糞便懸濁ろ過用容器
【課題】 糞便中の剥離がん細胞を迅速、簡便、かつ、安全に回収するための糞便懸濁・濾過用容器を提供する。
【解決手段】 （ａ）糞便に突き刺すことにより０．５グラム以上の糞便を採取できる容量を有するシリンジ２と、糞便採取口と該糞便採取口の他端の該シリンジ外周部に設けられた取っ手３と、該糞便採取口の他端に設けられた蓋部材４からなる糞便採取容器１と、（ｃ）該シリンジを収納するシリンジ収納部２１と、該シリンジ収納部に接続し糞便の懸濁を行う懸濁部２２と、該懸濁部に接続され分離可能で、懸濁・濾過された糞便の濾液を受ける濾液受け容器２３と、該懸濁部と該濾液受け容器の接続部に設けられたフィルター２６からなる糞便処理容器本体２０と、（ｄ）該糞便採取容器のシリンジ中に採取された糞便を該蓋部材を押し下げ又は突き破って該懸濁部に移動させる押出し部材３０とからなる糞便処理キット。
【解決手段】 （ａ）糞便に突き刺すことにより０．５グラム以上の糞便を採取できる容量を有するシリンジ２と、糞便採取口と該糞便採取口の他端の該シリンジ外周部に設けられた取っ手３と、該糞便採取口の他端に設けられた蓋部材４からなる糞便採取容器１と、（ｃ）該シリンジを収納するシリンジ収納部２１と、該シリンジ収納部に接続し糞便の懸濁を行う懸濁部２２と、該懸濁部に接続され分離可能で、懸濁・濾過された糞便の濾液を受ける濾液受け容器２３と、該懸濁部と該濾液受け容器の接続部に設けられたフィルター２６からなる糞便処理容器本体２０と、（ｄ）該糞便採取容器のシリンジ中に採取された糞便を該蓋部材を押し下げ又は突き破って該懸濁部に移動させる押出し部材３０とからなる糞便処理キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸がん検査に使用する糞便を採取する糞便採取キット、及び採取した糞便を懸濁・濾過する糞便処理キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
欧米では、大腸がんが癌死亡率の上位を占めている。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加している。これは日本人の食生活が欧米型の肉食が中心となったことに原因があると考えられている。国内では毎年約６万人程度が大腸がんに羅患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後のさらなる増加も予想されている。しかしながら、大腸がんは早期がんであれば手術により、１００％近く治せることが知られている。従って、大腸がんは早期がん検診の対象となり、数多くの検査法が考案されてきた。
【０００３】
大腸がんの早期発見を目指した検査法として注腸検査や内視鏡検査などが行なわれている。注腸検査とはバリウムを大腸内に注入し、大腸の粘膜面に付着させ、その表面の凹凸をＸ線により調べる方法である。内視鏡検査は大腸の中を直接内視鏡で調べる方法である。特に内視鏡検査は大腸がんの発見に対して、高い感度と特異性を有している。加えて、早期がんや前がん状態のポリープを切除できる利点も有している。
【０００４】
しかし、これらの検査法はコストが高い上に、被験者への負担が大きく、合併症のリスクを伴っている。さらに内視鏡検査では操作に熟練を要し、検査の出来る施設が限られている。従ってこれらの方法は無症状の一般人を対象にした大腸がん検査には向いていない。
【０００５】
そこで、大腸がん一次スクリーニング法として、簡便で、検査コストも低い便潜血検査が広く利用されている。便潜血検査とは糞便に含まれるヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸がんの存在を予測する方法である。
【０００６】
広く実施されている便潜血検査ではあるが、一方で検査の有用性に対して疑問の声も上がっている。１つの理由は便潜血検査の感度は約２５％と低く、大腸がん患者を見落とす率が高いことに原因ある。さらに加えて、陽性的中率も低く、便潜血検査陽性の被験者の中で実際に大腸がん患者である割合は１０％以下であり、多くの偽陽性を含んでいる。そのため、より信頼性の高い新たな検査法の開発が強く望まれている。
【０００７】
そこで、新しい大腸がん検査法として、便中に剥離したがん細胞を利用した方法に注目が集まっている。大腸がんに伴い、間接的におこる腸内の出血を調べる便潜血検査法に比べて、本方法は直接がん細胞の存在を調べるため、より信頼性の高い検査法になり得ると考えられる。
【０００８】
上記の剥離した細胞を利用する方法では、糞便中からがん細胞に由来する核酸を直接抽出する戦略と、実際にがん細胞自体を回収する戦略の２種類が考えられる。がん細胞由来産物を濃縮できるという点では、後者のがん細胞を回収する戦略が有利である。
【０００９】
大腸内剥離がん細胞の回収方法ではパーコールを利用した回収法や（下記非特許文献１，２，３）、凍結させた便の表面からがん細胞を回収する方法が考案されている（下記特許文献１、非特許文献４，５，６）。また糞便からの細胞回収に関する便処理のトータルシステムも松村らが考案している（特許文献２）。
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ９７／０９６００号公報
【特許文献２】特願２００３−２８１９７８
【非特許文献１】Int.J.Cancer, Vol.52, 347-350, 1992
【非特許文献２】Gastroenterology, Vol.114, 1196-1205, 1998
【非特許文献３】International Journal of Molecular Medicine, Vol.13, 451-454, 2004
【非特許文献４】Clinical Cancer Research, Vol.4, 337-342, 1998
【非特許文献５】The Lancet, Vol.359, 1917-1919, 2002
【非特許文献６】APMIS, Vol.110, 239-246, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在の大腸がん細胞回収法では糞便を懸濁するために、糞便を懸濁用の溶液と共に袋に入れ、ストマッカーと呼ばれる固形物をマイルドに粉砕できる装置を使用して粉砕している（特許文献１，２）。特許文献２では、さらに糞便懸濁液を漏斗型フィルターにより、濾過し、その濾液中から大腸がん細胞を回収している。
【００１２】
しかし、これらの方法では採取糞便のストマッカー処理あるいは懸濁液の濾過処理の工程が開放系であるため、周囲への臭いの漏れや、糞便懸濁液の飛散などの問題が生じる。さらにマニュアル操作のステップが多いため、大量検体の処理には向いていない等の問題点も存在する。
【００１３】
また従来の便潜血検査用の糞便検体の回収、懸濁容器を本方法に利用した場合、細胞の回収に必要な便量を扱うことができない。図１に示すように、便潜血検査は、少量の糞便（０．１ｇ以下）で検出可能であるが、細胞を回収するためには少なくとも０．５ｇ以上の糞便が必要である。
【００１４】
本発明は、糞便中の剥離がん細胞を迅速、簡便、かつ、安全に回収するための糞便回収容器及び糞便処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、糞便の採取、粉砕、懸濁、濾過の一連の過程を一体化した糞便採取キット及び糞便処理キットにより上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。
【００１６】
本発明の糞便採取キットは、（ａ）シリンジと、取っ手と、結合部と、蓋部材からなる糞便採取容器と、（ｂ）結合部を有する収納筒体からなる収納容器とで構成される。又、本発明の糞便処理キットは、（ａ）シリンジと、取っ手と、結合部と、蓋部材からなる糞便採取容器と、（ｃ）シリンジ収納部と、懸濁部と、濾液受け容器と、フィルターからなる糞便処理容器本体と、（ｄ）押出し部材とで構成される。
【００１７】
糞便処理キットは、糞便を破砕し、懸濁する懸濁部と、懸濁した糞便を濾過するフィルターと、フィルターを通した濾液を回収する濾液受け容器が一体化した構造をとる。さらに糞便採取容器を取り付け、採取した糞便を糞便処理キット本体内に直接押し出すことが可能である。
【００１８】
粉砕、懸濁、濾過のステップは糞便処理キットを振とうすることにより、同時に行う。さらにこのステップは糞便処理キットを振とう装置に装着することにより、自動化することも可能である。
【発明の効果】
【００１９】
糞便の採取、粉砕、懸濁、濾過の一連の過程を一体化にした本発明により、糞便の濾過液を得る一連の操作を簡便かつ、短時間に行うことができる。さらに、糞便の懸濁を閉鎖系で行うことが出来るため、サンプルの飛散の危険性が低く、操作者に対する安全性を高めることができる。加えて、糞便からがん細胞を回収するために必要な多量の便（０．５ｇ以上）を処理できる。更に、これらの一連の操作を自動化し、多検体処理を行うことも可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットの具体的構造とその使用方法を示す。
【００２１】
＜糞便採集＞
図２は本発明の糞便採取キットを構成する糞便採取容器部分及び収納容器部分の断面図である。糞便採取容器１は、シリンジ２状の構造をしており、採取容器使用時に容器を保持する取っ手３を有している。シリンジ２の先端部は糞便に付き差す部分であり、シリンジ２の内部は空洞になっている。シリンジ２の取っ手３近くには、糞便採取容器１の蓋部材としてゴム状の蓋用パッキン４で封止されており、該蓋用パッキン４を外部からシリンジ２内に押し込むことにより、シリンジ内に移動できる。蓋部材４は後から突き破ることの出来る薄膜をシリンジ２の取っ手３近くに貼りつけることで代用することもできる。同じく、シリンジ２の取っ手３近くには、糞便採取時に糞便がシリンジ２内に収納されやすいように空気穴５が設けられている。収納容器６は、該糞便採取容器と結合できる他方の結合部７を有し、該糞便採取容器を収納できる収納筒体８からなる。
【００２２】
図３（Ａ）は糞便採取の状態を示した図である。糞便採取容器１のシリンジ２先端部分を糞便９に突き刺すことにより、シリンジ２内に糞便を押し込み、採取することが出来る。さらに採取容器を糞便に複数回突き刺すことにより、複数部位の糞便を採取するとともに、細胞検査に必要な０．５ｇ以上の糞便を採取することが可能である。空気穴５は、シリンジ内に糞便が入ってきた時にシリンジ内の空気を逃がす役目があるが、必ずしも空気穴を設ける必要はない。シリンジに設けられた目盛り線１０は、採取した糞便の量を知るために設けてあり、採取に必要な量に応じて、設定することが出来る。
【００２３】
図３（Ｂ）は糞便を採取した糞便採取容器１を収納容器６に装着する操作を示した図である。収納容器６は、中に糞便採取容器１を収納することが出来る。糞便採取容器１は収納容器６にねじ込み式にはめることでき、糞便を密閉することが出来る。
【００２４】
図３（Ｃ）は、収納容器６に糞便採取容器１をはめ込んだ図である。この状態で、次の操作に備えて保存、運搬することが可能である。運搬は通常の封筒等に入れて、郵便や宅配便で行うことが可能である。運搬用に、保冷剤を組み込んだ糞便採取容器専用箱を使用することも可能である。専用箱は糞便収納容器の形に合わせて作製できるため、少ないスペースで多検体を運搬することができる。
【００２５】
＜糞便懸濁・濾過＞
図４は、糞便処理容器本体２０の断面図を示したものであり、糞便処理容器本体２０は、シリンジ収納部２１、懸濁部２２、濾液受け容器２３で構成されている。シリンジ収納部２１の上部には糞便採取容器１との結合部２４を有し、ねじ込み式に糞便採取容器１と糞便処理容器本体２０を結合することができる。この場合、糞便採取容器１を接続せずに、直接糞便のみを糞便処理容器本体２０内に落とし込む方式に容器を変更することも可能である。シリンジ収納部２１は糞便採取容器１のシリンジ２が収まる部分である。懸濁部２２は糞便の懸濁を行う本体の中心部分である。懸濁部２２と濾液受け容器２３との接続部２５は、フィルター２６をはめ込みと部位と、濾液受け用容器２３の接続をおこなう結合部からなる、ねじ状構造をした部分である。フィルター２６は、懸濁液を濾過するために使用する、直径が３０ｍｍ程度のポリアミドメッシュフィルターで、外周がゴム性のリング構造になっており、懸濁部２２の接続部２５に嵌め込んで使用する。フィルター部位の素材は上記のものに限定する必要はなく、フィルターの条件を満たし、本操作に適応できるものであれば、他の素材でも問題ない。フィルターの口径は５００μｍから１０００μｍ程度が好ましいが、糞便量、糞便中の混合物などの条件によって、１００μｍから２０００μｍ程度まで変化させることができる。濾液受け容器２３は、懸濁部２２の接続部２５にねじ込み式に接続する。コニカルチューブと呼ばれる名前でファルコン社から市販されている５０ｍｌ遠沈管又は新たに作製したものを接続させて使用する。
【００２６】
図５（Ａ）は、糞便を採取した糞便採取容器１を収納容器６から取り出した図である。
【００２７】
図５（Ｂ）は、糞便採取容器１を図４で示した糞便処理容器本体２０に嵌め合わせた断面図である。ゴム製のパッキン２７は糞便採取容器１の蓋の代わりをしている。懸濁部２２中には糞便粉砕用ボール２８がある。糞便粉砕用ボール２８の材質は、ジルコニアなどのセラミックス製やステンレスなどの金属性のものが使用できる。大きさは直径１０ｍｍ程度のものが好ましいが、直径５ｍｍから２５ｍｍ程度まで使用できる。個数は標準では３個使用するが、１個から十数個まで使用できる。濾液受け容器２３中には懸濁用溶液２９を予め入れておく。懸濁用溶液２９の量は２０ｍｌから４０ｍｌ程度が好ましい。溶液の種類はＨａｎｋｓ液、ＤＭＥＭ培養液など、細胞の洗浄や培養に使用する溶液ならば使用可能である。溶液には血清やＢＳＡなど細胞を安定させるを物質を加えることも可能である。
【００２８】
図５（Ｃ）は採取した糞便を押出し部材である押出し棒３０を用いて、懸濁部２２内に押出した様子を示した断面図である。押出し棒３０は、シリンジ２内に押し込むことにより、糞便採取容器１中の糞便を糞便処理容器２０の懸濁部２２内に押し出す。押出し棒３０の軸の外周に付属したパッキン３１は、押出し棒３０とシリンジ２の間を密閉し、押出し棒３０を固定する役目と懸濁液の漏れを防ぐ役目がある。パッキン３１の数を増やして、より密閉した構造とることも可能である。なお押出し棒３０はシリンジ収納部２１に嵌め込み、固定する構造に変えることも可能である。糞便採取容器１の蓋の代わりをしていたパッキン４は、押出し棒３０の挿入と共に、シリンジ２の先端部分に移動して、糞便を押し出す役割を果たす。懸濁部２２内に押出された糞便３２は続いて、粉砕、懸濁、濾過処理を受ける。
【００２９】
図５（Ｄ）は糞便処理容器２０を上下逆さまにして振とうすることにより、糞便を懸濁している状態を示している。懸濁部２２の中心部では糞便と粉砕用ボール３３が懸濁用溶液２９と混合し、糞便が破砕される。振とうを繰り返すことにより、糞便がより懸濁された状態になる。図では糞便処理容器２０を逆にして濾液受け容器２３が上になる向きで、振とうしているが、必ずしも逆さにする必要はない。糞便の懸濁状態に対応して、糞便処理容器２０の向きは随時変えることができる。糞便処理容器２０はおよそ１００往復振とうして、糞便を懸濁する。糞便の状態により、およそ５０回から１０００回まで、振とう回数を変えることも可能である。振とうは人の手もしくは振とう装置を用いて行う。振とう装置には市販のシェイカーあるいはアーム式に振とうする振とう装置などを使用することが出来る。なお、糞便処理容器２０の中心部に、メッシュ状の構造物を備えると、摩擦により、糞便の懸濁を促進すると同時に、液中に含まれる固形の破砕物の一部を捕らえて、フィルターの詰まりを少なくすることができる。
【００３０】
図５（Ｅ）は懸濁液が濾過されて、濾液受け用容器２３に移動した状態を示している。振とう後の糞便処理容器２０は濾液受け用容器２３を下にして、フィルター２６を通過した濾液を集める。この状態では懸濁液の大部分は下に移動せず、懸濁部２２内に残っているため、片方の手で懸濁部２２を保持し、もう片方の手で濾液受け容器２３を小刻みに軽く叩き、懸濁液を濾液受け用容器２３に集める。あるいは、濾液受け用容器２３が上にくるように、糞便処理容器２０本体を片手で掴み、体温計を振る動作と同様に上から下に振り下ろすことにより、濾液受け容器２３内に懸濁液を集めることが出来る。
【００３１】
濾液受け用容器２３を糞便処理容器２０本体から取り外し、中の濾液を別の容器に移し変える。この濾液中から細胞を回収し、大腸がんの検査に使用する。
【００３２】
＜磁気ビーズによる細胞回収＞
濾液中に含まれるがん細胞を、がん細胞にアフィニティーをもった担体を用いて回収する。担体にはがん細胞に対するアフィニティーを持った抗体が表面に結合した磁気ビーズを使用する。具体的にはダイナル社から市販されているＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）を使用する。Ｂｅｒ−ＥＰ４以外にも大腸がん細胞に対するアフィニィティーを持った抗体ならば適応可能である。抗体以外にも大腸がん細胞にアフィニィティーのあるアプタマー、リガンドなどが使用できる。
【００３３】
分注したろ液が約２０〜４０ ｍｌ 入ったチューブ一本当たり、４０μｌの磁気ビーズを加える。磁気ビーズの量は２０〜４００μｌ程度の範囲で変えることが可能である。
【００３４】
磁気ビーズを加えたろ液はミックスローターを用いて混和し、ろ液中の細胞を磁気ビーズに結合させる。混和は室温もしくは４℃のコールドルーム内で行なうことが望ましい。混和時間は３０分間以上が望ましい。この磁気ビーズ反応のステップは、室温で行った。
【００３５】
混和したろ液入りチューブは磁気スタンドに設置した後、１５分間振とうし、磁気ビーズをチューブ側面に集める。振とう時間は１０分間以上が望ましい。振とう方法はシーソー運動、回転、旋回など、ろ液が緩やかに混和する条件であれば問題ない。
【００３６】
磁気ビーズが壁面に付着した後、ろ液は取り除く。ろ液除去後、磁気スタンドからチューブを外し、上記バッファ液で洗浄し、ビーズ洗浄液を回収する。バッファ液の量はチューブ当たり５００μｌ使用するが、次の実験を想定して、任意に量を変動させることが出来る。この磁気分離のステップは、室温で行った。
【００３７】
洗浄液は先に使用したチューブよりも小型のエッペンチューブ等に回収する。洗浄液の入ったチューブは直ちに専用磁気スタンドに設置し、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた後、上清を除去し、細胞-ビーズ複合体のペレットを得る。この磁気分離、エッペンチューブのステップは、室温で行った。
【００３８】
＜大腸がん診断＞
上記標準化プロトコールで回収したペレットは、続いて大腸がん判定用の検体として使用する。がんの判定には細胞そのものを利用する場合と細胞から抽出した物質を利用する場合がある。細胞そのものを利用する場合は回収後、直ちに使用することが可能である。又、細胞固定液等で保存することも可能である。抽出物質を利用する場合は−８０℃にペレットを凍結保存することが可能である。
【００３９】
細胞そのものを利用する場合はパパニコロウ染色により、細胞を染色し、顕微鏡で観察し判定する。細胞質に対する核の比率（Ｎ／Ｃ比）が高く、クロマチンが凝集した異型性の細胞が確認できた場合、がん細胞であると判定を下す。染色法はその他にもがん細胞を同定できるものであれば適応可能である。一般染色以外にもがん細胞特異的抗体を利用した免疫染色が適応可能である。
【００４０】
細胞からはＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して、がん判定に利用することが可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡの抽出には各社から発売されている核酸抽出キットが使用出来る。具体的にはＤＮＡの抽出にはダイナル社のＤｙｎａｂｅａｄｓＤＮＡ ＤＩＲＥＩＣ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，キアゲン社のＱＩＡａｍｐＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、三光純薬社のセパジーンなどが挙げられる。ＲＮＡの抽出にはニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮ,インビトロジェン社のＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔなどが挙げられる。
【００４１】
本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットを用いる大腸がん細胞の回収プロトコールに対して、従来の、ストマッカー法による大腸がん細胞の回収では、検体回収及び濾過の手順が相違する。即ち、本発明では、糞便回収を特定の糞便回収容器により行い、懸濁と濾過をストマッカーを用いず、該糞便回収容器と結合可能な糞便処理容器によって行う。懸濁と濾過を同一工程、連結された容器で行うことが可能となったことで、糞便を扱う煩雑さからの解放、作業時間の短縮、消耗品の低減等がもたらされた。又、糞便の粉砕にステンレス製やセラミックス製ボールを用いることで、作業の高効率化を可能にした。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
＜実施例１：糞便回収用容器の作製＞
本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットの各樹脂部品を射出成型で作製した。部品は糞便採取容器（ポレエチレン製）、収納容器（ポレエチレン製）、糞便処理キット本体（ポレエチレン製）、フィルター（外周：エラストマー製、フィルター部：ナイロン製）、蓋用パッキン（エラストマー製）、押出し棒（ポリエチレン製）からなる。各部品の説明は上記を参照のこと。
【００４４】
＜実施例２：模擬便による評価＞
模擬便を使って糞便採取容器及び糞便処理容器の使用方法に関して検討した。模擬便は基材として釣餌（浮子鯉、マルキュー株式会社）２．５ｇ、増粘剤として小麦粉（カメリヤ強力小麦粉、日清製粉）１ｇを混合した後、水２．５ｍｌを加えて練りこみ作製した。
【００４５】
模擬便を使用して糞便採取容器１本当たりに適切な便量を決定した。始めに糞便採取容器を使用して、半刺し（０．８２ｇ）、一刺し（１．３６ｇ）、二刺し（２．８７ｇ）の３種類の模擬便を採取した。それぞれの糞便採取容器を糞便処理容器本体にセットし、押出し棒を使って、模擬便を懸濁部内に押出した。押出し棒を指で押さえながら、糞便処理キットを上下に１００往復して模擬便の粉砕、懸濁を行った後、静置し、ろ液受け用容器への懸濁液の移動を調べた。
【００４６】
その結果、糞便採取容器半刺しと１刺し分の模擬便では問題なく懸濁液はフィルターを通過したが、２刺し分ではフィルターが詰まり、濾液量が減少した。さらに、濾液中に混入した沈殿物も多く、この容器に対して過剰の便量であると考えられた。従って、糞便採取容器使用の際には糞便採取容器1刺し以下（およそ１．５ｇ）の便量が好ましいと考えられた。
【００４７】
＜実施例３：大腸がん患者からの細胞の回収＞
手術前の３人の大腸がん患者由来糞便（Ａ，Ｂ，Ｃ）を検体として使用した。糞便の使用に関しては事前に各被験者へ実験内容の説明を行い、同意を得た。
【００４８】
糞便採取容器を使用して上記患者検体から1人当たり一刺分の糞便を得た。便を採取した容器はそれぞれ糞便処理容器本体に接続した。なお、容器の濾液受け部分には予めＨａｎｋｓ液＋１０％ＦＢＳ ３０ｍｌを入れておいた。
【００４９】
次に押出し棒を使って、糞便を糞便処理容器本体内に押出した。押出し棒が飛び出さないように、指で押さえながら、容器を上下に１００往復して振とうした。その結果、糞便は粉砕され懸濁液となった。懸濁液の一部は本体と濾液受け用容器の境目に位置するフィルターを通して濾過され、下部の濾液受け用容器内に移動した。また振とう後、懸濁部内に残った糞便懸濁液は軽く容器を指ではじいて振動させることにより、濾液受け用容器内に移動させた。
【００５０】
次に濾液受け用容器を糞便処理容器本体から外し、濾液を新しい５０ｍｌ遠沈管（ＩＷＡＫＩ）に移した。濾液には４０μlのＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）を加え、ミックスローター(VMR-5、 AS ONE社)で３０分間攪拌した。攪拌後、遠沈管は磁石スタンド（Dynal MPC-1、ダイナル社）にセッティングし、マイルドミキサー（SI-36、TAITEC社）で１５分間振とうし、磁気ビーズを磁石スタンドの壁面に集めた。ろ液を除去した後、遠沈管をスタンドから外し、洗浄液として、一本当たり５００μlのＰＢＳ液を加えて、壁面に集められたビーズを洗浄した。ビーズを含んだ洗浄液をエッペンチューブ（１．５ｍｌ用）に回収し、再び、磁石スタンド（Dynal MPC-S、ダイナル社）にセットし、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた。最後に洗浄液を除去して、細胞−ビーズ複合体のペレットを得た。図６に、糞便濾液から洗浄・回収までを模式的に示す。
【００５１】
Ａの患者由来の細胞−ビーズ複合体ペレットの一部を用いて、細胞染色を行った。ペレットにＹＭ固定液１００μｌを加えて懸濁した後、５０ｍｌの遠沈管に移し、ＹＭ固定液で全量２５ｍｌにして細胞含有固定液を作成した。細胞含有固定液をスライドグラス8枚分のオートスメア装置に分注し、更にＹＭ固定液を加えて装置を固定液で満たした後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心して、スライドグラスに細胞を塗抹した。スライドに冷風を当てて乾燥させた後、９５％エタノールで固定した。細胞形態観察用の代表的な染色法であるパパニコロウ染色法により、細胞を染色し、顕微鏡で観察した。
【００５２】
その結果ペレット中には上皮系由来と判断できる細胞が存在していることが確認でき、本方法で糞便中から細胞が回収できることが判明した。
【００５３】
＜比較例：従来法による糞便からの細胞の回収＞
実施例３に示した３人の大腸がん患者と同一の糞便サンプルを使用して、ストマッカーを使用した従来法（上記特許特許文献２）により、細胞-磁気ビーズペレットを回収した。Ａの患者由来のサンプルの一部を実施例３と同様に染色し、細胞を観察した。その結果上皮系由来と判断できる細胞が存在していることが確認できた。さらに形態的に詳しく観察すると、核の大小不同、クロマチンの濃縮、核膜肥厚が観察され、ＣｌａｓｓＶの大腸がん細胞であることが判明した。従って、Ａの患者由来の糞便中にはがん細胞が存在していることが明らかになった。
【００５４】
しかし、一方で、本法で回収した細胞と比べるとリンパ球系の細胞が多く混入していることも観察された。
【００５５】
＜実施例４：回収細胞由来ＤＮＡのシークエンス解析＞
回収した磁気ビーズのペレットからセパジーンキット（三光純薬）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型にして、がん抑制遺伝子であるＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）遺伝子ののエキソン１５に含まれる領域をＰＣＲで増幅した。増幅に使用したプライマーの配列はＦ：５‘-ＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣ−３’とＲ： ５‘−ＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣ−３’であり、増幅する領域の塩基数は１５５３ｂｐであった。この増幅断片中に存在する、ＭＣＲ（mutation cluster region, codon1250-1550）と呼ばれるＡＰＣ遺伝子変異のホットスポットである領域をシークエンス解析した。シークエンス解析にはＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１／１．１ ｃｙｃｌｅ ｋｉｔ(ABI)を付属プロトコールに従い使用した。
【００５６】
その結果、サンプルＡではＡＰＣ遺伝子（M74088）の３９４０番目のＡがＴに変化しているナンセンス変異（Ｌｙｓ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３０８）が見つかった。サンプルＢでは３９８２番目のＧがＴに変化したナンセンス変異（Ｇｌｕ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３２２）と４１７９番目のＴがＡに変化したナンセンス変異（Ｃｙｓ→Ｓｔｏｐ）の２種類が見つかった。さらにサンプルＣでは４２３４番目のＣがＴに変化したナンセンス変異（Ｇｌｎ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１４０６）が見つかった。
【００５７】
一方で、従来法で回収した細胞に関しても同様にＤＮＡを抽出し、シークエンス解析を行った。その結果、サンプルＡではＡＰＣ遺伝子（M74088）の３９４０番目のＡがＴに変化しているナンセンス変異（Ｌｙｓ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３０８）が見つかった。サンプルＢでは３９８２番目のＧがＴに変化したナンセンス変異（Ｇｌｕ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３２２）のみが見つかった。サンプルＣでは変異を判別することができなかった。
【００５８】
以上のことから本発明で回収した細胞では、リンパ球系の細胞の混入が少なく、がん細胞リッチに回収できた可能性があり、シークエンス解析によるがん細胞の判定に有用であることが判明した。
【００５９】
＜実施例５：改良型容器の作製＞
糞便処理キットを改良し、操作性を改善した。
【００６０】
図７は改良した糞便採取容器及び糞便処理容器本体の断面図である。図７（Ａ）は糞便採取容器であり、蓋用パッキンの代わりに取り付けた薄膜３１を有する。図７（Ｂ）は、糞便処理容器本体に糞便採取容器と、押出し棒を装着した断面図である。押出し棒の先端３２は薄膜３１を突き刺せるように先端を尖らせた。押出し棒は薄膜３１を破った後、糞便採取容器のシリンジ内の糞便を直接糞便処理容器本体内に押し出す仕組みになっている。
【００６１】
押出し棒と本体が固定できるように連結部分３３を設けた。これにより、糞便処理容器本体振とう時に押出し棒のずれを防ぐことができた。
【００６２】
又、糞便処理容器本体の入り口部分３４を、従来容器より広い構造に変えた。これにより、採取容器の本体への装着が容易になり、採取容器装着時の手振れにより、糞便が本体容器の入り口部分に付着する現象を防ぐことができた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットにより、大腸内剥離がん細胞の回収方法が容易になった。これにより、大腸がんの早期発見に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】糞便処理容器の糞便処理能力と糞便中の細胞数の関係を表した概念図である。
【図２】本発明の糞便採取容器を示す断面図である。
【図３】本発明の糞便採取容器による糞便の懸濁・ろ過の手順を示す図である。
【図４】本発明の糞便処理容器本体を示す断面図である。
【図５】本発明の糞便採取容器を糞便処理容器本体に嵌め合わせて糞便を処理する工程を示す断面図である。
【図６】糞便濾液からのがん細胞の磁気分離、洗浄・回収までを模式的に示す図である。
【図７】改良した糞便採取容器及び糞便処理容器本体の断面図である。
【符号の説明】
【００６５】
１：糞便採取容器、２：シリンジ、３：取っ手、４：蓋用パッキン、５：空気穴、６：収納容器、７：結合部、８：収納筒体、９：糞便、１０：目盛り線、２０：糞便処理容器本体、２１：シリンジ収納部、２２：懸濁部、２３：濾液受け容器、２４：結合部、２５：接続部、２６：フィルター、２７：パッキン、２８：粉砕用ボール、２９：懸濁用溶液、３０：押出し棒、３１：パッキン、３２：糞便。
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸がん検査に使用する糞便を採取する糞便採取キット、及び採取した糞便を懸濁・濾過する糞便処理キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
欧米では、大腸がんが癌死亡率の上位を占めている。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加している。これは日本人の食生活が欧米型の肉食が中心となったことに原因があると考えられている。国内では毎年約６万人程度が大腸がんに羅患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後のさらなる増加も予想されている。しかしながら、大腸がんは早期がんであれば手術により、１００％近く治せることが知られている。従って、大腸がんは早期がん検診の対象となり、数多くの検査法が考案されてきた。
【０００３】
大腸がんの早期発見を目指した検査法として注腸検査や内視鏡検査などが行なわれている。注腸検査とはバリウムを大腸内に注入し、大腸の粘膜面に付着させ、その表面の凹凸をＸ線により調べる方法である。内視鏡検査は大腸の中を直接内視鏡で調べる方法である。特に内視鏡検査は大腸がんの発見に対して、高い感度と特異性を有している。加えて、早期がんや前がん状態のポリープを切除できる利点も有している。
【０００４】
しかし、これらの検査法はコストが高い上に、被験者への負担が大きく、合併症のリスクを伴っている。さらに内視鏡検査では操作に熟練を要し、検査の出来る施設が限られている。従ってこれらの方法は無症状の一般人を対象にした大腸がん検査には向いていない。
【０００５】
そこで、大腸がん一次スクリーニング法として、簡便で、検査コストも低い便潜血検査が広く利用されている。便潜血検査とは糞便に含まれるヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸がんの存在を予測する方法である。
【０００６】
広く実施されている便潜血検査ではあるが、一方で検査の有用性に対して疑問の声も上がっている。１つの理由は便潜血検査の感度は約２５％と低く、大腸がん患者を見落とす率が高いことに原因ある。さらに加えて、陽性的中率も低く、便潜血検査陽性の被験者の中で実際に大腸がん患者である割合は１０％以下であり、多くの偽陽性を含んでいる。そのため、より信頼性の高い新たな検査法の開発が強く望まれている。
【０００７】
そこで、新しい大腸がん検査法として、便中に剥離したがん細胞を利用した方法に注目が集まっている。大腸がんに伴い、間接的におこる腸内の出血を調べる便潜血検査法に比べて、本方法は直接がん細胞の存在を調べるため、より信頼性の高い検査法になり得ると考えられる。
【０００８】
上記の剥離した細胞を利用する方法では、糞便中からがん細胞に由来する核酸を直接抽出する戦略と、実際にがん細胞自体を回収する戦略の２種類が考えられる。がん細胞由来産物を濃縮できるという点では、後者のがん細胞を回収する戦略が有利である。
【０００９】
大腸内剥離がん細胞の回収方法ではパーコールを利用した回収法や（下記非特許文献１，２，３）、凍結させた便の表面からがん細胞を回収する方法が考案されている（下記特許文献１、非特許文献４，５，６）。また糞便からの細胞回収に関する便処理のトータルシステムも松村らが考案している（特許文献２）。
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ９７／０９６００号公報
【特許文献２】特願２００３−２８１９７８
【非特許文献１】Int.J.Cancer, Vol.52, 347-350, 1992
【非特許文献２】Gastroenterology, Vol.114, 1196-1205, 1998
【非特許文献３】International Journal of Molecular Medicine, Vol.13, 451-454, 2004
【非特許文献４】Clinical Cancer Research, Vol.4, 337-342, 1998
【非特許文献５】The Lancet, Vol.359, 1917-1919, 2002
【非特許文献６】APMIS, Vol.110, 239-246, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在の大腸がん細胞回収法では糞便を懸濁するために、糞便を懸濁用の溶液と共に袋に入れ、ストマッカーと呼ばれる固形物をマイルドに粉砕できる装置を使用して粉砕している（特許文献１，２）。特許文献２では、さらに糞便懸濁液を漏斗型フィルターにより、濾過し、その濾液中から大腸がん細胞を回収している。
【００１２】
しかし、これらの方法では採取糞便のストマッカー処理あるいは懸濁液の濾過処理の工程が開放系であるため、周囲への臭いの漏れや、糞便懸濁液の飛散などの問題が生じる。さらにマニュアル操作のステップが多いため、大量検体の処理には向いていない等の問題点も存在する。
【００１３】
また従来の便潜血検査用の糞便検体の回収、懸濁容器を本方法に利用した場合、細胞の回収に必要な便量を扱うことができない。図１に示すように、便潜血検査は、少量の糞便（０．１ｇ以下）で検出可能であるが、細胞を回収するためには少なくとも０．５ｇ以上の糞便が必要である。
【００１４】
本発明は、糞便中の剥離がん細胞を迅速、簡便、かつ、安全に回収するための糞便回収容器及び糞便処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、糞便の採取、粉砕、懸濁、濾過の一連の過程を一体化した糞便採取キット及び糞便処理キットにより上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。
【００１６】
本発明の糞便採取キットは、（ａ）シリンジと、取っ手と、結合部と、蓋部材からなる糞便採取容器と、（ｂ）結合部を有する収納筒体からなる収納容器とで構成される。又、本発明の糞便処理キットは、（ａ）シリンジと、取っ手と、結合部と、蓋部材からなる糞便採取容器と、（ｃ）シリンジ収納部と、懸濁部と、濾液受け容器と、フィルターからなる糞便処理容器本体と、（ｄ）押出し部材とで構成される。
【００１７】
糞便処理キットは、糞便を破砕し、懸濁する懸濁部と、懸濁した糞便を濾過するフィルターと、フィルターを通した濾液を回収する濾液受け容器が一体化した構造をとる。さらに糞便採取容器を取り付け、採取した糞便を糞便処理キット本体内に直接押し出すことが可能である。
【００１８】
粉砕、懸濁、濾過のステップは糞便処理キットを振とうすることにより、同時に行う。さらにこのステップは糞便処理キットを振とう装置に装着することにより、自動化することも可能である。
【発明の効果】
【００１９】
糞便の採取、粉砕、懸濁、濾過の一連の過程を一体化にした本発明により、糞便の濾過液を得る一連の操作を簡便かつ、短時間に行うことができる。さらに、糞便の懸濁を閉鎖系で行うことが出来るため、サンプルの飛散の危険性が低く、操作者に対する安全性を高めることができる。加えて、糞便からがん細胞を回収するために必要な多量の便（０．５ｇ以上）を処理できる。更に、これらの一連の操作を自動化し、多検体処理を行うことも可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットの具体的構造とその使用方法を示す。
【００２１】
＜糞便採集＞
図２は本発明の糞便採取キットを構成する糞便採取容器部分及び収納容器部分の断面図である。糞便採取容器１は、シリンジ２状の構造をしており、採取容器使用時に容器を保持する取っ手３を有している。シリンジ２の先端部は糞便に付き差す部分であり、シリンジ２の内部は空洞になっている。シリンジ２の取っ手３近くには、糞便採取容器１の蓋部材としてゴム状の蓋用パッキン４で封止されており、該蓋用パッキン４を外部からシリンジ２内に押し込むことにより、シリンジ内に移動できる。蓋部材４は後から突き破ることの出来る薄膜をシリンジ２の取っ手３近くに貼りつけることで代用することもできる。同じく、シリンジ２の取っ手３近くには、糞便採取時に糞便がシリンジ２内に収納されやすいように空気穴５が設けられている。収納容器６は、該糞便採取容器と結合できる他方の結合部７を有し、該糞便採取容器を収納できる収納筒体８からなる。
【００２２】
図３（Ａ）は糞便採取の状態を示した図である。糞便採取容器１のシリンジ２先端部分を糞便９に突き刺すことにより、シリンジ２内に糞便を押し込み、採取することが出来る。さらに採取容器を糞便に複数回突き刺すことにより、複数部位の糞便を採取するとともに、細胞検査に必要な０．５ｇ以上の糞便を採取することが可能である。空気穴５は、シリンジ内に糞便が入ってきた時にシリンジ内の空気を逃がす役目があるが、必ずしも空気穴を設ける必要はない。シリンジに設けられた目盛り線１０は、採取した糞便の量を知るために設けてあり、採取に必要な量に応じて、設定することが出来る。
【００２３】
図３（Ｂ）は糞便を採取した糞便採取容器１を収納容器６に装着する操作を示した図である。収納容器６は、中に糞便採取容器１を収納することが出来る。糞便採取容器１は収納容器６にねじ込み式にはめることでき、糞便を密閉することが出来る。
【００２４】
図３（Ｃ）は、収納容器６に糞便採取容器１をはめ込んだ図である。この状態で、次の操作に備えて保存、運搬することが可能である。運搬は通常の封筒等に入れて、郵便や宅配便で行うことが可能である。運搬用に、保冷剤を組み込んだ糞便採取容器専用箱を使用することも可能である。専用箱は糞便収納容器の形に合わせて作製できるため、少ないスペースで多検体を運搬することができる。
【００２５】
＜糞便懸濁・濾過＞
図４は、糞便処理容器本体２０の断面図を示したものであり、糞便処理容器本体２０は、シリンジ収納部２１、懸濁部２２、濾液受け容器２３で構成されている。シリンジ収納部２１の上部には糞便採取容器１との結合部２４を有し、ねじ込み式に糞便採取容器１と糞便処理容器本体２０を結合することができる。この場合、糞便採取容器１を接続せずに、直接糞便のみを糞便処理容器本体２０内に落とし込む方式に容器を変更することも可能である。シリンジ収納部２１は糞便採取容器１のシリンジ２が収まる部分である。懸濁部２２は糞便の懸濁を行う本体の中心部分である。懸濁部２２と濾液受け容器２３との接続部２５は、フィルター２６をはめ込みと部位と、濾液受け用容器２３の接続をおこなう結合部からなる、ねじ状構造をした部分である。フィルター２６は、懸濁液を濾過するために使用する、直径が３０ｍｍ程度のポリアミドメッシュフィルターで、外周がゴム性のリング構造になっており、懸濁部２２の接続部２５に嵌め込んで使用する。フィルター部位の素材は上記のものに限定する必要はなく、フィルターの条件を満たし、本操作に適応できるものであれば、他の素材でも問題ない。フィルターの口径は５００μｍから１０００μｍ程度が好ましいが、糞便量、糞便中の混合物などの条件によって、１００μｍから２０００μｍ程度まで変化させることができる。濾液受け容器２３は、懸濁部２２の接続部２５にねじ込み式に接続する。コニカルチューブと呼ばれる名前でファルコン社から市販されている５０ｍｌ遠沈管又は新たに作製したものを接続させて使用する。
【００２６】
図５（Ａ）は、糞便を採取した糞便採取容器１を収納容器６から取り出した図である。
【００２７】
図５（Ｂ）は、糞便採取容器１を図４で示した糞便処理容器本体２０に嵌め合わせた断面図である。ゴム製のパッキン２７は糞便採取容器１の蓋の代わりをしている。懸濁部２２中には糞便粉砕用ボール２８がある。糞便粉砕用ボール２８の材質は、ジルコニアなどのセラミックス製やステンレスなどの金属性のものが使用できる。大きさは直径１０ｍｍ程度のものが好ましいが、直径５ｍｍから２５ｍｍ程度まで使用できる。個数は標準では３個使用するが、１個から十数個まで使用できる。濾液受け容器２３中には懸濁用溶液２９を予め入れておく。懸濁用溶液２９の量は２０ｍｌから４０ｍｌ程度が好ましい。溶液の種類はＨａｎｋｓ液、ＤＭＥＭ培養液など、細胞の洗浄や培養に使用する溶液ならば使用可能である。溶液には血清やＢＳＡなど細胞を安定させるを物質を加えることも可能である。
【００２８】
図５（Ｃ）は採取した糞便を押出し部材である押出し棒３０を用いて、懸濁部２２内に押出した様子を示した断面図である。押出し棒３０は、シリンジ２内に押し込むことにより、糞便採取容器１中の糞便を糞便処理容器２０の懸濁部２２内に押し出す。押出し棒３０の軸の外周に付属したパッキン３１は、押出し棒３０とシリンジ２の間を密閉し、押出し棒３０を固定する役目と懸濁液の漏れを防ぐ役目がある。パッキン３１の数を増やして、より密閉した構造とることも可能である。なお押出し棒３０はシリンジ収納部２１に嵌め込み、固定する構造に変えることも可能である。糞便採取容器１の蓋の代わりをしていたパッキン４は、押出し棒３０の挿入と共に、シリンジ２の先端部分に移動して、糞便を押し出す役割を果たす。懸濁部２２内に押出された糞便３２は続いて、粉砕、懸濁、濾過処理を受ける。
【００２９】
図５（Ｄ）は糞便処理容器２０を上下逆さまにして振とうすることにより、糞便を懸濁している状態を示している。懸濁部２２の中心部では糞便と粉砕用ボール３３が懸濁用溶液２９と混合し、糞便が破砕される。振とうを繰り返すことにより、糞便がより懸濁された状態になる。図では糞便処理容器２０を逆にして濾液受け容器２３が上になる向きで、振とうしているが、必ずしも逆さにする必要はない。糞便の懸濁状態に対応して、糞便処理容器２０の向きは随時変えることができる。糞便処理容器２０はおよそ１００往復振とうして、糞便を懸濁する。糞便の状態により、およそ５０回から１０００回まで、振とう回数を変えることも可能である。振とうは人の手もしくは振とう装置を用いて行う。振とう装置には市販のシェイカーあるいはアーム式に振とうする振とう装置などを使用することが出来る。なお、糞便処理容器２０の中心部に、メッシュ状の構造物を備えると、摩擦により、糞便の懸濁を促進すると同時に、液中に含まれる固形の破砕物の一部を捕らえて、フィルターの詰まりを少なくすることができる。
【００３０】
図５（Ｅ）は懸濁液が濾過されて、濾液受け用容器２３に移動した状態を示している。振とう後の糞便処理容器２０は濾液受け用容器２３を下にして、フィルター２６を通過した濾液を集める。この状態では懸濁液の大部分は下に移動せず、懸濁部２２内に残っているため、片方の手で懸濁部２２を保持し、もう片方の手で濾液受け容器２３を小刻みに軽く叩き、懸濁液を濾液受け用容器２３に集める。あるいは、濾液受け用容器２３が上にくるように、糞便処理容器２０本体を片手で掴み、体温計を振る動作と同様に上から下に振り下ろすことにより、濾液受け容器２３内に懸濁液を集めることが出来る。
【００３１】
濾液受け用容器２３を糞便処理容器２０本体から取り外し、中の濾液を別の容器に移し変える。この濾液中から細胞を回収し、大腸がんの検査に使用する。
【００３２】
＜磁気ビーズによる細胞回収＞
濾液中に含まれるがん細胞を、がん細胞にアフィニティーをもった担体を用いて回収する。担体にはがん細胞に対するアフィニティーを持った抗体が表面に結合した磁気ビーズを使用する。具体的にはダイナル社から市販されているＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）を使用する。Ｂｅｒ−ＥＰ４以外にも大腸がん細胞に対するアフィニィティーを持った抗体ならば適応可能である。抗体以外にも大腸がん細胞にアフィニィティーのあるアプタマー、リガンドなどが使用できる。
【００３３】
分注したろ液が約２０〜４０ ｍｌ 入ったチューブ一本当たり、４０μｌの磁気ビーズを加える。磁気ビーズの量は２０〜４００μｌ程度の範囲で変えることが可能である。
【００３４】
磁気ビーズを加えたろ液はミックスローターを用いて混和し、ろ液中の細胞を磁気ビーズに結合させる。混和は室温もしくは４℃のコールドルーム内で行なうことが望ましい。混和時間は３０分間以上が望ましい。この磁気ビーズ反応のステップは、室温で行った。
【００３５】
混和したろ液入りチューブは磁気スタンドに設置した後、１５分間振とうし、磁気ビーズをチューブ側面に集める。振とう時間は１０分間以上が望ましい。振とう方法はシーソー運動、回転、旋回など、ろ液が緩やかに混和する条件であれば問題ない。
【００３６】
磁気ビーズが壁面に付着した後、ろ液は取り除く。ろ液除去後、磁気スタンドからチューブを外し、上記バッファ液で洗浄し、ビーズ洗浄液を回収する。バッファ液の量はチューブ当たり５００μｌ使用するが、次の実験を想定して、任意に量を変動させることが出来る。この磁気分離のステップは、室温で行った。
【００３７】
洗浄液は先に使用したチューブよりも小型のエッペンチューブ等に回収する。洗浄液の入ったチューブは直ちに専用磁気スタンドに設置し、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた後、上清を除去し、細胞-ビーズ複合体のペレットを得る。この磁気分離、エッペンチューブのステップは、室温で行った。
【００３８】
＜大腸がん診断＞
上記標準化プロトコールで回収したペレットは、続いて大腸がん判定用の検体として使用する。がんの判定には細胞そのものを利用する場合と細胞から抽出した物質を利用する場合がある。細胞そのものを利用する場合は回収後、直ちに使用することが可能である。又、細胞固定液等で保存することも可能である。抽出物質を利用する場合は−８０℃にペレットを凍結保存することが可能である。
【００３９】
細胞そのものを利用する場合はパパニコロウ染色により、細胞を染色し、顕微鏡で観察し判定する。細胞質に対する核の比率（Ｎ／Ｃ比）が高く、クロマチンが凝集した異型性の細胞が確認できた場合、がん細胞であると判定を下す。染色法はその他にもがん細胞を同定できるものであれば適応可能である。一般染色以外にもがん細胞特異的抗体を利用した免疫染色が適応可能である。
【００４０】
細胞からはＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して、がん判定に利用することが可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡの抽出には各社から発売されている核酸抽出キットが使用出来る。具体的にはＤＮＡの抽出にはダイナル社のＤｙｎａｂｅａｄｓＤＮＡ ＤＩＲＥＩＣ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，キアゲン社のＱＩＡａｍｐＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、三光純薬社のセパジーンなどが挙げられる。ＲＮＡの抽出にはニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮ,インビトロジェン社のＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔなどが挙げられる。
【００４１】
本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットを用いる大腸がん細胞の回収プロトコールに対して、従来の、ストマッカー法による大腸がん細胞の回収では、検体回収及び濾過の手順が相違する。即ち、本発明では、糞便回収を特定の糞便回収容器により行い、懸濁と濾過をストマッカーを用いず、該糞便回収容器と結合可能な糞便処理容器によって行う。懸濁と濾過を同一工程、連結された容器で行うことが可能となったことで、糞便を扱う煩雑さからの解放、作業時間の短縮、消耗品の低減等がもたらされた。又、糞便の粉砕にステンレス製やセラミックス製ボールを用いることで、作業の高効率化を可能にした。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
＜実施例１：糞便回収用容器の作製＞
本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットの各樹脂部品を射出成型で作製した。部品は糞便採取容器（ポレエチレン製）、収納容器（ポレエチレン製）、糞便処理キット本体（ポレエチレン製）、フィルター（外周：エラストマー製、フィルター部：ナイロン製）、蓋用パッキン（エラストマー製）、押出し棒（ポリエチレン製）からなる。各部品の説明は上記を参照のこと。
【００４４】
＜実施例２：模擬便による評価＞
模擬便を使って糞便採取容器及び糞便処理容器の使用方法に関して検討した。模擬便は基材として釣餌（浮子鯉、マルキュー株式会社）２．５ｇ、増粘剤として小麦粉（カメリヤ強力小麦粉、日清製粉）１ｇを混合した後、水２．５ｍｌを加えて練りこみ作製した。
【００４５】
模擬便を使用して糞便採取容器１本当たりに適切な便量を決定した。始めに糞便採取容器を使用して、半刺し（０．８２ｇ）、一刺し（１．３６ｇ）、二刺し（２．８７ｇ）の３種類の模擬便を採取した。それぞれの糞便採取容器を糞便処理容器本体にセットし、押出し棒を使って、模擬便を懸濁部内に押出した。押出し棒を指で押さえながら、糞便処理キットを上下に１００往復して模擬便の粉砕、懸濁を行った後、静置し、ろ液受け用容器への懸濁液の移動を調べた。
【００４６】
その結果、糞便採取容器半刺しと１刺し分の模擬便では問題なく懸濁液はフィルターを通過したが、２刺し分ではフィルターが詰まり、濾液量が減少した。さらに、濾液中に混入した沈殿物も多く、この容器に対して過剰の便量であると考えられた。従って、糞便採取容器使用の際には糞便採取容器1刺し以下（およそ１．５ｇ）の便量が好ましいと考えられた。
【００４７】
＜実施例３：大腸がん患者からの細胞の回収＞
手術前の３人の大腸がん患者由来糞便（Ａ，Ｂ，Ｃ）を検体として使用した。糞便の使用に関しては事前に各被験者へ実験内容の説明を行い、同意を得た。
【００４８】
糞便採取容器を使用して上記患者検体から1人当たり一刺分の糞便を得た。便を採取した容器はそれぞれ糞便処理容器本体に接続した。なお、容器の濾液受け部分には予めＨａｎｋｓ液＋１０％ＦＢＳ ３０ｍｌを入れておいた。
【００４９】
次に押出し棒を使って、糞便を糞便処理容器本体内に押出した。押出し棒が飛び出さないように、指で押さえながら、容器を上下に１００往復して振とうした。その結果、糞便は粉砕され懸濁液となった。懸濁液の一部は本体と濾液受け用容器の境目に位置するフィルターを通して濾過され、下部の濾液受け用容器内に移動した。また振とう後、懸濁部内に残った糞便懸濁液は軽く容器を指ではじいて振動させることにより、濾液受け用容器内に移動させた。
【００５０】
次に濾液受け用容器を糞便処理容器本体から外し、濾液を新しい５０ｍｌ遠沈管（ＩＷＡＫＩ）に移した。濾液には４０μlのＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）を加え、ミックスローター(VMR-5、 AS ONE社)で３０分間攪拌した。攪拌後、遠沈管は磁石スタンド（Dynal MPC-1、ダイナル社）にセッティングし、マイルドミキサー（SI-36、TAITEC社）で１５分間振とうし、磁気ビーズを磁石スタンドの壁面に集めた。ろ液を除去した後、遠沈管をスタンドから外し、洗浄液として、一本当たり５００μlのＰＢＳ液を加えて、壁面に集められたビーズを洗浄した。ビーズを含んだ洗浄液をエッペンチューブ（１．５ｍｌ用）に回収し、再び、磁石スタンド（Dynal MPC-S、ダイナル社）にセットし、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた。最後に洗浄液を除去して、細胞−ビーズ複合体のペレットを得た。図６に、糞便濾液から洗浄・回収までを模式的に示す。
【００５１】
Ａの患者由来の細胞−ビーズ複合体ペレットの一部を用いて、細胞染色を行った。ペレットにＹＭ固定液１００μｌを加えて懸濁した後、５０ｍｌの遠沈管に移し、ＹＭ固定液で全量２５ｍｌにして細胞含有固定液を作成した。細胞含有固定液をスライドグラス8枚分のオートスメア装置に分注し、更にＹＭ固定液を加えて装置を固定液で満たした後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心して、スライドグラスに細胞を塗抹した。スライドに冷風を当てて乾燥させた後、９５％エタノールで固定した。細胞形態観察用の代表的な染色法であるパパニコロウ染色法により、細胞を染色し、顕微鏡で観察した。
【００５２】
その結果ペレット中には上皮系由来と判断できる細胞が存在していることが確認でき、本方法で糞便中から細胞が回収できることが判明した。
【００５３】
＜比較例：従来法による糞便からの細胞の回収＞
実施例３に示した３人の大腸がん患者と同一の糞便サンプルを使用して、ストマッカーを使用した従来法（上記特許特許文献２）により、細胞-磁気ビーズペレットを回収した。Ａの患者由来のサンプルの一部を実施例３と同様に染色し、細胞を観察した。その結果上皮系由来と判断できる細胞が存在していることが確認できた。さらに形態的に詳しく観察すると、核の大小不同、クロマチンの濃縮、核膜肥厚が観察され、ＣｌａｓｓＶの大腸がん細胞であることが判明した。従って、Ａの患者由来の糞便中にはがん細胞が存在していることが明らかになった。
【００５４】
しかし、一方で、本法で回収した細胞と比べるとリンパ球系の細胞が多く混入していることも観察された。
【００５５】
＜実施例４：回収細胞由来ＤＮＡのシークエンス解析＞
回収した磁気ビーズのペレットからセパジーンキット（三光純薬）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型にして、がん抑制遺伝子であるＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）遺伝子ののエキソン１５に含まれる領域をＰＣＲで増幅した。増幅に使用したプライマーの配列はＦ：５‘-ＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣ−３’とＲ： ５‘−ＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣ−３’であり、増幅する領域の塩基数は１５５３ｂｐであった。この増幅断片中に存在する、ＭＣＲ（mutation cluster region, codon1250-1550）と呼ばれるＡＰＣ遺伝子変異のホットスポットである領域をシークエンス解析した。シークエンス解析にはＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１／１．１ ｃｙｃｌｅ ｋｉｔ(ABI)を付属プロトコールに従い使用した。
【００５６】
その結果、サンプルＡではＡＰＣ遺伝子（M74088）の３９４０番目のＡがＴに変化しているナンセンス変異（Ｌｙｓ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３０８）が見つかった。サンプルＢでは３９８２番目のＧがＴに変化したナンセンス変異（Ｇｌｕ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３２２）と４１７９番目のＴがＡに変化したナンセンス変異（Ｃｙｓ→Ｓｔｏｐ）の２種類が見つかった。さらにサンプルＣでは４２３４番目のＣがＴに変化したナンセンス変異（Ｇｌｎ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１４０６）が見つかった。
【００５７】
一方で、従来法で回収した細胞に関しても同様にＤＮＡを抽出し、シークエンス解析を行った。その結果、サンプルＡではＡＰＣ遺伝子（M74088）の３９４０番目のＡがＴに変化しているナンセンス変異（Ｌｙｓ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３０８）が見つかった。サンプルＢでは３９８２番目のＧがＴに変化したナンセンス変異（Ｇｌｕ→Ｓｔｏｐ／ｃｄｏｎ１３２２）のみが見つかった。サンプルＣでは変異を判別することができなかった。
【００５８】
以上のことから本発明で回収した細胞では、リンパ球系の細胞の混入が少なく、がん細胞リッチに回収できた可能性があり、シークエンス解析によるがん細胞の判定に有用であることが判明した。
【００５９】
＜実施例５：改良型容器の作製＞
糞便処理キットを改良し、操作性を改善した。
【００６０】
図７は改良した糞便採取容器及び糞便処理容器本体の断面図である。図７（Ａ）は糞便採取容器であり、蓋用パッキンの代わりに取り付けた薄膜３１を有する。図７（Ｂ）は、糞便処理容器本体に糞便採取容器と、押出し棒を装着した断面図である。押出し棒の先端３２は薄膜３１を突き刺せるように先端を尖らせた。押出し棒は薄膜３１を破った後、糞便採取容器のシリンジ内の糞便を直接糞便処理容器本体内に押し出す仕組みになっている。
【００６１】
押出し棒と本体が固定できるように連結部分３３を設けた。これにより、糞便処理容器本体振とう時に押出し棒のずれを防ぐことができた。
【００６２】
又、糞便処理容器本体の入り口部分３４を、従来容器より広い構造に変えた。これにより、採取容器の本体への装着が容易になり、採取容器装着時の手振れにより、糞便が本体容器の入り口部分に付着する現象を防ぐことができた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の糞便採取キット及び糞便処理キットにより、大腸内剥離がん細胞の回収方法が容易になった。これにより、大腸がんの早期発見に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】糞便処理容器の糞便処理能力と糞便中の細胞数の関係を表した概念図である。
【図２】本発明の糞便採取容器を示す断面図である。
【図３】本発明の糞便採取容器による糞便の懸濁・ろ過の手順を示す図である。
【図４】本発明の糞便処理容器本体を示す断面図である。
【図５】本発明の糞便採取容器を糞便処理容器本体に嵌め合わせて糞便を処理する工程を示す断面図である。
【図６】糞便濾液からのがん細胞の磁気分離、洗浄・回収までを模式的に示す図である。
【図７】改良した糞便採取容器及び糞便処理容器本体の断面図である。
【符号の説明】
【００６５】
１：糞便採取容器、２：シリンジ、３：取っ手、４：蓋用パッキン、５：空気穴、６：収納容器、７：結合部、８：収納筒体、９：糞便、１０：目盛り線、２０：糞便処理容器本体、２１：シリンジ収納部、２２：懸濁部、２３：濾液受け容器、２４：結合部、２５：接続部、２６：フィルター、２７：パッキン、２８：粉砕用ボール、２９：懸濁用溶液、３０：押出し棒、３１：パッキン、３２：糞便。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便採取容器と該糞便採取容器を収納する収納容器からなる糞便採取キットであって、（ａ）該糞便採取容器は、糞便に突き刺すことにより０．５グラム以上の糞便を採取できる容量を有するシリンジと、糞便採取口と該糞便採取口の他端の該シリンジ外周部に設けられた取っ手と、該収納容器と結合できる一方の結合部と、該糞便採取口の他端に設けられた蓋部材からなり、（ｂ）該収納容器は、該糞便採取容器と結合できる他方の結合部を有し、該糞便採取容器を収納できる収納筒体からなることを特徴とする糞便採取キット。
【請求項２】
前記シリンジは、糞便採取時にシリンジ中の空気を逃がすための空気穴を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項３】
前記シリンジは、透明又は半透明材料からなり、採取した糞便量の目安となる目盛り線を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項４】
前記蓋部材は、押出し部材に押されて前記シリンジ中を移動可能な蓋用パッキンであることを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項５】
前記蓋部材は、先端が尖った押出し部材に突き破られてることが可能な蓋用薄膜であることを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項６】
前記結合部は、螺合部又は勘合（スナップフィット）部であることを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項７】
更に、保管及び運搬用の保冷材又は保冷部を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項８】
糞便採取容器と該糞便採取容器と結合可能な糞便処理容器本体と該糞便採取容器から該糞便処理容器本体へ採取した糞便を移動させる押出し棒からなる糞便処理キットであって、（ａ）該糞便採取容器は、糞便に突き刺すことにより０．５グラム以上の糞便を採取できる容量を有するシリンジと、糞便採取口と該糞便採取口の他端の該シリンジ外周部に設けられた取っ手と、該糞便採取口の他端に設けられた蓋部材からなり、（ｃ）該糞便処理容器本体は、該シリンジを収納するシリンジ収納部と、該シリンジ収納部に接続し糞便の懸濁を行う懸濁部と、該懸濁部に接続され分離可能で、懸濁・濾過された糞便の濾液を受ける濾液受け容器と、該懸濁部と該濾液受け容器の接続部に設けられたフィルターからなり、（ｄ）該押出し部材は、該糞便採取容器のシリンジ中に採取された糞便を該蓋部材を押し下げ又は突き破って該懸濁部に移動させる押出し部材である、ことを特徴とする糞便処理キット。
【請求項９】
前記懸濁部の内部に、前記糞便を破砕する破砕手段を有することを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１０】
前記破砕手段が、金属製、セラミック製、ガラス製、プラスチック製から選択される１個以上のボールであることを特徴とする請求項９に記載の糞便処理キット。
【請求項１１】
前記フィルターが、ポリアミドメッシュのフィルターであることを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１２】
前記濾液受け容器中に、糞便懸濁用溶液が収納されていることを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１３】
前記糞便懸濁用溶液が、細胞洗浄液及び／又は細胞培養液であることを特徴とする請求項１２に記載の糞便処理キット。
【請求項１４】
前記糞便採取容器は、前記糞便処理容器のシリンジ収納部と結合できる一方の結合部を有し、該糞便処理容器のシリンジ収納部は該糞便採取容器と結合できる他方の結合部を有することを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１５】
前記結合部は、螺合部又は勘合（スナップフィット）部であることを特徴とする請求項１４に記載の糞便処理キット。
【請求項１６】
前記糞便処理容器本体の、前記懸濁部は前記濾液受け容器と結合できる一方の結合部を有し、前記濾液受け容器は前記懸濁部と結合できる他方の結合部を有することを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１７】
前記結合部は、螺合部又は勘合（スナップフィット）部であることを特徴とする請求項１６に記載の糞便処理キット。
【請求項１８】
前記糞便処理容器本体の前記シリンジ収納部、前記懸濁部、前記濾液受け容器結合部は、透明又は半透明材料からなることを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１】
糞便採取容器と該糞便採取容器を収納する収納容器からなる糞便採取キットであって、（ａ）該糞便採取容器は、糞便に突き刺すことにより０．５グラム以上の糞便を採取できる容量を有するシリンジと、糞便採取口と該糞便採取口の他端の該シリンジ外周部に設けられた取っ手と、該収納容器と結合できる一方の結合部と、該糞便採取口の他端に設けられた蓋部材からなり、（ｂ）該収納容器は、該糞便採取容器と結合できる他方の結合部を有し、該糞便採取容器を収納できる収納筒体からなることを特徴とする糞便採取キット。
【請求項２】
前記シリンジは、糞便採取時にシリンジ中の空気を逃がすための空気穴を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項３】
前記シリンジは、透明又は半透明材料からなり、採取した糞便量の目安となる目盛り線を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項４】
前記蓋部材は、押出し部材に押されて前記シリンジ中を移動可能な蓋用パッキンであることを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項５】
前記蓋部材は、先端が尖った押出し部材に突き破られてることが可能な蓋用薄膜であることを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項６】
前記結合部は、螺合部又は勘合（スナップフィット）部であることを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項７】
更に、保管及び運搬用の保冷材又は保冷部を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便採取キット。
【請求項８】
糞便採取容器と該糞便採取容器と結合可能な糞便処理容器本体と該糞便採取容器から該糞便処理容器本体へ採取した糞便を移動させる押出し棒からなる糞便処理キットであって、（ａ）該糞便採取容器は、糞便に突き刺すことにより０．５グラム以上の糞便を採取できる容量を有するシリンジと、糞便採取口と該糞便採取口の他端の該シリンジ外周部に設けられた取っ手と、該糞便採取口の他端に設けられた蓋部材からなり、（ｃ）該糞便処理容器本体は、該シリンジを収納するシリンジ収納部と、該シリンジ収納部に接続し糞便の懸濁を行う懸濁部と、該懸濁部に接続され分離可能で、懸濁・濾過された糞便の濾液を受ける濾液受け容器と、該懸濁部と該濾液受け容器の接続部に設けられたフィルターからなり、（ｄ）該押出し部材は、該糞便採取容器のシリンジ中に採取された糞便を該蓋部材を押し下げ又は突き破って該懸濁部に移動させる押出し部材である、ことを特徴とする糞便処理キット。
【請求項９】
前記懸濁部の内部に、前記糞便を破砕する破砕手段を有することを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１０】
前記破砕手段が、金属製、セラミック製、ガラス製、プラスチック製から選択される１個以上のボールであることを特徴とする請求項９に記載の糞便処理キット。
【請求項１１】
前記フィルターが、ポリアミドメッシュのフィルターであることを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１２】
前記濾液受け容器中に、糞便懸濁用溶液が収納されていることを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１３】
前記糞便懸濁用溶液が、細胞洗浄液及び／又は細胞培養液であることを特徴とする請求項１２に記載の糞便処理キット。
【請求項１４】
前記糞便採取容器は、前記糞便処理容器のシリンジ収納部と結合できる一方の結合部を有し、該糞便処理容器のシリンジ収納部は該糞便採取容器と結合できる他方の結合部を有することを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１５】
前記結合部は、螺合部又は勘合（スナップフィット）部であることを特徴とする請求項１４に記載の糞便処理キット。
【請求項１６】
前記糞便処理容器本体の、前記懸濁部は前記濾液受け容器と結合できる一方の結合部を有し、前記濾液受け容器は前記懸濁部と結合できる他方の結合部を有することを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【請求項１７】
前記結合部は、螺合部又は勘合（スナップフィット）部であることを特徴とする請求項１６に記載の糞便処理キット。
【請求項１８】
前記糞便処理容器本体の前記シリンジ収納部、前記懸濁部、前記濾液受け容器結合部は、透明又は半透明材料からなることを特徴とする請求項８に記載の糞便処理キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１３８８１５（Ｐ２００６−１３８８１５Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３０９４９（Ｐ２００４−３３０９４９）
【出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度、独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構（再）委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度、独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構（再）委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
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