納豆菌ワクチン
【課題】納豆菌ワクチンを提供する。
【解決手段】納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に抗原タンパク質の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とする納豆菌ワクチン、及び納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とする納豆菌ワクチンの製造方法。
【効果】納豆菌を利用した「食べるワクチン」を提供することができる。
【解決手段】納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に抗原タンパク質の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とする納豆菌ワクチン、及び納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とする納豆菌ワクチンの製造方法。
【効果】納豆菌を利用した「食べるワクチン」を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫機能調節を目的とした納豆菌のワクチンとしての利用技術に関するものであり、更に詳しくは、納豆菌（胞子）の細胞表層に抗原タンパク質又は抗原ペプチドを高発現量で発現させた納豆菌ワクチンに関するものである。本発明は、納豆菌の細胞表層に発現させた抗原タンパク質又は抗原ペプチドのワクチン効果を利用した新しい納豆菌ワクチンを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、先行技術として、例えば、外来の抗原等の遺伝暗号により遺伝子改変されたバシラス属又はクロストリジウム属細菌の胞子及び該胞子をワクチンとして投与する方法が提案されている（特許文献１）。また、抗原及び胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする一つ以上の遺伝子構築物を含む遺伝暗号により遺伝子改変された胞子をワクチンとして投与する方法が提案されている（特許文献２）。
【０００３】
このように、細菌（胞子）に外来の抗原遺伝子を導入して遺伝子改変された細胞（胞子）を経口ワクチンとして投与する方法は組換え細菌を利用した新しい手法として公知である。一方、現状のワクチンは、注射により投与する形態が多く、熟練者による投与が必要である。また、ワクチンを必要とする発展途上国においては、注射針の再使用による２次感染のリスクが懸念されており、ワクチンの冷蔵・冷凍保管にかかる経済的な負担も問題である。本発明において提案する納豆菌ワクチンは、日本人が食経験をもつ納豆菌を宿主とし、組換え操作により抗原タンパク質を発現する性質を付与した経口ワクチンである。経口ワクチンは粘膜経路を介する感染症の予防に特に効果的であると考えられ、また、納豆菌はその培養が比較的容易な好気性の細菌であり、その胞子は栄養源の枯渇や乾燥に耐性を示すことから、保管及び輸送にも適している。
【０００４】
上述の遺伝子改変された胞子をワクチンとして投与する方法では、先行文献には、抗原と融合し発現させるタンパク質（アンカータンパク質）として種々の胞子コートタンパク質が開示されているが、具体的に実施されているのは胞子コートタンパク質ＣｏｔＢであり、また、抗原タンパク質として具体的に開示されているのはＴＴＦＣ（破傷風抗原タンパク質）である。しかし、実際に実用化可能な有用なワクチンを開発するには、例えば、アンカータンパク質の条件として、１）細胞表層に存在すること、２）発現量が高いこと、が理想的であり、これらの条件は、使用する宿主の種類、胞子コートタンパク質の種類、抗原タンパク質等のコンストラクトによって、大きく異なるものであることが知られている。したがって、実用化可能な有用なワクチンを開発するには、これらのあらゆる構成及び条件について詳細に試験し、実証することが極めて重要である。
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５１９１２３号公報
【特許文献２】特表２００５−５２２１９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、組換え細菌を利用して、実用化可能な有用なワクチンを開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、納豆菌の特定コートタンパク質遺伝子と外来抗原遺伝子を利用した新しい納豆菌ワクチンを開発することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、納豆菌（胞子）の特定のコートタンパク質に外来抗原を融合させた経口投与可能な新しい納豆菌ワクチンを提供することを目的するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に、抗原タンパク質の遺伝子又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とする納豆菌ワクチン。
（２）抗原タンパク質が、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来の鞭毛タンパク質ＦｌｉＣである、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（３）セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）又は中性プロテアーゼ（ＮｐｒＥ）の欠損株、あるいはその両方の欠損株である納豆菌を宿主として使用した、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（４）納豆菌の胞子表層タンパク質の遺伝子ｃｏｔと、サルモネラ菌由来の鞭毛タンパク質の遺伝子ｆｌｉＣとのキメラ遺伝子を含む遺伝子領域を挿入して形質転換した組換え納豆菌ワクチンである、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（５）組換え納豆菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ４；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４３である、前記（３）又は（４）に記載の納豆菌ワクチン。
（６）納豆菌が、細胞表層にキメラタンパク質が発現する発現時期を指標として培養した納豆菌である、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（７）Ｄｉｆｃｏ Ｓｐｏｒｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＤ培地）を用いた培養において、ＯＤ６６０＝１．５〜４．５の範囲で、胞子表層にキメラタンパク質を発現する、前記（６）に記載の納豆菌ワクチン。
（８）前記（１）から（７）のいずれかに記載の納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質の発現量が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とする納豆菌ワクチンの製造方法。
（９）キメラタンパク質が、“ＣｏｔＥ−抗原タンパク質”である、前記（８）に記載の納豆菌ワクチンの製造方法。
【０００８】
本発明は、納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に抗原タンパク質の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とするものである。また、本発明は、上記の納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とするものである。
【０００９】
次に、本発明の納豆菌ワクチンの製法について説明する。本発明では、アンカータンパク質として、納豆菌（胞子）のコートタンパク質ＣｏｔＥを使用し、抗原タンパク質として、サルモネラ菌由来の鞭毛タンパク質（ＦｌｉＣ）を使用して発現系を構築した。具体的には、納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子（ｃｏｔＥ）とサルモネラ菌の鞭毛タンパク質の遺伝子（ｆｌｉＣ）とのキメラ遺伝子を含む遺伝子領域（ｃｏｔＥ−ｆｌｉＣ）を、納豆菌のゲノム上のａｍｙＥ遺伝子座に挿入し、キメラタンパク質ＣｏｔＥ−ＦｌｉＣを発現する組換え納豆菌（ＴＴＣＣ Ｇ４）を作製した。
【００１０】
キメラタンパク質の発現解析は、ＳＤ培地で２４時間培養した胞子を集菌し、洗浄して精製胞子とし、これをローディング・バッファー（ＳＤＳ＋２−ＭｅＳＨ）に懸濁して胞子タンパク質を抽出後、抗ＦｌｉＣ抗血清を１次抗体としたウエスタン解析によって行った。また、胞子表層のキメラタンパク質の検出は、精製胞子を使用し、抗ＦｌｉＣ抗血清による１次処理の後に蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡観察及びＦＡＣＳ解析により行った。
【００１１】
組換え納豆菌の評価は、胞子タンパク質のウエスタン解析によるＦｌｉＣタンパク質の発現の評価、蛍光顕微鏡観察とＦＡＣＳ解析による胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の検出により行った。アンカータンパク質の発現時期について検討した結果、キメラタンパク質（ＣｏｔＥ−ＦｌｉＣ）は、ＳＤ培地での培養ではＯＤ６６０＝１．５〜４．５の範囲内で、胞子表層に提示されることが分かった。
【００１２】
次に、動物試験について説明する。まず、本発明の納豆菌ワクチン等の試料を投与したマウスの脾臓を抽出し、細胞を分離し、刺激成分ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（ＣｏｎＡ）と共に培養し、４５時間後にＩＦＮ−γ産生量を評価した。投与群は、１）ブランク（ＰＢＳ）投与群、２）ＦｌｉＣタンパク投与群（５０μｇ／ｈｅａｄ）、３）非組換え納豆菌（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ；ＴＴＣＣ ２１８株）投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、４）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、５）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）とした。
【００１３】
次に、マウス脾細胞をＣｏｎＡにより刺激した時のＩＦＮ−γ産生量を調べた。その結果、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群では、ＰＢＳ投与群やＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示し、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群ではＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示した。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、実用化可能な有用な納豆菌ワクチンを提供することができる。
（２）アンカータンパク質として、細胞（胞子）表層に存在するコートタンパク質ＣｏｔＥを用いること及び細菌の培養時間を因子として抗原タンパク質を表層提示させることにより、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高め、従来法の胞子ワクチンと比べて高い発現量で抗原タンパク質を発現させることが可能となる。
（３）生体内で生存し、ＩＦＮ−γを誘導する納豆菌（胞子）ワクチンを提供することができる。
（４）納豆菌を利用した「食べるワクチン」を提供することができる。
（５）納豆菌ワクチンの基本技術を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
（宿主となる納豆菌の作製）
納豆菌は、ＴＴＣＣ ２１８株を使用した。ＴＴＣＣ ２１８株を形質転換し、セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）と中性プロテアーゼ（ＮｐｒＥ）を生産しない組換え納豆菌株（ΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ×ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）を作製した。この株を宿主として、次項に示すような性質を付与した。
【００１７】
（胞子表層提示型の納豆菌ワクチンを目指したアンカータンパク質の探索）
ＴＴＣＣ ２１８株を使用し、胞子のコートタンパク質のうち転写レベルが高いものを探索した。納豆菌をＬＢ培地にて３７℃でｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅ前期まで培養し、菌体を回収・破砕してＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを用いＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。尚、この解析には納豆菌の近縁種である枯草菌のＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を使用した。
【００１８】
（納豆菌ワクチンの作製）
納豆菌の胞子コートタンパク質（Ｃｏｔ）と、サルモネラ菌の鞭毛タンパク質（ＦｌｉＣ）とのキメラタンパク質（Ｃｏｔ−ＦｌｉＣ）を発現する組換え納豆菌をデザインした。ｃｏｔ遺伝子の下流にｆｌｉＣ遺伝子を連結してキメラ遺伝子（ｃｏｔ−ｆｌｉＣ）を作製し、これとクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を合わせた遺伝子領域を、相同組換えにより宿主納豆菌（ΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ×ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）のゲノムのａｍｙＥ遺伝子領域に挿入した。
【００１９】
尚、胞子のコートタンパク質には、マイクロアレイ解析で発現が高かったＣｏｔＡ及びＣｏｔＥを選択し、ＣｏｔＡ−ＦｌｉＣ株を発現する組換え納豆菌（ＴＴＣＣ Ｇ５）及びＣｏｔＥ−ＦｌｉＣ株を発現する組換え納豆菌（ＴＴＣＣ Ｇ４）（図１）をそれぞれ作製した。
【００２０】
（キメラ遺伝子のシークエンス解析）
ＴＴＣＣ Ｇ４のキメラ遺伝子領域の塩基配列をＤＮＡシークエンサー ＡＢＩ ３１０Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により決定した。
【００２１】
（キメラ遺伝子の発現解析）
ＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５をＤｉｆｃｏ Ｓｐｏｒｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍで培養し、ｌｏｇ−ｐｈａｓｅからｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅにかけて集菌した。集菌したサンプルからＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｖｅ ｋｉｔにより逆転写を行った。逆転写により得られたｃＤＮＡについて、キメラ遺伝子ｃｏｔ−ｆｌｉＣの連結部分をターゲットにしたリアルタイムＰＣＲを、７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。
【００２２】
（胞子タンパク質の抽出）
一方で、前項と同様の操作で集菌したＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５をリゾチーム処理して栄養細胞を溶解し、洗浄により除去して精製胞子を得た。精製胞子をＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８， ４％ＳＤＳ， １０％ Ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、９５℃、５ｍｉｎの熱処理の後にＳｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ ｖｅｒ １．２（Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ）により破砕して胞子タンパク質を抽出した。
【００２３】
（キメラタンパク質の発現解析）
前項の操作により、１０８ｃｆｕの胞子から出した胞子タンパク質を１２．５％のポリアクリドアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、１次抗体にウサギ由来の抗ＦｌｉＣ抗血清、２次抗体に抗ウサギＩｇＧ抗体、検出にＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア）を使用してウエスタン解析を行った。一方で、前項の精製胞子をウサギ由来の抗ＦｌｉＣ抗血清で１次抗体処理した後、Ａｌｅｘａ４８８を結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブ）で２次処理して蛍光染色した。蛍光染色した精製胞子の評価は、オールインワンＢＩＯＺＥＲＯ（キーエンス）による蛍光顕微鏡観察及びＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によるＦＡＣＳ解析により行った。
【００２４】
（動物試験による納豆菌ワクチンの評価）
試験動物には８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ雌マウス（日本エスエルシー）を用い、固形飼料及び飲料水は自由に摂取させた。投与サンプルは、１）ブランク（ＰＢＳ）投与群、２）ＦｌｉＣタンパク投与群（５０μｇ／ｈｅａｄ）、３）非組換え納豆菌（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ；ＴＴＣＣ ２１８株）投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、４）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、５）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）とした。尚、３）４）５）は、ＳＤ培地で３７℃、１５時間の培養し、集菌後、リゾチーム処理を行い、−８０℃で凍結保存したものを解凍後に用いた。
【００２５】
上記の動物試験において、サンプルの投与は、１、２、３、２２、２３、２４、４４、４５、４６日目（合計９回、投与開始日を１日目とする）に行い、０．２ｍｌ／ｄａｙの胃内投与を行った。投与日（４６日目）から１、３、６日後にマウスから糞便を採取し、ＰＢＳで懸濁した後に熱処理（７０℃、２０ｍｉｎ）し、希釈液をＬＢプレート（クロラムフェニコール ５μｇ／ｍｌを含む）に撒いて、４８時間後のコロニー数を測定した。
【００２６】
上記の動物試験において、投与開始後５６日目又は５７日目にマウスから脾臓を摘出し、１０％ ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（インビトロジェン）を含むＲＰＭＩ１６４０で細胞数を２×１０５／ｗｅｌｌに調整して９６ｗｅｌｌプレートに分注し、Ｃｏｎ Ａ（Ｗａｋｏ）を１０μｇ／ｍｌになるように添加して培養した。培養後の細胞上清に含まれるＩＦＮ−γをＢＩＯ Ｏｐｔ ＥＩＡＴＭ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。統計学的処理方法としてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔを用いた。
【００２７】
（アンカータンパク質の発現解析結果）
ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果において、納豆菌の主要な胞子コートタンパク質では遺伝子の発現量に差が見られた（図２）。特に、ｃｏｔＢと比較して、ｃｏｔＡ、ｃｏｔＥ、ｃｏｔＧは１００倍程度の高発現を示した。このうち、ＣｏｔＡ及びＣｏｔＥをアンカータンパク質として選択し、納豆菌ワクチンの創出を行った。
【００２８】
（宿主となる納豆菌の性質）
宿主として作製した組換え納豆菌株（ΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ×ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）では、カゼインプレート上のコロニーにおいて、カゼインタンパク質の分解に起因するハロー形成を示さなかった（図３）。一方で、ＡｐｒＥあるいはＮｐｒＥのいずれか１つのプロテアーゼ遺伝子を欠損させた納豆菌（それぞれΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ、ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）はハローを形成した。
【００２９】
（キメラ遺伝子のシークエンス解析の結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４のキメラ遺伝子領域について、塩基配列をシークエンス解析した。結果として、キメラ遺伝子の全領域について正確な塩基配列が確認できた。
【００３０】
（ＴＴＣＣ Ｇ４の培養結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４をＳＤ培地で培養し培養開始から６、７、１１、１５、１９時間後のＯＤ６６０の経時変化を調べた結果、１１時間後に１．９２であったＯＤ６６０の値は、１９時間後には４．５４に達した（図４）。
【００３１】
（キメラ遺伝子の発現解析結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５をＳＤ培地で培養し、培養開始から７、１１、１５、１９時間後に菌体からＲＮＡ抽出を行い、これを逆転写して得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、ＴＴＣＣ Ｇ４のキメラ遺伝子ｃｏｔＥ−ｆｌｉＣとＴＴＣＣ Ｇ５のキメラ遺伝子ｃｏｔＡ−ｆｌｉＣの発現は、いずれも培養から１１時間後にピークを示した（図５）。
【００３２】
（キメラタンパク質の発現解析結果）
精製胞子からタンパク質を抽出し、ウエスタン解析によりＦｌｉＣタンパク質の発現を確認した。ＴＴＣＣ Ｇ４とＴＴＣＣ Ｇ５のそれぞれについて、キメラタンパク質のサイズに相当するバンドが確認できた（図６）。ＴＴＣＣ Ｇ４については、培養１１時間後、１５時間後、１９時間後、２３時間後についていずれもキメラタンパク質に相当するバンドが検出できた。
【００３３】
ウエスタン解析において、ＦｌｉＣタンパク質に相当するバンドの検出値（バンドの大きさ×密度）を算出した。その結果、培養１５時間後のＴＴＣＣ Ｇ４では１×１０１０ｃｆｕの胞子あたり１２．５μｇのＦｌｉＣタンパク質に相当するキメラタンパク質が発現していることが示唆された。
【００３４】
精製胞子の蛍光顕微鏡観察では、Ｗｉｌｄ ＴｙｐｅとＴＴＣＣ Ｇ５にはキメラタンパク質の存在を示す蛍光が見られなかったが、ＴＴＣＣ Ｇ４で明確な蛍光が見られた（図７）。更に、精製胞子のＦＡＣＳ解析では、ＴＴＣＣ Ｇ４はＷｉｌｄ Ｔｙｐｅに比べて明らかに強い蛍光強度に粒子数のピークを示し、ＦｌｉＣタンパク質が胞子表層に提示されていることが示唆された（図８）。
【００３５】
精製胞子のＦＡＣＳ解析における粒子数のピーク値は培養開始から１５時間後程度で最も強い蛍光強度を示し、その前後では蛍光強度が弱かった（図９）。尚、ＴＴＣＣ Ｇ４を培養から１５時間後に集菌した精製胞子について、これを凍結保存（−８０℃）した場合の影響を調べたが、ＦＡＣＳ解析において大きな差異は見られなかった。
【００３６】
（動物試験による納豆菌ワクチンの評価の結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４を３連続日でマウスに経口投与した後、マウスの糞便中からはクロラムフェニコールに耐性を示す耐熱性のコロニーがみられ、ＰＢＳ、ＦｌｉＣタンパク質、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅを投与したマウスの糞便からはこのようなコロニーは検出されなかった。また、ＴＴＣＣ Ｇ４を１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ投与したマウスでは投与日から６日後まで、１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄの投与群では、投与日から３日後まで１０４ｃｆｕ／ｆｅｃｅｓ以上のＴＴＣＣ Ｇ４が糞便中に排泄された（図１０）。
【００３７】
各投与群のマウスから脾細胞を調製し、Ｃｏｎ Ａ刺激により産生されるＩＦＮ−γ量を比較したところ、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群では、ＰＢＳ投与群やＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示し、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群ではＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示した（図１１）。投与動物の免疫応答を引き起こすためのコントロールである、ＦｌｉＣタンパク質５０μｇ／ｈｅａｄの投与群と比較した場合にも、ＴＴＣＣ Ｇ４の投与群のＩＦＮ−γ産生値はより高かった。ウエスタン解析によって、１０１０ｃｆｕのＴＴＣＣ Ｇ４ は１２．５μｇのＦｌｉＣタンパク質に相当するキメラタンパク質を発現していることが示唆されている。動物試験においてＴＴＣＣ Ｇ４は、投与しているＦｌｉＣ相当量以上の効果を示していることが考えられ、抗原運搬体としての納豆菌のアドバンテージが期待できる。
【００３８】
作製した組換え納豆菌の株、ＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５を微生物寄託機関に寄託した。受領機関名：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、受領日：平成１９年３月８日、微生物：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ４；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ５；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４４。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上詳述したように、本発明は、納豆菌ワクチンに係るものであり、本発明により、実用化可能な有用な納豆菌ワクチンを提供することができる。本発明では、アンカータンパク質として、細胞（胞子）表層に存在するコートタンパク質ＣｏｔＥを用いることにより、細胞表層に抗原タンパク質を表層提示させて、従来法の胞子ワクチンと比べて高い発現量で抗原タンパク質を発現させることを可能とした。本発明は、納豆菌を利用した「食べるワクチン」を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＴＴＣＣ Ｇ４におけるａｍｙＥ遺伝子座の概略図を示す。
【図２】納豆菌の主要な胞子コートタンパク質の発現を示す。
【図３】カゼインプレート上で宿主納豆菌が示すプロテアーゼ活性を示す。
【図４】ＳＤ培地中におけるＴＴＣＣ Ｇ４の生育曲線を示す。
【図５】ウエスタン解析による、キメラ遺伝子ｃｏｔ−ｆｌｉＣの発現解析結果を示す。
【図６】キメラタンパク質Ｃｏｔ−ＦｌｉＣタンパク質の発現を示す。
【図７】蛍光顕微鏡による、胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の検出結果を示す。
【図８】ＦＡＣＳ解析による、胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の検出結果を示す。
【図９】ＴＴＣＣ Ｇ４の培養時間が胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の発現に与える影響を示す。
【図１０】ＴＴＣＣ Ｇ４を胃内投与したマウスの糞便中に含まれるＴＴＣＣ Ｇ４の菌数を示す。
【図１１】ＣｏｎＡ刺激による脾細胞のＩＦＮ−γ産生量を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫機能調節を目的とした納豆菌のワクチンとしての利用技術に関するものであり、更に詳しくは、納豆菌（胞子）の細胞表層に抗原タンパク質又は抗原ペプチドを高発現量で発現させた納豆菌ワクチンに関するものである。本発明は、納豆菌の細胞表層に発現させた抗原タンパク質又は抗原ペプチドのワクチン効果を利用した新しい納豆菌ワクチンを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、先行技術として、例えば、外来の抗原等の遺伝暗号により遺伝子改変されたバシラス属又はクロストリジウム属細菌の胞子及び該胞子をワクチンとして投与する方法が提案されている（特許文献１）。また、抗原及び胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする一つ以上の遺伝子構築物を含む遺伝暗号により遺伝子改変された胞子をワクチンとして投与する方法が提案されている（特許文献２）。
【０００３】
このように、細菌（胞子）に外来の抗原遺伝子を導入して遺伝子改変された細胞（胞子）を経口ワクチンとして投与する方法は組換え細菌を利用した新しい手法として公知である。一方、現状のワクチンは、注射により投与する形態が多く、熟練者による投与が必要である。また、ワクチンを必要とする発展途上国においては、注射針の再使用による２次感染のリスクが懸念されており、ワクチンの冷蔵・冷凍保管にかかる経済的な負担も問題である。本発明において提案する納豆菌ワクチンは、日本人が食経験をもつ納豆菌を宿主とし、組換え操作により抗原タンパク質を発現する性質を付与した経口ワクチンである。経口ワクチンは粘膜経路を介する感染症の予防に特に効果的であると考えられ、また、納豆菌はその培養が比較的容易な好気性の細菌であり、その胞子は栄養源の枯渇や乾燥に耐性を示すことから、保管及び輸送にも適している。
【０００４】
上述の遺伝子改変された胞子をワクチンとして投与する方法では、先行文献には、抗原と融合し発現させるタンパク質（アンカータンパク質）として種々の胞子コートタンパク質が開示されているが、具体的に実施されているのは胞子コートタンパク質ＣｏｔＢであり、また、抗原タンパク質として具体的に開示されているのはＴＴＦＣ（破傷風抗原タンパク質）である。しかし、実際に実用化可能な有用なワクチンを開発するには、例えば、アンカータンパク質の条件として、１）細胞表層に存在すること、２）発現量が高いこと、が理想的であり、これらの条件は、使用する宿主の種類、胞子コートタンパク質の種類、抗原タンパク質等のコンストラクトによって、大きく異なるものであることが知られている。したがって、実用化可能な有用なワクチンを開発するには、これらのあらゆる構成及び条件について詳細に試験し、実証することが極めて重要である。
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５１９１２３号公報
【特許文献２】特表２００５−５２２１９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、組換え細菌を利用して、実用化可能な有用なワクチンを開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、納豆菌の特定コートタンパク質遺伝子と外来抗原遺伝子を利用した新しい納豆菌ワクチンを開発することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、納豆菌（胞子）の特定のコートタンパク質に外来抗原を融合させた経口投与可能な新しい納豆菌ワクチンを提供することを目的するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に、抗原タンパク質の遺伝子又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とする納豆菌ワクチン。
（２）抗原タンパク質が、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来の鞭毛タンパク質ＦｌｉＣである、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（３）セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）又は中性プロテアーゼ（ＮｐｒＥ）の欠損株、あるいはその両方の欠損株である納豆菌を宿主として使用した、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（４）納豆菌の胞子表層タンパク質の遺伝子ｃｏｔと、サルモネラ菌由来の鞭毛タンパク質の遺伝子ｆｌｉＣとのキメラ遺伝子を含む遺伝子領域を挿入して形質転換した組換え納豆菌ワクチンである、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（５）組換え納豆菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ４；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４３である、前記（３）又は（４）に記載の納豆菌ワクチン。
（６）納豆菌が、細胞表層にキメラタンパク質が発現する発現時期を指標として培養した納豆菌である、前記（１）に記載の納豆菌ワクチン。
（７）Ｄｉｆｃｏ Ｓｐｏｒｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＤ培地）を用いた培養において、ＯＤ６６０＝１．５〜４．５の範囲で、胞子表層にキメラタンパク質を発現する、前記（６）に記載の納豆菌ワクチン。
（８）前記（１）から（７）のいずれかに記載の納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質の発現量が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とする納豆菌ワクチンの製造方法。
（９）キメラタンパク質が、“ＣｏｔＥ−抗原タンパク質”である、前記（８）に記載の納豆菌ワクチンの製造方法。
【０００８】
本発明は、納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に抗原タンパク質の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とするものである。また、本発明は、上記の納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とするものである。
【０００９】
次に、本発明の納豆菌ワクチンの製法について説明する。本発明では、アンカータンパク質として、納豆菌（胞子）のコートタンパク質ＣｏｔＥを使用し、抗原タンパク質として、サルモネラ菌由来の鞭毛タンパク質（ＦｌｉＣ）を使用して発現系を構築した。具体的には、納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子（ｃｏｔＥ）とサルモネラ菌の鞭毛タンパク質の遺伝子（ｆｌｉＣ）とのキメラ遺伝子を含む遺伝子領域（ｃｏｔＥ−ｆｌｉＣ）を、納豆菌のゲノム上のａｍｙＥ遺伝子座に挿入し、キメラタンパク質ＣｏｔＥ−ＦｌｉＣを発現する組換え納豆菌（ＴＴＣＣ Ｇ４）を作製した。
【００１０】
キメラタンパク質の発現解析は、ＳＤ培地で２４時間培養した胞子を集菌し、洗浄して精製胞子とし、これをローディング・バッファー（ＳＤＳ＋２−ＭｅＳＨ）に懸濁して胞子タンパク質を抽出後、抗ＦｌｉＣ抗血清を１次抗体としたウエスタン解析によって行った。また、胞子表層のキメラタンパク質の検出は、精製胞子を使用し、抗ＦｌｉＣ抗血清による１次処理の後に蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡観察及びＦＡＣＳ解析により行った。
【００１１】
組換え納豆菌の評価は、胞子タンパク質のウエスタン解析によるＦｌｉＣタンパク質の発現の評価、蛍光顕微鏡観察とＦＡＣＳ解析による胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の検出により行った。アンカータンパク質の発現時期について検討した結果、キメラタンパク質（ＣｏｔＥ−ＦｌｉＣ）は、ＳＤ培地での培養ではＯＤ６６０＝１．５〜４．５の範囲内で、胞子表層に提示されることが分かった。
【００１２】
次に、動物試験について説明する。まず、本発明の納豆菌ワクチン等の試料を投与したマウスの脾臓を抽出し、細胞を分離し、刺激成分ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（ＣｏｎＡ）と共に培養し、４５時間後にＩＦＮ−γ産生量を評価した。投与群は、１）ブランク（ＰＢＳ）投与群、２）ＦｌｉＣタンパク投与群（５０μｇ／ｈｅａｄ）、３）非組換え納豆菌（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ；ＴＴＣＣ ２１８株）投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、４）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、５）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）とした。
【００１３】
次に、マウス脾細胞をＣｏｎＡにより刺激した時のＩＦＮ−γ産生量を調べた。その結果、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群では、ＰＢＳ投与群やＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示し、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群ではＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示した。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、実用化可能な有用な納豆菌ワクチンを提供することができる。
（２）アンカータンパク質として、細胞（胞子）表層に存在するコートタンパク質ＣｏｔＥを用いること及び細菌の培養時間を因子として抗原タンパク質を表層提示させることにより、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高め、従来法の胞子ワクチンと比べて高い発現量で抗原タンパク質を発現させることが可能となる。
（３）生体内で生存し、ＩＦＮ−γを誘導する納豆菌（胞子）ワクチンを提供することができる。
（４）納豆菌を利用した「食べるワクチン」を提供することができる。
（５）納豆菌ワクチンの基本技術を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
（宿主となる納豆菌の作製）
納豆菌は、ＴＴＣＣ ２１８株を使用した。ＴＴＣＣ ２１８株を形質転換し、セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）と中性プロテアーゼ（ＮｐｒＥ）を生産しない組換え納豆菌株（ΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ×ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）を作製した。この株を宿主として、次項に示すような性質を付与した。
【００１７】
（胞子表層提示型の納豆菌ワクチンを目指したアンカータンパク質の探索）
ＴＴＣＣ ２１８株を使用し、胞子のコートタンパク質のうち転写レベルが高いものを探索した。納豆菌をＬＢ培地にて３７℃でｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅ前期まで培養し、菌体を回収・破砕してＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを用いＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。尚、この解析には納豆菌の近縁種である枯草菌のＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を使用した。
【００１８】
（納豆菌ワクチンの作製）
納豆菌の胞子コートタンパク質（Ｃｏｔ）と、サルモネラ菌の鞭毛タンパク質（ＦｌｉＣ）とのキメラタンパク質（Ｃｏｔ−ＦｌｉＣ）を発現する組換え納豆菌をデザインした。ｃｏｔ遺伝子の下流にｆｌｉＣ遺伝子を連結してキメラ遺伝子（ｃｏｔ−ｆｌｉＣ）を作製し、これとクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を合わせた遺伝子領域を、相同組換えにより宿主納豆菌（ΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ×ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）のゲノムのａｍｙＥ遺伝子領域に挿入した。
【００１９】
尚、胞子のコートタンパク質には、マイクロアレイ解析で発現が高かったＣｏｔＡ及びＣｏｔＥを選択し、ＣｏｔＡ−ＦｌｉＣ株を発現する組換え納豆菌（ＴＴＣＣ Ｇ５）及びＣｏｔＥ−ＦｌｉＣ株を発現する組換え納豆菌（ＴＴＣＣ Ｇ４）（図１）をそれぞれ作製した。
【００２０】
（キメラ遺伝子のシークエンス解析）
ＴＴＣＣ Ｇ４のキメラ遺伝子領域の塩基配列をＤＮＡシークエンサー ＡＢＩ ３１０Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により決定した。
【００２１】
（キメラ遺伝子の発現解析）
ＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５をＤｉｆｃｏ Ｓｐｏｒｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍで培養し、ｌｏｇ−ｐｈａｓｅからｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅにかけて集菌した。集菌したサンプルからＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｖｅ ｋｉｔにより逆転写を行った。逆転写により得られたｃＤＮＡについて、キメラ遺伝子ｃｏｔ−ｆｌｉＣの連結部分をターゲットにしたリアルタイムＰＣＲを、７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。
【００２２】
（胞子タンパク質の抽出）
一方で、前項と同様の操作で集菌したＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５をリゾチーム処理して栄養細胞を溶解し、洗浄により除去して精製胞子を得た。精製胞子をＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８， ４％ＳＤＳ， １０％ Ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、９５℃、５ｍｉｎの熱処理の後にＳｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ ｖｅｒ １．２（Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ）により破砕して胞子タンパク質を抽出した。
【００２３】
（キメラタンパク質の発現解析）
前項の操作により、１０８ｃｆｕの胞子から出した胞子タンパク質を１２．５％のポリアクリドアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、１次抗体にウサギ由来の抗ＦｌｉＣ抗血清、２次抗体に抗ウサギＩｇＧ抗体、検出にＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア）を使用してウエスタン解析を行った。一方で、前項の精製胞子をウサギ由来の抗ＦｌｉＣ抗血清で１次抗体処理した後、Ａｌｅｘａ４８８を結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブ）で２次処理して蛍光染色した。蛍光染色した精製胞子の評価は、オールインワンＢＩＯＺＥＲＯ（キーエンス）による蛍光顕微鏡観察及びＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によるＦＡＣＳ解析により行った。
【００２４】
（動物試験による納豆菌ワクチンの評価）
試験動物には８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ雌マウス（日本エスエルシー）を用い、固形飼料及び飲料水は自由に摂取させた。投与サンプルは、１）ブランク（ＰＢＳ）投与群、２）ＦｌｉＣタンパク投与群（５０μｇ／ｈｅａｄ）、３）非組換え納豆菌（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ；ＴＴＣＣ ２１８株）投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、４）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）、５）ＴＴＣＣ Ｇ４投与群（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）とした。尚、３）４）５）は、ＳＤ培地で３７℃、１５時間の培養し、集菌後、リゾチーム処理を行い、−８０℃で凍結保存したものを解凍後に用いた。
【００２５】
上記の動物試験において、サンプルの投与は、１、２、３、２２、２３、２４、４４、４５、４６日目（合計９回、投与開始日を１日目とする）に行い、０．２ｍｌ／ｄａｙの胃内投与を行った。投与日（４６日目）から１、３、６日後にマウスから糞便を採取し、ＰＢＳで懸濁した後に熱処理（７０℃、２０ｍｉｎ）し、希釈液をＬＢプレート（クロラムフェニコール ５μｇ／ｍｌを含む）に撒いて、４８時間後のコロニー数を測定した。
【００２６】
上記の動物試験において、投与開始後５６日目又は５７日目にマウスから脾臓を摘出し、１０％ ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（インビトロジェン）を含むＲＰＭＩ１６４０で細胞数を２×１０５／ｗｅｌｌに調整して９６ｗｅｌｌプレートに分注し、Ｃｏｎ Ａ（Ｗａｋｏ）を１０μｇ／ｍｌになるように添加して培養した。培養後の細胞上清に含まれるＩＦＮ−γをＢＩＯ Ｏｐｔ ＥＩＡＴＭ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。統計学的処理方法としてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔを用いた。
【００２７】
（アンカータンパク質の発現解析結果）
ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果において、納豆菌の主要な胞子コートタンパク質では遺伝子の発現量に差が見られた（図２）。特に、ｃｏｔＢと比較して、ｃｏｔＡ、ｃｏｔＥ、ｃｏｔＧは１００倍程度の高発現を示した。このうち、ＣｏｔＡ及びＣｏｔＥをアンカータンパク質として選択し、納豆菌ワクチンの創出を行った。
【００２８】
（宿主となる納豆菌の性質）
宿主として作製した組換え納豆菌株（ΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ×ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）では、カゼインプレート上のコロニーにおいて、カゼインタンパク質の分解に起因するハロー形成を示さなかった（図３）。一方で、ＡｐｒＥあるいはＮｐｒＥのいずれか１つのプロテアーゼ遺伝子を欠損させた納豆菌（それぞれΔａｐｒＥ：：ｓｐｃＲ、ΔｎｐｒＥ：：ｎｅｏＲ）はハローを形成した。
【００２９】
（キメラ遺伝子のシークエンス解析の結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４のキメラ遺伝子領域について、塩基配列をシークエンス解析した。結果として、キメラ遺伝子の全領域について正確な塩基配列が確認できた。
【００３０】
（ＴＴＣＣ Ｇ４の培養結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４をＳＤ培地で培養し培養開始から６、７、１１、１５、１９時間後のＯＤ６６０の経時変化を調べた結果、１１時間後に１．９２であったＯＤ６６０の値は、１９時間後には４．５４に達した（図４）。
【００３１】
（キメラ遺伝子の発現解析結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５をＳＤ培地で培養し、培養開始から７、１１、１５、１９時間後に菌体からＲＮＡ抽出を行い、これを逆転写して得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、ＴＴＣＣ Ｇ４のキメラ遺伝子ｃｏｔＥ−ｆｌｉＣとＴＴＣＣ Ｇ５のキメラ遺伝子ｃｏｔＡ−ｆｌｉＣの発現は、いずれも培養から１１時間後にピークを示した（図５）。
【００３２】
（キメラタンパク質の発現解析結果）
精製胞子からタンパク質を抽出し、ウエスタン解析によりＦｌｉＣタンパク質の発現を確認した。ＴＴＣＣ Ｇ４とＴＴＣＣ Ｇ５のそれぞれについて、キメラタンパク質のサイズに相当するバンドが確認できた（図６）。ＴＴＣＣ Ｇ４については、培養１１時間後、１５時間後、１９時間後、２３時間後についていずれもキメラタンパク質に相当するバンドが検出できた。
【００３３】
ウエスタン解析において、ＦｌｉＣタンパク質に相当するバンドの検出値（バンドの大きさ×密度）を算出した。その結果、培養１５時間後のＴＴＣＣ Ｇ４では１×１０１０ｃｆｕの胞子あたり１２．５μｇのＦｌｉＣタンパク質に相当するキメラタンパク質が発現していることが示唆された。
【００３４】
精製胞子の蛍光顕微鏡観察では、Ｗｉｌｄ ＴｙｐｅとＴＴＣＣ Ｇ５にはキメラタンパク質の存在を示す蛍光が見られなかったが、ＴＴＣＣ Ｇ４で明確な蛍光が見られた（図７）。更に、精製胞子のＦＡＣＳ解析では、ＴＴＣＣ Ｇ４はＷｉｌｄ Ｔｙｐｅに比べて明らかに強い蛍光強度に粒子数のピークを示し、ＦｌｉＣタンパク質が胞子表層に提示されていることが示唆された（図８）。
【００３５】
精製胞子のＦＡＣＳ解析における粒子数のピーク値は培養開始から１５時間後程度で最も強い蛍光強度を示し、その前後では蛍光強度が弱かった（図９）。尚、ＴＴＣＣ Ｇ４を培養から１５時間後に集菌した精製胞子について、これを凍結保存（−８０℃）した場合の影響を調べたが、ＦＡＣＳ解析において大きな差異は見られなかった。
【００３６】
（動物試験による納豆菌ワクチンの評価の結果）
ＴＴＣＣ Ｇ４を３連続日でマウスに経口投与した後、マウスの糞便中からはクロラムフェニコールに耐性を示す耐熱性のコロニーがみられ、ＰＢＳ、ＦｌｉＣタンパク質、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅを投与したマウスの糞便からはこのようなコロニーは検出されなかった。また、ＴＴＣＣ Ｇ４を１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ投与したマウスでは投与日から６日後まで、１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄの投与群では、投与日から３日後まで１０４ｃｆｕ／ｆｅｃｅｓ以上のＴＴＣＣ Ｇ４が糞便中に排泄された（図１０）。
【００３７】
各投与群のマウスから脾細胞を調製し、Ｃｏｎ Ａ刺激により産生されるＩＦＮ−γ量を比較したところ、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０１０ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群では、ＰＢＳ投与群やＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示し、ＴＴＣＣ Ｇ４（１０９ｃｆｕ／ｈｅａｄ）を投与した群ではＷｉｌｄ Ｔｙｐｅ投与群に比べ有意に高い値を示した（図１１）。投与動物の免疫応答を引き起こすためのコントロールである、ＦｌｉＣタンパク質５０μｇ／ｈｅａｄの投与群と比較した場合にも、ＴＴＣＣ Ｇ４の投与群のＩＦＮ−γ産生値はより高かった。ウエスタン解析によって、１０１０ｃｆｕのＴＴＣＣ Ｇ４ は１２．５μｇのＦｌｉＣタンパク質に相当するキメラタンパク質を発現していることが示唆されている。動物試験においてＴＴＣＣ Ｇ４は、投与しているＦｌｉＣ相当量以上の効果を示していることが考えられ、抗原運搬体としての納豆菌のアドバンテージが期待できる。
【００３８】
作製した組換え納豆菌の株、ＴＴＣＣ Ｇ４及びＴＴＣＣ Ｇ５を微生物寄託機関に寄託した。受領機関名：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、受領日：平成１９年３月８日、微生物：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ４；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ５；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４４。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上詳述したように、本発明は、納豆菌ワクチンに係るものであり、本発明により、実用化可能な有用な納豆菌ワクチンを提供することができる。本発明では、アンカータンパク質として、細胞（胞子）表層に存在するコートタンパク質ＣｏｔＥを用いることにより、細胞表層に抗原タンパク質を表層提示させて、従来法の胞子ワクチンと比べて高い発現量で抗原タンパク質を発現させることを可能とした。本発明は、納豆菌を利用した「食べるワクチン」を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＴＴＣＣ Ｇ４におけるａｍｙＥ遺伝子座の概略図を示す。
【図２】納豆菌の主要な胞子コートタンパク質の発現を示す。
【図３】カゼインプレート上で宿主納豆菌が示すプロテアーゼ活性を示す。
【図４】ＳＤ培地中におけるＴＴＣＣ Ｇ４の生育曲線を示す。
【図５】ウエスタン解析による、キメラ遺伝子ｃｏｔ−ｆｌｉＣの発現解析結果を示す。
【図６】キメラタンパク質Ｃｏｔ−ＦｌｉＣタンパク質の発現を示す。
【図７】蛍光顕微鏡による、胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の検出結果を示す。
【図８】ＦＡＣＳ解析による、胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の検出結果を示す。
【図９】ＴＴＣＣ Ｇ４の培養時間が胞子表層のＦｌｉＣタンパク質の発現に与える影響を示す。
【図１０】ＴＴＣＣ Ｇ４を胃内投与したマウスの糞便中に含まれるＴＴＣＣ Ｇ４の菌数を示す。
【図１１】ＣｏｎＡ刺激による脾細胞のＩＦＮ−γ産生量を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に、抗原タンパク質の遺伝子又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とする納豆菌ワクチン。
【請求項２】
抗原タンパク質が、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来の鞭毛タンパク質ＦｌｉＣである、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項３】
セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）又は中性プロテアーゼ（ＮｐｒＥ）の欠損株、あるいはその両方の欠損株である納豆菌を宿主として使用した、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項４】
納豆菌の胞子表層タンパク質の遺伝子ｃｏｔと、サルモネラ菌由来の鞭毛タンパク質の遺伝子ｆｌｉＣとのキメラ遺伝子を含む遺伝子領域を挿入して形質転換した組換え納豆菌ワクチンである、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項５】
組換え納豆菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ４；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４３である、請求項３又は請求項４に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項６】
納豆菌が、細胞表層にキメラタンパク質が発現する発現時期を指標として培養した納豆菌である、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項７】
Ｄｉｆｃｏ Ｓｐｏｒｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＤ培地）を用いた培養において、ＯＤ６６０＝１．５〜４．５の範囲で、胞子表層にキメラタンパク質を発現する、請求項６に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質の発現量が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とする納豆菌ワクチンの製造方法。
【請求項９】
キメラタンパク質が、“ＣｏｔＥ−抗原タンパク質”である、請求項８に記載の納豆菌ワクチンの製造方法。
【請求項１】
納豆菌の胞子コートタンパク質ＣｏｔＥの遺伝子に、抗原タンパク質の遺伝子又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の遺伝子を連結した遺伝子で形質転換した納豆菌ワクチンであって、該納豆菌の培養時間を因子として、細胞表層における抗原タンパク質の発現量を高めて該タンパク質を表層提示させたことを特徴とする納豆菌ワクチン。
【請求項２】
抗原タンパク質が、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来の鞭毛タンパク質ＦｌｉＣである、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項３】
セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）又は中性プロテアーゼ（ＮｐｒＥ）の欠損株、あるいはその両方の欠損株である納豆菌を宿主として使用した、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項４】
納豆菌の胞子表層タンパク質の遺伝子ｃｏｔと、サルモネラ菌由来の鞭毛タンパク質の遺伝子ｆｌｉＣとのキメラ遺伝子を含む遺伝子領域を挿入して形質転換した組換え納豆菌ワクチンである、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項５】
組換え納豆菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＴＣＣ Ｇ４；ＦＥＲＭ ＡＰ−２１２４３である、請求項３又は請求項４に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項６】
納豆菌が、細胞表層にキメラタンパク質が発現する発現時期を指標として培養した納豆菌である、請求項１に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項７】
Ｄｉｆｃｏ Ｓｐｏｒｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＤ培地）を用いた培養において、ＯＤ６６０＝１．５〜４．５の範囲で、胞子表層にキメラタンパク質を発現する、請求項６に記載の納豆菌ワクチン。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の納豆菌ワクチンを製造する方法であって、キメラタンパク質の発現量が所定のレベルに高まるまで培養することにより、細胞表層に存在する抗原タンパク質の発現量を調整乃至高めた納豆菌ワクチンを作製することを特徴とする納豆菌ワクチンの製造方法。
【請求項９】
キメラタンパク質が、“ＣｏｔＥ−抗原タンパク質”である、請求項８に記載の納豆菌ワクチンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
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【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２３１０６３（Ｐ２００８−２３１０６３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７５６７７（Ｐ２００７−７５６７７）
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（０００１０８６１６）タカノフーズ株式会社 (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（０００１０８６１６）タカノフーズ株式会社 (29)
【Ｆターム（参考）】
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