粒子保存容器、粒子の保存方法および生化学試料の検査方法
【課題】 本発明の目的は、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子保存容器および粒子の保存方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を提供することにある。
【解決手段】 先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、
前記突出部から連続して容器内部に向かって突き出した中心に先端開口部につながる孔を有する筒状突起を有することを特徴とする保存容器
また、本発明の別の目的は、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を提供することにある。
【解決手段】 先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、
前記突出部から連続して容器内部に向かって突き出した中心に先端開口部につながる孔を有する筒状突起を有することを特徴とする保存容器
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子保存容器、粒子の保存方法および生化学試料の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清，細胞破砕液，組織などの混合物の中から，糖鎖などの特定の生体分子を精製抽出する手段として，これらの分子と特異的に作用する固相担体を用いる方法がある。例えば，（特許文献１）には，ヒドラジド基含有ポリマービーズを用いて糖鎖を精製抽出する方法が記載されている。また，（非特許文献１）には，固相ビーズを用いてタンパク質を精製する方法が記載されている。
ところで、近年において、同時に複数のアッセイを行うためのマルチウェルタイプ、特に９６穴、３８４穴などのハイスループットタイプのマイクロタイタープレートなどが開発され、アッセイ技術の向上が図られている。また、糖鎖の精製抽出も、迅速化ならびに少量サンプルでの実施の要請から、このようなマイクロタイタープレートを用いて行うことが要望されるようになってきている。
そこで、特許文献１に記載されているような糖鎖捕捉物質を用いて、マイクロタイタープレートにて糖鎖の精製抽出を行う場合には、マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とする必要がある。このような用途では、糖鎖捕捉物質は通常微粒子の形態のものが使用され、一般的に微粒子は乾燥粉末の状態で提供されることが多い。
このような場合、各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とするために、使用するウェルの数だけ糖鎖捕捉物質の乾燥粉末を秤量して、ウェルごとに分散液を作製する方法がある。この場合、ミリグラムまたはマイクログラムのオーダーで秤量する必要があることから秤量誤差が無視できないという点、およびその秤量誤差が各ウェルについて発生する点、ならびにウェルの数が非常に多いハイスループットアッセイには秤量回数が非常に多くなるという点などから現実的なアプローチとは言えない。
一方で、秤量誤差をおよび秤量回数の低減の観点から、一度に大容量の分散液を作製し、その分散液をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注するという操作を行う方法が考えられる。しかしながら、ハイスループットアッセイにおいては、分注の回数が非常に多くなり、操作も煩雑になる。また、分注の操作中に分散液中で微粒子が沈殿し、分散液中で糖鎖捕捉物質の分布ができてしまうため、各ウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を導入することが困難であり、これが分注操作時の誤差となる。このような分注操作持の誤差は、各ウェルでのアッセイの評価を困難にし、特にスクリーニング用途でのマイクロタイタープレートでのアッセイでは望ましくない。
分散液の入った容器を振とう、あるいは、分散液をスターラー等で撹拌させながら、各ウェルへの分注操作を行うことにより、分注操作時の誤差を低減することは可能である。しかしながら、分注操作の回数を低減させることは困難であり、このような煩雑な操作は、分注操作を含めた全操作の自動化を実現することを困難にしている。
このため、マイクロタイタープレートを用いて同時に多くのアッセイを行うことが可能であったとしても、分注操作を含めた全操作の自動化が困難であることから、ハイスループットアッセイを行うことの利点が生かし切れていなかった。
そこで、本発明は、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないような、タブレットおよびその用途を提供するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】実験医学別冊 タンパク質実験ハンドブック ｐ．４７−５２ 羊土社（２００３年）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０００８３８公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子保存容器および粒子の保存方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記（１）〜（４）に記載の本発明により達成される。
（１）先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、前記容器本体の内部に、前記突出部から連続して基端側に突出した筒状突起部とを有することを特徴とする粒子保存容器。
（２）前記筒状突起部と、容器本体の内部との間隙に粒子を留置可能なものである（１）に記載の粒子保存容器。
（３）（１）記載の先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、前記突出部から連続して容器内部に向かって突き出した中心に先端開口部につながる孔を有する筒状突起を有する容器に、粒子を充填したことを特徴とする粒子の保存方法。
（４）（１）ないし（３）のいずれかに記載の粒子保存容器を用いることを特徴とする生化学試料の検査方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子保存容器および粒子の保存方法を得ることができる。
また、本発明によれば、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の粒子保存容器とそのの断面図である。
【図２】本発明の粒子保存容器を説明するための説明図である。
【図３】本発明の粒子保存容器を９６穴マイクロタイタープレートしたものの説明図である。
【図４】実施例、比較例のウシＩｇＧ由来糖鎖（２ＡＢラベル）のＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、
前記突出部から連続して容器内部に向かって突き出した中心に先端開口部につながる孔を有する筒状突起を有することを特徴とする
以下、本発明の粒子保存容器、粒子の保存方法および生化学試料の検査方法について説明する。
【００１０】
（粒子保存容器）
＜実施形態＞
まず、粒子保存容器について、図１に示す好適な実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００１１】
図１に示すように、筒状の容器本体１は、先端が開口した突出開口部１１１を有する先細り形状をなす突出部１１と、基端が開口した基端開口部１２とを有しており、さらに突出部１１から連続して容器本体１内部に突き出た、中心に突出開口部につながる孔を有する筒状突起物１３からなる（図１ｂ）。
これにより、粒子を基端開口部１２から充填し、容器本体底部と筒状突起物１３の上側開口部の間に粒子を保持することが可能である。この状態から、基端開口部１２より洗浄液を加えることにより、保持されていた粒子を、筒状突起物１３の上側開口部より突出開口部より洗浄液とともに回収することが可能である。
【００１２】
容器本体１の形状は、図１に示す実施形態では円筒状であるが、これに限定されず角筒状でも良いが、円筒状（より具体的にはチューブ状）であることが好ましい。このような容器本体１の幅は、特に限定されないが、幅０．５ｍｍ〜５０ｍｍが好ましく、より好ましくは１ｍｍ〜２０ｍｍであり、さらに好ましくは１．５ｍｍ〜１０ｍｍである。
また、長さ（突出部１１を含む全体の長さ）は２．５ｍｍ〜２００ｍｍが好ましく、より好ましくは５ｍｍ〜１００ｍｍであり、さらに好ましくは１０ｍｍ〜５０ｍｍである。容器本体１のサイズが前記範囲内であると、特に生体試料由来のサンプルのように少量のサンプルを扱う際サンプル損失を最小限に抑えることができるという点で優れる。
容器内部に突き出した筒状突起物１３の容器内部部分の長さは、その長さにより、保持できる粒子の量が制御可能であるが、容器本体から突き出てはその用を成さないため基端開口部より内側に存在する必要がある。そのためその長さは容器内部の長さの１／２〜１／１０が好ましく、より好ましくは１／３〜１／１０、さらに好ましくは１／５〜１／１０である。
【００１３】
突出開口部１１１の内径は、保存する粒子の大きさに依存して特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍが好ましく、特に０．２〜５ｍｍが好ましく、最も０．５〜３ｍｍが好ましい。突出開口部１１１の内径が前記範囲内であると、特に粒子の排出を効率良く実施することができる。
また、突出部１１の長さも特に限定されないが、１〜５０ｍｍが好ましく、特に２〜２５ｍｍが好ましく、最も３〜１５ｍｍが好ましい。突出部１１の長さが前記範囲内であると、微粒子の損失を最小限に抑えられる点に優れる。
【００１４】
容器本体１を構成する材料としては、例えばポリプロピレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。これらの中でもポリプロピレンが好ましい。これにより、耐溶剤性を向上することができる。
【００１５】
容器本体１は、透明、半透明、不透明でも構わないが、透明または半透明であることが好ましい。これにより、容器内の状態を確認することができる。
【００１６】
このような容器本体１は、例えば射出成形、切削加工等の方法により得ることができる。
【００１７】
本発明の粒子保存容器１は、上述したような容器本体で構成されているが、これに限定されない。
例えば、基端部が角筒状であり、突出部１１のみが筒状であっても良く、また、逆に基端部が筒状であって、突出部１１のみが角筒状であっても良い。
【００１８】
また、本発明の粒子保存容器１に保存する粒子には、シリカ粒子、高分子粒子、金粒子、セファロース粒子、アガロース粒子、セルロース粒子等が挙げられる。これらの粒子の中でも、表面に活性基としてアビジン、ビオチン、抗体、レクチン、カルボニル基、アミノ基、アミノオキシル基、ヒドラジド基、エステル基、マレイミド基およびチオール基のいずれか１種以上の活性基を有するものが好ましい。
より具体的には、レーザーイオン化飛行時間型時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等の前処理に使用する固相抽出に用いる粒子を保存することが好ましい。
【００１９】
前記粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、０．１〜５００μｍが好ましく、特に１０〜１５０μｍであることが好ましい。平均粒子径が前記範囲内であると、○に優れる。
前記平均粒子径は、例えば粒度分布測定装置を用いてで測定することができる。
【００２０】
実施形態で説明した粒子保存容器１は、例えば図３に示す、９６穴型マイクロプレートに適用可能なものであることが好ましい。これにより、作業性を特に向上することができる。
このように、粒子保存容器１を一体化（連結）させた場合、作業を効率良く進めるために個々の粒子保存容器１間の間隔が既存のディスペンサーに対応していることが好ましい。
【００２１】
（粒子の保存方法）
次に、粒子の保存方法について、詳細に説明する。
容器本体１の基端開口部１２より粒子を充填する（図２（ａ））。充填する粒子の充填量は、容器本体１のサイズに依存して特に限定されないが、容器内部の筒状突起物の上端を越える量を加えると内孔を通して流れ出るので必然的に筒状突起物上端を越えない量に制限される。これにより、生化学試料の検査を精度良く実施することができる。
なお、粒子は、予め保存液に分散した状態で容器本体１に充填した後、乾燥させることが好ましい。これにより、作業性を向上することができる。
乾燥の方法としては、加熱乾燥、自然乾燥または真空凍結乾燥等の方法が用いることができる。
【００２２】
前記保存液としては、例えば水、エタノール、メタノール等が挙げられる。これらの中でも水が好ましい。これにより、耐溶剤性の容器を使用する必要がなくなる。
【００２３】
そして、この粒子を使用する際には、溶液を容器本体内部に加え、乾燥状態にある粒子を再分散させて粒子分散液を作製し、さらに、内部の筒状突起物の上端より粒子分散液の界面を揚げることで内容物を、内孔を通して突出開口部より粒子を排出させることが可能となる。
【００２４】
これにより、上述した粒子保存容器１を用いた本発明の粒子の保存方法により、粒子を粒子保存容器１内に保存し、必要時に容易に使用することが可能となる。したがってハイスループット処理が可能な方式で、粒子を保存する方法を提供することができる。
さらに、上述した粒子保存容器１を用いた本発明の粒子の保存方法により一定量の粒子を反応容器に容易に導入することが可能となる。この際、従来問題となっていた粒子の損失を低減することが可能である。また、微粒子を封入する部分を複数個連結させることで、作業の効率化も図れる。
【００２５】
上述のように粒子の保存法について、粒子の乾燥状態での保存方法について説明したが、本発明はこれに限定されず、粒子５が保存液に分散された状態で粒子保存容器１の内部に保存されても良い。この場合は、突出部の内孔を液体が流れ出ないようにキャップをしたり、粘着フィルムで封止して分散液が流れださないようにすることが必要である。
【００２６】
（生化学試料の検査方法）
本発明の生化学試料の検査方法は、上述したような粒子保存容器１を用いることを特徴とするものである。
例えば、粒子保存容器１用いた上述の粒子の保存方法で保存した後、回収された粒子を、生体試料と反応させて、粒子に特定の生物由来物質等を固定する。次に、この特定の生物由来物質が固定された粒子に、標識化工程、余剰試薬除去工程等を実施し、固定化された生物由来物質を検査する。
本発明の生化学試料の検査方法では、上述したような粒子保存容器１を用いるので、粒子の損失を低減することができる。それによって、検査結果のバラツキを低減することができる。
このような生化学試料の検査方法を実施する場合、粒子５としてはポリマー粒子、金属粒子等を用いることが好ましい。
また、生体由来物質としては糖鎖、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質等を挙げることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
粒子保存容器の作製
縦幅３８ｍｍ、横幅８．２ｍｍ、下部開口部の形状は円形で直径２．２ｍｍ、突出部が２０ｍｍ、筒状突起物の容器内部の長さが６ｍｍである容器本体を原材料としてポリプロピレン樹脂（株式会社プライムポリマー製、Ｊ２３５Ｔ）を用いて射出成形にて作製した。
【００２９】
（２）微粒子の封入・保存
上述の粒子保存容器１０個の内部に、ヒドラジド基含有ビーズ分散液（ポリマー粒子、球状、０．１ｍｇ／ｕＬ、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）５０μＬを分注した。そのうちの５個を自然乾燥して使用し、残りの５個は凍結乾燥させ、使用した。
【００３０】
（３）微粒子の回収
続いて行う微粒子の反応に使用する新たな反応容器（フィルターカラム、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）を準備した。保存容器の下部開口部の真下にフィルターカラムが来るように設置した。保存容器上部から、ディスペンサーを用いて、超純水２００μL加え、粒子を浮かせて筒状突起物を通して、フィルターカラムに排出した。目視観察しながらさらに容器内に超純水２００μLを加え、容器内に残っている粒子をすべてフィルターカラムに排出させた。
最後に、フィルターカラムを遠心させフィルターカラム内に溜まった水を完全に排出させた。
【００３１】
（４）微粒子の性能確認
（Ａ）試料の作製
ウシ免疫グロブリンＧ（ウシＩｇＧ）１ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
【００３２】
（Ｂ）微粒子と生体試料の反応
予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させビーズ上のヒドラジド基に糖を固定させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にてビーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にてビーズを洗浄した。
ビーズの入ったディスポカラムに超純水２０μLおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１時間反応させビーズ上の糖鎖を切り出した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。
【００３３】
（Ｃ）標識化工程
ビーズの入ったディスポカラムに、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
【００３４】
（Ｄ）余剰試薬除去工程
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、付属のクリーンアップカラムに吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
【００３５】
（Ｅ）標識化糖鎖の検出
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミドカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０ ４．６＊２５０）を用いて励起波長３３０ ｎｍ、蛍光波長４２０ ｎｍにて測定した。溶媒Ａは５０ｍＭギ酸、２５％アンモニア水にてｐＨ４．４に調整したものを使用し、溶媒Ｂとしてアセトニトリルを使用し、溶媒Ａ液２０％ （０ｍｉｎ）→Ａ液５８％（１５８ｍｉｎ）で送液した。カラム温度は３０℃で流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００３６】
（比較例）
実施例と同様のヒドラジドビーズを用いて、保存容器内で保存する操作を行わないこと以外は実施例と同様にして標識化糖鎖の検出を行った。
【００３７】
実施例１及び比較例１により、本手法により保存したヒドラジドビーズを用いても、図４に示すように通常と同様の結果が得られることを確認した。
【符号の説明】
【００３８】
１ 容器本体
１１ 突出部
１１１ 突出開口部
１２ 基端開口部
１３ 筒状突起物
２ ディスペンサー
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の粒子保存容器は、抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズ等の微粒子を一定量任意の容器に保存するのに使用できる。また、他の反応容器に微粒子を移し替えも容易に可能であり、例えば、９６穴型マイクロプレートに対応した保存容器形状とすることで、ハイスループットに微粒子の移し替えが可能となる。保存容器から微粒子を排出させる方法が単純なため、ロボットによる自動処理にも対抗が可能である。また、一連の操作により微粒子の有する活性基等を破壊することもない。使用毎に量り取る手間や、ロスを心配することなく微粒子保存するのに適している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子保存容器、粒子の保存方法および生化学試料の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清，細胞破砕液，組織などの混合物の中から，糖鎖などの特定の生体分子を精製抽出する手段として，これらの分子と特異的に作用する固相担体を用いる方法がある。例えば，（特許文献１）には，ヒドラジド基含有ポリマービーズを用いて糖鎖を精製抽出する方法が記載されている。また，（非特許文献１）には，固相ビーズを用いてタンパク質を精製する方法が記載されている。
ところで、近年において、同時に複数のアッセイを行うためのマルチウェルタイプ、特に９６穴、３８４穴などのハイスループットタイプのマイクロタイタープレートなどが開発され、アッセイ技術の向上が図られている。また、糖鎖の精製抽出も、迅速化ならびに少量サンプルでの実施の要請から、このようなマイクロタイタープレートを用いて行うことが要望されるようになってきている。
そこで、特許文献１に記載されているような糖鎖捕捉物質を用いて、マイクロタイタープレートにて糖鎖の精製抽出を行う場合には、マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とする必要がある。このような用途では、糖鎖捕捉物質は通常微粒子の形態のものが使用され、一般的に微粒子は乾燥粉末の状態で提供されることが多い。
このような場合、各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とするために、使用するウェルの数だけ糖鎖捕捉物質の乾燥粉末を秤量して、ウェルごとに分散液を作製する方法がある。この場合、ミリグラムまたはマイクログラムのオーダーで秤量する必要があることから秤量誤差が無視できないという点、およびその秤量誤差が各ウェルについて発生する点、ならびにウェルの数が非常に多いハイスループットアッセイには秤量回数が非常に多くなるという点などから現実的なアプローチとは言えない。
一方で、秤量誤差をおよび秤量回数の低減の観点から、一度に大容量の分散液を作製し、その分散液をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注するという操作を行う方法が考えられる。しかしながら、ハイスループットアッセイにおいては、分注の回数が非常に多くなり、操作も煩雑になる。また、分注の操作中に分散液中で微粒子が沈殿し、分散液中で糖鎖捕捉物質の分布ができてしまうため、各ウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を導入することが困難であり、これが分注操作時の誤差となる。このような分注操作持の誤差は、各ウェルでのアッセイの評価を困難にし、特にスクリーニング用途でのマイクロタイタープレートでのアッセイでは望ましくない。
分散液の入った容器を振とう、あるいは、分散液をスターラー等で撹拌させながら、各ウェルへの分注操作を行うことにより、分注操作時の誤差を低減することは可能である。しかしながら、分注操作の回数を低減させることは困難であり、このような煩雑な操作は、分注操作を含めた全操作の自動化を実現することを困難にしている。
このため、マイクロタイタープレートを用いて同時に多くのアッセイを行うことが可能であったとしても、分注操作を含めた全操作の自動化が困難であることから、ハイスループットアッセイを行うことの利点が生かし切れていなかった。
そこで、本発明は、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないような、タブレットおよびその用途を提供するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】実験医学別冊 タンパク質実験ハンドブック ｐ．４７−５２ 羊土社（２００３年）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０００８３８公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子保存容器および粒子の保存方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記（１）〜（４）に記載の本発明により達成される。
（１）先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、前記容器本体の内部に、前記突出部から連続して基端側に突出した筒状突起部とを有することを特徴とする粒子保存容器。
（２）前記筒状突起部と、容器本体の内部との間隙に粒子を留置可能なものである（１）に記載の粒子保存容器。
（３）（１）記載の先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、前記突出部から連続して容器内部に向かって突き出した中心に先端開口部につながる孔を有する筒状突起を有する容器に、粒子を充填したことを特徴とする粒子の保存方法。
（４）（１）ないし（３）のいずれかに記載の粒子保存容器を用いることを特徴とする生化学試料の検査方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子保存容器および粒子の保存方法を得ることができる。
また、本発明によれば、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の粒子保存容器とそのの断面図である。
【図２】本発明の粒子保存容器を説明するための説明図である。
【図３】本発明の粒子保存容器を９６穴マイクロタイタープレートしたものの説明図である。
【図４】実施例、比較例のウシＩｇＧ由来糖鎖（２ＡＢラベル）のＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、
前記突出部から連続して容器内部に向かって突き出した中心に先端開口部につながる孔を有する筒状突起を有することを特徴とする
以下、本発明の粒子保存容器、粒子の保存方法および生化学試料の検査方法について説明する。
【００１０】
（粒子保存容器）
＜実施形態＞
まず、粒子保存容器について、図１に示す好適な実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００１１】
図１に示すように、筒状の容器本体１は、先端が開口した突出開口部１１１を有する先細り形状をなす突出部１１と、基端が開口した基端開口部１２とを有しており、さらに突出部１１から連続して容器本体１内部に突き出た、中心に突出開口部につながる孔を有する筒状突起物１３からなる（図１ｂ）。
これにより、粒子を基端開口部１２から充填し、容器本体底部と筒状突起物１３の上側開口部の間に粒子を保持することが可能である。この状態から、基端開口部１２より洗浄液を加えることにより、保持されていた粒子を、筒状突起物１３の上側開口部より突出開口部より洗浄液とともに回収することが可能である。
【００１２】
容器本体１の形状は、図１に示す実施形態では円筒状であるが、これに限定されず角筒状でも良いが、円筒状（より具体的にはチューブ状）であることが好ましい。このような容器本体１の幅は、特に限定されないが、幅０．５ｍｍ〜５０ｍｍが好ましく、より好ましくは１ｍｍ〜２０ｍｍであり、さらに好ましくは１．５ｍｍ〜１０ｍｍである。
また、長さ（突出部１１を含む全体の長さ）は２．５ｍｍ〜２００ｍｍが好ましく、より好ましくは５ｍｍ〜１００ｍｍであり、さらに好ましくは１０ｍｍ〜５０ｍｍである。容器本体１のサイズが前記範囲内であると、特に生体試料由来のサンプルのように少量のサンプルを扱う際サンプル損失を最小限に抑えることができるという点で優れる。
容器内部に突き出した筒状突起物１３の容器内部部分の長さは、その長さにより、保持できる粒子の量が制御可能であるが、容器本体から突き出てはその用を成さないため基端開口部より内側に存在する必要がある。そのためその長さは容器内部の長さの１／２〜１／１０が好ましく、より好ましくは１／３〜１／１０、さらに好ましくは１／５〜１／１０である。
【００１３】
突出開口部１１１の内径は、保存する粒子の大きさに依存して特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍが好ましく、特に０．２〜５ｍｍが好ましく、最も０．５〜３ｍｍが好ましい。突出開口部１１１の内径が前記範囲内であると、特に粒子の排出を効率良く実施することができる。
また、突出部１１の長さも特に限定されないが、１〜５０ｍｍが好ましく、特に２〜２５ｍｍが好ましく、最も３〜１５ｍｍが好ましい。突出部１１の長さが前記範囲内であると、微粒子の損失を最小限に抑えられる点に優れる。
【００１４】
容器本体１を構成する材料としては、例えばポリプロピレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。これらの中でもポリプロピレンが好ましい。これにより、耐溶剤性を向上することができる。
【００１５】
容器本体１は、透明、半透明、不透明でも構わないが、透明または半透明であることが好ましい。これにより、容器内の状態を確認することができる。
【００１６】
このような容器本体１は、例えば射出成形、切削加工等の方法により得ることができる。
【００１７】
本発明の粒子保存容器１は、上述したような容器本体で構成されているが、これに限定されない。
例えば、基端部が角筒状であり、突出部１１のみが筒状であっても良く、また、逆に基端部が筒状であって、突出部１１のみが角筒状であっても良い。
【００１８】
また、本発明の粒子保存容器１に保存する粒子には、シリカ粒子、高分子粒子、金粒子、セファロース粒子、アガロース粒子、セルロース粒子等が挙げられる。これらの粒子の中でも、表面に活性基としてアビジン、ビオチン、抗体、レクチン、カルボニル基、アミノ基、アミノオキシル基、ヒドラジド基、エステル基、マレイミド基およびチオール基のいずれか１種以上の活性基を有するものが好ましい。
より具体的には、レーザーイオン化飛行時間型時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等の前処理に使用する固相抽出に用いる粒子を保存することが好ましい。
【００１９】
前記粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、０．１〜５００μｍが好ましく、特に１０〜１５０μｍであることが好ましい。平均粒子径が前記範囲内であると、○に優れる。
前記平均粒子径は、例えば粒度分布測定装置を用いてで測定することができる。
【００２０】
実施形態で説明した粒子保存容器１は、例えば図３に示す、９６穴型マイクロプレートに適用可能なものであることが好ましい。これにより、作業性を特に向上することができる。
このように、粒子保存容器１を一体化（連結）させた場合、作業を効率良く進めるために個々の粒子保存容器１間の間隔が既存のディスペンサーに対応していることが好ましい。
【００２１】
（粒子の保存方法）
次に、粒子の保存方法について、詳細に説明する。
容器本体１の基端開口部１２より粒子を充填する（図２（ａ））。充填する粒子の充填量は、容器本体１のサイズに依存して特に限定されないが、容器内部の筒状突起物の上端を越える量を加えると内孔を通して流れ出るので必然的に筒状突起物上端を越えない量に制限される。これにより、生化学試料の検査を精度良く実施することができる。
なお、粒子は、予め保存液に分散した状態で容器本体１に充填した後、乾燥させることが好ましい。これにより、作業性を向上することができる。
乾燥の方法としては、加熱乾燥、自然乾燥または真空凍結乾燥等の方法が用いることができる。
【００２２】
前記保存液としては、例えば水、エタノール、メタノール等が挙げられる。これらの中でも水が好ましい。これにより、耐溶剤性の容器を使用する必要がなくなる。
【００２３】
そして、この粒子を使用する際には、溶液を容器本体内部に加え、乾燥状態にある粒子を再分散させて粒子分散液を作製し、さらに、内部の筒状突起物の上端より粒子分散液の界面を揚げることで内容物を、内孔を通して突出開口部より粒子を排出させることが可能となる。
【００２４】
これにより、上述した粒子保存容器１を用いた本発明の粒子の保存方法により、粒子を粒子保存容器１内に保存し、必要時に容易に使用することが可能となる。したがってハイスループット処理が可能な方式で、粒子を保存する方法を提供することができる。
さらに、上述した粒子保存容器１を用いた本発明の粒子の保存方法により一定量の粒子を反応容器に容易に導入することが可能となる。この際、従来問題となっていた粒子の損失を低減することが可能である。また、微粒子を封入する部分を複数個連結させることで、作業の効率化も図れる。
【００２５】
上述のように粒子の保存法について、粒子の乾燥状態での保存方法について説明したが、本発明はこれに限定されず、粒子５が保存液に分散された状態で粒子保存容器１の内部に保存されても良い。この場合は、突出部の内孔を液体が流れ出ないようにキャップをしたり、粘着フィルムで封止して分散液が流れださないようにすることが必要である。
【００２６】
（生化学試料の検査方法）
本発明の生化学試料の検査方法は、上述したような粒子保存容器１を用いることを特徴とするものである。
例えば、粒子保存容器１用いた上述の粒子の保存方法で保存した後、回収された粒子を、生体試料と反応させて、粒子に特定の生物由来物質等を固定する。次に、この特定の生物由来物質が固定された粒子に、標識化工程、余剰試薬除去工程等を実施し、固定化された生物由来物質を検査する。
本発明の生化学試料の検査方法では、上述したような粒子保存容器１を用いるので、粒子の損失を低減することができる。それによって、検査結果のバラツキを低減することができる。
このような生化学試料の検査方法を実施する場合、粒子５としてはポリマー粒子、金属粒子等を用いることが好ましい。
また、生体由来物質としては糖鎖、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質等を挙げることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
粒子保存容器の作製
縦幅３８ｍｍ、横幅８．２ｍｍ、下部開口部の形状は円形で直径２．２ｍｍ、突出部が２０ｍｍ、筒状突起物の容器内部の長さが６ｍｍである容器本体を原材料としてポリプロピレン樹脂（株式会社プライムポリマー製、Ｊ２３５Ｔ）を用いて射出成形にて作製した。
【００２９】
（２）微粒子の封入・保存
上述の粒子保存容器１０個の内部に、ヒドラジド基含有ビーズ分散液（ポリマー粒子、球状、０．１ｍｇ／ｕＬ、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）５０μＬを分注した。そのうちの５個を自然乾燥して使用し、残りの５個は凍結乾燥させ、使用した。
【００３０】
（３）微粒子の回収
続いて行う微粒子の反応に使用する新たな反応容器（フィルターカラム、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）を準備した。保存容器の下部開口部の真下にフィルターカラムが来るように設置した。保存容器上部から、ディスペンサーを用いて、超純水２００μL加え、粒子を浮かせて筒状突起物を通して、フィルターカラムに排出した。目視観察しながらさらに容器内に超純水２００μLを加え、容器内に残っている粒子をすべてフィルターカラムに排出させた。
最後に、フィルターカラムを遠心させフィルターカラム内に溜まった水を完全に排出させた。
【００３１】
（４）微粒子の性能確認
（Ａ）試料の作製
ウシ免疫グロブリンＧ（ウシＩｇＧ）１ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
【００３２】
（Ｂ）微粒子と生体試料の反応
予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させビーズ上のヒドラジド基に糖を固定させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にてビーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にてビーズを洗浄した。
ビーズの入ったディスポカラムに超純水２０μLおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１時間反応させビーズ上の糖鎖を切り出した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。
【００３３】
（Ｃ）標識化工程
ビーズの入ったディスポカラムに、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
【００３４】
（Ｄ）余剰試薬除去工程
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、付属のクリーンアップカラムに吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
【００３５】
（Ｅ）標識化糖鎖の検出
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミドカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０ ４．６＊２５０）を用いて励起波長３３０ ｎｍ、蛍光波長４２０ ｎｍにて測定した。溶媒Ａは５０ｍＭギ酸、２５％アンモニア水にてｐＨ４．４に調整したものを使用し、溶媒Ｂとしてアセトニトリルを使用し、溶媒Ａ液２０％ （０ｍｉｎ）→Ａ液５８％（１５８ｍｉｎ）で送液した。カラム温度は３０℃で流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００３６】
（比較例）
実施例と同様のヒドラジドビーズを用いて、保存容器内で保存する操作を行わないこと以外は実施例と同様にして標識化糖鎖の検出を行った。
【００３７】
実施例１及び比較例１により、本手法により保存したヒドラジドビーズを用いても、図４に示すように通常と同様の結果が得られることを確認した。
【符号の説明】
【００３８】
１ 容器本体
１１ 突出部
１１１ 突出開口部
１２ 基端開口部
１３ 筒状突起物
２ ディスペンサー
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の粒子保存容器は、抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズ等の微粒子を一定量任意の容器に保存するのに使用できる。また、他の反応容器に微粒子を移し替えも容易に可能であり、例えば、９６穴型マイクロプレートに対応した保存容器形状とすることで、ハイスループットに微粒子の移し替えが可能となる。保存容器から微粒子を排出させる方法が単純なため、ロボットによる自動処理にも対抗が可能である。また、一連の操作により微粒子の有する活性基等を破壊することもない。使用毎に量り取る手間や、ロスを心配することなく微粒子保存するのに適している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、
前記容器本体の内部に、前記突出部から連続して基端側に突出した筒状突起部とを有することを特徴とする粒子保存容器。
【請求項２】
前記筒状突起部と、容器本体の内部との間隙に粒子を留置可能なものである請求項１に記載の粒子保存容器。
【請求項３】
請求項１記載の粒子保存容器に、粒子を充填したことを特徴とする粒子の保存方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の粒子保存容器を用いることを特徴とする生化学試料の検査方法。
【請求項１】
先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に粒子を保存する筒状の容器本体と、
前記容器本体の内部に、前記突出部から連続して基端側に突出した筒状突起部とを有することを特徴とする粒子保存容器。
【請求項２】
前記筒状突起部と、容器本体の内部との間隙に粒子を留置可能なものである請求項１に記載の粒子保存容器。
【請求項３】
請求項１記載の粒子保存容器に、粒子を充填したことを特徴とする粒子の保存方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の粒子保存容器を用いることを特徴とする生化学試料の検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−８０８６４（Ｐ２０１１−８０８６４Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３３４５２（Ｐ２００９−２３３４５２）
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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