精子懸濁液の製造方法および濾過カラム
【課題】ＨＩＶを含有する精子懸濁液より、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る手段を提供すること。
【解決手段】膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムを用いて濾過を行うことを特徴とする。
【解決手段】膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムを用いて濾過を行うことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において、ＨＩＶを含有する精子懸濁液より、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不治の病として恐れられてきた後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）の生命予後は、抗エイズ薬の進歩により著しく改善され、いまやコントロール可能な疾患ととらえられるようになった。このような状況のなかで、ヒト免疫不全ウィルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）感染者のカップルが子供を望むケースが増加している。夫がＨＩＶ陽性で妻がＨＩＶ陰性のカップルにおいて、ＨＩＶ感染の危険性を可能なかぎり減少させて妊娠を成立させる方法が試みられている。花房はｐｅｒｃｏｌｌｓｗｉｍ−ｕｐ法と呼ばれる精子洗浄法について報告している（非特許文献１）。該方法は、等量のハンクス緩衝塩類溶液で希釈した精液を多段ｐｅｒｃｏｌｌ液に重層し、４００ｘ ｇ、３０分の遠心分離を行った後にＨＩＶを含む上層を除去する。次に、８０％ｐｅｒｃｏｌｌ液と沈渣の精子にＨＴＦ（ｈｕｍａｎ ｔｕｂａｌ ｆｌｕｉｄ）培地を重層し、３７℃で６０分培養し、浮遊する精子を回収するという方法である。この方法で回収された精子浮遊液はＨＩＶの混入が少ないことが報告されているが、精子回収率が低いという欠点がある。さらには、ＨＩＶを含むｐｅｒｃｏｌｌ層の分離度は操作者の技術に依存しており、安定した精子分離には高度な技術を必要とする。
【０００３】
特開平６−２６９６４５号公報（特許文献１）には多孔性の精密濾過膜を用いたウィルス分離例が記載されている。特許文献１には、ひとつの面の孔の大きさが他の面の孔の大きさの２倍以上であり、孔径分布の極大値が０．０１μｍから１０μｍの間に２つ有することを特徴とする分離膜が記述されており、ウィルス分離に対する信頼性の向上と処理速度の向上が得られたことが報告されている。膜を用いた濾過法は、ＨＩＶなどの病原性を有するウィルスを取扱うにあたり、密閉系で操作できる点、ウィルス除去率が高い点、分離速度が速く、操作に特別な技術を要しない点など、多くの利点がある。特許文献１に記載のウィルス分離の原理は、ウィルスを通過させない孔径を有する膜による除去であり、回収すべき対象が膜による濾過液中に存在する場合にのみ有効である。すなわち、ウィルスを含有する精子懸濁液からのウィルス除去に該発明の膜を用いることはできない。なぜならウィルスを通過させない孔径を有する膜を用いて精子懸濁液を処理しても、回収すべき精子とウィルスは常に膜の同じ側に留まることになり、ウィルス除去という目的を果たせないからである。
【特許文献１】特開平６−２６９６４５号公報
【非特許文献１】Ｈｉｄｅｊｉ Ｈａｎａｂｕｓａ， Ｎａｏａｋｉ Ｋｕｊｉ， Ｓｈｉｎｇｏ Ｋａｔｏ， Ｈｉｓａｍｉｃｈｉ Ｔａｇａｍｉ， Ｓａｔｏｒｕ Ｋａｎｅｋｏ， Ｈｉｒｏａｋｉ Ｔａｎａｋａ ａｎｄ Ｙａｓｕｎｏｒｉ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ“Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｍｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ＨＩＶ−１” ＡＩＤＳ ２０００，１４：１６１１−１６１６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、ＨＩＶ含有精子懸濁液から、簡便、高い精子回収率、かつ、高いＨＩＶ除去能を有するＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等はかかる状況に鑑み、高い精子回収率を有し、簡便で、ＨＩＶ除去能の高いＨＩＶ含有精子懸濁液からＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る方法を鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
（１）膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムにＨＩＶを含む精子懸濁液を導入して、生理的溶液による希釈と前記中空糸膜による濾過を行うことによって、前記精子懸濁液中のＨＩＶを濾液に排出して精子懸濁液中のＨＩＶを除去することを特徴とする、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
（２）前記ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液のＨＩＶ−ＲＮＡコピー数が、１ｍＬ当たり５０コピー以下であることを特徴とする（１）記載のＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
（３）円筒形のシリンダーに膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜が充填されており、
該シリンダー内の空間は該中空糸膜によって精子懸濁液と生理的溶液の出入口に連通する中空糸膜外側空間及び濾過液の出口に連通する中空糸膜内側空間の２つの空間に分割され、
前記濾過液の出口は注射筒が接続可能な構造であり、
前記精子懸濁液と生理的溶液の出入口は注射針又は活栓が接続可能な構造である、
精子懸濁液の濾過カラム。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムにＨＩＶを含む精子懸濁液を導入して、該精子懸濁液の生理的溶液による希釈と前記中空糸膜による濾過を行うことによって、簡便かつ高い精子回収率で、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を製造することができる。
【本発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明に係る方法を具体的に説明する。
従来のＨＩＶ含有精液からのＨＩＶ除去方法が、開放系の操作であり、操作中の感染リスクを無視できず、かつ精子回収率が操作者の技術に大きく依存する方法であるのに対し、本発明によれば、閉鎖系のカラムにより感染リスクが少なく、特別な技術を必要としない、誰にでも安定かつ簡便な精子の回収が可能である。本発明でいう精子懸濁液は、精液を後述の生理的溶液で希釈することによって得られる。生理的溶液の温度は４〜３７℃の範囲であることが一般的だが、特に制限はない。希釈倍率に特に限定はないが、通常は２倍から２０倍程度の希釈が用いられる。希釈を行った後、精子懸濁液を得るための方法に特に制限はないが、一例を挙げれば、蓋付きの遠心管チューブの中などで穏やかな転倒混和を２〜３回行うことで均一な精子懸濁液を得ることができる。精子懸濁液を調製後、速やかにウィルス分離することが望ましいが、４時間程度であれば、問題ない。
【０００８】
本発明で使用される生理的溶液とは、体液とほぼ等張な塩化ナトリウム濃度（０．９％）を含む溶液をいい、生理的食塩水、ハンクス緩衝塩類溶液、ＨＴＳ培地、ＨＴＦ培地その他の培地等をいう。
【０００９】
本発明でいう膜孔径は、米国試験・材料協会規格（ＡＳＴＭ−Ｆ３１６）に記載されたパームポロメータを用いて算出されるバブルポイント法による中空糸膜の平均孔径を意味する。HIVの大きさが０．１μm、ヒト精子の大きさが頭部と尾部をあわせた長さが６０μm、頭部の短径が２．５μmであることから、ＨＩＶは通過させるが、ヒト精子は通過させない中空糸膜の膜孔径の範囲は０．１μｍ〜２．０μｍであることが必要である。孔径が０．１μｍより小さくなるとＨＩＶが精子懸濁液から中空糸膜を通過しないリスクが高くなるため好ましくない。また、孔径が２．０μｍより大きくなると、懸濁液中の精子が中空糸膜を通過するため精子回収率が低下するため好ましくない。０．１μｍ〜１．０μｍであることがより好ましく、０．３μｍ〜０．５μｍであることが最も好ましい。
【００１０】
本発明に用いられる中空糸膜の材質は特に限定されないが、血液処理用途に用いられる公知の材質であれば、例えばポリエチレンやポリプロピレンを基材とし、親水性を得るためにエチレン‐ビニルアルコール共重合体などの親水性高分子を有したポリオレフィン系膜、ポリスルホンを基材とし、親水性を得るためにポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子を有したポリスルホン系膜、あるいはポリメチルメタクリレート膜、ポリアクリロニトリル膜を用いることができる。なかでも、エチレン‐ビニルアルコール共重合体を被覆させた親水性ポリエチレン膜は、本発明で用いるための好ましい具体例として挙げられる。
【００１１】
本発明で用いる中空糸膜の形状、寸法等は特に限定されるものではなく、内径は１００μｍ〜３００μｍ、好ましくは１５０μｍ〜２５０μｍ、膜厚は１０μｍ〜１５０μｍ、好ましくは２０μｍ〜１００μｍ、長さは１ｃｍ〜２０ｃｍ、好ましくは２ｃｍ〜１０ｃｍのものが好適に用いられる。
【００１２】
上記した中空糸膜を精子懸濁液濾過カラムとして使用する場合には、本発明の中空糸膜を充填したカラムは、中空糸束をＵ字型に折り曲げ、両端をポッティングして市販カラム（例えば２．５ｍＬラボラトリーカラムＭｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社製）に固定して作製しても良いし、市販の注射筒を利用して作製することも可能である。中空糸束をＵ字型に折り曲げ、両端をポッティングする代わりに一方の末端を接着剤やヒートシーラー等を用いて封止し、もう一方の末端をポッティングしてカラムを作製することも可能である。カラムの形状は特に限定されないが、作製のしやすさから円筒状のカラムが好適である。カラムの容量は特に限定されないが１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜１０ｍＬのものが好適に用いられる。本発明の中空糸膜を充填したカラムは、必要に応じて滅菌処理を行う。滅菌方法は公知の方法から選択すればよく、例えば乾燥状態でエチレンオキサイド、高圧蒸気、放射線滅菌、あるいはカラム内に水を充填して高圧蒸気、放射線照射等の処理を行えばよい。
【００１３】
本発明のカラムに接続する注射針は、特に限定はないが、吸引の際に精子に物理的なダメージを与えないことが重要であり、１８ゲージ以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明のカラムに接続する活栓は、医療分野で薬液の輸注や採血で使用されるディスポーザブルのルアーロック式二方活栓や三方活栓などが好適に用いられる。
【００１５】
本発明でいうＨＩＶを実質的に含まないとは、精子懸濁液中のＨＩＶ−ＲＮＡ量がＥＵ基準である５０コピー／ｍＬ以下であることを言い、より好ましくは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法において、検出限界以下であることを言う。ＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は、市販の定量標準ＲＮＡを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲキットを用いることによって算出することができる。本発明の方法によれば、２０倍の希釈濾過洗浄操作を４回以上、より好ましくは５回以上繰り返すことにより、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得ることができる。
非特許文献１には、ＨＩＶ陽性男性１２人の精液中のＨＩＶ−ＲＮＡ量が記載されており、最も濃度の低い例で５０コピー／ｍＬ精液以下、最も濃度の高い例で３００００コピー／ｍＬであったことが記載されている。ヒトの平均精液量はおよそ３ｍＬであることから、除去すべきＨＩＶ−ＲＮＡ量の目安は、１０００００コピー／精液と考えられる。
本発明による中空糸膜は、ＨＩＶを通過させる孔径を有するため、１回の操作で２０倍希釈する希釈濾過操作によりＨＩＶ−ＲＮＡ量は約１／２０になる。本発明の方法により４回の希釈濾過を繰り返すと、ＨＩＶ−ＲＮＡ量は約１／１６００００になるから、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得ることができる。さらに希釈濾過を繰り返すことにより、回収精子懸濁液中のＨＩＶ混入のリスクを低減することが可能である。
【００１６】
精子の回収率は血球計算板を用いた顕微鏡観察や自動血球計数機など通常の細胞計数の方法を用いて、濾過前の全精子数に対する濾過後の回収精子数の比率を算出することによって求められる。ＨＩＶ除去能は濾過前の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量をａ、濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量をｂとするとき、{（ａ − ｂ）／ａ } ×１００で示され、ＨＩＶ量は定量ＲＴ−ＰＣＲ法によって容易に求められる。
【００１７】
以下、本発明の使用方法を図を参照しながら説明する。
用手法によりＨＩＶ陽性者精液を５０ｍＬ蓋付の遠心管に採取し、１０ｍＬのＨＴＳ培地を加えて精液を希釈し、転倒混和によって均一な精子懸濁液を準備する。
図１のカラムの入口側栓７を外し、ハウジング４からポート３を開放して、充填されている注射用水を廃液する。ポート３をハウジング４に再び装着し、出入口６に注射針９を取り付ける。注射針の代わりに活栓を接続してもよいし、注射針と活栓の両者を接続しても良い。出口側栓１を外して注射筒８を取り付ける。注射針９よりＨＴＳ培地を吸い上げて、中空糸膜内部に残っている注射用水をＨＴＳ培地に置換する。
注射筒８で注射針９より精子懸濁液を吸引し、ＨＩＶを含む精子懸濁液を濾過する。
新しい遠心管に新鮮なＨＴＳ培地を加え、注射針９より注射筒８にて吸引し、ＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過する。注射針の代わりに活栓、または注射針と活栓の両者を接続する場合は、活栓を開状態にして吸引する。遠心管に新鮮なＨＴＳ培地を加えてから、注射針９より注射筒８にて吸引し、ＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過するまでの操作を更に３〜４回繰り返すことにより、ウィルス粒子を実質的に含まない精子懸濁液を得ることができる。カラム内の精子の回収は以下の要領で行うことができる。
まず注射筒８を濾過液の出口２から取り外し、あらかじめ新鮮なＨＴＳ培地の入った清浄な注射筒を接続する。注射筒のプランジャーを押し、ＨＴＳ培地を中空糸膜内に導入することにより、カラム内の精子を回収する。
［実施例］
【００１８】
本発明を次に実施例及び比較例によって説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（１）最初に、図１に示す構成で精子懸濁液の濾過カラムの作製方法について説明する。内径３３０μｍ、膜厚５０μｍ、平均孔径０．３μｍ、全長１２ｃｍのポリエチレン製中空糸膜に親水化剤としてポリエチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆した中空糸膜を用い、該中空糸膜を２０本束ねて、束を中央でＵ字型に曲げ両端を１つに束ね、予め４０℃で一昼夜脱泡したポリウレタン系接着剤を用いて内径５ｍｍ、外径７ｍｍ、全長１．５ｃｍのポリエチレン製チューブに中空糸膜端部を挿入し固定した。ポリウレタンを硬化させるため該中空糸膜を挿入したチューブを一昼夜４０℃で加熱した後、ポリエチレン製チューブの端部を１ｃｍ程度切断し、中空糸膜端部を開口させた。該チューブ側面をシアノアクリレート樹脂系瞬間接着剤（東亜合成株式会社製）を用いて２．５ｍＬラボラトリーカラム（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社製）ポート３の内側に固定し、該中空糸膜部分を７０ｗｔ％エタノールに浸漬、注射用水に置換した後、２．５ｍＬラボラトリーカラムのハウジング４に中空糸膜部分を傷つけないよう挿入し、該ポート３を回してロックした。入口６に１６ゲージニードル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩEＳ ＩＮＣ社製）、出口２に一般汎用注射筒（１０ｍＬ）（株式会社テルモ製）を取り付けてカラム内に注射用水を充填し、該カラムの入口６側を上に向け、入口６側の１６ゲージニードルを取り外し入口側栓７で密栓し、該カラムの入口６側を下に向け、汎用注射筒（１０ｍＬ）を取り外し出口側栓１で密栓した。該カラムをγ線滅菌（２５ｋＧｙ）し、精子懸濁液の濾過カラム図１を作製した。カラムあたりの有効膜面積は１７ｃｍ２であった。
（２）次に、図１の該カラム内に充填された注射用液を廃液し、中空糸膜内を注射用液からＨＴＳ培地に置換する操作方法について説明する。なお、この操作は安全キャビネット内で行う。図１の該カラムの入口側栓７を外しハウジング４からポート３を開放して、充填されていた注射用水を廃液した。ポート３をハウジング４に装着し、入口に図２の１６ゲージニードル９を取り付け、出口側栓１を外して汎用注射筒（１０ｍＬ）８を取り付けた。１６ゲージニードル９よりＨＴＳ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を吸い上げて、中空糸膜内部を注射用水からＨＴＳ培地に置換した。
（３）次に、該カラムのＨＩＶ除去率を評価するための精子懸濁液の作製について説明する。健常者精液（精子濃度２０００万／ｍＬ以上）３ｍＬにＨＴＳ培地７ｍＬを添加し精子懸濁液を調製し、更にＨＩＶ（５×１０６コピー）を添加してＨＩＶ含有精子懸濁液を作製した。
（４）次に、該カラムを使用して精子懸濁液中のＨＩＶ濾過方法について説明する。なお、この操作は安全キャビネット内で行った。精子懸濁液１０ｍＬをファルコンチューブ（５０ｍＬ）に加えた。該カラム先端の１６ゲージニードル９を該ファルコンチューブ（５０ｍＬ）内に挿入し、汎用注射筒（１０ｍＬ）で精子懸濁液を吸引してＨＩＶ含有精子懸濁液を濾過した。新たに該カラムのファルコンチューブ（５０ｍＬ）にＨＴＳ培地１０ｍＬを加え、汎用注射筒（１０ｍＬ）でＨＴＳ培地を吸引してＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過した。該ファルコンチューブ（５０ｍＬ）にＨＴＳ培地１０ｍＬを加えてから、汎用注射筒（１０ｍＬ）でＨＴＳ培地を吸引してＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過するまでの操作をさらに４回繰り返した。該カラム出口にＨＴＳ培地５ｍＬを内蔵した新しい汎用注射筒（１０ｍＬ）を接続し、汎用注射筒（１０ｍＬ）から該カラム内にＨＴＳ培地５ｍＬを排出して、精子を回収した。
（５）次に、該カラムにおける精子懸濁液中のＨＩＶ除去率の求め方を説明する。
ＨＩＶ量の測定には、アンプリコアＨＩＶ−１モニターキット（日本ロッシュ社製）を使用し、以下のように行った。精子懸濁液５００μＬを２〜８℃、２３，６００ ｘ ｇで１時間遠心し、上清除去した沈渣を核酸抽出に用いた。キット添付の方法に従って、逆転写反応によるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成とＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅後、増幅ＤＮＡの希釈系列の作成とＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーション反応を行い、酵素作用による発色反応を行ってＤＮＡ量を定量した。
ＨＩＶ除去率（％）は以下の式により算出した。
ＨＩＶ除去率（％）＝{（ａ−ｂ）／ａ } ×１００
ａ：濾過前の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量
ｂ：濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量
（６）次に、該カラムにおける精子懸濁液中からの精子回収率の求め方を説明する。
精子濃度測定には、マクラー氏精子算定盤を使用し、以下の式により精子回収率（％）を算出した。
精子回収率（％）＝｛（ｂ×ｄ）／（ａ×ｃ）｝ ×１００
ａ：濾過前の精子懸濁液の精子濃度［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］
ｂ：濾過後の精子懸濁液の精子濃度［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］
ｃ：濾過前の精子懸濁液量［ｍＬ］
ｄ：回収した精子懸濁液量［ｍＬ］
（７）健常者３名から提供された精液を用いて、（３）〜（４）に示した操作方法によりＨＩＶの濾過を行った。その結果を表１に示す。濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡはいずれも検出限界（５０コピー／ｍＬ）以下でありＨＩＶ除去率は９９．９９％以上、精子回収率は８１％であった。
【００２０】
【表１】
【比較例１】
【００２１】
図１に示す精子懸濁液中のＨＩＶを濾過するカラムにおいて、内径１７５μｍ、膜厚４０μｍ、平均孔径０．０３μｍ、ポリエチレン−ビニルアルコール共重合体製中空糸膜を用いたこと以外は実施例１と同様に作製した。健常者精液３ｍＬにＨＩＶ（５×１０６コピー）を含む培地７ｍＬを加えた精子懸濁液を使用して、濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量及び精子回収率を測定したところ、ＨＩＶ除去率は０％、精子回収率は８０％であった。
【比較例２】
【００２２】
図１に示す精子懸濁液中のＨＩＶを濾過するカラムにおいて、内径３ｍｍ、膜厚１ｍｍ、平均孔径２．５μｍ、ポリスルホン製中空糸膜に親水化剤としてポリエチレンビニルアルコールを被覆した中空糸膜を用い、該中空糸膜１本の一方の端部をヒートシーラーを使用して封止し、他方の端部を５．０ｍＬラボラトリーカラム（ＭｏＢｉ Ｔｅｃ社製）ポートの内側にポリウレタン系接着剤を用いて直接固定したこと以外は、実施例１と同様に作製した。健常者精液３ｍＬにＨＩＶ（５×１０６コピー）を含む培地７ｍＬを加えた精子懸濁液を使用して、濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ及び精子回収率を測定したところ、ＨＩＶ除去率は９９．９９％、精子回収率は６２％であった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明に係るＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法及び精子懸濁液の濾過カラムは、ＨＩＶを含む精液から簡便かつ確実にＨＩＶを除去し、しかも精子の回収率が高いので、ＨＩＶ陽性男性が精液提供者である人工授精や体外受精に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の精子懸濁液の濾過カラムの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の精子懸濁液の濾過カラムに注射筒と注射針を接続した例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００２５】
１ 出口側栓
２ 濾過液の出口
３ ポート
４ ハウジング
５ 中空糸膜
６ 精子懸濁液と生理的溶液の出入口
７ 入口側栓
８ 注射筒
９ 注射針
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において、ＨＩＶを含有する精子懸濁液より、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不治の病として恐れられてきた後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）の生命予後は、抗エイズ薬の進歩により著しく改善され、いまやコントロール可能な疾患ととらえられるようになった。このような状況のなかで、ヒト免疫不全ウィルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）感染者のカップルが子供を望むケースが増加している。夫がＨＩＶ陽性で妻がＨＩＶ陰性のカップルにおいて、ＨＩＶ感染の危険性を可能なかぎり減少させて妊娠を成立させる方法が試みられている。花房はｐｅｒｃｏｌｌｓｗｉｍ−ｕｐ法と呼ばれる精子洗浄法について報告している（非特許文献１）。該方法は、等量のハンクス緩衝塩類溶液で希釈した精液を多段ｐｅｒｃｏｌｌ液に重層し、４００ｘ ｇ、３０分の遠心分離を行った後にＨＩＶを含む上層を除去する。次に、８０％ｐｅｒｃｏｌｌ液と沈渣の精子にＨＴＦ（ｈｕｍａｎ ｔｕｂａｌ ｆｌｕｉｄ）培地を重層し、３７℃で６０分培養し、浮遊する精子を回収するという方法である。この方法で回収された精子浮遊液はＨＩＶの混入が少ないことが報告されているが、精子回収率が低いという欠点がある。さらには、ＨＩＶを含むｐｅｒｃｏｌｌ層の分離度は操作者の技術に依存しており、安定した精子分離には高度な技術を必要とする。
【０００３】
特開平６−２６９６４５号公報（特許文献１）には多孔性の精密濾過膜を用いたウィルス分離例が記載されている。特許文献１には、ひとつの面の孔の大きさが他の面の孔の大きさの２倍以上であり、孔径分布の極大値が０．０１μｍから１０μｍの間に２つ有することを特徴とする分離膜が記述されており、ウィルス分離に対する信頼性の向上と処理速度の向上が得られたことが報告されている。膜を用いた濾過法は、ＨＩＶなどの病原性を有するウィルスを取扱うにあたり、密閉系で操作できる点、ウィルス除去率が高い点、分離速度が速く、操作に特別な技術を要しない点など、多くの利点がある。特許文献１に記載のウィルス分離の原理は、ウィルスを通過させない孔径を有する膜による除去であり、回収すべき対象が膜による濾過液中に存在する場合にのみ有効である。すなわち、ウィルスを含有する精子懸濁液からのウィルス除去に該発明の膜を用いることはできない。なぜならウィルスを通過させない孔径を有する膜を用いて精子懸濁液を処理しても、回収すべき精子とウィルスは常に膜の同じ側に留まることになり、ウィルス除去という目的を果たせないからである。
【特許文献１】特開平６−２６９６４５号公報
【非特許文献１】Ｈｉｄｅｊｉ Ｈａｎａｂｕｓａ， Ｎａｏａｋｉ Ｋｕｊｉ， Ｓｈｉｎｇｏ Ｋａｔｏ， Ｈｉｓａｍｉｃｈｉ Ｔａｇａｍｉ， Ｓａｔｏｒｕ Ｋａｎｅｋｏ， Ｈｉｒｏａｋｉ Ｔａｎａｋａ ａｎｄ Ｙａｓｕｎｏｒｉ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ“Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｍｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ＨＩＶ−１” ＡＩＤＳ ２０００，１４：１６１１−１６１６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、ＨＩＶ含有精子懸濁液から、簡便、高い精子回収率、かつ、高いＨＩＶ除去能を有するＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等はかかる状況に鑑み、高い精子回収率を有し、簡便で、ＨＩＶ除去能の高いＨＩＶ含有精子懸濁液からＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得る方法を鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
（１）膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムにＨＩＶを含む精子懸濁液を導入して、生理的溶液による希釈と前記中空糸膜による濾過を行うことによって、前記精子懸濁液中のＨＩＶを濾液に排出して精子懸濁液中のＨＩＶを除去することを特徴とする、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
（２）前記ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液のＨＩＶ−ＲＮＡコピー数が、１ｍＬ当たり５０コピー以下であることを特徴とする（１）記載のＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
（３）円筒形のシリンダーに膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜が充填されており、
該シリンダー内の空間は該中空糸膜によって精子懸濁液と生理的溶液の出入口に連通する中空糸膜外側空間及び濾過液の出口に連通する中空糸膜内側空間の２つの空間に分割され、
前記濾過液の出口は注射筒が接続可能な構造であり、
前記精子懸濁液と生理的溶液の出入口は注射針又は活栓が接続可能な構造である、
精子懸濁液の濾過カラム。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムにＨＩＶを含む精子懸濁液を導入して、該精子懸濁液の生理的溶液による希釈と前記中空糸膜による濾過を行うことによって、簡便かつ高い精子回収率で、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を製造することができる。
【本発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明に係る方法を具体的に説明する。
従来のＨＩＶ含有精液からのＨＩＶ除去方法が、開放系の操作であり、操作中の感染リスクを無視できず、かつ精子回収率が操作者の技術に大きく依存する方法であるのに対し、本発明によれば、閉鎖系のカラムにより感染リスクが少なく、特別な技術を必要としない、誰にでも安定かつ簡便な精子の回収が可能である。本発明でいう精子懸濁液は、精液を後述の生理的溶液で希釈することによって得られる。生理的溶液の温度は４〜３７℃の範囲であることが一般的だが、特に制限はない。希釈倍率に特に限定はないが、通常は２倍から２０倍程度の希釈が用いられる。希釈を行った後、精子懸濁液を得るための方法に特に制限はないが、一例を挙げれば、蓋付きの遠心管チューブの中などで穏やかな転倒混和を２〜３回行うことで均一な精子懸濁液を得ることができる。精子懸濁液を調製後、速やかにウィルス分離することが望ましいが、４時間程度であれば、問題ない。
【０００８】
本発明で使用される生理的溶液とは、体液とほぼ等張な塩化ナトリウム濃度（０．９％）を含む溶液をいい、生理的食塩水、ハンクス緩衝塩類溶液、ＨＴＳ培地、ＨＴＦ培地その他の培地等をいう。
【０００９】
本発明でいう膜孔径は、米国試験・材料協会規格（ＡＳＴＭ−Ｆ３１６）に記載されたパームポロメータを用いて算出されるバブルポイント法による中空糸膜の平均孔径を意味する。HIVの大きさが０．１μm、ヒト精子の大きさが頭部と尾部をあわせた長さが６０μm、頭部の短径が２．５μmであることから、ＨＩＶは通過させるが、ヒト精子は通過させない中空糸膜の膜孔径の範囲は０．１μｍ〜２．０μｍであることが必要である。孔径が０．１μｍより小さくなるとＨＩＶが精子懸濁液から中空糸膜を通過しないリスクが高くなるため好ましくない。また、孔径が２．０μｍより大きくなると、懸濁液中の精子が中空糸膜を通過するため精子回収率が低下するため好ましくない。０．１μｍ〜１．０μｍであることがより好ましく、０．３μｍ〜０．５μｍであることが最も好ましい。
【００１０】
本発明に用いられる中空糸膜の材質は特に限定されないが、血液処理用途に用いられる公知の材質であれば、例えばポリエチレンやポリプロピレンを基材とし、親水性を得るためにエチレン‐ビニルアルコール共重合体などの親水性高分子を有したポリオレフィン系膜、ポリスルホンを基材とし、親水性を得るためにポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子を有したポリスルホン系膜、あるいはポリメチルメタクリレート膜、ポリアクリロニトリル膜を用いることができる。なかでも、エチレン‐ビニルアルコール共重合体を被覆させた親水性ポリエチレン膜は、本発明で用いるための好ましい具体例として挙げられる。
【００１１】
本発明で用いる中空糸膜の形状、寸法等は特に限定されるものではなく、内径は１００μｍ〜３００μｍ、好ましくは１５０μｍ〜２５０μｍ、膜厚は１０μｍ〜１５０μｍ、好ましくは２０μｍ〜１００μｍ、長さは１ｃｍ〜２０ｃｍ、好ましくは２ｃｍ〜１０ｃｍのものが好適に用いられる。
【００１２】
上記した中空糸膜を精子懸濁液濾過カラムとして使用する場合には、本発明の中空糸膜を充填したカラムは、中空糸束をＵ字型に折り曲げ、両端をポッティングして市販カラム（例えば２．５ｍＬラボラトリーカラムＭｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社製）に固定して作製しても良いし、市販の注射筒を利用して作製することも可能である。中空糸束をＵ字型に折り曲げ、両端をポッティングする代わりに一方の末端を接着剤やヒートシーラー等を用いて封止し、もう一方の末端をポッティングしてカラムを作製することも可能である。カラムの形状は特に限定されないが、作製のしやすさから円筒状のカラムが好適である。カラムの容量は特に限定されないが１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜１０ｍＬのものが好適に用いられる。本発明の中空糸膜を充填したカラムは、必要に応じて滅菌処理を行う。滅菌方法は公知の方法から選択すればよく、例えば乾燥状態でエチレンオキサイド、高圧蒸気、放射線滅菌、あるいはカラム内に水を充填して高圧蒸気、放射線照射等の処理を行えばよい。
【００１３】
本発明のカラムに接続する注射針は、特に限定はないが、吸引の際に精子に物理的なダメージを与えないことが重要であり、１８ゲージ以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明のカラムに接続する活栓は、医療分野で薬液の輸注や採血で使用されるディスポーザブルのルアーロック式二方活栓や三方活栓などが好適に用いられる。
【００１５】
本発明でいうＨＩＶを実質的に含まないとは、精子懸濁液中のＨＩＶ−ＲＮＡ量がＥＵ基準である５０コピー／ｍＬ以下であることを言い、より好ましくは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法において、検出限界以下であることを言う。ＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は、市販の定量標準ＲＮＡを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲキットを用いることによって算出することができる。本発明の方法によれば、２０倍の希釈濾過洗浄操作を４回以上、より好ましくは５回以上繰り返すことにより、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得ることができる。
非特許文献１には、ＨＩＶ陽性男性１２人の精液中のＨＩＶ−ＲＮＡ量が記載されており、最も濃度の低い例で５０コピー／ｍＬ精液以下、最も濃度の高い例で３００００コピー／ｍＬであったことが記載されている。ヒトの平均精液量はおよそ３ｍＬであることから、除去すべきＨＩＶ−ＲＮＡ量の目安は、１０００００コピー／精液と考えられる。
本発明による中空糸膜は、ＨＩＶを通過させる孔径を有するため、１回の操作で２０倍希釈する希釈濾過操作によりＨＩＶ−ＲＮＡ量は約１／２０になる。本発明の方法により４回の希釈濾過を繰り返すと、ＨＩＶ−ＲＮＡ量は約１／１６００００になるから、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液を得ることができる。さらに希釈濾過を繰り返すことにより、回収精子懸濁液中のＨＩＶ混入のリスクを低減することが可能である。
【００１６】
精子の回収率は血球計算板を用いた顕微鏡観察や自動血球計数機など通常の細胞計数の方法を用いて、濾過前の全精子数に対する濾過後の回収精子数の比率を算出することによって求められる。ＨＩＶ除去能は濾過前の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量をａ、濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量をｂとするとき、{（ａ − ｂ）／ａ } ×１００で示され、ＨＩＶ量は定量ＲＴ−ＰＣＲ法によって容易に求められる。
【００１７】
以下、本発明の使用方法を図を参照しながら説明する。
用手法によりＨＩＶ陽性者精液を５０ｍＬ蓋付の遠心管に採取し、１０ｍＬのＨＴＳ培地を加えて精液を希釈し、転倒混和によって均一な精子懸濁液を準備する。
図１のカラムの入口側栓７を外し、ハウジング４からポート３を開放して、充填されている注射用水を廃液する。ポート３をハウジング４に再び装着し、出入口６に注射針９を取り付ける。注射針の代わりに活栓を接続してもよいし、注射針と活栓の両者を接続しても良い。出口側栓１を外して注射筒８を取り付ける。注射針９よりＨＴＳ培地を吸い上げて、中空糸膜内部に残っている注射用水をＨＴＳ培地に置換する。
注射筒８で注射針９より精子懸濁液を吸引し、ＨＩＶを含む精子懸濁液を濾過する。
新しい遠心管に新鮮なＨＴＳ培地を加え、注射針９より注射筒８にて吸引し、ＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過する。注射針の代わりに活栓、または注射針と活栓の両者を接続する場合は、活栓を開状態にして吸引する。遠心管に新鮮なＨＴＳ培地を加えてから、注射針９より注射筒８にて吸引し、ＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過するまでの操作を更に３〜４回繰り返すことにより、ウィルス粒子を実質的に含まない精子懸濁液を得ることができる。カラム内の精子の回収は以下の要領で行うことができる。
まず注射筒８を濾過液の出口２から取り外し、あらかじめ新鮮なＨＴＳ培地の入った清浄な注射筒を接続する。注射筒のプランジャーを押し、ＨＴＳ培地を中空糸膜内に導入することにより、カラム内の精子を回収する。
［実施例］
【００１８】
本発明を次に実施例及び比較例によって説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（１）最初に、図１に示す構成で精子懸濁液の濾過カラムの作製方法について説明する。内径３３０μｍ、膜厚５０μｍ、平均孔径０．３μｍ、全長１２ｃｍのポリエチレン製中空糸膜に親水化剤としてポリエチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆した中空糸膜を用い、該中空糸膜を２０本束ねて、束を中央でＵ字型に曲げ両端を１つに束ね、予め４０℃で一昼夜脱泡したポリウレタン系接着剤を用いて内径５ｍｍ、外径７ｍｍ、全長１．５ｃｍのポリエチレン製チューブに中空糸膜端部を挿入し固定した。ポリウレタンを硬化させるため該中空糸膜を挿入したチューブを一昼夜４０℃で加熱した後、ポリエチレン製チューブの端部を１ｃｍ程度切断し、中空糸膜端部を開口させた。該チューブ側面をシアノアクリレート樹脂系瞬間接着剤（東亜合成株式会社製）を用いて２．５ｍＬラボラトリーカラム（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社製）ポート３の内側に固定し、該中空糸膜部分を７０ｗｔ％エタノールに浸漬、注射用水に置換した後、２．５ｍＬラボラトリーカラムのハウジング４に中空糸膜部分を傷つけないよう挿入し、該ポート３を回してロックした。入口６に１６ゲージニードル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩEＳ ＩＮＣ社製）、出口２に一般汎用注射筒（１０ｍＬ）（株式会社テルモ製）を取り付けてカラム内に注射用水を充填し、該カラムの入口６側を上に向け、入口６側の１６ゲージニードルを取り外し入口側栓７で密栓し、該カラムの入口６側を下に向け、汎用注射筒（１０ｍＬ）を取り外し出口側栓１で密栓した。該カラムをγ線滅菌（２５ｋＧｙ）し、精子懸濁液の濾過カラム図１を作製した。カラムあたりの有効膜面積は１７ｃｍ２であった。
（２）次に、図１の該カラム内に充填された注射用液を廃液し、中空糸膜内を注射用液からＨＴＳ培地に置換する操作方法について説明する。なお、この操作は安全キャビネット内で行う。図１の該カラムの入口側栓７を外しハウジング４からポート３を開放して、充填されていた注射用水を廃液した。ポート３をハウジング４に装着し、入口に図２の１６ゲージニードル９を取り付け、出口側栓１を外して汎用注射筒（１０ｍＬ）８を取り付けた。１６ゲージニードル９よりＨＴＳ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を吸い上げて、中空糸膜内部を注射用水からＨＴＳ培地に置換した。
（３）次に、該カラムのＨＩＶ除去率を評価するための精子懸濁液の作製について説明する。健常者精液（精子濃度２０００万／ｍＬ以上）３ｍＬにＨＴＳ培地７ｍＬを添加し精子懸濁液を調製し、更にＨＩＶ（５×１０６コピー）を添加してＨＩＶ含有精子懸濁液を作製した。
（４）次に、該カラムを使用して精子懸濁液中のＨＩＶ濾過方法について説明する。なお、この操作は安全キャビネット内で行った。精子懸濁液１０ｍＬをファルコンチューブ（５０ｍＬ）に加えた。該カラム先端の１６ゲージニードル９を該ファルコンチューブ（５０ｍＬ）内に挿入し、汎用注射筒（１０ｍＬ）で精子懸濁液を吸引してＨＩＶ含有精子懸濁液を濾過した。新たに該カラムのファルコンチューブ（５０ｍＬ）にＨＴＳ培地１０ｍＬを加え、汎用注射筒（１０ｍＬ）でＨＴＳ培地を吸引してＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過した。該ファルコンチューブ（５０ｍＬ）にＨＴＳ培地１０ｍＬを加えてから、汎用注射筒（１０ｍＬ）でＨＴＳ培地を吸引してＨＩＶを含むＨＴＳ培地を濾過するまでの操作をさらに４回繰り返した。該カラム出口にＨＴＳ培地５ｍＬを内蔵した新しい汎用注射筒（１０ｍＬ）を接続し、汎用注射筒（１０ｍＬ）から該カラム内にＨＴＳ培地５ｍＬを排出して、精子を回収した。
（５）次に、該カラムにおける精子懸濁液中のＨＩＶ除去率の求め方を説明する。
ＨＩＶ量の測定には、アンプリコアＨＩＶ−１モニターキット（日本ロッシュ社製）を使用し、以下のように行った。精子懸濁液５００μＬを２〜８℃、２３，６００ ｘ ｇで１時間遠心し、上清除去した沈渣を核酸抽出に用いた。キット添付の方法に従って、逆転写反応によるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成とＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅後、増幅ＤＮＡの希釈系列の作成とＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーション反応を行い、酵素作用による発色反応を行ってＤＮＡ量を定量した。
ＨＩＶ除去率（％）は以下の式により算出した。
ＨＩＶ除去率（％）＝{（ａ−ｂ）／ａ } ×１００
ａ：濾過前の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量
ｂ：濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量
（６）次に、該カラムにおける精子懸濁液中からの精子回収率の求め方を説明する。
精子濃度測定には、マクラー氏精子算定盤を使用し、以下の式により精子回収率（％）を算出した。
精子回収率（％）＝｛（ｂ×ｄ）／（ａ×ｃ）｝ ×１００
ａ：濾過前の精子懸濁液の精子濃度［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］
ｂ：濾過後の精子懸濁液の精子濃度［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］
ｃ：濾過前の精子懸濁液量［ｍＬ］
ｄ：回収した精子懸濁液量［ｍＬ］
（７）健常者３名から提供された精液を用いて、（３）〜（４）に示した操作方法によりＨＩＶの濾過を行った。その結果を表１に示す。濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡはいずれも検出限界（５０コピー／ｍＬ）以下でありＨＩＶ除去率は９９．９９％以上、精子回収率は８１％であった。
【００２０】
【表１】
【比較例１】
【００２１】
図１に示す精子懸濁液中のＨＩＶを濾過するカラムにおいて、内径１７５μｍ、膜厚４０μｍ、平均孔径０．０３μｍ、ポリエチレン−ビニルアルコール共重合体製中空糸膜を用いたこと以外は実施例１と同様に作製した。健常者精液３ｍＬにＨＩＶ（５×１０６コピー）を含む培地７ｍＬを加えた精子懸濁液を使用して、濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ量及び精子回収率を測定したところ、ＨＩＶ除去率は０％、精子回収率は８０％であった。
【比較例２】
【００２２】
図１に示す精子懸濁液中のＨＩＶを濾過するカラムにおいて、内径３ｍｍ、膜厚１ｍｍ、平均孔径２．５μｍ、ポリスルホン製中空糸膜に親水化剤としてポリエチレンビニルアルコールを被覆した中空糸膜を用い、該中空糸膜１本の一方の端部をヒートシーラーを使用して封止し、他方の端部を５．０ｍＬラボラトリーカラム（ＭｏＢｉ Ｔｅｃ社製）ポートの内側にポリウレタン系接着剤を用いて直接固定したこと以外は、実施例１と同様に作製した。健常者精液３ｍＬにＨＩＶ（５×１０６コピー）を含む培地７ｍＬを加えた精子懸濁液を使用して、濾過後の精子懸濁液中に含まれるＨＩＶ−ＲＮＡ及び精子回収率を測定したところ、ＨＩＶ除去率は９９．９９％、精子回収率は６２％であった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明に係るＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法及び精子懸濁液の濾過カラムは、ＨＩＶを含む精液から簡便かつ確実にＨＩＶを除去し、しかも精子の回収率が高いので、ＨＩＶ陽性男性が精液提供者である人工授精や体外受精に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の精子懸濁液の濾過カラムの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の精子懸濁液の濾過カラムに注射筒と注射針を接続した例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００２５】
１ 出口側栓
２ 濾過液の出口
３ ポート
４ ハウジング
５ 中空糸膜
６ 精子懸濁液と生理的溶液の出入口
７ 入口側栓
８ 注射筒
９ 注射針
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムにＨＩＶを含む精子懸濁液を導入して、生理的溶液による希釈と前記中空糸膜による濾過を行うことによって、前記精子懸濁液中のＨＩＶを濾液に排出して精子懸濁液中のＨＩＶを除去することを特徴とする、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
【請求項２】
前記ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液のＨＩＶ−ＲＮＡコピー数が、１ｍＬ当たり５０コピー以下であることを特徴とする請求項１記載のＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
【請求項３】
円筒形のシリンダーに膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜が充填されており、
該シリンダー内の空間は該中空糸膜によって精子懸濁液と生理的溶液の出入口に連通する中空糸膜外側空間及び濾過液の出口に連通する中空糸膜内側空間の２つの空間に分割され、
前記濾過液の出口は注射筒が接続可能な構造であり、
前記精子懸濁液と生理的溶液の出入口は注射針又は活栓が接続可能な構造である、
精子懸濁液の濾過カラム。
【請求項１】
膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜を充填したカラムにＨＩＶを含む精子懸濁液を導入して、生理的溶液による希釈と前記中空糸膜による濾過を行うことによって、前記精子懸濁液中のＨＩＶを濾液に排出して精子懸濁液中のＨＩＶを除去することを特徴とする、ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
【請求項２】
前記ＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液のＨＩＶ−ＲＮＡコピー数が、１ｍＬ当たり５０コピー以下であることを特徴とする請求項１記載のＨＩＶを実質的に含まない精子懸濁液の製造方法。
【請求項３】
円筒形のシリンダーに膜孔径０．１μｍ〜２．０μｍの中空糸膜が充填されており、
該シリンダー内の空間は該中空糸膜によって精子懸濁液と生理的溶液の出入口に連通する中空糸膜外側空間及び濾過液の出口に連通する中空糸膜内側空間の２つの空間に分割され、
前記濾過液の出口は注射筒が接続可能な構造であり、
前記精子懸濁液と生理的溶液の出入口は注射針又は活栓が接続可能な構造である、
精子懸濁液の濾過カラム。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１４８１７６（Ｐ２００９−１４８１７６Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２６９３２（Ｐ２００７−３２６９３２）
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【出願人】（０００１１６８０６）旭化成クラレメディカル株式会社 (133)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【出願人】（０００１１６８０６）旭化成クラレメディカル株式会社 (133)
【Ｆターム（参考）】
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