細胞の生産方法
【課題】従来のマイクロキャリアでの継代培養における問題点を解決することを目的とする。具体的には、培養した細胞を新たなマイクロキャリアに継代する際に、細胞増殖能の低下を防ぐことを目的とする。
【解決手段】細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、細胞培養担体及び新たな細胞培養担体が特定のポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体であり、継代工程が下記の工程である細胞の生産方法。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、新たな細胞培養担体を特定の割合で添加し、細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、間欠撹拌時間が８〜９６時間である工程。
【解決手段】細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、細胞培養担体及び新たな細胞培養担体が特定のポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体であり、継代工程が下記の工程である細胞の生産方法。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、新たな細胞培養担体を特定の割合で添加し、細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、間欠撹拌時間が８〜９６時間である工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の生産方法に関する。さらに詳しくは、細胞培養の分野において長期間にわたり細胞の培養を続ける際に、細胞密度が過剰になったとき、細胞数を減じて新しい細胞培養担体に移す必要があり、この操作を継代といい、本発明はこの継代工程を含む細胞の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の接着性細胞の継代の手順としては、以下のようになる。先ず、細胞培養担体で細胞を培養し増殖させる。細胞培養担体の全体に細胞が増殖したら、トリプシンやコラゲナーゼ等の蛋白分解酵素を作用させ、細胞培養担体から細胞を剥離させ、培地を加える。培地中に細胞を分散させた後、この細胞浮遊液を遠沈管に回収する。このとき細胞浮遊液中にはトリプシン等の酵素が含まれているため、これらの酵素を取り除く目的で、遠心分離により細胞を遠沈し、上清の培地を除く。その後、新たな培地を加えて細胞を再度分散させ、この細胞浮遊液を適度に希釈し、新しい細胞培養担体で培養を行う。
【０００３】
この方法では、細胞を剥離させる工程があるが、この工程におけるトリプシン等の蛋白質分解酵素の作用やピペッティングの条件が、細胞の生存率に大きく影響し、細胞の増殖能の回復に多大な時間を要する。
トリプシン等の蛋白質分解酵素を作用させない継代方法としては、細胞培養担体としてマイクロキャリアを用いた場合、マイクロキャリア間の継代方法として、細胞が新しいマイクロキャリアに乗り移ることを促進させるために、撹拌培養と静置培養を交互に行う間欠撹拌培養方法（非特許文献１）やカルシウムイオン濃度を通常培養の濃度の５０％に下げた培地での継代方法（非特許文献２）がある。しかし、これらの方法においても新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に継代することは難しく、細胞増殖能が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２１，２１１−２１３，１９９９
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２３，９８３−９９３，１９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記のマイクロキャリアでの継代培養における問題点を解決することを目的とする。具体的には、培養した細胞を新たなマイクロキャリアに継代する際に、細胞増殖能の低下を防ぐことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞の生産方法は、細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、細胞培養担体及び新たな細胞培養担体が細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体であり、継代工程が下記の工程であることを要旨とする。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、細胞の付着した細胞培養担体１〜９重量部に対して、新たな細胞培養担体を９重量部の割合で添加し、細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、間欠撹拌時間が８〜９６時間である工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞の生産方法で細胞を生産すると、細胞が新しいマイクロキャリアに均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において接着性細胞とは、固体表面に接着して増殖する細胞であれば特に限定されないが、例えば、上皮細胞（Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞及びＨｍＬｕ細胞等）、腫瘍細胞（Ｈｅｌａ細胞及びＶＡＣＯ細胞等）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞及びＤＢＡＥ細胞等）、白血球（ＨＩＴ−Ｔ１５細胞等）、線維芽細胞（ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ２１細胞及びＳＦＭＥ細胞等）、筋肉細胞（ＨＬ１細胞及びＣ２Ｃ１２細胞等）、神経／内分泌腺細胞（ＲＯＣ−１細胞及びＩＭＲ−３２細胞等）及び初代細胞（鶏胚初代細胞、ウズラ胚初代細胞及びウサギ腎初代細胞等）等が挙げられる。これらのうち、細胞増殖能を低下させないという観点から、上皮細胞及び初代細胞が好ましく、さらに好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨｍＬｕ細胞及び初代細胞、特に好ましくＶｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞及びＨｍＬｕ細胞である。
【０００９】
本発明で使用する細胞培養担体は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体である。
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【００１０】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）及びPro His Ser Arg Asn（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）及びPro His Ser Arg Asn（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端には、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでなる介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましい。
【００１１】
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端には、細胞接着性の観点から、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp配列（６６）、Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６７）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６８）、Gly Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（６９）、Gly Ala Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７０）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７１）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７４）、Gly Pro Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７５）、Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７６）及びGly Ala Ala Pro Gly Ala Ser配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp配列（６６）、Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６７）及びAla Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６８）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）が特に好ましい。
【００１２】
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端には、細胞接着性の観点から、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser配列（７９）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys配列（８０）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro配列（８１）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys配列（８２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser配列（８３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro配列（８４）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８５）、Cys Asp Ala Gly Tyr配列（８６）、Cys Asp Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８７）及びSer Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr配列（８８）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser配列（７９）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys配列（８０）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro配列（８１）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys配列（８２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser配列（８３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro配列（８４）及びSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８５）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）が特に好ましい。
【００１３】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個、次に好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１５個有するものである。なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００１４】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外に、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。
【００１５】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点等から、Gly及び／又はAlaを有する配列が好ましい。
【００１６】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列、｛Asp Gly Gly （Ala）f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly）i配列、（Ala）j配列、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）m配列、（Gly Pro Pro）n配列、（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）o配列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）p配列及び／又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）q配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e、｛Asp Gly Gly （Ala）f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）m配列及び／又は（Gly Pro Pro）n配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）m配列及び／又は（Gly Pro Pro）n配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものである。
【００１７】
なお、aは５〜１００の整数、bは１〜３３の整数、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００１８】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン（Gly）及び／又はアラニン（Ala）を含むことが好ましい。グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００１９】
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇｌｙ／Ａｌａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００２０】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでいてもよい。
【００２１】
（Gly Ala）a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１７）〜（１９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２０）〜（２２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２３）〜（２５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２６）〜（２８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２９）〜（３１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly （Ala）f Gly Gly Ala｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３２）〜（３４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３５）〜（３８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３９）〜（４１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４２）〜（４４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４５）〜（４７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Gly Val Pro）m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４８）〜（５０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Pro Pro）n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５１）〜（５３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５４）〜（５６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５７）〜（５９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（６０）〜（６２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２２】
これらの補助アミノ酸配列のうち、熱安定性の観点等から、配列番号（１７）、（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２６）、（２７）、（２９）、（３０）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３８）、（３９）、（４０）、（４２）、（４３）、（４５）、（４６）、（４８）、（４９）、（５１）、（５２）、（５４）、（５５）、（５７）、（５８）、（６０）又は（６１）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２４）、（２７）、（３０）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３８）、（４０）、（４３）、（４６）、（４９）、（５２）、（５５）、（５８）又は（６１）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（２０）、（２１）又は（３８）で表されるアミノ酸配列である。
【００２３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）を含む場合、（Ｙ）の含有個数は、熱安定性の観点等から、ポリペプチド（Ｐ）1分子中に、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１５である。また、ポリペプチド（Ｐ）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。
【００２４】
ポリペプチド（Ｐ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、ポリペプチド（Ｐ）は、細胞のポリペプチドの認識しやすさという観点から、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００２５】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。これらの場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
【００２６】
また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。
【００２７】
また、ポリペプチド（Ｐ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、細胞のポリペプチドの認識しやすさという観点から、ポリペプチド（Ｐ）１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。
【００２８】
ポリペプチド（Ｐ）の重量平均分子量（以下、Ｍｗ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。
【００２９】
なお、ポリペプチド（Ｐ）のＭｗは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。
【００３０】
好ましいポリペプチド（Ｐ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がArg Gly Asp配列（ｘ１）の場合
Arg Gly Asp配列（ｘ１）の１３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２１）（ｙ１）の１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のポリペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；（ｘ１）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２０）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３８）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。
【００３１】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がIle Lys Val Ala Val配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）をGly Ala Ala Pro Gly Ala Ser配列（７７）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）をSer Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr配列（８８）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。
【００３２】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）をGly Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（６９）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）をCys Asp Ala Gly Tyr配列（８６）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。
【００３３】
また、（１）〜（３）のポリペプチドの他、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）及びLeu Asp Val配列を含有するＭｗ約６万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）を含有するＭｗ約３万のポリペプチド｝も好ましく使用できる｛ただし、これらのポリペプチドは天然に由来し、補助アミノ酸配列（Ｙ）が含まれていない。よって、熱安定性等が上記の（１）〜（３）よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平２−３１１４９８号公報に開示されている。｝。
【００３４】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に合成される人工ポリペプチドあってもよく、人工ポリペプチドである場合は、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって製造する。すなわち、人工ポリペプチドは、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。
ポリペプチド（Ｐ）は、動物由来成分を含まないという観点から、人工ポリペプチドであることが好ましい。
【００３５】
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。人工ポリペプチドを容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。
【００３６】
マイクロキャリア（Ａ）の材質としては、接着性細胞が接着できる材質であれば特に限定されないが、細胞毒性の観点等から以下の物質を主成分とすることが好ましい。なお、主成分とは、材質の重量を基準として、以下の物質の含有量が９０重量％以上であることを意味する。
（１）合成高分子：ポリ（メタ）アクリル酸（塩）、ビニル樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、ナイロン及びポリカーボネート等。
（２）天然高分子：セルロース、セルロース誘導体（セルロースジアセテート及びセルローストリアセテート等）及びデキストラン等。
（３）無機物：酸化アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チタン、シリカ及びガラス等。
【００３７】
これらのうち、細胞親和性の観点から、合成高分子、天然高分子及びハイドロキシアパタイトが好ましく、さらに好ましくは合成高分子及び天然高分子、特に好ましくは合成高分子、最も好ましくはポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
【００３８】
ポリ（メタ）アクリル酸（塩）としては、下記（１）〜（３）のポリマー等が含まれる。
（１）特開昭５５−１３３４１３号公報等に記載の水溶液重合（断熱重合、薄膜重合又は噴霧重合等）により得られる架橋ポリアクリル酸（塩）。
（２）特公昭５４−３０７１０号公報、特開昭５６−２６９０９号公報又は特開平１１−５８０８号公報等に記載の逆相懸濁重合により得られる架橋ポリアクリル酸（塩）。
（３）特開２００１−２９３５号公報、特開２００３−０５２７４２号公報、特開２００３−０８２２５０号公報、特開２００３−１６５８８３号公報、特開２００３−１７６４２１号公報、特開２００３−１８３５２８号公報、特開２００３−１９２７３２号公報、特開２００３−２２５５６５号公報、特開２００３−２３８６９６号公報、特開２００３−３３５９７０号公報、特開２００４−０９１６７３号公報、特開２００４−１２１４００号公報、特開２００４−１２３８３５号公報、特開２００５−０７５９８２号公報、特開２００５−０９５７５９号公報、特開２００５−０９７５６９号公報、特開２００５−１８６０１５号公報、特開２００５−１８６０１６号公報、特開２００５−２４７９３１号公報等に記載された架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）。
【００３９】
これらのうち、細胞の担体への接着性等の観点から、（２）及び（３）が好ましい。すなわち、カルボキシル基を有するモノマーを重合して得られる架橋重合体が好ましく、さらに好ましくは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
なお、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及び／又はメタクリル酸を意味し、酸（塩）とは、酸及び／又は酸塩を意味する。
【００４０】
マイクロキャリア（Ａ）の形態としては中実型と多孔質型とが含まれ、いずれも使用できるが、細胞への栄養、酸素の供給効率及び細胞の回収率の観点等から、中実型が好ましい。また、マイクロキャリアの形状としては、球状及び扁平（楕円）等のいずれも使用できる。
【００４１】
マイクロキャリア（Ａ）の粒子径（μｍ）は、中実型の場合、２０〜２，０００が好ましく、さらに好ましくは４０〜１，０００、特に好ましくは８０〜５００である。一方、多孔質型の場合、粒子径（μｍ）は、３０〜２５，０００が好ましく、さらに好ましくは６０〜１２，０００、特に好ましくは１２０〜６，０００である。扁平状の場合、最大径（μｍ）が２０〜２０，０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１０，０００、特に好ましくは１００〜５，０００である。これらの範囲内であると、細胞の増殖量がさらに高くなる。
（Ａ）の粒子径又は最大径の分布は、細胞増殖の均一性の観点から、上記粒子径又は最大径の範囲の粒子径又は最大径を有する粒子の重量が、マイクロキャリア（Ａ）の重量を基準として、９０〜１００重量％となることが好ましく、さらに好ましくは９５〜１００重量％である。
【００４２】
マイクロキャリア（Ａ）の真比重は特に制限ないが、（Ａ）を培地とともに撹拌しながら培養する一般的な方法において、撹拌中は（Ａ）が浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ましい。このような観点から、（Ａ）の真比重（ｇ／ｃｍ3）は、１.００〜１.１０が好ましく、さらに好ましくは１.０１〜１.０８、特に好ましくは１．０１〜１．０５である。
【００４３】
ポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア又はポリペプチドを有しないマイクロキャリア支持体は、市場から容易に入手でき、以下のような商品等が使用できる。
（１）ポリスチレン製：ナルジェヌンク社製バイオシロン（Biosilon）、ソロヒル社製プラスチックビーズ（Plastic beads）及びラックス社製サイトスフェア（Cytosphere）等。
（２）ポリアクリルアミド製：バイオラッド（株）製バイオキャリア（Biocarrier）等。
（３）ポリウレタン製：イノアック（株）製ＰＵＦ等。
（４）セルロース製：バイオマテリアル（株）製セルスノウ（Cellsnow）等。
（５）デキストラン製：アムシャムファルマシア社製サイトデックス（Cytodex）等。
（６）ガラス製：スコット社製シラン（SIRAN）等。
【００４４】
マイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を含有させるには、（Ｐ）は、支持体の表面に含有していればよく、（Ｐ）は化学結合（イオン結合、水素結合及び共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって、支持体の表面に結合されている。これらのうち、ポリペプチドがマイクロキャリアから脱離しないという観点から化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００４５】
マイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を共有結合させる方法は公知の方法で行うことができる。例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法が挙げられ、具体的には、以下の（１）〜（３）の通りである。
【００４６】
（１）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとポリペプチド（Ｐ）を含有しないマイクロキャリアの支持体（以下、Ｐ未含有支持体）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが支持体に由来する部分）｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをアミド結合できる。
【００４７】
カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００４８】
（２）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとＰ未含有支持体のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ。Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒが支持体に由来｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのイミダゾール誘導体に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをＮ−Ｃ結合できる。
【００４９】
カルボニルジイミダゾール化合物としては、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
【００５０】
（３）ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものとＰ未含有支持体のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをエステル結合できる。
【００５１】
ポリペプチド（Ｐ）をＰ未含有支持体に、物理吸着、イオン結合及び／又は水素結合させる方法としては、溶媒等にポリペプチド（Ｐ）とＰ未含有支持体とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、酸及び／又は塩基を０．００１〜５０重量％（好ましくは０．００５〜３０重量％、さらに好ましくは０．０１〜１０重量％）含有する水溶液等（特開２００３−１８９８４８号公報等に記載）が使用できる。
これらの溶媒の中で、ポリペプチドの結合効率の観点から、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びにイオン交換蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液である。
【００５２】
また細胞の細胞培養担体への接着性等の観点からマイクロキャリア（Ａ）の表面を正に荷電させたほうが好ましい。表面を正に荷電させたマイクロキャリア（Ａ）の作製方法としては、（ｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物と混合する方法、（ｉｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を反応させる方法が挙げられる。
【００５３】
（ｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を混合する方法としては、（Ａ）がカルボキシル基を有する場合、（Ａ）と１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を溶媒中で混合することで、（Ａ）のカルボキシル基と１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物との間にイオン結合が形成し、細胞培養担体に正に荷電した官能基（Ｂ）を含有させることができる。
この方法（ｉ）で使用できる１級アミノ基含有化合物としては、アミノメタン、アミノエタン等のアミノアルカン及びこの塩、ジアミノエタン等のジアミノアルカン（アルキレンジアミン）及びこの塩並びにリジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸及びこの塩が挙げられる。
２級アミノ基含有化合物としては、ジメチルアミン等の２つの炭化水素基で置換されたアミン及びこの塩並びに２−メチルイミダゾール、ヒスチジン等のイミダゾール類及びこの塩が挙げられる。
３級アミノ基含有化合物としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン等の３つの炭化水素基で置換されたアミン及びこの塩が挙げられる。
第４級アンモニオ基含有化合物としては、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム等の４つの炭化水素で置換されたアンモニウム及びこの塩が挙げられる。
溶媒としては１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を溶解するものであれば特に制限はないが、安全性の観点から水が好ましい。
【００５４】
（ｉｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を反応させる方法としては、前述のマイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を共有結合させる方法等と同様の方法が挙げられる。使用できる１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物としては、上記と同様のものが挙げられる。
【００５５】
細胞培養担体は、マイクロキャリア（Ａ）を含んでなるものであれば特に制限が無い。
【００５６】
ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、細胞接着性等の観点から、細胞培養担体１ｇ当たり、５ｎｇ／ｇ〜５００ｍｇ／ｇが好ましく、さらに好ましくは５０ｎｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、次に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、次に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜２０ｍｇ／ｇ、特に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜５ｍｇ／ｇ、最も好ましくは５μｇ〜５ｍｇ／ｇである。
【００５７】
なお、ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、（Ｐ）の含有量が５００μｇ／ｇを超える場合、Ｂｉｕｒｅｔ法（たとえば、日本生化学会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」第４５〜５５頁（１９７９年１２月１１日；株式会社東京化学同人発行）等により求められる。
【００５８】
一方、ポリペプチド（Ｐ）の含有量が５００μｇ／ｇ以下の場合、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（たとえば、日本生化学会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」第４５〜５５頁（１９７９年１２月１１日；株式会社東京化学同人発行）等により求められる。
【００５９】
また、免疫学的測定法（特開２００４−０４９９２１号公報等に記載）を利用して測定することもできる。具体的には、（１）ポリペプチド（Ｐ）の含有量が既知である細胞培養用担体｛Ｂｉｕｒｅｔ法やＫｊｅｌｄａｈｌ法等で（Ｐ）の含有量が既知になった細胞培養用担体｝を生理食塩水に浸漬し、（Ｐ）と結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体）とを反応させ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を吸光度測定し、検量線（（Ｐ）の含有量とそれに対する吸光度）を作成する。（２）同様に検体（（Ｐ）の含有量が未知である細胞培養用担体）の吸光度を測定する。（１）で得られた検量線と（２）で得られた吸光度から、検体の（Ｐ）の含有量を求めることができる。
なお、測定試料は、減圧乾燥機｛１２０℃、０．１ｋＰａ以下｝で１時間乾燥したものを用いる。
【００６０】
本発明の細胞の生産方法は、細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、継代工程が下記の工程である細胞の生産方法である。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、細胞の付着した細胞培養担体１〜９重量部に対して、新たな細胞培養担体を９重量部の割合で添加し、かつ細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６ｇ/〜１０ｇ/Ｌである工程。
【００６１】
細胞培養担体及び新たな細胞培養担体は、前述のポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体を使用する。
【００６２】
細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養する工程を培養工程、その後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる工程を継代工程とし、以下に説明する。
【００６３】
＜培養工程＞
培養工程に用いる細胞培養担体は、前述の物を使用する。
培養工程に用いる培養用培地としては、血清培地及び無血清培地のいずれも使用可能である。血清培地としては、用いる細胞の種類に応じて、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、ＯＰＴＩ ＰＲＯTM ＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ ＡＴＧTM培地及びこれらの混合培地が挙げられる。
これらの培地の中で、培地の調製の観点から、ＤＭＥＭ培地及びＭＥＭ培地が好ましい。
【００６４】
培養条件としては、特に制限なく、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２９体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しながら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【００６５】
播種する細胞の量としては、用いる細胞培養担体の種類や、細胞の種類等によって異なるが、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１，０００万個が好ましく、さらに好ましくは１００〜１００万個、特に好ましくは１，０００〜１０万個である。
【００６６】
＜継代工程＞
上記培養工程の後に、培養で得られた細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる。
【００６７】
上記培養工程終了後の細胞が付着した細胞培養担体（以下、細胞付着担体と略す）の入った容器内に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体と培養用培地（Ｃ）を添加し、間欠攪拌を実施する。培養工程で使用した培地は、除去する必要はない。
培養用培地（Ｃ）としては、前述の培養用培地と同様のものが使用できる。
（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体において、新たな細胞培養担体を（Ｃ）に浸漬させる際の（Ｃ）と新たな細胞培養担体の使用比率は、継代効率の観点から、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌである。
【００６８】
新たな細胞培養担体を（Ｃ）に浸漬させる浸漬温度は、細胞培養担体の性能保持と培地の劣化の観点から、２５〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜３８℃である。
【００６９】
細胞付着担体と培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体との割合（重量比率）は、１〜９重量部：９重量部であり、細胞増殖の観点から、好ましくは１〜４．５重量部：９重量部、特に好ましくは１〜３重量部：９重量部である。
細胞付着担体の新たな細胞培養担体９重量部に対する割合が、１重量部未満では継代効率が悪くなり、９重量部を超えると細胞増殖性が悪くなる。
なお、細胞付着担体の重量は、付着した細胞を含めた重量である。
【００７０】
継代工程における細胞培養担体濃度は、培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、継代効率の観点から、６ｇ/Ｌ〜９ｇ/Ｌが好ましく、さらに好ましくは６ｇ/Ｌ〜８ｇ/Ｌである。
細胞培養担体濃度が、６ｇ／Ｌ未満では継代効率が悪くなり、１０ｇ／Ｌを超えると細胞増殖性が悪くなる。
継代工程における細胞培養担体濃度は、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体と培養用培地（Ｃ）を添加した後に、（Ｃ）を除去する又は（Ｃ）を追加することにより調製できる。
なお、細胞培養担体濃度は、継代工程で添加した培養用培地（Ｃ）の体積に対する、細胞付着担体及び継代工程で添加した新たな細胞培養担体の合計重量である。また、細胞付着担体の重量は、付着した細胞を含めた重量である。
【００７１】
細胞が付着した細胞培養担体に培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する。
この工程において間欠撹拌とは攪拌と静置を繰り返し行う操作である。
それぞれの攪拌時間は、継代の観点から、１〜３０分が好ましく、さらに好ましくは１〜２０分、特に好ましくは１〜１０分である。
それぞれの静置時間は、継代の観点から、５〜１２０分が好ましく、さらに好ましくは５〜９０分、特に好ましくは５〜６０分である。
撹拌と静置を繰り返し行うが、合計の間欠撹拌時間としては、８〜９６時間であり、継代の観点から、好ましくは１２〜７２時間、特に好ましくは１６〜４８時間である。間欠撹拌時間が８時間未満では、細胞の移動が不十分でマイクロキャリアへの接着率が低下する。９６時間を越えると細胞増殖性が悪くなる。
間欠攪拌時の温度としては、細胞への損傷の観点から、５〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは１５〜４５、特に好ましくは２５〜４０である。
【００７２】
継代工程の終了後、培地交換をせずに通常の細胞培養を実施する。通常の細胞培養とは、間欠攪拌をせずに連続攪拌を細胞培養担体が均一に培地中を浮遊しうる回転数で実施する培養である。培養温度は３５〜３９℃が好ましい。必要により培地を追加してもよく、細胞培養における細胞培養担体濃度は３ｇ/Ｌ〜６ｇ/Ｌが好ましい。
細胞培養担体のコンフルエント率が８０〜１００％になるまで培養する。その際、必要総細胞数に到達していなければ、上記継代工程を再度実施し、さらに培養する。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
【００７４】
＜製造例１＞
＜マイクロキャリア（Ａ）の調製＞
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン６２４部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート３．１部を仕込み、窒素バブリングを３０分以上行って、溶存空気を追い出し７５℃まで昇温した。
別の反応器に８０％アクリル酸水溶液１７３部を仕込み、冷却しながら２８％水酸化ナトリウム水溶液２０７部を加えて中和した。この水溶液に架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝０．９０部及び重合開始剤｛過硫酸カリウム｝０．２７８部、連鎖移動剤｛次亜リン酸ナトリウム｝０．０５３部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より６．５ｍｌ／分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中（撹拌速度は５００ｒｐｍ）のシクロヘキサン液中に約１時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって１６０部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に１２０℃で２時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが７５μｍのふるい及び１０６μｍのふるい（ＪＩＳ Ｚ８８０１−１：２０００）により分級して、粒子径７５〜１０６μｍの粒子｛架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子｝（Ｇ）を得た。
吸水性樹脂（Ｇ）１ｇ、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩３．８３ｇ及びアミノエタノール・塩酸塩３．９０ｇに、塩化ナトリウムを０．８５％で含有する０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のリン酸緩衝液（以下、ｐＨ５．２のＰＢＳ）２５ｍＬを加え、２５℃で撹拌し、４時間反応させた後、反応溶液を吸引除去した。イオン交換水の１００ｍLを添加し１時間撹拌後、吸引除去する洗浄操作を５回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥して吸水性樹脂（Ｈ）を得た。吸水性樹脂（Ｈ）１ｇ、Ｎ−ジエチルアミノエチルクロライド・塩酸塩８．６ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液４．３５ｇに、イオン交換水１０ｍＬを加え、６０℃で撹拌し、５時間反応させた後、反応溶液を吸引除去した。イオン交換水の１００ｍLを添加し１時間撹拌後、吸引除去する洗浄操作を５回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥して吸水性樹脂（Ｉ−１）を得た。（Ｉ−１）の保水量は１０ｇ／ｇであった。
【００７５】
＜ポリペプチド（Ｐ１）の調製＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）１３個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列（２１）１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のペプチド「プロネクチンＦ」を製造し、ポリペプチド（Ｐ１）とした。
【００７６】
＜ポリペプチド（Ｐ１）が結合した吸水性樹脂の調製＞
吸水性樹脂（Ｉ−１）１ｇに、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）を６０ｍＭの濃度で含む、０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のＰＢＳ溶液の１５ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、０．５時間反応させて、変性吸水性樹脂を得た。
次に、この変性吸水性樹脂に、ポリペプチド（Ｐ１）を２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含む０．２Ｍ、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液の1ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、２時間反応させた後、反応溶液を吸引除去し、ＰＢＳの４０ｍLを添加、吸引除去する洗浄操作を５回行い、さらにイオン交換水の４０ｍＬを添加、吸引除去する洗浄操作を２回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥してマイクロキャリア（ポリペプチド結合吸水性樹脂）（Ａ−１）を得た。Ａ−１の真比重は、１.０３であった。
【００７７】
＜ＭＤＣＫ細胞を用いた継代評価＞
＜実施例１＞
＜培養工程＞
スピンナーフラスコへ、マイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム０．０２％、リン酸二水素カリウム０．０７６％及び塩化ナトリウム０．８５％を含む。以下、実施例１においてＰＢＳと略記する。）１００ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTM ＳＦＭ：インビトロジェン社製）に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン Ｂ、カスケード社製）を０．２％で含有させた培地を２０ｍL添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を５０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＭＤＣＫ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。その後、培養容量が１００ｍＬとなるように無血清培地を添加した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、３０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面が細胞で覆われるまで４日間培養を行い細胞が付着した（Ａ−１）を得た。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地３００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．９ｇを浸漬に使用した無血清培地３００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地を２５０ｍＬ除去した。１．２ｇのマイクロキャリアが無血清培地１５０ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
間欠撹終了後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を２５０ｍｌ添加した。
＜継代後の培養工程＞
継代工程終了後、３０ｒｐｍの攪拌をしながら培養した。培養温度等の条件は培養工程と同様にした。
【００７８】
＜マイクロキャリアへの細胞接着率評価＞
継代後の培養工程開始後、培養４日目にサンプリングし、マイクロキャリアへの接着率を下記に記載の方法で測定した。
マイクロキャリアへの細胞接着率評価は次のように実施した。細胞培養担体含有培養液０．５ｍＬを取り、顕微鏡にて細胞が１つ以上接着しているマイクロキャリアの数（Ｍ）と細胞が接着していないマイクロキャリアの数（Ｎ）を測定する。測定後、以下の式からマイクロキャリアへの細胞接着率を算出し、結果を表１に示した。
マイクロキャリアへの細胞接着率（％）＝｛Ｍ／（Ｍ＋Ｎ）｝×１００
【００７９】
＜細胞増殖性評価＞
継代後の培養工程開始後、培養４日後の細胞培養液を０．５ｍＬ採り、培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％及びクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数し、培地中の細胞濃度（１０5個／ｍＬ）を測定し、結果を表１に示した。
【００８０】
＜実施例２＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地９００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）２．７ｇを浸漬に使用した無血清培地９００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ５００ｍＬ除去した。３．０ｇのマイクロキャリアが無血清培地５００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を５００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８１】
＜実施例３＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地１００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇを浸漬に使用した無血清培地１００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１００ｍＬ除去した。０．６ｇのマイクロキャリアが無血清培地１００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を１００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８２】
＜実施例４＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地９００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）２．７ｇを浸漬に使用した無血清培地９００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ７００ｍＬ除去した。３．０ｇのマイクロキャリアが無血清培地３００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を７００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８３】
＜実施例５＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地１００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇを浸漬に使用した無血清培地１００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１４０ｍＬ除去した。０．６ｇのマイクロキャリアが無血清培地６０ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を１４０ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８４】
＜実施例６＞
実施例１において、継代工程における間欠攪拌時間を１６時間に変更した以外は、実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
【００８５】
＜実施例７＞
実施例１において、継代工程における間欠攪拌時間を９６時間に変更した以外は、実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
【００８６】
＜比較例１＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地１８００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）５．４ｇを浸漬に使用した無血清培地１８００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１０８７ｍＬ除去した。５．７ｇのマイクロキャリアが無血清培地７１３ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を１０８７ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８７】
＜比較例２＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地７５ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．２２５ｇを浸漬に使用した無血清培地７５ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１０９ｍＬ除去した。０．５２５ｇのマイクロキャリアが無血清培地６６ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を６６ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８８】
＜比較例３＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地３００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．９ｇを浸漬に使用した無血清培地３００ｍｌとともに投入した。間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。継代工程後４日間培養した。
【００８９】
＜比較例４＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地３００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．９ｇを浸漬に使用した無血清培地３００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ３００ｍＬ除去した。１．２ｇのマイクロキャリアが無血清培地１００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を３００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００９０】
＜比較例５＞
実施例１において、間欠攪拌時間を６時間に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９１】
＜比較例６＞
実施例１において、間欠攪拌時間を１２０時間に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９２】
【表１】
【００９３】
表１より、本発明の実施例１〜５の細胞接着率及び細胞増殖性が、比較例１及び２の結果よりもはるかに優れることが分かる。すなわち、本発明の細胞生産方法を実施することで、細胞接着率が優れることからマイクロキャリアに均一に細胞を継代することができることが分かり、比較例に比べて細胞増殖性が向上していることから、細胞増殖能を低下させることなく継代することができることが分かり、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施できていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の細胞の生産方法で細胞を生産すると、細胞が新しいマイクロキャリアに均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
したがって、本発明はウイルス培養用細胞の生産、有用タンパク質発現細胞の生産等、あらゆる接着性細胞の培養生産に有効である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の生産方法に関する。さらに詳しくは、細胞培養の分野において長期間にわたり細胞の培養を続ける際に、細胞密度が過剰になったとき、細胞数を減じて新しい細胞培養担体に移す必要があり、この操作を継代といい、本発明はこの継代工程を含む細胞の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の接着性細胞の継代の手順としては、以下のようになる。先ず、細胞培養担体で細胞を培養し増殖させる。細胞培養担体の全体に細胞が増殖したら、トリプシンやコラゲナーゼ等の蛋白分解酵素を作用させ、細胞培養担体から細胞を剥離させ、培地を加える。培地中に細胞を分散させた後、この細胞浮遊液を遠沈管に回収する。このとき細胞浮遊液中にはトリプシン等の酵素が含まれているため、これらの酵素を取り除く目的で、遠心分離により細胞を遠沈し、上清の培地を除く。その後、新たな培地を加えて細胞を再度分散させ、この細胞浮遊液を適度に希釈し、新しい細胞培養担体で培養を行う。
【０００３】
この方法では、細胞を剥離させる工程があるが、この工程におけるトリプシン等の蛋白質分解酵素の作用やピペッティングの条件が、細胞の生存率に大きく影響し、細胞の増殖能の回復に多大な時間を要する。
トリプシン等の蛋白質分解酵素を作用させない継代方法としては、細胞培養担体としてマイクロキャリアを用いた場合、マイクロキャリア間の継代方法として、細胞が新しいマイクロキャリアに乗り移ることを促進させるために、撹拌培養と静置培養を交互に行う間欠撹拌培養方法（非特許文献１）やカルシウムイオン濃度を通常培養の濃度の５０％に下げた培地での継代方法（非特許文献２）がある。しかし、これらの方法においても新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に継代することは難しく、細胞増殖能が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２１，２１１−２１３，１９９９
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２３，９８３−９９３，１９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記のマイクロキャリアでの継代培養における問題点を解決することを目的とする。具体的には、培養した細胞を新たなマイクロキャリアに継代する際に、細胞増殖能の低下を防ぐことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞の生産方法は、細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、細胞培養担体及び新たな細胞培養担体が細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体であり、継代工程が下記の工程であることを要旨とする。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、細胞の付着した細胞培養担体１〜９重量部に対して、新たな細胞培養担体を９重量部の割合で添加し、細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、間欠撹拌時間が８〜９６時間である工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞の生産方法で細胞を生産すると、細胞が新しいマイクロキャリアに均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において接着性細胞とは、固体表面に接着して増殖する細胞であれば特に限定されないが、例えば、上皮細胞（Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞及びＨｍＬｕ細胞等）、腫瘍細胞（Ｈｅｌａ細胞及びＶＡＣＯ細胞等）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞及びＤＢＡＥ細胞等）、白血球（ＨＩＴ−Ｔ１５細胞等）、線維芽細胞（ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ２１細胞及びＳＦＭＥ細胞等）、筋肉細胞（ＨＬ１細胞及びＣ２Ｃ１２細胞等）、神経／内分泌腺細胞（ＲＯＣ−１細胞及びＩＭＲ−３２細胞等）及び初代細胞（鶏胚初代細胞、ウズラ胚初代細胞及びウサギ腎初代細胞等）等が挙げられる。これらのうち、細胞増殖能を低下させないという観点から、上皮細胞及び初代細胞が好ましく、さらに好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨｍＬｕ細胞及び初代細胞、特に好ましくＶｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞及びＨｍＬｕ細胞である。
【０００９】
本発明で使用する細胞培養担体は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体である。
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【００１０】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）及びPro His Ser Arg Asn（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）及びPro His Ser Arg Asn（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端には、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでなる介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましい。
【００１１】
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端には、細胞接着性の観点から、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp配列（６６）、Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６７）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６８）、Gly Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（６９）、Gly Ala Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７０）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７１）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７４）、Gly Pro Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７５）、Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７６）及びGly Ala Ala Pro Gly Ala Ser配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp配列（６６）、Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６７）及びAla Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６８）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）が特に好ましい。
【００１２】
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端には、細胞接着性の観点から、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser配列（７９）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys配列（８０）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro配列（８１）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys配列（８２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser配列（８３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro配列（８４）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８５）、Cys Asp Ala Gly Tyr配列（８６）、Cys Asp Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８７）及びSer Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr配列（８８）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser配列（７９）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys配列（８０）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro配列（８１）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys配列（８２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser配列（８３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro配列（８４）及びSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８５）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）が特に好ましい。
【００１３】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個、次に好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１５個有するものである。なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００１４】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外に、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。
【００１５】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点等から、Gly及び／又はAlaを有する配列が好ましい。
【００１６】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列、｛Asp Gly Gly （Ala）f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly）i配列、（Ala）j配列、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）m配列、（Gly Pro Pro）n配列、（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）o配列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）p配列及び／又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）q配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e、｛Asp Gly Gly （Ala）f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）m配列及び／又は（Gly Pro Pro）n配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）m配列及び／又は（Gly Pro Pro）n配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものである。
【００１７】
なお、aは５〜１００の整数、bは１〜３３の整数、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００１８】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン（Gly）及び／又はアラニン（Ala）を含むことが好ましい。グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００１９】
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇｌｙ／Ａｌａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００２０】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでいてもよい。
【００２１】
（Gly Ala）a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１７）〜（１９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２０）〜（２２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２３）〜（２５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２６）〜（２８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２９）〜（３１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly （Ala）f Gly Gly Ala｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３２）〜（３４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３５）〜（３８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３９）〜（４１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４２）〜（４４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４５）〜（４７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Gly Val Pro）m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４８）〜（５０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Pro Pro）n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５１）〜（５３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５４）〜（５６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５７）〜（５９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（６０）〜（６２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２２】
これらの補助アミノ酸配列のうち、熱安定性の観点等から、配列番号（１７）、（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２６）、（２７）、（２９）、（３０）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３８）、（３９）、（４０）、（４２）、（４３）、（４５）、（４６）、（４８）、（４９）、（５１）、（５２）、（５４）、（５５）、（５７）、（５８）、（６０）又は（６１）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２４）、（２７）、（３０）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３８）、（４０）、（４３）、（４６）、（４９）、（５２）、（５５）、（５８）又は（６１）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（２０）、（２１）又は（３８）で表されるアミノ酸配列である。
【００２３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）を含む場合、（Ｙ）の含有個数は、熱安定性の観点等から、ポリペプチド（Ｐ）1分子中に、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１５である。また、ポリペプチド（Ｐ）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。
【００２４】
ポリペプチド（Ｐ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、ポリペプチド（Ｐ）は、細胞のポリペプチドの認識しやすさという観点から、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００２５】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。これらの場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
【００２６】
また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。
【００２７】
また、ポリペプチド（Ｐ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、細胞のポリペプチドの認識しやすさという観点から、ポリペプチド（Ｐ）１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。
【００２８】
ポリペプチド（Ｐ）の重量平均分子量（以下、Ｍｗ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。
【００２９】
なお、ポリペプチド（Ｐ）のＭｗは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。
【００３０】
好ましいポリペプチド（Ｐ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がArg Gly Asp配列（ｘ１）の場合
Arg Gly Asp配列（ｘ１）の１３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２１）（ｙ１）の１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のポリペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；（ｘ１）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２０）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３８）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。
【００３１】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がIle Lys Val Ala Val配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）をGly Ala Ala Pro Gly Ala Ser配列（７７）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）をSer Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr配列（８８）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。
【００３２】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）をGly Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（６９）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）をCys Asp Ala Gly Tyr配列（８６）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。
【００３３】
また、（１）〜（３）のポリペプチドの他、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）及びLeu Asp Val配列を含有するＭｗ約６万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）を含有するＭｗ約３万のポリペプチド｝も好ましく使用できる｛ただし、これらのポリペプチドは天然に由来し、補助アミノ酸配列（Ｙ）が含まれていない。よって、熱安定性等が上記の（１）〜（３）よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平２−３１１４９８号公報に開示されている。｝。
【００３４】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に合成される人工ポリペプチドあってもよく、人工ポリペプチドである場合は、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって製造する。すなわち、人工ポリペプチドは、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。
ポリペプチド（Ｐ）は、動物由来成分を含まないという観点から、人工ポリペプチドであることが好ましい。
【００３５】
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。人工ポリペプチドを容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。
【００３６】
マイクロキャリア（Ａ）の材質としては、接着性細胞が接着できる材質であれば特に限定されないが、細胞毒性の観点等から以下の物質を主成分とすることが好ましい。なお、主成分とは、材質の重量を基準として、以下の物質の含有量が９０重量％以上であることを意味する。
（１）合成高分子：ポリ（メタ）アクリル酸（塩）、ビニル樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、ナイロン及びポリカーボネート等。
（２）天然高分子：セルロース、セルロース誘導体（セルロースジアセテート及びセルローストリアセテート等）及びデキストラン等。
（３）無機物：酸化アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チタン、シリカ及びガラス等。
【００３７】
これらのうち、細胞親和性の観点から、合成高分子、天然高分子及びハイドロキシアパタイトが好ましく、さらに好ましくは合成高分子及び天然高分子、特に好ましくは合成高分子、最も好ましくはポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
【００３８】
ポリ（メタ）アクリル酸（塩）としては、下記（１）〜（３）のポリマー等が含まれる。
（１）特開昭５５−１３３４１３号公報等に記載の水溶液重合（断熱重合、薄膜重合又は噴霧重合等）により得られる架橋ポリアクリル酸（塩）。
（２）特公昭５４−３０７１０号公報、特開昭５６−２６９０９号公報又は特開平１１−５８０８号公報等に記載の逆相懸濁重合により得られる架橋ポリアクリル酸（塩）。
（３）特開２００１−２９３５号公報、特開２００３−０５２７４２号公報、特開２００３−０８２２５０号公報、特開２００３−１６５８８３号公報、特開２００３−１７６４２１号公報、特開２００３−１８３５２８号公報、特開２００３−１９２７３２号公報、特開２００３−２２５５６５号公報、特開２００３−２３８６９６号公報、特開２００３−３３５９７０号公報、特開２００４−０９１６７３号公報、特開２００４−１２１４００号公報、特開２００４−１２３８３５号公報、特開２００５−０７５９８２号公報、特開２００５−０９５７５９号公報、特開２００５−０９７５６９号公報、特開２００５−１８６０１５号公報、特開２００５−１８６０１６号公報、特開２００５−２４７９３１号公報等に記載された架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）。
【００３９】
これらのうち、細胞の担体への接着性等の観点から、（２）及び（３）が好ましい。すなわち、カルボキシル基を有するモノマーを重合して得られる架橋重合体が好ましく、さらに好ましくは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
なお、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及び／又はメタクリル酸を意味し、酸（塩）とは、酸及び／又は酸塩を意味する。
【００４０】
マイクロキャリア（Ａ）の形態としては中実型と多孔質型とが含まれ、いずれも使用できるが、細胞への栄養、酸素の供給効率及び細胞の回収率の観点等から、中実型が好ましい。また、マイクロキャリアの形状としては、球状及び扁平（楕円）等のいずれも使用できる。
【００４１】
マイクロキャリア（Ａ）の粒子径（μｍ）は、中実型の場合、２０〜２，０００が好ましく、さらに好ましくは４０〜１，０００、特に好ましくは８０〜５００である。一方、多孔質型の場合、粒子径（μｍ）は、３０〜２５，０００が好ましく、さらに好ましくは６０〜１２，０００、特に好ましくは１２０〜６，０００である。扁平状の場合、最大径（μｍ）が２０〜２０，０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１０，０００、特に好ましくは１００〜５，０００である。これらの範囲内であると、細胞の増殖量がさらに高くなる。
（Ａ）の粒子径又は最大径の分布は、細胞増殖の均一性の観点から、上記粒子径又は最大径の範囲の粒子径又は最大径を有する粒子の重量が、マイクロキャリア（Ａ）の重量を基準として、９０〜１００重量％となることが好ましく、さらに好ましくは９５〜１００重量％である。
【００４２】
マイクロキャリア（Ａ）の真比重は特に制限ないが、（Ａ）を培地とともに撹拌しながら培養する一般的な方法において、撹拌中は（Ａ）が浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ましい。このような観点から、（Ａ）の真比重（ｇ／ｃｍ3）は、１.００〜１.１０が好ましく、さらに好ましくは１.０１〜１.０８、特に好ましくは１．０１〜１．０５である。
【００４３】
ポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア又はポリペプチドを有しないマイクロキャリア支持体は、市場から容易に入手でき、以下のような商品等が使用できる。
（１）ポリスチレン製：ナルジェヌンク社製バイオシロン（Biosilon）、ソロヒル社製プラスチックビーズ（Plastic beads）及びラックス社製サイトスフェア（Cytosphere）等。
（２）ポリアクリルアミド製：バイオラッド（株）製バイオキャリア（Biocarrier）等。
（３）ポリウレタン製：イノアック（株）製ＰＵＦ等。
（４）セルロース製：バイオマテリアル（株）製セルスノウ（Cellsnow）等。
（５）デキストラン製：アムシャムファルマシア社製サイトデックス（Cytodex）等。
（６）ガラス製：スコット社製シラン（SIRAN）等。
【００４４】
マイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を含有させるには、（Ｐ）は、支持体の表面に含有していればよく、（Ｐ）は化学結合（イオン結合、水素結合及び共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって、支持体の表面に結合されている。これらのうち、ポリペプチドがマイクロキャリアから脱離しないという観点から化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００４５】
マイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を共有結合させる方法は公知の方法で行うことができる。例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法が挙げられ、具体的には、以下の（１）〜（３）の通りである。
【００４６】
（１）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとポリペプチド（Ｐ）を含有しないマイクロキャリアの支持体（以下、Ｐ未含有支持体）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが支持体に由来する部分）｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをアミド結合できる。
【００４７】
カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００４８】
（２）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとＰ未含有支持体のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ。Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒが支持体に由来｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのイミダゾール誘導体に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをＮ−Ｃ結合できる。
【００４９】
カルボニルジイミダゾール化合物としては、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
【００５０】
（３）ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものとＰ未含有支持体のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをエステル結合できる。
【００５１】
ポリペプチド（Ｐ）をＰ未含有支持体に、物理吸着、イオン結合及び／又は水素結合させる方法としては、溶媒等にポリペプチド（Ｐ）とＰ未含有支持体とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、酸及び／又は塩基を０．００１〜５０重量％（好ましくは０．００５〜３０重量％、さらに好ましくは０．０１〜１０重量％）含有する水溶液等（特開２００３−１８９８４８号公報等に記載）が使用できる。
これらの溶媒の中で、ポリペプチドの結合効率の観点から、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びにイオン交換蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液である。
【００５２】
また細胞の細胞培養担体への接着性等の観点からマイクロキャリア（Ａ）の表面を正に荷電させたほうが好ましい。表面を正に荷電させたマイクロキャリア（Ａ）の作製方法としては、（ｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物と混合する方法、（ｉｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を反応させる方法が挙げられる。
【００５３】
（ｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を混合する方法としては、（Ａ）がカルボキシル基を有する場合、（Ａ）と１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を溶媒中で混合することで、（Ａ）のカルボキシル基と１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物との間にイオン結合が形成し、細胞培養担体に正に荷電した官能基（Ｂ）を含有させることができる。
この方法（ｉ）で使用できる１級アミノ基含有化合物としては、アミノメタン、アミノエタン等のアミノアルカン及びこの塩、ジアミノエタン等のジアミノアルカン（アルキレンジアミン）及びこの塩並びにリジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸及びこの塩が挙げられる。
２級アミノ基含有化合物としては、ジメチルアミン等の２つの炭化水素基で置換されたアミン及びこの塩並びに２−メチルイミダゾール、ヒスチジン等のイミダゾール類及びこの塩が挙げられる。
３級アミノ基含有化合物としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン等の３つの炭化水素基で置換されたアミン及びこの塩が挙げられる。
第４級アンモニオ基含有化合物としては、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム等の４つの炭化水素で置換されたアンモニウム及びこの塩が挙げられる。
溶媒としては１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を溶解するものであれば特に制限はないが、安全性の観点から水が好ましい。
【００５４】
（ｉｉ）１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物を反応させる方法としては、前述のマイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を共有結合させる方法等と同様の方法が挙げられる。使用できる１〜３級アミノ基又は第４級アンモニオ基含有化合物としては、上記と同様のものが挙げられる。
【００５５】
細胞培養担体は、マイクロキャリア（Ａ）を含んでなるものであれば特に制限が無い。
【００５６】
ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、細胞接着性等の観点から、細胞培養担体１ｇ当たり、５ｎｇ／ｇ〜５００ｍｇ／ｇが好ましく、さらに好ましくは５０ｎｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、次に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、次に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜２０ｍｇ／ｇ、特に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜５ｍｇ／ｇ、最も好ましくは５μｇ〜５ｍｇ／ｇである。
【００５７】
なお、ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、（Ｐ）の含有量が５００μｇ／ｇを超える場合、Ｂｉｕｒｅｔ法（たとえば、日本生化学会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」第４５〜５５頁（１９７９年１２月１１日；株式会社東京化学同人発行）等により求められる。
【００５８】
一方、ポリペプチド（Ｐ）の含有量が５００μｇ／ｇ以下の場合、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（たとえば、日本生化学会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」第４５〜５５頁（１９７９年１２月１１日；株式会社東京化学同人発行）等により求められる。
【００５９】
また、免疫学的測定法（特開２００４−０４９９２１号公報等に記載）を利用して測定することもできる。具体的には、（１）ポリペプチド（Ｐ）の含有量が既知である細胞培養用担体｛Ｂｉｕｒｅｔ法やＫｊｅｌｄａｈｌ法等で（Ｐ）の含有量が既知になった細胞培養用担体｝を生理食塩水に浸漬し、（Ｐ）と結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体）とを反応させ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を吸光度測定し、検量線（（Ｐ）の含有量とそれに対する吸光度）を作成する。（２）同様に検体（（Ｐ）の含有量が未知である細胞培養用担体）の吸光度を測定する。（１）で得られた検量線と（２）で得られた吸光度から、検体の（Ｐ）の含有量を求めることができる。
なお、測定試料は、減圧乾燥機｛１２０℃、０．１ｋＰａ以下｝で１時間乾燥したものを用いる。
【００６０】
本発明の細胞の生産方法は、細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、継代工程が下記の工程である細胞の生産方法である。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、細胞の付着した細胞培養担体１〜９重量部に対して、新たな細胞培養担体を９重量部の割合で添加し、かつ細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６ｇ/〜１０ｇ/Ｌである工程。
【００６１】
細胞培養担体及び新たな細胞培養担体は、前述のポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体を使用する。
【００６２】
細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養する工程を培養工程、その後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる工程を継代工程とし、以下に説明する。
【００６３】
＜培養工程＞
培養工程に用いる細胞培養担体は、前述の物を使用する。
培養工程に用いる培養用培地としては、血清培地及び無血清培地のいずれも使用可能である。血清培地としては、用いる細胞の種類に応じて、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、ＯＰＴＩ ＰＲＯTM ＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ ＡＴＧTM培地及びこれらの混合培地が挙げられる。
これらの培地の中で、培地の調製の観点から、ＤＭＥＭ培地及びＭＥＭ培地が好ましい。
【００６４】
培養条件としては、特に制限なく、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２９体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しながら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【００６５】
播種する細胞の量としては、用いる細胞培養担体の種類や、細胞の種類等によって異なるが、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１，０００万個が好ましく、さらに好ましくは１００〜１００万個、特に好ましくは１，０００〜１０万個である。
【００６６】
＜継代工程＞
上記培養工程の後に、培養で得られた細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる。
【００６７】
上記培養工程終了後の細胞が付着した細胞培養担体（以下、細胞付着担体と略す）の入った容器内に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体と培養用培地（Ｃ）を添加し、間欠攪拌を実施する。培養工程で使用した培地は、除去する必要はない。
培養用培地（Ｃ）としては、前述の培養用培地と同様のものが使用できる。
（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体において、新たな細胞培養担体を（Ｃ）に浸漬させる際の（Ｃ）と新たな細胞培養担体の使用比率は、継代効率の観点から、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌである。
【００６８】
新たな細胞培養担体を（Ｃ）に浸漬させる浸漬温度は、細胞培養担体の性能保持と培地の劣化の観点から、２５〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜３８℃である。
【００６９】
細胞付着担体と培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体との割合（重量比率）は、１〜９重量部：９重量部であり、細胞増殖の観点から、好ましくは１〜４．５重量部：９重量部、特に好ましくは１〜３重量部：９重量部である。
細胞付着担体の新たな細胞培養担体９重量部に対する割合が、１重量部未満では継代効率が悪くなり、９重量部を超えると細胞増殖性が悪くなる。
なお、細胞付着担体の重量は、付着した細胞を含めた重量である。
【００７０】
継代工程における細胞培養担体濃度は、培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、継代効率の観点から、６ｇ/Ｌ〜９ｇ/Ｌが好ましく、さらに好ましくは６ｇ/Ｌ〜８ｇ/Ｌである。
細胞培養担体濃度が、６ｇ／Ｌ未満では継代効率が悪くなり、１０ｇ／Ｌを超えると細胞増殖性が悪くなる。
継代工程における細胞培養担体濃度は、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体と培養用培地（Ｃ）を添加した後に、（Ｃ）を除去する又は（Ｃ）を追加することにより調製できる。
なお、細胞培養担体濃度は、継代工程で添加した培養用培地（Ｃ）の体積に対する、細胞付着担体及び継代工程で添加した新たな細胞培養担体の合計重量である。また、細胞付着担体の重量は、付着した細胞を含めた重量である。
【００７１】
細胞が付着した細胞培養担体に培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する。
この工程において間欠撹拌とは攪拌と静置を繰り返し行う操作である。
それぞれの攪拌時間は、継代の観点から、１〜３０分が好ましく、さらに好ましくは１〜２０分、特に好ましくは１〜１０分である。
それぞれの静置時間は、継代の観点から、５〜１２０分が好ましく、さらに好ましくは５〜９０分、特に好ましくは５〜６０分である。
撹拌と静置を繰り返し行うが、合計の間欠撹拌時間としては、８〜９６時間であり、継代の観点から、好ましくは１２〜７２時間、特に好ましくは１６〜４８時間である。間欠撹拌時間が８時間未満では、細胞の移動が不十分でマイクロキャリアへの接着率が低下する。９６時間を越えると細胞増殖性が悪くなる。
間欠攪拌時の温度としては、細胞への損傷の観点から、５〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは１５〜４５、特に好ましくは２５〜４０である。
【００７２】
継代工程の終了後、培地交換をせずに通常の細胞培養を実施する。通常の細胞培養とは、間欠攪拌をせずに連続攪拌を細胞培養担体が均一に培地中を浮遊しうる回転数で実施する培養である。培養温度は３５〜３９℃が好ましい。必要により培地を追加してもよく、細胞培養における細胞培養担体濃度は３ｇ/Ｌ〜６ｇ/Ｌが好ましい。
細胞培養担体のコンフルエント率が８０〜１００％になるまで培養する。その際、必要総細胞数に到達していなければ、上記継代工程を再度実施し、さらに培養する。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
【００７４】
＜製造例１＞
＜マイクロキャリア（Ａ）の調製＞
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン６２４部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート３．１部を仕込み、窒素バブリングを３０分以上行って、溶存空気を追い出し７５℃まで昇温した。
別の反応器に８０％アクリル酸水溶液１７３部を仕込み、冷却しながら２８％水酸化ナトリウム水溶液２０７部を加えて中和した。この水溶液に架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝０．９０部及び重合開始剤｛過硫酸カリウム｝０．２７８部、連鎖移動剤｛次亜リン酸ナトリウム｝０．０５３部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より６．５ｍｌ／分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中（撹拌速度は５００ｒｐｍ）のシクロヘキサン液中に約１時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって１６０部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に１２０℃で２時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが７５μｍのふるい及び１０６μｍのふるい（ＪＩＳ Ｚ８８０１−１：２０００）により分級して、粒子径７５〜１０６μｍの粒子｛架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子｝（Ｇ）を得た。
吸水性樹脂（Ｇ）１ｇ、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩３．８３ｇ及びアミノエタノール・塩酸塩３．９０ｇに、塩化ナトリウムを０．８５％で含有する０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のリン酸緩衝液（以下、ｐＨ５．２のＰＢＳ）２５ｍＬを加え、２５℃で撹拌し、４時間反応させた後、反応溶液を吸引除去した。イオン交換水の１００ｍLを添加し１時間撹拌後、吸引除去する洗浄操作を５回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥して吸水性樹脂（Ｈ）を得た。吸水性樹脂（Ｈ）１ｇ、Ｎ−ジエチルアミノエチルクロライド・塩酸塩８．６ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液４．３５ｇに、イオン交換水１０ｍＬを加え、６０℃で撹拌し、５時間反応させた後、反応溶液を吸引除去した。イオン交換水の１００ｍLを添加し１時間撹拌後、吸引除去する洗浄操作を５回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥して吸水性樹脂（Ｉ−１）を得た。（Ｉ−１）の保水量は１０ｇ／ｇであった。
【００７５】
＜ポリペプチド（Ｐ１）の調製＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）１３個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列（２１）１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のペプチド「プロネクチンＦ」を製造し、ポリペプチド（Ｐ１）とした。
【００７６】
＜ポリペプチド（Ｐ１）が結合した吸水性樹脂の調製＞
吸水性樹脂（Ｉ−１）１ｇに、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）を６０ｍＭの濃度で含む、０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のＰＢＳ溶液の１５ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、０．５時間反応させて、変性吸水性樹脂を得た。
次に、この変性吸水性樹脂に、ポリペプチド（Ｐ１）を２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含む０．２Ｍ、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液の1ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、２時間反応させた後、反応溶液を吸引除去し、ＰＢＳの４０ｍLを添加、吸引除去する洗浄操作を５回行い、さらにイオン交換水の４０ｍＬを添加、吸引除去する洗浄操作を２回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥してマイクロキャリア（ポリペプチド結合吸水性樹脂）（Ａ−１）を得た。Ａ−１の真比重は、１.０３であった。
【００７７】
＜ＭＤＣＫ細胞を用いた継代評価＞
＜実施例１＞
＜培養工程＞
スピンナーフラスコへ、マイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム０．０２％、リン酸二水素カリウム０．０７６％及び塩化ナトリウム０．８５％を含む。以下、実施例１においてＰＢＳと略記する。）１００ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTM ＳＦＭ：インビトロジェン社製）に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン Ｂ、カスケード社製）を０．２％で含有させた培地を２０ｍL添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を５０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＭＤＣＫ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。その後、培養容量が１００ｍＬとなるように無血清培地を添加した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、３０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面が細胞で覆われるまで４日間培養を行い細胞が付着した（Ａ−１）を得た。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地３００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．９ｇを浸漬に使用した無血清培地３００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地を２５０ｍＬ除去した。１．２ｇのマイクロキャリアが無血清培地１５０ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
間欠撹終了後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を２５０ｍｌ添加した。
＜継代後の培養工程＞
継代工程終了後、３０ｒｐｍの攪拌をしながら培養した。培養温度等の条件は培養工程と同様にした。
【００７８】
＜マイクロキャリアへの細胞接着率評価＞
継代後の培養工程開始後、培養４日目にサンプリングし、マイクロキャリアへの接着率を下記に記載の方法で測定した。
マイクロキャリアへの細胞接着率評価は次のように実施した。細胞培養担体含有培養液０．５ｍＬを取り、顕微鏡にて細胞が１つ以上接着しているマイクロキャリアの数（Ｍ）と細胞が接着していないマイクロキャリアの数（Ｎ）を測定する。測定後、以下の式からマイクロキャリアへの細胞接着率を算出し、結果を表１に示した。
マイクロキャリアへの細胞接着率（％）＝｛Ｍ／（Ｍ＋Ｎ）｝×１００
【００７９】
＜細胞増殖性評価＞
継代後の培養工程開始後、培養４日後の細胞培養液を０．５ｍＬ採り、培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％及びクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数し、培地中の細胞濃度（１０5個／ｍＬ）を測定し、結果を表１に示した。
【００８０】
＜実施例２＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地９００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）２．７ｇを浸漬に使用した無血清培地９００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ５００ｍＬ除去した。３．０ｇのマイクロキャリアが無血清培地５００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を５００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８１】
＜実施例３＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地１００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇを浸漬に使用した無血清培地１００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１００ｍＬ除去した。０．６ｇのマイクロキャリアが無血清培地１００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を１００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８２】
＜実施例４＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地９００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）２．７ｇを浸漬に使用した無血清培地９００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ７００ｍＬ除去した。３．０ｇのマイクロキャリアが無血清培地３００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を７００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８３】
＜実施例５＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地１００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇを浸漬に使用した無血清培地１００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１４０ｍＬ除去した。０．６ｇのマイクロキャリアが無血清培地６０ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を１４０ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８４】
＜実施例６＞
実施例１において、継代工程における間欠攪拌時間を１６時間に変更した以外は、実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
【００８５】
＜実施例７＞
実施例１において、継代工程における間欠攪拌時間を９６時間に変更した以外は、実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
【００８６】
＜比較例１＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地１８００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）５．４ｇを浸漬に使用した無血清培地１８００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１０８７ｍＬ除去した。５．７ｇのマイクロキャリアが無血清培地７１３ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を１０８７ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８７】
＜比較例２＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地７５ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．２２５ｇを浸漬に使用した無血清培地７５ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ１０９ｍＬ除去した。０．５２５ｇのマイクロキャリアが無血清培地６６ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を６６ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００８８】
＜比較例３＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地３００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．９ｇを浸漬に使用した無血清培地３００ｍｌとともに投入した。間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。継代工程後４日間培養した。
【００８９】
＜比較例４＞
実施例１において、継代工程を下記の継代工程とする以外は実施例１と同様にし、マイクロキャリアへの細胞接着率及び培地中の細胞濃度の結果を表１に示した。
＜継代工程＞
細胞が付着した（Ａ−１）が入った容器内に、無血清培地３００ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．９ｇを浸漬に使用した無血清培地３００ｍｌとともに投入した。その後、静置させることでマイクロキャリアを沈殿させた後、無血清培地だけ３００ｍＬ除去した。１．２ｇのマイクロキャリアが無血清培地１００ｍＬ中にいる状態で、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を４８時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。
継代工程後、細胞培養担体濃度が３ｇ／Ｌとなるように無血清培地を３００ｍｌ添加して、４日間培養した。
【００９０】
＜比較例５＞
実施例１において、間欠攪拌時間を６時間に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９１】
＜比較例６＞
実施例１において、間欠攪拌時間を１２０時間に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９２】
【表１】
【００９３】
表１より、本発明の実施例１〜５の細胞接着率及び細胞増殖性が、比較例１及び２の結果よりもはるかに優れることが分かる。すなわち、本発明の細胞生産方法を実施することで、細胞接着率が優れることからマイクロキャリアに均一に細胞を継代することができることが分かり、比較例に比べて細胞増殖性が向上していることから、細胞増殖能を低下させることなく継代することができることが分かり、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施できていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の細胞の生産方法で細胞を生産すると、細胞が新しいマイクロキャリアに均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
したがって、本発明はウイルス培養用細胞の生産、有用タンパク質発現細胞の生産等、あらゆる接着性細胞の培養生産に有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、細胞培養担体及び新たな細胞培養担体が細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体であり、継代工程が下記の工程である細胞の生産方法。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、細胞の付着した細胞培養担体１〜９重量部に対して、新たな細胞培養担体を９重量部の割合で添加し、細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、間欠撹拌時間が８〜９６時間である工程。
【請求項１】
細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、細胞培養担体及び新たな細胞培養担体が細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体であり、継代工程が下記の工程である細胞の生産方法。
継代工程：細胞が付着した細胞培養担体に、培養用培地（Ｃ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、間欠攪拌を実施する工程であって、細胞の付着した細胞培養担体１〜９重量部に対して、新たな細胞培養担体を９重量部の割合で添加し、細胞培養担体濃度が培養用培地（Ｃ）に対して６〜１０ｇ/Ｌであり、間欠撹拌時間が８〜９６時間である工程。
【公開番号】特開２０１１−３０４５３（Ｐ２０１１−３０４５３Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７７３７８（Ｐ２００９−１７７３７８）
【出願日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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