糖及び糖鎖認識機構を利用する物質送達用及びバイオイメージング用バイオナノカプセル
【課題】糖や糖鎖による標的化機構をＢＮＣに搭載し、新しい標的化機構を有するＢＮＣを提供する。
【解決手段】糖鎖もしくはレクチンを提示した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）タンパク質を構成要素とするバイオナノカプセル。
【解決手段】糖鎖もしくはレクチンを提示した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）タンパク質を構成要素とするバイオナノカプセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖及び糖鎖認識機構を利用する物質送達用及びバイオイメージング用バイオナノカプセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の任意の箇所に薬剤や遺伝子を送達する技術（DDS,GDS）に対する社会的な需要はきわめて高い。特に血液中低濃度でも患部にのみ高濃度で集積する「積極的標的化」の技術は非常に重要と考えられており、今までに抗体と抗原、リガンドと受容体などの生体内分子間相互作用を利用して、薬効成分を包含したカプセル（リポソーム等）を送達させる試みがなされてきた。一方、古くから生体内分子間相互作用には糖、糖鎖及びレクチンが関与する事が知られてきたが、糖関係の取り扱い技術が未熟だったため、上記送達技術に応用される事はなかった。最近、産総研の山崎らは様々な糖や糖鎖をリポソーム上に提示して、その体内での挙動を調べたところ、選別機構は不明ながら提示分子依存的に特定の部位に集積する事を見出した。リポソームはただのカプセルであり、生体内安定性が悪く、細胞や組織への取り込みはエンドサイトーシスという遅く効率の悪い経路で行われるが、新しい標的化機構としては非常に有望と考えられる。ただ、多くの糖や糖鎖は物質としては既に公知であり、同じ糖や糖鎖でもリポソーム以外のものを結合させるとリポソームとは異なる部位に集積する可能性が指摘されており、この糖や糖鎖による標的化機構を特許化するにはキャリアーとの組み合わせで行うべきと考えている。
【０００３】
既に我々は、B型肝炎ウイルスの強烈な感染機構を保有しつつ、内部は中空で、あらゆる物質の送達が可能なバイオナノカプセル（BNC）という技術を完成している。これは、リポソームとウイルスの長所を併せ持ち、リポソームの欠点（上述）を有さない画期的な送達技術であり、既に臨床応用された素材であるので非常に有望である。現在、BNC表面に、抗体、抗原、リガンド、ホーミングペプチドなどを提示させて生体内の任意の部位に強力に物質送達させることにも成功している。
【特許文献１】特開2001-316298
【特許文献２】特開2003-286189
【特許文献３】特開2003-286198
【特許文献４】特開2004-002313
【特許文献５】特開2006-265152
【特許文献６】特開2007-106752
【特許文献７】特開2007-209307
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記の糖や糖鎖による標的化機構をＢＮＣに搭載し、新しい標的化機構を有するＢＮＣを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の物質送達用バイオナノカプセルを提供するものである。
「糖鎖もしくはレクチンを提示した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）タンパク質を構成要素とするバイオナノカプセル。」
【発明の効果】
【０００６】
ガラクトース提示型ＢＮＣは、肝細胞アシアロ受容体に認識され幅広い種の肝臓特異的ＢＮＣとなり、シアリルルイスＸ提示型ＢＮＣは、セレクチンに認識され炎症部位特異的ＢＮＣとなる。他の糖及び糖鎖がそれぞれ異なる臓器に集積する。また、今まで標的化分子として使用されてこなかったレクチンも使用できる事が本発明により明らかにされた。具体的には、L4-PHAレクチン提示型BNCは高転移性（β（１→６）分岐GlcNAcを発現する悪性度の高い）癌組織に対して特異的に集積かつ物質送達できることが本発明により示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書において、導入物質を内包する、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)タンパク質またはその改変体を含むバイオナノカプセル（BNC）としては、HBsAgタンパク質粒子などが例示される。なお、HBsAgタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス内部コア抗原(HBcAg)タンパク質と組み合わせて粒子を形成してもよい。
【０００８】
本明細書において、BNC、導入物質(核酸、タンパク質、薬物等)の大きさは、電子顕微鏡により測定してもよく、ゼーターサイザーナノ-ZS（Malvern Instruments）などにより光学的に測定してもよい。
【０００９】
本発明で導入物質を内包するためのBNCは、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質を主成分として包含し、該タンパク質は糖鎖を有していてもよい。また、BNCには脂質成分が含まれていてもよい。
【００１０】
１つの好ましい実施形態において、BNCは、７０〜９０重量部のＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、５〜１５重量部の脂質、５〜１５重量部の糖鎖から構成される。本願の実施例で使用されているBNCは、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質８０重量部、糖鎖１０重量部、脂質１０重量部からなる(J Biotechnol. 1992 Nov;26(2-3):155-62. Characterization of two differently glycosylated molecular species of yeast-derived hepatitis B vaccine carrying the pre-S2 region. Kobayashi M, Asano T, Ohfune K, Kato K.)。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、BNCへの物質の導入は、導入される物質を内部に含むリポソームとBNCを融合することにより実施できる。
【００１２】
なお、本明細書において、「BNC」とは、導入物質を内包する前の粒子と内包した後の粒子の両方の意味で使用される。
【００１３】
HBsAgに包含され、S粒子 の構成要素であるSタンパク質(226アミノ酸)は、粒子 形成能を有している。S粒子 に55アミノ酸からなるPre-S2を付加したのがMタンパク質（M粒子 の構成蛋白）であり、M蛋白に108アミノ酸(サブタイプy)または119アミノ酸(サブタイプd)からなるPre-S1を付加したものがLタンパク質（L粒子 の構成蛋白）である。
【００１４】
なお、本願明細書では特に断らない限り、Pre-S1領域のアミノ酸位置の番号付けは、108アミノ酸のサブタイプyに基づいて行う。
【００１５】
Lタンパク質、Mタンパク質はSタンパク質と同様に粒子形成能を有している。従って、PreS1およびPreS2の2つの領域は任意に置換、付加、欠失、挿入を行ってもよい。例えばPre-S1領域の3-77位(サブタイプy)に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質を用いることで、肝細胞認識能を失った中空のBNCを得ることができる。また、PreS2領域にはアルブミンを介して肝細胞を認識する部位が含まれているので、このアルブミン認識部位を欠失させることもできる。一方、S領域(226アミノ酸)は粒子形成能を担っているので、S領域の改変は、粒子形成能を損なわないように行う必要がある。例えば、S領域の107-148は削除しても粒子形成能を保持するので（J. Virol. 2002 76 (19), 10060-10063）、置換、付加、欠失、挿入等を行ってもよく、C末端部の疎水性の154-226残基も同様に置換、付加、欠失、挿入などを行っても粒子形成能を保持し得る。一方、S領域の8-26残基部(TM1)および80-98残基部(TM2)は膜貫通helix（transmembrane配列）であり、この領域は変異を行わないか、欠失、付加、置換等は、膜貫通特性を維持するように疎水性の残基を残して行うのが望ましい。
【００１６】
1つの好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質の改変体としてはBNCを形成する能力を有する限り種々の改変体が広く包含され、HBsAgを例に取ると、PreS1とPreS2領域に関しては任意の数の置換、欠失、付加、挿入が挙げられ、S領域に関しては、１又は数個もしくは複数個、例えば１〜１２０個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に１〜５個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されていてもよい。置換、付加、欠失、挿入などの変異を導入する方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)）などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段（例えばＤＮＡ合成機を使用する）（J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981)）などが挙げられる。コドンの選択は、宿主のコドンユーセージを考慮して決定できる。Ｑ１２９Ｒおよび／またはＧ１４５ＲのHBsAg改変体を発現させて得られる粒子（BNC(Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ)）は、抗原性が低いため好ましいものである。
【００１７】
本発明のBNCにおいて、糖鎖ないしレクチンは、Lタンパク質、Mタンパク質などの肝細胞を認識可能なタンパク質に連結されても良く、Pre-S1領域の３から７７アミノ酸残基に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質、或いはPreS1とPreS2の両方の領域を欠失させた、細胞認識能を欠くタンパク質に連結してもよい。このような特定の細胞を認識する細胞認識部位として、本発明では糖鎖、レクチンを導入する。
【００１８】
細胞認識部位は、BNCに化学修飾によりビオチンを付加し、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどを介してビオチン標識糖鎖ないしビオチン標識レクチンを提示する方法が挙げられる。
【００１９】
糖鎖としては、ガラクトース残基を有する糖鎖、シアリルルイスＸ又はその誘導体などが挙げられる。レクチンとしては、Ｌ−フコース結合性レクチン、Ｄ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチン、Ｄ−マンノース結合性レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合性レクチン又はシアル酸結合性レクチンが挙げられる。具体的なレクチンとしては、コンカナバリンＡ、ヒマレクチン、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチンなどが挙げられる。使用可能な他の糖鎖を以下の表１に、当該糖鎖の標的臓器を表２に、使用可能な他のレクチンを表３に示す。
【００２０】
【表１−１】
【００２１】
【表１−２】
【００２２】
【表１−３】
【００２３】
【表２−１】
【００２４】
【表２−２】
【００２５】
【表２−３】
【００２６】
【表３】
【００２７】
BNC の大きさは、50〜500nm、好ましくは80〜130nm程度である。BNC は、特に封入される導入物質が大きい場合にはある程度以上の大きさであるのが望ましい。BNC を大きくするためには、例えばS領域のN末端に付加しているPre-S領域のサイズを大きくすると（Pre-S1+Pre-S2を足した１６３残基（サブタイプｙ）よりも大きくすると）粒子 のサイズが大きくなることが本発明者により確認されている。
【００２８】
本発明において、ビオチン結合部位は、ビオチン導入に適したリシン(Lys)残基を有するＺ領域と呼ばれるprotein Aのもつ「抗体Fc領域との結合部位」がタンデムにならんだＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体をHBsAgタンパク質又はその変異体に導入し、このＺＺ領域にビオチン残基を導入することができる。
【００２９】
ＺＺ領域（ＺＺタグ）は、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
ZZタグは、Lys(K)が豊富であり、後でビオチン化する際に側鎖のアミノ基がビオチン化できるため、ビオチンを数多く結合させることができるために好ましい(図１３、図１４参照)。ZZタグ以外にも、Lys(K)残基の豊富なペプチドを導入したＢ型肝炎ウイルスタンパク質改変体は、ビオチン化の効率が高くなるために好ましい。なお、ビオチン化されたアミノ酸(位置)の検出は、必要であればＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体をトリプシンなどのプロテアーゼで消化し、LC-MS、MS/MSなどで解析することにより決定できる。
【００３０】
本発明のビオチン化BNCは、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体を真核細胞で発現することにより得ることができる非ビオチン化BNCを適当なビオチン化剤でビオチン化することにより得ることができる。
【００３１】
ビオチン化剤としては、ビオチンを直接あるいは適当なスペーサーを介して結合するものであればよく、特に限定されない。好ましいビオチン化剤は、-NH-(CH2)n-CO- (n=1〜6)などの脂肪族アミド構造あるいはポリアルキレングリコール構造を有するスペーサーを介して結合される。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール(PBG)、(PEG)-(PPG)-(PEG)ブロック共重合体、(PPG)-(PEG)-(PPG)ブロック共重合体、(PEG)-(PBG)-(PEG)ブロック共重合体、(PBG)-(PEG)-(PBG)ブロック共重合体などがあげられ、好ましくは、PEG、PPG、(PEG)-(PPG)-(PEG)ブロック共重合体、(PPG)-(PEG)-(PPG)ブロック共重合体、より好ましくはPEGがあげられる。好ましいPEG構造は、下記式で表される：
-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-
（式中、nは2〜500、好ましくは2〜100、より好ましくは2〜50、さらに好ましくは４〜10の整数を示す。）
1つの好ましい実施形態において、本発明のビオチン化剤の好ましいスペーサーはポリアルキレングリコール構造を有する。該ポリアルキレングリコール構造は、エステル、アミドまたはチオエーテル結合を介して、好ましくはアミド結合を介してビオチンおよびＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体と各々結合するのが好ましい。
【００３２】
他の1つの好ましい実施形態において、ビオチン化剤としては、たとえば下記の構造のものが使用できる：
X-(CH2)m1-NH-{CO(CH2)nNH}m2-(ビオチニル)
(式中、Xはスルホコハク酸イミドオキシカルボニル基、コハク酸イミドオキシカルボニル基、テトラフルオロフェノキシカルボニル、シアノメチルオキシカルボニル、p-ニトロフェニルオキシカルボニル、I, Br, Clなどのアミノ基と反応してアミド（NHCO）またはアミノアルキル基を形成可能な活性エステル残基、ハロゲン原子を表す。m1は2〜6の整数を表し、m2は0〜50、好ましくは1〜10、より好ましくは0〜5、さらに好ましくは0〜3の整数を示す。)
【００３３】
具体的なビオチン化剤としては、たとえばPierce製のEZ-Link Sulfo-NHS-Biotin、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin、EZ-Link-NHS-PEO4-Solid Phase Biotinylation Kitなどの各種ビオチン化剤が例示される。
【００３４】
ビオチン化剤は、上記のようなビオチン化剤とBNCを1〜37℃、好ましくは室温で反応させればよい。本発明のビオチン化BNCを構成するＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体あたりビオチン残基が0.1〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは3〜8個結合している。本発明者は、ビオチン残基がＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体のほぼすべてのLys残基に導入された場合でも、物質の導入活性が著しく損なわれないことを見出した。多くのLys残基はBNC外表面に存在し、細胞認識に関わっていると考えられ、この知見は意外なものであった。
【００３５】
本発明で使用する多価アビジン物質は、ビオチン化Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体とビオチン化ホーミングペプチドなどのビオチン化生体認識分子を連結できるものであればよく、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましく例示されるが、それ以外にもストレプトアビジン、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)やアビジンが複数個結合した融合蛋白質(リンカーで化学的に結合されていてもよい)などの、複数のビオチンと結合可能な多価アビジン物質は広く包含される。多価アビジン物質は、中性または弱酸性下で中性か弱陰性であるのが良い。
【００３６】
細胞に導入される物質としては、特に限定されず、例えば細胞内に導入されて生理作用を生じる各種薬物、例えばホルモン、リンホカイン、酵素などの生理活性蛋白質；ワクチンとして作用する抗原性蛋白質；細胞内で発現する遺伝子、プラスミド等のポリヌクレオチド、又は発現を誘発もしくは誘導する特定の遺伝子発現に関与するポリヌクレオチド；さらに遺伝子治療のために導入される各種遺伝子及びアンチセンスDNA/RNA及びRNA干渉を引き起こすsiRNA及びRNAi等を挙げることができる。なお、導入される「遺伝子」には、ＤＮＡだけでなくＲＮＡ及び核酸ホモログ（例 BNA等）も含まれる。また、導入される物質は蛋白質、遺伝子などの高分子の生理活性物質が好ましく例示できるが、低分子量の各種薬物に適用しても好ましい結果を得ることができる。また、遺伝子、タンパク質などは天然のものでも合成されたものでもよく、改変された遺伝子、タンパク質であってもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例1
糖鎖提示型ZZ-BNCの作製法
１）ビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCの作製法
ZZ-BNC（特開２００４−２３１３号公報、実施例Ｄ参照） 1 mg に1 mg/ml NHS-Rhodamine(PIERCE)若しくはNHS-Cy7(GE Healthcare) 100μl(100μg,0.1μmol)及び 6.7 mg/ml EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(PIERCE) 100μl(0.67 mg 1.34μmol)を混和して室温で1時間 反応させた。Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare)を充填したEcono-Pac Disposable Chromatography Columns(BIO-RAD)に、反応させたサンプルを投入し、フラクションを回収し、蛍光色のあるフラクションをまとめ、サンプルとして回収した。
回収サンプルをAmicon Ultra-4 Ultracel-100k(MILLIPORE)を用いて2380Gで10分遠心し、限外濾過により１mlまで濃縮した。濃縮したSampleを吸光度測定及びEZ Biotin Quantitation Kit(PIERCE)を用いて定量した(濃度：0.3〜0.4 mg/ml（タンパク質量）、Rhodamine若しくはCy7提示量：220〜330個/BNC、Biotin提示量：440〜770個/BNC)。サンプルを100 μg（タンパク質量）ずつ分注し、0.25g/ml スクロースを20 μl加えて(Final 5％)凍結乾燥し、−20度で保存した。
【００３８】
２）糖鎖の提示法（ガラクトースとシアリルルイスX）
(i)蛍光標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCの作製法（その１）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml β-D-Galactose-PAA-biotin (GlycoTech)をmol比で４：１若しくは４：２若しくは４：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００３９】
(ii) 蛍光標識β-D-Galactoseモノマー提示型 ZZ-BNCの作製法（その２）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml β-D-Galactose-sp-biotin (GlycoTech)をmol比で１：１若しくは１：２若しくは１：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００４０】
(iii) 蛍光標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの作製法（その１）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml Sialyl Lex-PAA-biotin (GlycoTech)をmol比で４：１若しくは４：２若しくは４：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００４１】
(iv) 蛍光標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの作製法（その２）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml Sialyl Lex-sp-biotin (GlycoTech)をmol比で１：１若しくは１：２若しくは１：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００４２】
(v）蛍光標識バイオナノカプセル表面に提示された糖鎖の確認
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml Lewis B-Tetrasaccharide BP-probe (ポリマー型、GlycoTech)をmol比で１：１の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して0.2〜4倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。これらの溶液に、Lewis B-Tetrasaccharide中のフコースを特異的に認識する、ヒイロチャワンタケレクチン結合アガロースビーズ溶液を加えて10分間反応させた後、低速遠心にてビーズを回収した。得られたビーズを洗浄し、Laemmli’s sample bufferで処理した後、Western Blotに供した。Anti-BNC抗体を用いて、ブロットを行ったところ、ZZ-BNCタンパク質のバンドが観察された。このことからLewis B-Tetrasaccharide BP-probeは、ZZ-ＢＮＣ表面に提示されていることが明らかとなった（図１）。以上から、同様な製法による上記β-D-Galactose提示型ZZ-BNC及びSialyl Lex提示型ZZ-BNCについてもZZ-BNC表面に糖鎖が提示されていると考えられた。さらに、このようにして得られた糖鎖提示型ZZ-BNCについて、Zetasizerにより粒子径を測定したところ、直径５０nm前後であることが判明した（図２）。
【００４３】
実施例２
蛍光標識糖鎖提示型ZZ-BNCによる培養細胞のイメージング、並びに、DNA及び蛍光ビーズ封入糖鎖提示型ZZ-BNCによる培養細胞への物質送達
(i) 培養細胞のイメージング
１）蛍光標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる哺乳類肝細胞のイメージング
10%FBS含有DMEMで培養したMH1C1(ラット肝臓癌細胞株)を35 mm径plateに播種し、37度で12時間培養した。培養細胞上清に、Rhodamine標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCまたは陰性コントロールとしてビオチン化Rhodamine標識ZZ-BNCを5μg（粒子分のタンパク質として）添加して、37度で12時間培養した。Hoechst 33342 (Invitrogen)を終濃度0.5μg/mlになるように添加して、37度で30分間インキュベートした後、PBS(-)で細胞を洗浄後、4％PFA（パラフォルムアルデヒド）を添加して、室温で10分間固定した。封埋剤(90% グリセリン、100mM Tris-HCl pH8.0、0.1% p-Phenylendiamine)を加え、共焦点レーザー顕微鏡下で蛍光を観察した。その結果、陰性コントロールであるビオチン化Rhodamine標識ZZ-BNCに比べ、Rhodamine標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCは、標的細胞へと特異的に送達された（図３）。これは、哺乳類肝細胞表面に広く発現するアシアロ糖タンパク質受容体をBNC表面のβ-D-Galactoseが認識して取り込まれたためと考えられた。
【００４４】
２）蛍光標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるセレクチン発現細胞のイメージング
10%FBS含有EMEMで培養したA549(ヒト肺癌細胞株)を３５mm径Plateに播種し、37度で24時間培養した。一方、A549細胞を３５mm径Plateに播種し、11時間培養した後、Recombinant Human IL-1beta(BioVision)を終濃度1ng/mlになるよう添加して13時間培養することで、Sialyl Lexの標的となるセレクチンをA549細胞表面に発現誘導させた。各々の培養細胞に、Rhodamine標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCまたは陰性コントロールとしてビオチン化Rhodamine標識ZZ-BNCを粒子量（タンパク質量）として2μg若しくは5μg添加して37度で1時間、3時間、6時間、12時間、24時間インキュベートした。各時間の細胞にHoechst 33342 (Invitrogen)を終濃度0.5μg/mlになるように添加して37度で30分間インキュベートした。PBS(-)で細胞を洗浄後、4％PFAを添加して室温で10分間インキュベートした後、封埋剤(90% グリセリン、100mM Tris-HCl pH8.0、0.1% p-Phenylendiamine)を加え、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。その結果、Recombinant Human IL-1betaを添加したＡ５４９細胞に対して、陰性コントロールであるRhodamine標識ZZ-BNCに比べ、Rhodamine標識Sialyl Lex提示型 ZZ-BNCは特異的に集積した。未処理のA549に対しては何れも集積しなかった。これは、炎症部位の哺乳類細胞の表面に発現するセレクチンをBNC表面のSialyl Lexが認識して取り込まれたためと考えられた。
【００４５】
(ii)培養細胞へのDNA導入
１）DNA封入β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる哺乳類肝細胞への遺伝子導入
1.5 mg 脂質を含有するCoatsome EL-01-D(日本油脂)1バイアルに250 μg/mlのDNA(プラスミド：CLONTECH社のEGFP発現ベクター) 1 ml溶液を加えて溶解させて室温で15分間反応させた。β-D-Galactose提示型ZZ-BNC100 μg（BNC由来タンパク質量として）に対して脂質量が100 μgになるように混和して室温で15分間反応させた（終容量１ｍL）。MH1C1(ラット肝臓癌細胞株)を10%FBS含有DMEMを含む３５mm径plateに播種し、37度で24時間インキュベートした。上記BNCを100 μl（10μg BNC含有）ずつ細胞に添加して37度で48時間培養した。細胞培養液を調製した後、蛍光光度計を用いてDNAから生成されたGFP由来の蛍光を測定した。その結果、陰性コントロールであるビオチン化ZZ-BNCに比べてβ-D-Galactose提示型ZZ-BNCの方が、標的細胞への高い遺伝子導入効率を示した。また、Sialyl Lex提示型ZZ-BNCをβ-D-Galactose提示型ZZ-BNCの替りに使用したところ、糖鎖依存的にRecombinant Human IL-1betaを添加したA549細胞にのみGFP遺伝子の発現が確認された。以上から、DNA封入糖鎖提示型ZZ-BNCは、糖鎖依存的に標的培養細胞に遺伝子導入できる事が判明した。さらに、DNAの替りに蛍光ビーズを封入した糖鎖提示型ZZ-BNCは、糖鎖依存的に標的培養細胞に蛍光ビーズ送達できる事も判明している。
【００４６】
実施例３
蛍光標識糖鎖提示型ZZ-BNCによる生体内イメージング、並びに、DNA封入糖鎖提示型ZZ-BNCによる生体内への物質送達
(i) Cy7標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる肝臓のイメージング
上記Cy7標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNC、または陰性コントロールとしてビオチン化Cy7標識ZZ-BNCを、マウス(BALBcA/Jcl)に粒子量（タンパク質量）として10μg静脈内投与して0時間〜48時間の間1時間ごとにマウス肝臓若しくは肝癌腫瘍部をOV100 In vivo imaging system(Olympus)で観察した。また、ラット(Wister)に粒子量（タンパク質量）として同じバイオナノカプセルを500μg静脈内投与して0時間〜48時間の間1時間ごとにラット肝臓を同じくOV100 In vivo imaging system(Olympus)で観察した。その結果、ビオチン化Cy7標識ZZ-BNCは肝臓組織に投与後３−４時間で集積し１２時間後には排除されていたが、Cy7標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCは投与後３−４時間の集積度は高く、かつ１２時間後においても排除されていなかった。この結果から、糖鎖提示型ZZ-BNCは生体内における任意の部位（臓器や細胞）を標的化できるものと考えられた。
【００４７】
(ii)β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる肝臓へのDNA送達
上記方法に基づきホタルルシフェラーゼ遺伝子発現ベクター（Promega社）を封入したβ-D-Galactose提示型ZZ-BNCを作製した。陰性コントロールとして、同DNAを封入したビオチン化ZZ-BNCを用意した。マウス(BALBcA/Jcl)に粒子量（タンパク質量）として５0μg静脈内投与して７２時間後、マウス肝臓及び腫瘍臓器を摘出し、常法に従って組織抽出液を作製し、ルシフェリン（Promega社）を用いて各組織での単位タンパク質量あたりのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を化学発光を利用して定量した。その結果、β-D-Galactose提示型ZZ-BNCを投与されたマウス肝臓において、他の臓器よりも高いルシフェラーゼの発現が確認された。また、陰性コントロールのビオチン化ZZ-BNCを投与されたマウスの肝臓におけるルシフェラーゼの発現量は極めて低かった。
【００４８】
(iii) Cy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるEAUマウスの網膜内ぶどう膜炎のイメージング
M. tuberculosis（DIFCO）を終濃度6.0 mg/mlで添加し、完全フロイントアジュバント（CFA, Sigma）でエマルジョン化（100%, v/v）したヒトIRBPペプチド（GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD）200 μgをC57BL/6マウスに皮下免疫した。追加のアジュバントとして同様にCFAでエマルジョン化（0.1%, v/v）した百日咳毒（PTX）0.1 μgを腹腔内投与した。細隙燈顕微鏡で観察し、グレード2ぶどう膜炎（Experimental Autoimmune Uveoretinitis: EAU）マウスとした（Namba K, Ogasawara K, 2000, Thurau SR, Chan CC 1997）。本マウスに於いて、網膜全域の血管内皮細胞にE-セレクチンの強い発現が確認されている。上記方法で作製したCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCおよびその陰性コントロールとしてCy7標識ビオチン化ZZ-BNCを粒子量（タンパク質量）として10μg静脈内投与し、４時間後に2% (wt/vol) エバンスブルー色素(Sigma) 100μlを静脈投与し、10分後に屠殺した。網膜全載(retinal wholemounts)をChan-Lingら（Chan-Ling, Microsc. Res. Techn., 1997）の方法に従い調製した。全網膜組織を4%(v/w)パラホルムアルデヒドで60分間固定後スライドガラスへマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000, Olympus）で観察した。その結果、Cy7標識ビオチン化ZZ-BNCに比べてCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの方が網膜血管内皮細胞周囲の炎症部位へ特異的に集積した。
【００４９】
(iv) Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるEAUマウスの網膜内ぶどう膜炎部位へのDNA導入
上記方法でGFP発現プラスミド（CLONTECH社）を封入したSialyl Lex提示型ZZ-BNCおよび同DNA封入ビオチン化ZZ-BNC を各10 μg（BNCのタンパク質量として）ずつ、EAUマウスの静脈内に投与して１週間後、2% (wt/vol) エバンスブルー色素(Sigma) 100μlを静脈投与し、10分後に屠殺した。網膜全載(retinal wholemounts)をChan-Lingら（Chan-Ling, Microsc. Res. Techn., 1997）の方法に従い調製した。全網膜組織を4%(v/w)パラホルムアルデヒドで60分間固定後スライドガラスへマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000, Olympus）で遺伝子発現を観察した。その結果、陰性コントロールに比べ、Sialyl Lex提示型ZZ-BNCは、網膜血管内皮細胞周囲の炎症部位におけるGFP遺伝子の高い発現が確認された。
【００５０】
(v) Cy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによる関節リウマチ（Collagen-induced arthritis:CIA）動物の炎症部位イメージング
ウシ・タイプ２コラーゲン（Cosmo-Bio, Tokyo, Japan）を0.1M酢酸に溶解（4mg/mL）し、50 μlを同量の完全H37Raアジュバンド（Difco, Detroit, MI）に懸濁させたもの（計100 μl）を、9週齢のDBA/1Jマウスの皮下に投与した。3週後に同様に調整したものを皮下に投与し、ブーストをかける事によりCIAマウスを作成した。本マウスにおいてCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCおよびその陰性コントロールとしてCy7標識ビオチン化ZZ-BNCを、粒子量として10μg静脈内投与し、0時間〜48時間の間1時間ごとにマウス関節炎症部位をOV100 In vivo imaging system(Olympus)で観察した。その結果、陰性コントロールに比べてCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの方がマウス関節炎症部位へ特異的に高度に集積した。さらに、CIAマウスの替りにエールリッヒ担癌ラット(Wister系)に粒子量として500μg静脈内投与し観察した場合にも、炎症部位特異的なBNCの集積が担癌部位において観察された。
【００５１】
(vi) Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるエールリッヒ担癌マウスの炎症部位へのDNA導入
上記方法でGFP発現プラスミド（CLONTECH社）を封入したSialyl Lex提示型ZZ-BNCおよび同DNA封入ビオチン化ZZ-BNC を各10 μg（BNCのタンパク質量として）ずつ、エールリッヒ担癌マウスの静脈内に投与して１週間後、腫瘍部位をIV 100 Intravital Laser Scanning Microscope(Olympus)を用いて観察し、GFP由来の蛍光の存在を評価した。その結果、陰性コントロールに比べ、Sialyl Lex提示型ZZ-BNCは、腫瘍部位での高いGFP遺伝子発現が確認された。
【００５２】
実施例４
レクチン提示型ZZ-BNCの作製法
１）ビオチン化ZZ-BNCの作製法
超純水を用いてSulfo-NHS-Biotin(Pierce)を溶解して10 mMの溶液を作製し、1mlの1 mg/ml zz-BNC溶液に74.2 μlを加えて常温で1時間反応させた。1M Tris-HCl pH8.5溶液を50 μl加えて反応を停止させた。反応液をZeba Desalt Spin Column (Pierce)に供し、溶出液を分取した。各分画中のビオチン濃度を定量し、ZZ-BNCに該当する分画を集め、タンパク質濃度を定量した。ビオチン化ZZ-BNCを100 μgずつ分注し、0.25g/ml スクロース溶液を20 μl加えて凍結乾燥した。上記計算の結果、ZZ-BNCを構成するZZ-ＨＢｓＡｇタンパク質１分子あたり、７〜８分子のビオチンが結合していた。動的光散乱を用いて各ZZ-BNCの粒子径およびゼータ電位を測定したところ、ZZ-BNCとビオチン化ZZ-BNCの間で大差はなかった（粒子径約40 nm, ゼータ電位約50 mV）。
【００５３】
２）レクチンの提示法
ここではモデルのレクチンとして、ビオチン化leukoagglutinating phytohemagglutinin（L4-PHA, 生化学工業）を用いた。該レクチンとストレプトアビジン（生化学工業）がモル比にて1:1となるように混和し、5分間常温で反応させた。更に、同溶液をレクチン：ストレプトアビジン：ZZ-HBsAgタンパク質が1:1:1となるようにビオチン化ZZ-BNC溶液に添加し、30分間常温で反応させた。レクチンがZZ-BNC表面に提示されていることを確認するため、反応が完了した溶液中にanti-BNC抗体結合ビーズ（ダイナボット社ＩＭx同梱品）を添加して免疫沈降を行った。回収したビーズを洗浄し、Laemmli’s sample bufferで熱処理した後、Western Blotに供した。Streptavidinを用いてBlot中のビオチン分子を検出したところ、ビオチン化ZZ-BNCタンパク質およびビオチン化レクチンの分子量に該当する位置にバンドが観察された（粒子径に関しては図４上、Blotに関しては図４下）。また、ビオチン化ZZ-BNCに提示されているレクチンを定量するため、Quarts Crystal Microbalance (アズワン)を用いて結合量を算定したところ、1個のZZ-BNCの表面に約36個のストレプトアビジンと約6個のレクチンが提示されていることが判明した。
【００５４】
実施例５
蛍光標識レクチン提示型ZZ-BNCによる培養細胞のイメージング、並びに、DNA・蛍光ビーズ封入レクチン提示型ZZ-BNCによる培養細胞へのDNA・蛍光ビーズ送達
【００５５】
（i）培養細胞のイメージング
L4-PHAレクチンの標的分子であるβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを多量に発現するN-acetyltransferase V（GnT-V）安定発現MKN45ヒト胃癌細胞（高転移性癌細胞モデル：MKN45-GnT-V）、同じくGnT-Vを過剰発現するWiDrヒト大腸癌細胞（高転移性大腸癌細胞モデル：WiDr-GnT-V）、及び、陰性コントロール細胞としてGnT-Vを過剰発現していないMKN45細胞及びWiDr細胞（図５上の左：細胞抽出液を用いたL4-PHAレクチン結合タンパク質の検出；図５下：L4-PHAレクチンを用いた蛍光法による細胞観察）を24穴primaria細胞培養プレート（Falcon）に1×10４個撒種し、24時間培養した。
【００５６】
上記方法で作製したL4-PHA提示型ZZ-BNC 1 mg（BNC由来タンパク質量として）に、50 μlの生体膜標識用近赤外領域蛍光色素DiD（Invitrogen）溶液 (5 mg/ml)を添加し、遮光状態にて1時間、常温で反応させた。その後、遮光状態にて、Zeba Desalt Spin Columnを用いてDiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNCを精製した。上記培養細胞の上清にDiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNC 1μg（BNC由来タンパク質量として）を添加し、37℃にて3時間培養した後、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、4% パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液を用いて細胞を15分間常温で固定した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡FV-1000（オリンパス）を用いてDiD由来の蛍光を観察した。陰性コントロールとしてDiD標識ビオチン化ZZ-BNCを用いた。その結果、DiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNCは、L4-PHAとβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンの親和性により、β（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを発現する高転移性癌細胞に特異的に集積することが判明した（図６）。
【００５７】
（ii）培養細胞へのＤＮＡ導入
ルシフェラーゼ発現プラスミドpCMV-Luc（Promega社）を封入したL4-PHA提示型ZZ-BNCを作製した。また、陰性コントロールとして同ＤＮＡ封入ビオチン化ZZ-BNCを作製した。具体的には、DNA溶液を超純水で希釈し、250μg/mlにした。この溶液1 mlを用いて凍結乾燥カチオン性リポソームCoatsome-EL-1-D（日本油脂）を溶解し、DNA-リポソーム複合体（リポプレックス）を得た。このリポプレックス溶液67μlに33μlの超純水を加えて全量を100 μlとし、この全量を用いて100 μgの凍結乾燥ビオチン化ZZ-BNCを溶解し、ＤＮＡ封入ビオチン化ZZ-BNCを得た。その後、上記方法に従ってDNA封入L4-PHA提示型ZZ-BNCとした。次に、上記細胞に各BNC 1μg（BNCのタンパク質量として）を投与し、37℃にて3時間培養して細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、更に72時間培養した。その後、細胞抽出液を調製して、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いて、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、L4-PHA提示型ZZ-BNCは、L4-PHAとβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンの親和性により、β（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを発現する高転移性癌細胞に特異的にDNAを送達できることが判明した（図７）。
【００５８】
（iii）培養細胞への蛍光ビーズ導入
培養細胞への巨大物質送達モデルとして、蛍光ビーズ（Rhodamine標識polysteleneビーズ、4%水溶液、粒径100 nm：Invitrogen）を用いた。蛍光ビーズ溶液を超純水で希釈し、2 mlの1%ビーズ溶液を作製した。この溶液2 mlを用いて、凍結乾燥アニオン性リポソームCoatsome EL-1-A（日本油脂）１バイアルを溶解して、蛍光ビーズ封入リポソームを作製した。作製したリポソーム溶液3.28μlを超純水で100 μlにメスアップし、凍結乾燥済みビオチン化ZZ-BNC 100 μgを溶解することで蛍光ビーズ封入ビオチン化ZZ-BNCを得た。その後、上記方法に従って蛍光ビーズ封入L4-PHA提示型ZZ-BNCとした。陰性コントロールとして、蛍光ビーズ封入ビオチン化ZZ-BNCを用意した。次に、上記細胞に各BNC 1μg（BNCのタンパク質量として）を投与し、37℃にて３時間培養して、細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、4% パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液を用いて細胞を15分間常温で固定した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡FV-1000（オリンパス）を用いて蛍光ビーズ由来の蛍光を観察した。その結果、L4-PHA提示型ZZ-BNCは、L4-PHAとβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンの親和性により、β（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを発現する高転移性癌細胞に特異的に蛍光ビーズを送達できることが判明した。
【００５９】
実施例６
蛍光標識レクチン提示型ZZ-BNCによる生体内高転移性腫瘍イメージング、及び、DNA封入レクチン提示型ZZ-BNCによる生体内高転移性腫瘍部位へのDNA送達
【００６０】
（i）生体内高転移性腫瘍のイメージング
高転移性大腸癌モデル細胞であるWiDr-GnT-V細胞1×106個を、50％ MatriGel（BD Bioscience）含有Dulbecco’s Minimal Eagle’s Medium 100μl中で懸濁し、ヌードマウス（5週齢、オス：日本クレア）背部皮下に移植し、腫瘍モデル（Xenograftヌードマウス）を作製した。２〜３週間後、腫瘍直径が1 cm程度に達した後、実験に供した。陰性コントロール動物として、通常のWiDr細胞を腫瘍として同様に保持するXenograftヌードマウスを作製した。次に、体重１ｇあたりDiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNC 1 μg（BNC由来のタンパク質量として）を、尾静脈より投与して、蛍光の腫瘍への集積をin vivo imaging system OV100（オリンパス）を用いて経時的に観察した。その結果、DiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNCは、高転移性腫瘍へ特異的に集積した。本集積は経時的なものであり、投与後から徐々に集積量が増大していき、24時間で最大に達することも判明した（図８）。
【００６１】
（ii）生体内高転移性腫瘍へのＤＮＡ送達
上記の方法によりルシフェラーゼ発現プラスミドpCMV-Luc（Promega社）を封入したL4-PHA提示型ZZ-BNCを作製し、上記腫瘍モデル（Xenograftヌードマウス）に体重１ｇあたりＤＮＡ封入L4-PHA提示型ZZ-BNC 1 μg（BNC由来のタンパク質量として）を、尾静脈より投与して、5日後に腫瘍組織を摘出した。ホモジェナイザーを用いて組織を破砕し、破砕液中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキットを用いて測定した。その結果、腫瘍破砕液中のルシフェラーゼ活性は、陰性コントロール動物由来の腫瘍に比べ、高転移性腫瘍で格段に上昇していた。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＺＺ−ＢＮＣ表面に提示された糖鎖の検出。
【図２】糖鎖提示型ＺＺ−ＢＮＣの粒子径。
【図３】Rhodamine標識ガラクトース提示型ZZ-BNCの肝細胞への特異的集積。
【図４】L4-PHA提示型ZZ-BNCの粒子径、およびZZ-BNC表面に提示されたレクチンの検出。
【図５】標的細胞におけるβ(1→６)GlcNAcの発現および細胞表面へのレクチンの集積。
【図６】標的細胞へのDiD標識L4-PHAレクチン提示型ZZ-BNCの特異的集積。
【図７】ルシフェラーゼ遺伝子封入L4-PHAレクチン提示型ZZ-BNCによる標的細胞特異的遺伝子送達。
【図８】DiD標識L4-PHAレクチン提示型ZZ-BNCの生体内標的腫瘍への経時的集積。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖及び糖鎖認識機構を利用する物質送達用及びバイオイメージング用バイオナノカプセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の任意の箇所に薬剤や遺伝子を送達する技術（DDS,GDS）に対する社会的な需要はきわめて高い。特に血液中低濃度でも患部にのみ高濃度で集積する「積極的標的化」の技術は非常に重要と考えられており、今までに抗体と抗原、リガンドと受容体などの生体内分子間相互作用を利用して、薬効成分を包含したカプセル（リポソーム等）を送達させる試みがなされてきた。一方、古くから生体内分子間相互作用には糖、糖鎖及びレクチンが関与する事が知られてきたが、糖関係の取り扱い技術が未熟だったため、上記送達技術に応用される事はなかった。最近、産総研の山崎らは様々な糖や糖鎖をリポソーム上に提示して、その体内での挙動を調べたところ、選別機構は不明ながら提示分子依存的に特定の部位に集積する事を見出した。リポソームはただのカプセルであり、生体内安定性が悪く、細胞や組織への取り込みはエンドサイトーシスという遅く効率の悪い経路で行われるが、新しい標的化機構としては非常に有望と考えられる。ただ、多くの糖や糖鎖は物質としては既に公知であり、同じ糖や糖鎖でもリポソーム以外のものを結合させるとリポソームとは異なる部位に集積する可能性が指摘されており、この糖や糖鎖による標的化機構を特許化するにはキャリアーとの組み合わせで行うべきと考えている。
【０００３】
既に我々は、B型肝炎ウイルスの強烈な感染機構を保有しつつ、内部は中空で、あらゆる物質の送達が可能なバイオナノカプセル（BNC）という技術を完成している。これは、リポソームとウイルスの長所を併せ持ち、リポソームの欠点（上述）を有さない画期的な送達技術であり、既に臨床応用された素材であるので非常に有望である。現在、BNC表面に、抗体、抗原、リガンド、ホーミングペプチドなどを提示させて生体内の任意の部位に強力に物質送達させることにも成功している。
【特許文献１】特開2001-316298
【特許文献２】特開2003-286189
【特許文献３】特開2003-286198
【特許文献４】特開2004-002313
【特許文献５】特開2006-265152
【特許文献６】特開2007-106752
【特許文献７】特開2007-209307
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記の糖や糖鎖による標的化機構をＢＮＣに搭載し、新しい標的化機構を有するＢＮＣを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の物質送達用バイオナノカプセルを提供するものである。
「糖鎖もしくはレクチンを提示した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）タンパク質を構成要素とするバイオナノカプセル。」
【発明の効果】
【０００６】
ガラクトース提示型ＢＮＣは、肝細胞アシアロ受容体に認識され幅広い種の肝臓特異的ＢＮＣとなり、シアリルルイスＸ提示型ＢＮＣは、セレクチンに認識され炎症部位特異的ＢＮＣとなる。他の糖及び糖鎖がそれぞれ異なる臓器に集積する。また、今まで標的化分子として使用されてこなかったレクチンも使用できる事が本発明により明らかにされた。具体的には、L4-PHAレクチン提示型BNCは高転移性（β（１→６）分岐GlcNAcを発現する悪性度の高い）癌組織に対して特異的に集積かつ物質送達できることが本発明により示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書において、導入物質を内包する、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)タンパク質またはその改変体を含むバイオナノカプセル（BNC）としては、HBsAgタンパク質粒子などが例示される。なお、HBsAgタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス内部コア抗原(HBcAg)タンパク質と組み合わせて粒子を形成してもよい。
【０００８】
本明細書において、BNC、導入物質(核酸、タンパク質、薬物等)の大きさは、電子顕微鏡により測定してもよく、ゼーターサイザーナノ-ZS（Malvern Instruments）などにより光学的に測定してもよい。
【０００９】
本発明で導入物質を内包するためのBNCは、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質を主成分として包含し、該タンパク質は糖鎖を有していてもよい。また、BNCには脂質成分が含まれていてもよい。
【００１０】
１つの好ましい実施形態において、BNCは、７０〜９０重量部のＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、５〜１５重量部の脂質、５〜１５重量部の糖鎖から構成される。本願の実施例で使用されているBNCは、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質８０重量部、糖鎖１０重量部、脂質１０重量部からなる(J Biotechnol. 1992 Nov;26(2-3):155-62. Characterization of two differently glycosylated molecular species of yeast-derived hepatitis B vaccine carrying the pre-S2 region. Kobayashi M, Asano T, Ohfune K, Kato K.)。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、BNCへの物質の導入は、導入される物質を内部に含むリポソームとBNCを融合することにより実施できる。
【００１２】
なお、本明細書において、「BNC」とは、導入物質を内包する前の粒子と内包した後の粒子の両方の意味で使用される。
【００１３】
HBsAgに包含され、S粒子 の構成要素であるSタンパク質(226アミノ酸)は、粒子 形成能を有している。S粒子 に55アミノ酸からなるPre-S2を付加したのがMタンパク質（M粒子 の構成蛋白）であり、M蛋白に108アミノ酸(サブタイプy)または119アミノ酸(サブタイプd)からなるPre-S1を付加したものがLタンパク質（L粒子 の構成蛋白）である。
【００１４】
なお、本願明細書では特に断らない限り、Pre-S1領域のアミノ酸位置の番号付けは、108アミノ酸のサブタイプyに基づいて行う。
【００１５】
Lタンパク質、Mタンパク質はSタンパク質と同様に粒子形成能を有している。従って、PreS1およびPreS2の2つの領域は任意に置換、付加、欠失、挿入を行ってもよい。例えばPre-S1領域の3-77位(サブタイプy)に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質を用いることで、肝細胞認識能を失った中空のBNCを得ることができる。また、PreS2領域にはアルブミンを介して肝細胞を認識する部位が含まれているので、このアルブミン認識部位を欠失させることもできる。一方、S領域(226アミノ酸)は粒子形成能を担っているので、S領域の改変は、粒子形成能を損なわないように行う必要がある。例えば、S領域の107-148は削除しても粒子形成能を保持するので（J. Virol. 2002 76 (19), 10060-10063）、置換、付加、欠失、挿入等を行ってもよく、C末端部の疎水性の154-226残基も同様に置換、付加、欠失、挿入などを行っても粒子形成能を保持し得る。一方、S領域の8-26残基部(TM1)および80-98残基部(TM2)は膜貫通helix（transmembrane配列）であり、この領域は変異を行わないか、欠失、付加、置換等は、膜貫通特性を維持するように疎水性の残基を残して行うのが望ましい。
【００１６】
1つの好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質の改変体としてはBNCを形成する能力を有する限り種々の改変体が広く包含され、HBsAgを例に取ると、PreS1とPreS2領域に関しては任意の数の置換、欠失、付加、挿入が挙げられ、S領域に関しては、１又は数個もしくは複数個、例えば１〜１２０個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に１〜５個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されていてもよい。置換、付加、欠失、挿入などの変異を導入する方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)）などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段（例えばＤＮＡ合成機を使用する）（J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981)）などが挙げられる。コドンの選択は、宿主のコドンユーセージを考慮して決定できる。Ｑ１２９Ｒおよび／またはＧ１４５ＲのHBsAg改変体を発現させて得られる粒子（BNC(Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ)）は、抗原性が低いため好ましいものである。
【００１７】
本発明のBNCにおいて、糖鎖ないしレクチンは、Lタンパク質、Mタンパク質などの肝細胞を認識可能なタンパク質に連結されても良く、Pre-S1領域の３から７７アミノ酸残基に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質、或いはPreS1とPreS2の両方の領域を欠失させた、細胞認識能を欠くタンパク質に連結してもよい。このような特定の細胞を認識する細胞認識部位として、本発明では糖鎖、レクチンを導入する。
【００１８】
細胞認識部位は、BNCに化学修飾によりビオチンを付加し、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどを介してビオチン標識糖鎖ないしビオチン標識レクチンを提示する方法が挙げられる。
【００１９】
糖鎖としては、ガラクトース残基を有する糖鎖、シアリルルイスＸ又はその誘導体などが挙げられる。レクチンとしては、Ｌ−フコース結合性レクチン、Ｄ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチン、Ｄ−マンノース結合性レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合性レクチン又はシアル酸結合性レクチンが挙げられる。具体的なレクチンとしては、コンカナバリンＡ、ヒマレクチン、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチンなどが挙げられる。使用可能な他の糖鎖を以下の表１に、当該糖鎖の標的臓器を表２に、使用可能な他のレクチンを表３に示す。
【００２０】
【表１−１】
【００２１】
【表１−２】
【００２２】
【表１−３】
【００２３】
【表２−１】
【００２４】
【表２−２】
【００２５】
【表２−３】
【００２６】
【表３】
【００２７】
BNC の大きさは、50〜500nm、好ましくは80〜130nm程度である。BNC は、特に封入される導入物質が大きい場合にはある程度以上の大きさであるのが望ましい。BNC を大きくするためには、例えばS領域のN末端に付加しているPre-S領域のサイズを大きくすると（Pre-S1+Pre-S2を足した１６３残基（サブタイプｙ）よりも大きくすると）粒子 のサイズが大きくなることが本発明者により確認されている。
【００２８】
本発明において、ビオチン結合部位は、ビオチン導入に適したリシン(Lys)残基を有するＺ領域と呼ばれるprotein Aのもつ「抗体Fc領域との結合部位」がタンデムにならんだＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体をHBsAgタンパク質又はその変異体に導入し、このＺＺ領域にビオチン残基を導入することができる。
【００２９】
ＺＺ領域（ＺＺタグ）は、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
ZZタグは、Lys(K)が豊富であり、後でビオチン化する際に側鎖のアミノ基がビオチン化できるため、ビオチンを数多く結合させることができるために好ましい(図１３、図１４参照)。ZZタグ以外にも、Lys(K)残基の豊富なペプチドを導入したＢ型肝炎ウイルスタンパク質改変体は、ビオチン化の効率が高くなるために好ましい。なお、ビオチン化されたアミノ酸(位置)の検出は、必要であればＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体をトリプシンなどのプロテアーゼで消化し、LC-MS、MS/MSなどで解析することにより決定できる。
【００３０】
本発明のビオチン化BNCは、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体を真核細胞で発現することにより得ることができる非ビオチン化BNCを適当なビオチン化剤でビオチン化することにより得ることができる。
【００３１】
ビオチン化剤としては、ビオチンを直接あるいは適当なスペーサーを介して結合するものであればよく、特に限定されない。好ましいビオチン化剤は、-NH-(CH2)n-CO- (n=1〜6)などの脂肪族アミド構造あるいはポリアルキレングリコール構造を有するスペーサーを介して結合される。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール(PBG)、(PEG)-(PPG)-(PEG)ブロック共重合体、(PPG)-(PEG)-(PPG)ブロック共重合体、(PEG)-(PBG)-(PEG)ブロック共重合体、(PBG)-(PEG)-(PBG)ブロック共重合体などがあげられ、好ましくは、PEG、PPG、(PEG)-(PPG)-(PEG)ブロック共重合体、(PPG)-(PEG)-(PPG)ブロック共重合体、より好ましくはPEGがあげられる。好ましいPEG構造は、下記式で表される：
-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-
（式中、nは2〜500、好ましくは2〜100、より好ましくは2〜50、さらに好ましくは４〜10の整数を示す。）
1つの好ましい実施形態において、本発明のビオチン化剤の好ましいスペーサーはポリアルキレングリコール構造を有する。該ポリアルキレングリコール構造は、エステル、アミドまたはチオエーテル結合を介して、好ましくはアミド結合を介してビオチンおよびＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体と各々結合するのが好ましい。
【００３２】
他の1つの好ましい実施形態において、ビオチン化剤としては、たとえば下記の構造のものが使用できる：
X-(CH2)m1-NH-{CO(CH2)nNH}m2-(ビオチニル)
(式中、Xはスルホコハク酸イミドオキシカルボニル基、コハク酸イミドオキシカルボニル基、テトラフルオロフェノキシカルボニル、シアノメチルオキシカルボニル、p-ニトロフェニルオキシカルボニル、I, Br, Clなどのアミノ基と反応してアミド（NHCO）またはアミノアルキル基を形成可能な活性エステル残基、ハロゲン原子を表す。m1は2〜6の整数を表し、m2は0〜50、好ましくは1〜10、より好ましくは0〜5、さらに好ましくは0〜3の整数を示す。)
【００３３】
具体的なビオチン化剤としては、たとえばPierce製のEZ-Link Sulfo-NHS-Biotin、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin、EZ-Link-NHS-PEO4-Solid Phase Biotinylation Kitなどの各種ビオチン化剤が例示される。
【００３４】
ビオチン化剤は、上記のようなビオチン化剤とBNCを1〜37℃、好ましくは室温で反応させればよい。本発明のビオチン化BNCを構成するＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体あたりビオチン残基が0.1〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは3〜8個結合している。本発明者は、ビオチン残基がＢ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体のほぼすべてのLys残基に導入された場合でも、物質の導入活性が著しく損なわれないことを見出した。多くのLys残基はBNC外表面に存在し、細胞認識に関わっていると考えられ、この知見は意外なものであった。
【００３５】
本発明で使用する多価アビジン物質は、ビオチン化Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体とビオチン化ホーミングペプチドなどのビオチン化生体認識分子を連結できるものであればよく、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましく例示されるが、それ以外にもストレプトアビジン、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)やアビジンが複数個結合した融合蛋白質(リンカーで化学的に結合されていてもよい)などの、複数のビオチンと結合可能な多価アビジン物質は広く包含される。多価アビジン物質は、中性または弱酸性下で中性か弱陰性であるのが良い。
【００３６】
細胞に導入される物質としては、特に限定されず、例えば細胞内に導入されて生理作用を生じる各種薬物、例えばホルモン、リンホカイン、酵素などの生理活性蛋白質；ワクチンとして作用する抗原性蛋白質；細胞内で発現する遺伝子、プラスミド等のポリヌクレオチド、又は発現を誘発もしくは誘導する特定の遺伝子発現に関与するポリヌクレオチド；さらに遺伝子治療のために導入される各種遺伝子及びアンチセンスDNA/RNA及びRNA干渉を引き起こすsiRNA及びRNAi等を挙げることができる。なお、導入される「遺伝子」には、ＤＮＡだけでなくＲＮＡ及び核酸ホモログ（例 BNA等）も含まれる。また、導入される物質は蛋白質、遺伝子などの高分子の生理活性物質が好ましく例示できるが、低分子量の各種薬物に適用しても好ましい結果を得ることができる。また、遺伝子、タンパク質などは天然のものでも合成されたものでもよく、改変された遺伝子、タンパク質であってもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例1
糖鎖提示型ZZ-BNCの作製法
１）ビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCの作製法
ZZ-BNC（特開２００４−２３１３号公報、実施例Ｄ参照） 1 mg に1 mg/ml NHS-Rhodamine(PIERCE)若しくはNHS-Cy7(GE Healthcare) 100μl(100μg,0.1μmol)及び 6.7 mg/ml EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(PIERCE) 100μl(0.67 mg 1.34μmol)を混和して室温で1時間 反応させた。Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare)を充填したEcono-Pac Disposable Chromatography Columns(BIO-RAD)に、反応させたサンプルを投入し、フラクションを回収し、蛍光色のあるフラクションをまとめ、サンプルとして回収した。
回収サンプルをAmicon Ultra-4 Ultracel-100k(MILLIPORE)を用いて2380Gで10分遠心し、限外濾過により１mlまで濃縮した。濃縮したSampleを吸光度測定及びEZ Biotin Quantitation Kit(PIERCE)を用いて定量した(濃度：0.3〜0.4 mg/ml（タンパク質量）、Rhodamine若しくはCy7提示量：220〜330個/BNC、Biotin提示量：440〜770個/BNC)。サンプルを100 μg（タンパク質量）ずつ分注し、0.25g/ml スクロースを20 μl加えて(Final 5％)凍結乾燥し、−20度で保存した。
【００３８】
２）糖鎖の提示法（ガラクトースとシアリルルイスX）
(i)蛍光標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCの作製法（その１）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml β-D-Galactose-PAA-biotin (GlycoTech)をmol比で４：１若しくは４：２若しくは４：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００３９】
(ii) 蛍光標識β-D-Galactoseモノマー提示型 ZZ-BNCの作製法（その２）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml β-D-Galactose-sp-biotin (GlycoTech)をmol比で１：１若しくは１：２若しくは１：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００４０】
(iii) 蛍光標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの作製法（その１）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml Sialyl Lex-PAA-biotin (GlycoTech)をmol比で４：１若しくは４：２若しくは４：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００４１】
(iv) 蛍光標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの作製法（その２）
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml Sialyl Lex-sp-biotin (GlycoTech)をmol比で１：１若しくは１：２若しくは１：４の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して2倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。
【００４２】
(v）蛍光標識バイオナノカプセル表面に提示された糖鎖の確認
1 mg/ml NeutrAvidin Biotin Binding Protein(PIERCE)と1 mg/ml Lewis B-Tetrasaccharide BP-probe (ポリマー型、GlycoTech)をmol比で１：１の割合で混和し、室温で30分反応させた。混和したサンプルにNeutrAvidin Biotin Binding Proteinに対して0.2〜4倍モル量のビオチン及び蛍光標識ZZ-BNCを加えて、室温で30分反応させた。これらの溶液に、Lewis B-Tetrasaccharide中のフコースを特異的に認識する、ヒイロチャワンタケレクチン結合アガロースビーズ溶液を加えて10分間反応させた後、低速遠心にてビーズを回収した。得られたビーズを洗浄し、Laemmli’s sample bufferで処理した後、Western Blotに供した。Anti-BNC抗体を用いて、ブロットを行ったところ、ZZ-BNCタンパク質のバンドが観察された。このことからLewis B-Tetrasaccharide BP-probeは、ZZ-ＢＮＣ表面に提示されていることが明らかとなった（図１）。以上から、同様な製法による上記β-D-Galactose提示型ZZ-BNC及びSialyl Lex提示型ZZ-BNCについてもZZ-BNC表面に糖鎖が提示されていると考えられた。さらに、このようにして得られた糖鎖提示型ZZ-BNCについて、Zetasizerにより粒子径を測定したところ、直径５０nm前後であることが判明した（図２）。
【００４３】
実施例２
蛍光標識糖鎖提示型ZZ-BNCによる培養細胞のイメージング、並びに、DNA及び蛍光ビーズ封入糖鎖提示型ZZ-BNCによる培養細胞への物質送達
(i) 培養細胞のイメージング
１）蛍光標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる哺乳類肝細胞のイメージング
10%FBS含有DMEMで培養したMH1C1(ラット肝臓癌細胞株)を35 mm径plateに播種し、37度で12時間培養した。培養細胞上清に、Rhodamine標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCまたは陰性コントロールとしてビオチン化Rhodamine標識ZZ-BNCを5μg（粒子分のタンパク質として）添加して、37度で12時間培養した。Hoechst 33342 (Invitrogen)を終濃度0.5μg/mlになるように添加して、37度で30分間インキュベートした後、PBS(-)で細胞を洗浄後、4％PFA（パラフォルムアルデヒド）を添加して、室温で10分間固定した。封埋剤(90% グリセリン、100mM Tris-HCl pH8.0、0.1% p-Phenylendiamine)を加え、共焦点レーザー顕微鏡下で蛍光を観察した。その結果、陰性コントロールであるビオチン化Rhodamine標識ZZ-BNCに比べ、Rhodamine標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCは、標的細胞へと特異的に送達された（図３）。これは、哺乳類肝細胞表面に広く発現するアシアロ糖タンパク質受容体をBNC表面のβ-D-Galactoseが認識して取り込まれたためと考えられた。
【００４４】
２）蛍光標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるセレクチン発現細胞のイメージング
10%FBS含有EMEMで培養したA549(ヒト肺癌細胞株)を３５mm径Plateに播種し、37度で24時間培養した。一方、A549細胞を３５mm径Plateに播種し、11時間培養した後、Recombinant Human IL-1beta(BioVision)を終濃度1ng/mlになるよう添加して13時間培養することで、Sialyl Lexの標的となるセレクチンをA549細胞表面に発現誘導させた。各々の培養細胞に、Rhodamine標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCまたは陰性コントロールとしてビオチン化Rhodamine標識ZZ-BNCを粒子量（タンパク質量）として2μg若しくは5μg添加して37度で1時間、3時間、6時間、12時間、24時間インキュベートした。各時間の細胞にHoechst 33342 (Invitrogen)を終濃度0.5μg/mlになるように添加して37度で30分間インキュベートした。PBS(-)で細胞を洗浄後、4％PFAを添加して室温で10分間インキュベートした後、封埋剤(90% グリセリン、100mM Tris-HCl pH8.0、0.1% p-Phenylendiamine)を加え、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。その結果、Recombinant Human IL-1betaを添加したＡ５４９細胞に対して、陰性コントロールであるRhodamine標識ZZ-BNCに比べ、Rhodamine標識Sialyl Lex提示型 ZZ-BNCは特異的に集積した。未処理のA549に対しては何れも集積しなかった。これは、炎症部位の哺乳類細胞の表面に発現するセレクチンをBNC表面のSialyl Lexが認識して取り込まれたためと考えられた。
【００４５】
(ii)培養細胞へのDNA導入
１）DNA封入β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる哺乳類肝細胞への遺伝子導入
1.5 mg 脂質を含有するCoatsome EL-01-D(日本油脂)1バイアルに250 μg/mlのDNA(プラスミド：CLONTECH社のEGFP発現ベクター) 1 ml溶液を加えて溶解させて室温で15分間反応させた。β-D-Galactose提示型ZZ-BNC100 μg（BNC由来タンパク質量として）に対して脂質量が100 μgになるように混和して室温で15分間反応させた（終容量１ｍL）。MH1C1(ラット肝臓癌細胞株)を10%FBS含有DMEMを含む３５mm径plateに播種し、37度で24時間インキュベートした。上記BNCを100 μl（10μg BNC含有）ずつ細胞に添加して37度で48時間培養した。細胞培養液を調製した後、蛍光光度計を用いてDNAから生成されたGFP由来の蛍光を測定した。その結果、陰性コントロールであるビオチン化ZZ-BNCに比べてβ-D-Galactose提示型ZZ-BNCの方が、標的細胞への高い遺伝子導入効率を示した。また、Sialyl Lex提示型ZZ-BNCをβ-D-Galactose提示型ZZ-BNCの替りに使用したところ、糖鎖依存的にRecombinant Human IL-1betaを添加したA549細胞にのみGFP遺伝子の発現が確認された。以上から、DNA封入糖鎖提示型ZZ-BNCは、糖鎖依存的に標的培養細胞に遺伝子導入できる事が判明した。さらに、DNAの替りに蛍光ビーズを封入した糖鎖提示型ZZ-BNCは、糖鎖依存的に標的培養細胞に蛍光ビーズ送達できる事も判明している。
【００４６】
実施例３
蛍光標識糖鎖提示型ZZ-BNCによる生体内イメージング、並びに、DNA封入糖鎖提示型ZZ-BNCによる生体内への物質送達
(i) Cy7標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる肝臓のイメージング
上記Cy7標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNC、または陰性コントロールとしてビオチン化Cy7標識ZZ-BNCを、マウス(BALBcA/Jcl)に粒子量（タンパク質量）として10μg静脈内投与して0時間〜48時間の間1時間ごとにマウス肝臓若しくは肝癌腫瘍部をOV100 In vivo imaging system(Olympus)で観察した。また、ラット(Wister)に粒子量（タンパク質量）として同じバイオナノカプセルを500μg静脈内投与して0時間〜48時間の間1時間ごとにラット肝臓を同じくOV100 In vivo imaging system(Olympus)で観察した。その結果、ビオチン化Cy7標識ZZ-BNCは肝臓組織に投与後３−４時間で集積し１２時間後には排除されていたが、Cy7標識β-D-Galactose提示型ZZ-BNCは投与後３−４時間の集積度は高く、かつ１２時間後においても排除されていなかった。この結果から、糖鎖提示型ZZ-BNCは生体内における任意の部位（臓器や細胞）を標的化できるものと考えられた。
【００４７】
(ii)β-D-Galactose提示型ZZ-BNCによる肝臓へのDNA送達
上記方法に基づきホタルルシフェラーゼ遺伝子発現ベクター（Promega社）を封入したβ-D-Galactose提示型ZZ-BNCを作製した。陰性コントロールとして、同DNAを封入したビオチン化ZZ-BNCを用意した。マウス(BALBcA/Jcl)に粒子量（タンパク質量）として５0μg静脈内投与して７２時間後、マウス肝臓及び腫瘍臓器を摘出し、常法に従って組織抽出液を作製し、ルシフェリン（Promega社）を用いて各組織での単位タンパク質量あたりのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を化学発光を利用して定量した。その結果、β-D-Galactose提示型ZZ-BNCを投与されたマウス肝臓において、他の臓器よりも高いルシフェラーゼの発現が確認された。また、陰性コントロールのビオチン化ZZ-BNCを投与されたマウスの肝臓におけるルシフェラーゼの発現量は極めて低かった。
【００４８】
(iii) Cy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるEAUマウスの網膜内ぶどう膜炎のイメージング
M. tuberculosis（DIFCO）を終濃度6.0 mg/mlで添加し、完全フロイントアジュバント（CFA, Sigma）でエマルジョン化（100%, v/v）したヒトIRBPペプチド（GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD）200 μgをC57BL/6マウスに皮下免疫した。追加のアジュバントとして同様にCFAでエマルジョン化（0.1%, v/v）した百日咳毒（PTX）0.1 μgを腹腔内投与した。細隙燈顕微鏡で観察し、グレード2ぶどう膜炎（Experimental Autoimmune Uveoretinitis: EAU）マウスとした（Namba K, Ogasawara K, 2000, Thurau SR, Chan CC 1997）。本マウスに於いて、網膜全域の血管内皮細胞にE-セレクチンの強い発現が確認されている。上記方法で作製したCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCおよびその陰性コントロールとしてCy7標識ビオチン化ZZ-BNCを粒子量（タンパク質量）として10μg静脈内投与し、４時間後に2% (wt/vol) エバンスブルー色素(Sigma) 100μlを静脈投与し、10分後に屠殺した。網膜全載(retinal wholemounts)をChan-Lingら（Chan-Ling, Microsc. Res. Techn., 1997）の方法に従い調製した。全網膜組織を4%(v/w)パラホルムアルデヒドで60分間固定後スライドガラスへマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000, Olympus）で観察した。その結果、Cy7標識ビオチン化ZZ-BNCに比べてCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの方が網膜血管内皮細胞周囲の炎症部位へ特異的に集積した。
【００４９】
(iv) Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるEAUマウスの網膜内ぶどう膜炎部位へのDNA導入
上記方法でGFP発現プラスミド（CLONTECH社）を封入したSialyl Lex提示型ZZ-BNCおよび同DNA封入ビオチン化ZZ-BNC を各10 μg（BNCのタンパク質量として）ずつ、EAUマウスの静脈内に投与して１週間後、2% (wt/vol) エバンスブルー色素(Sigma) 100μlを静脈投与し、10分後に屠殺した。網膜全載(retinal wholemounts)をChan-Lingら（Chan-Ling, Microsc. Res. Techn., 1997）の方法に従い調製した。全網膜組織を4%(v/w)パラホルムアルデヒドで60分間固定後スライドガラスへマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000, Olympus）で遺伝子発現を観察した。その結果、陰性コントロールに比べ、Sialyl Lex提示型ZZ-BNCは、網膜血管内皮細胞周囲の炎症部位におけるGFP遺伝子の高い発現が確認された。
【００５０】
(v) Cy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによる関節リウマチ（Collagen-induced arthritis:CIA）動物の炎症部位イメージング
ウシ・タイプ２コラーゲン（Cosmo-Bio, Tokyo, Japan）を0.1M酢酸に溶解（4mg/mL）し、50 μlを同量の完全H37Raアジュバンド（Difco, Detroit, MI）に懸濁させたもの（計100 μl）を、9週齢のDBA/1Jマウスの皮下に投与した。3週後に同様に調整したものを皮下に投与し、ブーストをかける事によりCIAマウスを作成した。本マウスにおいてCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCおよびその陰性コントロールとしてCy7標識ビオチン化ZZ-BNCを、粒子量として10μg静脈内投与し、0時間〜48時間の間1時間ごとにマウス関節炎症部位をOV100 In vivo imaging system(Olympus)で観察した。その結果、陰性コントロールに比べてCy7標識Sialyl Lex提示型ZZ-BNCの方がマウス関節炎症部位へ特異的に高度に集積した。さらに、CIAマウスの替りにエールリッヒ担癌ラット(Wister系)に粒子量として500μg静脈内投与し観察した場合にも、炎症部位特異的なBNCの集積が担癌部位において観察された。
【００５１】
(vi) Sialyl Lex提示型ZZ-BNCによるエールリッヒ担癌マウスの炎症部位へのDNA導入
上記方法でGFP発現プラスミド（CLONTECH社）を封入したSialyl Lex提示型ZZ-BNCおよび同DNA封入ビオチン化ZZ-BNC を各10 μg（BNCのタンパク質量として）ずつ、エールリッヒ担癌マウスの静脈内に投与して１週間後、腫瘍部位をIV 100 Intravital Laser Scanning Microscope(Olympus)を用いて観察し、GFP由来の蛍光の存在を評価した。その結果、陰性コントロールに比べ、Sialyl Lex提示型ZZ-BNCは、腫瘍部位での高いGFP遺伝子発現が確認された。
【００５２】
実施例４
レクチン提示型ZZ-BNCの作製法
１）ビオチン化ZZ-BNCの作製法
超純水を用いてSulfo-NHS-Biotin(Pierce)を溶解して10 mMの溶液を作製し、1mlの1 mg/ml zz-BNC溶液に74.2 μlを加えて常温で1時間反応させた。1M Tris-HCl pH8.5溶液を50 μl加えて反応を停止させた。反応液をZeba Desalt Spin Column (Pierce)に供し、溶出液を分取した。各分画中のビオチン濃度を定量し、ZZ-BNCに該当する分画を集め、タンパク質濃度を定量した。ビオチン化ZZ-BNCを100 μgずつ分注し、0.25g/ml スクロース溶液を20 μl加えて凍結乾燥した。上記計算の結果、ZZ-BNCを構成するZZ-ＨＢｓＡｇタンパク質１分子あたり、７〜８分子のビオチンが結合していた。動的光散乱を用いて各ZZ-BNCの粒子径およびゼータ電位を測定したところ、ZZ-BNCとビオチン化ZZ-BNCの間で大差はなかった（粒子径約40 nm, ゼータ電位約50 mV）。
【００５３】
２）レクチンの提示法
ここではモデルのレクチンとして、ビオチン化leukoagglutinating phytohemagglutinin（L4-PHA, 生化学工業）を用いた。該レクチンとストレプトアビジン（生化学工業）がモル比にて1:1となるように混和し、5分間常温で反応させた。更に、同溶液をレクチン：ストレプトアビジン：ZZ-HBsAgタンパク質が1:1:1となるようにビオチン化ZZ-BNC溶液に添加し、30分間常温で反応させた。レクチンがZZ-BNC表面に提示されていることを確認するため、反応が完了した溶液中にanti-BNC抗体結合ビーズ（ダイナボット社ＩＭx同梱品）を添加して免疫沈降を行った。回収したビーズを洗浄し、Laemmli’s sample bufferで熱処理した後、Western Blotに供した。Streptavidinを用いてBlot中のビオチン分子を検出したところ、ビオチン化ZZ-BNCタンパク質およびビオチン化レクチンの分子量に該当する位置にバンドが観察された（粒子径に関しては図４上、Blotに関しては図４下）。また、ビオチン化ZZ-BNCに提示されているレクチンを定量するため、Quarts Crystal Microbalance (アズワン)を用いて結合量を算定したところ、1個のZZ-BNCの表面に約36個のストレプトアビジンと約6個のレクチンが提示されていることが判明した。
【００５４】
実施例５
蛍光標識レクチン提示型ZZ-BNCによる培養細胞のイメージング、並びに、DNA・蛍光ビーズ封入レクチン提示型ZZ-BNCによる培養細胞へのDNA・蛍光ビーズ送達
【００５５】
（i）培養細胞のイメージング
L4-PHAレクチンの標的分子であるβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを多量に発現するN-acetyltransferase V（GnT-V）安定発現MKN45ヒト胃癌細胞（高転移性癌細胞モデル：MKN45-GnT-V）、同じくGnT-Vを過剰発現するWiDrヒト大腸癌細胞（高転移性大腸癌細胞モデル：WiDr-GnT-V）、及び、陰性コントロール細胞としてGnT-Vを過剰発現していないMKN45細胞及びWiDr細胞（図５上の左：細胞抽出液を用いたL4-PHAレクチン結合タンパク質の検出；図５下：L4-PHAレクチンを用いた蛍光法による細胞観察）を24穴primaria細胞培養プレート（Falcon）に1×10４個撒種し、24時間培養した。
【００５６】
上記方法で作製したL4-PHA提示型ZZ-BNC 1 mg（BNC由来タンパク質量として）に、50 μlの生体膜標識用近赤外領域蛍光色素DiD（Invitrogen）溶液 (5 mg/ml)を添加し、遮光状態にて1時間、常温で反応させた。その後、遮光状態にて、Zeba Desalt Spin Columnを用いてDiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNCを精製した。上記培養細胞の上清にDiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNC 1μg（BNC由来タンパク質量として）を添加し、37℃にて3時間培養した後、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、4% パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液を用いて細胞を15分間常温で固定した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡FV-1000（オリンパス）を用いてDiD由来の蛍光を観察した。陰性コントロールとしてDiD標識ビオチン化ZZ-BNCを用いた。その結果、DiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNCは、L4-PHAとβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンの親和性により、β（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを発現する高転移性癌細胞に特異的に集積することが判明した（図６）。
【００５７】
（ii）培養細胞へのＤＮＡ導入
ルシフェラーゼ発現プラスミドpCMV-Luc（Promega社）を封入したL4-PHA提示型ZZ-BNCを作製した。また、陰性コントロールとして同ＤＮＡ封入ビオチン化ZZ-BNCを作製した。具体的には、DNA溶液を超純水で希釈し、250μg/mlにした。この溶液1 mlを用いて凍結乾燥カチオン性リポソームCoatsome-EL-1-D（日本油脂）を溶解し、DNA-リポソーム複合体（リポプレックス）を得た。このリポプレックス溶液67μlに33μlの超純水を加えて全量を100 μlとし、この全量を用いて100 μgの凍結乾燥ビオチン化ZZ-BNCを溶解し、ＤＮＡ封入ビオチン化ZZ-BNCを得た。その後、上記方法に従ってDNA封入L4-PHA提示型ZZ-BNCとした。次に、上記細胞に各BNC 1μg（BNCのタンパク質量として）を投与し、37℃にて3時間培養して細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、更に72時間培養した。その後、細胞抽出液を調製して、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いて、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、L4-PHA提示型ZZ-BNCは、L4-PHAとβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンの親和性により、β（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを発現する高転移性癌細胞に特異的にDNAを送達できることが判明した（図７）。
【００５８】
（iii）培養細胞への蛍光ビーズ導入
培養細胞への巨大物質送達モデルとして、蛍光ビーズ（Rhodamine標識polysteleneビーズ、4%水溶液、粒径100 nm：Invitrogen）を用いた。蛍光ビーズ溶液を超純水で希釈し、2 mlの1%ビーズ溶液を作製した。この溶液2 mlを用いて、凍結乾燥アニオン性リポソームCoatsome EL-1-A（日本油脂）１バイアルを溶解して、蛍光ビーズ封入リポソームを作製した。作製したリポソーム溶液3.28μlを超純水で100 μlにメスアップし、凍結乾燥済みビオチン化ZZ-BNC 100 μgを溶解することで蛍光ビーズ封入ビオチン化ZZ-BNCを得た。その後、上記方法に従って蛍光ビーズ封入L4-PHA提示型ZZ-BNCとした。陰性コントロールとして、蛍光ビーズ封入ビオチン化ZZ-BNCを用意した。次に、上記細胞に各BNC 1μg（BNCのタンパク質量として）を投与し、37℃にて３時間培養して、細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、4% パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液を用いて細胞を15分間常温で固定した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡FV-1000（オリンパス）を用いて蛍光ビーズ由来の蛍光を観察した。その結果、L4-PHA提示型ZZ-BNCは、L4-PHAとβ（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンの親和性により、β（1→6）結合型N-アセチルグルコサミンを発現する高転移性癌細胞に特異的に蛍光ビーズを送達できることが判明した。
【００５９】
実施例６
蛍光標識レクチン提示型ZZ-BNCによる生体内高転移性腫瘍イメージング、及び、DNA封入レクチン提示型ZZ-BNCによる生体内高転移性腫瘍部位へのDNA送達
【００６０】
（i）生体内高転移性腫瘍のイメージング
高転移性大腸癌モデル細胞であるWiDr-GnT-V細胞1×106個を、50％ MatriGel（BD Bioscience）含有Dulbecco’s Minimal Eagle’s Medium 100μl中で懸濁し、ヌードマウス（5週齢、オス：日本クレア）背部皮下に移植し、腫瘍モデル（Xenograftヌードマウス）を作製した。２〜３週間後、腫瘍直径が1 cm程度に達した後、実験に供した。陰性コントロール動物として、通常のWiDr細胞を腫瘍として同様に保持するXenograftヌードマウスを作製した。次に、体重１ｇあたりDiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNC 1 μg（BNC由来のタンパク質量として）を、尾静脈より投与して、蛍光の腫瘍への集積をin vivo imaging system OV100（オリンパス）を用いて経時的に観察した。その結果、DiD標識L4-PHA提示型ZZ-BNCは、高転移性腫瘍へ特異的に集積した。本集積は経時的なものであり、投与後から徐々に集積量が増大していき、24時間で最大に達することも判明した（図８）。
【００６１】
（ii）生体内高転移性腫瘍へのＤＮＡ送達
上記の方法によりルシフェラーゼ発現プラスミドpCMV-Luc（Promega社）を封入したL4-PHA提示型ZZ-BNCを作製し、上記腫瘍モデル（Xenograftヌードマウス）に体重１ｇあたりＤＮＡ封入L4-PHA提示型ZZ-BNC 1 μg（BNC由来のタンパク質量として）を、尾静脈より投与して、5日後に腫瘍組織を摘出した。ホモジェナイザーを用いて組織を破砕し、破砕液中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキットを用いて測定した。その結果、腫瘍破砕液中のルシフェラーゼ活性は、陰性コントロール動物由来の腫瘍に比べ、高転移性腫瘍で格段に上昇していた。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＺＺ−ＢＮＣ表面に提示された糖鎖の検出。
【図２】糖鎖提示型ＺＺ−ＢＮＣの粒子径。
【図３】Rhodamine標識ガラクトース提示型ZZ-BNCの肝細胞への特異的集積。
【図４】L4-PHA提示型ZZ-BNCの粒子径、およびZZ-BNC表面に提示されたレクチンの検出。
【図５】標的細胞におけるβ(1→６)GlcNAcの発現および細胞表面へのレクチンの集積。
【図６】標的細胞へのDiD標識L4-PHAレクチン提示型ZZ-BNCの特異的集積。
【図７】ルシフェラーゼ遺伝子封入L4-PHAレクチン提示型ZZ-BNCによる標的細胞特異的遺伝子送達。
【図８】DiD標識L4-PHAレクチン提示型ZZ-BNCの生体内標的腫瘍への経時的集積。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖もしくはレクチンを提示した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）タンパク質を構成要素とするバイオナノカプセル。
【請求項１】
糖鎖もしくはレクチンを提示した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）タンパク質を構成要素とするバイオナノカプセル。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１２０５３２（Ｐ２００９−１２０５３２Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９６１２７（Ｐ２００７−２９６１２７）
【出願日】平成１９年１１月１４日（２００７．１１．１４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（５０３１００８２１）株式会社ビークル (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１４日（２００７．１１．１４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（５０３１００８２１）株式会社ビークル (12)
【Ｆターム（参考）】
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