糖液の製造方法
【課題】セルロース前処理物から糖液を製造する方法を提供する。
【解決手段】セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行う、糖液の製造方法。好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属、またはサーモプラズマ属由来であり、糸状菌由来セルラーゼが、トリコデルマ属由来セルラーゼである、糖液の製造方法。
【解決手段】セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行う、糖液の製造方法。好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属、またはサーモプラズマ属由来であり、糸状菌由来セルラーゼが、トリコデルマ属由来セルラーゼである、糖液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖液の製造方法に関する。特にセルロース前処理物に対して、好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を使用して酵素処理を行う糖液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原油代替資源として、再生可能なセルロース含有バイオマスを分解し、得られた糖を利用して、バイオ燃料あるいはバイオポリマー原料を発酵生産する試みが国内外で盛んに検討されている。
【０００３】
セルロース含有バイオマスを分解して糖を得る方法として、セルロースの加水分解に糸状菌由来セルラーゼ混合物を糖化酵素として使用する方法が古くより提案されている。しかしながら、セルロースはグルコースがβ１，４結合した直鎖状の多糖の集合体であることから結晶性が高く、澱粉などの多糖に比べ糖化分解効率が非常に低く、糖化酵素使用量が増大するといった課題があった。こうした課題に対し、セルロース含有バイオマスを希硫酸、加圧熱水、アンモニアなどを使用して、前処理を施すことで、酵素による分解効率が向上することが知られている。
【０００４】
セルロースの酵素分解には、複数の酵素種が関与しており、大きくセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼの３種に大別できる。セロビオハイドラーゼは、セルロースの末端部分より加水分解することを特徴とし、セルロースの結晶領域を分解可能な酵素である。一方エンドグルカナーゼは、セルロース分子鎖の内部領域から加水分解することを特徴とし、セルロース分解による分子量の低下を促進する酵素である。βグルコシダーゼは、グルコースがβ１，４結合した２糖であるセロビオースを主に分解し、最終分解産物であるグルコースの生成を触媒する酵素である。
一般的にセロビオハイドラーゼ、あるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解生成物であるセロビオースによって反応阻害を受ける。すなわち、セルラーゼによるセルロース分解反応において、その分解効率を向上させるためにβグルコシダーゼが存在することは極めて重要である。
【０００５】
トリコデルマ属は、糸状菌の１種で、菌体外に大量のエンド型およびエキソ型セルラーゼを生産することで知られている。トリコデルマ由来セルラーゼは、セルロース含有バイオマスの酵素分解に最も多く使用されているものである。しかしながら、トリコデルマが産生するβグルコシダーゼの一部は、菌体細胞壁に局在しており（非特許文献１）、トリコデルマ培養液より調製されたセルラーゼでは、この中に含まれるβグルコシダーゼ量および活性が十分でないといった課題があった。
【０００６】
この課題を解決する方法として、他の微生物由来のβグルコシダーゼをセルラーゼに加えて使用する方法がある。特に、アスペルギルス・ニガーが培養液中に産生するβグルコシダーゼを、トリコデルマ由来セルラーゼとともに添加する方法が良く検討されており、セルロース分解効率が向上することが知られている（非特許文献２）。このアスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼは、ノボザイム社より市販（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）されている。
【０００７】
また別の方法として、βグルコシダーゼ遺伝子をトリコデルマに新たに導入し、組換えトリコデルマを作製し、この培養液より、βグルコシダーゼ量を強化したセルラーゼ混合物を製造する試みが行われている（非特許文献３、特許文献１）。しかしながら、こうした組換えトリコデルマ株を作出してβグルコシダーゼ産生を強化しても、セルロース分解に十分なβグルコシダーゼ量および活性を十分補うことはできていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５０６６１６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｅｓｓｎｅｒ, Ｒら“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｉｎｇｌｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｚｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ＱＭ９４１４”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９０年２１巻６８５−６９０
【非特許文献２】Ｔｅｎｇｂｏｒｇ， Ｃ.ら、“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００１年１７巻１１０−１１７
【非特許文献３】Ｂａｒｎｅｔｔら“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ β−ｇｕｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｓａｃｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”Ｂｉｏｅｔｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１９９１年９巻５６２−５６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の課題は、セルロース前処理物の糸状菌由来セルラーゼ混合物分解において、従来技術に対しタンパク質量当たりの比活性が高く、少量でセロビオース分解促進効果のある微生物由来βグルコシダーゼを選定することである。また第２の課題は、選定したβグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を併用した際におけるセルロースの最適分解条件を決定することである。また第３の課題は、セルロース分解における酵素の使用量を削減することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、好熱性菌由来βグルコシダーゼが、セルロースの分解に適用できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の技術的手段から構成される。
（１）セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。
（２）好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来であることを特徴とする、上記（１）記載の糖液の製造方法。
（３）好熱性菌由来βグルコシダーゼが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、それらの各アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セロビオース分解活性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、上記（１）または（２）記載の糖液の製造方法。
（４）好熱性菌由来βグルコシダーゼが、異種宿主によって生産されたものであることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（５）糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼであることを特徴とする、上記（１）から（４）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（６）酵素処理条件が、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７、で行うことを特徴とする、上記（１）から（５）いずれか記載の糖液の製造方法。
（７）酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で１：１〜１：０．０００５で添加することを特徴とする、上記（１）から（６）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（８）酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量として、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇ添加し、酵素処理することを特徴とする、上記（１）から（７）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（９）セルロース前処理物が、セルロース含有バイオマスを希硫酸処理してなることを特徴とする、上記（１）から（８）のいずれか記載の糖液の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、従来の糸状菌由来セルラーゼ混合物のみの酵素処理、あるいは糸状菌由来セルラーゼ混合物と糸状菌由来βグルコシダーゼを使用した際に比べて、少ない酵素量で、高いセルロースの分解効率を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明では、セルロース含有バイオマスを糖液製造の原料として使用する。セルロース含有バイオマスとは、広く植物バイオマスに由来するセルロースのことを指し、例えば非食用の農産廃棄物、草本系植物、樹木、廃建材、紙などのことを指す。さらに具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。
【００１５】
セルロース前処理物とは、前記のセルロース含有バイオマスを加熱処理、粉砕処理、爆砕処理、酸処理、酸処理、希硫酸処理、濃硫酸処理、加圧熱水処理、アルカリ処理、アンモニア処理などの１以上の処理を施すことによって得られるセルロースのことを指す。こうしたセルロース含有バイオマスの前処理は、セルロース含有バイオマスに含まれるセルロース成分、リグニン成分、ヘミセルロース成分などを部分的に分解・変性することができるため本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼ混合物の反応効率を高めることができる。セルロース前処理物を調製する方法は公知の文献に多く開示されており、これらを参考にセルロース前処理物を調製することができる。
【００１６】
本発明で使用するセルロース前処理物は、セルロース含有成分を希硫酸処理したものであることが好ましい。希硫酸処理の方法としては、セルロース含有バイオマスを０．１〜５重量％の希硫酸溶液に浸し、１２０℃〜２９０℃の範囲で処理する。得られた処理物は、固液分離を行い、溶液成分と固形成分に分離を行ってもよい。この際、溶液成分には、主としてヘミセルロース由来の分解物であるキシロースおよび希硫酸が含まれており、固形成分としてセルロースあるいはリグニンが含まれる。希硫酸処理を行った際、中和処理を行う必要がある。中和処理は、処理物を固液分離し、希硫酸溶液に対し処理してもよく、また固液分離を行わずに処理してもよい。中和に使用するアルカリ試薬は、特に限定されないが、水酸化カルシウムであることが好ましい。
【００１７】
本発明で使用するセルロース前処理物は加圧熱水処理してなるものが好ましい。本発明のいう加圧熱水とは温度が１００℃〜３５０℃の範囲であり飽和蒸気圧以上に加圧された熱水溶液のことを指す。本発明で使用するセルロース前処理物とは、処理温度が２００℃〜２８０℃の範囲で処理されたセルロース含有バイオマスであることが好ましい。これ以上の温度になるとセルロースの分解も引き起こされ、単糖の収率低下も起きる。加圧熱水処理物は、そのまま使用してもよいし、また固液分離を行い固形分のみを使用してもよい。
【００１８】
セルロース含有バイオマスの前処理は、回分法、半回分法、スラリー流通法などがあるが特に限定されるものではない。また、前処理は、単独、あるいは複数組み合わせて施したものでもよく、特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の糖液には、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、アラビナン）に由来する、グルコース、キシロース、アラビノース、など単糖を含む。単糖の構成比率は、特に限定されないが、主たる単糖成分はグルコースであり、ついでキシロースである。本発明の糖液には、単糖に比べると微量ではあるが、セロビオースなどの２糖、オリゴ糖、などを含んでもよい。本発明の糖液に含まれる単糖濃度は特に限定されないが、０．１〜２０重量％であることが好ましく、さらに好ましくは、５〜２０重量％であることが好ましい。糖液濃度が、５〜２０重量％の範囲にあると、本発明で得られた糖液は、特段の濃縮の必要なく発酵原料として使用できるので好ましい。
【００２０】
本発明では、糸状菌由来セルラーゼ混合物を使用する。本発明における糸状菌由来セルラーゼ混合物とは、糸状菌由来の酵素混合物であって、セルロース分解を触媒する酵素混合物である。糸状菌由来セルラーゼ混合物には、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼといった分解様式の異なるセルラーゼが含まれる。
エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２１】
セロビオハイドラーゼとは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】
本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼ混合物は、少なくともエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドラーゼの両方を含む混合物である。さらに効率的なセルロースの糖化を行うためには、エンドグルカナーゼに関して２種以上、および／または、セロビオハイドラーゼに関して２種以上をそれぞれ含む糸状菌由来セルラーゼ混合物であることが好ましい。
【００２３】
前記糸状菌由来セルラーゼ混合物を生産する微生物として、トリコデルマ属、アスペルギルス属、セルロモナス属、クロストリジウム属、ストレプトマイセス属、フミコラ属、アクレモニウム属、イルベック属、ムコール属、タラロマイセス属、などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼの両方のセルラーゼを産生するために、その培養液を未精製の糸状菌由来セルラーゼ混合物としてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製し、製剤化したもの糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。
【００２４】
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼに加えて、これらと同時に微生物が産生したβグルコシダーゼが含まれる場合もあるが、セルロース分解において、量的に十分量存在しないこと、後述の好熱性菌由来βグルコシダーゼと明確に区別することが可能であることから、本発明では、糸状菌由来のβグルコシダーゼ成分は、セルラーゼ混合物に含まれるものとする。
【００２５】
前記培養液より、糸状菌由来セルラーゼ混合物を精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを、セルラーゼ製剤として使用してもよい。
【００２６】
本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼ混合物は、トリコデルマ属の微生物が産生するセルラーゼ混合物であることが好ましい。さらに好ましくは、トリコデルマ属のうち、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来するセルラーゼ混合物を用いることがより好ましい。トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ混合物としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ９１２３）に由来するセルラーゼからなる群から選択されるセルラーゼ混合物が挙げられる。また、前記トリコデルマ属に由来し、公知の変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。
【００２７】
トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物には、少なくとも２種以上のエンドグルカナーゼ、および、少なくとも２種以上のセロビオハイドラーゼを含むセルラーゼ混合物である。これら混合物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物の５０〜９５％はセロビオハイドラーゼから構成されており、残りの成分がエンドグルカナーゼ、あるいは糸状菌由来βグルコシダーゼである。
【００２８】
本発明では、好熱性菌由来βグルコシダーゼを使用する。
本発明におけるβグルコシダーゼとは、βグリコシド結合である２糖を加水分解する活性（βグルコシダーゼ活性）を有する酵素のことを指す。好ましくは、２糖であるセロビオース、ガラクトース、の分解活性を有する酵素である。βグルコシダーゼ活性は、後述する実施例３に記載する方法で測定することができる。
【００２９】
本発明における好熱性菌とは、５０℃以上で生育可能な微生物群の総称であり、特に８０℃以上で生育可能な微生物群である超好熱性菌も本発明における好熱性菌に含まれる。該好熱性菌としては、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、サーモスファエラ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）、スルホロバス属（Ｓｕｌｏｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、フェルビドバクテリウム属（Ｆｅｒｖｉｄｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、などを例示することができる。
【００３０】
カルディビルグラ属の微生物としては、カルディビルグラ・マキリンジェンシス（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ ｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ）が例示され、高温酸性温泉、火山の硫気噴気口などから単離することができる。
【００３１】
サーモスファエラ属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する超好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、サーモスファエラ・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００３２】
スルホロバス属に属する微生物としては、好熱好酸菌の１種であり、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離されている微生物であり、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ） 、スルフォロバス・トウコウダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ）、スルフォロバス・メタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ）、スルフォロバス・シバタ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ ）が例示され、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離される。
【００３３】
サーモプラズマ属に属する微生物としては、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）が例示され、温泉、ボタ山、その他硫黄環境から単離される。
【００３４】
フェルビドバクテリウム属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する超好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、フェルビドバクテリウム・ノドサム（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００３５】
バシラス属に属する微生物としては、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が例示され、温泉、深海底水孔周辺から単離される。
【００３６】
クロストリジウム属に属する微生物としては、クロストリジウム・スポロジェネス (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ)、クロストリジウム・サーモセラム (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ)が例示され、温泉から単離される。
【００３７】
サーマス属に属する微生物としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が例示され、温泉、噴気孔から単離される。
【００３８】
ピクロフィラス属に属する微生物としては、ピクロフィラス・オシマエ（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｏｓｈｉｍａｅ）、ピクロフィラス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ）が例示され、噴気孔から単離される。
【００３９】
パイロコッカス属の微生物としては、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、パイロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・ホエイセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｓｅｉ）が例示され、深海の熱水噴出孔、油田などから単離される。
【００４０】
本発明では、こうした好熱性菌のうち、パイロコッカス属、あるいはサーモプラズマ属に由来するβグルコシダーゼを使用することが好ましい。さらに好ましくは、パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼ、あるいはサーモプラズマ・ボルケイカム由来βグルコシダーゼであることが好ましい。これらの好熱菌由来βグルコシダーゼは、前述した好熱性菌由来βグルコシダーゼ群の中でも、４０℃〜６０℃付近における比活性が極めて高く、糸状菌由来セルラーゼの共存下におけるセルロース前処理物の分解に好適に使用できる。
【００４１】
さらに好ましくは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むβグルコシダーゼであることが好ましい。前記配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、当該配列において１若しくは複数個（好ましくは１若しくは数個）のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個（好ましくは１若しくは数個）のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもセロビオース分解活性を示すものであれば本発明に用いることができる。あるいは、このようなアミノ酸配列は、配列番号２あるいは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するものであって、セロビオース分解活性を有するものである。あるいは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列によってコードされる塩基配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつセロビオース分解活性を有するタンパク質を、本発明に用いることができる。
【００４２】
ストリンジェント条件は、低ストリンジェント条件、中ストリンジェント条件または高ストリンジェント条件のいずれでもよい。そのような条件は、例えば、２〜５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ（ここで、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０を指す）中、４５〜７０℃でのハイブリダイゼーションを行ったのち、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ＳＤＳを用いて、４５〜６５℃で洗浄を行うことを含む。ストリンジェント条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどに記載されている。
【００４３】
上記変異の導入は、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲによる特異的変異導入法などの公知の手法によって行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記）。
【００４４】
変異がアミノ酸の置換であれば、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換は、電気的性質、構造的性質、極性もしくは疎水性、などが類似したアミノ酸間での置換である。例えば、塩基性アミノ酸である、リシン、アルギニン、ヒスチジン間での置換、酸性アミノ酸である、グルタミン酸、アスパラギン酸間での置換、芳香族アミノ酸である、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン間での置換、分枝鎖アミノ酸である、バリン、イソロイシン、トレオニン間での置換、極性アミノ酸である、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン間での置換、疎水性アミノ酸である、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン間での置換、などが挙げられる。
【００４５】
なお、本発明における「同一性」は、２つのアミノ酸配列をギャップを導入してかまたはギャップを導入しないで整列した場合の、（ギャップの数も含めた）総アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基数のパーセンテージであり、そして、同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム）を使用して求めることができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。
【００４６】
さらにまた、本明細書で使用する「数個」は、２〜１０の整数、好ましくは２〜５の整数である。
【００４７】
本発明の好熱性菌由来βグルコシダーゼは、異種宿主によって生産された組換え酵素が好ましい。本発明で使用可能な異種宿主としては、特に限定されるものでないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、等を例示することができる。これら異種宿主に対して、好熱性菌由来βグルコシダーゼをコードする遺伝子を、該当する異種宿主において発現するような適切なプロモーターに加えて、エンハンサー、ターミネーター、ＳＤ配列もしくはリボソーム結合配列、ポリアデニル化サイト、シグナル配列、選択マーカー、などからの少なくとも１つの要素と連結し、環状プラスミド、あるいはＤＮＡ断片で遺伝子導入し、形質転換することで、好熱性菌由来βグルコシダーゼを産生する異種宿主を作製することができる。
【００４８】
プラスミドの例は、非限定的に、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０などの市販のプラスミドである。
【００４９】
さらにまた、プロモーターの例は、非限定的に、λＰＲプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、などである。
【００５０】
遺伝子組換え技術は、例えばＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、その開示は、本発明のために参照し利用しうる。
【００５１】
本発明におけるセルロース前処理物の酵素処理条件は、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７、セルロース前処理物固形分濃度０．１〜３０％が好ましい。該範囲に設定することにより、糸状菌由来セルラーゼ混合物および好熱性菌由来βグルコシダーゼのセルロース分解効率を最大限発揮することができる。好熱性菌由来βグルコシダーゼは、本来、反応最適温度が８５℃〜１００℃付近であるが、本発明で使用する好熱性菌由来βグルコシダーゼは、４０℃〜６０℃においても十分高い比活性を示し、糸状菌由来セルラーゼ共存下で、セルロース前処理物の分解を効率的に行うことが可能である。
【００５２】
本発明の酵素処理温度は４０℃〜６０℃であることが好ましい。反応温度６０℃以上の場合、好熱性菌由来βグルコシダーゼの酵素活性は増大するが、糸状菌由来セルラーゼ混合物の酵素活性が低下するためセルロース分解効率が低下する。また反応温度４０℃以下では、好熱性菌由来βグルコシダーゼの酵素活性が低下するため、セルロース分解効率が低下する。したがって、本発明の酵素処理温度は４０℃〜６０℃であることが好ましい。
【００５３】
本発明の酵素処理条件は、処理ｐＨ３〜７であることが好ましい。処理ｐＨ３以下の場合、好熱性菌由来βグルコシダーゼおよび糸状菌由来セルラーゼ混合物ともに酵素活性が低下するので好ましくない。また、ｐＨ７以上では、一般的に糸状菌由来セルラーゼ混合物の酵素活性が低下するため好ましくない。したがって、本発明の酵素処理条件は、処理ｐＨ３〜７であることが好ましい。
【００５４】
本発明の酵素処理条件は、セルロース前処理物固形分濃度０．１〜３０重量％が好ましい。本発明のセルロース前処理物固形分濃度とは、酵素処理の際に含まれる固形物濃度を測定することで算出することができる。例えば、酵素処理に供するセルロース前処理物の総重量を測定しておき、その後遠心分離あるいは膜濾過などによって、水分と固形分を分離する。分離して得られた固形分重量を測定し、セルロース前処理物総重量で除することでセルロース前処理物固形分濃度を算出することができる。セルロース前処理物固形分濃度が０．１％未満であると、分解によって得られる糖濃度が極めて低くなるため好ましくない。一方セルロース前処理物固形分濃度が３０％を超えると水分量が極めて低くなり、効率的な攪拌混合が難しく反応効率が低下する。したがって、本発明のセルロース前処理物固形分濃度は０．１％〜３０％の範囲にあることが好ましい。さらに好ましい酵素処理条件としては、処理温度４５〜５５℃、処理ｐＨ４．５〜６．０、セルロース前処理物濃度５％〜２０％である。
【００５５】
本発明におけるセルロース前処理物の酵素処理条件は糸状菌由来セルラーゼ混合物と、好熱性菌由来βグルコシダーゼを、タンパク質の重量比で１：１〜１：０．０００５の比率で添加することが好ましい。好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比が糸状菌由来セルラーゼ混合物に対して１：０．０００５の比率以下になると、セルロース分解効率化の効果がなくなるので好ましくない。一方、好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比が糸状菌由来セルラーゼ混合物に対して１：１の比率以上にしても、セルロース分解効率の大きな向上は見られず、逆に酵素使用量が増大し経済的に好ましくない。したがって、本発明におけるセルロース前処理物の酵素処理条件は糸状菌由来セルラーゼ混合物と、好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で１：１〜１：０．０００５の比率で添加することが好ましい。
【００５６】
本明細書でいう重量比とは、セルロース前処理物に、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを添加した後の、糸状菌由来セルラーゼ混合物および、好熱性菌由来βグルコシダーゼの濃度比のことである。本発明で使用する、糸状菌由来セルラーゼ混合物は、前記記載のとおり、セロビオハイドラーゼ、あるいはエンドグルカナーゼといった複数の酵素を含んでなる。したがって、これら含有する酵素の総重量をもって糸状菌由来セルラーゼ混合物の重量とする。重量比として、糸状菌由来セルラーゼ混合物、および、好熱性菌由来βグルコシダーゼが、個別の酵素水溶液としてある場合、それぞれの酵素水溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ測定などで算出しておき、添加したタンパク質全量の濃度をもって重量比を算出することが可能である。
【００５７】
本発明の酵素処理条件において、糸状菌由来セルラーゼ混合物と、好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量としては、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇ（純度９５％以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）の場合の重量）が好ましい。より好ましくは、セルロース１ｇに対し、０．１〜５０ｍｇである。セルロース前処理物１ｇに対し、５００ｍｇを超えると酵素添加量に対してセルロース分解効率があまり向上しないため、経済的に好ましくない。一方で、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１ｍｇ未満であると、セルロース分解効率が低くなるため好ましくない。したがって、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇの範囲にあることによって、酵素使用量を低く抑えることができ、またセルロース前処理物の効率的な分解効率を得ることができる。
【００５８】
エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ、βグルコシダーゼなどの本発明に関わる酵素の活性は、公知の方法で測定することができる。
【００５９】
エンドグルカナーゼ活性の測定方法としては、例えばカルボキシルメチルセルロース０．２５％溶液に酵素液を添加し、生成した還元糖末端をジニトロサリチル酸、あるいはソモギーネルソン法といった測定方法により定量する方法などを例示できる。
【００６０】
セロビオハイドラーゼ活性の測定、例えばリン酸膨潤アビセルに酵素液を添加し、生成した還元等を測定する方法、またはｐ−ニトロフェニル−β−セロビシドを基質として加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノールの発色をもって測定する方法が例示できる。
【００６１】
βグルコシダーゼ活性の測定は、例えば５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したセロビオースの基質溶液に酵素液を添加し、３０〜８５℃で３０分間反応後、必要によりｐＨを変化させるなどして反応を停止させた後、グルコース定量キットを用いて、反応液中のグルコース濃度を定量することによって行うことができる。
【００６２】
(実施例)
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ（セルクラスト、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）混合物を使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、分画分子量１００００のポリエーテルスルホン製限外ろ過膜（ミリポア）を使用して、脱塩・精製を行った。タンパク質濃度は、ＢＣＡ測定キット（BCA Protein Assay Regent kit、ピアス社）を使用して行い、牛アルブミン（２ｍｇ／ｍＬ）を標品として、５６２ｎｍの吸光度を測定し、比色定量を行った。ＰｆＢＧＬは、実施例１で得られたタンパク質濃度を前記同様の方法で測定した。ＴｖＢＧＬは、実施例２で得られたタンパク質濃度を前記同様の方法で測定した。重量比率は、酵素反応に最終的に添加するタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）をもって算出した。
【００６４】
［実施例１］
パイロコッカス属由来βグルコシダーゼの大腸菌での発現
パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子は、配列番号１記載の遺伝子を全合成し、ｐＥＴ１１ｄのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結し、ＪＭ１０９（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて行った。形質転換されたＪＭ１０９株より、作製したベクターｐＥＴ−ＰｆＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析を行った。ｐＥＴ−ＰｆＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株を、アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、８５℃で１５分保温し、βグルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に透析した。透析後の溶液をＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＮａＣｌ勾配、０Ｍ〜０．５Ｍ）にて、さらに精製した。得られたタンパク質溶液をパイロコッカス属由来βグルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、得られたＰｆＢＧＬは、純度９５％以上であることが確認できた。
【００６５】
［実施例２］
サーモプラズマ属由来βグルコシダーゼの大腸菌での発現
サーモプラズマ・ボルカニウム由来のβグルコシダーゼ遺伝子は、配列番号３記載の遺伝子を全合成し、ｐＥＴ１１ｄのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結し、ＪＭ１０９（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて行った。形質転換されたＪＭ１０９株より、作製したベクターｐＥＴ−ＴｖＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析を行った。ｐＥＴ−ＴｖＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬ株を、アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、８５℃で１５分保温し、βグルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に透析した。透析後の溶液をＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＮａＣｌ勾配、０Ｍ〜０．５Ｍ）にて、さらに精製した。得られたタンパク質溶液をサーモプラズマ属由来βグルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、得られたＴｖＢＧＬは、純度９５％以上であることが確認できた。
【００６６】
＜比較例１＞アスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼの調製
アスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼの調製を行った。アスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）より調製した。まず、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８をタンパク質濃度２０ｍｇ／ｍＬとなるように、酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）で希釈した。希釈した溶液を、酢酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア）により精製した。次に、分画分子量３００００の限外濾過膜（ミリポア）を使用して、さらに脱塩・濃縮を行い、アスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼ（ＡｓｐＢＧＬ）を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、得られたＡｓｐＢＧＬは、純度９５％以上であることが確認できた。
【００６７】
［実施例３］
セロビオース分解活性（比活性）の比較
実施例１および実施例２で得られたパイロコッカス属由来βグルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）、サーモプラズマ属由来βグルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）、および比較例１で得られたアスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼ（ＡｓｐＢＧＬ）のタンパク質濃度あたりセロビオース分解活性（比活性）を測定した。セロビオース分解活性の測定は以下の方法で実施した。
【００６８】
１５ｍＭのセロビオース溶液２５０μＬ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）に対し、実施例１で調製した１０μｇ／ｍＬのＰｆＢＧＬ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）と、実施例２で調製した１０μｇ／ｍＬのＴｖＢＧＬ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）と、比較例１で調製した１０μｇ／ｍＬのＡｓｐＢＧＬβグルコシダーゼ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を２５０μL添加し、３０〜８５℃の各温度で３０分間反応させた後、生成したグルコース濃度測定を行った。生成したグルコース濃度は、グルコーステスト和光で測定した。セロビオース分解活性１ユニット（Ｕ）は、下記の式に準じて算出した。
【００６９】
セロビオース分解活性１ユニット（Ｕ）＝反応終了時に生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）×１０００÷１８０÷３０
【００７０】
さらに、セロビオース分解活性を、βグルコシダーゼ量（ｍｇ）当たりの比活性を下記の式で算出した。
【００７１】
セロビオース分解比活性（Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）＝セロビオース分解活性（Ｕ）÷活性測定に添加したβグルコシダーゼ量（ｍｇ）
【００７２】
各温度において得られた比活性の比較結果を表１にまとめた。ＰｆＢＧＬおよびＴｖＢＧＬは、８５℃の温度条件において、最も高いセロビオース分解活性を示すものの、６５℃、６０℃、５５℃、５０℃、４５℃においてもＡｓｐＢＧＬよりも高い比活性を示すことが示された。すなわち、従来技術で使用されるＡｓｐＢＧＬの最適反応温度においても、ＰｆＢＧＬおよびＴｖＢＧＬを代替物として使用できることが確認できた。
【００７３】
【表１】
【００７４】
［実施例４］
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼによるセルロース前処理物の分解と反応温度条件
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ（セルクラスト、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、分画分子量１００００のポリエーテルスルホン製限外ろ過膜（ミリポア）を使用して、脱塩・精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物には、セロビオハイドラーゼが純度８０％〜９５％で含まれていた。
【００７５】
またβグルコシダーゼとして、実施例１で調製したＰｆＢＧＬ、実施例２で調製したＴｖＢＧＬ、比較例１で調製したＡｓｐＢＧＬ、を使用した。
【００７６】
セルロース前処理物としては、αセルロース（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を使用し、これを希硫酸処理したものを使用した。希硫酸処理は、下記の手順で実施した。αセルロース２０ｇ秤量し、２重量％希硫酸水溶液１８０ｍＬを加え、１３０℃で３０分オートクレーブを行った。得られた希硫酸処理物を固液分離し、固形分をＲＯ水でよく洗浄した。洗浄後、水分を搾り、カッター式ミル（ＩＫＡジャパン）を使用してさらに粉砕し、その後乳鉢でペーストとなるまですりつぶした。この時点のセルロース前処理物はそれぞれ、８４重量％であった。これを酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５）に懸濁し、セルロース前処理物として使用した。
【００７７】
セルロース前処理物の酵素分解条件として、糸状菌由来セルラーゼ混合物とＰｆＢＧＬ、糸状菌由来セルラーゼ混合物とＴｖＢＧＬ、糸状菌由来セルラーゼ混合物とＡｓｐＢＧＬの混合比は、１：０．１に設定し、最終濃度が０．１３ ｍｇ／ｍLとなるようにセルロース前処理物に添加した。セルロース前処理物固形分濃度は２重量％となるように調整した。処理温度は、３０℃〜８５℃の範囲で行い、処理時間は、２４時間で実施した。２４時間反応後のグルコース生成量（ｇ／Ｌ）は、グルコーステスト和光（和光純薬工業）を使用して測定した。
【００７８】
以下セルロース前処理物として、αセルロースを使用した場合の結果である。好熱性菌由来βグルコシダーゼであるＰｆＢＧＬ（実施例１）あるいはＴｖＢＧＬ（実施例２）と糸状菌由来セルラーゼ混合物を併用することで、セルロース分解効率が向上することが確認できた。また、比較例１であるＡｓｐＢＧＬと比較して、ＰｆＢＧＬ（実施例１）あるいはＴｖＧＢＬ（実施例２）の方がセルロース分解効率が向上することが確認できた。またＰｆＢＧＬ（実施例１）あるいはＴｖＢＧＬ（実施例２）と糸状菌由来セルラーゼを使用するセルロースの分解条件としては、４０℃〜６０℃が高い分解効率を得るために最適であることが示された。
【００７９】
【表２】
【００８０】
［実施例５］
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比の最適化
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比（混合比率）の最適化の検討を行った。好熱性菌由来βグルコシダーゼは、実施例１で調製したＰｆＢＧＬ、実施例２で調製したＴｖＢＧＬ、比較例１で調製したＡｓｐＢＧＬを使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、実施例４で調製したトリコデルマ由来セルラーゼ混合物を使用した。
【００８１】
基質にはαセルロースを使用し、セルロース前処理物固形分濃度は２重量％となるように調整した。これに、最終濃度が０．１３ ｍｇ／ｍLとなるように糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、この糸状菌由来セルラーゼ混合物濃度に対して、ＰｆＢＧＬ。ＴｖＢＧＬ、あるいはＡｓｐＢＧＬが、重量比率として、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：１（０．１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．１（０．０１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．０１（０．００１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．００１（０．０００１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．０００５（０．００００６５ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．０００１（０．００００１３ ｍｇ／ｍL）となるようにそれぞれ調整した（実施例４）。また、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：１０（１．３ ｍｇ／ｍL）の場合（参考例１）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０（０ ｍｇ／ｍL）の場合（比較例２）も同様に行った。処理温度は５０℃、処理時間は２４時間で実施した。２４時間反応後のグルコース生成量（ｇ／Ｌ）は、グルコーステスト和光（和光純薬工業）を使用して測定した。
【００８２】
各酵素比率でのグルコース生成量を表３にまとめた。実施例１のＰｆＢＧＬは、糸状菌由来セルラーゼ混合物１に対して０．０００５加えるだけでもセルロース分解効率を向上させ、添加効果があることを確認できた。実施例２のＴｖＢＧＬは、糸状菌由来セルラーゼ混合物１に対して０．００１加えるだけでもセルロース分解効率を向上させ、添加効果があることを確認できた。また比較例１であるＡｓｐＢＧＬでも添加効果は確認されたが、このときの比率は１：０．０１であった。これと比較すると、実施例１のＰｆＢＧＬ、あるいは実施例２のＴｖＢＧＬの方が、従来ＡｓｐＢＧＬの１／１０〜１００量で効果があることが確認できた。実施例１のＰｆＢＧＬを使用する際の糸状菌由来セルラーゼ混合物との混合比率として、糸状菌由来セルラーゼ混合物１に対して１〜０．０１が高い分解効率を得るために最適であることが示された。
【００８３】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、セルロースから発酵原料である糖液を製造する工程に使用することができる。本発明では、セルロースの加水分解に使用する酵素の使用量削減することができるため、産業上極めて有益である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖液の製造方法に関する。特にセルロース前処理物に対して、好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を使用して酵素処理を行う糖液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原油代替資源として、再生可能なセルロース含有バイオマスを分解し、得られた糖を利用して、バイオ燃料あるいはバイオポリマー原料を発酵生産する試みが国内外で盛んに検討されている。
【０００３】
セルロース含有バイオマスを分解して糖を得る方法として、セルロースの加水分解に糸状菌由来セルラーゼ混合物を糖化酵素として使用する方法が古くより提案されている。しかしながら、セルロースはグルコースがβ１，４結合した直鎖状の多糖の集合体であることから結晶性が高く、澱粉などの多糖に比べ糖化分解効率が非常に低く、糖化酵素使用量が増大するといった課題があった。こうした課題に対し、セルロース含有バイオマスを希硫酸、加圧熱水、アンモニアなどを使用して、前処理を施すことで、酵素による分解効率が向上することが知られている。
【０００４】
セルロースの酵素分解には、複数の酵素種が関与しており、大きくセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼの３種に大別できる。セロビオハイドラーゼは、セルロースの末端部分より加水分解することを特徴とし、セルロースの結晶領域を分解可能な酵素である。一方エンドグルカナーゼは、セルロース分子鎖の内部領域から加水分解することを特徴とし、セルロース分解による分子量の低下を促進する酵素である。βグルコシダーゼは、グルコースがβ１，４結合した２糖であるセロビオースを主に分解し、最終分解産物であるグルコースの生成を触媒する酵素である。
一般的にセロビオハイドラーゼ、あるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解生成物であるセロビオースによって反応阻害を受ける。すなわち、セルラーゼによるセルロース分解反応において、その分解効率を向上させるためにβグルコシダーゼが存在することは極めて重要である。
【０００５】
トリコデルマ属は、糸状菌の１種で、菌体外に大量のエンド型およびエキソ型セルラーゼを生産することで知られている。トリコデルマ由来セルラーゼは、セルロース含有バイオマスの酵素分解に最も多く使用されているものである。しかしながら、トリコデルマが産生するβグルコシダーゼの一部は、菌体細胞壁に局在しており（非特許文献１）、トリコデルマ培養液より調製されたセルラーゼでは、この中に含まれるβグルコシダーゼ量および活性が十分でないといった課題があった。
【０００６】
この課題を解決する方法として、他の微生物由来のβグルコシダーゼをセルラーゼに加えて使用する方法がある。特に、アスペルギルス・ニガーが培養液中に産生するβグルコシダーゼを、トリコデルマ由来セルラーゼとともに添加する方法が良く検討されており、セルロース分解効率が向上することが知られている（非特許文献２）。このアスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼは、ノボザイム社より市販（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）されている。
【０００７】
また別の方法として、βグルコシダーゼ遺伝子をトリコデルマに新たに導入し、組換えトリコデルマを作製し、この培養液より、βグルコシダーゼ量を強化したセルラーゼ混合物を製造する試みが行われている（非特許文献３、特許文献１）。しかしながら、こうした組換えトリコデルマ株を作出してβグルコシダーゼ産生を強化しても、セルロース分解に十分なβグルコシダーゼ量および活性を十分補うことはできていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５０６６１６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｅｓｓｎｅｒ, Ｒら“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｉｎｇｌｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｚｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ＱＭ９４１４”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９０年２１巻６８５−６９０
【非特許文献２】Ｔｅｎｇｂｏｒｇ， Ｃ.ら、“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００１年１７巻１１０−１１７
【非特許文献３】Ｂａｒｎｅｔｔら“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ β−ｇｕｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｓａｃｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”Ｂｉｏｅｔｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１９９１年９巻５６２−５６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の課題は、セルロース前処理物の糸状菌由来セルラーゼ混合物分解において、従来技術に対しタンパク質量当たりの比活性が高く、少量でセロビオース分解促進効果のある微生物由来βグルコシダーゼを選定することである。また第２の課題は、選定したβグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を併用した際におけるセルロースの最適分解条件を決定することである。また第３の課題は、セルロース分解における酵素の使用量を削減することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、好熱性菌由来βグルコシダーゼが、セルロースの分解に適用できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の技術的手段から構成される。
（１）セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。
（２）好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来であることを特徴とする、上記（１）記載の糖液の製造方法。
（３）好熱性菌由来βグルコシダーゼが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、それらの各アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セロビオース分解活性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、上記（１）または（２）記載の糖液の製造方法。
（４）好熱性菌由来βグルコシダーゼが、異種宿主によって生産されたものであることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（５）糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼであることを特徴とする、上記（１）から（４）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（６）酵素処理条件が、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７、で行うことを特徴とする、上記（１）から（５）いずれか記載の糖液の製造方法。
（７）酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で１：１〜１：０．０００５で添加することを特徴とする、上記（１）から（６）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（８）酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量として、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇ添加し、酵素処理することを特徴とする、上記（１）から（７）のいずれか記載の糖液の製造方法。
（９）セルロース前処理物が、セルロース含有バイオマスを希硫酸処理してなることを特徴とする、上記（１）から（８）のいずれか記載の糖液の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、従来の糸状菌由来セルラーゼ混合物のみの酵素処理、あるいは糸状菌由来セルラーゼ混合物と糸状菌由来βグルコシダーゼを使用した際に比べて、少ない酵素量で、高いセルロースの分解効率を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明では、セルロース含有バイオマスを糖液製造の原料として使用する。セルロース含有バイオマスとは、広く植物バイオマスに由来するセルロースのことを指し、例えば非食用の農産廃棄物、草本系植物、樹木、廃建材、紙などのことを指す。さらに具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。
【００１５】
セルロース前処理物とは、前記のセルロース含有バイオマスを加熱処理、粉砕処理、爆砕処理、酸処理、酸処理、希硫酸処理、濃硫酸処理、加圧熱水処理、アルカリ処理、アンモニア処理などの１以上の処理を施すことによって得られるセルロースのことを指す。こうしたセルロース含有バイオマスの前処理は、セルロース含有バイオマスに含まれるセルロース成分、リグニン成分、ヘミセルロース成分などを部分的に分解・変性することができるため本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼ混合物の反応効率を高めることができる。セルロース前処理物を調製する方法は公知の文献に多く開示されており、これらを参考にセルロース前処理物を調製することができる。
【００１６】
本発明で使用するセルロース前処理物は、セルロース含有成分を希硫酸処理したものであることが好ましい。希硫酸処理の方法としては、セルロース含有バイオマスを０．１〜５重量％の希硫酸溶液に浸し、１２０℃〜２９０℃の範囲で処理する。得られた処理物は、固液分離を行い、溶液成分と固形成分に分離を行ってもよい。この際、溶液成分には、主としてヘミセルロース由来の分解物であるキシロースおよび希硫酸が含まれており、固形成分としてセルロースあるいはリグニンが含まれる。希硫酸処理を行った際、中和処理を行う必要がある。中和処理は、処理物を固液分離し、希硫酸溶液に対し処理してもよく、また固液分離を行わずに処理してもよい。中和に使用するアルカリ試薬は、特に限定されないが、水酸化カルシウムであることが好ましい。
【００１７】
本発明で使用するセルロース前処理物は加圧熱水処理してなるものが好ましい。本発明のいう加圧熱水とは温度が１００℃〜３５０℃の範囲であり飽和蒸気圧以上に加圧された熱水溶液のことを指す。本発明で使用するセルロース前処理物とは、処理温度が２００℃〜２８０℃の範囲で処理されたセルロース含有バイオマスであることが好ましい。これ以上の温度になるとセルロースの分解も引き起こされ、単糖の収率低下も起きる。加圧熱水処理物は、そのまま使用してもよいし、また固液分離を行い固形分のみを使用してもよい。
【００１８】
セルロース含有バイオマスの前処理は、回分法、半回分法、スラリー流通法などがあるが特に限定されるものではない。また、前処理は、単独、あるいは複数組み合わせて施したものでもよく、特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の糖液には、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、アラビナン）に由来する、グルコース、キシロース、アラビノース、など単糖を含む。単糖の構成比率は、特に限定されないが、主たる単糖成分はグルコースであり、ついでキシロースである。本発明の糖液には、単糖に比べると微量ではあるが、セロビオースなどの２糖、オリゴ糖、などを含んでもよい。本発明の糖液に含まれる単糖濃度は特に限定されないが、０．１〜２０重量％であることが好ましく、さらに好ましくは、５〜２０重量％であることが好ましい。糖液濃度が、５〜２０重量％の範囲にあると、本発明で得られた糖液は、特段の濃縮の必要なく発酵原料として使用できるので好ましい。
【００２０】
本発明では、糸状菌由来セルラーゼ混合物を使用する。本発明における糸状菌由来セルラーゼ混合物とは、糸状菌由来の酵素混合物であって、セルロース分解を触媒する酵素混合物である。糸状菌由来セルラーゼ混合物には、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼといった分解様式の異なるセルラーゼが含まれる。
エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２１】
セロビオハイドラーゼとは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】
本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼ混合物は、少なくともエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドラーゼの両方を含む混合物である。さらに効率的なセルロースの糖化を行うためには、エンドグルカナーゼに関して２種以上、および／または、セロビオハイドラーゼに関して２種以上をそれぞれ含む糸状菌由来セルラーゼ混合物であることが好ましい。
【００２３】
前記糸状菌由来セルラーゼ混合物を生産する微生物として、トリコデルマ属、アスペルギルス属、セルロモナス属、クロストリジウム属、ストレプトマイセス属、フミコラ属、アクレモニウム属、イルベック属、ムコール属、タラロマイセス属、などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼの両方のセルラーゼを産生するために、その培養液を未精製の糸状菌由来セルラーゼ混合物としてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製し、製剤化したもの糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。
【００２４】
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼに加えて、これらと同時に微生物が産生したβグルコシダーゼが含まれる場合もあるが、セルロース分解において、量的に十分量存在しないこと、後述の好熱性菌由来βグルコシダーゼと明確に区別することが可能であることから、本発明では、糸状菌由来のβグルコシダーゼ成分は、セルラーゼ混合物に含まれるものとする。
【００２５】
前記培養液より、糸状菌由来セルラーゼ混合物を精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを、セルラーゼ製剤として使用してもよい。
【００２６】
本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼ混合物は、トリコデルマ属の微生物が産生するセルラーゼ混合物であることが好ましい。さらに好ましくは、トリコデルマ属のうち、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来するセルラーゼ混合物を用いることがより好ましい。トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ混合物としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ９１２３）に由来するセルラーゼからなる群から選択されるセルラーゼ混合物が挙げられる。また、前記トリコデルマ属に由来し、公知の変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。
【００２７】
トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物には、少なくとも２種以上のエンドグルカナーゼ、および、少なくとも２種以上のセロビオハイドラーゼを含むセルラーゼ混合物である。これら混合物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物の５０〜９５％はセロビオハイドラーゼから構成されており、残りの成分がエンドグルカナーゼ、あるいは糸状菌由来βグルコシダーゼである。
【００２８】
本発明では、好熱性菌由来βグルコシダーゼを使用する。
本発明におけるβグルコシダーゼとは、βグリコシド結合である２糖を加水分解する活性（βグルコシダーゼ活性）を有する酵素のことを指す。好ましくは、２糖であるセロビオース、ガラクトース、の分解活性を有する酵素である。βグルコシダーゼ活性は、後述する実施例３に記載する方法で測定することができる。
【００２９】
本発明における好熱性菌とは、５０℃以上で生育可能な微生物群の総称であり、特に８０℃以上で生育可能な微生物群である超好熱性菌も本発明における好熱性菌に含まれる。該好熱性菌としては、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、サーモスファエラ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）、スルホロバス属（Ｓｕｌｏｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、フェルビドバクテリウム属（Ｆｅｒｖｉｄｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、などを例示することができる。
【００３０】
カルディビルグラ属の微生物としては、カルディビルグラ・マキリンジェンシス（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ ｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ）が例示され、高温酸性温泉、火山の硫気噴気口などから単離することができる。
【００３１】
サーモスファエラ属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する超好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、サーモスファエラ・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００３２】
スルホロバス属に属する微生物としては、好熱好酸菌の１種であり、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離されている微生物であり、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ） 、スルフォロバス・トウコウダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ）、スルフォロバス・メタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ）、スルフォロバス・シバタ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ ）が例示され、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離される。
【００３３】
サーモプラズマ属に属する微生物としては、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）が例示され、温泉、ボタ山、その他硫黄環境から単離される。
【００３４】
フェルビドバクテリウム属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する超好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、フェルビドバクテリウム・ノドサム（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００３５】
バシラス属に属する微生物としては、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が例示され、温泉、深海底水孔周辺から単離される。
【００３６】
クロストリジウム属に属する微生物としては、クロストリジウム・スポロジェネス (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ)、クロストリジウム・サーモセラム (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ)が例示され、温泉から単離される。
【００３７】
サーマス属に属する微生物としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が例示され、温泉、噴気孔から単離される。
【００３８】
ピクロフィラス属に属する微生物としては、ピクロフィラス・オシマエ（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｏｓｈｉｍａｅ）、ピクロフィラス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ）が例示され、噴気孔から単離される。
【００３９】
パイロコッカス属の微生物としては、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、パイロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・ホエイセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｓｅｉ）が例示され、深海の熱水噴出孔、油田などから単離される。
【００４０】
本発明では、こうした好熱性菌のうち、パイロコッカス属、あるいはサーモプラズマ属に由来するβグルコシダーゼを使用することが好ましい。さらに好ましくは、パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼ、あるいはサーモプラズマ・ボルケイカム由来βグルコシダーゼであることが好ましい。これらの好熱菌由来βグルコシダーゼは、前述した好熱性菌由来βグルコシダーゼ群の中でも、４０℃〜６０℃付近における比活性が極めて高く、糸状菌由来セルラーゼの共存下におけるセルロース前処理物の分解に好適に使用できる。
【００４１】
さらに好ましくは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むβグルコシダーゼであることが好ましい。前記配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、当該配列において１若しくは複数個（好ましくは１若しくは数個）のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個（好ましくは１若しくは数個）のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもセロビオース分解活性を示すものであれば本発明に用いることができる。あるいは、このようなアミノ酸配列は、配列番号２あるいは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するものであって、セロビオース分解活性を有するものである。あるいは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列によってコードされる塩基配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつセロビオース分解活性を有するタンパク質を、本発明に用いることができる。
【００４２】
ストリンジェント条件は、低ストリンジェント条件、中ストリンジェント条件または高ストリンジェント条件のいずれでもよい。そのような条件は、例えば、２〜５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ（ここで、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０を指す）中、４５〜７０℃でのハイブリダイゼーションを行ったのち、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ＳＤＳを用いて、４５〜６５℃で洗浄を行うことを含む。ストリンジェント条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどに記載されている。
【００４３】
上記変異の導入は、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲによる特異的変異導入法などの公知の手法によって行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記）。
【００４４】
変異がアミノ酸の置換であれば、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換は、電気的性質、構造的性質、極性もしくは疎水性、などが類似したアミノ酸間での置換である。例えば、塩基性アミノ酸である、リシン、アルギニン、ヒスチジン間での置換、酸性アミノ酸である、グルタミン酸、アスパラギン酸間での置換、芳香族アミノ酸である、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン間での置換、分枝鎖アミノ酸である、バリン、イソロイシン、トレオニン間での置換、極性アミノ酸である、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン間での置換、疎水性アミノ酸である、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン間での置換、などが挙げられる。
【００４５】
なお、本発明における「同一性」は、２つのアミノ酸配列をギャップを導入してかまたはギャップを導入しないで整列した場合の、（ギャップの数も含めた）総アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基数のパーセンテージであり、そして、同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム）を使用して求めることができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。
【００４６】
さらにまた、本明細書で使用する「数個」は、２〜１０の整数、好ましくは２〜５の整数である。
【００４７】
本発明の好熱性菌由来βグルコシダーゼは、異種宿主によって生産された組換え酵素が好ましい。本発明で使用可能な異種宿主としては、特に限定されるものでないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、等を例示することができる。これら異種宿主に対して、好熱性菌由来βグルコシダーゼをコードする遺伝子を、該当する異種宿主において発現するような適切なプロモーターに加えて、エンハンサー、ターミネーター、ＳＤ配列もしくはリボソーム結合配列、ポリアデニル化サイト、シグナル配列、選択マーカー、などからの少なくとも１つの要素と連結し、環状プラスミド、あるいはＤＮＡ断片で遺伝子導入し、形質転換することで、好熱性菌由来βグルコシダーゼを産生する異種宿主を作製することができる。
【００４８】
プラスミドの例は、非限定的に、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０などの市販のプラスミドである。
【００４９】
さらにまた、プロモーターの例は、非限定的に、λＰＲプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、などである。
【００５０】
遺伝子組換え技術は、例えばＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、その開示は、本発明のために参照し利用しうる。
【００５１】
本発明におけるセルロース前処理物の酵素処理条件は、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７、セルロース前処理物固形分濃度０．１〜３０％が好ましい。該範囲に設定することにより、糸状菌由来セルラーゼ混合物および好熱性菌由来βグルコシダーゼのセルロース分解効率を最大限発揮することができる。好熱性菌由来βグルコシダーゼは、本来、反応最適温度が８５℃〜１００℃付近であるが、本発明で使用する好熱性菌由来βグルコシダーゼは、４０℃〜６０℃においても十分高い比活性を示し、糸状菌由来セルラーゼ共存下で、セルロース前処理物の分解を効率的に行うことが可能である。
【００５２】
本発明の酵素処理温度は４０℃〜６０℃であることが好ましい。反応温度６０℃以上の場合、好熱性菌由来βグルコシダーゼの酵素活性は増大するが、糸状菌由来セルラーゼ混合物の酵素活性が低下するためセルロース分解効率が低下する。また反応温度４０℃以下では、好熱性菌由来βグルコシダーゼの酵素活性が低下するため、セルロース分解効率が低下する。したがって、本発明の酵素処理温度は４０℃〜６０℃であることが好ましい。
【００５３】
本発明の酵素処理条件は、処理ｐＨ３〜７であることが好ましい。処理ｐＨ３以下の場合、好熱性菌由来βグルコシダーゼおよび糸状菌由来セルラーゼ混合物ともに酵素活性が低下するので好ましくない。また、ｐＨ７以上では、一般的に糸状菌由来セルラーゼ混合物の酵素活性が低下するため好ましくない。したがって、本発明の酵素処理条件は、処理ｐＨ３〜７であることが好ましい。
【００５４】
本発明の酵素処理条件は、セルロース前処理物固形分濃度０．１〜３０重量％が好ましい。本発明のセルロース前処理物固形分濃度とは、酵素処理の際に含まれる固形物濃度を測定することで算出することができる。例えば、酵素処理に供するセルロース前処理物の総重量を測定しておき、その後遠心分離あるいは膜濾過などによって、水分と固形分を分離する。分離して得られた固形分重量を測定し、セルロース前処理物総重量で除することでセルロース前処理物固形分濃度を算出することができる。セルロース前処理物固形分濃度が０．１％未満であると、分解によって得られる糖濃度が極めて低くなるため好ましくない。一方セルロース前処理物固形分濃度が３０％を超えると水分量が極めて低くなり、効率的な攪拌混合が難しく反応効率が低下する。したがって、本発明のセルロース前処理物固形分濃度は０．１％〜３０％の範囲にあることが好ましい。さらに好ましい酵素処理条件としては、処理温度４５〜５５℃、処理ｐＨ４．５〜６．０、セルロース前処理物濃度５％〜２０％である。
【００５５】
本発明におけるセルロース前処理物の酵素処理条件は糸状菌由来セルラーゼ混合物と、好熱性菌由来βグルコシダーゼを、タンパク質の重量比で１：１〜１：０．０００５の比率で添加することが好ましい。好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比が糸状菌由来セルラーゼ混合物に対して１：０．０００５の比率以下になると、セルロース分解効率化の効果がなくなるので好ましくない。一方、好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比が糸状菌由来セルラーゼ混合物に対して１：１の比率以上にしても、セルロース分解効率の大きな向上は見られず、逆に酵素使用量が増大し経済的に好ましくない。したがって、本発明におけるセルロース前処理物の酵素処理条件は糸状菌由来セルラーゼ混合物と、好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で１：１〜１：０．０００５の比率で添加することが好ましい。
【００５６】
本明細書でいう重量比とは、セルロース前処理物に、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを添加した後の、糸状菌由来セルラーゼ混合物および、好熱性菌由来βグルコシダーゼの濃度比のことである。本発明で使用する、糸状菌由来セルラーゼ混合物は、前記記載のとおり、セロビオハイドラーゼ、あるいはエンドグルカナーゼといった複数の酵素を含んでなる。したがって、これら含有する酵素の総重量をもって糸状菌由来セルラーゼ混合物の重量とする。重量比として、糸状菌由来セルラーゼ混合物、および、好熱性菌由来βグルコシダーゼが、個別の酵素水溶液としてある場合、それぞれの酵素水溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ測定などで算出しておき、添加したタンパク質全量の濃度をもって重量比を算出することが可能である。
【００５７】
本発明の酵素処理条件において、糸状菌由来セルラーゼ混合物と、好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量としては、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇ（純度９５％以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）の場合の重量）が好ましい。より好ましくは、セルロース１ｇに対し、０．１〜５０ｍｇである。セルロース前処理物１ｇに対し、５００ｍｇを超えると酵素添加量に対してセルロース分解効率があまり向上しないため、経済的に好ましくない。一方で、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１ｍｇ未満であると、セルロース分解効率が低くなるため好ましくない。したがって、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇの範囲にあることによって、酵素使用量を低く抑えることができ、またセルロース前処理物の効率的な分解効率を得ることができる。
【００５８】
エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ、βグルコシダーゼなどの本発明に関わる酵素の活性は、公知の方法で測定することができる。
【００５９】
エンドグルカナーゼ活性の測定方法としては、例えばカルボキシルメチルセルロース０．２５％溶液に酵素液を添加し、生成した還元糖末端をジニトロサリチル酸、あるいはソモギーネルソン法といった測定方法により定量する方法などを例示できる。
【００６０】
セロビオハイドラーゼ活性の測定、例えばリン酸膨潤アビセルに酵素液を添加し、生成した還元等を測定する方法、またはｐ−ニトロフェニル−β−セロビシドを基質として加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノールの発色をもって測定する方法が例示できる。
【００６１】
βグルコシダーゼ活性の測定は、例えば５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したセロビオースの基質溶液に酵素液を添加し、３０〜８５℃で３０分間反応後、必要によりｐＨを変化させるなどして反応を停止させた後、グルコース定量キットを用いて、反応液中のグルコース濃度を定量することによって行うことができる。
【００６２】
(実施例)
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ（セルクラスト、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）混合物を使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、分画分子量１００００のポリエーテルスルホン製限外ろ過膜（ミリポア）を使用して、脱塩・精製を行った。タンパク質濃度は、ＢＣＡ測定キット（BCA Protein Assay Regent kit、ピアス社）を使用して行い、牛アルブミン（２ｍｇ／ｍＬ）を標品として、５６２ｎｍの吸光度を測定し、比色定量を行った。ＰｆＢＧＬは、実施例１で得られたタンパク質濃度を前記同様の方法で測定した。ＴｖＢＧＬは、実施例２で得られたタンパク質濃度を前記同様の方法で測定した。重量比率は、酵素反応に最終的に添加するタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）をもって算出した。
【００６４】
［実施例１］
パイロコッカス属由来βグルコシダーゼの大腸菌での発現
パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子は、配列番号１記載の遺伝子を全合成し、ｐＥＴ１１ｄのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結し、ＪＭ１０９（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて行った。形質転換されたＪＭ１０９株より、作製したベクターｐＥＴ−ＰｆＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析を行った。ｐＥＴ−ＰｆＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株を、アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、８５℃で１５分保温し、βグルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に透析した。透析後の溶液をＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＮａＣｌ勾配、０Ｍ〜０．５Ｍ）にて、さらに精製した。得られたタンパク質溶液をパイロコッカス属由来βグルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、得られたＰｆＢＧＬは、純度９５％以上であることが確認できた。
【００６５】
［実施例２］
サーモプラズマ属由来βグルコシダーゼの大腸菌での発現
サーモプラズマ・ボルカニウム由来のβグルコシダーゼ遺伝子は、配列番号３記載の遺伝子を全合成し、ｐＥＴ１１ｄのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結し、ＪＭ１０９（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて行った。形質転換されたＪＭ１０９株より、作製したベクターｐＥＴ−ＴｖＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析を行った。ｐＥＴ−ＴｖＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬ株を、アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、８５℃で１５分保温し、βグルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に透析した。透析後の溶液をＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＮａＣｌ勾配、０Ｍ〜０．５Ｍ）にて、さらに精製した。得られたタンパク質溶液をサーモプラズマ属由来βグルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、得られたＴｖＢＧＬは、純度９５％以上であることが確認できた。
【００６６】
＜比較例１＞アスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼの調製
アスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼの調製を行った。アスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）より調製した。まず、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８をタンパク質濃度２０ｍｇ／ｍＬとなるように、酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）で希釈した。希釈した溶液を、酢酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア）により精製した。次に、分画分子量３００００の限外濾過膜（ミリポア）を使用して、さらに脱塩・濃縮を行い、アスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼ（ＡｓｐＢＧＬ）を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、得られたＡｓｐＢＧＬは、純度９５％以上であることが確認できた。
【００６７】
［実施例３］
セロビオース分解活性（比活性）の比較
実施例１および実施例２で得られたパイロコッカス属由来βグルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）、サーモプラズマ属由来βグルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）、および比較例１で得られたアスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼ（ＡｓｐＢＧＬ）のタンパク質濃度あたりセロビオース分解活性（比活性）を測定した。セロビオース分解活性の測定は以下の方法で実施した。
【００６８】
１５ｍＭのセロビオース溶液２５０μＬ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）に対し、実施例１で調製した１０μｇ／ｍＬのＰｆＢＧＬ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）と、実施例２で調製した１０μｇ／ｍＬのＴｖＢＧＬ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）と、比較例１で調製した１０μｇ／ｍＬのＡｓｐＢＧＬβグルコシダーゼ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を２５０μL添加し、３０〜８５℃の各温度で３０分間反応させた後、生成したグルコース濃度測定を行った。生成したグルコース濃度は、グルコーステスト和光で測定した。セロビオース分解活性１ユニット（Ｕ）は、下記の式に準じて算出した。
【００６９】
セロビオース分解活性１ユニット（Ｕ）＝反応終了時に生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）×１０００÷１８０÷３０
【００７０】
さらに、セロビオース分解活性を、βグルコシダーゼ量（ｍｇ）当たりの比活性を下記の式で算出した。
【００７１】
セロビオース分解比活性（Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）＝セロビオース分解活性（Ｕ）÷活性測定に添加したβグルコシダーゼ量（ｍｇ）
【００７２】
各温度において得られた比活性の比較結果を表１にまとめた。ＰｆＢＧＬおよびＴｖＢＧＬは、８５℃の温度条件において、最も高いセロビオース分解活性を示すものの、６５℃、６０℃、５５℃、５０℃、４５℃においてもＡｓｐＢＧＬよりも高い比活性を示すことが示された。すなわち、従来技術で使用されるＡｓｐＢＧＬの最適反応温度においても、ＰｆＢＧＬおよびＴｖＢＧＬを代替物として使用できることが確認できた。
【００７３】
【表１】
【００７４】
［実施例４］
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼによるセルロース前処理物の分解と反応温度条件
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ（セルクラスト、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、分画分子量１００００のポリエーテルスルホン製限外ろ過膜（ミリポア）を使用して、脱塩・精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析の結果、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物には、セロビオハイドラーゼが純度８０％〜９５％で含まれていた。
【００７５】
またβグルコシダーゼとして、実施例１で調製したＰｆＢＧＬ、実施例２で調製したＴｖＢＧＬ、比較例１で調製したＡｓｐＢＧＬ、を使用した。
【００７６】
セルロース前処理物としては、αセルロース（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を使用し、これを希硫酸処理したものを使用した。希硫酸処理は、下記の手順で実施した。αセルロース２０ｇ秤量し、２重量％希硫酸水溶液１８０ｍＬを加え、１３０℃で３０分オートクレーブを行った。得られた希硫酸処理物を固液分離し、固形分をＲＯ水でよく洗浄した。洗浄後、水分を搾り、カッター式ミル（ＩＫＡジャパン）を使用してさらに粉砕し、その後乳鉢でペーストとなるまですりつぶした。この時点のセルロース前処理物はそれぞれ、８４重量％であった。これを酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５）に懸濁し、セルロース前処理物として使用した。
【００７７】
セルロース前処理物の酵素分解条件として、糸状菌由来セルラーゼ混合物とＰｆＢＧＬ、糸状菌由来セルラーゼ混合物とＴｖＢＧＬ、糸状菌由来セルラーゼ混合物とＡｓｐＢＧＬの混合比は、１：０．１に設定し、最終濃度が０．１３ ｍｇ／ｍLとなるようにセルロース前処理物に添加した。セルロース前処理物固形分濃度は２重量％となるように調整した。処理温度は、３０℃〜８５℃の範囲で行い、処理時間は、２４時間で実施した。２４時間反応後のグルコース生成量（ｇ／Ｌ）は、グルコーステスト和光（和光純薬工業）を使用して測定した。
【００７８】
以下セルロース前処理物として、αセルロースを使用した場合の結果である。好熱性菌由来βグルコシダーゼであるＰｆＢＧＬ（実施例１）あるいはＴｖＢＧＬ（実施例２）と糸状菌由来セルラーゼ混合物を併用することで、セルロース分解効率が向上することが確認できた。また、比較例１であるＡｓｐＢＧＬと比較して、ＰｆＢＧＬ（実施例１）あるいはＴｖＧＢＬ（実施例２）の方がセルロース分解効率が向上することが確認できた。またＰｆＢＧＬ（実施例１）あるいはＴｖＢＧＬ（実施例２）と糸状菌由来セルラーゼを使用するセルロースの分解条件としては、４０℃〜６０℃が高い分解効率を得るために最適であることが示された。
【００７９】
【表２】
【００８０】
［実施例５］
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比の最適化
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比（混合比率）の最適化の検討を行った。好熱性菌由来βグルコシダーゼは、実施例１で調製したＰｆＢＧＬ、実施例２で調製したＴｖＢＧＬ、比較例１で調製したＡｓｐＢＧＬを使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、実施例４で調製したトリコデルマ由来セルラーゼ混合物を使用した。
【００８１】
基質にはαセルロースを使用し、セルロース前処理物固形分濃度は２重量％となるように調整した。これに、最終濃度が０．１３ ｍｇ／ｍLとなるように糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、この糸状菌由来セルラーゼ混合物濃度に対して、ＰｆＢＧＬ。ＴｖＢＧＬ、あるいはＡｓｐＢＧＬが、重量比率として、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：１（０．１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．１（０．０１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．０１（０．００１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．００１（０．０００１３ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．０００５（０．００００６５ ｍｇ／ｍL）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０．０００１（０．００００１３ ｍｇ／ｍL）となるようにそれぞれ調整した（実施例４）。また、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：１０（１．３ ｍｇ／ｍL）の場合（参考例１）、１（０．１３ ｍｇ／ｍL）：０（０ ｍｇ／ｍL）の場合（比較例２）も同様に行った。処理温度は５０℃、処理時間は２４時間で実施した。２４時間反応後のグルコース生成量（ｇ／Ｌ）は、グルコーステスト和光（和光純薬工業）を使用して測定した。
【００８２】
各酵素比率でのグルコース生成量を表３にまとめた。実施例１のＰｆＢＧＬは、糸状菌由来セルラーゼ混合物１に対して０．０００５加えるだけでもセルロース分解効率を向上させ、添加効果があることを確認できた。実施例２のＴｖＢＧＬは、糸状菌由来セルラーゼ混合物１に対して０．００１加えるだけでもセルロース分解効率を向上させ、添加効果があることを確認できた。また比較例１であるＡｓｐＢＧＬでも添加効果は確認されたが、このときの比率は１：０．０１であった。これと比較すると、実施例１のＰｆＢＧＬ、あるいは実施例２のＴｖＢＧＬの方が、従来ＡｓｐＢＧＬの１／１０〜１００量で効果があることが確認できた。実施例１のＰｆＢＧＬを使用する際の糸状菌由来セルラーゼ混合物との混合比率として、糸状菌由来セルラーゼ混合物１に対して１〜０．０１が高い分解効率を得るために最適であることが示された。
【００８３】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、セルロースから発酵原料である糖液を製造する工程に使用することができる。本発明では、セルロースの加水分解に使用する酵素の使用量削減することができるため、産業上極めて有益である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。
【請求項２】
好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来であることを特徴とする、請求項１記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
好熱性菌由来βグルコシダーゼが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、それらの各アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セロビオース分解活性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、請求項１または２記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
好熱性菌由来βグルコシダーゼが、異種宿主によって生産されたものであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
【請求項６】
酵素処理条件が、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７で行うことを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項７】
酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で１：１〜１：０．０００５で添加することを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項８】
酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量として、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇ添加し、酵素処理することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項９】
セルロース前処理物が、セルロース含有バイオマスを希硫酸処理してなることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項１】
セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。
【請求項２】
好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来であることを特徴とする、請求項１記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
好熱性菌由来βグルコシダーゼが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、それらの各アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セロビオース分解活性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、請求項１または２記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
好熱性菌由来βグルコシダーゼが、異種宿主によって生産されたものであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
【請求項６】
酵素処理条件が、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７で行うことを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項７】
酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で１：１〜１：０．０００５で添加することを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項８】
酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量として、セルロース前処理物１ｇに対し、０．０１〜５００ｍｇ添加し、酵素処理することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【請求項９】
セルロース前処理物が、セルロース含有バイオマスを希硫酸処理してなることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項記載の糖液の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−２４５０１（Ｐ２０１１−２４５０１Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７４６６２（Ｐ２００９−１７４６６２）
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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