７】
用語「前駆細胞」は、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞の子孫をいい、従って、先祖細胞および娘の両方の、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞を含む。
【００１８】
多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞は、胚性の神経組織、出産後の神経組織、若年性の神経組織、または成体の神経組織から得られ得る。好ましい供給源の神経組織は、哺乳動物であり、好ましくは、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）ならびに霊長類であり、そして最も好ましくは、ヒトに由来する。成体のヒトの神経組織、胚性のヒトの神経組織、成体のサル（Ｒｈｅｓｕｓ）の神経組織、胚性のマウスの神経組織、ならびに若年性および成体のマウスの脳組織に由来する、多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞の単離、増殖、および継代の方法（ＣＮＳ神経幹細胞に由来する培養物中での神経幹細胞の確立、およびＣＮＳ神経幹細胞の子孫の分化を含む）は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号（それぞれ、本明細書中で参考として援用されている）に提供されている。しかし、本発明の方法においては、ニューロスフェアは、凝集した細胞を解離させるために、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号、ならびにＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（それぞれ、本明細書中で参考として援用されている）によって使用される方法に従う粉砕またはトリプシン化よりもむしろ、コラゲナーゼ処理される。
【００１９】
多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号、ならびにＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号によって記載されているように、結合している組織の細胞外マトリックスからの個々の細胞の解離によって、ドナー組織から得られ得る。組織は、滅菌手順を使用して神経の領域から取り出され、そして細胞は、トリプシン、コラゲナーゼなどのような酵素での処理を含む、当該分野で公知の任意の方法を使用して、またはＷｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８３２号によって記載されているような、鈍い（ｂｌｕｎｔ）機器を用いるような物理的な解離方法を使用することによって、組織培養培地から解離させられる。解離させられた細胞は、低速で（２００から２０００ｒｐｍの間、通常は、４００から１０００ｒｐｍの間）で遠心分離され、次いで培養培地中に再懸濁される。神経細胞は、懸濁物中で、または固定された基質上で培養され得る。細胞懸濁物は、細胞を維持することが可能な任意の入れ物の中に（詳細には、培養フラスコ、培養プレート、またはローラーボトル、そしてより詳細には、２５ｃｍ2の培養フラスコのような小さな培養フラスコ中に）播種される。懸濁物中で培養された細胞は、約５×１０4から１×１０6細胞／ｍｌ、好ましくは、１×１０6細胞／ｍｌ（２０週のｇ．ｗ．組織について）で再懸濁される。固定された基質上にプレートされた細胞は、約２〜３×１０3１０細胞／ｃｍ2、好ましくは、２．５×１０3細胞／ｃｍ2で、プレートされる。
【００２０】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物（ニューロスフェアの多能性の自己再生するＣＮＳ神経幹細胞を含む）は、基質上または懸濁物中のいずれかで増殖させられ得、好ましくは、解離された未分化の細胞のクラスターを形成し、これは、「ニューロスフェア」と呼ばれる。基質の非存在下での培養後、増殖しているニューロスフェアが培養ディッシュの底から浮き上がり、そしてニューロスフェアに特徴的な自由に浮遊するクラスターを形成する傾向にある。ニューロスフェアの増殖している前駆細胞は、懸濁物中で増殖し続ける。懸濁物のクラスターのニューロスフェアは、増殖を再び開始するように容易に継代され得る。本発明の方法においては、ニューロスフェア中の個々の細胞は、コラゲナーゼでの処理によって分離させられる。コラゲナーゼ処理されたニューロスフェア細胞は、次いで、増殖を再び開始させるために、所望される密度で再度プレートされる。解離させられたニューロスフェアに由来する単一の細胞が、増殖因子を含有している培養培地中に懸濁され、そしてこれらの細胞の一定の割合が増殖し、そして大部分が未分化の細胞から構成される新規のニューロスフェアを形成する。この作成プロセスは、それぞれの継代での生存可能な細胞の数において、対数関数的な増大を生じるまで、反復され得る。この手順は、所望される細胞の数が得られるまで継続される。
【００２１】
Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８８３号は、「多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有している培養培地」を開示している。しかし、以下を含む種々の基本培地が使用され得るが、それらに制限されない：
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；
Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；
神経先祖基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；または、
上記の基本培地の組合せ。
【００２２】
培養培地は、少なくとも１つの増殖を誘導する増殖因子で補充される。本明細書中で使用される場合は、用語「増殖因子」は、タンパク質、ペプチド、または神経幹細胞および／もしくは神経幹細胞の子孫に対して、成長、増殖、分化、または栄養的な影響を有する他の分子をいう。増殖を誘導するために使用され得る増殖因子として、神経幹細胞および前駆細胞が増殖することを可能にする、任意の栄養的な因子が挙げられる。これには、細胞に対する栄養的な、または増殖を誘導する影響を発揮する、細胞の表面上のレセプターに結合する任意の分子が含まれる。好ましい増殖を誘導する増殖因子として、ＥＧＦスーパーファミリ、ＦＧＦスーパーファミリー、およびＴＧＦαスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＥＧＦ、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、グリコスタチンＣ）、およびそれらの組合せが挙げられる。増殖を誘導する増殖因子の好ましい組合せは、ＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２との、ＥＧＦまたはＴＧＦαである。通常は、増殖因子は、約１ｆｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間の範囲の濃度で培養培地に添加される。約１から１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度が、通常は十分である。単純な滴定実験が、特定の増殖因子の最適な濃度を決定するために容易に行われ得る。
【００２３】
培地処方物の最適化は、確立された初代の脳組織から開始されるニューロスフェアの高い割合を可能にする。本発明者らは、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５培地を好む。培地処方物の最適化はまた、より一貫したニューロスフェアの増殖を可能にする。ニューロスフェアの発達を最大にするためには、コラゲナーゼ処理されたニューロスフェア細胞は、代表的には、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養される。
【００２４】
ヒトの神経幹細胞培養物を培養するための代表的な培地処方物が、表１に提供される
【００２５】
【表１】
。
【００２６】
ＥＧＦは、培地を濾過した後に、ヒトの神経幹細胞培養物についての１００ｍｌの基本培地に添加される。ＥＧＦは、培地中では比較的安定である。ＦＧＦ−２およびＬＩＦは、使用するために培地を準備するときに添加される。補充試薬の最終濃度は以下のとおりである：
【００２７】
【表２】
。
【００２８】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物はまた、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同第５，８５１，８８３号に記載されているような、分化の典型を使用して分化させられ得る。例えば、（１）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、０．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有している培地中で、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングされたガラスのカバースライド上にプレートされた後の、迅速な分化によって分化させられ得る；（２）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、１％のＦＢＳを含有しているＥＧＦを含有していない完全培地中で、解離させられたニューロスフェアを使用して分化させられ得る；（３）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、ラミニンでコーティングされたガラスのカバースライド上にプレートされた単一のニューロスフェアを使用して分化させられ得る；（４）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、コラゲナーゼ処理されそして３５ｍｍの培養ディッシュ上にプレートされた単一の解離させられたニューロスフェアを使用して、分化させられ得る；（５）コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、線条体内の星状細胞と同時に培養されたニューロスフェアを使用して、分化させられ得る。好ましい分化の方法においては、ニューロスフェア細胞は、ＦＢＳの存在下でラミニンでコーティングされた基質上にプレートされる。得られる分化した細胞は、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在について、例えば、ＭＡＰ−２、ｔａｕ−１、神経フィラメント１６８ｋＤａ、β−チューブリン、ＧＡＢＡ、基質Ｐ（ニューロンのマーカー）、ＧＦＡＰ（星状細胞のマーカー）、Ｏ４、およびＭＢＰ（稀突起神経膠細胞のマーカー）に対する抗体を使用して、直接的な免疫細胞化学によってプローブされる。全ての３個の神経細胞の型が同定されると予想される。
【００２９】
（コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物の遺伝的な改変）
本明細書中に記載されている神経幹細胞培養物は、インビトロでの遺伝的な改変、またはトランスジェニック哺乳動物に由来する遺伝的に改変された神経幹細胞培養物の生成を含む、任意の適切な当該分野で公知の方法に従って、遺伝的に改変され得る。神経幹細胞の遺伝的な改変は、組換えレトロウイルスでの感染、または当該分野で公知の形質転換方法のいずれかによって行われる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。遺伝的に改変された神経幹細胞培養物を作成する方法は、例えば、本明細書中で参考として援用されている、Ｗｅｉｓｓの米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。
【００３０】
一般的には、用語「遺伝的な改変」は、外因性のＤＮＡの意図的な導入による前駆細胞の遺伝子型の安定なまたは一時的な変更をいう。ＤＮＡは、合成であり得るかまたは天然に由来し得、そして遺伝子、遺伝子の一部、または他の有用なＤＮＡ配列を含み得る。用語「遺伝的な改変」は、当該分野で公知の種々の遺伝子活性化方法を含む。例えば、本明細書中で参考として援用されている、米国特許第５，７３３，７６１号、および同第５，７３３，７４６号を参照のこと。
【００３１】
特定の実施形態においては、神経幹細胞は、生物学的に活性な分子（ホルモン、酵素、神経伝達物質、抗体、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、栄養的な因子、または生物学的応答の改変因子を含む）を産生するように遺伝的に改変される。あるいは、神経幹細胞は、宿主（好ましくは、ヒト）中での移植の際に、代謝機能または免疫学的な機能を提供するように、遺伝的に改変される。細胞が特定の増殖因子産物を分泌するようにそれらを遺伝的に改変することもまた、所望され得る。用語「増殖因子産物」は、タンパク質、ペプチド、有糸分裂促進物質、または成長、増殖、分化、もしくは栄養的な影響を有する他の分子（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＣＮＴＦ、アンフィレグリン、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、およびインターロイキン）をいう。ニューロスフェアの子孫の細胞はまた、特定の増殖因子レセプター（例えば、ｐ７５低親和性ＮＧＦレセプター、ＣＮＴＦレセプター、ニューロトロフィンレセプターのｔｒｋファミリー、ＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、およびアンフィレグリンレセプター）を発現するように改変され得る。コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、種々の神経伝達物質、神経伝達物質レセプター、または神経伝達物質合成酵素を産生するように操作され得る。
【００３２】
（ヒトの障害を緩和するための神経幹細胞培養物の移植）
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が産生され得、そして哺乳動物宿主（好ましくは、ヒトの患者）に、種々の障害（中枢神経システム（「ＣＮＳ」のものおよび全身的なものの両方）の処置のために、移植される。細胞は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって、被験体に送達される。中枢神経システムに送達される場合は、次いで、細胞は、脳の周辺の領域の完全性を維持する任意の方法を使用して、好ましくは、注射カニューレによって、特定の領域に投与される。Ｄｕｎｃａｎら、１７ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌｏｇｙ ３５１−３６１（１９８８）によって使用されたものによって説明され、そしてスケールアップされ、そしてヒトでの使用のために改変された注射方法が好ましい。ＣＮＳ中への細胞懸濁物（例えば、線維芽細胞）の注射のための方法もまた、神経前駆細胞の注射のために使用され得る。さらなるアプローチおよび方法が、Ｎｅｕｒａｌ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ，ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編（１９８５）に見出され得る。
【００３３】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が産生され得、そして種々の神経変性の障害を処置するための上記の手順を使用して移植され得る。このようなＣＮＳ障害は、神経変性の疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性の脳の損傷（例えば、発作、頭部の損傷、脳性麻痺）、および多数のＣＮＳ不全（例えば、欝状態、癲癇、および精神分裂病）のような多数の苦痛を含む。最近の数年間においては、神経変性の疾患は、これらの障害についてのもっとも大きな危険性を有する高齢者の集団が増大しつつあることに起因して、重要な関心となっている。アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの疾患は、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の退行に関連しており、これによってこれらの細胞またはそれらの意図される機能を実行する脳の領域の不能性を導く。特異的な異なる増殖因子を通じる１つ以上の選択された系統への成熟、増殖、および分化を提供することによって、先祖細胞は、約束された細胞の供給源として使用され得る。１つの一連の実施形態においては、コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が産生され得、そして脱髄疾患の処置のための上記の手順を使用して移植され得る。脱髄した標的の付近の細胞の移植のための任意の適切な方法は、細胞が脱髄した軸索と会合するようになり得るように使用され得る。
【００３４】
本発明に従って作成された神経幹細胞培養物はまた、種々の血液細胞の型（骨髄細胞およびリンパ系細胞、ならびに、初期の造血細胞を含む）を産生するためにも使用され得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ５３４（１９９９）（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【００３５】
（ＣＮＳの発達、機能、および機能不全のインビトロでのモデル、ならびに細胞に対する薬物の影響をスクリーニングするための方法）
インビトロで培養されたコラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物は、可能性のある神経学的な治療組成物のスクリーニングに使用され得る。これらの組成物は、種々の投与量で培養物中の細胞に対して適用され得、そして細胞の応答が種々の時間の期間についてモニターされる。細胞の物理的な特徴は、細胞および神経突起の成長を顕微鏡で観察することによって分析され得る。酵素、レセプター、および他の細胞表面分子のようなタンパク質の、または神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド、および生命維持に不可欠なアミンの、新規の発現または増大したレベルの発現の誘導は、このような分子のレベルの変更を同定し得る、当該分野で公知の任意の技術を用いて分析され得る。これらの技術として、このような分子に対する抗体を使用する免疫組織化学または生化学的分析が挙げられる。このような生化学的分析として、タンパク質アッセイ、酵素によるアッセイ、レセプター結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動による分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）での分析、ウェスタンブロット、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。核酸の分析（例えば、ノーザンブロット）が、これらの分子またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを試験するために使用される。あるいは、これらの薬学的組成物で処理された細胞が動物中に移植され得、そしてそれらの生存性、ニューロンの連結を形成する能力、ならびに生化学的および免疫学的特徴が、以前に記載されているように試験される。
【００３６】
コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物が、神経細胞に対する生物学的な試薬の影響を決定する方法において使用され得る。用語「生物学的試薬」は、ウイルス、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、薬物、プロドラッグ、または神経細胞に対して影響を有し得る他の物質（このような影響が有害であるかまたは有益であるか、またはそうでないかにはかかわらず）をいう。神経細胞に対して有益である生物学的試薬は、「神経学的な試薬」と本明細書中で呼ばれる。この用語は、ＣＮＳ細胞の増殖、分化、もしくはは機能化、または神経学的な疾患もしくは障害の処置に有用である可能性があると証明され得る、任意の生物学的または薬学的に活性な物質を含む。神経細胞に対する可能性のある生物学的な試薬の影響を決定するために、コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物のクラスターが得られ、そして増殖を誘導する増殖因子の存在下でインビトロで増殖させられる。一般的には、生物学的試薬が可溶化され、そしてそれぞれの用量での試薬の影響を決定するために、種々の濃度で培養培地に対して添加される。培養培地は、試薬の濃度をいくらか一定に維持するような量で、１日おきに生物学的試薬で補充され得る。
【００３７】
従って、移植の目的のために大量の細胞を生成するために有用な、先祖細胞の増殖能力を増大させる生物学的試薬をスクリーニングすることが可能である。コラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物を使用して、前駆細胞の増殖を阻害する生物学的試薬をスクリーニングすることもまた可能である。また、分化した神経細胞の数および性質をいくつかの他の方法において増大、減少、または改変するための種々の生物学的試薬の能力が、分化を誘導されているコラゲナーゼ処理された神経幹細胞培養物に対してスクリーニングされ得る。次いで、分化、および分化した神経細胞の生存に対する生物学的試薬または生物学的試薬の組合せの影響が、決定され得る。分化する前にコラゲナーゼ処理した神経幹細胞培養物に対してそれらを適用することによる分化のプロセスに対する生物学的試薬の影響を決定することもまた、可能である。
【００３８】
本発明の他の特徴、目的、および利点が、明細書および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲においては、単数形は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。他に特に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中で参考として援用されている全ての特許および刊行物が、参考として援用されている。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲を限定するようには、いかなる方法においても解釈されないはずである。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
（コラゲナーゼプロトコール）
１．Ｃａ++、Ｍｇ++を含有していないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で組織を数回リンスする。
２．ペトリディッシュ中で、交差させた解剖用メスを使用して組織を１〜２ｍｍの立方体の断片に切断する。組織（閉じ込めた容量 約７．５ｍｌ）およびＰＢＳ（約８８ｍｌ）を５０ｍｌの遠心分離チューブに注ぐ。組織を除去する必要がある場合にはＰＢＳでディッシュをリンスし、そして遠心分離チューブに移す。３．組織および遊離の細胞を沈殿させるために穏やかにチューブを遠心分離する（＜１０００ｒｐｍ）。
４．吸引系統を使用して注意深く上清を取り除く。
５．１．０ｇまでの組織に対して、１．０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有している、Ｃａ++、Ｍｇ++を含有していないＨＢＳＳ中の５．０ｍｌの０．１％のコラゲナーゼ、０．１％のヒアルロニダーゼを添加する。
６．時折軽く攪拌しながら１時間、３７℃の水浴中でインキュベートする。１時間の終わりに、約３秒間ボルテックスし、そして組織の解離の程度を評価する。完全な組織の大きな断片が残っている場合には、さらに３０〜４５分間３７℃でインキュベーションし続ける。大きな細胞の凝集物を完全に処理することを可能にするために、１〜２分間チューブを垂直に立てておく。新しいチューブ（１）に上清を移す。
７．ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡで新しいチューブ（１）の上部まで満たし、そして約９００ｒｐｍで６分間遠心分離する。上清（これは、破片で濁っているはずである）を新しい５０ｍｌの遠心分離チューブ（２）に取り出す。チューブ（１）および（２）を９００ｒｐｍで遠心分離する。
８．チューブ（１）から上清を廃棄し、そしてチューブ（２）に由来するペレットを細胞の生存性について試験する。価値がある場合には、チューブ（２）に由来するペレット化した細胞をチューブ（１）の内容物と混合する。チューブをＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡで満たし、そして６分間９００ｒｐｍで再度スピンさせる。終了すると上清を廃棄する。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、そしてトリパンブルーを用いて計数する。この段階で、細胞懸濁物は、比較的破片を含まないはずであり、そして主に健康な細胞から構成されるはずである。
【００４０】
（実施例２）
（コラゲナーゼの結果）
コラゲナーゼ処理は、コラゲナーゼ方法を使用して、生存可能な神経幹細胞の増大した数を提供した。細胞は、血球計数器上でトリパンブルーで計数する。生の数は、規定された面積中の生存している細胞の数である。
【００４１】
【表３】
コラゲナーゼ処理は、コラゲナーゼ方法を使用して、継時的に増大した数の増殖した神経幹細胞を提供した。
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
上記の記載は、説明の目的だけのためのに示され、そして開示される正確な形態に本発明を限定するようには意図されず、本明細書中に添付される特許請求の範囲によって限定するように意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２２７１２７（Ｐ２０１０−２２７１２７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６３４３８（Ｐ２０１０−１６３４３８）
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【分割の表示】特願２０００−６０１１３６（Ｐ２０００−６０１１３６）の分割
【原出願日】平成１２年２月２５日（２０００．２．２５）
【出願人】（５０１３２７００８）ステムセルズ， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【分割の表示】特願２０００−６０１１３６（Ｐ２０００−６０１１３６）の分割
【原出願日】平成１２年２月２５日（２０００．２．２５）
【出願人】（５０１３２７００８）ステムセルズ， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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