糖化アミンの測定方法
信頼性に優れた糖化アミンの測定を可能にすることを目的とする。試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を添加して、前記試料中に測定対象糖化アミンとは別に存在する非測定対象物である糖化アミンを除去した後、前記試料に、プロテアーゼを添加して、前記測定対象糖化アミンを分解させ、前記分解物とすでに添加された前記ＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元反応を用いて、糖化タンパク質等の糖化アミンを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血球中の糖化ヘモグロビン（中でも「ＨｂＡ１ｃ」）は、その濃度が生体血糖値の過去の履歴を反映することから、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このＨｂＡ１ｃの測定は、一般に、免疫学的方法、ＨＰＬＣ法等によって行われている。
【０００３】
しかしながら、全血や血球中には、測定対象である糖化ヘモグロビン（糖化Ｈｂ）以外にも、非測定対象物として、糖化アミン（例えば、糖化アルブミン、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸等）等の種々の糖化物が存在する。このため、このような測定対象物以外の糖化物（非測定対象物）をも測定してしまい、結果的に、真値よりも高い測定値が得られたり、偽陽性を示すという問題がある。
【０００４】
このような問題を解決するために、前記免疫学的方法においては、例えば、以下のような方法が提案されている。すなわち、測定対象物と抗測定対象物抗体との主反応に先立って、非測定対象物と抗非測定対象物抗体とのコンプレックスを形成させ、非測定対象物の構造を、糖化Ｈｂの免疫反応に影響しないものに変化させる方法や（例えば、特許文献１参照）、Ｂ／Ｆ分離によって、試料から非測定対象物を分離除去する方法等である。また、ＨＰＬＣ法においては、例えば、１つの試料について２本のＨＰＬＣカラムを準備し、１本目のカラムで試料から非測定対象物を除去し、２本目のカラムで測定対象物の分離分析を行う方法が提案されている。
【０００５】
しかしながら、前記免疫学的方法によると、高コストであり、また、主反応とは別の抗原抗体反応をさらに必要とするため、反応系の環境設定が複雑化し、測定に長時間を要するという問題がある。また、Ｂ／Ｆ分離については、操作が煩雑になることが明らかである。さらに、抗体は特異性を有する物質（抗原）に対してのみ効果を奏するため、試料に含まれる非測定対象物の種類が不明であったり、その種類が多数である場合等、十分に非測定対象物の影響を排除することは困難である。また、ＨＰＬＣ法においても、２本のカラムを使用するため高コストは回避し難く、また、非測定対象物の分離に時間を有するため、測定精度の向上を目的した場合、測定時間の短縮には限度がある。
【０００６】
一方、近年、糖化Ｈｂをはじめとする各種糖化タンパク質の測定に、酸化還元反応を利用した酵素法が広く適用されており、実用化が図られている。具体的には、以下示すようにして測定されている。
【０００７】
まず、血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料にプロテアーゼを添加して、糖化Ｈｂ分解物を生成させる。さらに、この分解物にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を添加し、これを糖化Ｈｂの糖化部分に作用させ、その酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は前記糖化タンパク質量に対応している。そして、この反応液にペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する基質を添加し、酵素反応により前記発色性基質を発色させる。この発色を測定することにより前記過酸化水素量を測定でき、この結果、血球中の糖化Ｈｂを決定できるのである。
【０００８】
しかし、このような酵素法においても、前述と同様に、試料中に含まれる非測定対象物である糖化物が原因となり、真値よりも高い値を示すという問題がみられる。そこで、この問題を解決するために、酵素法においても次のような方法が本出願人により提案されている（例えば、特許文献２）。
【０００９】
すなわち、第１の方法として、予め、測定対象糖化Ｈｂへの反応性が低いＦＡＯＤ（分解用ＦＡＯＤ）を試料に添加することにより、非測定対象の糖化物を処理しておき、その後、糖化Ｈｂのプロテアーゼ分解物を、糖化Ｈｂへの反応性が高いＦＡＯＤ（測定用ＦＡＯＤ）で処理することによって測定する方法が提案されている。
【００１０】
また、第２の方法として、予め、糖化Ｈｂへの反応性が高い少量のＦＡＯＤ（分解用ＦＡＯＤ）で試料を前処理した後、この試料をプロテアーゼで処理し、再度、前述と同じＦＡＯＤ（測定用ＦＡＯＤ）を添加する方法が提案されている。この第２の方法において、分解用ＦＡＯＤの添加量を少量とする、詳しくは、測定用ＦＡＯＤに対する前処理用ＦＡＯＤの比を小さくするのは、速度論の点から、前処理の段階における糖化ＨｂとＦＡＯＤとの反応を防止するためである。さらに、前記第２の方法におけるプロテアーゼの添加は、前記糖化Ｈｂの分解を目的とするだけでなく、初めに添加した分解用ＦＡＯＤを失活させることも目的としている。なぜなら、初めに添加した分解用ＦＡＯＤが残存すると、プロテアーゼの添加によって生成された糖化Ｈｂ分解物が残存ＦＡＯＤと反応してしまうからである。
【特許文献１】特開２０００−１８０４３９号公報
【特許文献２】国際公開第０３−０３３７２９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来の第１の酵素法によると、予め前処理用ＦＡＯＤにより非測定対象物に対する前処理を行っても、主反応に使用する測定用ＦＡＯＤは異なる触媒機能であるために、この測定用ＦＡＯＤが作用する非測定対象物は処理し切れてない状態となる。このため、測定精度の向上は見られるものの、さらなる精度の向上が求められている。また、第１の酵素法では、（１）前処理用ＦＡＯＤ、（２）プロテアーゼ、（３）測定用ＦＡＯＤ（＋ＰＯＤ）という、少なくとも３種類の試薬をそれぞれ別個に使用した三段階の反応が必須となるため、測定に時間がかかり、試薬の調製にも手間がかかる。
【００１２】
一方、従来の第２の酵素法では、前述のように、前処理ＦＡＯＤの添加量を少量とする必要があり、かつ、測定用ＦＡＯＤの添加に先立って、前処理用ＦＡＯＤをほぼ完全に失活させることが重要となる。しかし、前処理ＦＡＯＤを少量とすると、非測定対象物を消化するために十分な処理時間の確保が必要となり、完全な消化を試みると、処理時間が長くなり、ひいては全測定時間が長くなるという問題がある。さらに、前処理ＦＡＯＤ、プロテアーゼ、測定用ＦＡＯＤによる各処理は、いずれも同時に行うことができないことも、測定時間に影響を与えている。
【００１３】
そこで、本発明は、糖化アミンの測定方法の提供であって、これによって、容易且つ簡便に、信頼性に優れた糖化アミンの測定を可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明の糖化アミン測定方法は、プロテアーゼを試料に添加して、前記プロテアーゼにより前記試料中の測定対象である糖化アミンを分解する工程と、前記試料にＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを糖化アミンの分解物に作用させて酸化還元反応を行う工程と、前記酸化還元反応を測定する工程と、前記酸化還元反応の測定結果により、前記糖化アミンの量を決定する工程とを含む、糖化アミンの測定方法であって、さらに、前記測定対象糖化アミンとは別に前記試料中に存在する非測定対象である糖化アミンの影響を除去することを目的として、前記プロテアーゼを添加する分解工程に先立ち、前記試料に前記ＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程を含み、前記分解工程に先立って添加したＦＡＯＤによって、前記分解工程後の前記酸化還元反応を行うことを特徴とする。なお、本発明において測定対象物である糖化アミンは、「測定対象糖化アミン」と、非測定対象物である糖化アミンは、「非測定対象糖化アミン」といい、非測定対象糖化アミンに対するＦＡＯＤ反応を「前処理反応」、測定対象糖化アミンに対するＦＡＯＤ反応を「主反応」ともいう。
【００１５】
前記ＦＡＯＤは一般名称であって、その基質特異性はＦＡＯＤの種類により様々であり、糖化アミノ酸だけでなく、糖化ペプチドや糖化タンパク質にも作用し得る酵素である。また、前記糖化アミンとしては、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸等が含まれるが、本発明において「測定対象糖化アミン」とは、糖化タンパク質または糖化ペプチドを示す。
【発明の効果】
【００１６】
本発明者らは、糖化Ｈｂをはじめとする糖化アミンの測定方法について鋭意研究を行った。その結果、予め試料にＦＡＯＤを添加することによって非測定対象糖化アミンを処理した後、プロテアーゼを添加して、このプロテアーゼによる測定対象糖化アミンの分解物に、すでに添加されているＦＡＯＤを作用させるという本発明に想到した。この方法によれば、予め試料にＦＡＯＤを添加して、非測定対象物を処理するため、プロテアーゼによる分解反応ならびに主反応を行う際には、ＦＡＯＤと作用する非測定対象物はすでに消化されていることとなる。したがって、非測定対象物が原因となる偽陽性や測定値の上昇（高値化）を防止し、著しく優れた測定精度を確保できるのである。また、本発明によれば、予めＦＡＯＤによって非測定対象糖化アミンを処理さえすれば、その後は、後述するように、プロテアーゼによる測定対象物の分解、酸化還元反応等は、経時的に行ってもよいし同時に行うこともできる。このため、測定における反応工程数を極めて少ない２工程にまで減少することができ、簡便な操作が可能になる。また、臨床検査だけなく食品分析等にも広く適用されている従来の酵素法においては、サンプルをプロテアーゼで処理した後に、主反応の酵素を添加することが基本形態であり、本発明のように、プロテアーゼの添加に先立って主反応の酵素ＦＡＯＤを添加できることも、本発明者らが初めて見出したことである。したがって、このような本発明の測定方法を、例えば、前述のような糖化Ｈｂの測定に適用すれば、糖化Ｈｂの糖尿病診断の指標としての信頼性も増し、臨床医療等の分野において有用な方法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の測定方法は、前述のように、プロテアーゼを試料に添加して、前記プロテアーゼにより前記試料中の測定対象である糖化アミンを分解する工程と、前記試料にＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを糖化アミンの分解物に作用させて酸化還元反応を行う工程と、前記酸化還元反応を測定する工程と、前記酸化還元反応の測定結果により、前記糖化アミンの量を決定する工程とを含む、糖化アミンの測定方法であって、さらに、前記測定対象糖化アミンとは別に前記試料中に存在する非測定対象である糖化アミンの影響を除去することを目的として、前記プロテアーゼを添加する分解工程に先立ち、前記試料に前記ＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程（前処理工程）を含み、前記分解工程に先立って添加したＦＡＯＤによって、前記分解工程後の前記酸化還元反応を行うことを特徴とする。つまり、前記分解工程前に、前記非測定対象糖化アミンに作用させるために添加したＦＡＯＤによって、さらに、前記分解工程後の酸化還元反応を行うことができるのである。
【００１８】
前記測定対象物としては、前述のような酸化還元反応を利用できる糖化アミンであれば特に制限されず、本発明による測定が可能である。具体的な測定対象糖化アミンとしては、糖化Ｈｂ、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチドがあげられ、本発明の測定方法は、中でも血球内糖化アミン、特に糖化Ｈｂの測定に有用である。
【００１９】
本発明において、前記酸化還元反応工程は、例えば、ＦＡＯＤを糖化アミン分解物に作用させて過酸化水素を発生させる工程であり、前記酸化還元反応を測定する工程は、前記試料に酸化酵素（例えば、ＰＯＤ）と酸化により発色する基質とを添加して、前記発生した過酸化水素と前記基質とを前記酸化酵素により反応させる工程を含むことが好ましい。この反応により前記基質が発色するため、この発色量の測定により、前記酸化還元反応を測定できる。
【００２０】
本発明において、前記分解工程と、前記酸化還元反応工程と、前記酸化還元反応を測定する工程とを同時に行うことが好ましい。これによって、測定工程が低減され、操作を迅速かつ簡便に行うことができる。具体的には、例えば、（１）前記前処理工程の後、前記試料に、プロテアーゼ、酸化酵素および酸化により発色する基質を同時に添加する、（２）前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化酵素を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化により発色する基質を同時に前記試料に添加する、または、（３）前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化により発色する基質を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化酵素を同時に前記試料に添加することによって、前述の３つの工程を同時に行うことができる。
【００２１】
本発明の測定方法において使用するＦＡＯＤは、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましく、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）、アミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−Ｓ」という）、α−アミノ基が糖化された糖化アミンおよびアミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンのいずれにも特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）等があげられる。
【００２２】
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ＋ＮＨ２−Ｒ２＋Ｈ２Ｏ２ …（１）
【００２３】
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００２４】
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチド（糖化タンパク質を含む）の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基（アミノ酸側鎖のアミノ基）が糖化されている場合とで異なる。
【００２５】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−αおよびＦＡＯＤ−αＳである。
【００２６】
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
【００２７】
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００２８】
−（ＮＨ−ＣＲ３Ｈ−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
【００２９】
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−ＳおよびＦＡＯＤ−αＳである。
【００３０】
−Ｒ５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４）
【００３１】
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
【００３２】
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００３３】
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５）
【００３４】
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００３５】
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６）
【００３６】
前記糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αとしては、例えば、市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−ＴＥ）（キッコーマン社製）、ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）等があげられる。前記アミノ酸残基の糖化された側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会 平成１２年度「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀 他」）等があげられる。また、前記糖化α−アミノ基および糖化側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ−αＳとしては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）等があげられる。
【００３７】
これらのＦＡＯＤは、測定対象糖化アミンの種類に応じて適宜決定することができる。測定対象物が前述のように糖化Ｈｂの場合には、そのβ鎖Ｎ末端バリンにおけるα−アミノ基の糖化程度を測定することによってＨｂＡ１ｃ（％）を算出できるため、糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αを使用することが好ましい。特に、ＦＡＯＤ−αである商品名ＦＡＯＸ−ＴＥは、α−アミノ基が糖化された遊離の「バリン」に特異的に作用するため、Ｎ末端配列が「Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・・・」となるβ鎖Ｎ末端バリンや、Ｎ末端配列が「Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ・・・」となるα鎖Ｎ末端バリンからＶａｌを遊離させて、糖化程度を測定するのに適している。また、前記ＦＡＯＤ−α、特に、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＬ２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４５１）から常套手段によって得られるＦＡＯＤを使用することもできる。このＦＡＯＤ−αは、α−アミノ基が糖化された遊離のＶａｌや、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ等に特異的に作用するため、α鎖やβ鎖のＮ末端からこれらの配列を遊離させて、糖化量を測定するのに適している。また、測定対象物が、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸（糖化Ｖａｌ）やペプチド（糖化Ｖａｌ−Ｈｉｓ）、ε−アミノ基が糖化されたアミノ酸（糖化Ｌｙｓ）やペプチド（糖化Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、糖化Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）等の場合には、糖化Ｌｙｓおよび糖化Ｖａｌの両方に特異的に作用するＦＡＯＤ−αＳを使用することが好ましい。
【００３８】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、メタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼが使用できるが、測定対象糖化アミンの種類に応じて選択することが好ましく、特に、測定対象糖化アミンを選択的に分解できるプロテアーゼ、ＦＡＯＤが作用し易い分解物を特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましい。測定対象糖化アミンを選択的に分解できるプロテアーゼであれば、例えば、試料中に他の糖化アミン（特に、糖化タンパク質、糖化ペプチド）が存在する場合であっても、これらの糖化アミンは分解され難く、ＦＡＯＤが作用し易い分解物も発生しないため、測定精度をより一層向上できるからである。具体的に、測定対象物が前述のような糖化Ｈｂである場合、糖化Ｈｂを選択的に分解するプロテアーゼが好ましく、例えば、メタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼ等があげられ、より好ましくはメタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。
【００３９】
また、前述のようなＦＡＯＤ−αを使用する際には、ＦＡＯＤ−αが作用し易い分解物、例えば、β鎖Ｎ末端バリン、もしくはこれを含むペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を、特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましく、ズブチリシン、プロナーゼ、アンギオテンシン変換酵素等が使用できる。具体的には、例えば、糖化Ｈｂをズブチリシン、プロナーゼ等で処理することによってＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのトリペプチドを遊離でき、さらにＨｉｓ−Ｌｅｕに特異的なアンギオテンシン変換酵素で処理すれば、糖化バリン（フルクトシルバリン）を遊離することができる。
【００４０】
また、フサリウム属（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＬ２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４５１））由来のＦＡＯＤ−αを使用する際には、例えば、α鎖Ｎ末端バリン、もしくはこれを含むペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を、特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましく、例えば、エンドプロティナーゼＡＳＰ−Ｎ等が使用できる。具体的には、例えば、糖化Ｈｂを前記エンドプロティナーゼＡＳＰ−Ｎで処理することによって、
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐペプチドを遊離でき、さらにカルボキシペプチダーゼＹで処理することによって糖化Ｖａｌ−Ｌｅｕを遊離できる。また、糖化アルブミンの場合は、例えば、プロテイナーゼＫ、ズブチリシン、フィシン、エラスターゼ、サーモリシン等が使用でき、アルブミンの種類（例えば、ＨＳＡ，ＢＳＡ等）はその由来に何ら制限されず、測定できる。
【００４１】
本発明において、測定試料は特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清、血球、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても、本発明の測定方法を適用できる。この中でも、本発明の測定方法は、例えば、前記全血、血漿、血清、血球などの血液試料やその他の生体試料に有用である。例えば、前記血球成分である糖化アミンを測定する場合には、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、点滴等の成分には、例えば、グルコース等の糖類や各種アミノ酸が含まれる場合が多いため、これらの成分から糖化アミンが生成されることにより、患者の血液等に一過的に糖化アミノ酸が増加する場合がある。したがって、このような点滴後の患者の血液試料等にも本発明の測定方法は極めて有用である。
【００４２】
本発明において、前記酸化還元反応の測定は、前記ＦＡＯＤの酸化還元反応により発生した、測定対象糖化アミン由来の過酸化水素量の測定であることが好ましい。過酸化水素の量は、例えば、ＰＯＤによって、測定対象糖化アミン由来の過酸化水素を還元し、同時に酸化により発色する基質（発色性基質）を酸化し、発色した前記基質の発色程度を測定することによって、決定できる。
【００４３】
なお、ＰＯＤの添加順序は特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼの添加前または添加後に添加してもよいし、前記プロテアーゼの添加と同時に添加してもよい。また、発色性基質の添加も同様に制限されない。なお、具体例については後述する。
【００４４】
つぎに、本発明の測定方法について、非測定対象物を含む全血試料における、血球中の糖化Ｈｂを測定する一例をあげて説明する。なお、この実施形態において「糖化アミノ酸」とは、特に示さない限り、試料中に含まれる非測定対象糖化アミノ酸のことをいい、測定対象物である糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物としての糖化アミノ酸は含まない。
【００４５】
まず、全血を溶血して溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００４６】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
【００４７】
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
【００４８】
つぎに、前記溶血試料にＦＡＯＤを添加する。このＦＡＯＤの添加によって、前記溶血試料中の非測定対象糖化アミンであって、前記ＦＡＯＤの基質となり得るものが分解される（前処理工程）。具体的には、ＦＡＯＤが触媒する前記式（１）の反応によって、非測定対象糖化アミンの糖化部分が、過酸化水素の発生を伴って分解される。このように、ＦＡＯＤと反応可能な非測定対象糖化アミンは、この段階ですでに分解されているため、次工程において、糖化Ｈｂをプロテアーゼで分解しても、本工程で添加したＦＡＯＤと非測定対象物とが反応することはなく、糖化Ｈｂ分解物のみをＦＡＯＤと反応させることができるのである。また、この工程と前記溶血処理とを同時に行うこともできる。
【００４９】
なお、この工程で発生した非測定対象由来の過酸化水素は、血球中に含まれるグルタチオンペルオキシダーゼやカタラーゼによって発生と同時に速やかに消失するため、現段階で発生した過酸化水素が、後述する糖化Ｈｂ由来の過酸化水素の測定（ＰＯＤ反応）に影響を及ぼすことはない。このように発生と同時に瞬時に過酸化水素が消化されることは、例えば、反応液中に含まれるＨｂと非測定対象物の含有割合や、反応速度論の点から考慮しても明らかであり、また、ＰＯＤ反応に影響を与えないことは、後述する実施例の結果からも明らかである。
【００５０】
このように、測定対象糖化アミンが糖化Ｈｂをはじめとする血球内成分である場合、血球中に本来存在しているカタラーゼ等によって、非測定対象糖化アミンの分解で発生した過酸化水素が速やかに分解されるために、別途カタラーゼ等を添加することがなく、操作がより一層簡便となる。なお、試料が血球を含まない場合（例えば、血清試料、尿等）、すなわち血球中のカタラーゼを含まない場合には、別途カタラーゼを添加して、非測定対象糖化アミン由来の過酸化水素を消去してもよい。このように前記カタラーゼにより過酸化水素を消去した場合、後に行うＦＡＯＤ処理で生成する過酸化水素までもが消去されることを防ぐために、前記酸化還元反応の測定の際には、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが好ましく、また、前記ＰＯＤおよび発色性基質の添加は、例えば、ＦＡＯＤの添加前またはＦＡＯＤ添加と同時であることが好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
【００５１】
また、非測定対象糖化アミンから発生する過酸化水素を処理する方法としては、この他に以下の方法も採用できる。例えば、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとＰＯＤならびに電子供与体を共存させる方法がある。これによれば、プロテアーゼを添加する前に、非対象糖化アミンより発生した過酸化水素は、ＰＯＤ反応によって脱水素を起こし、電子は電子供与体に供与される。このため、後にプロテアーゼを添加しても、過酸化水素は消去されており、測定対象糖化アミンに対する測定には影響がない。また、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとＰＯＤならびに酸化により発色する発色剤を添加し、この発色量を予め測定しておき、この発色量で補正を行うことも可能である。
【００５２】
前記溶血試料に対するＦＡＯＤの添加量は、非測定対象物の処理ならびに後述する糖化Ｈｂ分解物の処理を十分に行うことができる量であればよい。例えば、溶血試料中のＨｂ濃度等によって適宜決定することができるが、非測定対象物を迅速に消去するために過剰量を添加することが好ましい。具体的には、反応液において、血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、ＦＡＯＤ０．１〜３０Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２〜１０Ｕ／Ｌであり、より好ましくは３〜６Ｕ／Ｌである。また、反応液において、全血濃度が０．３体積％の場合、ＦＡＯＤ０．１〜４５Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２〜１５Ｕ／Ｌであり、より好ましくは３〜９Ｕ／Ｌである。
【００５３】
このＦＡＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応温度は、例えば、２〜６０℃、好ましくは４〜４０℃であり、反応時間は、例えば、１〜３０分間、好ましくは３〜５分間であり、ｐＨは、例えば、６〜９の範囲である。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
【００５４】
なお、前記溶血工程とＦＡＯＤの添加工程は、別々に行ってもよいが、時間の短縮、工程の簡略化の点から、同時に行うことが好ましい。特に、試薬キットを用いた本発明の測定方法の実行を考慮すると、溶血ならびに非測定対象糖化アミンのＦＡＯＤ処理を同時に行うことによって、試薬数を低減できるため好ましい。
【００５５】
続いて、前記ＦＡＯＤを添加した反応液に、さらにプロテアーゼ、およびＰＯＤと酸化により発色する基質（発色性基質）を添加する。このように前記プロテアーゼの添加によって、糖化Ｈｂは、先に添加したＦＡＯＤが作用し易いように分解され、この分解物とＦＡＯＤとの間で前記式（１）に示す反応が起こり、糖化Ｈｂ由来の過酸化水素が発生する。つまり、プロテアーゼの添加によって、自動的にすでに添加されているＦＡＯＤによる酸化還元反応が開始するのである。そして、発生すると同時に、前記過酸化水素はＰＯＤにより還元され、一方、共存する前記発色性基質は酸化され、発色を呈するのである。この発色は、例えば、分光光度計等により吸光度として測定することができ、その結果から過酸化水素量を決定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化Ｈｂの量（糖化量）を求めることができる。
【００５６】
この処理は、通常、前述のような緩衝液中で行われ、条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象の糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５７】
前記反応液中におけるプロテアーゼの濃度は、血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、１０ＫＵ／Ｌ〜３００ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１ＭＵ／Ｕ〜６０ＭＵ／Ｌ、より好ましくは５ＭＵ／Ｌ〜３０ＭＵ／Ｌであり、前記反応液において、全血濃度が０．３体積％の場合、１０ＫＵ／Ｌ〜１５０ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１ＭＵ／Ｌ〜３０ＭＵ／Ｌであり、より好ましくは５ＭＵ／Ｌ〜１５ＭＵ／Ｌである。
【００５８】
また、前記反応液中におけるＰＯＤ濃度は、例えば、過剰量であることが好ましい。ＰＯＤが過剰量であれば、発生と同時に、過酸化水素と迅速に反応させることができ、例えば、試料中のカタラーゼによる影響を十分に抑制できるからである。具体例としては、反応液中の血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、０．０１ＫＵ／Ｌ〜４ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１ＫＵ／Ｌ〜２００ＫＵ／Ｌ、より好ましくは５ＫＵ／Ｌ〜１００ＫＵ／Ｌであり、前記反応液において、全血濃度が０．３体積％の場合、０．０１ＫＵ／Ｌ〜２ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１ＫＵ／Ｌ〜１００ＫＵ／Ｌであり、より好ましくは５ＫＵ／Ｌ〜５０ＫＵ／Ｌである。前記反応液中における発色性基質の濃度は、血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、０．０１〜３００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜１００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５〜３０μｍｏｌ／Ｌである。
【００５９】
この処理の条件は、特に制限されないが、反応温度は、例えば、２〜６０℃、好ましくは４〜４０℃であり、反応時間は、例えば、１〜３０分間、好ましくは３〜１０分間であり、ｐＨは、例えば、６〜９の範囲である。
【００６０】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００６１】
本発明において、前記プロテアーゼの添加後に、前記試料にＰＯＤおよび発色性基質を添加して、プロテアーゼ処理とＰＯＤ処理とを別個に行うこともできるが、以下の理由より、前記両処理を同時に行うことが好ましい。すなわち、第１に、プロテアーゼと共に、ＰＯＤおよび発色性基質を添加すれば、発生した過酸化水素は瞬時にＰＯＤと反応し、前述のようにカタラーゼによって消去されるおそれがないからである。第２に、前記両処理を１工程とすれば、測定をよりいっそう簡便かつ迅速に行うことができる。また、第３に、試薬キットを用いた測定を考慮すれば、工程数に応じて試薬数を低減できるため、低コスト化も可能になるからである。特に、従来の第２の酵素法においては、通常、少なくとも分解用ＦＡＯＤ処理、プロテアーゼ処理および測定用ＦＡＯＤ処理という３工程以上の処理が必要であり、また、従来の第１の酵素法でも測定用ＦＡＯＤの安定性の面から、プロテアーゼと測定用ＦＡＯＤを別々の試薬として調製しなければならないために、使用する試薬は少なくとも３試薬系が必要であった。しかしながら、本発明によれば、非測定対象物の除去を１工程（溶血処理を含んでもよい）、プロテアーゼ処理およびＰＯＤ処理を１工程とする合計２工程という、極めて少ない工程数での反応が可能である。このため、ＦＡＯＤを含む試薬（溶血試薬を含んでもよい）、プロテアーゼとＰＯＤと発色性基質とを含む試薬の２試薬系による測定が実現できるのである。このように２試薬系での測定が可能になったことは、コストの面、簡便性の点からも極めて有用である。
【００６２】
また、プロテアーゼ処理とＰＯＤ処理とを同時に行うには、例えば、前述のように、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させた後、前記試料に、プロテアーゼ、ＰＯＤおよび発色性基質を同時に添加すればよい。また、この他に、前記分解工程に先立って、ＦＡＯＤと共にＰＯＤを試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび発色性基質を同時に試料に添加してもよい。また、前記分解工程に先立って、ＦＡＯＤと共に発色性基質を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよびＰＯＤを同時に試料に添加することによっても行える。なお、このような場合において、溶血処理を行う際には、前記ＦＡＯＤと共に、さらに溶血試薬を添加すればよい。
【００６３】
前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００６４】
また、本発明においては、より一層、測定精度を向上させるために、プロテアーゼによる分解工程前に、さらに、各種添加剤を添加することもできる。前記添加剤としては、例えば、テトラゾリウム化合物があげられる。前記テトラゾリウム化合物を添加することによって、例えば、以下のような様々な効果を得ることができる。通常、血液試料等には、アスコルビン酸等の還元物質が存在するため、これによって酸化により発色した基質が還元され発色が消失するというような問題が起こるが、テトラゾリウム化合物の添加によって、このような問題が回避でき、測定精度をさらに向上できる。また、テトラゾリウム化合物の添加により、測定対象糖化アミンの分解が促進され、効率良くＦＡＯＤが分解物に作用するという効果もある。
【００６５】
前記テトラゾリウム化合物としては、その種類は特に制限されないが、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムや、その塩（例えば、モノナトリウム塩）等があげられる。
【００６６】
また、前記テトラゾリウム化合物と同様に、ＷＯ ０３／１０７０１１に開示されているようなスルホン酸化合物やニトロ化合物等も使用できる。具体例としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬｉＬＳ）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（ＡＢＳＡ）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＤＳ）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＤＡＤＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、バソフェナントロリンスルホン酸等や、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ２）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＰＳ）、ニトロベンゼン等があげられる。
【００６７】
また、さらに、前述のようなテトラゾリウム化合物の効果を向上するために、例えば、界面活性剤をあわせて前記試料に添加することが好ましい。前記界面活性剤としては、特に制限されないが、トリトンＸ−１００やＴＷＥＥＮ２０などに代表される非イオン性界面活性剤；ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ＣＨＡＰＳ等に代表される陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等に代表される陽イオン界面活性剤等があげられる。また、この他にも、尿素等が添加物として使用できる。
【００６８】
一般に糖化アミン（特に糖化タンパク質）の糖化率を求める場合には、タンパク質の量とタンパク質の糖化量をそれぞれ測定し、この両者から糖化率が算出される。本発明の測定方法において、測定対象糖化アミンが糖化Ｈｂの場合、Ｈｂの測定は、従来公知の方法で行うこともできるが、例えば、前記試料にテトラゾリウム化合物、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、アジ化ナトリウム等を添加して、前記Ｈｂを変性によって安定化させ、その吸光度を測定することによって求めることもできる（例えば、ＷＯ ０２／２７３３０参照。）。また、測定対象糖化アミンが糖化アルブミンの場合には、オルトクレゾール、ブロムクレゾールグリーン等の公知の物質を用いて、アルブミン量を測定することができる。
【００６９】
つぎに、本発明の測定キットは、前述の本発明の測定方法に使用するための、第１試薬および第２試薬からなる２試薬系キットであり、前記第１試薬は、少なくともＦＡＯＤを含み、第２試薬は、少なくともプロテアーゼを含み、さらに、ＰＯＤおよび酸化により発色する基質のいずれか一方が前記第１試薬に、他方が前記第２試薬に含まれる、または、前記ＰＯＤおよび前記基質の両者が前記第２試薬に含まれることを特徴とする。
【００７０】
本発明の測定キットにおける第１試薬と第２試薬の組み合わせ（Ａ〜Ｃ）の具体例を以下に示す。
（Ａ）第１試薬：ＦＡＯＤ
第２試薬：プロテアーゼ＋ＰＯＤ＋発色性基質
（Ｂ）第１試薬：ＦＡＯＤ＋ＰＯＤ
第２試薬：プロテアーゼ＋発色性基質
（Ｃ）第１試薬：ＦＡＯＤ＋発色性基質
第２試薬：プロテアーゼ＋ＰＯＤ
【００７１】
また、本発明の試薬キットは、さらに測定精度を向上させるために、例えば、前記第１試薬が、前述のような、分解工程前に試料に添加し得るテトラゾリウム化合物、スルホン酸化合物、ニトロ化合物、界面活性剤等の添加物をさらに含んでもよい。また、血球を溶血する場合には、前記第１試薬に、さらに溶血試薬を含有させてもよい。また、各試薬における各成分の含有量は、特に制限されず、これらを反応系に添加した際に、反応液における濃度が前述のような濃度となる範囲に適宜設定できる。
【００７２】
このような本発明の試薬キットは、例えば、まず、試料に前記第１試薬を添加し、その後、前記第２試薬を添加することで、本発明の測定方法を実施することができる。前記第１試薬を添加した後の処理条件（例えば、温度や処理時間等）、ならびに第２試薬を添加した後の処理条件は、前述のとおりである。
【実施例１】
【００７３】
（Ｉ）血球試料に非測定対象糖化アミンとして各種糖化アミノ酸を添加し、血球中のＨｂＡ１ｃの測定を行った。
【００７４】
血球試料
健常者の血液を遠心分離（３０００Ｇ、１０分間）し、回収した血球に下記糖化アミノ酸水溶液と水とを添加して、ヘマトクリット値が６０％である全血試料を調製した。なお、全血試料における前記糖化アミノ酸水溶液の添加割合は、０体積％、１体積％、３体積％とした。前記糖化アミノ酸水溶液は、１６種類の糖化アミノ酸（フルクトシルイソロイシン、フルクトシルロイシン、フルクトシルリジン、フルクトシルメチオニン、フルクトシルフェニルアラニン、フルクトシルトレオニン、フルクトシルトリプトファン、フルクトシルバリン、フルクトシルチロシン、フルクトシルアルギニン、フルクトシルヒスチジン、フルクトシルアラニン、フルクトシルアスパラギン酸、フルクトシルプロリン、フルクトシルセリン、フルクトシルグリシン）を含む溶液であり、各糖化アミノ酸の濃度は、それぞれ約０．０２〜０．４ｗ／ｖ％とした。
【００７５】
（実施例１）
以下に示す操作は、自動分析器（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８、日本電子社製）を用いて行った。まず、前記血球試料０．５８μＬに精製水１５μＬを添加した。なお、精製水を添加したのは、後述する比較例において添加する試薬ａ（１５μＬ）に対する容量補正のためである。続いて、前記血球試料に下記第１試薬を７４μＬ添加し、３７℃で約４分間インキュベートした後、混合溶液の吸光度を測定した（第一測定）。さらに、約１分後に、前記混合溶液に下記第２試薬を１８．５μＬ添加し、３７℃で３分間インキュベートした後、この反応液の吸光度を測定した（第二測定）。吸光度測定は、いずれも主波長７００ｎｍ、副波長５７０ｎｍで行った。そして、第１測定の吸光度に８９．５８／１０８．０８を乗じて用量補正を行い、第二測定の吸光度と前記第１測定の補正した吸光度との差（ΔＡｂｓ．）を求めた。そして、血球試料における糖化アミノ酸溶液の添加量が０体積％の場合のΔＡｂｓ．を１００％とし、各血球試料についてのΔＡｂｓ．の相対値（％）を算出した。この結果を実施例１として、下記表１に示す。なお、このΔＡｂｓ．を、血液試料のＨｂＡ１ｃ濃度として、後に考察する。
【００７６】
【００７７】
（比較例１）
この例は、第１のＦＡＯＤで非測定対象糖化アミンを分解した後、異なる第２のＦＡＯＤを用いて測定対象ＨｂＡ１ｃと酸化還元反応させ、前記ＨｂＡ１ｃの測定を行う従来法に関する比較例である。
【００７８】
前記精製水に代えて試薬ａ−１（１５μＬ）、前記第１試薬に代えて下記試薬ｂ（７４μＬ）、前記第２試薬に代えて下記試薬ｃを添加した以外は、前記実施例１と同様にして吸光度の測定を行い、ΔＡｂｓ．を求め、相対値（％）を算出した。これらの結果を下記表１に示す。下記試薬ａ−１における第１ＦＡＯＤとして商品名ＦＡＯＸ−ＴＥ（キッコーマン社製）を使用し、下記試薬Ｃにおける第２ＦＡＯＤとしてジベレラ属由来ＦＡＯＤ（アークレイ社製）を使用した。なお、比較例１において前記試薬ａ−１は、血球の溶血および非測定対象糖化アミンの分解に使用する試薬であり、試薬ｂはＨｂＡ１ｃの分解に使用する試薬であり、試薬ｃはＨｂＡ１ｃ分解物との酸化還元反応ならびに発色反応に使用する試薬である。
【００７９】
【００８０】
（比較例２）
この例は、ＦＡＯＤで非測定対象糖化アミンを分解した後、前記ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ、さらに同じＦＡＯＤを添加して測定対象ＨｂＡ１ｃの分解物と酸化還元反応させ、前記ＨｂＡ１ｃの測定を行う従来法に関する比較例である。
【００８１】
前記比較例１における前記試薬ａ−１の第１ＦＡＯＤをジベレラ属ＦＡＯＤ（アークレイ社製）に代えた試薬ａ−２を使用した以外は、前記比較例１と同様にして吸光度の測定を行い、ΔＡｂｓ．を求めて相対値（％）を算出した。これらの結果を下記表１に示す。なお、比較例２において、試薬ａ−２と試薬ｃとは同じＦＡＯＤを使用することとなり、試薬ｂはＨｂＡ１ｃの分解ならびに試薬ａ−２におけるＦＡＯＤの失活に使用する試薬となる。
【００８２】
（比較例３）
なお、比較例３としては、前記比較例１における試薬ａ−１にＦＡＯＤを添加せずに精製水で用量補正した試薬ａ−３を使用した以外は、前記比較例１と同様にして吸光度の測定を行い、ΔＡｂｓ．を求め、相対値（％）を算出した。
【００８３】
【００８４】
前記表１に示すように、ＦＡＯＤ無添加の試薬ａ−３を使用した比較例３は、ＨｂＡ１ｃに対するＦＡＯＤを用いた酸化還元反応に先立って、予め試料に添加した糖化アミノ酸が分解されていないため、糖化アミノ酸溶液の添加割合の増加に伴って、ΔＡｂｓ．の相対値の著しい上昇が確認された。特に、糖化アミノ酸溶液の添加割合が３体積％の場合、ΔＡｂｓ．が約７５倍もの値を示した。また、前記酸化還元反応に先立って、添加した糖化アミノ酸をＦＡＯＤによって処理した比較例１および２については、比較例３よりは抑制されたものの、ΔＡｂｓ．の相対値の上昇は顕著であり、糖化アミノ酸溶液の添加割合が３体積％の場合、ΔＡｂｓ．は、比較例１で約３倍、比較例２で約９．５倍の値を示した。これに対して、実施例１は、糖化アミノ酸溶液の添加割合を増加させてもΔＡｂｓ．の相対値には著しい変化はみられず、ほぼ一定の値を示し、糖化アミノ酸溶液の添加割合が３体積％の場合であっても、ΔＡｂｓ．は１割程度の変化しかみられなかった。このような結果から、実施例によれば、非測定対象物である糖化アミノ酸が高濃度であっても、非常に効果的な処理が可能であり、これによって測定対象糖化アミンを高精度に測定できることがわかる。
【００８５】
（ＩＩ）さらに、実施例１における試薬１のＦＡＯＤ濃度を変化させて、前記実施例１と同様の吸光度測定を行い、ΔＡｂｓ．の相対値を算出した（第１試薬におけるＦＡＯＤ濃度：３、５、１０ＫＵ／Ｌ）。また、比較例１に関しては試薬ａ−１のＦＡＯＤ濃度、比較例２に関しては試薬ａ−２のＦＡＯＤ濃度をそれぞれ変化させ、同様にしてΔＡｂｓ．の相対値を算出した（前記試薬ａ−１および試薬ａ−２におけるＦＡＯＤ濃度：０．３、３、３０ＫＵ／Ｌ）。これらの結果を下記表２に示す。なお、下記表２において、ＦＡＯＤ濃度とは、実施例については第１試薬、比較例１については試薬ａ−１、比較例２については試薬ａ−２、比較例３については試薬ａ−３における濃度を表す。
【００８６】
【００８７】
前記表２に示すように、未処理の比較例３に対して、比較例１においては、試薬ａ−１におけるＦＡＯＤ濃度を増加することによって、試料に添加した糖化アミノ酸を除去する能力は向上した。しかしながら、前述のように、糖化アミノ酸を除去するための試薬ａ−１のＦＡＯＤと、測定対象ＨｂＡ１ｃとの酸化還元反応に使用する試薬ｃのＦＡＯＤとは、触媒機能が異なるため、試薬ｃのＦＡＯＤが作用する糖化アミノ酸が残存し、吸光度の上昇をより一層抑制することはできなかった。また、比較例２においては、試薬ａ−２のＦＡＯＤ濃度を増加させると、糖化アミノ酸を除去する能力は向上するが、さらにＦＡＯＤ濃度を増加させると、試薬ｂによりプロテアーゼを添加しても、反対に前記ＦＡＯＤが失活することなく大量に残存する。このため、試薬Ｃを添加する以前に、残存ＦＡＯＤとＨｂ分解物とが反応してしまい、また、残存ＦＡＯＤにより発生した過酸化水素を、３試薬系であるために迅速にＰＯＤと反応させることもできず、反対に吸光度が低下してしまうという結果となった。これに対して、実施例１は、ＦＡＯＤの添加割合を変化させても、これに伴う吸光度の変化は特に見られなかったため、ＦＡＯＤの添加量によっては、測定系が影響を受けることなく、十分な精度での測定が可能であることがわかる。
【実施例２】
【００８８】
本発明における２試薬系試薬キットのバリエーションについて確認を行った。
【００８９】
（試料）
凍結乾燥されたグリコヘモグロビンコントロール血液を精製水１．８ｍＬで溶解して試料を調製した。なお、前記凍結乾燥品としては、低濃度（Ｈｂ＝２．４ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ％＝４．３％）、中濃度（Ｈｂ＝３．５ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ％＝９．０％）、高濃度（Ｈｂ＝３．１ｇ／Ｌ，ＨｂＡ１ｃ％＝１１．７％）の３種類を使用した。
【００９０】
（試薬）
下記表３に示す第１試薬（２−１、２−２、２−３）および第２試薬（２−１、２−２、２−３）をそれぞれ、下記表４に示す組み合わせとなるように使用した。
【００９１】
【００９２】
（測定方法）
前記試料１３μＬと第１試薬７６μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベーションした。さらに、第２試薬２８μＬを混合して３７℃で１０分間インキュベーションした後、前記自動分析器により波長７５１ｎｍの吸光度を測定した。その結果を下記表４に示す。
【００９３】
【００９４】
前記表４に示すように、ＰＯＤおよび発色性基質を第１試薬に含有させた実施例２−１、発色性基質を第２試薬に含有させた実施例２−２、および、ＰＯＤを第２試薬、発色性基質を第１試薬に含有させた実施例２−３は、それぞれ同様の結果を示し、試料中のＨｂＡ１ｃ（％）に応じて吸光度は上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
以上のように、本発明の測定方法によれば、ＦＡＯＤと反応する非測定対象の糖化アミンが試料中に含まれる場合であっても、十分にその影響を排除できるため、測定精度に優れる糖化アミンの測定が実現できる。特に、従来の測定方法においては、非測定対象糖化アミンを除去するために、通常、３工程以上の処理が必要であったが、本発明の測定方法によれば、前述のように２工程のみの処理であっても、従来よりも極めて優れた影響除去能を示す。このため、例えば、赤血球中の糖化Ｈｂの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が向上し、糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元反応を用いて、糖化タンパク質等の糖化アミンを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血球中の糖化ヘモグロビン（中でも「ＨｂＡ１ｃ」）は、その濃度が生体血糖値の過去の履歴を反映することから、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このＨｂＡ１ｃの測定は、一般に、免疫学的方法、ＨＰＬＣ法等によって行われている。
【０００３】
しかしながら、全血や血球中には、測定対象である糖化ヘモグロビン（糖化Ｈｂ）以外にも、非測定対象物として、糖化アミン（例えば、糖化アルブミン、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸等）等の種々の糖化物が存在する。このため、このような測定対象物以外の糖化物（非測定対象物）をも測定してしまい、結果的に、真値よりも高い測定値が得られたり、偽陽性を示すという問題がある。
【０００４】
このような問題を解決するために、前記免疫学的方法においては、例えば、以下のような方法が提案されている。すなわち、測定対象物と抗測定対象物抗体との主反応に先立って、非測定対象物と抗非測定対象物抗体とのコンプレックスを形成させ、非測定対象物の構造を、糖化Ｈｂの免疫反応に影響しないものに変化させる方法や（例えば、特許文献１参照）、Ｂ／Ｆ分離によって、試料から非測定対象物を分離除去する方法等である。また、ＨＰＬＣ法においては、例えば、１つの試料について２本のＨＰＬＣカラムを準備し、１本目のカラムで試料から非測定対象物を除去し、２本目のカラムで測定対象物の分離分析を行う方法が提案されている。
【０００５】
しかしながら、前記免疫学的方法によると、高コストであり、また、主反応とは別の抗原抗体反応をさらに必要とするため、反応系の環境設定が複雑化し、測定に長時間を要するという問題がある。また、Ｂ／Ｆ分離については、操作が煩雑になることが明らかである。さらに、抗体は特異性を有する物質（抗原）に対してのみ効果を奏するため、試料に含まれる非測定対象物の種類が不明であったり、その種類が多数である場合等、十分に非測定対象物の影響を排除することは困難である。また、ＨＰＬＣ法においても、２本のカラムを使用するため高コストは回避し難く、また、非測定対象物の分離に時間を有するため、測定精度の向上を目的した場合、測定時間の短縮には限度がある。
【０００６】
一方、近年、糖化Ｈｂをはじめとする各種糖化タンパク質の測定に、酸化還元反応を利用した酵素法が広く適用されており、実用化が図られている。具体的には、以下示すようにして測定されている。
【０００７】
まず、血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料にプロテアーゼを添加して、糖化Ｈｂ分解物を生成させる。さらに、この分解物にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を添加し、これを糖化Ｈｂの糖化部分に作用させ、その酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は前記糖化タンパク質量に対応している。そして、この反応液にペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する基質を添加し、酵素反応により前記発色性基質を発色させる。この発色を測定することにより前記過酸化水素量を測定でき、この結果、血球中の糖化Ｈｂを決定できるのである。
【０００８】
しかし、このような酵素法においても、前述と同様に、試料中に含まれる非測定対象物である糖化物が原因となり、真値よりも高い値を示すという問題がみられる。そこで、この問題を解決するために、酵素法においても次のような方法が本出願人により提案されている（例えば、特許文献２）。
【０００９】
すなわち、第１の方法として、予め、測定対象糖化Ｈｂへの反応性が低いＦＡＯＤ（分解用ＦＡＯＤ）を試料に添加することにより、非測定対象の糖化物を処理しておき、その後、糖化Ｈｂのプロテアーゼ分解物を、糖化Ｈｂへの反応性が高いＦＡＯＤ（測定用ＦＡＯＤ）で処理することによって測定する方法が提案されている。
【００１０】
また、第２の方法として、予め、糖化Ｈｂへの反応性が高い少量のＦＡＯＤ（分解用ＦＡＯＤ）で試料を前処理した後、この試料をプロテアーゼで処理し、再度、前述と同じＦＡＯＤ（測定用ＦＡＯＤ）を添加する方法が提案されている。この第２の方法において、分解用ＦＡＯＤの添加量を少量とする、詳しくは、測定用ＦＡＯＤに対する前処理用ＦＡＯＤの比を小さくするのは、速度論の点から、前処理の段階における糖化ＨｂとＦＡＯＤとの反応を防止するためである。さらに、前記第２の方法におけるプロテアーゼの添加は、前記糖化Ｈｂの分解を目的とするだけでなく、初めに添加した分解用ＦＡＯＤを失活させることも目的としている。なぜなら、初めに添加した分解用ＦＡＯＤが残存すると、プロテアーゼの添加によって生成された糖化Ｈｂ分解物が残存ＦＡＯＤと反応してしまうからである。
【特許文献１】特開２０００−１８０４３９号公報
【特許文献２】国際公開第０３−０３３７２９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来の第１の酵素法によると、予め前処理用ＦＡＯＤにより非測定対象物に対する前処理を行っても、主反応に使用する測定用ＦＡＯＤは異なる触媒機能であるために、この測定用ＦＡＯＤが作用する非測定対象物は処理し切れてない状態となる。このため、測定精度の向上は見られるものの、さらなる精度の向上が求められている。また、第１の酵素法では、（１）前処理用ＦＡＯＤ、（２）プロテアーゼ、（３）測定用ＦＡＯＤ（＋ＰＯＤ）という、少なくとも３種類の試薬をそれぞれ別個に使用した三段階の反応が必須となるため、測定に時間がかかり、試薬の調製にも手間がかかる。
【００１２】
一方、従来の第２の酵素法では、前述のように、前処理ＦＡＯＤの添加量を少量とする必要があり、かつ、測定用ＦＡＯＤの添加に先立って、前処理用ＦＡＯＤをほぼ完全に失活させることが重要となる。しかし、前処理ＦＡＯＤを少量とすると、非測定対象物を消化するために十分な処理時間の確保が必要となり、完全な消化を試みると、処理時間が長くなり、ひいては全測定時間が長くなるという問題がある。さらに、前処理ＦＡＯＤ、プロテアーゼ、測定用ＦＡＯＤによる各処理は、いずれも同時に行うことができないことも、測定時間に影響を与えている。
【００１３】
そこで、本発明は、糖化アミンの測定方法の提供であって、これによって、容易且つ簡便に、信頼性に優れた糖化アミンの測定を可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明の糖化アミン測定方法は、プロテアーゼを試料に添加して、前記プロテアーゼにより前記試料中の測定対象である糖化アミンを分解する工程と、前記試料にＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを糖化アミンの分解物に作用させて酸化還元反応を行う工程と、前記酸化還元反応を測定する工程と、前記酸化還元反応の測定結果により、前記糖化アミンの量を決定する工程とを含む、糖化アミンの測定方法であって、さらに、前記測定対象糖化アミンとは別に前記試料中に存在する非測定対象である糖化アミンの影響を除去することを目的として、前記プロテアーゼを添加する分解工程に先立ち、前記試料に前記ＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程を含み、前記分解工程に先立って添加したＦＡＯＤによって、前記分解工程後の前記酸化還元反応を行うことを特徴とする。なお、本発明において測定対象物である糖化アミンは、「測定対象糖化アミン」と、非測定対象物である糖化アミンは、「非測定対象糖化アミン」といい、非測定対象糖化アミンに対するＦＡＯＤ反応を「前処理反応」、測定対象糖化アミンに対するＦＡＯＤ反応を「主反応」ともいう。
【００１５】
前記ＦＡＯＤは一般名称であって、その基質特異性はＦＡＯＤの種類により様々であり、糖化アミノ酸だけでなく、糖化ペプチドや糖化タンパク質にも作用し得る酵素である。また、前記糖化アミンとしては、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸等が含まれるが、本発明において「測定対象糖化アミン」とは、糖化タンパク質または糖化ペプチドを示す。
【発明の効果】
【００１６】
本発明者らは、糖化Ｈｂをはじめとする糖化アミンの測定方法について鋭意研究を行った。その結果、予め試料にＦＡＯＤを添加することによって非測定対象糖化アミンを処理した後、プロテアーゼを添加して、このプロテアーゼによる測定対象糖化アミンの分解物に、すでに添加されているＦＡＯＤを作用させるという本発明に想到した。この方法によれば、予め試料にＦＡＯＤを添加して、非測定対象物を処理するため、プロテアーゼによる分解反応ならびに主反応を行う際には、ＦＡＯＤと作用する非測定対象物はすでに消化されていることとなる。したがって、非測定対象物が原因となる偽陽性や測定値の上昇（高値化）を防止し、著しく優れた測定精度を確保できるのである。また、本発明によれば、予めＦＡＯＤによって非測定対象糖化アミンを処理さえすれば、その後は、後述するように、プロテアーゼによる測定対象物の分解、酸化還元反応等は、経時的に行ってもよいし同時に行うこともできる。このため、測定における反応工程数を極めて少ない２工程にまで減少することができ、簡便な操作が可能になる。また、臨床検査だけなく食品分析等にも広く適用されている従来の酵素法においては、サンプルをプロテアーゼで処理した後に、主反応の酵素を添加することが基本形態であり、本発明のように、プロテアーゼの添加に先立って主反応の酵素ＦＡＯＤを添加できることも、本発明者らが初めて見出したことである。したがって、このような本発明の測定方法を、例えば、前述のような糖化Ｈｂの測定に適用すれば、糖化Ｈｂの糖尿病診断の指標としての信頼性も増し、臨床医療等の分野において有用な方法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の測定方法は、前述のように、プロテアーゼを試料に添加して、前記プロテアーゼにより前記試料中の測定対象である糖化アミンを分解する工程と、前記試料にＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを糖化アミンの分解物に作用させて酸化還元反応を行う工程と、前記酸化還元反応を測定する工程と、前記酸化還元反応の測定結果により、前記糖化アミンの量を決定する工程とを含む、糖化アミンの測定方法であって、さらに、前記測定対象糖化アミンとは別に前記試料中に存在する非測定対象である糖化アミンの影響を除去することを目的として、前記プロテアーゼを添加する分解工程に先立ち、前記試料に前記ＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程（前処理工程）を含み、前記分解工程に先立って添加したＦＡＯＤによって、前記分解工程後の前記酸化還元反応を行うことを特徴とする。つまり、前記分解工程前に、前記非測定対象糖化アミンに作用させるために添加したＦＡＯＤによって、さらに、前記分解工程後の酸化還元反応を行うことができるのである。
【００１８】
前記測定対象物としては、前述のような酸化還元反応を利用できる糖化アミンであれば特に制限されず、本発明による測定が可能である。具体的な測定対象糖化アミンとしては、糖化Ｈｂ、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチドがあげられ、本発明の測定方法は、中でも血球内糖化アミン、特に糖化Ｈｂの測定に有用である。
【００１９】
本発明において、前記酸化還元反応工程は、例えば、ＦＡＯＤを糖化アミン分解物に作用させて過酸化水素を発生させる工程であり、前記酸化還元反応を測定する工程は、前記試料に酸化酵素（例えば、ＰＯＤ）と酸化により発色する基質とを添加して、前記発生した過酸化水素と前記基質とを前記酸化酵素により反応させる工程を含むことが好ましい。この反応により前記基質が発色するため、この発色量の測定により、前記酸化還元反応を測定できる。
【００２０】
本発明において、前記分解工程と、前記酸化還元反応工程と、前記酸化還元反応を測定する工程とを同時に行うことが好ましい。これによって、測定工程が低減され、操作を迅速かつ簡便に行うことができる。具体的には、例えば、（１）前記前処理工程の後、前記試料に、プロテアーゼ、酸化酵素および酸化により発色する基質を同時に添加する、（２）前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化酵素を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化により発色する基質を同時に前記試料に添加する、または、（３）前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化により発色する基質を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化酵素を同時に前記試料に添加することによって、前述の３つの工程を同時に行うことができる。
【００２１】
本発明の測定方法において使用するＦＡＯＤは、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましく、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）、アミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−Ｓ」という）、α−アミノ基が糖化された糖化アミンおよびアミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンのいずれにも特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）等があげられる。
【００２２】
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ＋ＮＨ２−Ｒ２＋Ｈ２Ｏ２ …（１）
【００２３】
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００２４】
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチド（糖化タンパク質を含む）の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基（アミノ酸側鎖のアミノ基）が糖化されている場合とで異なる。
【００２５】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−αおよびＦＡＯＤ−αＳである。
【００２６】
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
【００２７】
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００２８】
−（ＮＨ−ＣＲ３Ｈ−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
【００２９】
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−ＳおよびＦＡＯＤ−αＳである。
【００３０】
−Ｒ５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４）
【００３１】
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
【００３２】
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００３３】
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５）
【００３４】
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００３５】
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６）
【００３６】
前記糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αとしては、例えば、市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−ＴＥ）（キッコーマン社製）、ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）等があげられる。前記アミノ酸残基の糖化された側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会 平成１２年度「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀 他」）等があげられる。また、前記糖化α−アミノ基および糖化側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ−αＳとしては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）等があげられる。
【００３７】
これらのＦＡＯＤは、測定対象糖化アミンの種類に応じて適宜決定することができる。測定対象物が前述のように糖化Ｈｂの場合には、そのβ鎖Ｎ末端バリンにおけるα−アミノ基の糖化程度を測定することによってＨｂＡ１ｃ（％）を算出できるため、糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αを使用することが好ましい。特に、ＦＡＯＤ−αである商品名ＦＡＯＸ−ＴＥは、α−アミノ基が糖化された遊離の「バリン」に特異的に作用するため、Ｎ末端配列が「Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・・・」となるβ鎖Ｎ末端バリンや、Ｎ末端配列が「Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ・・・」となるα鎖Ｎ末端バリンからＶａｌを遊離させて、糖化程度を測定するのに適している。また、前記ＦＡＯＤ−α、特に、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＬ２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４５１）から常套手段によって得られるＦＡＯＤを使用することもできる。このＦＡＯＤ−αは、α−アミノ基が糖化された遊離のＶａｌや、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ等に特異的に作用するため、α鎖やβ鎖のＮ末端からこれらの配列を遊離させて、糖化量を測定するのに適している。また、測定対象物が、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸（糖化Ｖａｌ）やペプチド（糖化Ｖａｌ−Ｈｉｓ）、ε−アミノ基が糖化されたアミノ酸（糖化Ｌｙｓ）やペプチド（糖化Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、糖化Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）等の場合には、糖化Ｌｙｓおよび糖化Ｖａｌの両方に特異的に作用するＦＡＯＤ−αＳを使用することが好ましい。
【００３８】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、メタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼが使用できるが、測定対象糖化アミンの種類に応じて選択することが好ましく、特に、測定対象糖化アミンを選択的に分解できるプロテアーゼ、ＦＡＯＤが作用し易い分解物を特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましい。測定対象糖化アミンを選択的に分解できるプロテアーゼであれば、例えば、試料中に他の糖化アミン（特に、糖化タンパク質、糖化ペプチド）が存在する場合であっても、これらの糖化アミンは分解され難く、ＦＡＯＤが作用し易い分解物も発生しないため、測定精度をより一層向上できるからである。具体的に、測定対象物が前述のような糖化Ｈｂである場合、糖化Ｈｂを選択的に分解するプロテアーゼが好ましく、例えば、メタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼ等があげられ、より好ましくはメタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。
【００３９】
また、前述のようなＦＡＯＤ−αを使用する際には、ＦＡＯＤ−αが作用し易い分解物、例えば、β鎖Ｎ末端バリン、もしくはこれを含むペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を、特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましく、ズブチリシン、プロナーゼ、アンギオテンシン変換酵素等が使用できる。具体的には、例えば、糖化Ｈｂをズブチリシン、プロナーゼ等で処理することによってＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのトリペプチドを遊離でき、さらにＨｉｓ−Ｌｅｕに特異的なアンギオテンシン変換酵素で処理すれば、糖化バリン（フルクトシルバリン）を遊離することができる。
【００４０】
また、フサリウム属（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＬ２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４５１））由来のＦＡＯＤ−αを使用する際には、例えば、α鎖Ｎ末端バリン、もしくはこれを含むペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を、特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましく、例えば、エンドプロティナーゼＡＳＰ−Ｎ等が使用できる。具体的には、例えば、糖化Ｈｂを前記エンドプロティナーゼＡＳＰ−Ｎで処理することによって、
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐペプチドを遊離でき、さらにカルボキシペプチダーゼＹで処理することによって糖化Ｖａｌ−Ｌｅｕを遊離できる。また、糖化アルブミンの場合は、例えば、プロテイナーゼＫ、ズブチリシン、フィシン、エラスターゼ、サーモリシン等が使用でき、アルブミンの種類（例えば、ＨＳＡ，ＢＳＡ等）はその由来に何ら制限されず、測定できる。
【００４１】
本発明において、測定試料は特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清、血球、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても、本発明の測定方法を適用できる。この中でも、本発明の測定方法は、例えば、前記全血、血漿、血清、血球などの血液試料やその他の生体試料に有用である。例えば、前記血球成分である糖化アミンを測定する場合には、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、点滴等の成分には、例えば、グルコース等の糖類や各種アミノ酸が含まれる場合が多いため、これらの成分から糖化アミンが生成されることにより、患者の血液等に一過的に糖化アミノ酸が増加する場合がある。したがって、このような点滴後の患者の血液試料等にも本発明の測定方法は極めて有用である。
【００４２】
本発明において、前記酸化還元反応の測定は、前記ＦＡＯＤの酸化還元反応により発生した、測定対象糖化アミン由来の過酸化水素量の測定であることが好ましい。過酸化水素の量は、例えば、ＰＯＤによって、測定対象糖化アミン由来の過酸化水素を還元し、同時に酸化により発色する基質（発色性基質）を酸化し、発色した前記基質の発色程度を測定することによって、決定できる。
【００４３】
なお、ＰＯＤの添加順序は特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼの添加前または添加後に添加してもよいし、前記プロテアーゼの添加と同時に添加してもよい。また、発色性基質の添加も同様に制限されない。なお、具体例については後述する。
【００４４】
つぎに、本発明の測定方法について、非測定対象物を含む全血試料における、血球中の糖化Ｈｂを測定する一例をあげて説明する。なお、この実施形態において「糖化アミノ酸」とは、特に示さない限り、試料中に含まれる非測定対象糖化アミノ酸のことをいい、測定対象物である糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物としての糖化アミノ酸は含まない。
【００４５】
まず、全血を溶血して溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００４６】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
【００４７】
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
【００４８】
つぎに、前記溶血試料にＦＡＯＤを添加する。このＦＡＯＤの添加によって、前記溶血試料中の非測定対象糖化アミンであって、前記ＦＡＯＤの基質となり得るものが分解される（前処理工程）。具体的には、ＦＡＯＤが触媒する前記式（１）の反応によって、非測定対象糖化アミンの糖化部分が、過酸化水素の発生を伴って分解される。このように、ＦＡＯＤと反応可能な非測定対象糖化アミンは、この段階ですでに分解されているため、次工程において、糖化Ｈｂをプロテアーゼで分解しても、本工程で添加したＦＡＯＤと非測定対象物とが反応することはなく、糖化Ｈｂ分解物のみをＦＡＯＤと反応させることができるのである。また、この工程と前記溶血処理とを同時に行うこともできる。
【００４９】
なお、この工程で発生した非測定対象由来の過酸化水素は、血球中に含まれるグルタチオンペルオキシダーゼやカタラーゼによって発生と同時に速やかに消失するため、現段階で発生した過酸化水素が、後述する糖化Ｈｂ由来の過酸化水素の測定（ＰＯＤ反応）に影響を及ぼすことはない。このように発生と同時に瞬時に過酸化水素が消化されることは、例えば、反応液中に含まれるＨｂと非測定対象物の含有割合や、反応速度論の点から考慮しても明らかであり、また、ＰＯＤ反応に影響を与えないことは、後述する実施例の結果からも明らかである。
【００５０】
このように、測定対象糖化アミンが糖化Ｈｂをはじめとする血球内成分である場合、血球中に本来存在しているカタラーゼ等によって、非測定対象糖化アミンの分解で発生した過酸化水素が速やかに分解されるために、別途カタラーゼ等を添加することがなく、操作がより一層簡便となる。なお、試料が血球を含まない場合（例えば、血清試料、尿等）、すなわち血球中のカタラーゼを含まない場合には、別途カタラーゼを添加して、非測定対象糖化アミン由来の過酸化水素を消去してもよい。このように前記カタラーゼにより過酸化水素を消去した場合、後に行うＦＡＯＤ処理で生成する過酸化水素までもが消去されることを防ぐために、前記酸化還元反応の測定の際には、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが好ましく、また、前記ＰＯＤおよび発色性基質の添加は、例えば、ＦＡＯＤの添加前またはＦＡＯＤ添加と同時であることが好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
【００５１】
また、非測定対象糖化アミンから発生する過酸化水素を処理する方法としては、この他に以下の方法も採用できる。例えば、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとＰＯＤならびに電子供与体を共存させる方法がある。これによれば、プロテアーゼを添加する前に、非対象糖化アミンより発生した過酸化水素は、ＰＯＤ反応によって脱水素を起こし、電子は電子供与体に供与される。このため、後にプロテアーゼを添加しても、過酸化水素は消去されており、測定対象糖化アミンに対する測定には影響がない。また、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとＰＯＤならびに酸化により発色する発色剤を添加し、この発色量を予め測定しておき、この発色量で補正を行うことも可能である。
【００５２】
前記溶血試料に対するＦＡＯＤの添加量は、非測定対象物の処理ならびに後述する糖化Ｈｂ分解物の処理を十分に行うことができる量であればよい。例えば、溶血試料中のＨｂ濃度等によって適宜決定することができるが、非測定対象物を迅速に消去するために過剰量を添加することが好ましい。具体的には、反応液において、血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、ＦＡＯＤ０．１〜３０Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２〜１０Ｕ／Ｌであり、より好ましくは３〜６Ｕ／Ｌである。また、反応液において、全血濃度が０．３体積％の場合、ＦＡＯＤ０．１〜４５Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２〜１５Ｕ／Ｌであり、より好ましくは３〜９Ｕ／Ｌである。
【００５３】
このＦＡＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応温度は、例えば、２〜６０℃、好ましくは４〜４０℃であり、反応時間は、例えば、１〜３０分間、好ましくは３〜５分間であり、ｐＨは、例えば、６〜９の範囲である。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
【００５４】
なお、前記溶血工程とＦＡＯＤの添加工程は、別々に行ってもよいが、時間の短縮、工程の簡略化の点から、同時に行うことが好ましい。特に、試薬キットを用いた本発明の測定方法の実行を考慮すると、溶血ならびに非測定対象糖化アミンのＦＡＯＤ処理を同時に行うことによって、試薬数を低減できるため好ましい。
【００５５】
続いて、前記ＦＡＯＤを添加した反応液に、さらにプロテアーゼ、およびＰＯＤと酸化により発色する基質（発色性基質）を添加する。このように前記プロテアーゼの添加によって、糖化Ｈｂは、先に添加したＦＡＯＤが作用し易いように分解され、この分解物とＦＡＯＤとの間で前記式（１）に示す反応が起こり、糖化Ｈｂ由来の過酸化水素が発生する。つまり、プロテアーゼの添加によって、自動的にすでに添加されているＦＡＯＤによる酸化還元反応が開始するのである。そして、発生すると同時に、前記過酸化水素はＰＯＤにより還元され、一方、共存する前記発色性基質は酸化され、発色を呈するのである。この発色は、例えば、分光光度計等により吸光度として測定することができ、その結果から過酸化水素量を決定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化Ｈｂの量（糖化量）を求めることができる。
【００５６】
この処理は、通常、前述のような緩衝液中で行われ、条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象の糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５７】
前記反応液中におけるプロテアーゼの濃度は、血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、１０ＫＵ／Ｌ〜３００ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１ＭＵ／Ｕ〜６０ＭＵ／Ｌ、より好ましくは５ＭＵ／Ｌ〜３０ＭＵ／Ｌであり、前記反応液において、全血濃度が０．３体積％の場合、１０ＫＵ／Ｌ〜１５０ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１ＭＵ／Ｌ〜３０ＭＵ／Ｌであり、より好ましくは５ＭＵ／Ｌ〜１５ＭＵ／Ｌである。
【００５８】
また、前記反応液中におけるＰＯＤ濃度は、例えば、過剰量であることが好ましい。ＰＯＤが過剰量であれば、発生と同時に、過酸化水素と迅速に反応させることができ、例えば、試料中のカタラーゼによる影響を十分に抑制できるからである。具体例としては、反応液中の血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、０．０１ＫＵ／Ｌ〜４ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１ＫＵ／Ｌ〜２００ＫＵ／Ｌ、より好ましくは５ＫＵ／Ｌ〜１００ＫＵ／Ｌであり、前記反応液において、全血濃度が０．３体積％の場合、０．０１ＫＵ／Ｌ〜２ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１ＫＵ／Ｌ〜１００ＫＵ／Ｌであり、より好ましくは５ＫＵ／Ｌ〜５０ＫＵ／Ｌである。前記反応液中における発色性基質の濃度は、血球濃度が０．３体積％の場合、例えば、０．０１〜３００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜１００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５〜３０μｍｏｌ／Ｌである。
【００５９】
この処理の条件は、特に制限されないが、反応温度は、例えば、２〜６０℃、好ましくは４〜４０℃であり、反応時間は、例えば、１〜３０分間、好ましくは３〜１０分間であり、ｐＨは、例えば、６〜９の範囲である。
【００６０】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００６１】
本発明において、前記プロテアーゼの添加後に、前記試料にＰＯＤおよび発色性基質を添加して、プロテアーゼ処理とＰＯＤ処理とを別個に行うこともできるが、以下の理由より、前記両処理を同時に行うことが好ましい。すなわち、第１に、プロテアーゼと共に、ＰＯＤおよび発色性基質を添加すれば、発生した過酸化水素は瞬時にＰＯＤと反応し、前述のようにカタラーゼによって消去されるおそれがないからである。第２に、前記両処理を１工程とすれば、測定をよりいっそう簡便かつ迅速に行うことができる。また、第３に、試薬キットを用いた測定を考慮すれば、工程数に応じて試薬数を低減できるため、低コスト化も可能になるからである。特に、従来の第２の酵素法においては、通常、少なくとも分解用ＦＡＯＤ処理、プロテアーゼ処理および測定用ＦＡＯＤ処理という３工程以上の処理が必要であり、また、従来の第１の酵素法でも測定用ＦＡＯＤの安定性の面から、プロテアーゼと測定用ＦＡＯＤを別々の試薬として調製しなければならないために、使用する試薬は少なくとも３試薬系が必要であった。しかしながら、本発明によれば、非測定対象物の除去を１工程（溶血処理を含んでもよい）、プロテアーゼ処理およびＰＯＤ処理を１工程とする合計２工程という、極めて少ない工程数での反応が可能である。このため、ＦＡＯＤを含む試薬（溶血試薬を含んでもよい）、プロテアーゼとＰＯＤと発色性基質とを含む試薬の２試薬系による測定が実現できるのである。このように２試薬系での測定が可能になったことは、コストの面、簡便性の点からも極めて有用である。
【００６２】
また、プロテアーゼ処理とＰＯＤ処理とを同時に行うには、例えば、前述のように、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させた後、前記試料に、プロテアーゼ、ＰＯＤおよび発色性基質を同時に添加すればよい。また、この他に、前記分解工程に先立って、ＦＡＯＤと共にＰＯＤを試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび発色性基質を同時に試料に添加してもよい。また、前記分解工程に先立って、ＦＡＯＤと共に発色性基質を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよびＰＯＤを同時に試料に添加することによっても行える。なお、このような場合において、溶血処理を行う際には、前記ＦＡＯＤと共に、さらに溶血試薬を添加すればよい。
【００６３】
前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００６４】
また、本発明においては、より一層、測定精度を向上させるために、プロテアーゼによる分解工程前に、さらに、各種添加剤を添加することもできる。前記添加剤としては、例えば、テトラゾリウム化合物があげられる。前記テトラゾリウム化合物を添加することによって、例えば、以下のような様々な効果を得ることができる。通常、血液試料等には、アスコルビン酸等の還元物質が存在するため、これによって酸化により発色した基質が還元され発色が消失するというような問題が起こるが、テトラゾリウム化合物の添加によって、このような問題が回避でき、測定精度をさらに向上できる。また、テトラゾリウム化合物の添加により、測定対象糖化アミンの分解が促進され、効率良くＦＡＯＤが分解物に作用するという効果もある。
【００６５】
前記テトラゾリウム化合物としては、その種類は特に制限されないが、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムや、その塩（例えば、モノナトリウム塩）等があげられる。
【００６６】
また、前記テトラゾリウム化合物と同様に、ＷＯ ０３／１０７０１１に開示されているようなスルホン酸化合物やニトロ化合物等も使用できる。具体例としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬｉＬＳ）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（ＡＢＳＡ）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＤＳ）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＤＡＤＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、バソフェナントロリンスルホン酸等や、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ２）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＰＳ）、ニトロベンゼン等があげられる。
【００６７】
また、さらに、前述のようなテトラゾリウム化合物の効果を向上するために、例えば、界面活性剤をあわせて前記試料に添加することが好ましい。前記界面活性剤としては、特に制限されないが、トリトンＸ−１００やＴＷＥＥＮ２０などに代表される非イオン性界面活性剤；ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ＣＨＡＰＳ等に代表される陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等に代表される陽イオン界面活性剤等があげられる。また、この他にも、尿素等が添加物として使用できる。
【００６８】
一般に糖化アミン（特に糖化タンパク質）の糖化率を求める場合には、タンパク質の量とタンパク質の糖化量をそれぞれ測定し、この両者から糖化率が算出される。本発明の測定方法において、測定対象糖化アミンが糖化Ｈｂの場合、Ｈｂの測定は、従来公知の方法で行うこともできるが、例えば、前記試料にテトラゾリウム化合物、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、アジ化ナトリウム等を添加して、前記Ｈｂを変性によって安定化させ、その吸光度を測定することによって求めることもできる（例えば、ＷＯ ０２／２７３３０参照。）。また、測定対象糖化アミンが糖化アルブミンの場合には、オルトクレゾール、ブロムクレゾールグリーン等の公知の物質を用いて、アルブミン量を測定することができる。
【００６９】
つぎに、本発明の測定キットは、前述の本発明の測定方法に使用するための、第１試薬および第２試薬からなる２試薬系キットであり、前記第１試薬は、少なくともＦＡＯＤを含み、第２試薬は、少なくともプロテアーゼを含み、さらに、ＰＯＤおよび酸化により発色する基質のいずれか一方が前記第１試薬に、他方が前記第２試薬に含まれる、または、前記ＰＯＤおよび前記基質の両者が前記第２試薬に含まれることを特徴とする。
【００７０】
本発明の測定キットにおける第１試薬と第２試薬の組み合わせ（Ａ〜Ｃ）の具体例を以下に示す。
（Ａ）第１試薬：ＦＡＯＤ
第２試薬：プロテアーゼ＋ＰＯＤ＋発色性基質
（Ｂ）第１試薬：ＦＡＯＤ＋ＰＯＤ
第２試薬：プロテアーゼ＋発色性基質
（Ｃ）第１試薬：ＦＡＯＤ＋発色性基質
第２試薬：プロテアーゼ＋ＰＯＤ
【００７１】
また、本発明の試薬キットは、さらに測定精度を向上させるために、例えば、前記第１試薬が、前述のような、分解工程前に試料に添加し得るテトラゾリウム化合物、スルホン酸化合物、ニトロ化合物、界面活性剤等の添加物をさらに含んでもよい。また、血球を溶血する場合には、前記第１試薬に、さらに溶血試薬を含有させてもよい。また、各試薬における各成分の含有量は、特に制限されず、これらを反応系に添加した際に、反応液における濃度が前述のような濃度となる範囲に適宜設定できる。
【００７２】
このような本発明の試薬キットは、例えば、まず、試料に前記第１試薬を添加し、その後、前記第２試薬を添加することで、本発明の測定方法を実施することができる。前記第１試薬を添加した後の処理条件（例えば、温度や処理時間等）、ならびに第２試薬を添加した後の処理条件は、前述のとおりである。
【実施例１】
【００７３】
（Ｉ）血球試料に非測定対象糖化アミンとして各種糖化アミノ酸を添加し、血球中のＨｂＡ１ｃの測定を行った。
【００７４】
血球試料
健常者の血液を遠心分離（３０００Ｇ、１０分間）し、回収した血球に下記糖化アミノ酸水溶液と水とを添加して、ヘマトクリット値が６０％である全血試料を調製した。なお、全血試料における前記糖化アミノ酸水溶液の添加割合は、０体積％、１体積％、３体積％とした。前記糖化アミノ酸水溶液は、１６種類の糖化アミノ酸（フルクトシルイソロイシン、フルクトシルロイシン、フルクトシルリジン、フルクトシルメチオニン、フルクトシルフェニルアラニン、フルクトシルトレオニン、フルクトシルトリプトファン、フルクトシルバリン、フルクトシルチロシン、フルクトシルアルギニン、フルクトシルヒスチジン、フルクトシルアラニン、フルクトシルアスパラギン酸、フルクトシルプロリン、フルクトシルセリン、フルクトシルグリシン）を含む溶液であり、各糖化アミノ酸の濃度は、それぞれ約０．０２〜０．４ｗ／ｖ％とした。
【００７５】
（実施例１）
以下に示す操作は、自動分析器（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８、日本電子社製）を用いて行った。まず、前記血球試料０．５８μＬに精製水１５μＬを添加した。なお、精製水を添加したのは、後述する比較例において添加する試薬ａ（１５μＬ）に対する容量補正のためである。続いて、前記血球試料に下記第１試薬を７４μＬ添加し、３７℃で約４分間インキュベートした後、混合溶液の吸光度を測定した（第一測定）。さらに、約１分後に、前記混合溶液に下記第２試薬を１８．５μＬ添加し、３７℃で３分間インキュベートした後、この反応液の吸光度を測定した（第二測定）。吸光度測定は、いずれも主波長７００ｎｍ、副波長５７０ｎｍで行った。そして、第１測定の吸光度に８９．５８／１０８．０８を乗じて用量補正を行い、第二測定の吸光度と前記第１測定の補正した吸光度との差（ΔＡｂｓ．）を求めた。そして、血球試料における糖化アミノ酸溶液の添加量が０体積％の場合のΔＡｂｓ．を１００％とし、各血球試料についてのΔＡｂｓ．の相対値（％）を算出した。この結果を実施例１として、下記表１に示す。なお、このΔＡｂｓ．を、血液試料のＨｂＡ１ｃ濃度として、後に考察する。
【００７６】
【００７７】
（比較例１）
この例は、第１のＦＡＯＤで非測定対象糖化アミンを分解した後、異なる第２のＦＡＯＤを用いて測定対象ＨｂＡ１ｃと酸化還元反応させ、前記ＨｂＡ１ｃの測定を行う従来法に関する比較例である。
【００７８】
前記精製水に代えて試薬ａ−１（１５μＬ）、前記第１試薬に代えて下記試薬ｂ（７４μＬ）、前記第２試薬に代えて下記試薬ｃを添加した以外は、前記実施例１と同様にして吸光度の測定を行い、ΔＡｂｓ．を求め、相対値（％）を算出した。これらの結果を下記表１に示す。下記試薬ａ−１における第１ＦＡＯＤとして商品名ＦＡＯＸ−ＴＥ（キッコーマン社製）を使用し、下記試薬Ｃにおける第２ＦＡＯＤとしてジベレラ属由来ＦＡＯＤ（アークレイ社製）を使用した。なお、比較例１において前記試薬ａ−１は、血球の溶血および非測定対象糖化アミンの分解に使用する試薬であり、試薬ｂはＨｂＡ１ｃの分解に使用する試薬であり、試薬ｃはＨｂＡ１ｃ分解物との酸化還元反応ならびに発色反応に使用する試薬である。
【００７９】
【００８０】
（比較例２）
この例は、ＦＡＯＤで非測定対象糖化アミンを分解した後、前記ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ、さらに同じＦＡＯＤを添加して測定対象ＨｂＡ１ｃの分解物と酸化還元反応させ、前記ＨｂＡ１ｃの測定を行う従来法に関する比較例である。
【００８１】
前記比較例１における前記試薬ａ−１の第１ＦＡＯＤをジベレラ属ＦＡＯＤ（アークレイ社製）に代えた試薬ａ−２を使用した以外は、前記比較例１と同様にして吸光度の測定を行い、ΔＡｂｓ．を求めて相対値（％）を算出した。これらの結果を下記表１に示す。なお、比較例２において、試薬ａ−２と試薬ｃとは同じＦＡＯＤを使用することとなり、試薬ｂはＨｂＡ１ｃの分解ならびに試薬ａ−２におけるＦＡＯＤの失活に使用する試薬となる。
【００８２】
（比較例３）
なお、比較例３としては、前記比較例１における試薬ａ−１にＦＡＯＤを添加せずに精製水で用量補正した試薬ａ−３を使用した以外は、前記比較例１と同様にして吸光度の測定を行い、ΔＡｂｓ．を求め、相対値（％）を算出した。
【００８３】
【００８４】
前記表１に示すように、ＦＡＯＤ無添加の試薬ａ−３を使用した比較例３は、ＨｂＡ１ｃに対するＦＡＯＤを用いた酸化還元反応に先立って、予め試料に添加した糖化アミノ酸が分解されていないため、糖化アミノ酸溶液の添加割合の増加に伴って、ΔＡｂｓ．の相対値の著しい上昇が確認された。特に、糖化アミノ酸溶液の添加割合が３体積％の場合、ΔＡｂｓ．が約７５倍もの値を示した。また、前記酸化還元反応に先立って、添加した糖化アミノ酸をＦＡＯＤによって処理した比較例１および２については、比較例３よりは抑制されたものの、ΔＡｂｓ．の相対値の上昇は顕著であり、糖化アミノ酸溶液の添加割合が３体積％の場合、ΔＡｂｓ．は、比較例１で約３倍、比較例２で約９．５倍の値を示した。これに対して、実施例１は、糖化アミノ酸溶液の添加割合を増加させてもΔＡｂｓ．の相対値には著しい変化はみられず、ほぼ一定の値を示し、糖化アミノ酸溶液の添加割合が３体積％の場合であっても、ΔＡｂｓ．は１割程度の変化しかみられなかった。このような結果から、実施例によれば、非測定対象物である糖化アミノ酸が高濃度であっても、非常に効果的な処理が可能であり、これによって測定対象糖化アミンを高精度に測定できることがわかる。
【００８５】
（ＩＩ）さらに、実施例１における試薬１のＦＡＯＤ濃度を変化させて、前記実施例１と同様の吸光度測定を行い、ΔＡｂｓ．の相対値を算出した（第１試薬におけるＦＡＯＤ濃度：３、５、１０ＫＵ／Ｌ）。また、比較例１に関しては試薬ａ−１のＦＡＯＤ濃度、比較例２に関しては試薬ａ−２のＦＡＯＤ濃度をそれぞれ変化させ、同様にしてΔＡｂｓ．の相対値を算出した（前記試薬ａ−１および試薬ａ−２におけるＦＡＯＤ濃度：０．３、３、３０ＫＵ／Ｌ）。これらの結果を下記表２に示す。なお、下記表２において、ＦＡＯＤ濃度とは、実施例については第１試薬、比較例１については試薬ａ−１、比較例２については試薬ａ−２、比較例３については試薬ａ−３における濃度を表す。
【００８６】
【００８７】
前記表２に示すように、未処理の比較例３に対して、比較例１においては、試薬ａ−１におけるＦＡＯＤ濃度を増加することによって、試料に添加した糖化アミノ酸を除去する能力は向上した。しかしながら、前述のように、糖化アミノ酸を除去するための試薬ａ−１のＦＡＯＤと、測定対象ＨｂＡ１ｃとの酸化還元反応に使用する試薬ｃのＦＡＯＤとは、触媒機能が異なるため、試薬ｃのＦＡＯＤが作用する糖化アミノ酸が残存し、吸光度の上昇をより一層抑制することはできなかった。また、比較例２においては、試薬ａ−２のＦＡＯＤ濃度を増加させると、糖化アミノ酸を除去する能力は向上するが、さらにＦＡＯＤ濃度を増加させると、試薬ｂによりプロテアーゼを添加しても、反対に前記ＦＡＯＤが失活することなく大量に残存する。このため、試薬Ｃを添加する以前に、残存ＦＡＯＤとＨｂ分解物とが反応してしまい、また、残存ＦＡＯＤにより発生した過酸化水素を、３試薬系であるために迅速にＰＯＤと反応させることもできず、反対に吸光度が低下してしまうという結果となった。これに対して、実施例１は、ＦＡＯＤの添加割合を変化させても、これに伴う吸光度の変化は特に見られなかったため、ＦＡＯＤの添加量によっては、測定系が影響を受けることなく、十分な精度での測定が可能であることがわかる。
【実施例２】
【００８８】
本発明における２試薬系試薬キットのバリエーションについて確認を行った。
【００８９】
（試料）
凍結乾燥されたグリコヘモグロビンコントロール血液を精製水１．８ｍＬで溶解して試料を調製した。なお、前記凍結乾燥品としては、低濃度（Ｈｂ＝２．４ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ％＝４．３％）、中濃度（Ｈｂ＝３．５ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ％＝９．０％）、高濃度（Ｈｂ＝３．１ｇ／Ｌ，ＨｂＡ１ｃ％＝１１．７％）の３種類を使用した。
【００９０】
（試薬）
下記表３に示す第１試薬（２−１、２−２、２−３）および第２試薬（２−１、２−２、２−３）をそれぞれ、下記表４に示す組み合わせとなるように使用した。
【００９１】
【００９２】
（測定方法）
前記試料１３μＬと第１試薬７６μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベーションした。さらに、第２試薬２８μＬを混合して３７℃で１０分間インキュベーションした後、前記自動分析器により波長７５１ｎｍの吸光度を測定した。その結果を下記表４に示す。
【００９３】
【００９４】
前記表４に示すように、ＰＯＤおよび発色性基質を第１試薬に含有させた実施例２−１、発色性基質を第２試薬に含有させた実施例２−２、および、ＰＯＤを第２試薬、発色性基質を第１試薬に含有させた実施例２−３は、それぞれ同様の結果を示し、試料中のＨｂＡ１ｃ（％）に応じて吸光度は上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
以上のように、本発明の測定方法によれば、ＦＡＯＤと反応する非測定対象の糖化アミンが試料中に含まれる場合であっても、十分にその影響を排除できるため、測定精度に優れる糖化アミンの測定が実現できる。特に、従来の測定方法においては、非測定対象糖化アミンを除去するために、通常、３工程以上の処理が必要であったが、本発明の測定方法によれば、前述のように２工程のみの処理であっても、従来よりも極めて優れた影響除去能を示す。このため、例えば、赤血球中の糖化Ｈｂの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が向上し、糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼを試料に添加して、前記プロテアーゼにより前記試料中の測定対象である糖化アミンを分解する工程と、前記試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を添加して、前記ＦＡＯＤを糖化アミンの分解物に作用させて酸化還元反応を行う工程と、前記酸化還元反応を測定する工程と、前記酸化還元反応の測定結果により、前記糖化アミンの量を決定する工程とを含む、糖化アミンの測定方法であって、
さらに、前記測定対象糖化アミンとは別に前記試料中に存在する非測定対象である糖化アミンの影響を除去することを目的として、前記プロテアーゼを添加する分解工程に先立ち、前記試料に前記ＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程を含み、
前記分解工程に先立って添加したＦＡＯＤによって、前記分解工程後の前記酸化還元反応を行うことを特徴とする糖化アミンの測定方法。
【請求項２】
前記分解工程と、前記酸化還元工程と、前記酸化還元反応を測定する工程とを同時に行う、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記酸化還元反応工程が、前記ＦＡＯＤを前記糖化アミン分解物に作用させて過酸化水素を発生させる工程である請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記酸化還元反応を測定する工程が、前記試料に酸化酵素と酸化により発色する基質とを添加して、前記発生した過酸化水素と前記基質とを前記酸化酵素により反応させる工程を含む請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程の後、前記試料に、プロテアーゼ、酸化酵素および酸化により発色する基質を同時に添加することによって、前記分解工程、前記酸化還元反応工程ならびに前記酸化還元反応の測定工程を同時に行う、請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化酵素を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化により発色する基質を同時に前記試料に添加することによって、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程の後、前記分解工程、前記酸化還元反応工程ならびに前記酸化還元反応の測定工程を同時に行う、請求項４記載の測定方法。
【請求項７】
前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化により発色する基質を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化酵素を同時に前記試料に添加することによって、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程の後、前記分解工程、前記酸化還元反応工程ならびに前記酸化還元反応の測定工程を同時に行う、請求項４記載の測定方法。
【請求項８】
前記酸化酵素が、ペルオキシダーゼである請求項４記載の測定方法。
【請求項９】
前記ＦＡＯＤが、アミノ酸残基の糖化されたα−アミノ基に特異的に作用する酵素、アミノ酸残基の糖化された側鎖に特異的に作用する酵素、または、アミノ酸残基の糖化されたα−アミノ基およびアミノ酸残基の糖化された側鎖に特異的に作用する酵素である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１０】
前記非測定対象糖化アミンが、糖化アミノ酸である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１１】
前記測定対象糖化アミンが、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１２】
前記測定対象糖化アミンが、血球内糖化アミンである、請求項１記載の測定方法。
【請求項１３】
前記測定対象糖化アミンが、糖化ヘモグロビンである、請求項１記載の測定方法。
【請求項１４】
前記分解工程前に、前記試料に、さらにテトラゾリウム化合物を添加する、請求項１記載の測定方法。
【請求項１５】
前記テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムまたはその塩を含む、請求項１４記載の測定方法。
【請求項１６】
前記分解工程前に、前記試料に、さらに界面活性剤を添加する、請求項１記載の測定方法。
【請求項１７】
前記界面活性剤が、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および陽イオン性界面活性剤の少なくとも一方である、請求項１６記載の測定方法。
【請求項１８】
請求項１記載の測定方法に使用する試薬キットであって、第１試薬および第２試薬からなり、前記第１試薬が少なくともフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を含み、前記第２試薬が、少なくともプロテアーゼを含み、さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質のいずれか一方が前記第１試薬に、他方が前記第２試薬にそれぞれ含まれる、または、前記ペルオキシダーゼおよび前記基質の両者が前記第２試薬に含まれることを特徴とする、試薬キット。
【請求項１９】
前記第１試薬が、さらに、テトラゾリウム化合物を含む、請求項１８記載の試薬キット。
【請求項２０】
前記テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムまたはその塩を含む、請求項１９記載の試薬キット。
【請求項２１】
前記第１試薬が、さらに、界面活性剤を含む、請求項１９記載の試薬キット。
【請求項１】
プロテアーゼを試料に添加して、前記プロテアーゼにより前記試料中の測定対象である糖化アミンを分解する工程と、前記試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を添加して、前記ＦＡＯＤを糖化アミンの分解物に作用させて酸化還元反応を行う工程と、前記酸化還元反応を測定する工程と、前記酸化還元反応の測定結果により、前記糖化アミンの量を決定する工程とを含む、糖化アミンの測定方法であって、
さらに、前記測定対象糖化アミンとは別に前記試料中に存在する非測定対象である糖化アミンの影響を除去することを目的として、前記プロテアーゼを添加する分解工程に先立ち、前記試料に前記ＦＡＯＤを添加して、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程を含み、
前記分解工程に先立って添加したＦＡＯＤによって、前記分解工程後の前記酸化還元反応を行うことを特徴とする糖化アミンの測定方法。
【請求項２】
前記分解工程と、前記酸化還元工程と、前記酸化還元反応を測定する工程とを同時に行う、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記酸化還元反応工程が、前記ＦＡＯＤを前記糖化アミン分解物に作用させて過酸化水素を発生させる工程である請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記酸化還元反応を測定する工程が、前記試料に酸化酵素と酸化により発色する基質とを添加して、前記発生した過酸化水素と前記基質とを前記酸化酵素により反応させる工程を含む請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程の後、前記試料に、プロテアーゼ、酸化酵素および酸化により発色する基質を同時に添加することによって、前記分解工程、前記酸化還元反応工程ならびに前記酸化還元反応の測定工程を同時に行う、請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化酵素を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化により発色する基質を同時に前記試料に添加することによって、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程の後、前記分解工程、前記酸化還元反応工程ならびに前記酸化還元反応の測定工程を同時に行う、請求項４記載の測定方法。
【請求項７】
前記分解工程に先立って、前記ＦＡＯＤと共に前記酸化により発色する基質を前記試料に添加し、さらに、プロテアーゼおよび酸化酵素を同時に前記試料に添加することによって、前記ＦＡＯＤを前記非測定対象糖化アミンに作用させる工程の後、前記分解工程、前記酸化還元反応工程ならびに前記酸化還元反応の測定工程を同時に行う、請求項４記載の測定方法。
【請求項８】
前記酸化酵素が、ペルオキシダーゼである請求項４記載の測定方法。
【請求項９】
前記ＦＡＯＤが、アミノ酸残基の糖化されたα−アミノ基に特異的に作用する酵素、アミノ酸残基の糖化された側鎖に特異的に作用する酵素、または、アミノ酸残基の糖化されたα−アミノ基およびアミノ酸残基の糖化された側鎖に特異的に作用する酵素である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１０】
前記非測定対象糖化アミンが、糖化アミノ酸である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１１】
前記測定対象糖化アミンが、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１２】
前記測定対象糖化アミンが、血球内糖化アミンである、請求項１記載の測定方法。
【請求項１３】
前記測定対象糖化アミンが、糖化ヘモグロビンである、請求項１記載の測定方法。
【請求項１４】
前記分解工程前に、前記試料に、さらにテトラゾリウム化合物を添加する、請求項１記載の測定方法。
【請求項１５】
前記テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムまたはその塩を含む、請求項１４記載の測定方法。
【請求項１６】
前記分解工程前に、前記試料に、さらに界面活性剤を添加する、請求項１記載の測定方法。
【請求項１７】
前記界面活性剤が、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および陽イオン性界面活性剤の少なくとも一方である、請求項１６記載の測定方法。
【請求項１８】
請求項１記載の測定方法に使用する試薬キットであって、第１試薬および第２試薬からなり、前記第１試薬が少なくともフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を含み、前記第２試薬が、少なくともプロテアーゼを含み、さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質のいずれか一方が前記第１試薬に、他方が前記第２試薬にそれぞれ含まれる、または、前記ペルオキシダーゼおよび前記基質の両者が前記第２試薬に含まれることを特徴とする、試薬キット。
【請求項１９】
前記第１試薬が、さらに、テトラゾリウム化合物を含む、請求項１８記載の試薬キット。
【請求項２０】
前記テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムまたはその塩を含む、請求項１９記載の試薬キット。
【請求項２１】
前記第１試薬が、さらに、界面活性剤を含む、請求項１９記載の試薬キット。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６８２３
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６１９９（Ｐ２００５−５１６１９９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８５０３
【国際出願日】平成１６年１２月１０日（２００４．１２．１０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８５０３
【国際出願日】平成１６年１２月１０日（２００４．１２．１０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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