細胞内ペプチド送達
【課題】異種化合物を細胞、特に哺乳類細胞に輸送するための方法およびキットを提供する。
【解決手段】本発明の方法は、異種化合物を輸送する前に、細胞を、ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよび/またはカチオン性ペプチドにより、予め処理することを含む。本発明の方法は、特にペプチドおよび蛋白質の輸送に適用することができる。
【解決手段】本発明の方法は、異種化合物を輸送する前に、細胞を、ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよび/またはカチオン性ペプチドにより、予め処理することを含む。本発明の方法は、特にペプチドおよび蛋白質の輸送に適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照により本明細書に組み入れられる２００４年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６０／６１９，７２９号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は細胞内への化合物の輸送、特に真核細胞内へのペプチドおよびタンパク質などの異種化合物の輸送に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の形質膜は、多くの有用な治療剤にとって、通過障壁となる。一般に、分子は、身体の水性コンパートメントにも、それが通過しなければならない脂質層にも、易溶でなければ、細胞に入ることができない。ペプチドおよびオリゴヌクレオチドなど、多くの治療用高分子も、膜貫通輸送がとりわけ困難である。現在のＤＮＡトランスフェクション技法には、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム共沈、カチオン性リポソーム、ウイルスベクターおよびエレクトロポレーションなどがある。これらの方法により、ＤＮＡを細胞内に輸送することはできるが、これらの技法は面倒であり、細胞毒性である。さらにまた、トランスフェクションが完了しても、研究者は、対象遺伝子の発現を検出するために、トランスフェクション後、１２〜８０時間は待たなければならない。
【０００４】
最近、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（４８−６０）などといったタンパク質導入ドメインの助けを借りて、外因性のペプチドおよびタンパク質を生細胞内に直接送達するための新規な方法が開発された（Ａ． ＦｒａｎｋｅｌおよびＣ． Ｐａｂｏ「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ（ヒト免疫不全ウイルス由来のＴａｔタンパク質の細胞取り込み）」Ｃｅｌｌ ５５ （１９８８）， ｐｐ． １１８９−１１９３；Ｍ． ＧｒｅｅｎおよびＰ． Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ「Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ Ｔａｔ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（化学合成されたヒト免疫不全ウイルスＴａｔトランス活性化因子タンパク質の自律的機能ドメイン）」Ｃｅｌｌ ５５ （１９８８）， ｐｐ． １１７９−１１８８）。しかしこの方法には短所がある。Ｔａｔ融合タンパク質によるタンパク質導入は、カーゴタンパク質の失活および変性をもたらした。活性なタンパク質を送達するには、内部移行時に正しい再生が要求される。また、Ｔａｔは、送達されるべき化合物または高分子に、化学反応によって共有結合的に連結されなければならない。
【０００５】
ショウジョウバエアンテナペディアホメオ転写因子（４３−５８）から、もう一つの導入ドメインタンパク質が報告されている（Ａ． Ｊｏｌｉｏｔ， Ａ． Ｔｒｉｌｌｅｒ， Ｍ． Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ， Ｃ． ＰｅｒｎｅｌｌｅおよびＡ． Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ「Ａｌｐｈａ−２，８−ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｅｐｔｉｄｅ（アルファ−２，８−ポリシアル酸はアンテナペディアホメオボックスペプチドのニューロン表面受容体である）」Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ ３ （１９９１）， ｐｐ． １１２１−１１３４；Ｉ． Ｌｅ Ｒｏｕｘ， Ａ．Ｈ． Ｊｏｌｉｏｔ， Ｅ． Ｂｌｏｃｈ−Ｇａｌｌｅｇｏ， Ａ． ＰｒｏｃｈｉａｎｔｚおよびＭ． Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（アンテナペディアホメオドメインの神経栄養活性はその特異的ＤＮＡ結合特性に依存する）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０ （１９９３）， ｐｐ． ９１２０−９１２４）。このペプチドに基づく市販のタンパク質導入ドメインペプチドＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮ（登録商標）（米国特許第５，８８８，７６２号）は、アンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３ヘリックスに相当する１６アミノ酸からなる。活性化ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮ（登録商標）は、カーゴペプチドと共有結合的にカップリングするＮ末端ピリジルジスルフィドを持つ。しかし化学カップリングは潜在的に面倒であり、この試薬との化学カップリングのためにカーゴペプチドは遊離のチオール基を持たなければならない。
【０００６】
もう一つのタンパク質導入ドメインペプチドでは、３８ｋＤａ単純ヘルペスウイルス１型ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２を利用する（Ｇ． ＥｌｌｉｏｔｔおよびＰ． Ｏ’Ｈａｒｅ「Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ヘルペスウイルス構造タンパク質による細胞間輸送およびタンパク質送達）」Ｃｅｌｌ ８８ （１９９７）， ｐｐ． ２２３−２３３）。しかしＶＰ２２は、送達されるべきペプチド／タンパク質に融合しなければならず、その融合タンパク質を作製するために適切な発現ベクターの構築を必要とする。
【０００７】
Ｒｏｔｈｂａｒｄら（米国特許第６，３０６，９９３号）は、輸送された化合物と輸送ポリマーとを共有結合でコンジュゲートすることによって、生体膜を横切る化合物の輸送を増進する方法を開示している。輸送ポリマーはサブユニットを含み、その少なくとも５０％はグアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を含有する。米国特許第６，３０６，９９３号も、輸送体へのカーゴ分子の共有結合を必要とする。
【０００８】
上述した担体ペプチドの場合、さまざまなカーゴペプチドおよびカーゴタンパク質を効率よく細胞間送達するには、担体ペプチドと輸送されるべき分子とのハイブリッドを、遺伝子的にまたは化学的に形成させる必要があった。
【０００９】
ＷＯ０２／１０２０１（Ｄｉｖｉｄａら）は、異種化合物と非共有結合的に会合し、細胞内への異種化合物の輸送をもたらす、疎水性および親水性ドメインを持つペプチド（１５〜３０残基）を含む、トランスフェクション剤を開示している。この薬剤はＣＨＡＲＩＯＴ（商標）として市販されており、これは、生物学的に活性なタンパク質、ペプチドおよび抗体を６０〜９５％の効率で培養哺乳類細胞内に直接送達する。ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）ペプチドはカーゴペプチドと非共有結合的な結合を形成する。これはタンパク質を安定化し、カーゴタンパク質を分解から保護し、トランスフェクション過程の間、カーゴタンパク質が本来持っている特徴を維持する。共有結合は必要でないものの、送達前にＣＨＡＲＩＯＴ（商標）とカーゴペプチドとの混合物を調製する必要がある。
【００１０】
一般に、タンパク質導入ドメインＴａｔ、ＶＰ２２およびアンテナペディアタンパク質は、所望の細胞内へのペプチドの送達を成功させるために、組換え融合タンパク質の製造などといった、化学反応または生物学的過程によるカーゴ化合物またはカーゴ高分子への共有結合を必要とする。共有結合によって連結されたカーゴペプチドの製造は、潜在的に複雑であり、労働集約的であり、時間がかかる。カーゴタンパク質の輸送準備をそのような方法で行うと、カーゴペプチドの生物学的機能の失活も起こる。市販のタンパク質導入ドメインペプチドＣＨＡＲＩＯＴ（商標）は共有結合を必要としないが、細胞に適用する前に、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）とカーゴペプチドとの混合物を作製する必要がある。この混合時間も潜在的に多くの時間を必要とする。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の一部の実施形態は、単離された細胞内に異種化合物を輸送する方法であって、ポリカチオン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ペプチドである少なくとも一つの化合物を含む組成物で、細胞を前処理するステップ、および前処理した細胞内に異種化合物を輸送するステップを含む方法に向けられる。
【００１２】
一部の好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である。好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である。より好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である。一部の好ましい実施形態では、ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる。
【００１３】
一部の好ましい実施形態では、細胞を前処理するための組成物がカチオン性ペプチドを含む。好ましい一実施形態では、カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである。これに代わる好ましい一実施形態では、カチオン性ペプチドがポリアルギニンである。
【００１４】
好ましい実施形態では、異種化合物がペプチド誘導体である。一部の好ましい実施形態では、異種化合物がタンパク質である。一部の好ましい実施形態では、異種化合物が酵素である。一部の好ましい実施形態では、異種化合物が抗体である。
【００１５】
好ましい実施形態では、異種化合物の輸送を受ける細胞が哺乳類細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞が爬虫類細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞が昆虫細胞である。好ましい実施形態では、細胞が卵母細胞である。
【００１６】
本発明の一部の好ましい実施形態は、ポリカチオン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ペプチドである少なくとも一つの化合物を持つ組成物で処理された少なくとも一つの単離された細胞を含むキットに向けられる。一部の好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である。好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である。より好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である。一部の好ましい実施形態では、ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる。
【００１７】
一部の好ましい実施形態では、細胞処理用の組成物がカチオン性ペプチドを含む。好ましい実施形態では、カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである。これに代わる好ましい実施形態では、カチオン性ペプチドがポリアルギニンである。
【００１８】
好ましい実施形態では、異種化合物の輸送を受けるべき細胞が哺乳類細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞が爬虫類細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞が昆虫細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞が卵母細胞である。
【００１９】
本発明のさらなる側面、特徴および利点は、以下に記載する好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるだろう。
【００２０】
本発明のこれらの特徴および他の特徴を、以下に、本発明の限定ではなく例示を意図する好ましい実施形態の図面を参照しながら説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ここに記述する実施形態は本発明の好ましい実施形態を表すが、当業者であれば本発明の要旨から逸脱することなく変更形態を考えつくであろうと理解すべきである。したがって本発明の範囲は本願請求項によってのみ決定されるべきである。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態は、生体膜を横切る細胞内への異種化合物の輸送に関する。本明細書で使用する「生体膜」という用語は、細胞または細胞群を細胞外空間から分離する脂質含有障壁を指す。生体膜には、形質膜、細胞壁、細胞内小器官膜、例えばミトコンドリア膜、核膜などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
異種化合物には、輸送を受ける細胞にとってネイティブでない化合物、および異種化合物の輸送を受ける細胞タイプに通常見出しうる化合物が含まれうる。本発明の好ましい実施形態では、異種化合物が、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはその類似体である。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが抗原または抗体であってもよい。しかし、他のタイプの化合物も、本明細書に記載する方法によって細胞内に輸送することができる。例えば異種化合物には、金属イオン（これは典型的には金属キレートとして送達される）、小有機分子、および他の高分子、例えば核酸、ならびにその類似体が含まれうるが、これらに限定されるわけではない。一部の実施形態では、異種化合物がペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００２４】
「カーゴ」という用語は、細胞内に輸送される異種分子を指すために用いられる。
【００２５】
本明細書で使用する「高分子」という用語は、例えば生物学的起源または合成的起源を持つペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（ただしこれらに限定されるわけではない）によって例示されるような、大きな分子（１０００ダルトンを超える分子量）を指す。「小有機分子」とは、１０００ダルトン以下の分子量（ＭＷ）を持つ炭素含有物を指す。
【００２６】
本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接合されたＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物の一本鎖で構成される化合物を指す。一般にペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸残基を含有し、長さが約５０アミノ酸未満である。
【００２７】
本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって連結された、線状に配置されたアミノ酸から構成されるが、ペプチドとは対照的に、明確なコンフォメーションを持つ化合物を指す。タンパク質は、ペプチドとは異なり、一般に、５０個以上のアミノ酸の鎖からなる。
【００２８】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基の数が少なくとも２であって、一つ以上のペプチド結合を含有するポリマーを指す。「ポリペプチド」はペプチドおよびタンパク質を包含し、そのポリペプチドが明確なコンフォメーションを持つかどうかを問わない。
【００２９】
「ポリカチオン」という用語は、生理的ｐＨで正に帯電した基を数多く持つ高分子を指す。高分子はタンパク質、ペプチドまたはポリマーであることができる。
【００３０】
「細胞」という用語は、インビトロ細胞とインビボ細胞の両方を指す。本明細書に記載する方法は、インビトロでも、インビボでも、細胞に化合物を輸送するために使用することができる。例えばカーゴ化合物は、より大きな生物内にある原位置の細胞に輸送することができる。一部の実施形態では、細胞にインビトロで輸送を行った後、その細胞をインビボの組織または生物に輸送することができる。
【００３１】
本明細書で使用する「輸送剤」という用語は、細胞への高分子の送達を助長する薬剤を指す。好ましい実施形態では、高分子がペプチドまたはタンパク質であり、細胞が哺乳類細胞である。輸送試薬は一般に、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）、ポリアセタール、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの、カチオンまたはポリカチオンである。輸送剤は、ポリ（リジン）のように非分解性であってもよいし、分解性であってもよい。生理的ｐＨでより安定な、アセタール結合を含有する酸感受性ポリマー（ポリアセタール）も使用することができる。
【００３２】
分解性ポリマーを合成する方法は、米国出願第１０／６９２，５７３号（２００３年１０月２４日出願）および第１０／６５１，３９４号（２００３年８月２８日出願）に教示されている。どちらの出願も参照により本明細書に組み入れられる。簡単に述べると、分解可能な架橋を持つカチオン性ポリマーは、カチオン性繰り返し単位と架橋単位とを含む。「カチオン性繰り返し単位」という用語は、ここではその通常の意味で、例えば、合成ポリマーのポリマー主鎖または側鎖に組み込まれる、または合成ポリマーのポリマー主鎖または側鎖への組み込みに適した、正に帯電した種々の化学基を指すために用いられる。好ましいカチオン性繰り返し単位は、正に帯電したアミン基を含む。正に帯電したアミン基には、酸性条件下で正に帯電する１級、２級および３級アミン、ならびに幅広いｐＨ範囲にわたって正に帯電する４級アミンが含まれる。最も好ましくは、カチオン性繰り返し単位が４級アミン基を含む。ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリエチレンイミン、およびポリプロピレンイミンは、カチオン性繰り返し単位を含む好ましい合成ポリマーの限定でない例である。
【００３３】
カチオン性繰り返し単位は、対応するカチオン性モノマーの重合によって、または後反応によって、ポリマーに組み込むことができる。重合は共重合であることができ、当業者に広く知られている技法を使って、逐次重合機序および連鎖重合機序を含むさまざまな重合機序で進行させることができる。Ｇ． Ｏｄｉａｎ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」第３版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ （１９９１）参照。重合に適した好ましいカチオン性モノマーの限定でない例には、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノプロピル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、およびポリ（アミドアミン）デンドリマーなどがある。カチオン性モノマーは市販されているか、当業者に知られている方法によって合成することができる。
【００３４】
架橋ポリマーは、その末端以外の位置で互いに結合されたポリマー鎖を含有する。Ｇ． Ｏｄｉａｎ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」第３版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ （１９９１）参照。本明細書で使用する「架橋単位」という用語は、２本の鎖間の結合位置の一部または全部を形成する化学基を指す。したがって架橋単位は、２本以上のポリマー鎖に、その鎖の末端以外の位置で取り付けられる。架橋単位は、適切な架橋剤の存在下でポリマーを形成させることによって、またはポリマーを互いに反応させて結合点を形成させることによって、ポリマー鎖中に組み込むことができる。
【００３５】
架橋単位は、好ましくは、アセタール、イミンおよびヒドラゾンからなる群より選択される少なくとも第１の分解可能な単位と、エステル、ホスホエステル、アミド、無水物およびウレタンからなる群より選択される少なくとも第２の分解可能な単位とを含む。第１の分解可能な単位は好ましくは酸不安定性であり、第２の分解可能な単位は好ましくは加水分解可能である。好ましい架橋剤は、典型的には、モノマーと反応させることで、結果として生じるポリマーと架橋単位とを相互に結合させるのに適した、重合可能な基を含む。好ましい架橋剤は、上述した第１および第２の分解可能な単位を含んでもよいし、ポリマーへの架橋剤の組み込みによって形成された架橋単位を後反応に付すことによって、分解可能な単位を形成させることもできる。好ましい架橋剤は式：Ｒ１ｘ−（−Ｘ−Ｒ３−Ｙ−）ｚ−Ｒ２ｙによって表される（式中、Ｒ１およびＲ２は重合可能な基であり、Ｒ３は連結基であり、Ｘは、アセタール、イミンおよびヒドラゾンからなる群より選択される第１の分解可能な単位であり、Ｙは、エステル、ホスホエステル、アミド、無水物、およびウレタンからなる群より選択される第２の分解可能な単位であり、ｘおよびｙは１〜３の範囲の整数であり、ｚは１〜５の範囲の整数である）。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、イソチオシアネート、イソシアネート、エポキシド、アルデヒド、塩化アシル、塩化スルホニル、無水物、マレイミド、カルボン酸、カルボン酸エステル、ヒドロキシル、アミン、およびアミドからなる群より、それぞれ独立して選択される。好ましくは、Ｒ３は、炭素数６〜１０のアリール、炭素数４〜１０のシクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２Ｏ）ｎ−、および−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−からなる群より選択される（式中、ｎは１〜約１００の範囲にあり、より好ましくは１〜約５の範囲にある）。架橋剤は、含まれるべき基（例えば重合可能な基、第１の分解可能な基および第２の分解可能な基）の性質に応じて、商業的供給源から入手するか、当業者に知られている方法で合成することができる。
【００３６】
カチオン性繰り返し単位と架橋単位とを含む合成ポリマーは、好ましくは、架橋剤の存在下でカチオン性モノマーを重合することによって製造される。モノマー中および架橋剤中の重合可能な基の性質に応じて、さまざまな重合方法を使用することができる。好ましい一実施形態では、カチオン性モノマーは、当該モノマーが適切な架橋剤と反応できるように２個以上の活性水素を持つ、脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素または芳香族炭化水素である。
【００３７】
架橋剤の存在下でのカチオン性モノマーの重合は、好ましくは、適切な溶媒または懸濁媒体中で行われる。カチオン性モノマーと架橋剤との割合は重大な問題ではなく、日常的な実験で決定することができる。ポリアミンモノマーの場合、反応物比（架橋剤中のアミン反応性官能基当量数−対−ポリアミンモノマー中のアミン水素当量数として表したもの）は、好ましくは、約１：１０〜約１：１の範囲にある。より好ましくは、約１：５〜約４：５の範囲の反応物質比を使用する。式：Ｒ１ｘ−（−Ｘ−Ｒ３−Ｙ−）ｚ−Ｒ２ｙで表される架橋剤の場合、アミン反応性官能基当量数はｘ＋ｙに等しい。ポリアミンに関して、アミン水素当量数は、窒素原子に結合している反応性水素原子の数である。
【００３８】
好ましい実施形態では、ポリマーがポリアセタールである。ポリアセタールは、アセタール（−Ｏ−ＣＨＲ−Ｏ−）繰り返し単位を含有するポリマーである。好ましくは、Ｒはメチルである。好ましいポリアセタールは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）：
【化１】
からなる群より選択される式によって表される繰り返し単位を含む。
【００３９】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ａは、少なくとも一つのアセタール基を含むリンカー基を表し、Ｂは、−ＣＨ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＨ２ＣＨ−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ−、および−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）−からなる群より選択され、Ｚは、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２、およびＶＵからなる群より選択され、Ｖはリンカー基であり、Ｕは、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、ポリ（リジン）、ＰＡＭＡＭデンドリマー、オクタアミンデンドリマー、ヘキサデカアミンデンドリマー、エンハンサー、およびターゲティングレセプター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群より選択され、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より、それぞれ独立して選択され、Ｄは、カルボン酸アミド、カルボン酸エステル、尿素、およびウレタンからなる群より選択される結合であり、そしてＧは、Ｃ４〜Ｃ２０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−からなる群より選択される（式中、ｎは１〜約２５０の範囲にある）。この文脈において、「リンカー基」とは、ある化学基を別の化学基に接合する二官能性化学基である。リンカー基は単一の二官能性化学基、例えばアミドなどを含有することができ、あるいは二つの化学基、例えばアミド−アミド、アミド−アルキル、アルキル−アミド、アミン−アミド、またはチオエーテル−アミドなどを含有してもよい。好ましいリンカー基の例には、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ９−、−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨなどがある（式中、Ｒ９は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より選択される）。少なくとも一つのアセタール基を含むリンカー基の例には、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、および−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−などがある。
【００４０】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）内のＵに関して、ＰＥＩおよびＰＰＩを使用する場合、それらは、好ましくは約２００〜約１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を持つ。ポリ（リジン）を使用する場合、それは約２００〜約５０，０００ダルトンの範囲にある分子量を持つ。ここで言及するポリマーの分子量は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（光散乱検出器）によって測定される重量平均分子量である。
【００４１】
この文脈において、「エンハンサー」とは、真核細胞へのペプチド送達またはタンパク質送達の効率を増進することができる官能基であり、「ターゲティングレセプター」とは、細胞表面上の特異的レセプターを認識することができる官能基である。上述の定義は相互排他的ではないので、Ｕは、エンハンサーであり、かつターゲティングレセプターであることもできる。好ましくは、Ｕは、脂質、コレステロール、トランスフェリン、抗体、抗体断片、ガラクトース、マンノース、リポタンパク質、リソソーム作用剤、および融合誘導剤からなる群より選択される。エンハンサーおよびターゲティングレセプターは、さまざまな方法で（例えばリンカー基Ｖを介したポリアセタールへの共有結合によって、またはエンハンサーおよび／もしくはターゲティングレセプターをＺにコンジュゲートすることによって、またはその両方によって）、ポリアセタールに取り付けることができる。したがって、二つ以上のエンハンサーおよび／またはターゲティングレセプターを、ポリアセタールに取り付けることができる。
【００４２】
ポリアセタールはコポリマーであってもよく、したがって、二つ以上の異なる式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位および／または他の繰り返し単位を含有しうる。したがって、「式（Ｉ）のポリアセタール」「式（ＩＩ）のポリアセタール」「式（Ｉ）のポリマー」および「式（ＩＩ）のポリマー」などの用語は、本質的に式（Ｉ）または式（ＩＩ）の繰り返し単位からなるホモポリマーだけでなく、コポリマーも包含する。
【００４３】
ポリアセタールの製造にはさまざまな方法を使用することができる。好ましい方法は、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）からなる群より選択される式で表されるモノマーを、式（Ｖ）で表される式を持つコモノマーと反応させることを含む。
【化２】
式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）において、Ａ、Ｂ、ＺおよびＧは上記と同じ意味を持ち、Ｅは、好ましくは−ＯＨ、−ＮＨ２、および−ＮＨ（ＣＨ３）からなる群より選択される反応性末端基であり、そしてＣは、好ましくはイソシアネート、ＮＨＳ−エステル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸塩化物および無水物からなる群より選択される反応性末端基である。重合反応条件は、反応性末端基ＥおよびＣの性質に応じて、当業者に広く知られている方法で調節される。Ｇ． Ｏｄｉａｎ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」第３版（１９９１）参照。任意に、適合する反応性末端基を持つ一つ以上の追加コモノマーの存在下で、重合を行ってもよい。好ましくは、混合物中のモノマー（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）対コモノマー（Ｖ）のモル比は約１：１であるが、正確な比率は、結果として生じるポリマーの分子量を調節するために、かつ／または追加コモノマーの存在について補償するために、変化させることができる。比率が１：１に近いほど、一般に高い分子量が達成される。モノマー（ＩＩＩ）／（ＩＶ）またはコモノマー（Ｖ）のどちらか一方をわずかに過剰に使用することにより、かつ／または少量の単官能性反応物を含めることにより、低い分子量を達成することができる。好ましくは、結果として生じるポリアセタール（例えば式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むポリマーまたはコポリマー）の分子量は、約１，０００ダルトン以上であり、より好ましくは約１，０００〜約２５０，０００ダルトンの範囲にある。
【００４４】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表される繰り返し単位には二つの種類が包含される。すなわち、一つは、ＺがＣ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、およびＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２からなる群より選択されるものであり、もう一つは、ＺがＶＵであるものである。ＺがＣ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、およびＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２からなる群より選択されるポリアセタールは、ＺがＶＵであるポリアセタールを製造するのに役立つ。例えば、ＺがＶＵであり、Ｖが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリアセタールは、好ましくは、式：Ｈ２ＮＵで表される化合物を、式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）：
【化３】
に示すような、ＺがＣ（Ｏ）ＯＲ１である式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリアセタールと反応させることによって製造される。
【００４５】
式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）において、Ｕ、Ａ、Ｂ、ＤおよびＧは上記と同じ意味を持ち、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より、それぞれ独立して選択される。式：Ｈ２ＮＵで表される化合物に関して、Ｕは上記と同じ意味を持つ。式：Ｈ２ＮＵで表される化合物と式（ＶＩＩ）または式（ＶＩＩＩ）のポリアセタールとの反応は、好ましくは、ジメチルホルムアミドなどの極性溶媒中で行われる。式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）のポリアセタールは、上述のように式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）の対応するモノマーを反応させることによって製造することができる。「式（ＶＩＩ）のポリアセタール」「式（ＶＩＩＩ）のポリアセタール」「式（ＶＩＩ）のポリマー」または「式（ＶＩＩＩ）のポリマー」という用語を本明細書で使用する場合、これらの用語は、本質的に式（ＶＩＩ）または式（ＶＩＩＩ）の繰り返し単位からなるホモポリマーだけでなく、式（ＶＩＩ）および／または式（ＶＩＩＩ）の繰り返し単位を含むコポリマーも包含する。
【００４６】
好ましいポリアセタールの例には、式（ＩＸ）および式（Ｘ）：
【化４】
からなる群より選択される式で表される繰り返し単位を含むものがある。
【００４７】
式（ＩＸ）および式（Ｘ）において、Ｚは上記と同じ意味を持ち、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈおよび−ＣＨ３からなる群より、それぞれ独立して選択され、Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−からなる群より選択され、そしてＹは、直鎖状または分枝状のＣ４Ｈ８、Ｃ５Ｈ１０、Ｃ６Ｈ１２、Ｃ７Ｈ１４、Ｃ８Ｈ１６、Ｃ１０Ｈ２０、およびＣ１２Ｈ２４からなる群より選択される。Ｚは好ましくはＶＵであり、Ｖは好ましくはＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、Ｕは好ましくはポリ（エチレンイミン）、ポリ（リジン）、エンハンサー、またはターゲティングレセプターである。ポリ（エチレンイミン）は、好ましくは、約２００〜約１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を持ち、ポリ（リジン）は、好ましくは、約２００〜約５０，０００ダルトンの範囲にある分子量を持つ。好ましいエンハンサーの限定でない例には、脂質、コレステロール、リポタンパク質、脂肪酸、リソソーム作用剤、および融合誘導剤からなる群より選択されるものがある。好ましいターゲティングレセプターの限定でない例には、トランスフェリン、抗体、抗体断片、ガラクトース、およびマンノースからなる群より選択されるものがある。
【００４８】
式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位を含むポリアセタールは、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）の繰り返し単位を含むポリアセタールの製造について上述したものと同じ一般的方法で製造することができる。例えば、好ましい一実施形態は、式（ＸＩ）および式（ＸＩＩ）からなる群より選択される式で表されるモノマーを、式（ＸＩＩＩ）で表されるコモノマーと反応させることを含む方法を提供する（式中、Ｘ、ＹおよびＺは、上記式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位の場合と同じ意味を持つ）。
【化５】
式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位を含むポリアセタールは、式：Ｈ２ＮＵの化合物を、式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）からなる群より選択される式で表される繰り返し単位を含むポリマーと反応させることによって製造することもできる（式中、ＸおよびＹは、上記式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位の場合と同じ意味を持つ）。
【化６】
もう一つの好ましい実施形態は、式（ＸＩ）で表されるモノマーを提供する。そのようなモノマーを製造するための好ましい方法は、式（ＸＶＩ）で表されるジビニルエーテルを、非アルコール性有機溶媒中の酸の存在下に、約２当量の式（ＸＶＩＩ）で表される化合物と反応させることを含む。
【化７】
式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−からなる群より選択され、Ｚは、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、およびＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２からなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より、それぞれ独立して選択され、Ｍは、９−フルオレニルメチルカルバメート、活性アミド、および環状イミドからなる群より選択される保護基であり、Ｒはメチルまたは水素であり、そしてｎは１または２である。
【００４９】
輸送試薬には、ポリカチオン性またはカチオン性脂質に基づく担体、ポリカチオン性またはカチオン性ポリマーに基づく担体、ポリカチオン性またはカチオン性脂質−ポリマーに基づく担体、ポリカチオン性またはカチオン性多糖に基づく担体、およびポリカチオン性またはカチオン性タンパク質またはペプチドに基づく担体も含まれる。輸送試薬はデンドリマーであることができる。輸送試薬は、上に列挙した化合物の二つ以上の組み合わせであることができる。それら二つ以上の化合物は共有結合によって連結されていてもよいし（例えば図８のＰＡ−ＰＥＩを参照されたい）、二つ以上の化合物の混合物として使用してもよい（例えば図８のＤ２２およびＤ２３を参照されたい）。さらなる具体例として、市販の活性化デンドリマー系トランスフェクション剤であるＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））、ならびに線状ポリエチレンイミン誘導体であるｊｅｔＰＥＴ（商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）が挙げられる。さらなる具体例を図８に示す。これらの例は単なる例示であって、決して、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００５０】
一部の実施形態では、細胞内への異種化合物の輸送に先だって、受容細胞を処理するために輸送試薬を使用する。しかし、本発明の新規な特徴の一つは、輸送剤による細胞の処理が、受容細胞内へのポリペプチドおよび他の異種化合物の細胞内輸送を可能とするのに十分だということである。
【００５１】
本発明の実施形態は全ての細胞タイプに適用することができるが、特に真核細胞、より具体的には哺乳類細胞に適用することができる。
【００５２】
本発明者らは、カチオン性ポリマーによるペプチド細胞送達阻害の程度を実証するために、一連の実験を行った。意外なことに、本発明者らは、カチオン性ポリマーの存在下では、ペプチド送達が阻害されるのではなく、むしろ増進されることを見出した。具体的に述べると、以下の実施例で例示するように、ｊｅｔ−ＰＥＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）は、ビオチン標識Ｔａｔペプチドによって媒介されるペプチド送達を増進した。さらなる実験で、本発明者らは、意外にも、ポリカチオン性ポリマーによる細胞の処理が細胞内へのペプチド送達を可能とするのに十分であることを見出した。輸送体でないペプチド、ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦが、ｊｅｔ−ＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔで処理しておいたＨｅＬａ細胞内に、うまく輸送された。ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ単独では全く導入を示さなかったことから、ポリカチオン性ポリマーが細胞内へのペプチドの輸送を担っていることが確認された。ヒト線維芽細胞についてもペプチド輸送が示された。本発明者らは、カチオン性ペプチドまたはカチオン性ポリマーによる受容細胞の前処理が、細胞内へのペプチドおよび／またはタンパク質の効率のよい送達をもたらしうることを発見した。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態は、関心対象の細胞をカチオン性ポリマーまたはカチオン性ペプチドで前処理するステップを含む、改良された、細胞内へのペプチド送達方法に向けられる。本発明の好ましい実施形態を実施することにより、輸送剤と輸送されるべき異種化合物との間で、何らかの共有結合反応を行うことは不必要になる。また、哺乳類細胞内へのペプチド送達に先だって混合物を調製する必要もない。インビトロおよびインビボの細胞に関して、ペプチド送達が劇的に簡略化される。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ペプチド送達の２４時間前に、９６ウェルプレートに、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）を接種した。送達前に培地を捨て、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ中の輸送剤（ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理した細胞を、カーゴであるビオチン−Ｔａｔ（ビオチン−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ，１０μＭ）と共に、ＰＢＳ中、３７℃で９０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで、室温にて５分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１０％メタノールで、室温にて１０分間処理した。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ培地中、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、シグナルを蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１Ａ〜Ｄに示す。ビオチンをストレプトアビジン−ＦＩＴＣと併用することにより、ＨｅＬａ細胞中の輸送されたペプチドを、顕微鏡で可視化することができた。図１Ｃおよび図１Ｄは、細胞をｊｅｔ−ＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔのどちらか一方で前処理しておいた場合に起こる輸送の増進を示す。
【００５５】
実施例２
輸送剤（Ｔａｔ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号２），１ｍＭまたは１０ｍＭ）、ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理した細胞をカーゴであるビオチン−Ｔａｔ（ビオチン−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ，３０μＭ）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図２Ａ〜Ｅに示す。この実施例では、ビオチン−Ｔａｔをカーゴとして使用し、図２Ｂおよび図２ＣではＴａｔを輸送剤として使用した。
【００５６】
実施例３
前処理のために、輸送剤（ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理した細胞をカーゴであるビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図３Ｂおよび図３Ｅに示す。
【００５７】
同時処理のために、試験管で、輸送剤（ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）とカーゴであるビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦとの両方を、３７℃で３０分間混合した。その後、その混合物をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図３Ｃおよび図３Ｆに示す。
【００５８】
ペプチドの送達は、細胞前処理剤として使用した輸送剤（図３Ｂおよび図３Ｅ）または同時に使用した輸送剤（図３Ｃおよび図３Ｆ）によって助長された。図３Ａは、ペプチドおよびポリカチオンなしの無処理対照細胞を示す。図３Ｄは、細胞処理なしの対照処理を示す。
【００５９】
実施例４
この実施例では、さまざまな分子量を持つＰＥＩ化合物（ＰＥＩ（分子量２５，０００）、ＰＥＩ（分子量１０，０００）、ＰＥＩ（分子量１，８００）、ＰＥＩ（分子量１，２００）、ＰＥＩ（分子量６００））を、輸送剤として、ＨｅＬａ細胞内への輸送に使用した。細胞を３７℃で３０分間前処理した。カーゴはビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ）とした。ＰＢＳで洗浄した後、処理された細胞をカーゴと共に３７℃で１０分間インキュベートした。実施例３の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６０】
実施例５
独自のカチオンポリマーを、それらがＨｅＬａ細胞内へのビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ）の輸送に及ぼす効果について試験した。カチオン性ポリマー（ＰＥＩ６００＋ＧＤＥ、ＰＥＩ６００＋ＧＤＥ、ＢＡＰＥＤＡ＋ＤＴＭＯＰＴＡ、ＰＡ−ＰＥＩ−１，２００、およびＰＡ−ＰＥＩ−１，８００；構造については図８参照）をＨｅＬａ細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をビオチン−ペプチドと共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図５Ａ〜Ｇに示す。この実施例で使用したカチオン性ポリマーの構造を図８に示す。
【００６１】
実施例３〜４の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６２】
実施例６
実施例６は、ポリアルギニン（Ｒ７Ｃ，ＲＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号１））、ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を含むさまざまな輸送剤によるＨＴ１０８０細胞（ヒト線維芽細胞）の前処理の効果を示す。細胞の前処理は３７℃で３０分間行った。ＰＢＳで洗浄した後、処理した細胞をカーゴ（ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ））と共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図６Ａ〜Ｄに示す。
【００６３】
実施例６は、ここに記載する方法を、他の細胞タイプに広く応用できることを示している。実施例３〜５の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６４】
実施例７
実施例７は、輸送剤としてポリアルギニンＲ７Ｃ（ＲＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号１））、ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使った、ＨｅＬａ細胞内へのβ−ガラクトシダーゼタンパク質の輸送を示す。簡単に述べると、β−ガラクトシダーゼを５００ｎＭの濃度でＰＢＳに溶解した。ペプチド送達の２４時間前に、９６ウェルプレートに、ＨｅＬａ細胞を接種した。送達前に、培地を捨て、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。輸送剤を各ウェルに加え、３７℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中のβ−ガラクトシダーゼ（５００ｎＭ）を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒドで、室温にて５分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＸ−ｇａｌ染色溶液（ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬ Ｘ−ｇａｌ、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）と共に３７℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、シグナルを顕微鏡で観察した。結果を図７Ａ〜Ｅに示す。
【００６５】
この実施例は、ここに記載する方法を、ペプチドだけでなくタンパク質にも使用しうることを示している。実施例３〜６の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６６】
本発明の要旨から逸脱せずに数多くのさまざまな変更を加えうることは、当業者には理解されるだろう。したがって、本発明の形態は単なる例示であって、本発明の範囲を限定しようとするものでないことは、明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１Ａは、無処理のＨｅＬａ細胞を示す。図１Ｂは、ビオチン−Ｔａｔと共にインキュベートした後のＨｅＬａ細胞を示す。図１Ｃは、ＨｅＬａ細胞内へのビオチン−Ｔａｔの輸送にｊｅｔ−ＰＥＩが及ぼす効果を示す。図１Ｄは、ＨｅＬａ細胞内へのビオチン−Ｔａｔの輸送にＳｕｐｅｒＦｅｃｔが及ぼす効果を示す。
【図２】図２Ａは、無処理のＨｅＬａ細胞である対照を示す。図２Ｂおよび図２Ｃは、ペプチド輸送に１ｍＭおよび１０ｍＭのＴａｔが及ぼす効果を示す。図２Ｄおよび図２Ｅは、ＨｅＬａ細胞内へのビオチン−Ｔａｔの輸送にｊｅｔ−ＰＥＩおよびＳｕｐｅｒＦｅｃｔが及ぼす効果を示す。
【図３】ｊｅｔ−ＰＥＩ（図３Ｂおよび図３Ｃ）またはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（図３Ｅおよび図３Ｆ）で前処理（図３Ｂおよび図３Ｅ）または同時処理（図３Ｃおよび図３Ｆ）したＨｅＬａ細胞内へのペプチド輸送を示す。図３Ａは、ペプチドおよびポリカチオンなしの無処理対照細胞を示す。図３Ｄは、細胞処理なしの対照処理を示す。
【図４】さまざまな分子量のＰＥＩ化合物を輸送剤として用いたＨｅＬａ細胞内へのペプチド輸送を示す。分子量２５，０００（図４Ａ）、１０，０００（図４Ｂ）、１，８００（図４Ｃ）、１，２００（図４Ｄ）および６００（図４Ｅ）のＰＥＩを試験した。図４Ｆは対照（細胞の前処理なし）を示す。
【図５】ＨｅＬａ細胞へのペプチド送達に種々のカチオン性ポリマーが及ぼす効果を示す。図５Ａは、細胞前処理なしの対照処理を示す。図５Ｂは、ＰＥＩ６００＋ＧＤＥ（構造については図８参照）を示す。図５Ｃは、ＰＥＩ６００＋ＧＤＥを示す。図５Ｄおよび図５Ｅは、二つの異なる比率で使用したＢＡＰＥＤＡ＋ＤＴＭＯＰＴＡ（構造については図８参照）を示す。図５Ｆは、ポリアセタール−ＰＥＩ１２００を示す。図５Ｇは、ポリアセタール−ＰＥＩ１８００を示す。ポリカチオンの構造については図８を参照されたい。
【図６】ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維芽細胞）内へのペプチド（ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ）の輸送に輸送剤Ｒ７Ｃ（ＲＲＲＲＲＲＲＣ）（配列番号１）（図６Ｂ）、ｊｅｔ−ＰＥＩ（図６Ｃ）、およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（図６Ｄ）が及ぼす効果を示す。図６Ａは、輸送剤の不在下でのペプチド輸送を示す。
【図７】ポリアルギニンＲ７Ｃ（ＲＲＲＲＲＲＲＣ）（配列番号１；図７Ｃ）、ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）（図７Ｄ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）（図７Ｅ）を使ったＨｅＬａ細胞内へのβ−ガラクトシダーゼの輸送を示す。図７Ａは、輸送剤なしでのβ−ガラクトシダーゼの輸送を示す。図７Ｂは、カーゴを加えなかった陰性対照である。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例５および図５Ａ〜Ｇで使用したポリカチオン化合物の構造を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例５および図５Ａ〜Ｇで使用したポリカチオン化合物の構造を示す。
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照により本明細書に組み入れられる２００４年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６０／６１９，７２９号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は細胞内への化合物の輸送、特に真核細胞内へのペプチドおよびタンパク質などの異種化合物の輸送に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の形質膜は、多くの有用な治療剤にとって、通過障壁となる。一般に、分子は、身体の水性コンパートメントにも、それが通過しなければならない脂質層にも、易溶でなければ、細胞に入ることができない。ペプチドおよびオリゴヌクレオチドなど、多くの治療用高分子も、膜貫通輸送がとりわけ困難である。現在のＤＮＡトランスフェクション技法には、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム共沈、カチオン性リポソーム、ウイルスベクターおよびエレクトロポレーションなどがある。これらの方法により、ＤＮＡを細胞内に輸送することはできるが、これらの技法は面倒であり、細胞毒性である。さらにまた、トランスフェクションが完了しても、研究者は、対象遺伝子の発現を検出するために、トランスフェクション後、１２〜８０時間は待たなければならない。
【０００４】
最近、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（４８−６０）などといったタンパク質導入ドメインの助けを借りて、外因性のペプチドおよびタンパク質を生細胞内に直接送達するための新規な方法が開発された（Ａ． ＦｒａｎｋｅｌおよびＣ． Ｐａｂｏ「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ（ヒト免疫不全ウイルス由来のＴａｔタンパク質の細胞取り込み）」Ｃｅｌｌ ５５ （１９８８）， ｐｐ． １１８９−１１９３；Ｍ． ＧｒｅｅｎおよびＰ． Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ「Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ Ｔａｔ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（化学合成されたヒト免疫不全ウイルスＴａｔトランス活性化因子タンパク質の自律的機能ドメイン）」Ｃｅｌｌ ５５ （１９８８）， ｐｐ． １１７９−１１８８）。しかしこの方法には短所がある。Ｔａｔ融合タンパク質によるタンパク質導入は、カーゴタンパク質の失活および変性をもたらした。活性なタンパク質を送達するには、内部移行時に正しい再生が要求される。また、Ｔａｔは、送達されるべき化合物または高分子に、化学反応によって共有結合的に連結されなければならない。
【０００５】
ショウジョウバエアンテナペディアホメオ転写因子（４３−５８）から、もう一つの導入ドメインタンパク質が報告されている（Ａ． Ｊｏｌｉｏｔ， Ａ． Ｔｒｉｌｌｅｒ， Ｍ． Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ， Ｃ． ＰｅｒｎｅｌｌｅおよびＡ． Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ「Ａｌｐｈａ−２，８−ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｅｐｔｉｄｅ（アルファ−２，８−ポリシアル酸はアンテナペディアホメオボックスペプチドのニューロン表面受容体である）」Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ ３ （１９９１）， ｐｐ． １１２１−１１３４；Ｉ． Ｌｅ Ｒｏｕｘ， Ａ．Ｈ． Ｊｏｌｉｏｔ， Ｅ． Ｂｌｏｃｈ−Ｇａｌｌｅｇｏ， Ａ． ＰｒｏｃｈｉａｎｔｚおよびＭ． Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（アンテナペディアホメオドメインの神経栄養活性はその特異的ＤＮＡ結合特性に依存する）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０ （１９９３）， ｐｐ． ９１２０−９１２４）。このペプチドに基づく市販のタンパク質導入ドメインペプチドＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮ（登録商標）（米国特許第５，８８８，７６２号）は、アンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３ヘリックスに相当する１６アミノ酸からなる。活性化ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮ（登録商標）は、カーゴペプチドと共有結合的にカップリングするＮ末端ピリジルジスルフィドを持つ。しかし化学カップリングは潜在的に面倒であり、この試薬との化学カップリングのためにカーゴペプチドは遊離のチオール基を持たなければならない。
【０００６】
もう一つのタンパク質導入ドメインペプチドでは、３８ｋＤａ単純ヘルペスウイルス１型ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２を利用する（Ｇ． ＥｌｌｉｏｔｔおよびＰ． Ｏ’Ｈａｒｅ「Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ヘルペスウイルス構造タンパク質による細胞間輸送およびタンパク質送達）」Ｃｅｌｌ ８８ （１９９７）， ｐｐ． ２２３−２３３）。しかしＶＰ２２は、送達されるべきペプチド／タンパク質に融合しなければならず、その融合タンパク質を作製するために適切な発現ベクターの構築を必要とする。
【０００７】
Ｒｏｔｈｂａｒｄら（米国特許第６，３０６，９９３号）は、輸送された化合物と輸送ポリマーとを共有結合でコンジュゲートすることによって、生体膜を横切る化合物の輸送を増進する方法を開示している。輸送ポリマーはサブユニットを含み、その少なくとも５０％はグアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を含有する。米国特許第６，３０６，９９３号も、輸送体へのカーゴ分子の共有結合を必要とする。
【０００８】
上述した担体ペプチドの場合、さまざまなカーゴペプチドおよびカーゴタンパク質を効率よく細胞間送達するには、担体ペプチドと輸送されるべき分子とのハイブリッドを、遺伝子的にまたは化学的に形成させる必要があった。
【０００９】
ＷＯ０２／１０２０１（Ｄｉｖｉｄａら）は、異種化合物と非共有結合的に会合し、細胞内への異種化合物の輸送をもたらす、疎水性および親水性ドメインを持つペプチド（１５〜３０残基）を含む、トランスフェクション剤を開示している。この薬剤はＣＨＡＲＩＯＴ（商標）として市販されており、これは、生物学的に活性なタンパク質、ペプチドおよび抗体を６０〜９５％の効率で培養哺乳類細胞内に直接送達する。ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）ペプチドはカーゴペプチドと非共有結合的な結合を形成する。これはタンパク質を安定化し、カーゴタンパク質を分解から保護し、トランスフェクション過程の間、カーゴタンパク質が本来持っている特徴を維持する。共有結合は必要でないものの、送達前にＣＨＡＲＩＯＴ（商標）とカーゴペプチドとの混合物を調製する必要がある。
【００１０】
一般に、タンパク質導入ドメインＴａｔ、ＶＰ２２およびアンテナペディアタンパク質は、所望の細胞内へのペプチドの送達を成功させるために、組換え融合タンパク質の製造などといった、化学反応または生物学的過程によるカーゴ化合物またはカーゴ高分子への共有結合を必要とする。共有結合によって連結されたカーゴペプチドの製造は、潜在的に複雑であり、労働集約的であり、時間がかかる。カーゴタンパク質の輸送準備をそのような方法で行うと、カーゴペプチドの生物学的機能の失活も起こる。市販のタンパク質導入ドメインペプチドＣＨＡＲＩＯＴ（商標）は共有結合を必要としないが、細胞に適用する前に、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）とカーゴペプチドとの混合物を作製する必要がある。この混合時間も潜在的に多くの時間を必要とする。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の一部の実施形態は、単離された細胞内に異種化合物を輸送する方法であって、ポリカチオン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ペプチドである少なくとも一つの化合物を含む組成物で、細胞を前処理するステップ、および前処理した細胞内に異種化合物を輸送するステップを含む方法に向けられる。
【００１２】
一部の好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である。好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である。より好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である。一部の好ましい実施形態では、ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる。
【００１３】
一部の好ましい実施形態では、細胞を前処理するための組成物がカチオン性ペプチドを含む。好ましい一実施形態では、カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである。これに代わる好ましい一実施形態では、カチオン性ペプチドがポリアルギニンである。
【００１４】
好ましい実施形態では、異種化合物がペプチド誘導体である。一部の好ましい実施形態では、異種化合物がタンパク質である。一部の好ましい実施形態では、異種化合物が酵素である。一部の好ましい実施形態では、異種化合物が抗体である。
【００１５】
好ましい実施形態では、異種化合物の輸送を受ける細胞が哺乳類細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞が爬虫類細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞が昆虫細胞である。好ましい実施形態では、細胞が卵母細胞である。
【００１６】
本発明の一部の好ましい実施形態は、ポリカチオン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ペプチドである少なくとも一つの化合物を持つ組成物で処理された少なくとも一つの単離された細胞を含むキットに向けられる。一部の好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である。好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である。より好ましくは、ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である。一部の好ましい実施形態では、ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる。
【００１７】
一部の好ましい実施形態では、細胞処理用の組成物がカチオン性ペプチドを含む。好ましい実施形態では、カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである。これに代わる好ましい実施形態では、カチオン性ペプチドがポリアルギニンである。
【００１８】
好ましい実施形態では、異種化合物の輸送を受けるべき細胞が哺乳類細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞が爬虫類細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞が昆虫細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞が卵母細胞である。
【００１９】
本発明のさらなる側面、特徴および利点は、以下に記載する好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるだろう。
【００２０】
本発明のこれらの特徴および他の特徴を、以下に、本発明の限定ではなく例示を意図する好ましい実施形態の図面を参照しながら説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ここに記述する実施形態は本発明の好ましい実施形態を表すが、当業者であれば本発明の要旨から逸脱することなく変更形態を考えつくであろうと理解すべきである。したがって本発明の範囲は本願請求項によってのみ決定されるべきである。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態は、生体膜を横切る細胞内への異種化合物の輸送に関する。本明細書で使用する「生体膜」という用語は、細胞または細胞群を細胞外空間から分離する脂質含有障壁を指す。生体膜には、形質膜、細胞壁、細胞内小器官膜、例えばミトコンドリア膜、核膜などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
異種化合物には、輸送を受ける細胞にとってネイティブでない化合物、および異種化合物の輸送を受ける細胞タイプに通常見出しうる化合物が含まれうる。本発明の好ましい実施形態では、異種化合物が、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはその類似体である。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが抗原または抗体であってもよい。しかし、他のタイプの化合物も、本明細書に記載する方法によって細胞内に輸送することができる。例えば異種化合物には、金属イオン（これは典型的には金属キレートとして送達される）、小有機分子、および他の高分子、例えば核酸、ならびにその類似体が含まれうるが、これらに限定されるわけではない。一部の実施形態では、異種化合物がペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００２４】
「カーゴ」という用語は、細胞内に輸送される異種分子を指すために用いられる。
【００２５】
本明細書で使用する「高分子」という用語は、例えば生物学的起源または合成的起源を持つペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（ただしこれらに限定されるわけではない）によって例示されるような、大きな分子（１０００ダルトンを超える分子量）を指す。「小有機分子」とは、１０００ダルトン以下の分子量（ＭＷ）を持つ炭素含有物を指す。
【００２６】
本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接合されたＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物の一本鎖で構成される化合物を指す。一般にペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸残基を含有し、長さが約５０アミノ酸未満である。
【００２７】
本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって連結された、線状に配置されたアミノ酸から構成されるが、ペプチドとは対照的に、明確なコンフォメーションを持つ化合物を指す。タンパク質は、ペプチドとは異なり、一般に、５０個以上のアミノ酸の鎖からなる。
【００２８】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基の数が少なくとも２であって、一つ以上のペプチド結合を含有するポリマーを指す。「ポリペプチド」はペプチドおよびタンパク質を包含し、そのポリペプチドが明確なコンフォメーションを持つかどうかを問わない。
【００２９】
「ポリカチオン」という用語は、生理的ｐＨで正に帯電した基を数多く持つ高分子を指す。高分子はタンパク質、ペプチドまたはポリマーであることができる。
【００３０】
「細胞」という用語は、インビトロ細胞とインビボ細胞の両方を指す。本明細書に記載する方法は、インビトロでも、インビボでも、細胞に化合物を輸送するために使用することができる。例えばカーゴ化合物は、より大きな生物内にある原位置の細胞に輸送することができる。一部の実施形態では、細胞にインビトロで輸送を行った後、その細胞をインビボの組織または生物に輸送することができる。
【００３１】
本明細書で使用する「輸送剤」という用語は、細胞への高分子の送達を助長する薬剤を指す。好ましい実施形態では、高分子がペプチドまたはタンパク質であり、細胞が哺乳類細胞である。輸送試薬は一般に、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）、ポリアセタール、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの、カチオンまたはポリカチオンである。輸送剤は、ポリ（リジン）のように非分解性であってもよいし、分解性であってもよい。生理的ｐＨでより安定な、アセタール結合を含有する酸感受性ポリマー（ポリアセタール）も使用することができる。
【００３２】
分解性ポリマーを合成する方法は、米国出願第１０／６９２，５７３号（２００３年１０月２４日出願）および第１０／６５１，３９４号（２００３年８月２８日出願）に教示されている。どちらの出願も参照により本明細書に組み入れられる。簡単に述べると、分解可能な架橋を持つカチオン性ポリマーは、カチオン性繰り返し単位と架橋単位とを含む。「カチオン性繰り返し単位」という用語は、ここではその通常の意味で、例えば、合成ポリマーのポリマー主鎖または側鎖に組み込まれる、または合成ポリマーのポリマー主鎖または側鎖への組み込みに適した、正に帯電した種々の化学基を指すために用いられる。好ましいカチオン性繰り返し単位は、正に帯電したアミン基を含む。正に帯電したアミン基には、酸性条件下で正に帯電する１級、２級および３級アミン、ならびに幅広いｐＨ範囲にわたって正に帯電する４級アミンが含まれる。最も好ましくは、カチオン性繰り返し単位が４級アミン基を含む。ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリエチレンイミン、およびポリプロピレンイミンは、カチオン性繰り返し単位を含む好ましい合成ポリマーの限定でない例である。
【００３３】
カチオン性繰り返し単位は、対応するカチオン性モノマーの重合によって、または後反応によって、ポリマーに組み込むことができる。重合は共重合であることができ、当業者に広く知られている技法を使って、逐次重合機序および連鎖重合機序を含むさまざまな重合機序で進行させることができる。Ｇ． Ｏｄｉａｎ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」第３版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ （１９９１）参照。重合に適した好ましいカチオン性モノマーの限定でない例には、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノプロピル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、およびポリ（アミドアミン）デンドリマーなどがある。カチオン性モノマーは市販されているか、当業者に知られている方法によって合成することができる。
【００３４】
架橋ポリマーは、その末端以外の位置で互いに結合されたポリマー鎖を含有する。Ｇ． Ｏｄｉａｎ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」第３版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ （１９９１）参照。本明細書で使用する「架橋単位」という用語は、２本の鎖間の結合位置の一部または全部を形成する化学基を指す。したがって架橋単位は、２本以上のポリマー鎖に、その鎖の末端以外の位置で取り付けられる。架橋単位は、適切な架橋剤の存在下でポリマーを形成させることによって、またはポリマーを互いに反応させて結合点を形成させることによって、ポリマー鎖中に組み込むことができる。
【００３５】
架橋単位は、好ましくは、アセタール、イミンおよびヒドラゾンからなる群より選択される少なくとも第１の分解可能な単位と、エステル、ホスホエステル、アミド、無水物およびウレタンからなる群より選択される少なくとも第２の分解可能な単位とを含む。第１の分解可能な単位は好ましくは酸不安定性であり、第２の分解可能な単位は好ましくは加水分解可能である。好ましい架橋剤は、典型的には、モノマーと反応させることで、結果として生じるポリマーと架橋単位とを相互に結合させるのに適した、重合可能な基を含む。好ましい架橋剤は、上述した第１および第２の分解可能な単位を含んでもよいし、ポリマーへの架橋剤の組み込みによって形成された架橋単位を後反応に付すことによって、分解可能な単位を形成させることもできる。好ましい架橋剤は式：Ｒ１ｘ−（−Ｘ−Ｒ３−Ｙ−）ｚ−Ｒ２ｙによって表される（式中、Ｒ１およびＲ２は重合可能な基であり、Ｒ３は連結基であり、Ｘは、アセタール、イミンおよびヒドラゾンからなる群より選択される第１の分解可能な単位であり、Ｙは、エステル、ホスホエステル、アミド、無水物、およびウレタンからなる群より選択される第２の分解可能な単位であり、ｘおよびｙは１〜３の範囲の整数であり、ｚは１〜５の範囲の整数である）。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、イソチオシアネート、イソシアネート、エポキシド、アルデヒド、塩化アシル、塩化スルホニル、無水物、マレイミド、カルボン酸、カルボン酸エステル、ヒドロキシル、アミン、およびアミドからなる群より、それぞれ独立して選択される。好ましくは、Ｒ３は、炭素数６〜１０のアリール、炭素数４〜１０のシクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２Ｏ）ｎ−、および−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−からなる群より選択される（式中、ｎは１〜約１００の範囲にあり、より好ましくは１〜約５の範囲にある）。架橋剤は、含まれるべき基（例えば重合可能な基、第１の分解可能な基および第２の分解可能な基）の性質に応じて、商業的供給源から入手するか、当業者に知られている方法で合成することができる。
【００３６】
カチオン性繰り返し単位と架橋単位とを含む合成ポリマーは、好ましくは、架橋剤の存在下でカチオン性モノマーを重合することによって製造される。モノマー中および架橋剤中の重合可能な基の性質に応じて、さまざまな重合方法を使用することができる。好ましい一実施形態では、カチオン性モノマーは、当該モノマーが適切な架橋剤と反応できるように２個以上の活性水素を持つ、脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素または芳香族炭化水素である。
【００３７】
架橋剤の存在下でのカチオン性モノマーの重合は、好ましくは、適切な溶媒または懸濁媒体中で行われる。カチオン性モノマーと架橋剤との割合は重大な問題ではなく、日常的な実験で決定することができる。ポリアミンモノマーの場合、反応物比（架橋剤中のアミン反応性官能基当量数−対−ポリアミンモノマー中のアミン水素当量数として表したもの）は、好ましくは、約１：１０〜約１：１の範囲にある。より好ましくは、約１：５〜約４：５の範囲の反応物質比を使用する。式：Ｒ１ｘ−（−Ｘ−Ｒ３−Ｙ−）ｚ−Ｒ２ｙで表される架橋剤の場合、アミン反応性官能基当量数はｘ＋ｙに等しい。ポリアミンに関して、アミン水素当量数は、窒素原子に結合している反応性水素原子の数である。
【００３８】
好ましい実施形態では、ポリマーがポリアセタールである。ポリアセタールは、アセタール（−Ｏ−ＣＨＲ−Ｏ−）繰り返し単位を含有するポリマーである。好ましくは、Ｒはメチルである。好ましいポリアセタールは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）：
【化１】
からなる群より選択される式によって表される繰り返し単位を含む。
【００３９】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ａは、少なくとも一つのアセタール基を含むリンカー基を表し、Ｂは、−ＣＨ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＨ２ＣＨ−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ−、および−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）−からなる群より選択され、Ｚは、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２、およびＶＵからなる群より選択され、Ｖはリンカー基であり、Ｕは、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、ポリ（リジン）、ＰＡＭＡＭデンドリマー、オクタアミンデンドリマー、ヘキサデカアミンデンドリマー、エンハンサー、およびターゲティングレセプター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群より選択され、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より、それぞれ独立して選択され、Ｄは、カルボン酸アミド、カルボン酸エステル、尿素、およびウレタンからなる群より選択される結合であり、そしてＧは、Ｃ４〜Ｃ２０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−からなる群より選択される（式中、ｎは１〜約２５０の範囲にある）。この文脈において、「リンカー基」とは、ある化学基を別の化学基に接合する二官能性化学基である。リンカー基は単一の二官能性化学基、例えばアミドなどを含有することができ、あるいは二つの化学基、例えばアミド−アミド、アミド−アルキル、アルキル−アミド、アミン−アミド、またはチオエーテル−アミドなどを含有してもよい。好ましいリンカー基の例には、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ９−、−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）ＮＨなどがある（式中、Ｒ９は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より選択される）。少なくとも一つのアセタール基を含むリンカー基の例には、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、および−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−などがある。
【００４０】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）内のＵに関して、ＰＥＩおよびＰＰＩを使用する場合、それらは、好ましくは約２００〜約１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を持つ。ポリ（リジン）を使用する場合、それは約２００〜約５０，０００ダルトンの範囲にある分子量を持つ。ここで言及するポリマーの分子量は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（光散乱検出器）によって測定される重量平均分子量である。
【００４１】
この文脈において、「エンハンサー」とは、真核細胞へのペプチド送達またはタンパク質送達の効率を増進することができる官能基であり、「ターゲティングレセプター」とは、細胞表面上の特異的レセプターを認識することができる官能基である。上述の定義は相互排他的ではないので、Ｕは、エンハンサーであり、かつターゲティングレセプターであることもできる。好ましくは、Ｕは、脂質、コレステロール、トランスフェリン、抗体、抗体断片、ガラクトース、マンノース、リポタンパク質、リソソーム作用剤、および融合誘導剤からなる群より選択される。エンハンサーおよびターゲティングレセプターは、さまざまな方法で（例えばリンカー基Ｖを介したポリアセタールへの共有結合によって、またはエンハンサーおよび／もしくはターゲティングレセプターをＺにコンジュゲートすることによって、またはその両方によって）、ポリアセタールに取り付けることができる。したがって、二つ以上のエンハンサーおよび／またはターゲティングレセプターを、ポリアセタールに取り付けることができる。
【００４２】
ポリアセタールはコポリマーであってもよく、したがって、二つ以上の異なる式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位および／または他の繰り返し単位を含有しうる。したがって、「式（Ｉ）のポリアセタール」「式（ＩＩ）のポリアセタール」「式（Ｉ）のポリマー」および「式（ＩＩ）のポリマー」などの用語は、本質的に式（Ｉ）または式（ＩＩ）の繰り返し単位からなるホモポリマーだけでなく、コポリマーも包含する。
【００４３】
ポリアセタールの製造にはさまざまな方法を使用することができる。好ましい方法は、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）からなる群より選択される式で表されるモノマーを、式（Ｖ）で表される式を持つコモノマーと反応させることを含む。
【化２】
式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）において、Ａ、Ｂ、ＺおよびＧは上記と同じ意味を持ち、Ｅは、好ましくは−ＯＨ、−ＮＨ２、および−ＮＨ（ＣＨ３）からなる群より選択される反応性末端基であり、そしてＣは、好ましくはイソシアネート、ＮＨＳ−エステル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸塩化物および無水物からなる群より選択される反応性末端基である。重合反応条件は、反応性末端基ＥおよびＣの性質に応じて、当業者に広く知られている方法で調節される。Ｇ． Ｏｄｉａｎ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」第３版（１９９１）参照。任意に、適合する反応性末端基を持つ一つ以上の追加コモノマーの存在下で、重合を行ってもよい。好ましくは、混合物中のモノマー（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）対コモノマー（Ｖ）のモル比は約１：１であるが、正確な比率は、結果として生じるポリマーの分子量を調節するために、かつ／または追加コモノマーの存在について補償するために、変化させることができる。比率が１：１に近いほど、一般に高い分子量が達成される。モノマー（ＩＩＩ）／（ＩＶ）またはコモノマー（Ｖ）のどちらか一方をわずかに過剰に使用することにより、かつ／または少量の単官能性反応物を含めることにより、低い分子量を達成することができる。好ましくは、結果として生じるポリアセタール（例えば式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むポリマーまたはコポリマー）の分子量は、約１，０００ダルトン以上であり、より好ましくは約１，０００〜約２５０，０００ダルトンの範囲にある。
【００４４】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表される繰り返し単位には二つの種類が包含される。すなわち、一つは、ＺがＣ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、およびＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２からなる群より選択されるものであり、もう一つは、ＺがＶＵであるものである。ＺがＣ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、およびＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２からなる群より選択されるポリアセタールは、ＺがＶＵであるポリアセタールを製造するのに役立つ。例えば、ＺがＶＵであり、Ｖが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリアセタールは、好ましくは、式：Ｈ２ＮＵで表される化合物を、式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）：
【化３】
に示すような、ＺがＣ（Ｏ）ＯＲ１である式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリアセタールと反応させることによって製造される。
【００４５】
式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）において、Ｕ、Ａ、Ｂ、ＤおよびＧは上記と同じ意味を持ち、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より、それぞれ独立して選択される。式：Ｈ２ＮＵで表される化合物に関して、Ｕは上記と同じ意味を持つ。式：Ｈ２ＮＵで表される化合物と式（ＶＩＩ）または式（ＶＩＩＩ）のポリアセタールとの反応は、好ましくは、ジメチルホルムアミドなどの極性溶媒中で行われる。式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）のポリアセタールは、上述のように式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）の対応するモノマーを反応させることによって製造することができる。「式（ＶＩＩ）のポリアセタール」「式（ＶＩＩＩ）のポリアセタール」「式（ＶＩＩ）のポリマー」または「式（ＶＩＩＩ）のポリマー」という用語を本明細書で使用する場合、これらの用語は、本質的に式（ＶＩＩ）または式（ＶＩＩＩ）の繰り返し単位からなるホモポリマーだけでなく、式（ＶＩＩ）および／または式（ＶＩＩＩ）の繰り返し単位を含むコポリマーも包含する。
【００４６】
好ましいポリアセタールの例には、式（ＩＸ）および式（Ｘ）：
【化４】
からなる群より選択される式で表される繰り返し単位を含むものがある。
【００４７】
式（ＩＸ）および式（Ｘ）において、Ｚは上記と同じ意味を持ち、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈおよび−ＣＨ３からなる群より、それぞれ独立して選択され、Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−からなる群より選択され、そしてＹは、直鎖状または分枝状のＣ４Ｈ８、Ｃ５Ｈ１０、Ｃ６Ｈ１２、Ｃ７Ｈ１４、Ｃ８Ｈ１６、Ｃ１０Ｈ２０、およびＣ１２Ｈ２４からなる群より選択される。Ｚは好ましくはＶＵであり、Ｖは好ましくはＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、Ｕは好ましくはポリ（エチレンイミン）、ポリ（リジン）、エンハンサー、またはターゲティングレセプターである。ポリ（エチレンイミン）は、好ましくは、約２００〜約１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を持ち、ポリ（リジン）は、好ましくは、約２００〜約５０，０００ダルトンの範囲にある分子量を持つ。好ましいエンハンサーの限定でない例には、脂質、コレステロール、リポタンパク質、脂肪酸、リソソーム作用剤、および融合誘導剤からなる群より選択されるものがある。好ましいターゲティングレセプターの限定でない例には、トランスフェリン、抗体、抗体断片、ガラクトース、およびマンノースからなる群より選択されるものがある。
【００４８】
式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位を含むポリアセタールは、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）の繰り返し単位を含むポリアセタールの製造について上述したものと同じ一般的方法で製造することができる。例えば、好ましい一実施形態は、式（ＸＩ）および式（ＸＩＩ）からなる群より選択される式で表されるモノマーを、式（ＸＩＩＩ）で表されるコモノマーと反応させることを含む方法を提供する（式中、Ｘ、ＹおよびＺは、上記式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位の場合と同じ意味を持つ）。
【化５】
式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位を含むポリアセタールは、式：Ｈ２ＮＵの化合物を、式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）からなる群より選択される式で表される繰り返し単位を含むポリマーと反応させることによって製造することもできる（式中、ＸおよびＹは、上記式（ＩＸ）および式（Ｘ）の繰り返し単位の場合と同じ意味を持つ）。
【化６】
もう一つの好ましい実施形態は、式（ＸＩ）で表されるモノマーを提供する。そのようなモノマーを製造するための好ましい方法は、式（ＸＶＩ）で表されるジビニルエーテルを、非アルコール性有機溶媒中の酸の存在下に、約２当量の式（ＸＶＩＩ）で表される化合物と反応させることを含む。
【化７】
式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−からなる群より選択され、Ｚは、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１、Ｃ（Ｏ）ＳＲ１、およびＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２からなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、およびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群より、それぞれ独立して選択され、Ｍは、９−フルオレニルメチルカルバメート、活性アミド、および環状イミドからなる群より選択される保護基であり、Ｒはメチルまたは水素であり、そしてｎは１または２である。
【００４９】
輸送試薬には、ポリカチオン性またはカチオン性脂質に基づく担体、ポリカチオン性またはカチオン性ポリマーに基づく担体、ポリカチオン性またはカチオン性脂質−ポリマーに基づく担体、ポリカチオン性またはカチオン性多糖に基づく担体、およびポリカチオン性またはカチオン性タンパク質またはペプチドに基づく担体も含まれる。輸送試薬はデンドリマーであることができる。輸送試薬は、上に列挙した化合物の二つ以上の組み合わせであることができる。それら二つ以上の化合物は共有結合によって連結されていてもよいし（例えば図８のＰＡ−ＰＥＩを参照されたい）、二つ以上の化合物の混合物として使用してもよい（例えば図８のＤ２２およびＤ２３を参照されたい）。さらなる具体例として、市販の活性化デンドリマー系トランスフェクション剤であるＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））、ならびに線状ポリエチレンイミン誘導体であるｊｅｔＰＥＴ（商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）が挙げられる。さらなる具体例を図８に示す。これらの例は単なる例示であって、決して、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００５０】
一部の実施形態では、細胞内への異種化合物の輸送に先だって、受容細胞を処理するために輸送試薬を使用する。しかし、本発明の新規な特徴の一つは、輸送剤による細胞の処理が、受容細胞内へのポリペプチドおよび他の異種化合物の細胞内輸送を可能とするのに十分だということである。
【００５１】
本発明の実施形態は全ての細胞タイプに適用することができるが、特に真核細胞、より具体的には哺乳類細胞に適用することができる。
【００５２】
本発明者らは、カチオン性ポリマーによるペプチド細胞送達阻害の程度を実証するために、一連の実験を行った。意外なことに、本発明者らは、カチオン性ポリマーの存在下では、ペプチド送達が阻害されるのではなく、むしろ増進されることを見出した。具体的に述べると、以下の実施例で例示するように、ｊｅｔ−ＰＥＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）は、ビオチン標識Ｔａｔペプチドによって媒介されるペプチド送達を増進した。さらなる実験で、本発明者らは、意外にも、ポリカチオン性ポリマーによる細胞の処理が細胞内へのペプチド送達を可能とするのに十分であることを見出した。輸送体でないペプチド、ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦが、ｊｅｔ−ＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔで処理しておいたＨｅＬａ細胞内に、うまく輸送された。ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ単独では全く導入を示さなかったことから、ポリカチオン性ポリマーが細胞内へのペプチドの輸送を担っていることが確認された。ヒト線維芽細胞についてもペプチド輸送が示された。本発明者らは、カチオン性ペプチドまたはカチオン性ポリマーによる受容細胞の前処理が、細胞内へのペプチドおよび／またはタンパク質の効率のよい送達をもたらしうることを発見した。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態は、関心対象の細胞をカチオン性ポリマーまたはカチオン性ペプチドで前処理するステップを含む、改良された、細胞内へのペプチド送達方法に向けられる。本発明の好ましい実施形態を実施することにより、輸送剤と輸送されるべき異種化合物との間で、何らかの共有結合反応を行うことは不必要になる。また、哺乳類細胞内へのペプチド送達に先だって混合物を調製する必要もない。インビトロおよびインビボの細胞に関して、ペプチド送達が劇的に簡略化される。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ペプチド送達の２４時間前に、９６ウェルプレートに、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）を接種した。送達前に培地を捨て、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ中の輸送剤（ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理した細胞を、カーゴであるビオチン−Ｔａｔ（ビオチン−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ，１０μＭ）と共に、ＰＢＳ中、３７℃で９０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで、室温にて５分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１０％メタノールで、室温にて１０分間処理した。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ培地中、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、シグナルを蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１Ａ〜Ｄに示す。ビオチンをストレプトアビジン−ＦＩＴＣと併用することにより、ＨｅＬａ細胞中の輸送されたペプチドを、顕微鏡で可視化することができた。図１Ｃおよび図１Ｄは、細胞をｊｅｔ−ＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔのどちらか一方で前処理しておいた場合に起こる輸送の増進を示す。
【００５５】
実施例２
輸送剤（Ｔａｔ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号２），１ｍＭまたは１０ｍＭ）、ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理した細胞をカーゴであるビオチン−Ｔａｔ（ビオチン−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ，３０μＭ）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図２Ａ〜Ｅに示す。この実施例では、ビオチン−Ｔａｔをカーゴとして使用し、図２Ｂおよび図２ＣではＴａｔを輸送剤として使用した。
【００５６】
実施例３
前処理のために、輸送剤（ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理した細胞をカーゴであるビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図３Ｂおよび図３Ｅに示す。
【００５７】
同時処理のために、試験管で、輸送剤（ｊｅｔＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）とカーゴであるビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦとの両方を、３７℃で３０分間混合した。その後、その混合物をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図３Ｃおよび図３Ｆに示す。
【００５８】
ペプチドの送達は、細胞前処理剤として使用した輸送剤（図３Ｂおよび図３Ｅ）または同時に使用した輸送剤（図３Ｃおよび図３Ｆ）によって助長された。図３Ａは、ペプチドおよびポリカチオンなしの無処理対照細胞を示す。図３Ｄは、細胞処理なしの対照処理を示す。
【００５９】
実施例４
この実施例では、さまざまな分子量を持つＰＥＩ化合物（ＰＥＩ（分子量２５，０００）、ＰＥＩ（分子量１０，０００）、ＰＥＩ（分子量１，８００）、ＰＥＩ（分子量１，２００）、ＰＥＩ（分子量６００））を、輸送剤として、ＨｅＬａ細胞内への輸送に使用した。細胞を３７℃で３０分間前処理した。カーゴはビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ）とした。ＰＢＳで洗浄した後、処理された細胞をカーゴと共に３７℃で１０分間インキュベートした。実施例３の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６０】
実施例５
独自のカチオンポリマーを、それらがＨｅＬａ細胞内へのビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ）の輸送に及ぼす効果について試験した。カチオン性ポリマー（ＰＥＩ６００＋ＧＤＥ、ＰＥＩ６００＋ＧＤＥ、ＢＡＰＥＤＡ＋ＤＴＭＯＰＴＡ、ＰＡ−ＰＥＩ−１，２００、およびＰＡ−ＰＥＩ−１，８００；構造については図８参照）をＨｅＬａ細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をビオチン−ペプチドと共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図５Ａ〜Ｇに示す。この実施例で使用したカチオン性ポリマーの構造を図８に示す。
【００６１】
実施例３〜４の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６２】
実施例６
実施例６は、ポリアルギニン（Ｒ７Ｃ，ＲＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号１））、ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を含むさまざまな輸送剤によるＨＴ１０８０細胞（ヒト線維芽細胞）の前処理の効果を示す。細胞の前処理は３７℃で３０分間行った。ＰＢＳで洗浄した後、処理した細胞をカーゴ（ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（１ｍＭ））と共に３７℃で１０分間インキュベートした。結果を図６Ａ〜Ｄに示す。
【００６３】
実施例６は、ここに記載する方法を、他の細胞タイプに広く応用できることを示している。実施例３〜５の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６４】
実施例７
実施例７は、輸送剤としてポリアルギニンＲ７Ｃ（ＲＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号１））、ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使った、ＨｅＬａ細胞内へのβ−ガラクトシダーゼタンパク質の輸送を示す。簡単に述べると、β−ガラクトシダーゼを５００ｎＭの濃度でＰＢＳに溶解した。ペプチド送達の２４時間前に、９６ウェルプレートに、ＨｅＬａ細胞を接種した。送達前に、培地を捨て、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。輸送剤を各ウェルに加え、３７℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中のβ−ガラクトシダーゼ（５００ｎＭ）を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒドで、室温にて５分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＸ−ｇａｌ染色溶液（ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬ Ｘ−ｇａｌ、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）と共に３７℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、シグナルを顕微鏡で観察した。結果を図７Ａ〜Ｅに示す。
【００６５】
この実施例は、ここに記載する方法を、ペプチドだけでなくタンパク質にも使用しうることを示している。実施例３〜６の場合と同様に、ＴＡＴなどの担体は、効率のよいペプチド送達には必要でなかった。
【００６６】
本発明の要旨から逸脱せずに数多くのさまざまな変更を加えうることは、当業者には理解されるだろう。したがって、本発明の形態は単なる例示であって、本発明の範囲を限定しようとするものでないことは、明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１Ａは、無処理のＨｅＬａ細胞を示す。図１Ｂは、ビオチン−Ｔａｔと共にインキュベートした後のＨｅＬａ細胞を示す。図１Ｃは、ＨｅＬａ細胞内へのビオチン−Ｔａｔの輸送にｊｅｔ−ＰＥＩが及ぼす効果を示す。図１Ｄは、ＨｅＬａ細胞内へのビオチン−Ｔａｔの輸送にＳｕｐｅｒＦｅｃｔが及ぼす効果を示す。
【図２】図２Ａは、無処理のＨｅＬａ細胞である対照を示す。図２Ｂおよび図２Ｃは、ペプチド輸送に１ｍＭおよび１０ｍＭのＴａｔが及ぼす効果を示す。図２Ｄおよび図２Ｅは、ＨｅＬａ細胞内へのビオチン−Ｔａｔの輸送にｊｅｔ−ＰＥＩおよびＳｕｐｅｒＦｅｃｔが及ぼす効果を示す。
【図３】ｊｅｔ−ＰＥＩ（図３Ｂおよび図３Ｃ）またはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（図３Ｅおよび図３Ｆ）で前処理（図３Ｂおよび図３Ｅ）または同時処理（図３Ｃおよび図３Ｆ）したＨｅＬａ細胞内へのペプチド輸送を示す。図３Ａは、ペプチドおよびポリカチオンなしの無処理対照細胞を示す。図３Ｄは、細胞処理なしの対照処理を示す。
【図４】さまざまな分子量のＰＥＩ化合物を輸送剤として用いたＨｅＬａ細胞内へのペプチド輸送を示す。分子量２５，０００（図４Ａ）、１０，０００（図４Ｂ）、１，８００（図４Ｃ）、１，２００（図４Ｄ）および６００（図４Ｅ）のＰＥＩを試験した。図４Ｆは対照（細胞の前処理なし）を示す。
【図５】ＨｅＬａ細胞へのペプチド送達に種々のカチオン性ポリマーが及ぼす効果を示す。図５Ａは、細胞前処理なしの対照処理を示す。図５Ｂは、ＰＥＩ６００＋ＧＤＥ（構造については図８参照）を示す。図５Ｃは、ＰＥＩ６００＋ＧＤＥを示す。図５Ｄおよび図５Ｅは、二つの異なる比率で使用したＢＡＰＥＤＡ＋ＤＴＭＯＰＴＡ（構造については図８参照）を示す。図５Ｆは、ポリアセタール−ＰＥＩ１２００を示す。図５Ｇは、ポリアセタール−ＰＥＩ１８００を示す。ポリカチオンの構造については図８を参照されたい。
【図６】ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維芽細胞）内へのペプチド（ビオチン−ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ）の輸送に輸送剤Ｒ７Ｃ（ＲＲＲＲＲＲＲＣ）（配列番号１）（図６Ｂ）、ｊｅｔ−ＰＥＩ（図６Ｃ）、およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（図６Ｄ）が及ぼす効果を示す。図６Ａは、輸送剤の不在下でのペプチド輸送を示す。
【図７】ポリアルギニンＲ７Ｃ（ＲＲＲＲＲＲＲＣ）（配列番号１；図７Ｃ）、ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）（図７Ｄ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）（図７Ｅ）を使ったＨｅＬａ細胞内へのβ−ガラクトシダーゼの輸送を示す。図７Ａは、輸送剤なしでのβ−ガラクトシダーゼの輸送を示す。図７Ｂは、カーゴを加えなかった陰性対照である。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例５および図５Ａ〜Ｇで使用したポリカチオン化合物の構造を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例５および図５Ａ〜Ｇで使用したポリカチオン化合物の構造を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された細胞内に異種化合物を輸送する方法であって、
ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよびカチオン性ペプチドからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む組成物で、単離された細胞を前処理すること、および
前処理した細胞内に異種化合物を輸送すること
を含む方法。
【請求項２】
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である、請求項１の方法。
【請求項３】
ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である、請求項２の方法。
【請求項４】
ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である、請求項２の方法。
【請求項５】
ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる、請求項２の方法。
【請求項６】
組成物がカチオン性ペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである、請求項６の方法。
【請求項８】
カチオン性ペプチドがポリアルギニンである、請求項６の方法。
【請求項９】
異種化合物がペプチド誘導体である、請求項１の方法。
【請求項１０】
異種化合物がタンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１１】
異種化合物が酵素である、請求項１の方法。
【請求項１２】
異種化合物が抗体である、請求項１の方法。
【請求項１３】
単離された細胞が哺乳類細胞、爬虫類細胞または昆虫細胞である、請求項１の方法。
【請求項１４】
細胞が卵母細胞である、請求項１の方法。
【請求項１５】
ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよびカチオン性ペプチドからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む組成物で処理された少なくとも一つの単離された細胞を含むキット。
【請求項１６】
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である、請求項１５のキット。
【請求項１７】
ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である、請求項１６のキット。
【請求項１８】
ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である、請求項１６のキット。
【請求項１９】
ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる、請求項１６のキット。
【請求項２０】
組成物がカチオン性ペプチドを含む、請求項１５のキット。
【請求項２１】
カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである、請求項２０のキット。
【請求項２２】
カチオン性ペプチドがポリアルギニンである、請求項２０のキット。
【請求項２３】
単離された細胞が哺乳類細胞、爬虫類細胞または昆虫細胞である、請求項１５のキット。
【請求項２４】
細胞が卵母細胞である、請求項１５のキット。
【請求項１】
単離された細胞内に異種化合物を輸送する方法であって、
ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよびカチオン性ペプチドからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む組成物で、単離された細胞を前処理すること、および
前処理した細胞内に異種化合物を輸送すること
を含む方法。
【請求項２】
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である、請求項１の方法。
【請求項３】
ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である、請求項２の方法。
【請求項４】
ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である、請求項２の方法。
【請求項５】
ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる、請求項２の方法。
【請求項６】
組成物がカチオン性ペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである、請求項６の方法。
【請求項８】
カチオン性ペプチドがポリアルギニンである、請求項６の方法。
【請求項９】
異種化合物がペプチド誘導体である、請求項１の方法。
【請求項１０】
異種化合物がタンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１１】
異種化合物が酵素である、請求項１の方法。
【請求項１２】
異種化合物が抗体である、請求項１の方法。
【請求項１３】
単離された細胞が哺乳類細胞、爬虫類細胞または昆虫細胞である、請求項１の方法。
【請求項１４】
細胞が卵母細胞である、請求項１の方法。
【請求項１５】
ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよびカチオン性ペプチドからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む組成物で処理された少なくとも一つの単離された細胞を含むキット。
【請求項１６】
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン誘導体である、請求項１５のキット。
【請求項１７】
ポリエチレンイミン誘導体が生分解性である、請求項１６のキット。
【請求項１８】
ポリエチレンイミン誘導体がｐＨ感応分解性である、請求項１６のキット。
【請求項１９】
ポリエチレンイミン誘導体が脂質とコンジュゲートされる、請求項１６のキット。
【請求項２０】
組成物がカチオン性ペプチドを含む、請求項１５のキット。
【請求項２１】
カチオン性ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔである、請求項２０のキット。
【請求項２２】
カチオン性ペプチドがポリアルギニンである、請求項２０のキット。
【請求項２３】
単離された細胞が哺乳類細胞、爬虫類細胞または昆虫細胞である、請求項１５のキット。
【請求項２４】
細胞が卵母細胞である、請求項１５のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５１６６１１（Ｐ２００８−５１６６１１Ａ）
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７０３２（Ｐ２００７−５３７０３２）
【出願日】平成１７年１０月１７日（２００５．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３７６３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４４９８６
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１７日（２００５．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３７６３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４４９８６
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
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