糖転移能が改善された欠失変異酵素を用いた配糖体の製造方法
【課題】ヘテロオリゴ糖をアルコール性水酸基を有する化合物に転移させる配糖体の製造方法において、より容易な酵素試料の提供と反応の高収率化を図る酵素の製造方法を提供する。
【解決手段】β１，４グルコシド結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインを酵素源とする、高効率にラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミン単位を転移する手法。また、該当する酵素を組み換え培養液からｐＨ調整、遠心分離からなる簡便な工程より、高い精製レベルで製造する手法。酵素の触媒ドメインとして、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩ（ＥＧ Ｉ）の活性ドメインを利用する。
【解決手段】β１，４グルコシド結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインを酵素源とする、高効率にラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミン単位を転移する手法。また、該当する酵素を組み換え培養液からｐＨ調整、遠心分離からなる簡便な工程より、高い精製レベルで製造する手法。酵素の触媒ドメインとして、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩ（ＥＧ Ｉ）の活性ドメインを利用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトシル配糖体またはＮ−アセチルラクトサミニル配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の配糖体の製造方法としては、例えば、「特許文献１」に掲載されたものが知られている。ここでは、β１，４グルコシル結合切断活性を持つ酵素の存在下でラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンを種々のアルコール性水酸基、フェノール性水酸基に転移する反応について述べられている。
【０００３】
また、「文献１」において糖転移活性を持つ酵素種がセルラーゼ中のエンドグルコシダーゼに分類されることを推察している。
【０００４】
【特許文献１】国際公開（ＷＯ０１／０１４５７５）公報
【非特許文献１】Ｊ． Ａｐｐｌｙ． Ｇｌｙｃｏｓｃｉ． ５１， ｐｐ１４１−１４７， ２００４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、「特許文献１」の配糖体の製造方法にあっては、反応に用いる酵素源としては、市販の酵素製剤（粗酵素）を用いた実施例にとどまり、特定の酵素によるものか評価されていいない。「文献１」においてもエンド型の酵素の一種が糖転移能を示すことを推察するのに限られている。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼには、セロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼに大別されておりそれぞれ複数種存在する。そのため、どの種類のどの酵素が糖転移に有用であるのか示されていない。
【０００６】
また、反応効率についても、市販の酵素製剤を用いた反応では、製剤中に複数種の酵素が混入されているため、糖転移の単位である２糖のラクトース、ラクトサミンが分解され単糖となる活性も含有されている。転移酵素に有用な酵素を特定し、当該酵素を組み換え発現した酵素原液を用いることで、夾雑する活性を除去することも可能であるが、組み換え体の宿主由来の夾雑活性が問題になることがある。また、組み換え遺伝子に特定の配列を付加することで、培養液からカラム分離等の操作で目的酵素を回収する手法が存在するが、産業への利用する規模で酵素原液を得るためには操作が煩雑であり、コストが高い製造法となる。以上の理由で、これまでの先行技術では、実際の産業に応用するには問題が多く、利用が限定されている。
【０００７】
本発明は上記の問題点に鑑みて為されたもので、糖転移反応を大幅に効率改善する酵素と、該当する酵素の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的を達成するための本発明の技術的手段は、β１，４グルコシド結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインを酵素源とすることで、酵素の混合物もしくは特定の酵素を用いる手法と比較して、高効率にラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミン単位を転移する手法を提供するものである。また、該当する酵素を組み換え培養液からｐＨ調整、遠心分離からなる簡便な工程より、高い精製レベルで製造する手法を提供するものである。
【０００９】
さらに詳細には、β１，４グルコシド結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインとして、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来エンドグルカナーゼＩ（ＥＧ Ｉ）の活性ドメインを利用する。当該酵素を大腸菌で組み換え発現し、ｐＨ調整と遠心分離からなる簡便な工程をより、精製酵素を得る手法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
セルラーゼ粗酵素中には物理化学的性質の似通った複数のセルラーゼが存在しており糖転移反応の効率が高い酵素のみを精製することは大変困難である。本発明によれば、触媒ドメインを発現し、培養液をｐＨ調整、遠心分離することにより、簡便に目的活性をもつ酵素のみを得ることができる。また、触媒ドメインのみの反応は酵素全体を用いた反応と比較して効率が上昇する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
現在、セルラーゼ製剤として市販されている製品にはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を由来とする製品が多い。本微生物は、図１に示すように２種のセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）と多種のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）を生産する。
【００１２】
セルラーゼの活性触媒ドメインは各種酵素により異なるが、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ ７（ＧＨファミリー７）に属するエンドグルカナーゼ等の場合は、ＵＮＩＰＬＯＴ等のデータベースによれば、図１１に示すように、アミノ酸２３７〜２６０の領域の保存性が高く、共通するアミノ酸配列として挙げられる。必要に応じて変異を導入してドメイン内のアミノ酸配列を改変しても良い。
【００１３】
組み換え体に用いるベクターやプラスミドについては特に制限はない。酵素の生産量の関係より、プロモーター領域を改変したり、発現誘導する薬剤マーカーを導入したり、宿主における発現場所を指定するためシグナル配列を導入しても良い。
【００１４】
組み換え体の宿主は、本発明のｐＨ調整、遠心分離からなる手法が可能であれば、特に制限はない。酵素の生産量の関係より、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母等、組み換え発現する手法が確立している生物種を宿主とするのが望ましい。
【００１５】
組み換え体の培養において種菌の量、培地組成、培養温度、ｐＨについては特に制限はない。発現誘導する薬剤マーカーを導入した場合には適切な培養フェーズにおいて誘導を行うことができる。
【００１６】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＥＧ Ｉの触媒ドメインを酵素源として、大腸菌で組み換え発現した場合の詳細な組み換え体の作成法、培養法を「実施例１」、「実施例２」に示す。
【００１７】
組み換え体からの酵素の精製法は、ｐＨ調整、遠心分離からなる手法であれば特に制限はない。ｐＨ調整の範囲は宿主由来のタンパク質や組み換え酵素の等電点（ｐI）、目的酵素の安定性、溶解性を考慮して任意に設定する。遠心分離については目的酵素の回収率に応じて任意に設定できる。
【００１８】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＥＧ Ｉの触媒ドメインを酵素源として、大腸菌で組み換え発現した場合の、精製酵素の回収例を「実施例３」に示す。
【００１９】
組み換え酵素を用いたヘテロオリゴ糖単位の転移反応については、β１，４結合で構成されるヘテロオリゴ糖単位であれば制限はない。産業上利用が可能な糖質として、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミンが挙げられる。
【００２０】
転移反応におけるアクセプターとしては、水酸基（ＯＨ）を有するものであれば特に制限はない。
【００２１】
転移反応における、反応温度、ｐＨは酵素の安定性、反応の効率を考慮して、任意に選択できる。
【００２２】
転移反応の確認はＴＬＣにおけるＲｆ値の比較、およびにＨＰＬＣ分析における溶出時間の比較を行うことで縮合生成物の成否を判定できる。
【００２３】
二糖としてラクトース（以下、Ｌａｃという）、Ｎ−アセチルラクトサミン、アグリコンのモデルとして、１，６−ヘキサンジオール（以下、ＨＤという）やオリゴエチレングリコールを用い、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＥＧ Ｉの触媒ドメインを酵素源として、縮合反応を実施した例を、「実施例４」、「実施例５」、「実施例６」に示す。
【００２４】
トリコデルマ・リーセイ由来の酵素製剤（粗酵素）や、それから調製した精製酵素（ＥＧ Ｉ）を用いた反応を「比較例２」に示す。精製酵素の調製方法は「比較例１」に示す。
【００２５】
以下、添付図面に基づいて、本発明の実施の形態に係る配糖体の製造方法について詳細に説明する。
【００２６】
（実施例１）組み換え遺伝子の作成法
図２に大腸菌におけるＥＧ Ｉ ＣＤ発現系構築の模式図を示す。トリコデルマ・リーセイのｅｇｌ１遺伝子のシグナル配列、セルロース結合ドメインおよびリンカーをコードするＤＮＡ配列を除去し、図１１におけるアミノ酸配列２３から３９７に相当する領域を触媒ドメインとして、メルク社のｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍのｐＥＴ２２ｂ（＋）のＭＣＳに組み込んだ発現ベクターｐＥＴ２２ｂｅｇｌ１ｃｄを構築し、メルク社のＥ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ?ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩを宿主とした形質転換体を用いて酵素調製を行った。得られたＥＧ Ｉ ＣＤ産生形質転換体を２×ＹＴ培地で１５℃、１日間培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２日間誘導培養することで酵素生産を行った。ＥＧ Ｉ ＣＤはシグナルペプチドを除去しているので菌体内に生産される。
【００２７】
（実施例２）組み換え遺伝体の培養法
図３に菌体の培養法とＥＧ Ｉ ＣＤ精製法を示す。適切な抗生物質（１００ｍｇ／ｌアンピシリン、１５ｍｇ／ｌカナマイシン、１２．５ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３０mg／lクロラムフェニコール）を含むＬＢプレート培地に、ＥＧ Ｉ ＣＤ産生Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体を、３７℃で２４時間静置培養し、生育したＥ． ｃｏｌｉ形質転換体を適切な抗生物質を含む５０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で１２０ｒｐｍ、２４時間振とうしながら培養した。６００ｎｍにおける濁度を測定し、適切な菌体濃度であることを確認した後、そのうちの２．５ｍｌを適切な抗生物質を含む５０ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌し、１５℃、１２０ｒｐｍ、２０時間培養（ＯＤ６００＝０．４−１．０になるまで）を行った。その後、６００ｎｍにおける濁度を測定し適切な菌体濃度であることを確認し、１Ｍのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を５０μｌ加え、１５℃、１２０ｒｐｍ、４８時間誘導培養を行った。
【００２８】
図４に示すようにＥＧ Ｉ ＣＤ産生Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体の培養温度とＥＧ Ｉ ＣＤの発現量の関係は１５℃のとき６．９ｍｇ／ｌ、２０℃のとき１．５ｍｇ／ｌ、３０℃のとき０．０４３ｍｇ／ｌであり、培養温度が１５℃のとき最も発現量が高かった。
【００２９】
（実施例３）組み換え遺伝体からの酵素精製法
培養液を回収し、遠心分離によって集菌を行った。菌体の培地成分を除去するために生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で洗浄し、メルク社製のＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅａｇｅｎｔによって菌体を穏やかに破砕した。ＥＧ Ｉとともに混在している大腸菌タンパク質を除去するためにｐＨ４．０の酢酸緩衝液を加え、１晩程度静置し、酸性沈殿を起こさせた。出現した大腸菌タンパク質を遠心分離によって除いたあと、この上澄み液を限外ろ過により濃縮し、精製ＥＧ Ｉ ＣＤ酵素標品を得た。
【００３０】
精製ＥＧ Ｉ ＣＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の写真を図５に示す。図３に示す簡便な精製法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一バンドとして見えるほど精製された状態になることが分かる。
【００３１】
（実施例４）組み換え酵素を用いたラクトース単位の転移反応
ラクトースと１，６−ヘキサンジオールの縮合反応を精製ＥＧ Ｉ ＣＤを触媒として実施した。以下に縮合反の条件を示す。２．６ｍｇ／ｍｌの酵素溶液１００μｌ（０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解）に、４３０ｍｇ／ｍｌのＬａｃを４００μｌ、４４４ｍｇ／ｍｌのＨＤを４００μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μｌ加え、全量を１０００μlとした。酵素反応は３７℃で行い、１００℃、１０分加熱し、反応を停止させた。サンプリングはそれぞれ反応開始から、１時間後、１２時間後、２３時間後、３２．５時間後、４７時間後に行った。反応は薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣという、展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝６０：３５：８）で確認した。ＴＬＣはメルク社製のアルミニウムシートシリカゲル６０／Ｋｉｅｓｅｌｇｕｒ Ｆ２５４プレコートを用いた。検出は、オルシノール−硫酸法による発色で行った。
【００３２】
上記の結果を図６に示す。図中のＧａｌはガラクトース、Ｌａｃはラクトースを表し、1ｈ、１２ｈ、２３ｈ、３２．５ｈ、４７ｈはそれぞれ反応時間を表す。Ｌａｃ−ＨＤは生成物の６−ヒドロキシヘキシル−β−ラクトシド（Ｌａｃβ−ＨＤ）を表す。Ｌａｃ−ＨＤのＲｆ値はＬａｃのＲｆ値よりも大きかった。１ｈ〜４７ｈのすべての反応液中に反応生成物であるＬａｃβ−ＨＤが生成されており、反応時間とともに増加する傾向にあった。
【００３３】
図７は、図６のすべての反応液を高速液体クロマトグラフィーにより定量的に分析したクロマトグラムの図である。経時的にサンプリングした図６の反応液を水で３倍に希釈し、Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０Ｅ ＨＰＬＣ用カラム（φ４．６×２５０ｍｍ）にロードし、８０％アセトニトリル水溶液を溶媒として、流速１．０ｍｌ／分で分析した。検出には示差屈折率検出器 Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−１０１を用いた。Ｓｔｄ．は反応の基質と生成物の標準品として、１％のＬａｃとを１％のＬａｃβ−ＨＤを等量混合したものを上記のカラムに供した際の、クロマトグラムである。
【００３４】
図８は、図７のそれぞれの反応時間での高速液体クロマトグラムにおけるＬａｃとＬａｃβ−ＨＤの面積比をプロットしたものである。図８から縮合率は２４時間以内に４０％近くに到達することがわかる。
【００３５】
（比較例１）トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧ Ｉの調製
「文献１」に従い、トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ粗酵素（合同酒精（株）製ＧＯＤＯ ＴＣＤ−Ｈ３）を０−７０％飽和硫安塩析し、沈殿を脱塩後、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したＧＥヘルスケア社製弱陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ（φ１．６×２．５ｃｍ）に供し、吸着部を０−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配よって溶出し、ｐ−ニトロフェニルβ−ラクトシド（Ｌａｃβ−ｐＮＰ）に対する加水分解活性を有する画分「ＦＩ」として得た。ＦＩをＢｉｏ−Ｒａｄ社の強陰イオン交換カラムＵＮＯ−Ｑ１（φ０．７×３．５ｃｍ）に展開し、吸着部を０−１Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配によって溶出し、ｐ−ニトロフェニルβ−ラクトシド（Ｌａｃβ−ｐＮＰ）に対する加水分解活性を有する画分「ＦＩ−２」を得た。ＦＩ−２は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動や等電点電気泳動（ＧＥヘルスケア社製ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）、ＭｏｎｏＰクロマトフォーカシング（ＧＥヘルスケア社製）などの結果からＥＧ Ｉが含まれていると推察された。
【００３６】
(比較例２)
トリコデルマ・リーセイの粗酵素、および比較例１より得られるＥＧ Ｉ精製酵素を酵素源として、実施例４と同様な反応を実施した。「粗酵素」は、トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ粗酵素（合同酒精（株）製ＧＯＤＯ ＴＣＤ−Ｈ３）を０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度で用い同様の縮合反応を行ったものである。いずれも縮合率は５％となり、実施例４のように高い縮合率には到達しなかった。
【００３７】
（実施例５）組み換え酵素を用いたＮ−アセチルラクトサミン単位の転移反応
実施例４と同様の精製酵素を用いて、ＨＤとＮ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃという）の縮合反応を行った。ＨＰＬＣによる縮合反応液の分析結果を図９に示す。２．６ｍｇ／ｍｌの酵素溶液５μｌ（０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解）に、１９２ｍｇ／ｍｌのＬａｃＮＡｃを２０μｌ、４４４ｍｇ／ｍｌのＨＤを２０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を５μｌ加え、全量を５０μlとした。酵素反応は３７℃で行い、１００℃、１０分加熱し、反応を停止させた。ＨＰＬＣ分析には関東化学製のＭｉｇｈｔｙｓｉｌ Ｓｉ６０ ＨＰＬＣ用カラムを用いた。９２．５％アセトニトリル水溶液を溶媒とし、生成物の検出は、２１０ｎｍのＵＶ吸収を測定することにより行った。生成物は、既に構造を確認している標準品、６−ヒドロキシヘキシル−β−Ｎ−アセチルラクトサミニド（ＬａｃＮＡｃβ−ＨＤ）とのＨＰＬＣ分析における溶出時間の比較を行うことで縮合生成物の成否と同定を行った。精製ＥＧ Ｉ ＣＤによる縮合反応により約２％のＬａｃＮＡｃβ−ＨＤの生成を認めた。
【００３８】
（実施例６）組み換え酵素を用いたラクトース単位の転移反応
ラクトースとオリゴエチレングリコールの縮合反応を精製ＥＧ Ｉ ＣＤを触媒として実施した。以下に縮合反の条件を示す。２．６ｍｇ／ｍｌの酵素溶液１００μｌ（０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解）に、４３０ｍｇ／ｍｌのＬａｃを４００μｌ、それぞれ反応液中の最終濃度が1 mole/l となるよう調製したオリゴエチレングリコール（ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール）を４００μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μｌ加え、全量を１０００μｌとした。酵素反応は３７℃で行い、１００℃、１０分加熱し、反応を停止させた。サンプリングは反応開始から、１４時間後に行った。反応はＴＬＣ（展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝６０：３５：８）で確認した。検出は、オルシノール−硫酸法による発色で行った。
【００３９】
上記の結果を図１０に示す。図中のｄｉ、ｔｒｉ、ｔｅｔ、ｐｅｎ、ＨＤは、それぞれ、アグリコンとして用いたオリゴエチレングリコール（エチレン数２〜５）と１，６−ヘキサンジオールを示し、Ｌａｃ−ＨＤはＬａｃβ−ＨＤを、Ｇａｌはガラクトースを、Ｌａｃはラクトースを表す。反応開始後１４時間で既に、ラクトースとオリゴエチレングリコールからなる一連の縮合生成物（図中の枠内、１〜４）が生成しており、それぞれ各アグリコンのラクトシル配糖体と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の産生するセルラーゼの一覧表にＥＧ Ｉの触媒ドメイン（ＥＧ Ｉ ＣＤ）を加えたものである。
【図２】トリコデルマ・リーセイＥＧ Ｉ ＣＤの大腸菌における発現系の構築を示す模式図である。
【図３】大腸菌形質転換体の培養方法とＥＧ Ｉ ＣＤの精製方法示す図である。
【図４】大腸菌形質転換体の培養温度とＥＧ Ｉ ＣＤの発現量の関係を示す図である。
【図５】精製ＥＧ Ｉ ＣＤの純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。
【図６】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応のＴＬＣによる分析結果を示す図である。
【図７】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図８】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応生成物量の経時変化を示す図である。
【図９】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるＮ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）縮合反応のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１０】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応のＴＬＣによる分析結果を示す図である。（アグリコン：オリゴエチレングリコール）
【図１１】トリコデルマ・リーセイのＥＧ ＩとＥＧ Ｉ ＣＤ、およびＧＨファミリー７に属するセルラーゼのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトシル配糖体またはＮ−アセチルラクトサミニル配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の配糖体の製造方法としては、例えば、「特許文献１」に掲載されたものが知られている。ここでは、β１，４グルコシル結合切断活性を持つ酵素の存在下でラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンを種々のアルコール性水酸基、フェノール性水酸基に転移する反応について述べられている。
【０００３】
また、「文献１」において糖転移活性を持つ酵素種がセルラーゼ中のエンドグルコシダーゼに分類されることを推察している。
【０００４】
【特許文献１】国際公開（ＷＯ０１／０１４５７５）公報
【非特許文献１】Ｊ． Ａｐｐｌｙ． Ｇｌｙｃｏｓｃｉ． ５１， ｐｐ１４１−１４７， ２００４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、「特許文献１」の配糖体の製造方法にあっては、反応に用いる酵素源としては、市販の酵素製剤（粗酵素）を用いた実施例にとどまり、特定の酵素によるものか評価されていいない。「文献１」においてもエンド型の酵素の一種が糖転移能を示すことを推察するのに限られている。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼには、セロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼに大別されておりそれぞれ複数種存在する。そのため、どの種類のどの酵素が糖転移に有用であるのか示されていない。
【０００６】
また、反応効率についても、市販の酵素製剤を用いた反応では、製剤中に複数種の酵素が混入されているため、糖転移の単位である２糖のラクトース、ラクトサミンが分解され単糖となる活性も含有されている。転移酵素に有用な酵素を特定し、当該酵素を組み換え発現した酵素原液を用いることで、夾雑する活性を除去することも可能であるが、組み換え体の宿主由来の夾雑活性が問題になることがある。また、組み換え遺伝子に特定の配列を付加することで、培養液からカラム分離等の操作で目的酵素を回収する手法が存在するが、産業への利用する規模で酵素原液を得るためには操作が煩雑であり、コストが高い製造法となる。以上の理由で、これまでの先行技術では、実際の産業に応用するには問題が多く、利用が限定されている。
【０００７】
本発明は上記の問題点に鑑みて為されたもので、糖転移反応を大幅に効率改善する酵素と、該当する酵素の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的を達成するための本発明の技術的手段は、β１，４グルコシド結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインを酵素源とすることで、酵素の混合物もしくは特定の酵素を用いる手法と比較して、高効率にラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミン単位を転移する手法を提供するものである。また、該当する酵素を組み換え培養液からｐＨ調整、遠心分離からなる簡便な工程より、高い精製レベルで製造する手法を提供するものである。
【０００９】
さらに詳細には、β１，４グルコシド結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインとして、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来エンドグルカナーゼＩ（ＥＧ Ｉ）の活性ドメインを利用する。当該酵素を大腸菌で組み換え発現し、ｐＨ調整と遠心分離からなる簡便な工程をより、精製酵素を得る手法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
セルラーゼ粗酵素中には物理化学的性質の似通った複数のセルラーゼが存在しており糖転移反応の効率が高い酵素のみを精製することは大変困難である。本発明によれば、触媒ドメインを発現し、培養液をｐＨ調整、遠心分離することにより、簡便に目的活性をもつ酵素のみを得ることができる。また、触媒ドメインのみの反応は酵素全体を用いた反応と比較して効率が上昇する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
現在、セルラーゼ製剤として市販されている製品にはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を由来とする製品が多い。本微生物は、図１に示すように２種のセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）と多種のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）を生産する。
【００１２】
セルラーゼの活性触媒ドメインは各種酵素により異なるが、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ ７（ＧＨファミリー７）に属するエンドグルカナーゼ等の場合は、ＵＮＩＰＬＯＴ等のデータベースによれば、図１１に示すように、アミノ酸２３７〜２６０の領域の保存性が高く、共通するアミノ酸配列として挙げられる。必要に応じて変異を導入してドメイン内のアミノ酸配列を改変しても良い。
【００１３】
組み換え体に用いるベクターやプラスミドについては特に制限はない。酵素の生産量の関係より、プロモーター領域を改変したり、発現誘導する薬剤マーカーを導入したり、宿主における発現場所を指定するためシグナル配列を導入しても良い。
【００１４】
組み換え体の宿主は、本発明のｐＨ調整、遠心分離からなる手法が可能であれば、特に制限はない。酵素の生産量の関係より、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母等、組み換え発現する手法が確立している生物種を宿主とするのが望ましい。
【００１５】
組み換え体の培養において種菌の量、培地組成、培養温度、ｐＨについては特に制限はない。発現誘導する薬剤マーカーを導入した場合には適切な培養フェーズにおいて誘導を行うことができる。
【００１６】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＥＧ Ｉの触媒ドメインを酵素源として、大腸菌で組み換え発現した場合の詳細な組み換え体の作成法、培養法を「実施例１」、「実施例２」に示す。
【００１７】
組み換え体からの酵素の精製法は、ｐＨ調整、遠心分離からなる手法であれば特に制限はない。ｐＨ調整の範囲は宿主由来のタンパク質や組み換え酵素の等電点（ｐI）、目的酵素の安定性、溶解性を考慮して任意に設定する。遠心分離については目的酵素の回収率に応じて任意に設定できる。
【００１８】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＥＧ Ｉの触媒ドメインを酵素源として、大腸菌で組み換え発現した場合の、精製酵素の回収例を「実施例３」に示す。
【００１９】
組み換え酵素を用いたヘテロオリゴ糖単位の転移反応については、β１，４結合で構成されるヘテロオリゴ糖単位であれば制限はない。産業上利用が可能な糖質として、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミンが挙げられる。
【００２０】
転移反応におけるアクセプターとしては、水酸基（ＯＨ）を有するものであれば特に制限はない。
【００２１】
転移反応における、反応温度、ｐＨは酵素の安定性、反応の効率を考慮して、任意に選択できる。
【００２２】
転移反応の確認はＴＬＣにおけるＲｆ値の比較、およびにＨＰＬＣ分析における溶出時間の比較を行うことで縮合生成物の成否を判定できる。
【００２３】
二糖としてラクトース（以下、Ｌａｃという）、Ｎ−アセチルラクトサミン、アグリコンのモデルとして、１，６−ヘキサンジオール（以下、ＨＤという）やオリゴエチレングリコールを用い、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＥＧ Ｉの触媒ドメインを酵素源として、縮合反応を実施した例を、「実施例４」、「実施例５」、「実施例６」に示す。
【００２４】
トリコデルマ・リーセイ由来の酵素製剤（粗酵素）や、それから調製した精製酵素（ＥＧ Ｉ）を用いた反応を「比較例２」に示す。精製酵素の調製方法は「比較例１」に示す。
【００２５】
以下、添付図面に基づいて、本発明の実施の形態に係る配糖体の製造方法について詳細に説明する。
【００２６】
（実施例１）組み換え遺伝子の作成法
図２に大腸菌におけるＥＧ Ｉ ＣＤ発現系構築の模式図を示す。トリコデルマ・リーセイのｅｇｌ１遺伝子のシグナル配列、セルロース結合ドメインおよびリンカーをコードするＤＮＡ配列を除去し、図１１におけるアミノ酸配列２３から３９７に相当する領域を触媒ドメインとして、メルク社のｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍのｐＥＴ２２ｂ（＋）のＭＣＳに組み込んだ発現ベクターｐＥＴ２２ｂｅｇｌ１ｃｄを構築し、メルク社のＥ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ?ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩを宿主とした形質転換体を用いて酵素調製を行った。得られたＥＧ Ｉ ＣＤ産生形質転換体を２×ＹＴ培地で１５℃、１日間培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２日間誘導培養することで酵素生産を行った。ＥＧ Ｉ ＣＤはシグナルペプチドを除去しているので菌体内に生産される。
【００２７】
（実施例２）組み換え遺伝体の培養法
図３に菌体の培養法とＥＧ Ｉ ＣＤ精製法を示す。適切な抗生物質（１００ｍｇ／ｌアンピシリン、１５ｍｇ／ｌカナマイシン、１２．５ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３０mg／lクロラムフェニコール）を含むＬＢプレート培地に、ＥＧ Ｉ ＣＤ産生Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体を、３７℃で２４時間静置培養し、生育したＥ． ｃｏｌｉ形質転換体を適切な抗生物質を含む５０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で１２０ｒｐｍ、２４時間振とうしながら培養した。６００ｎｍにおける濁度を測定し、適切な菌体濃度であることを確認した後、そのうちの２．５ｍｌを適切な抗生物質を含む５０ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌し、１５℃、１２０ｒｐｍ、２０時間培養（ＯＤ６００＝０．４−１．０になるまで）を行った。その後、６００ｎｍにおける濁度を測定し適切な菌体濃度であることを確認し、１Ｍのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を５０μｌ加え、１５℃、１２０ｒｐｍ、４８時間誘導培養を行った。
【００２８】
図４に示すようにＥＧ Ｉ ＣＤ産生Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体の培養温度とＥＧ Ｉ ＣＤの発現量の関係は１５℃のとき６．９ｍｇ／ｌ、２０℃のとき１．５ｍｇ／ｌ、３０℃のとき０．０４３ｍｇ／ｌであり、培養温度が１５℃のとき最も発現量が高かった。
【００２９】
（実施例３）組み換え遺伝体からの酵素精製法
培養液を回収し、遠心分離によって集菌を行った。菌体の培地成分を除去するために生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で洗浄し、メルク社製のＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅａｇｅｎｔによって菌体を穏やかに破砕した。ＥＧ Ｉとともに混在している大腸菌タンパク質を除去するためにｐＨ４．０の酢酸緩衝液を加え、１晩程度静置し、酸性沈殿を起こさせた。出現した大腸菌タンパク質を遠心分離によって除いたあと、この上澄み液を限外ろ過により濃縮し、精製ＥＧ Ｉ ＣＤ酵素標品を得た。
【００３０】
精製ＥＧ Ｉ ＣＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の写真を図５に示す。図３に示す簡便な精製法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一バンドとして見えるほど精製された状態になることが分かる。
【００３１】
（実施例４）組み換え酵素を用いたラクトース単位の転移反応
ラクトースと１，６−ヘキサンジオールの縮合反応を精製ＥＧ Ｉ ＣＤを触媒として実施した。以下に縮合反の条件を示す。２．６ｍｇ／ｍｌの酵素溶液１００μｌ（０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解）に、４３０ｍｇ／ｍｌのＬａｃを４００μｌ、４４４ｍｇ／ｍｌのＨＤを４００μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μｌ加え、全量を１０００μlとした。酵素反応は３７℃で行い、１００℃、１０分加熱し、反応を停止させた。サンプリングはそれぞれ反応開始から、１時間後、１２時間後、２３時間後、３２．５時間後、４７時間後に行った。反応は薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣという、展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝６０：３５：８）で確認した。ＴＬＣはメルク社製のアルミニウムシートシリカゲル６０／Ｋｉｅｓｅｌｇｕｒ Ｆ２５４プレコートを用いた。検出は、オルシノール−硫酸法による発色で行った。
【００３２】
上記の結果を図６に示す。図中のＧａｌはガラクトース、Ｌａｃはラクトースを表し、1ｈ、１２ｈ、２３ｈ、３２．５ｈ、４７ｈはそれぞれ反応時間を表す。Ｌａｃ−ＨＤは生成物の６−ヒドロキシヘキシル−β−ラクトシド（Ｌａｃβ−ＨＤ）を表す。Ｌａｃ−ＨＤのＲｆ値はＬａｃのＲｆ値よりも大きかった。１ｈ〜４７ｈのすべての反応液中に反応生成物であるＬａｃβ−ＨＤが生成されており、反応時間とともに増加する傾向にあった。
【００３３】
図７は、図６のすべての反応液を高速液体クロマトグラフィーにより定量的に分析したクロマトグラムの図である。経時的にサンプリングした図６の反応液を水で３倍に希釈し、Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０Ｅ ＨＰＬＣ用カラム（φ４．６×２５０ｍｍ）にロードし、８０％アセトニトリル水溶液を溶媒として、流速１．０ｍｌ／分で分析した。検出には示差屈折率検出器 Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−１０１を用いた。Ｓｔｄ．は反応の基質と生成物の標準品として、１％のＬａｃとを１％のＬａｃβ−ＨＤを等量混合したものを上記のカラムに供した際の、クロマトグラムである。
【００３４】
図８は、図７のそれぞれの反応時間での高速液体クロマトグラムにおけるＬａｃとＬａｃβ−ＨＤの面積比をプロットしたものである。図８から縮合率は２４時間以内に４０％近くに到達することがわかる。
【００３５】
（比較例１）トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧ Ｉの調製
「文献１」に従い、トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ粗酵素（合同酒精（株）製ＧＯＤＯ ＴＣＤ−Ｈ３）を０−７０％飽和硫安塩析し、沈殿を脱塩後、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したＧＥヘルスケア社製弱陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ（φ１．６×２．５ｃｍ）に供し、吸着部を０−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配よって溶出し、ｐ−ニトロフェニルβ−ラクトシド（Ｌａｃβ−ｐＮＰ）に対する加水分解活性を有する画分「ＦＩ」として得た。ＦＩをＢｉｏ−Ｒａｄ社の強陰イオン交換カラムＵＮＯ−Ｑ１（φ０．７×３．５ｃｍ）に展開し、吸着部を０−１Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配によって溶出し、ｐ−ニトロフェニルβ−ラクトシド（Ｌａｃβ−ｐＮＰ）に対する加水分解活性を有する画分「ＦＩ−２」を得た。ＦＩ−２は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動や等電点電気泳動（ＧＥヘルスケア社製ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）、ＭｏｎｏＰクロマトフォーカシング（ＧＥヘルスケア社製）などの結果からＥＧ Ｉが含まれていると推察された。
【００３６】
(比較例２)
トリコデルマ・リーセイの粗酵素、および比較例１より得られるＥＧ Ｉ精製酵素を酵素源として、実施例４と同様な反応を実施した。「粗酵素」は、トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ粗酵素（合同酒精（株）製ＧＯＤＯ ＴＣＤ−Ｈ３）を０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度で用い同様の縮合反応を行ったものである。いずれも縮合率は５％となり、実施例４のように高い縮合率には到達しなかった。
【００３７】
（実施例５）組み換え酵素を用いたＮ−アセチルラクトサミン単位の転移反応
実施例４と同様の精製酵素を用いて、ＨＤとＮ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃという）の縮合反応を行った。ＨＰＬＣによる縮合反応液の分析結果を図９に示す。２．６ｍｇ／ｍｌの酵素溶液５μｌ（０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解）に、１９２ｍｇ／ｍｌのＬａｃＮＡｃを２０μｌ、４４４ｍｇ／ｍｌのＨＤを２０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を５μｌ加え、全量を５０μlとした。酵素反応は３７℃で行い、１００℃、１０分加熱し、反応を停止させた。ＨＰＬＣ分析には関東化学製のＭｉｇｈｔｙｓｉｌ Ｓｉ６０ ＨＰＬＣ用カラムを用いた。９２．５％アセトニトリル水溶液を溶媒とし、生成物の検出は、２１０ｎｍのＵＶ吸収を測定することにより行った。生成物は、既に構造を確認している標準品、６−ヒドロキシヘキシル−β−Ｎ−アセチルラクトサミニド（ＬａｃＮＡｃβ−ＨＤ）とのＨＰＬＣ分析における溶出時間の比較を行うことで縮合生成物の成否と同定を行った。精製ＥＧ Ｉ ＣＤによる縮合反応により約２％のＬａｃＮＡｃβ−ＨＤの生成を認めた。
【００３８】
（実施例６）組み換え酵素を用いたラクトース単位の転移反応
ラクトースとオリゴエチレングリコールの縮合反応を精製ＥＧ Ｉ ＣＤを触媒として実施した。以下に縮合反の条件を示す。２．６ｍｇ／ｍｌの酵素溶液１００μｌ（０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解）に、４３０ｍｇ／ｍｌのＬａｃを４００μｌ、それぞれ反応液中の最終濃度が1 mole/l となるよう調製したオリゴエチレングリコール（ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール）を４００μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μｌ加え、全量を１０００μｌとした。酵素反応は３７℃で行い、１００℃、１０分加熱し、反応を停止させた。サンプリングは反応開始から、１４時間後に行った。反応はＴＬＣ（展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝６０：３５：８）で確認した。検出は、オルシノール−硫酸法による発色で行った。
【００３９】
上記の結果を図１０に示す。図中のｄｉ、ｔｒｉ、ｔｅｔ、ｐｅｎ、ＨＤは、それぞれ、アグリコンとして用いたオリゴエチレングリコール（エチレン数２〜５）と１，６−ヘキサンジオールを示し、Ｌａｃ−ＨＤはＬａｃβ−ＨＤを、Ｇａｌはガラクトースを、Ｌａｃはラクトースを表す。反応開始後１４時間で既に、ラクトースとオリゴエチレングリコールからなる一連の縮合生成物（図中の枠内、１〜４）が生成しており、それぞれ各アグリコンのラクトシル配糖体と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の産生するセルラーゼの一覧表にＥＧ Ｉの触媒ドメイン（ＥＧ Ｉ ＣＤ）を加えたものである。
【図２】トリコデルマ・リーセイＥＧ Ｉ ＣＤの大腸菌における発現系の構築を示す模式図である。
【図３】大腸菌形質転換体の培養方法とＥＧ Ｉ ＣＤの精製方法示す図である。
【図４】大腸菌形質転換体の培養温度とＥＧ Ｉ ＣＤの発現量の関係を示す図である。
【図５】精製ＥＧ Ｉ ＣＤの純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。
【図６】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応のＴＬＣによる分析結果を示す図である。
【図７】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図８】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応生成物量の経時変化を示す図である。
【図９】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるＮ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）縮合反応のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１０】精製ＥＧ Ｉ ＣＤによるラクトース縮合反応のＴＬＣによる分析結果を示す図である。（アグリコン：オリゴエチレングリコール）
【図１１】トリコデルマ・リーセイのＥＧ ＩとＥＧ Ｉ ＣＤ、およびＧＨファミリー７に属するセルラーゼのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配糖体の製造方法において、β１，４−グルコシル結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインを酵素源として、ヘテロオリゴ糖をアルコール性水酸基を有する化合物に転移させることを特徴とする、配糖体の製造方法。
【請求項２】
ヘテロオリゴ糖単位がラクトース、ラクトサミンであることを特徴とする請求項１記載の配糖体の製造方法。
【請求項３】
セルラーゼの活性ドメインが、エンドグルカナーゼであることを特徴とする請求項１または２記載の配糖体の製造方法。
【請求項４】
エンドグルカナーゼが、トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧ Ｉであることを特徴とする請求項１乃至３何れかに記載の配糖体の製造方法。
【請求項１】
配糖体の製造方法において、β１，４−グルコシル結合切断活性を有する酵素の触媒ドメインを酵素源として、ヘテロオリゴ糖をアルコール性水酸基を有する化合物に転移させることを特徴とする、配糖体の製造方法。
【請求項２】
ヘテロオリゴ糖単位がラクトース、ラクトサミンであることを特徴とする請求項１記載の配糖体の製造方法。
【請求項３】
セルラーゼの活性ドメインが、エンドグルカナーゼであることを特徴とする請求項１または２記載の配糖体の製造方法。
【請求項４】
エンドグルカナーゼが、トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧ Ｉであることを特徴とする請求項１乃至３何れかに記載の配糖体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２０１４２５（Ｐ２００９−２０１４２５Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４８１０５（Ｐ２００８−４８１０５）
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１月２２日 国立大学法人長岡技術科学大学発行の「Ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ ＣＯＥ ｐｒｏｒａｍ，Ｔｈｅ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｂｙ Ｇｒｅｅｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」に発表
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【出願人】（３０４０２１２８８）国立大学法人長岡技術科学大学 (458)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１月２２日 国立大学法人長岡技術科学大学発行の「Ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ ＣＯＥ ｐｒｏｒａｍ，Ｔｈｅ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｂｙ Ｇｒｅｅｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」に発表
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【出願人】（３０４０２１２８８）国立大学法人長岡技術科学大学 (458)
【Ｆターム（参考）】
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