細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果の評価方法
【課題】
低濃度の物質のイオンチャンネル活性への影響を評価することを可能にするために、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの活性を測定する際に、細胞内のＣａ２＋イオン濃度を制御する技術を開発すること。
【解決手段】 細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル前処理方法を提供する。本発明の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類のＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
低濃度の物質のイオンチャンネル活性への影響を評価することを可能にするために、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの活性を測定する際に、細胞内のＣａ２＋イオン濃度を制御する技術を開発すること。
【解決手段】 細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル前処理方法を提供する。本発明の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類のＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果の評価方法に関し、より具体的には、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果のハイスループット評価系において感度及び再現性を向上させるためのサンプル処理方法と、該方法に用いるサンプル処理用試薬と、該試薬を含むサンプル処理用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルは細胞機能に重要な役割を担っており、創薬研究や分子生物学の研究ターゲットとなっている。例えば、ＢＫＣａチャンネル（large conductance Ca2+-activated K+ channels）、ＩＫＣａ（intermediate conductance Ca2+-activated K+channels）及びＳＫＣａ（small conductance Ca2+-activated K+ channels）は、細胞質のＣａ２＋イオン濃度の上昇によって敏感に活性化される点で、他のカリウムイオンと異なる特徴がある。これらのうちＢＫＣａチャンネルは、平滑筋、脳、膵臓、膀胱等の組織に存在し、神経や筋肉の興奮性、神経伝達物質の放出、ホルモンの分泌、蝸牛細胞のチューニング、自然免疫の他、脈管、気管、子宮、胃腸及び膀胱の平滑筋の緊張弛緩の調節等の多様な細胞の機能に関与する（非特許文献１）。そこで、ＢＫＣａチャンネルをはじめとする細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに作用する物質をスクリーニングすることによって新規な創薬シーズを探索する作業が始まっている。
【非特許文献１】Ｇｈａｔｔａ、Ｓ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１１０：１０３−１１６（２００６） 近年の自動パッチクランプ装置の進歩により、多数の創薬候補物質についてハイスループットな手法でイオンチャンネル活性への影響を評価する実験が可能になった。しかし、他のイオンチャンネルとは異なり、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルは、細胞内のＣａ２＋イオン濃度の変化に敏感に反応するため、ノイズが高くなり、低濃度の物質のイオンチャンネル活性への影響を評価することが困難であるという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、低濃度の物質のイオンチャンネル活性への影響を評価することを可能にするために、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの活性を測定する際に、細胞内のＣａ２＋イオン濃度を制御する技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理方法を提供する。
【０００５】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの場合がある。
【０００６】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【０００７】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（O,O'-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraaceticacid, tetraacetoxymethyl ester）と、ＧＥＤＴＡ−ＡＭ（O,O'-Bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraaceticacid, pentaacetoxymethyl ester）と、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類のＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【０００８】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤はＢＡＰＴＡ−ＡＭの場合がある。
【０００９】
本発明は、細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤を含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理用試薬を提供する。
【００１０】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの場合がある。
【００１１】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【００１２】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【００１３】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤はＢＡＰＴＡ−ＡＭの場合がある。
【００１４】
本発明は、前記本発明の方法のいずれかを説明する使用説明書と、前記本発明の試薬のいずれかとを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネル活性測定のためのサンプル処理用キットを提供する。
【００１５】
本発明において、前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子とは、細胞内Ｃａ２＋イオンの濃度に応じて生理機能が調節されるいずれかの分子をいい、カルモジュリン及びこれにより機能が調節されるＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫ）と、カルシニューリンその他のカルシウム依存性タンパク質ホスファターゼと、カルパインその他のカルシウム依存性プロテアーゼと、トロポニン、カルデスモンその他のカルシウム依存性フィラメントタンパク質と、カリウムイオンを輸送するＢＫＣａチャンネル、ＩＫＣａチャンネル及びＳＫＣａチャンネル、塩素イオンを輸送するカルシウム依存性Ｃｌチャンネル、陽イオン輸送チャンネルであるＴＲＰ（Transient Receptor Potential）その他の細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルとを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明において細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤とは、細胞外から細胞質に流入したカルシウムイオン及び／又は細胞内の貯蔵部位から細胞質に放出されたカルシウムイオンと結合して錯体又は複合体を形成する物質をいう。本発明の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、細胞の外から内へ細胞膜を透過することができる物質が好ましい。かかる物質は、Ｃａ２＋イオンキレート剤の親水性の原子団を疎水性の化合物と反応させることによって調製することができる。本発明の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、いったん細胞外から細胞内に入ると、細胞膜を透過する能力を喪失して、細胞内に止まる物質が好ましい。かかる物質は、Ｃａ２＋イオンキレート剤の親水性の原子団を疎水性の化合物と反応させる際に、細胞内に豊富に存在する酵素によって分解することができる反応を利用することによって調製することができる。好ましい反応はアセトキシメチルエステル化反応であり、該反応による結合は細胞内のエステラーゼにより加水分解される。好ましい細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明におけるサンプル処理とは、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の前の段階で被検サンプルの細胞に施す処理、及び／又は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の段階で被検サンプルの細胞に施す処理をいう。すなわち、本発明のサンプル前処理方法は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の前の段階か、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の段階か、機能測定の前の段階と機能測定の段階との両方ともかにおいて、細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む。本発明におけるサンプル処理は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の際に細胞内のＣａ２＋イオン濃度を制御することが可能であることを条件として、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の前の段階及び／又は機能測定の段階の一部の期間だけ処理を施してもかまわない。
【００１８】
本発明における細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネル活性測定は、手動パッチクランプ法と、自動パッチクランプ法とを含む電気生理学的方法と、膜電位色素を用いる光学的方法と、Ｒｂイオン流出によるカリウムチャンネル活性測定法とを含むが、これらに限定されない、さまざまな方法によって実施される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【実施例１】
【００２０】
自動パッチクランプによる細胞内カリウムイオンの測定用溶液の調製
ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）の製造者による使用説明書に基づいて実験に用いる溶液を調製した。すなわち、低塩素細胞内用バッファー（１２０ｍＭ Ｋ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、２０ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５〜７．３）、高塩素細胞内用バッファー（１４０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５〜７．３）、低塩素細胞外用バッファー（１２０ｍＭ Ｎａ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、１７ｍＭ ＮａＣｌ、４．０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ブドウ糖、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）及び高塩素細胞外用バッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ブドウ糖、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用意した。そして、細胞外から投与して細胞のカリウムイオンチャンネル活性への影響を調べる物質は前記細胞外用バッファーに希釈した。アムフォテリシンＢは最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように細胞内用バッファーに希釈した。
【００２１】
ＢＫＣａチャンネルアッセイ系
ヒトＢＫＣａチャンネルαサブユニット遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞にトランスフェクションして、ヒトＢＫＣａチャンネルαサブユニットを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞をサンプルとして用いた。フラスコ中で培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞を０．２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを添加したＰＢＳでインキュベーションすることにより、フラスコの基質から剥がし、ピペッティングにより単一細胞に分散した。本発明の前処理方法を実施する場合には、２〜２．５ｘ１０６個／ｍＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞の単一細胞懸濁液に２０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現する内在性のカルシウム依存性塩素イオンチャンネル（Ca2+-activated Cl channel、ＣＡＣＣ）の影響を防ぐため、ブロッカーとして３００μＭのＤＩＤＳ（4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid, disodium salt）を細胞外用バッファーに添加した。また、サンプルの細胞内カルシウムイオン濃度を安定的に制御するために、サンプルが測定チップ上でシールを形成した後で、１．２μＭのイオノマイシンを含む細胞外用バッファーに液を添加することにより、細胞外カルシウムイオンの流入を促進させた。また、得られた電流データがＢＫＣａチャンネルに特異的であることを確認するために、ＢＫＣａチャンネルに特異的なブロッカーであるＴＥＡ（tetraethylammonium）又はイベリオトキシン（iberiotoxin、ＩｂｅＴＸ）と、ＢＫＣａチャンネルに特異的なアクチベータであるｄｉＣｌＤＨＡＡ（１２，１４−ジクロロデヒドロアビエチン酸、Tomohiko Ohwadaら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 3971-3974 (2003)）又はＮＳ１６１９とを用いた。
【００２２】
ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏによるデータ取得
ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏはシングルホール・モードで使用した。まず、測定チップの細胞側に、無添加の細胞外用バッファーを注入し、測定チップの細胞と反対の側に無添加の細胞内用バッファーを注入して、ホールチェックを行った。その後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の単一細胞懸濁液を測定チップに添加した。シール形成を確認してから、測定チップの細胞内バッファーをアムホテリシンＢを添加したバッファーに交換して、穿孔パッチを形成させた。１５分経過後、第１回目の電流測定（pre電流測定）を行った。その後、ＤＩＤＳ及びイオノマイシンを含む細胞外バッファーを添加した。４０分経過後、第２回目の電流測定（post 1st電流測定）を行った。その後、ヒトＢＫＣａチャンネルαサブユニットの活性への影響を調べる対象の物質を含む細胞外バッファーを添加した。５５分経過後、第３回目の電流測定（post 2nd電流測定）を行った。
【００２３】
実験１．ＢＫＣａチャンネル発現の確認
図１の左側のグラフは、１．２μＭのイオノマイシンのみを添加する（太い実線）か、１．２μＭのイオノマイシン及び１０ｍＭのＴＥＡを添加した（細い実線）条件下で異なる波形（破線）の電位パルスを印加したときのＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータである。図１の右側のグラフは、１．２μＭのイオノマイシンのみを添加する（太い実線）か、１．２μＭのイオノマイシン及び３００ｎＭのイベリオトキシンを添加した（細い実線）条件下で異なる波形（破線）の電位パルスを印加したときのＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータである。図１に示すとおり、形状の異なる電位パルス波形に対する電流が、ＢＫＣａチャンネルに特異的なブロッカーであるＴＥＡでもＩｂｅＴＸでも８０％程度抑制されたことから、この８０％がＢＫＣａチャンネル活性によって発生した電流（以下、「ＢＫ電流」という。）と認められた。
【００２４】
図２は、ＢＫ電流の安定性を確認するため、−９０ｍＶから＋１００ｍＶへのステップパルスを１０秒間隔で５回印加したとき（図２−１）、ＤＩＤＳ及びイオノマイシン非存在下で得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの６つの波形図（図２−２）である。図２−２からわかるとおり、電流の大きさが安定するものもあるが、大きく変動する例が多く観察された。
【００２５】
図２−２で観察された電流変動の原因として考えられるのは、細胞のシールが不安定であったこと、及び、細胞内のカルシウムイオン濃度が変化したことである。このうちシールについては、シールが不安定である場合には−９０ｍＶ保持電流にも大きな変化があるはずだが、電流が安定した場合にも電流変動が見られたことからシールが不安定であったことによって電流変動を説明することはできない。そこで細胞内のカルシウムイオン濃度の変動を抑制するために、細胞内カルシウムイオンキレート剤を投与し、細胞内でカルシウムイオンの緩衝作用を発揮させて、細胞内カルシウムイオン濃度の変動を減衰させることを特徴とするにした。以下の実験では、細胞内カルシウムイオンキレート剤としてＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いた。
【００２６】
実験２．ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の効果（１）
図３は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理がＢＫ電流の安定性に与える影響を確認するために、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行わなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、左上及び右上）と、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行った場合（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ、左下及び右下）のＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図を示す。図２−１の５回のパルスのうち、パルスＴ１によるＢＫ電流の大きさに対するパルスＴ３によるＢＫ電流の大きさの比の頻度分布グラフ（図３の左上及び左下のグラフ）と、パルスＴ１によるＢＫ電流の大きさに対するパルスＴ５によるＢＫ電流の大きさの比の頻度分布グラフ（図３の右上及び右下のグラフ）とを示す。以下の表１はＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加する前処置を施した場合（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と無添加の場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とにおいて大きな変動を示した細胞の数及び百分率を示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処置を施さなかった場合では、パルスＴ１によるＢＫ電流の大きさに対してＢＫ電流の大きさが数倍あるいは数分の１に変化した細胞が多くみられた。しかし、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処置を施した場合には、変動の幅はプラスマイナス２０％程度に抑えられた。細胞内のカルシウムイオン貯蔵部位から自然発生的にカルシウムイオンが遊離放出されて細胞内カルシウムイオン濃度が変動し、そのためにＢＫ電流の大きさも変動したものと考えられる。
【００２９】
実験３．ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の効果（２）
シングルホール・モードでの細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果のハイスループット評価系においてＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の有効性を検討するために、既知のＢＫＣａチャンネルアクチベーターである、ＮＳ１６１９及びｄｉＣｌ−ＤＨＡＡの低濃度での作用をＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を施した場合と施さなかった場合とで比較した。その結果、図４−１に示すとおり、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を施さなかった場合には、３０μＭのＮＳ１６１９のみでイオンチャンネル活性化作用が認められたが、他の濃度ではイオンチャンネル活性化作用は認められなかった。また、ｄｉＣｌ−ＤＨＡＡでは全くイオンチャンネル活性化作用は認められず、逆にブロッカーとして作用しているような結果になった。これに対し図４−２に示すとおり、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を施した場合には、ＮＳ１６１９及びＮＳ０１の両方とも３μＭ以上で濃度依存性のイオンチャンネル活性化作用が認められた。この実験からＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理は、イオンチャンネル活性化作用を高い感度で検出するのに有効であることが示された。
【００３０】
実験４．ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の効果（３）
最後に、ポピュレーション・パッチクランプ法を用いて、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がＢＫ電流を増大させるかどうか検討した。図５に示すとおり、細胞外用バッファーのカルシウムイオン濃度が２ｍＭのときであっても、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理と、ＤＩＤＳ添加とによって、ＢＫ電流の大きさを基底状態で安定化することができた。そのうえで、イオノマイシン存在下で細胞外用バッファーのカルシウムイオン濃度を２ｍＭから１６ｍＭまで上昇させると、ＢＫ電流が増大することが示された。すなわち、カルシウムイオン濃度依存性のＢＫ電流活性化を制御することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】イオノマイシン単独投与条件か、ＴＥＡ又はイベリオトキシンとイオノマイシンとの併用投与条件かにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータ。
【図２−１】ＢＫ電流の安定性を確認するためにＣＨＯ−Ｋ１細胞に印加した繰り返しステップパルス電位を示す波形図。
【図２−２】ＤＩＤＳ及びイオノマイシン非存在下で得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの６つの波形図。
【図３】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行わなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、左上及び右上）と、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行った場合（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ、左下及び右下）のＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図。
【図４−１】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行わなかった場合の既知のＢＫＣａチャンネルアクチベーターのＢＫＣａチャンネル活性への影響を示す、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図。
【図４−２】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行った場合の既知のＢＫＣａチャンネルアクチベーターのＢＫＣａチャンネル活性への影響を示す、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図。
【図５】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、イオノマイシン及びＤＩＤＳ存在下又は比存在下での細胞外カルシウムイオン濃度を増大したときの印加電位とＢＫ電流との関係を示すＣＨＯ−Ｋ１細胞のポピュレーション・パッチクランプ法のオートパッチデータ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果の評価方法に関し、より具体的には、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果のハイスループット評価系において感度及び再現性を向上させるためのサンプル処理方法と、該方法に用いるサンプル処理用試薬と、該試薬を含むサンプル処理用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルは細胞機能に重要な役割を担っており、創薬研究や分子生物学の研究ターゲットとなっている。例えば、ＢＫＣａチャンネル（large conductance Ca2+-activated K+ channels）、ＩＫＣａ（intermediate conductance Ca2+-activated K+channels）及びＳＫＣａ（small conductance Ca2+-activated K+ channels）は、細胞質のＣａ２＋イオン濃度の上昇によって敏感に活性化される点で、他のカリウムイオンと異なる特徴がある。これらのうちＢＫＣａチャンネルは、平滑筋、脳、膵臓、膀胱等の組織に存在し、神経や筋肉の興奮性、神経伝達物質の放出、ホルモンの分泌、蝸牛細胞のチューニング、自然免疫の他、脈管、気管、子宮、胃腸及び膀胱の平滑筋の緊張弛緩の調節等の多様な細胞の機能に関与する（非特許文献１）。そこで、ＢＫＣａチャンネルをはじめとする細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに作用する物質をスクリーニングすることによって新規な創薬シーズを探索する作業が始まっている。
【非特許文献１】Ｇｈａｔｔａ、Ｓ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１１０：１０３−１１６（２００６） 近年の自動パッチクランプ装置の進歩により、多数の創薬候補物質についてハイスループットな手法でイオンチャンネル活性への影響を評価する実験が可能になった。しかし、他のイオンチャンネルとは異なり、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルは、細胞内のＣａ２＋イオン濃度の変化に敏感に反応するため、ノイズが高くなり、低濃度の物質のイオンチャンネル活性への影響を評価することが困難であるという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、低濃度の物質のイオンチャンネル活性への影響を評価することを可能にするために、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの活性を測定する際に、細胞内のＣａ２＋イオン濃度を制御する技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理方法を提供する。
【０００５】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの場合がある。
【０００６】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【０００７】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（O,O'-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraaceticacid, tetraacetoxymethyl ester）と、ＧＥＤＴＡ−ＡＭ（O,O'-Bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraaceticacid, pentaacetoxymethyl ester）と、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類のＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【０００８】
本発明の方法において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤はＢＡＰＴＡ−ＡＭの場合がある。
【０００９】
本発明は、細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤を含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理用試薬を提供する。
【００１０】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルの場合がある。
【００１１】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【００１２】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤の場合がある。
【００１３】
本発明の試薬において、前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤はＢＡＰＴＡ−ＡＭの場合がある。
【００１４】
本発明は、前記本発明の方法のいずれかを説明する使用説明書と、前記本発明の試薬のいずれかとを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネル活性測定のためのサンプル処理用キットを提供する。
【００１５】
本発明において、前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子とは、細胞内Ｃａ２＋イオンの濃度に応じて生理機能が調節されるいずれかの分子をいい、カルモジュリン及びこれにより機能が調節されるＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫ）と、カルシニューリンその他のカルシウム依存性タンパク質ホスファターゼと、カルパインその他のカルシウム依存性プロテアーゼと、トロポニン、カルデスモンその他のカルシウム依存性フィラメントタンパク質と、カリウムイオンを輸送するＢＫＣａチャンネル、ＩＫＣａチャンネル及びＳＫＣａチャンネル、塩素イオンを輸送するカルシウム依存性Ｃｌチャンネル、陽イオン輸送チャンネルであるＴＲＰ（Transient Receptor Potential）その他の細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルとを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明において細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤とは、細胞外から細胞質に流入したカルシウムイオン及び／又は細胞内の貯蔵部位から細胞質に放出されたカルシウムイオンと結合して錯体又は複合体を形成する物質をいう。本発明の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、細胞の外から内へ細胞膜を透過することができる物質が好ましい。かかる物質は、Ｃａ２＋イオンキレート剤の親水性の原子団を疎水性の化合物と反応させることによって調製することができる。本発明の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、いったん細胞外から細胞内に入ると、細胞膜を透過する能力を喪失して、細胞内に止まる物質が好ましい。かかる物質は、Ｃａ２＋イオンキレート剤の親水性の原子団を疎水性の化合物と反応させる際に、細胞内に豊富に存在する酵素によって分解することができる反応を利用することによって調製することができる。好ましい反応はアセトキシメチルエステル化反応であり、該反応による結合は細胞内のエステラーゼにより加水分解される。好ましい細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明におけるサンプル処理とは、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の前の段階で被検サンプルの細胞に施す処理、及び／又は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の段階で被検サンプルの細胞に施す処理をいう。すなわち、本発明のサンプル前処理方法は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の前の段階か、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の段階か、機能測定の前の段階と機能測定の段階との両方ともかにおいて、細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む。本発明におけるサンプル処理は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の際に細胞内のＣａ２＋イオン濃度を制御することが可能であることを条件として、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定の前の段階及び／又は機能測定の段階の一部の期間だけ処理を施してもかまわない。
【００１８】
本発明における細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネル活性測定は、手動パッチクランプ法と、自動パッチクランプ法とを含む電気生理学的方法と、膜電位色素を用いる光学的方法と、Ｒｂイオン流出によるカリウムチャンネル活性測定法とを含むが、これらに限定されない、さまざまな方法によって実施される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【実施例１】
【００２０】
自動パッチクランプによる細胞内カリウムイオンの測定用溶液の調製
ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）の製造者による使用説明書に基づいて実験に用いる溶液を調製した。すなわち、低塩素細胞内用バッファー（１２０ｍＭ Ｋ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、２０ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５〜７．３）、高塩素細胞内用バッファー（１４０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５〜７．３）、低塩素細胞外用バッファー（１２０ｍＭ Ｎａ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、１７ｍＭ ＮａＣｌ、４．０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ブドウ糖、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）及び高塩素細胞外用バッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ブドウ糖、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用意した。そして、細胞外から投与して細胞のカリウムイオンチャンネル活性への影響を調べる物質は前記細胞外用バッファーに希釈した。アムフォテリシンＢは最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように細胞内用バッファーに希釈した。
【００２１】
ＢＫＣａチャンネルアッセイ系
ヒトＢＫＣａチャンネルαサブユニット遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞にトランスフェクションして、ヒトＢＫＣａチャンネルαサブユニットを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞をサンプルとして用いた。フラスコ中で培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞を０．２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを添加したＰＢＳでインキュベーションすることにより、フラスコの基質から剥がし、ピペッティングにより単一細胞に分散した。本発明の前処理方法を実施する場合には、２〜２．５ｘ１０６個／ｍＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞の単一細胞懸濁液に２０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現する内在性のカルシウム依存性塩素イオンチャンネル（Ca2+-activated Cl channel、ＣＡＣＣ）の影響を防ぐため、ブロッカーとして３００μＭのＤＩＤＳ（4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid, disodium salt）を細胞外用バッファーに添加した。また、サンプルの細胞内カルシウムイオン濃度を安定的に制御するために、サンプルが測定チップ上でシールを形成した後で、１．２μＭのイオノマイシンを含む細胞外用バッファーに液を添加することにより、細胞外カルシウムイオンの流入を促進させた。また、得られた電流データがＢＫＣａチャンネルに特異的であることを確認するために、ＢＫＣａチャンネルに特異的なブロッカーであるＴＥＡ（tetraethylammonium）又はイベリオトキシン（iberiotoxin、ＩｂｅＴＸ）と、ＢＫＣａチャンネルに特異的なアクチベータであるｄｉＣｌＤＨＡＡ（１２，１４−ジクロロデヒドロアビエチン酸、Tomohiko Ohwadaら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 3971-3974 (2003)）又はＮＳ１６１９とを用いた。
【００２２】
ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏによるデータ取得
ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏはシングルホール・モードで使用した。まず、測定チップの細胞側に、無添加の細胞外用バッファーを注入し、測定チップの細胞と反対の側に無添加の細胞内用バッファーを注入して、ホールチェックを行った。その後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の単一細胞懸濁液を測定チップに添加した。シール形成を確認してから、測定チップの細胞内バッファーをアムホテリシンＢを添加したバッファーに交換して、穿孔パッチを形成させた。１５分経過後、第１回目の電流測定（pre電流測定）を行った。その後、ＤＩＤＳ及びイオノマイシンを含む細胞外バッファーを添加した。４０分経過後、第２回目の電流測定（post 1st電流測定）を行った。その後、ヒトＢＫＣａチャンネルαサブユニットの活性への影響を調べる対象の物質を含む細胞外バッファーを添加した。５５分経過後、第３回目の電流測定（post 2nd電流測定）を行った。
【００２３】
実験１．ＢＫＣａチャンネル発現の確認
図１の左側のグラフは、１．２μＭのイオノマイシンのみを添加する（太い実線）か、１．２μＭのイオノマイシン及び１０ｍＭのＴＥＡを添加した（細い実線）条件下で異なる波形（破線）の電位パルスを印加したときのＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータである。図１の右側のグラフは、１．２μＭのイオノマイシンのみを添加する（太い実線）か、１．２μＭのイオノマイシン及び３００ｎＭのイベリオトキシンを添加した（細い実線）条件下で異なる波形（破線）の電位パルスを印加したときのＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータである。図１に示すとおり、形状の異なる電位パルス波形に対する電流が、ＢＫＣａチャンネルに特異的なブロッカーであるＴＥＡでもＩｂｅＴＸでも８０％程度抑制されたことから、この８０％がＢＫＣａチャンネル活性によって発生した電流（以下、「ＢＫ電流」という。）と認められた。
【００２４】
図２は、ＢＫ電流の安定性を確認するため、−９０ｍＶから＋１００ｍＶへのステップパルスを１０秒間隔で５回印加したとき（図２−１）、ＤＩＤＳ及びイオノマイシン非存在下で得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの６つの波形図（図２−２）である。図２−２からわかるとおり、電流の大きさが安定するものもあるが、大きく変動する例が多く観察された。
【００２５】
図２−２で観察された電流変動の原因として考えられるのは、細胞のシールが不安定であったこと、及び、細胞内のカルシウムイオン濃度が変化したことである。このうちシールについては、シールが不安定である場合には−９０ｍＶ保持電流にも大きな変化があるはずだが、電流が安定した場合にも電流変動が見られたことからシールが不安定であったことによって電流変動を説明することはできない。そこで細胞内のカルシウムイオン濃度の変動を抑制するために、細胞内カルシウムイオンキレート剤を投与し、細胞内でカルシウムイオンの緩衝作用を発揮させて、細胞内カルシウムイオン濃度の変動を減衰させることを特徴とするにした。以下の実験では、細胞内カルシウムイオンキレート剤としてＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いた。
【００２６】
実験２．ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の効果（１）
図３は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理がＢＫ電流の安定性に与える影響を確認するために、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行わなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、左上及び右上）と、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行った場合（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ、左下及び右下）のＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図を示す。図２−１の５回のパルスのうち、パルスＴ１によるＢＫ電流の大きさに対するパルスＴ３によるＢＫ電流の大きさの比の頻度分布グラフ（図３の左上及び左下のグラフ）と、パルスＴ１によるＢＫ電流の大きさに対するパルスＴ５によるＢＫ電流の大きさの比の頻度分布グラフ（図３の右上及び右下のグラフ）とを示す。以下の表１はＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加する前処置を施した場合（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と無添加の場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とにおいて大きな変動を示した細胞の数及び百分率を示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処置を施さなかった場合では、パルスＴ１によるＢＫ電流の大きさに対してＢＫ電流の大きさが数倍あるいは数分の１に変化した細胞が多くみられた。しかし、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処置を施した場合には、変動の幅はプラスマイナス２０％程度に抑えられた。細胞内のカルシウムイオン貯蔵部位から自然発生的にカルシウムイオンが遊離放出されて細胞内カルシウムイオン濃度が変動し、そのためにＢＫ電流の大きさも変動したものと考えられる。
【００２９】
実験３．ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の効果（２）
シングルホール・モードでの細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルに対する薬物効果のハイスループット評価系においてＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の有効性を検討するために、既知のＢＫＣａチャンネルアクチベーターである、ＮＳ１６１９及びｄｉＣｌ−ＤＨＡＡの低濃度での作用をＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を施した場合と施さなかった場合とで比較した。その結果、図４−１に示すとおり、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を施さなかった場合には、３０μＭのＮＳ１６１９のみでイオンチャンネル活性化作用が認められたが、他の濃度ではイオンチャンネル活性化作用は認められなかった。また、ｄｉＣｌ−ＤＨＡＡでは全くイオンチャンネル活性化作用は認められず、逆にブロッカーとして作用しているような結果になった。これに対し図４−２に示すとおり、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を施した場合には、ＮＳ１６１９及びＮＳ０１の両方とも３μＭ以上で濃度依存性のイオンチャンネル活性化作用が認められた。この実験からＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理は、イオンチャンネル活性化作用を高い感度で検出するのに有効であることが示された。
【００３０】
実験４．ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理の効果（３）
最後に、ポピュレーション・パッチクランプ法を用いて、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がＢＫ電流を増大させるかどうか検討した。図５に示すとおり、細胞外用バッファーのカルシウムイオン濃度が２ｍＭのときであっても、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理と、ＤＩＤＳ添加とによって、ＢＫ電流の大きさを基底状態で安定化することができた。そのうえで、イオノマイシン存在下で細胞外用バッファーのカルシウムイオン濃度を２ｍＭから１６ｍＭまで上昇させると、ＢＫ電流が増大することが示された。すなわち、カルシウムイオン濃度依存性のＢＫ電流活性化を制御することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】イオノマイシン単独投与条件か、ＴＥＡ又はイベリオトキシンとイオノマイシンとの併用投与条件かにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータ。
【図２−１】ＢＫ電流の安定性を確認するためにＣＨＯ−Ｋ１細胞に印加した繰り返しステップパルス電位を示す波形図。
【図２−２】ＤＩＤＳ及びイオノマイシン非存在下で得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの６つの波形図。
【図３】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行わなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、左上及び右上）と、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行った場合（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ、左下及び右下）のＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図。
【図４−１】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行わなかった場合の既知のＢＫＣａチャンネルアクチベーターのＢＫＣａチャンネル活性への影響を示す、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図。
【図４−２】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ前処理を行った場合の既知のＢＫＣａチャンネルアクチベーターのＢＫＣａチャンネル活性への影響を示す、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のシングルホール・モードでのオートパッチデータの波形図。
【図５】ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、イオノマイシン及びＤＩＤＳ存在下又は比存在下での細胞外カルシウムイオン濃度を増大したときの印加電位とＢＫ電流との関係を示すＣＨＯ−Ｋ１細胞のポピュレーション・パッチクランプ法のオートパッチデータ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理方法。
【請求項２】
前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤を含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理用試薬。
【請求項７】
前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルである、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤である、請求項６又は７に記載の試薬。
【請求項９】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類のＣａ２＋イオンキレート剤である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭである、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法を説明する使用説明書と、請求項６ないし１０のいずれかに記載の試薬とを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネル活性測定のためのサンプル処理用キット。
【請求項１】
細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤をサンプル細胞に投与するステップを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理方法。
【請求項２】
前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類の細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤を含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子の機能測定のためのサンプル処理用試薬。
【請求項７】
前記細胞内Ｃａ２＋イオン依存性分子は、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネルである、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、アセトキシメチルエステル化されたＣａ２＋イオンキレート剤である、請求項６又は７に記載の試薬。
【請求項９】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと、ＧＥＤＴＡ−ＡＭと、Ｆｕｒａ２−ＡＭと、Ｆｌｕｏ３−ＡＭと、Ｆｌｕｏ４−ＡＭと、Ｉｎｄｏ１−ＡＭと、Ｒｈｏｄ２−ＡＭとからなるグループから選択される少なくとも１種類のＣａ２＋イオンキレート剤である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記細胞内Ｃａ２＋イオンキレート剤は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭである、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法を説明する使用説明書と、請求項６ないし１０のいずれかに記載の試薬とを含む、細胞内Ｃａ２＋イオン依存性イオンチャンネル活性測定のためのサンプル処理用キット。
【図１】
【図２−１】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図２−２】
【図２−１】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図２−２】
【公開番号】特開２００９−２０７４２３（Ｐ２００９−２０７４２３Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４０７２（Ｐ２００８−５４０７２）
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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