細胞分別用マイクロチップおよび細胞分別方法ならびに細胞分別装置
【課題】特定の細胞を効率よく確実に他の細胞から分離することができる細胞分別方法および細胞分別用マイクロチップを提供する。
【解決手段】第１分配流路１０２と、チャンバ１０３と、第２分配流路１０４とを備えた細胞分別用マイクロチップ１０１を使用する。チャンバ１０３の内面には光応答性材料が用いられる。第１分配流路１０２は、チャンバ１０３の一方側の縁部１０３ａに連絡流路１０７を介して接続されている。第２分配流路１０４は、チャンバ１０３の他方側の縁部１０３ｂに連絡流路１０８を介して接続されている。チャンバ１０３の内面の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させて、連絡流路１０７から連絡流路１０８に分別用液体を流して細胞をチャンバ１０３から流出させることによって、前記領域にある細胞と前記領域外の細胞とを分別する。
【解決手段】第１分配流路１０２と、チャンバ１０３と、第２分配流路１０４とを備えた細胞分別用マイクロチップ１０１を使用する。チャンバ１０３の内面には光応答性材料が用いられる。第１分配流路１０２は、チャンバ１０３の一方側の縁部１０３ａに連絡流路１０７を介して接続されている。第２分配流路１０４は、チャンバ１０３の他方側の縁部１０３ｂに連絡流路１０８を介して接続されている。チャンバ１０３の内面の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させて、連絡流路１０７から連絡流路１０８に分別用液体を流して細胞をチャンバ１０３から流出させることによって、前記領域にある細胞と前記領域外の細胞とを分別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤スクリーニング、医薬品生産、薬剤アッセイ等に用いられる細胞分別用マイクロチップおよび細胞分別方法ならびに細胞分別装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀の最先端医療では、ヒトや動物の細胞の利用が益々盛んになると言われている。例えば、薬剤スクリーニング等の目的に応じて特定の細胞を分離し、分離した細胞について試験を行うことが考えられる。細胞を分離する技術としては、現在はフローサイトメトリーや磁気細胞分離法などが広く用いられている。
これらの分離操作は、溶液中に細胞を完全に分散させなくてはならず、動物細胞の大部分を占める足場依存性細胞に対して適用すると細胞に大きなダメージを与えることが問題視されてきた。そこで、足場依存性細胞を培養基材表面で培養している状態（ｉｎ ｓｉｔｕ）で選抜・分離する技術の確立が望まれている。
近年では、光照射によって細胞の接着性が変化する基材が報告されている。(例えば、特許文献１、２を参照)
これらの光応答性細胞培養基材は、培養した細胞に特定波長の光を照射すると、照射部位の細胞接着性が変化するため、顕微鏡などで観察しながら任意の細胞のみを剥離させ回収したり、逆にそれだけを残して他の細胞を除去できることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００７／０６３７３６号
【特許文献２】特開２００７−２４４３７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述の細胞分離技術では、光照射によって剥離させるべき細胞が剥離しなかったり、逆に、剥離するべきでない細胞が剥離することがあり、確実な細胞分別を実現することは難しかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、特定の細胞を効率よく確実に他の細胞から分離することができる細胞分別用マイクロチップおよび細胞分別方法ならびに細胞分別装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の構成は以下のとおりである。
（１）第１分配流路と、前記第１分配流路に連通する１または複数のチャンバと、前記チャンバに接続された第２分配流路とを備え、前記チャンバの内面の少なくとも一部に、光応答性材料が用いられ、前記第１分配流路は、前記チャンバの流通方向の一方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の一方側の連絡流路が、前記一方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列され、前記第２分配流路は、前記チャンバの前記一方側の縁部に対向する他方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の他方側の連絡流路が、前記他方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列されている細胞分別用マイクロチップ。
（２）前記チャンバが、平面視矩形状に形成され、前記一方側と他方側の縁部は、前記チャンバの向かい合う一対の辺部であり、前記一方側と他方側の連絡流路は、前記チャンバを介して向かい合って形成されている（１）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（３）前記複数のチャンバが、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列されている（１）または（２）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（４）前記光応答性材料は、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られる光分解性ゲルであり、前記光分解性架橋剤が、ポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基と、前記ニトロベンジル基の末端側に配置された活性エステル基とを含み、前記活性エステル基が、アミノ基またはヒドロキシル基に対する反応性を有し、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されている（１）〜（３）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップ。
（５）前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である（４）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（６）前記高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである（４）または（５）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（７）前記チャンバの内面には、前記光応答性材料からなる層が形成されている（１）〜（６）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップ。
（８）（１）〜（７）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップと、前記細胞分別用マイクロチップに光を照射する照射部とを備え、前記照射部は、光源と、前記光源からの光を前記チャンバの内面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部を有する細胞分別装置。
（９）（１）〜（７）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップを使用し、前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面に細胞を付着させた後、前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面のうち、一部領域にのみ前記光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させ、前記一方側の連絡流路から前記他方側の連絡流路に分別用液体を流すことで前記細胞を同伴して前記チャンバから流出させることによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別する細胞分別方法。
（１０）前記光応答性材料が光分解性ゲルであり、前記一部領域への前記光の照射により前記光分解性ゲルを選択的に分解することによって前記細胞接着性を低下させる（９）に記載の細胞分別方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細胞分別用マイクロチップのチャンバの内面の一部領域にのみ光を照射してこの領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させ、一方側の連絡流路から他方側の連絡流路に分別用液体を流して前記細胞の一部をチャンバから流出させることによって、前記領域にある細胞と前記領域外の細胞とを分別することができる。
一方側および他方側の連絡流路は、それぞれチャンバの一方および他方の縁部に複数形成されているため、チャンバ内の分別用液体の流れはチャンバの幅方向に均一となり、チャンバ内の細胞には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかる。
このため、接着性が低い領域の細胞は確実にチャンバから流出する一方、それ以外の細胞はチャンバ内に残留する。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の細胞分別用マイクロチップの全体を示す平面図である。
【図２】図１の細胞分別用マイクロチップの要部を拡大した平面図である。
【図３】図１の細胞分別用マイクロチップの要部をさらに拡大した平面図である。
【図４】図１の細胞分別用マイクロチップの要部の断面図である。
【図５】本発明の光分解性架橋剤の一例を示す化学構造式である。
【図６】前図の光分解性架橋剤を模式的に表した図である。
【図７】前図の光分解性架橋剤の構造の説明図である。
【図８】（ａ）光分解性架橋剤の分解反応の反応式である。（ｂ）（ａ）の反応式を模式的に表した図である。
【図９】光分解性ゲルの一例の生成反応を示す図である。
【図１０】前図の光分解性ゲルの分解反応を示す図である。
【図１１】本発明の細胞分別装置の一例を示す構成図である。
【図１２】試験方法を説明する工程図であり、（ａ）は細胞分別用マイクロチップの模式図であり、（ｂ）は要部を拡大した模式図である。
【図１３】試験方法を説明する工程図であり、（ａ）は細胞分別用マイクロチップの模式図であり、（ｂ）は要部を拡大した模式図である。
【図１４】本発明で使用できるスピロベンゾピランの一例である。
【図１５】スピロベンゾピランを含む光応答性材料の一例である。
【図１６】光分解性架橋剤の他の例である。
【図１７】光分解性架橋剤の他の例である。
【図１８】光応答性材料の他の例である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の一実施形態である細胞分別用マイクロチップ１０１（以下、単にマイクロチップ１０１という）について、図面を参照して説明する。
図１は、マイクロチップ１０１の全体を示す平面図である。図２はマイクロチップ１０１の要部を拡大した平面図である。図３はマイクロチップ１０１の要部をさらに拡大した平面図である。図４は、マイクロチップ１０１の要部の断面図である。
以下の説明において、マイクロチップ１０１の長手方向（図１における左右方向）を第１方向といい、マイクロチップ１０１の短手方向（図１における上下方向）を第２方向ということがある。
【０００９】
図１に示すように、マイクロチップ１０１は、上流側貯留部１２１と、上流側貯留部１２１に接続された上流側分配流路１０２（第１分配流路）と、上流側分配流路１０２に連通する１または複数のチャンバ１０３と、チャンバ１０３に連通する下流側分配流路１０４（第２分配流路）と、下流側分配流路１０４に接続された下流側貯留部１２２とを備えている。
【００１０】
上流側貯留部１２１は、マイクロチップ１０１内に形成された、液体を貯留可能な空間である。上流側貯留部１２１の数は１または複数とすることができ、図示例では、上流側貯留部１２１は、マイクロチップ１０１の長手方向の一端部に近い位置に４つ形成されている（上流側貯留部１２１Ａ〜１２１Ｄという）。
下流側貯留部１２２は、マイクロチップ１０１内に形成された、液体を貯留可能な空間である。下流側貯留部１２２の数は１または複数とすることができ、図示例では、下流側貯留部１２２は、上流側貯留部１２１に比べて他端側の位置に４つ形成されている（下流側貯留部１２２Ａ〜１２２Ｄという）。
【００１１】
図２および図３に示すように、分配流路１０２、１０４およびチャンバ１０３は液体が流通可能な空間であり、マイクロチップ１０１の内部に形成されている。
チャンバ１０３の形状は特に限定されないが、平面視矩形状とすることができる。図示例では、チャンバ１０３の平面視形状は略正方形である。
符号１０３ａ、１０３ｂは、チャンバ１０３の液流通方向（図２および図３における上下方向）の一方および他方の縁部であり、矩形のチャンバ１０３の向かい合う一対の辺部である。
一方縁部１０３ａおよび他方縁部１０３ｂは、第１方向（図２および図３における左右方向）に沿って形成されている。
【００１２】
図４に示すように、マイクロチップ１０１は、平板状の基板部１０５と、平板状の上板部１０６とを重ね合わせた構成とすることができる。
基板部１０５の、上板部１０６に対向する面１０５ａ（表面１０５ａ）には、各流路、チャンバ、および貯留部を形成する凹部が形成されている。図示例では、上流側分配流路１０２となる凹部１０２Ａ、チャンバ１０３となるチャンバ凹部１０３Ａ、下流側分配流路１０４となる凹部１０４Ａ、連絡流路１０７、１０８となる凹部１０７Ａ、１０８Ａ等が形成されている。
【００１３】
図１に示すように、チャンバ１０３は、複数の行１０９および複数の列１１０からなる行列をなすように２次元的に配列される。
図示例では、合計１６のチャンバ１０３が、４行および４列からなる行列をなすようアレイ状に配列されている。行を構成するチャンバ１０３は、第１方向（図１における左右方向）に沿って並び、列を構成するチャンバ１０３は、第２方向（図１における上下方向）に沿って並んでいる。各チャンバ１０３は、互いに間隔をおいて配列されている。
符号１０９Ａ〜１０９Ｄはそれぞれチャンバ１０３がなす４つの行を示し、符号１１０Ａ〜１１０Ｄはそれぞれチャンバ１０３がなす４つの列を示す。
なお、図示例では、行と列の形成方向は互いにほぼ垂直であるが、これに限らず、互いに交差する方向であればよい。
【００１４】
図１〜図３に示すように、上流側分配流路１０２は、第１方向に沿って直線状に形成されており、それぞれのチャンバ１０３の一方縁部１０３ａに、複数の細い上流側連絡流路１０７（一方側の連絡流路）を介して接続されている。
上流側分配流路１０２の数は１または複数とすることができ、図示例では上流側分配流路１０２は４つ形成され（上流側分配流路１０２Ａ〜１０２Ｄという）、それぞれが異なる上流側貯留部１２１（上流側貯留部１２１Ａ〜１２１Ｄ）に接続されている。
【００１５】
上流側分配流路１０２Ａは第１行１０９Ａと第２行１０９Ｂの間に延在し、上流側分配流路１０２Ｂ、１０２Ｃは第２行１０９Ｂと第３行１０９Ｃの間に延在し、上流側分配流路１０２Ｄは第３行１０９Ｃと第４行１０９Ｄの間に延在している。
【００１６】
上流側連絡流路１０７は、上流側分配流路１０２とチャンバ１０３との間で液を流通させるものである。上流側連絡流路１０７は、第２方向（図２および図３における上下方向）に沿って形成されていることが好ましい。
図３に示すように、これら複数の上流側連絡流路１０７は、一方縁部１０３ａの延在方向（図３の左右方向）に互いに間隔をおいて配列されている。上流側連絡流路１０７の幅は、互いにほぼ同じであることが好ましい。
隣り合う上流側連絡流路１０７、１０７の間隔は、すべての上流側連絡流路１０７について互いに同じであることが好ましい。
上流側連絡流路１０７は、一方縁部１０３ａの広い範囲にわたって形成するのが好ましい。図３に示す例では、上流側連絡流路１０７は一方縁部１０３ａのほぼ全範囲にわたって所定間隔ごとに形成されている。
この例では、８つの上流側連絡流路１０７のうち連絡流路１０７Ａは一方縁部１０３ａの一端（図３の左端）に近接した位置にあり、連絡流路１０７Ａから最も離れた連絡流路１０７Ｂは一方縁部１０３ａの他端（図３の右端）に近接した位置にあるため、上流側連絡流路１０７は一方縁部１０３ａのほぼ全範囲にわたって形成されているといえる。
【００１７】
図１〜図３に示すように、下流側分配流路１０４は、第１方向に沿って直線状に形成されており、それぞれのチャンバ１０３の他方縁部１０３ｂに、複数の細い下流側連絡流路１０８（他方側の連絡流路）を介して接続されている。
下流側分配流路１０４の数は１または複数とすることができ、図示例では下流側分配流路１０４は４つ形成され（下流側分配流路１０４Ａ〜１０４Ｄという）、それぞれが異なる下流側貯留部１２２（下流側貯留部１２２Ａ〜１２２Ｄ）に接続されている。
【００１８】
下流側分配流路１０４Ａは第１行１０９Ａの外側（図１における上方）に延在し、下流側分配流路１０４Ｂは第１行１０９Ａと第２行１０９Ｂの間に延在し、下流側分配流路１０４Ｃは第３行１０９Ｃと第４行１０９Ｄの間に延在し、下流側分配流路１０４Ｄは第４行１０９Ｄの外側（図１における下方）に延在している。
【００１９】
下流側連絡流路１０８は、チャンバ１０３と下流側分配流路１０４との間で液を流通させるものである。下流側連絡流路１０８は、第２方向（図２および図３における上下方向）に沿って形成されていることが好ましい。
図３に示すように、これら複数の下流側連絡流路１０８は、他方縁部１０３ｂの延在方向（図３の左右方向）に互いに間隔をおいて配列されている。下流側連絡流路１０８の幅は、互いにほぼ同じであることが好ましい。
隣り合う下流側連絡流路１０８、１０８の間隔は、すべての下流側連絡流路１０８について互いに同じであることが好ましい。
【００２０】
下流側連絡流路１０８は、他方縁部１０３ｂの広い範囲にわたって形成するのが好ましい。図３に示す例では、下流側連絡流路１０８は他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲にわたって所定間隔ごとに形成されている。
この例では、６つの下流側連絡流路１０８のうち連絡流路１０８Ａは他方縁部１０３ｂの一端（図３の左端）に近接した位置にあり、連絡流路１０８Ａから最も離れた連絡流路１０８Ｂは他方縁部１０３ｂの他端（図３の右端）に近接した位置にあるため、下流側連絡流路１０８は他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲にわたって形成されているといえる。
【００２１】
チャンバ１０３の一方縁部１０３ａに形成された上流側連絡流路１０７と、他方縁部１０３ｂに形成された下流側連絡流路１０８は、全体としてチャンバ１０３を介して向かい合って形成されていることが好ましい。
図示例では、一方縁部１０３ａと他方縁部１０３ｂは矩形のチャンバ１０３の向かい合う辺部であり、上流側連絡流路１０７は矩形のチャンバ１０３の一方縁部１０３ａのほぼ全範囲に形成され、下流側連絡流路１０８は他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲に形成されているため、これら連絡流路１０７、１０８は全体として向かい合って形成されている。
なお、図示例では、上流側連絡流路１０７の数と下流側連絡流路１０８の数が異なるため、個々の連絡流路１０７、１０８は向かい合う位置にない場合もあるが、全体としては向かい合う位置（一方および他方縁部１０３ａ、１０３ｂ）にあるといえる。
【００２２】
図１に示すように、マイクロチップ１０１では、上流側貯留部１２１Ａからの液を上流側分配流路１０２Ａから第１行１０９Ａのチャンバ１０３に導入でき、上流側貯留部１２１Ｂからの液を上流側分配流路１０２Ｂから第２行１０９Ｂのチャンバ１０３に導入でき、上流側貯留部１２１Ｃからの液を上流側分配流路１０２Ｃから第３行１０９Ｃのチャンバ１０３に導入でき、上流側貯留部１２１Ｄからの液を上流側分配流路１０２Ｄから第４行１０９Ｄのチャンバ１０３に導入できる。
【００２３】
図４に示すように、基板部１０５は、レプリカモールディング法によって形成することができる。また、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工などを採用することもできる。
基板部１０５および上板部１０６の材料としては、プラスチック、ガラス、改質ガラス、金属等を挙げることができる。
プラスチックとして好適なものとしては、ポリスチレン系樹脂、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ））、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン樹脂）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
【００２４】
チャンバ１０３の内面の少なくとも一部には、光応答性材料が用いられている。光応答性材料は、光照射によって細胞接着性を変化させ得る材料であって、例えば光分解性ゲルが使用できる。
例えば、チャンバ１０３の内面の少なくとも一部に光分解性ゲルからなる層を形成することができる。また、チャンバ１０３の内面の少なくとも表面が光分解性ゲルを含む材料で構成されていてもよい。
光分解性ゲルを用いる範囲はチャンバ１０３の内面の一部であってもよいし、全面であってもよい。
図４に示すように、例えば基板部１０５のチャンバ凹部１０３Ａの底面１０３Ａａのほぼ全面に、光分解性ゲル層を形成することができる。
【００２５】
光分解性ゲルとしては、例えばニトロベンジル基を含む高分子化合物が使用できる。以下、本発明に使用できる光分解性ゲルの一例について説明する。
【００２６】
（ａ）光分解性架橋剤
本発明に用いられる光分解性ゲルに使用できる光分解性架橋剤としては、ポリエチレングリコールからなる主鎖と、主鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基と、ニトロベンジル基の末端側に配置された活性エステル基とを含む光分解性架橋剤がある。
主鎖を構成するポリエチレングリコールのエチレングリコールの平均繰り返し数は、４から１２の範囲にあることが好ましい。
活性エステル基は、アミノ基またはヒドロキシル基に対する反応性を有することが好ましい。
前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であることが好ましい。
光分解性のニトロベンジル基は、産業用の水銀ランプやレーザーによって発生する紫外線や可視光を照射することにより分解できることが好ましい。
【００２７】
図５は、光分解性架橋剤の一例を示すものである。
式（１）に示す光分解性架橋剤１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる主鎖２と、この主鎖２の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基３、３と、ニトロベンジル基３、３の末端側に配置された活性エステル基４、４とからなる。
【００２８】
図６は、式（１）の光分解性架橋剤１を模式的に表した図であって、この光分解性架橋剤１は、主鎖２と、ニトロベンジル基３、３と、活性エステル基４、４とからなる。
図６および図７に示すように、主鎖２はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ニトロベンジル基３は、アミド結合部５（―ＮＨＣＯ―）を介して主鎖２に結合している。
【００２９】
（ｂ）光分解性ゲル
上記光分解性架橋剤は、高分子化合物と反応させることによって、光分解性ゲルを生成する。
高分子化合物は、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する水溶性高分子が好ましく、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つが好ましい。
【００３０】
高分子化合物としては、特に、ポリエチレングリコールまたはその誘導体が、細胞との相互作用が少なく、しかも高分子化合物自体が水に可溶であるために好ましい。
なかでも、分岐型のポリエチレングリコールまたはその誘導体を用いると、網目構造が形成されやすく、ゲル化が進行しやすくなるため好ましい。分岐型ポリエチレングリコール（または誘導体）の分岐数は３以上が好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は入手しやすいため好適である。
ポリエチレングリコール（または誘導体）は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール（または誘導体）の分子量は１万から４万の範囲にあることが好ましい。
塩基性多糖類としては、キトサンが好ましい。
【００３１】
高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合すると、高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基は、光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋される。
前記アミノ基は光分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光分解性ゲルとを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状（層状）のゲルの形成が容易である。
【００３２】
高分子化合物に対する光分解性架橋剤の添加量（光分解性架橋剤／高分子化合物）はモル比で１以上であることが好ましい。高分子化合物と光分解性架橋剤との混合比は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（またはその誘導体）を高分子化合物として用いる場合は、モル比（高分子化合物：光分解性架橋剤）で１：１から１：４の範囲が好ましい。
高分子化合物の使用量は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の場合、光分解性ゲル中に７．５重量％以上含有されるように設定することができる。
【００３３】
図９は、光分解性架橋剤１を用いて、光分解性ゲル１０を生成させる反応を示すものである。
光分解性架橋剤１と、高分子化合物６とを反応させることによって、光分解性ゲル１０を生成させる。
高分子化合物６は、末端にアミノ基を有する４分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
【００３４】
高分子化合物６と光分解性架橋剤１とを混合すると、高分子化合物６のアミノ基は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物６は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物６と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル１０が生成する。
【００３５】
図１０に示すように、光の照射により光分解性架橋剤１が分解されることによって、光分解性ゲル１０は分解される。これによって、光分解性ゲル１０は水に可溶となる。
具体的には、図８（ａ）に示すように、ニトロベンジル基３は、例えば波長３３０〜３８０ｎｍの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。図８（ｂ）は、この分解反応を模式的に示すものである。
ニトロベンジル基３は、アミド結合部５のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロソベンジル基３’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前期光照射によりニトロベンジル基３と活性エステル基４との結合が切断されることもある。
【００３６】
前記構造を有する光分解性架橋剤１は、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。
ラジカル重合を利用してゲル化される従来の光応答性ゲルおよび光分解性ゲルの製造工程は、重合の際に酸素が存在すると重合反応を阻害し、ゲル化が進行しない。この現象は特に薄膜状（層状）のゲルを調製する際に顕著になる。
一方、光分解性架橋剤１では、架橋反応時に酸素の影響を全く受けないため、このような重合反応阻害は起こらない。
ラジカル重合反応を利用する場合も無酸素雰囲気条件で反応を行えば薄膜状のゲルを調製することが可能となるかもしれないが、その場合には無酸素条件下で重合反応を行わせるための設備が必要となり、製造工程が複雑になる。
一方、光分解性架橋剤１を用いると、無酸素雰囲気条件が必要ないため、薄膜状（層状）のゲルの製造工程が簡略であり、効率的かつ低コストで光分解性ゲルを調製できる。
また、本発明では、架橋反応にラジカル重合を利用しないため、ラジカルによってダメージを受けやすい物質を混合した状態で光分解性ゲルを調製することが可能となる。従って、光分解性ゲルを広範な用途、例えば細胞や生理活性物質を固定化する用途にも使用できる。また、ラジカル重合に対応できないモノマーの重合物も高分子化合物として使用できることから、高分子化合物の選択範囲が広いという利点もある。
【００３７】
（ｃ）細胞分別装置
図１１は、本発明の細胞分別装置の一例であって、マイクロチップ１０１を保持する保持台１１と、マイクロチップ１０１に光を照射する照射部１２と、マイクロチップ１０１を撮影する撮影部１３と、制御部１４と、マイクロチップ１０１に分別用液体（培地、緩衝液など）を供給する送液部１５と、マイクロチップ１０１から使用済みの分別用液体を回収する回収部１６とを備えている。
照射部１２は、光源（図示略）と、マイクロチップ１０１の表面の任意の一部領域にのみ光照射する照射領域調整部１７とを備えている。
照射領域調整部１７は、所定のパターン１８をなす光をマイクロチップ１０１に照射することができる。パターン１８は表示装置１９に表示される。
【００３８】
照射領域調整部１７は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス（Digital Micromirror Device））を備えている。ＤＭＤは複数のマイクロミラーを有し、各マイクロミラーは、制御部１４からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光２０をマイクロチップ１０１に照射できる。
照射領域調整部１７からの光は、フィルター２１、ミラー２２（ダイクロイックミラー）、対物レンズ２３を経て、マイクロチップ１０１の任意の領域に照射される。マイクロチップ１０１の任意形状の一部領域にのみ光２０を照射することもできるし、全領域に光２０を照射することもできる。
光源としては、光分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
光の波長域は、例えば２００〜１０００ｎｍを例示できる。特に３００〜６００ｎｍ、なかでも３５０〜４００ｎｍは好適である。照射エネルギーは、通常は０．０１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２である。
なお、光をマイクロチップ内面の一部領域にのみ照射させるための構成としては、ＤＭＤに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
【００３９】
撮影部１３としては、ＣＣＤカメラ等を使用できる。
送液部１５としては、分別用液体をマイクロチップ１０１に送ることができるものであれば特に限定されず、例えばシリンジポンプ、ペリスタポンプ、エアーポンプ、圧力ボンベが使用できる。送液部１５は分別用液体を管路１５ａにより上流側貯留部１２１に送ることができる。回収部１６は使用済みの分別用液体を管路１６ａにより下流側貯留部１２２から回収することができる。
【００４０】
（ｄ）)細胞分別方法
次に、図１２を参照しつつ、光分解性ゲルを用いたマイクロチップ１０１を使用して、マイクロチップ１０１のチャンバ１０３の内面の所定領域の細胞と、それ以外の領域にある細胞とを分別する方法（細胞分別方法）の第１の例を説明する。
この細胞分別方法では、チャンバ１０３内面に光分解性ゲルからなる層が形成されたマイクロチップ１０１を使用する。
図１２（ａ）はチャンバ１０３内面の模式図であり、図１２（ｂ）は要部を拡大した模式図である。
【００４１】
本発明において分別対象となる細胞は、特に限定されず、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
【００４２】
チャンバ１０３の内面に光分解性ゲルの反応溶液を塗布し、光分解性ゲル層３２を形成する。光分解性ゲル層３２の厚さは、例えば１００ｎｍ〜１０μｍとすることができる。
次いで、光分解性ゲル層３２の表面に細胞接着性材料からなるコート層５２を形成する。
細胞接着性材料としては、細胞接着性タンパク質もしくは細胞接着性ペプチドが好ましい。細胞接着性タンパク質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニンからなる群から選択された少なくとも１つであることが望ましい。細胞接着性ペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸というアミノ酸配列（ＲＧＤ配列）を有することが望ましい。
【００４３】
図３および図４に示すように、光分解性ゲル層３２およびコート層５２は、例えば基板部１０５のチャンバ凹部１０３Ａの底面１０３Ａａのほぼ全面に形成することができる。光分解性ゲル層３２およびコート層５２は、複数のチャンバ１０３のすべてに形成してもよいし、目的に応じて一部のチャンバ１０３のみに形成してもよい。
基板部１０５と上板部１０６とを重ね合わせて接合することによって、マイクロチップ１０１を得る。
【００４４】
上流側貯留部１２１（１２１Ａ〜１２１Ｄ）には、それぞれ細胞を含まない培地（分別用液体）が導入される。
下流側貯留部１２２（１２２Ａ〜１２２Ｄ）には、それぞれ細胞を含む培養液が導入される。貯留部１２２Ａ〜１２２Ｄには、互いに異なる細胞を含む培養液を貯留してもよいし、互いに同じ細胞を含む培養液を貯留してもよい。
【００４５】
図１に示すように、下流側貯留部１２２（１２２Ａ〜１２２Ｄ）内の培養液を、下流側分配流路１０４を通してチャンバ１０３に導入する。
詳しくは、貯留部１２２Ａからの培養液を下流側分配流路１０４Ａから第１行１０９Ａのチャンバ１０３に導入し、貯留部１２２Ｂからの培養液を下流側分配流路１０４Ｂから第２行１０９Ｂのチャンバ１０３に導入し、貯留部１２２Ｃからの培養液を下流側分配流路１０４Ｃから第３行１０９Ｃのチャンバ１０３に導入し、貯留部１２２Ｄからの培養液を下流側分配流路１０４Ｄから第４行１０９Ｄのチャンバ１０３に導入する。
【００４６】
図１２に示すように、チャンバ１０３内のコート層５２表面に細胞３４が付着する。付着しなかった細胞３４は、上流側貯留部１２１内の培地を上流側分配流路１０２からチャンバ１０３に導入することによってチャンバ１０３から除去することができる。
なお、本発明において、細胞が付着する（接着する）とは、例えば、培地や緩衝液等による洗浄等の一定の物理的刺激によってもその位置から移動しなくなることである。例えば、培地や緩衝液等の流れによる所定の剪断応力（例えば０．１〜１０Ｎ／ｍ２）の洗浄操作により移動しない状態を「接着状態」（付着状態）とすることができる。
【００４７】
図１１に示す細胞分別装置を用いて、コート層５２の表面の一部である領域Ａ１に光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲル層３２を分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、領域Ａ１では、光分解性ゲル層３２上のコート層５２とともに、これに付着した細胞３４もチャンバ１０３表面から剥離可能となる。この工程では、光分解性ゲル層３２の分解によって細胞接着性が低下する。
光の照射条件は、チャンバ１０３ごとに任意に設定できる。例えば、各行１０９Ａ〜１０９Ｄが互いに異なる光照射条件であってもよいし、各列１１０Ａ〜１１０Ｄが互いに異なる光照射条件であってもよい。また、すべてのチャンバ１０３が互いに異なる光照射条件であってもよい。
【００４８】
剥離可能となった細胞３４は、次に示すように、培地を導入することによってチャンバ１０３から除去することができる。
図１〜図３に示すように、上流側貯留部１２１（１２１Ａ〜１２１Ｄ）内の培地を、上流側分配流路１０２を通してチャンバ１０３に導入する。
詳しくは、図１に示すように、貯留部１２１Ａからの培地は上流側分配流路１０２Ａを経て第１行１０９Ａのチャンバ１０３に導入される。貯留部１２１Ｂからの培地は上流側分配流路１０２Ｂを経て第２行１０９Ｂのチャンバ１０３に導入される。貯留部１２１Ｃからの培地は上流側分配流路１０２Ｃを経て第３行１０９Ｃのチャンバ１０３に導入される。貯留部１２１Ｄからの培地は上流側分配流路１０２Ｄを経て第４行１０９Ｄのチャンバ１０３に導入される。
なお、上流側貯留部１２１からチャンバ１０３に導入する分別用液体は、細胞３４をチャンバ１０３から流出させ得るものであれば培地に限らず、緩衝液等であってもよい。
【００４９】
以下、培地がチャンバ１０３に導入される過程について詳しく説明する。
図２および図３に示すように、上流側貯留部１２１から上流側分配流路１０２に導入された培地は、上流側連絡流路１０７を通ってチャンバ１０３に流入する。
上流側連絡流路１０７は一方縁部１０３ａのほぼ全範囲にわたって形成されているため、培地はチャンバ１０３の幅方向（図３の左右方向）のほぼ全範囲にわたってチャンバ１０３に流入し、チャンバ１０３内を他方縁部１０３ｂに向けて流れる。
下流側連絡流路１０８は、他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲に形成されているため、培地はチャンバ１０３の幅方向のほぼ全範囲にわたって下流側連絡流路１０８に流れ込む。
上流側および下流側の連絡流路１０７、１０８は全体として向かい合って形成されているため、チャンバ１０３内の培地の流れは、チャンバ１０３の幅方向（図３の左右方向）のほぼ全範囲にわたる均一方向（図３の下方）および均一流量の流れとなる。
【００５０】
図３および図１２に示すように、チャンバ１０３内には、上流側連絡流路１０７から下流側連絡流路１０８に向けて培地が流れるため、光照射によって剥離可能となった細胞３４は培地に同伴してチャンバ１０３から流出する。これによって、領域Ａ１にある細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別することができる（図１２参照）。
【００５１】
上述のように、培地はチャンバ１０３の幅方向のほぼ全範囲にわたって均一に流れるため、チャンバ１０３内の細胞３４には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかる。
このため、光照射により剥離可能となった細胞３４（領域Ａ１の細胞３４）は培地とともに確実にチャンバ１０３から流出する一方、光照射を受けていない細胞３４（領域Ａ１外の細胞３４）はチャンバ１０３内に残留する。
よって、光照射により剥離可能となった細胞３４（領域Ａ１の細胞３４）を、それ以外の細胞３４から効率よく確実に分離できる。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【００５２】
チャンバ１０３から下流側連絡流路１０８に流れ込んだ培地は、下流側分配流路１０４に流入し、下流側貯留部１２２に向かう。
詳しくは、図１に示すように、第１行１０９Ａのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ａ内を下流側貯留部１２２Ａに向けて流れる。第２行１０９Ｂのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ｂ内を下流側貯留部１２２Ｂに向けて流れる。第３行１０９Ｃのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ｃ内を下流側貯留部１２２Ｃに向けて流れる。第４行１０９Ｄのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ｄ内を下流側貯留部１２２Ｄに向けて流れる。
【００５３】
複数のチャンバ１０３について、導入される細胞の種類や光照射条件が互いに異なる場合には、これら条件の違いによる影響を互いに比較することができる。
【００５４】
次に、図１３を参照しつつ、細胞分別方法の第２の例を説明する。図１３（ａ）はチャンバ１０３内面の模式図であり、図１３（ｂ）は要部を拡大した模式図である。なお、上述の第１の例の細胞分別方法との共通部分については、同一符号を付してその説明を省略または簡略化する。
チャンバ１０３の内面に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層６２を形成する。コート層６２は、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを混合した混合材料であってもよいし、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとが化学的に結合した材料（例えばアミド結合によって化学的に結合した材料）であってもよい。
下流側貯留部１２２（１２２Ａ〜１２２Ｄ）内の培養液を、下流側分配流路１０４を通してチャンバ１０３に導入すると、コート層６２表面に細胞３４が付着する。
コート層６２の表面の一部である領域Ａ１に光を照射し、領域Ａ１のコート層６２の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化する。領域Ａ１では、コート層６２とともに、これに付着した細胞３４もチャンバ３内面から剥離可能となる。
【００５５】
図１〜図３に示すように、上流側貯留部１２１（１２１Ａ〜１２１Ｄ）内の培地を、上流側分配流路１０２を通してチャンバ１０３に導入する。
図３および図１３に示すように、チャンバ１０３内の培地の流れは、チャンバ１０３の幅方向（図３の左右方向）のほぼ全範囲にわたる均一方向（図３の下方）および均一流量の流れとなる。培地は、下流側連絡流路１０８を通って下流側分配流路１０４に流入し、下流側貯留部１２２に向かう。
チャンバ１０３内の培地の流れは、チャンバ１０３の幅方向のほぼ全範囲にわたる均一な流れとなるため、チャンバ１０３内の細胞３４には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかる。
このため、光照射により剥離可能となった細胞３４（領域Ａ１の細胞３４）を、それ以外の細胞３４から効率よく確実に分離できる。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【００５６】
光応答性材料としては、高分子化合物の側鎖または末端に、光照射によって構造と荷電状態が変化するスピロベンゾピランが担持されている光応答性材料を使用してもよい。
高分子化合物は、非イオン性で水和性が中程度のポリマーが好ましく、このようなポリマーとしては、Ｎ置換アクリルアミドの重合体が好適である。
Ｎ置換アクリルアミドとしては、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキレンアクリルアミドを挙げることができる。
Ｎ−アルキルアクリルアミドとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドを挙げることができる。
高分子化合物としては、特に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が好ましい。
【００５７】
スピロベンゾピランは、フォトクロミック分子である。フォトクロミック分子とは、特定波長の光の照射により分子構造が変化し、分子内の双極子モーメント、荷電などの性質が異なる異性体を可逆的に生成するものをいう。
図１４は、本発明で使用できるスピロベンゾピランの一例である。図１４において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子、アルキル基、アリール基、または複素環基を示す。
Ｘとしては水素原子、または置換基として電子供与性基を導入することが好ましい。電子供与性基の例としては、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、フェニル基、アミノ基、（アルキル置換）アミノ基、（ジアルキル置換）アミノ基などが挙げられる。
Ｙとしては水素原子、または置換基として電子吸引性基を導入することが好ましい。電子吸引性基の例としては、−Ｃ（＝Ｏ）−で表わされるカルボニル基を連結基として、その一方に置換基が結合して形成される置換カルボニル基や、ホルミル基、ニトロ基、ハロゲン化アルキル基、シアノ基、ハロゲン原子、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられる。
【００５８】
スピロベンゾピランは、光の照射によって荷電、もしくは分子内の双極子モーメントが異なる異性体を可逆的に生成する。
なお、本発明では、例示したものに限らず、上記式に示すスピロベンゾピランの誘導体も使用できる。
光応答性材料中のスピロベンゾピランの含有率は、低すぎる場合、および高すぎる場合のいずれにおいても光応答性材料の光応答性が小さくなるため、０．５〜２０ｍｏｌ％（例えば２〜１０ｍｏｌ％）が好ましい。
上記光応答性材料は、架橋がない（すなわち直鎖状）ポリマーであることが好ましい。
光応答性材料には、重合開始剤として、過酸化ベンゾイルなどの有機過酸化物や、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）などのアゾ重合開始剤を用いることができる。また、光重合開始剤として、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を添加するのが好ましい。
【００５９】
上記光応答性材料は、特定波長の光を照射すると、スピロベンゾピランが荷電の異なる異性体を生成し、細胞表面に吸着しやすくなる。
光応答性材料の具体的な例を図１５に示す。
図１５に示す光応答性材料は、高分子化合物（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド））の側鎖に、２つのアミド結合を含むリンカーを介してスピロベンゾピランが担持されている。スピロベンゾピランには、置換基としてニトロ基が導入されている。
上記光応答性材料は、波長３５０〜３８０ｎｍの光（近紫外線）を照射することによって開環し、波長４５０〜６００ｎｍの光（可視光）を照射することによって閉環する。
【００６０】
この光応答性材料を使用する場合には、チャンバ１０３内面に光応答性材料からなる層を形成し、その表面に細胞を付着させた後、チャンバ１０３の内面のうち一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させる。なお、チャンバ１０３の内面の少なくとも表面が光応答性材料を含む材料で構成されていてもよい。
チャンバ１０３の一方側の連絡流路１０７から他方側の連絡流路１０８に分別用液体を流すと、細胞接着性が低い領域の細胞は分別用液体に同伴してチャンバ１０３から流出する。これによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することができる。
上述のように、チャンバ１０３内の分別用液体の流れはチャンバ１０３の幅方向に均一となり、チャンバ１０３内の細胞には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかるため、接着性が低い領域の細胞は確実にチャンバ１０３から流出する一方、それ以外の細胞はチャンバ１０３内に残留する。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【００６１】
図１６は、光分解性架橋剤の他の例であって、ニトロベンジル基を含む化合物である。この光分解性架橋剤は光の照射により分解可能であるため、この光分解性架橋剤を用いた光分解性ゲルは光照射により特性（水溶性等）が変化し、細胞接着性が変化する。（Kloxin, A.M., et al Science 324, 59-63 (2009)参照）
図１７は、光分解性架橋剤の他の例であって、６−ブロモ−７−ヒドロキシクーマリン−４−イルメチル基（英文名：6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl group）を含む化合物である。この光分解性架橋剤は光の照射により分解可能であるため、この光分解性架橋剤を用いた光分解性ゲルは光照射により特性（水溶性等）が変化し、細胞接着性が変化する。（Satoshi Yamaguchi, et al. Chem. Commun., 46, 2244-2246 (2010)参照）
図１８は、光応答性材料の他の例であり、アゾベンゼン誘導体である。この化合物も光照射によりその形態が変化し、細胞接着性が変化するため光応答性材料として使用できる。（Dingbin Liu, et al. Anger. Chem. Int. Ed. 48, 4406-4408 (2009)参照）
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１・・・光分解性架橋剤、２・・・主鎖、３・・・ニトロベンジル基、４・・・活性エステル基、５・・・アミド結合部、６・・・高分子化合物、１０・・・光分解性ゲル、
１３・・・照射部、１４・・・照射領域調整部、３２・・・光分解性ゲル層、１０１・・・細胞分別用マイクロチップ、１０２・・・上流側分配流路（第１分配流路）、１０３・・・チャンバ、１０３ａ・・・一方縁部、１０３ｂ・・・他方縁部、１０４・・・下流側分配流路（第２分配流路）、１０７・・・上流側連絡流路（一方側の連絡流路）、１０８・・・下流側連絡流路（他方側の連絡流路）、１０９・・・行、１１０・・・列、Ａ１・・・光が照射される一部領域。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤スクリーニング、医薬品生産、薬剤アッセイ等に用いられる細胞分別用マイクロチップおよび細胞分別方法ならびに細胞分別装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀の最先端医療では、ヒトや動物の細胞の利用が益々盛んになると言われている。例えば、薬剤スクリーニング等の目的に応じて特定の細胞を分離し、分離した細胞について試験を行うことが考えられる。細胞を分離する技術としては、現在はフローサイトメトリーや磁気細胞分離法などが広く用いられている。
これらの分離操作は、溶液中に細胞を完全に分散させなくてはならず、動物細胞の大部分を占める足場依存性細胞に対して適用すると細胞に大きなダメージを与えることが問題視されてきた。そこで、足場依存性細胞を培養基材表面で培養している状態（ｉｎ ｓｉｔｕ）で選抜・分離する技術の確立が望まれている。
近年では、光照射によって細胞の接着性が変化する基材が報告されている。(例えば、特許文献１、２を参照)
これらの光応答性細胞培養基材は、培養した細胞に特定波長の光を照射すると、照射部位の細胞接着性が変化するため、顕微鏡などで観察しながら任意の細胞のみを剥離させ回収したり、逆にそれだけを残して他の細胞を除去できることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００７／０６３７３６号
【特許文献２】特開２００７−２４４３７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述の細胞分離技術では、光照射によって剥離させるべき細胞が剥離しなかったり、逆に、剥離するべきでない細胞が剥離することがあり、確実な細胞分別を実現することは難しかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、特定の細胞を効率よく確実に他の細胞から分離することができる細胞分別用マイクロチップおよび細胞分別方法ならびに細胞分別装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の構成は以下のとおりである。
（１）第１分配流路と、前記第１分配流路に連通する１または複数のチャンバと、前記チャンバに接続された第２分配流路とを備え、前記チャンバの内面の少なくとも一部に、光応答性材料が用いられ、前記第１分配流路は、前記チャンバの流通方向の一方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の一方側の連絡流路が、前記一方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列され、前記第２分配流路は、前記チャンバの前記一方側の縁部に対向する他方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の他方側の連絡流路が、前記他方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列されている細胞分別用マイクロチップ。
（２）前記チャンバが、平面視矩形状に形成され、前記一方側と他方側の縁部は、前記チャンバの向かい合う一対の辺部であり、前記一方側と他方側の連絡流路は、前記チャンバを介して向かい合って形成されている（１）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（３）前記複数のチャンバが、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列されている（１）または（２）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（４）前記光応答性材料は、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られる光分解性ゲルであり、前記光分解性架橋剤が、ポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基と、前記ニトロベンジル基の末端側に配置された活性エステル基とを含み、前記活性エステル基が、アミノ基またはヒドロキシル基に対する反応性を有し、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されている（１）〜（３）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップ。
（５）前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である（４）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（６）前記高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである（４）または（５）に記載の細胞分別用マイクロチップ。
（７）前記チャンバの内面には、前記光応答性材料からなる層が形成されている（１）〜（６）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップ。
（８）（１）〜（７）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップと、前記細胞分別用マイクロチップに光を照射する照射部とを備え、前記照射部は、光源と、前記光源からの光を前記チャンバの内面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部を有する細胞分別装置。
（９）（１）〜（７）のうちいずれか１つに記載の細胞分別用マイクロチップを使用し、前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面に細胞を付着させた後、前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面のうち、一部領域にのみ前記光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させ、前記一方側の連絡流路から前記他方側の連絡流路に分別用液体を流すことで前記細胞を同伴して前記チャンバから流出させることによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別する細胞分別方法。
（１０）前記光応答性材料が光分解性ゲルであり、前記一部領域への前記光の照射により前記光分解性ゲルを選択的に分解することによって前記細胞接着性を低下させる（９）に記載の細胞分別方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細胞分別用マイクロチップのチャンバの内面の一部領域にのみ光を照射してこの領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させ、一方側の連絡流路から他方側の連絡流路に分別用液体を流して前記細胞の一部をチャンバから流出させることによって、前記領域にある細胞と前記領域外の細胞とを分別することができる。
一方側および他方側の連絡流路は、それぞれチャンバの一方および他方の縁部に複数形成されているため、チャンバ内の分別用液体の流れはチャンバの幅方向に均一となり、チャンバ内の細胞には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかる。
このため、接着性が低い領域の細胞は確実にチャンバから流出する一方、それ以外の細胞はチャンバ内に残留する。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の細胞分別用マイクロチップの全体を示す平面図である。
【図２】図１の細胞分別用マイクロチップの要部を拡大した平面図である。
【図３】図１の細胞分別用マイクロチップの要部をさらに拡大した平面図である。
【図４】図１の細胞分別用マイクロチップの要部の断面図である。
【図５】本発明の光分解性架橋剤の一例を示す化学構造式である。
【図６】前図の光分解性架橋剤を模式的に表した図である。
【図７】前図の光分解性架橋剤の構造の説明図である。
【図８】（ａ）光分解性架橋剤の分解反応の反応式である。（ｂ）（ａ）の反応式を模式的に表した図である。
【図９】光分解性ゲルの一例の生成反応を示す図である。
【図１０】前図の光分解性ゲルの分解反応を示す図である。
【図１１】本発明の細胞分別装置の一例を示す構成図である。
【図１２】試験方法を説明する工程図であり、（ａ）は細胞分別用マイクロチップの模式図であり、（ｂ）は要部を拡大した模式図である。
【図１３】試験方法を説明する工程図であり、（ａ）は細胞分別用マイクロチップの模式図であり、（ｂ）は要部を拡大した模式図である。
【図１４】本発明で使用できるスピロベンゾピランの一例である。
【図１５】スピロベンゾピランを含む光応答性材料の一例である。
【図１６】光分解性架橋剤の他の例である。
【図１７】光分解性架橋剤の他の例である。
【図１８】光応答性材料の他の例である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の一実施形態である細胞分別用マイクロチップ１０１（以下、単にマイクロチップ１０１という）について、図面を参照して説明する。
図１は、マイクロチップ１０１の全体を示す平面図である。図２はマイクロチップ１０１の要部を拡大した平面図である。図３はマイクロチップ１０１の要部をさらに拡大した平面図である。図４は、マイクロチップ１０１の要部の断面図である。
以下の説明において、マイクロチップ１０１の長手方向（図１における左右方向）を第１方向といい、マイクロチップ１０１の短手方向（図１における上下方向）を第２方向ということがある。
【０００９】
図１に示すように、マイクロチップ１０１は、上流側貯留部１２１と、上流側貯留部１２１に接続された上流側分配流路１０２（第１分配流路）と、上流側分配流路１０２に連通する１または複数のチャンバ１０３と、チャンバ１０３に連通する下流側分配流路１０４（第２分配流路）と、下流側分配流路１０４に接続された下流側貯留部１２２とを備えている。
【００１０】
上流側貯留部１２１は、マイクロチップ１０１内に形成された、液体を貯留可能な空間である。上流側貯留部１２１の数は１または複数とすることができ、図示例では、上流側貯留部１２１は、マイクロチップ１０１の長手方向の一端部に近い位置に４つ形成されている（上流側貯留部１２１Ａ〜１２１Ｄという）。
下流側貯留部１２２は、マイクロチップ１０１内に形成された、液体を貯留可能な空間である。下流側貯留部１２２の数は１または複数とすることができ、図示例では、下流側貯留部１２２は、上流側貯留部１２１に比べて他端側の位置に４つ形成されている（下流側貯留部１２２Ａ〜１２２Ｄという）。
【００１１】
図２および図３に示すように、分配流路１０２、１０４およびチャンバ１０３は液体が流通可能な空間であり、マイクロチップ１０１の内部に形成されている。
チャンバ１０３の形状は特に限定されないが、平面視矩形状とすることができる。図示例では、チャンバ１０３の平面視形状は略正方形である。
符号１０３ａ、１０３ｂは、チャンバ１０３の液流通方向（図２および図３における上下方向）の一方および他方の縁部であり、矩形のチャンバ１０３の向かい合う一対の辺部である。
一方縁部１０３ａおよび他方縁部１０３ｂは、第１方向（図２および図３における左右方向）に沿って形成されている。
【００１２】
図４に示すように、マイクロチップ１０１は、平板状の基板部１０５と、平板状の上板部１０６とを重ね合わせた構成とすることができる。
基板部１０５の、上板部１０６に対向する面１０５ａ（表面１０５ａ）には、各流路、チャンバ、および貯留部を形成する凹部が形成されている。図示例では、上流側分配流路１０２となる凹部１０２Ａ、チャンバ１０３となるチャンバ凹部１０３Ａ、下流側分配流路１０４となる凹部１０４Ａ、連絡流路１０７、１０８となる凹部１０７Ａ、１０８Ａ等が形成されている。
【００１３】
図１に示すように、チャンバ１０３は、複数の行１０９および複数の列１１０からなる行列をなすように２次元的に配列される。
図示例では、合計１６のチャンバ１０３が、４行および４列からなる行列をなすようアレイ状に配列されている。行を構成するチャンバ１０３は、第１方向（図１における左右方向）に沿って並び、列を構成するチャンバ１０３は、第２方向（図１における上下方向）に沿って並んでいる。各チャンバ１０３は、互いに間隔をおいて配列されている。
符号１０９Ａ〜１０９Ｄはそれぞれチャンバ１０３がなす４つの行を示し、符号１１０Ａ〜１１０Ｄはそれぞれチャンバ１０３がなす４つの列を示す。
なお、図示例では、行と列の形成方向は互いにほぼ垂直であるが、これに限らず、互いに交差する方向であればよい。
【００１４】
図１〜図３に示すように、上流側分配流路１０２は、第１方向に沿って直線状に形成されており、それぞれのチャンバ１０３の一方縁部１０３ａに、複数の細い上流側連絡流路１０７（一方側の連絡流路）を介して接続されている。
上流側分配流路１０２の数は１または複数とすることができ、図示例では上流側分配流路１０２は４つ形成され（上流側分配流路１０２Ａ〜１０２Ｄという）、それぞれが異なる上流側貯留部１２１（上流側貯留部１２１Ａ〜１２１Ｄ）に接続されている。
【００１５】
上流側分配流路１０２Ａは第１行１０９Ａと第２行１０９Ｂの間に延在し、上流側分配流路１０２Ｂ、１０２Ｃは第２行１０９Ｂと第３行１０９Ｃの間に延在し、上流側分配流路１０２Ｄは第３行１０９Ｃと第４行１０９Ｄの間に延在している。
【００１６】
上流側連絡流路１０７は、上流側分配流路１０２とチャンバ１０３との間で液を流通させるものである。上流側連絡流路１０７は、第２方向（図２および図３における上下方向）に沿って形成されていることが好ましい。
図３に示すように、これら複数の上流側連絡流路１０７は、一方縁部１０３ａの延在方向（図３の左右方向）に互いに間隔をおいて配列されている。上流側連絡流路１０７の幅は、互いにほぼ同じであることが好ましい。
隣り合う上流側連絡流路１０７、１０７の間隔は、すべての上流側連絡流路１０７について互いに同じであることが好ましい。
上流側連絡流路１０７は、一方縁部１０３ａの広い範囲にわたって形成するのが好ましい。図３に示す例では、上流側連絡流路１０７は一方縁部１０３ａのほぼ全範囲にわたって所定間隔ごとに形成されている。
この例では、８つの上流側連絡流路１０７のうち連絡流路１０７Ａは一方縁部１０３ａの一端（図３の左端）に近接した位置にあり、連絡流路１０７Ａから最も離れた連絡流路１０７Ｂは一方縁部１０３ａの他端（図３の右端）に近接した位置にあるため、上流側連絡流路１０７は一方縁部１０３ａのほぼ全範囲にわたって形成されているといえる。
【００１７】
図１〜図３に示すように、下流側分配流路１０４は、第１方向に沿って直線状に形成されており、それぞれのチャンバ１０３の他方縁部１０３ｂに、複数の細い下流側連絡流路１０８（他方側の連絡流路）を介して接続されている。
下流側分配流路１０４の数は１または複数とすることができ、図示例では下流側分配流路１０４は４つ形成され（下流側分配流路１０４Ａ〜１０４Ｄという）、それぞれが異なる下流側貯留部１２２（下流側貯留部１２２Ａ〜１２２Ｄ）に接続されている。
【００１８】
下流側分配流路１０４Ａは第１行１０９Ａの外側（図１における上方）に延在し、下流側分配流路１０４Ｂは第１行１０９Ａと第２行１０９Ｂの間に延在し、下流側分配流路１０４Ｃは第３行１０９Ｃと第４行１０９Ｄの間に延在し、下流側分配流路１０４Ｄは第４行１０９Ｄの外側（図１における下方）に延在している。
【００１９】
下流側連絡流路１０８は、チャンバ１０３と下流側分配流路１０４との間で液を流通させるものである。下流側連絡流路１０８は、第２方向（図２および図３における上下方向）に沿って形成されていることが好ましい。
図３に示すように、これら複数の下流側連絡流路１０８は、他方縁部１０３ｂの延在方向（図３の左右方向）に互いに間隔をおいて配列されている。下流側連絡流路１０８の幅は、互いにほぼ同じであることが好ましい。
隣り合う下流側連絡流路１０８、１０８の間隔は、すべての下流側連絡流路１０８について互いに同じであることが好ましい。
【００２０】
下流側連絡流路１０８は、他方縁部１０３ｂの広い範囲にわたって形成するのが好ましい。図３に示す例では、下流側連絡流路１０８は他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲にわたって所定間隔ごとに形成されている。
この例では、６つの下流側連絡流路１０８のうち連絡流路１０８Ａは他方縁部１０３ｂの一端（図３の左端）に近接した位置にあり、連絡流路１０８Ａから最も離れた連絡流路１０８Ｂは他方縁部１０３ｂの他端（図３の右端）に近接した位置にあるため、下流側連絡流路１０８は他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲にわたって形成されているといえる。
【００２１】
チャンバ１０３の一方縁部１０３ａに形成された上流側連絡流路１０７と、他方縁部１０３ｂに形成された下流側連絡流路１０８は、全体としてチャンバ１０３を介して向かい合って形成されていることが好ましい。
図示例では、一方縁部１０３ａと他方縁部１０３ｂは矩形のチャンバ１０３の向かい合う辺部であり、上流側連絡流路１０７は矩形のチャンバ１０３の一方縁部１０３ａのほぼ全範囲に形成され、下流側連絡流路１０８は他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲に形成されているため、これら連絡流路１０７、１０８は全体として向かい合って形成されている。
なお、図示例では、上流側連絡流路１０７の数と下流側連絡流路１０８の数が異なるため、個々の連絡流路１０７、１０８は向かい合う位置にない場合もあるが、全体としては向かい合う位置（一方および他方縁部１０３ａ、１０３ｂ）にあるといえる。
【００２２】
図１に示すように、マイクロチップ１０１では、上流側貯留部１２１Ａからの液を上流側分配流路１０２Ａから第１行１０９Ａのチャンバ１０３に導入でき、上流側貯留部１２１Ｂからの液を上流側分配流路１０２Ｂから第２行１０９Ｂのチャンバ１０３に導入でき、上流側貯留部１２１Ｃからの液を上流側分配流路１０２Ｃから第３行１０９Ｃのチャンバ１０３に導入でき、上流側貯留部１２１Ｄからの液を上流側分配流路１０２Ｄから第４行１０９Ｄのチャンバ１０３に導入できる。
【００２３】
図４に示すように、基板部１０５は、レプリカモールディング法によって形成することができる。また、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工などを採用することもできる。
基板部１０５および上板部１０６の材料としては、プラスチック、ガラス、改質ガラス、金属等を挙げることができる。
プラスチックとして好適なものとしては、ポリスチレン系樹脂、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ））、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン樹脂）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
【００２４】
チャンバ１０３の内面の少なくとも一部には、光応答性材料が用いられている。光応答性材料は、光照射によって細胞接着性を変化させ得る材料であって、例えば光分解性ゲルが使用できる。
例えば、チャンバ１０３の内面の少なくとも一部に光分解性ゲルからなる層を形成することができる。また、チャンバ１０３の内面の少なくとも表面が光分解性ゲルを含む材料で構成されていてもよい。
光分解性ゲルを用いる範囲はチャンバ１０３の内面の一部であってもよいし、全面であってもよい。
図４に示すように、例えば基板部１０５のチャンバ凹部１０３Ａの底面１０３Ａａのほぼ全面に、光分解性ゲル層を形成することができる。
【００２５】
光分解性ゲルとしては、例えばニトロベンジル基を含む高分子化合物が使用できる。以下、本発明に使用できる光分解性ゲルの一例について説明する。
【００２６】
（ａ）光分解性架橋剤
本発明に用いられる光分解性ゲルに使用できる光分解性架橋剤としては、ポリエチレングリコールからなる主鎖と、主鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基と、ニトロベンジル基の末端側に配置された活性エステル基とを含む光分解性架橋剤がある。
主鎖を構成するポリエチレングリコールのエチレングリコールの平均繰り返し数は、４から１２の範囲にあることが好ましい。
活性エステル基は、アミノ基またはヒドロキシル基に対する反応性を有することが好ましい。
前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であることが好ましい。
光分解性のニトロベンジル基は、産業用の水銀ランプやレーザーによって発生する紫外線や可視光を照射することにより分解できることが好ましい。
【００２７】
図５は、光分解性架橋剤の一例を示すものである。
式（１）に示す光分解性架橋剤１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる主鎖２と、この主鎖２の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基３、３と、ニトロベンジル基３、３の末端側に配置された活性エステル基４、４とからなる。
【００２８】
図６は、式（１）の光分解性架橋剤１を模式的に表した図であって、この光分解性架橋剤１は、主鎖２と、ニトロベンジル基３、３と、活性エステル基４、４とからなる。
図６および図７に示すように、主鎖２はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ニトロベンジル基３は、アミド結合部５（―ＮＨＣＯ―）を介して主鎖２に結合している。
【００２９】
（ｂ）光分解性ゲル
上記光分解性架橋剤は、高分子化合物と反応させることによって、光分解性ゲルを生成する。
高分子化合物は、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する水溶性高分子が好ましく、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つが好ましい。
【００３０】
高分子化合物としては、特に、ポリエチレングリコールまたはその誘導体が、細胞との相互作用が少なく、しかも高分子化合物自体が水に可溶であるために好ましい。
なかでも、分岐型のポリエチレングリコールまたはその誘導体を用いると、網目構造が形成されやすく、ゲル化が進行しやすくなるため好ましい。分岐型ポリエチレングリコール（または誘導体）の分岐数は３以上が好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は入手しやすいため好適である。
ポリエチレングリコール（または誘導体）は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール（または誘導体）の分子量は１万から４万の範囲にあることが好ましい。
塩基性多糖類としては、キトサンが好ましい。
【００３１】
高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合すると、高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基は、光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋される。
前記アミノ基は光分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光分解性ゲルとを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状（層状）のゲルの形成が容易である。
【００３２】
高分子化合物に対する光分解性架橋剤の添加量（光分解性架橋剤／高分子化合物）はモル比で１以上であることが好ましい。高分子化合物と光分解性架橋剤との混合比は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（またはその誘導体）を高分子化合物として用いる場合は、モル比（高分子化合物：光分解性架橋剤）で１：１から１：４の範囲が好ましい。
高分子化合物の使用量は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の場合、光分解性ゲル中に７．５重量％以上含有されるように設定することができる。
【００３３】
図９は、光分解性架橋剤１を用いて、光分解性ゲル１０を生成させる反応を示すものである。
光分解性架橋剤１と、高分子化合物６とを反応させることによって、光分解性ゲル１０を生成させる。
高分子化合物６は、末端にアミノ基を有する４分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
【００３４】
高分子化合物６と光分解性架橋剤１とを混合すると、高分子化合物６のアミノ基は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物６は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物６と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル１０が生成する。
【００３５】
図１０に示すように、光の照射により光分解性架橋剤１が分解されることによって、光分解性ゲル１０は分解される。これによって、光分解性ゲル１０は水に可溶となる。
具体的には、図８（ａ）に示すように、ニトロベンジル基３は、例えば波長３３０〜３８０ｎｍの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。図８（ｂ）は、この分解反応を模式的に示すものである。
ニトロベンジル基３は、アミド結合部５のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロソベンジル基３’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前期光照射によりニトロベンジル基３と活性エステル基４との結合が切断されることもある。
【００３６】
前記構造を有する光分解性架橋剤１は、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。
ラジカル重合を利用してゲル化される従来の光応答性ゲルおよび光分解性ゲルの製造工程は、重合の際に酸素が存在すると重合反応を阻害し、ゲル化が進行しない。この現象は特に薄膜状（層状）のゲルを調製する際に顕著になる。
一方、光分解性架橋剤１では、架橋反応時に酸素の影響を全く受けないため、このような重合反応阻害は起こらない。
ラジカル重合反応を利用する場合も無酸素雰囲気条件で反応を行えば薄膜状のゲルを調製することが可能となるかもしれないが、その場合には無酸素条件下で重合反応を行わせるための設備が必要となり、製造工程が複雑になる。
一方、光分解性架橋剤１を用いると、無酸素雰囲気条件が必要ないため、薄膜状（層状）のゲルの製造工程が簡略であり、効率的かつ低コストで光分解性ゲルを調製できる。
また、本発明では、架橋反応にラジカル重合を利用しないため、ラジカルによってダメージを受けやすい物質を混合した状態で光分解性ゲルを調製することが可能となる。従って、光分解性ゲルを広範な用途、例えば細胞や生理活性物質を固定化する用途にも使用できる。また、ラジカル重合に対応できないモノマーの重合物も高分子化合物として使用できることから、高分子化合物の選択範囲が広いという利点もある。
【００３７】
（ｃ）細胞分別装置
図１１は、本発明の細胞分別装置の一例であって、マイクロチップ１０１を保持する保持台１１と、マイクロチップ１０１に光を照射する照射部１２と、マイクロチップ１０１を撮影する撮影部１３と、制御部１４と、マイクロチップ１０１に分別用液体（培地、緩衝液など）を供給する送液部１５と、マイクロチップ１０１から使用済みの分別用液体を回収する回収部１６とを備えている。
照射部１２は、光源（図示略）と、マイクロチップ１０１の表面の任意の一部領域にのみ光照射する照射領域調整部１７とを備えている。
照射領域調整部１７は、所定のパターン１８をなす光をマイクロチップ１０１に照射することができる。パターン１８は表示装置１９に表示される。
【００３８】
照射領域調整部１７は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス（Digital Micromirror Device））を備えている。ＤＭＤは複数のマイクロミラーを有し、各マイクロミラーは、制御部１４からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光２０をマイクロチップ１０１に照射できる。
照射領域調整部１７からの光は、フィルター２１、ミラー２２（ダイクロイックミラー）、対物レンズ２３を経て、マイクロチップ１０１の任意の領域に照射される。マイクロチップ１０１の任意形状の一部領域にのみ光２０を照射することもできるし、全領域に光２０を照射することもできる。
光源としては、光分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
光の波長域は、例えば２００〜１０００ｎｍを例示できる。特に３００〜６００ｎｍ、なかでも３５０〜４００ｎｍは好適である。照射エネルギーは、通常は０．０１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２である。
なお、光をマイクロチップ内面の一部領域にのみ照射させるための構成としては、ＤＭＤに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
【００３９】
撮影部１３としては、ＣＣＤカメラ等を使用できる。
送液部１５としては、分別用液体をマイクロチップ１０１に送ることができるものであれば特に限定されず、例えばシリンジポンプ、ペリスタポンプ、エアーポンプ、圧力ボンベが使用できる。送液部１５は分別用液体を管路１５ａにより上流側貯留部１２１に送ることができる。回収部１６は使用済みの分別用液体を管路１６ａにより下流側貯留部１２２から回収することができる。
【００４０】
（ｄ）)細胞分別方法
次に、図１２を参照しつつ、光分解性ゲルを用いたマイクロチップ１０１を使用して、マイクロチップ１０１のチャンバ１０３の内面の所定領域の細胞と、それ以外の領域にある細胞とを分別する方法（細胞分別方法）の第１の例を説明する。
この細胞分別方法では、チャンバ１０３内面に光分解性ゲルからなる層が形成されたマイクロチップ１０１を使用する。
図１２（ａ）はチャンバ１０３内面の模式図であり、図１２（ｂ）は要部を拡大した模式図である。
【００４１】
本発明において分別対象となる細胞は、特に限定されず、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
【００４２】
チャンバ１０３の内面に光分解性ゲルの反応溶液を塗布し、光分解性ゲル層３２を形成する。光分解性ゲル層３２の厚さは、例えば１００ｎｍ〜１０μｍとすることができる。
次いで、光分解性ゲル層３２の表面に細胞接着性材料からなるコート層５２を形成する。
細胞接着性材料としては、細胞接着性タンパク質もしくは細胞接着性ペプチドが好ましい。細胞接着性タンパク質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニンからなる群から選択された少なくとも１つであることが望ましい。細胞接着性ペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸というアミノ酸配列（ＲＧＤ配列）を有することが望ましい。
【００４３】
図３および図４に示すように、光分解性ゲル層３２およびコート層５２は、例えば基板部１０５のチャンバ凹部１０３Ａの底面１０３Ａａのほぼ全面に形成することができる。光分解性ゲル層３２およびコート層５２は、複数のチャンバ１０３のすべてに形成してもよいし、目的に応じて一部のチャンバ１０３のみに形成してもよい。
基板部１０５と上板部１０６とを重ね合わせて接合することによって、マイクロチップ１０１を得る。
【００４４】
上流側貯留部１２１（１２１Ａ〜１２１Ｄ）には、それぞれ細胞を含まない培地（分別用液体）が導入される。
下流側貯留部１２２（１２２Ａ〜１２２Ｄ）には、それぞれ細胞を含む培養液が導入される。貯留部１２２Ａ〜１２２Ｄには、互いに異なる細胞を含む培養液を貯留してもよいし、互いに同じ細胞を含む培養液を貯留してもよい。
【００４５】
図１に示すように、下流側貯留部１２２（１２２Ａ〜１２２Ｄ）内の培養液を、下流側分配流路１０４を通してチャンバ１０３に導入する。
詳しくは、貯留部１２２Ａからの培養液を下流側分配流路１０４Ａから第１行１０９Ａのチャンバ１０３に導入し、貯留部１２２Ｂからの培養液を下流側分配流路１０４Ｂから第２行１０９Ｂのチャンバ１０３に導入し、貯留部１２２Ｃからの培養液を下流側分配流路１０４Ｃから第３行１０９Ｃのチャンバ１０３に導入し、貯留部１２２Ｄからの培養液を下流側分配流路１０４Ｄから第４行１０９Ｄのチャンバ１０３に導入する。
【００４６】
図１２に示すように、チャンバ１０３内のコート層５２表面に細胞３４が付着する。付着しなかった細胞３４は、上流側貯留部１２１内の培地を上流側分配流路１０２からチャンバ１０３に導入することによってチャンバ１０３から除去することができる。
なお、本発明において、細胞が付着する（接着する）とは、例えば、培地や緩衝液等による洗浄等の一定の物理的刺激によってもその位置から移動しなくなることである。例えば、培地や緩衝液等の流れによる所定の剪断応力（例えば０．１〜１０Ｎ／ｍ２）の洗浄操作により移動しない状態を「接着状態」（付着状態）とすることができる。
【００４７】
図１１に示す細胞分別装置を用いて、コート層５２の表面の一部である領域Ａ１に光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲル層３２を分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、領域Ａ１では、光分解性ゲル層３２上のコート層５２とともに、これに付着した細胞３４もチャンバ１０３表面から剥離可能となる。この工程では、光分解性ゲル層３２の分解によって細胞接着性が低下する。
光の照射条件は、チャンバ１０３ごとに任意に設定できる。例えば、各行１０９Ａ〜１０９Ｄが互いに異なる光照射条件であってもよいし、各列１１０Ａ〜１１０Ｄが互いに異なる光照射条件であってもよい。また、すべてのチャンバ１０３が互いに異なる光照射条件であってもよい。
【００４８】
剥離可能となった細胞３４は、次に示すように、培地を導入することによってチャンバ１０３から除去することができる。
図１〜図３に示すように、上流側貯留部１２１（１２１Ａ〜１２１Ｄ）内の培地を、上流側分配流路１０２を通してチャンバ１０３に導入する。
詳しくは、図１に示すように、貯留部１２１Ａからの培地は上流側分配流路１０２Ａを経て第１行１０９Ａのチャンバ１０３に導入される。貯留部１２１Ｂからの培地は上流側分配流路１０２Ｂを経て第２行１０９Ｂのチャンバ１０３に導入される。貯留部１２１Ｃからの培地は上流側分配流路１０２Ｃを経て第３行１０９Ｃのチャンバ１０３に導入される。貯留部１２１Ｄからの培地は上流側分配流路１０２Ｄを経て第４行１０９Ｄのチャンバ１０３に導入される。
なお、上流側貯留部１２１からチャンバ１０３に導入する分別用液体は、細胞３４をチャンバ１０３から流出させ得るものであれば培地に限らず、緩衝液等であってもよい。
【００４９】
以下、培地がチャンバ１０３に導入される過程について詳しく説明する。
図２および図３に示すように、上流側貯留部１２１から上流側分配流路１０２に導入された培地は、上流側連絡流路１０７を通ってチャンバ１０３に流入する。
上流側連絡流路１０７は一方縁部１０３ａのほぼ全範囲にわたって形成されているため、培地はチャンバ１０３の幅方向（図３の左右方向）のほぼ全範囲にわたってチャンバ１０３に流入し、チャンバ１０３内を他方縁部１０３ｂに向けて流れる。
下流側連絡流路１０８は、他方縁部１０３ｂのほぼ全範囲に形成されているため、培地はチャンバ１０３の幅方向のほぼ全範囲にわたって下流側連絡流路１０８に流れ込む。
上流側および下流側の連絡流路１０７、１０８は全体として向かい合って形成されているため、チャンバ１０３内の培地の流れは、チャンバ１０３の幅方向（図３の左右方向）のほぼ全範囲にわたる均一方向（図３の下方）および均一流量の流れとなる。
【００５０】
図３および図１２に示すように、チャンバ１０３内には、上流側連絡流路１０７から下流側連絡流路１０８に向けて培地が流れるため、光照射によって剥離可能となった細胞３４は培地に同伴してチャンバ１０３から流出する。これによって、領域Ａ１にある細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別することができる（図１２参照）。
【００５１】
上述のように、培地はチャンバ１０３の幅方向のほぼ全範囲にわたって均一に流れるため、チャンバ１０３内の細胞３４には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかる。
このため、光照射により剥離可能となった細胞３４（領域Ａ１の細胞３４）は培地とともに確実にチャンバ１０３から流出する一方、光照射を受けていない細胞３４（領域Ａ１外の細胞３４）はチャンバ１０３内に残留する。
よって、光照射により剥離可能となった細胞３４（領域Ａ１の細胞３４）を、それ以外の細胞３４から効率よく確実に分離できる。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【００５２】
チャンバ１０３から下流側連絡流路１０８に流れ込んだ培地は、下流側分配流路１０４に流入し、下流側貯留部１２２に向かう。
詳しくは、図１に示すように、第１行１０９Ａのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ａ内を下流側貯留部１２２Ａに向けて流れる。第２行１０９Ｂのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ｂ内を下流側貯留部１２２Ｂに向けて流れる。第３行１０９Ｃのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ｃ内を下流側貯留部１２２Ｃに向けて流れる。第４行１０９Ｄのチャンバ１０３内の培地は下流側分配流路１０４Ｄ内を下流側貯留部１２２Ｄに向けて流れる。
【００５３】
複数のチャンバ１０３について、導入される細胞の種類や光照射条件が互いに異なる場合には、これら条件の違いによる影響を互いに比較することができる。
【００５４】
次に、図１３を参照しつつ、細胞分別方法の第２の例を説明する。図１３（ａ）はチャンバ１０３内面の模式図であり、図１３（ｂ）は要部を拡大した模式図である。なお、上述の第１の例の細胞分別方法との共通部分については、同一符号を付してその説明を省略または簡略化する。
チャンバ１０３の内面に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層６２を形成する。コート層６２は、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを混合した混合材料であってもよいし、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとが化学的に結合した材料（例えばアミド結合によって化学的に結合した材料）であってもよい。
下流側貯留部１２２（１２２Ａ〜１２２Ｄ）内の培養液を、下流側分配流路１０４を通してチャンバ１０３に導入すると、コート層６２表面に細胞３４が付着する。
コート層６２の表面の一部である領域Ａ１に光を照射し、領域Ａ１のコート層６２の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化する。領域Ａ１では、コート層６２とともに、これに付着した細胞３４もチャンバ３内面から剥離可能となる。
【００５５】
図１〜図３に示すように、上流側貯留部１２１（１２１Ａ〜１２１Ｄ）内の培地を、上流側分配流路１０２を通してチャンバ１０３に導入する。
図３および図１３に示すように、チャンバ１０３内の培地の流れは、チャンバ１０３の幅方向（図３の左右方向）のほぼ全範囲にわたる均一方向（図３の下方）および均一流量の流れとなる。培地は、下流側連絡流路１０８を通って下流側分配流路１０４に流入し、下流側貯留部１２２に向かう。
チャンバ１０３内の培地の流れは、チャンバ１０３の幅方向のほぼ全範囲にわたる均一な流れとなるため、チャンバ１０３内の細胞３４には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかる。
このため、光照射により剥離可能となった細胞３４（領域Ａ１の細胞３４）を、それ以外の細胞３４から効率よく確実に分離できる。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【００５６】
光応答性材料としては、高分子化合物の側鎖または末端に、光照射によって構造と荷電状態が変化するスピロベンゾピランが担持されている光応答性材料を使用してもよい。
高分子化合物は、非イオン性で水和性が中程度のポリマーが好ましく、このようなポリマーとしては、Ｎ置換アクリルアミドの重合体が好適である。
Ｎ置換アクリルアミドとしては、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキレンアクリルアミドを挙げることができる。
Ｎ−アルキルアクリルアミドとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドを挙げることができる。
高分子化合物としては、特に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が好ましい。
【００５７】
スピロベンゾピランは、フォトクロミック分子である。フォトクロミック分子とは、特定波長の光の照射により分子構造が変化し、分子内の双極子モーメント、荷電などの性質が異なる異性体を可逆的に生成するものをいう。
図１４は、本発明で使用できるスピロベンゾピランの一例である。図１４において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子、アルキル基、アリール基、または複素環基を示す。
Ｘとしては水素原子、または置換基として電子供与性基を導入することが好ましい。電子供与性基の例としては、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、フェニル基、アミノ基、（アルキル置換）アミノ基、（ジアルキル置換）アミノ基などが挙げられる。
Ｙとしては水素原子、または置換基として電子吸引性基を導入することが好ましい。電子吸引性基の例としては、−Ｃ（＝Ｏ）−で表わされるカルボニル基を連結基として、その一方に置換基が結合して形成される置換カルボニル基や、ホルミル基、ニトロ基、ハロゲン化アルキル基、シアノ基、ハロゲン原子、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられる。
【００５８】
スピロベンゾピランは、光の照射によって荷電、もしくは分子内の双極子モーメントが異なる異性体を可逆的に生成する。
なお、本発明では、例示したものに限らず、上記式に示すスピロベンゾピランの誘導体も使用できる。
光応答性材料中のスピロベンゾピランの含有率は、低すぎる場合、および高すぎる場合のいずれにおいても光応答性材料の光応答性が小さくなるため、０．５〜２０ｍｏｌ％（例えば２〜１０ｍｏｌ％）が好ましい。
上記光応答性材料は、架橋がない（すなわち直鎖状）ポリマーであることが好ましい。
光応答性材料には、重合開始剤として、過酸化ベンゾイルなどの有機過酸化物や、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）などのアゾ重合開始剤を用いることができる。また、光重合開始剤として、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を添加するのが好ましい。
【００５９】
上記光応答性材料は、特定波長の光を照射すると、スピロベンゾピランが荷電の異なる異性体を生成し、細胞表面に吸着しやすくなる。
光応答性材料の具体的な例を図１５に示す。
図１５に示す光応答性材料は、高分子化合物（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド））の側鎖に、２つのアミド結合を含むリンカーを介してスピロベンゾピランが担持されている。スピロベンゾピランには、置換基としてニトロ基が導入されている。
上記光応答性材料は、波長３５０〜３８０ｎｍの光（近紫外線）を照射することによって開環し、波長４５０〜６００ｎｍの光（可視光）を照射することによって閉環する。
【００６０】
この光応答性材料を使用する場合には、チャンバ１０３内面に光応答性材料からなる層を形成し、その表面に細胞を付着させた後、チャンバ１０３の内面のうち一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させる。なお、チャンバ１０３の内面の少なくとも表面が光応答性材料を含む材料で構成されていてもよい。
チャンバ１０３の一方側の連絡流路１０７から他方側の連絡流路１０８に分別用液体を流すと、細胞接着性が低い領域の細胞は分別用液体に同伴してチャンバ１０３から流出する。これによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することができる。
上述のように、チャンバ１０３内の分別用液体の流れはチャンバ１０３の幅方向に均一となり、チャンバ１０３内の細胞には均一なシェアストレス（剪断応力）がかかるため、接着性が低い領域の細胞は確実にチャンバ１０３から流出する一方、それ以外の細胞はチャンバ１０３内に残留する。
従って、目的とする細胞をそれ以外の細胞から効率よく確実に分離できる。
【００６１】
図１６は、光分解性架橋剤の他の例であって、ニトロベンジル基を含む化合物である。この光分解性架橋剤は光の照射により分解可能であるため、この光分解性架橋剤を用いた光分解性ゲルは光照射により特性（水溶性等）が変化し、細胞接着性が変化する。（Kloxin, A.M., et al Science 324, 59-63 (2009)参照）
図１７は、光分解性架橋剤の他の例であって、６−ブロモ−７−ヒドロキシクーマリン−４−イルメチル基（英文名：6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl group）を含む化合物である。この光分解性架橋剤は光の照射により分解可能であるため、この光分解性架橋剤を用いた光分解性ゲルは光照射により特性（水溶性等）が変化し、細胞接着性が変化する。（Satoshi Yamaguchi, et al. Chem. Commun., 46, 2244-2246 (2010)参照）
図１８は、光応答性材料の他の例であり、アゾベンゼン誘導体である。この化合物も光照射によりその形態が変化し、細胞接着性が変化するため光応答性材料として使用できる。（Dingbin Liu, et al. Anger. Chem. Int. Ed. 48, 4406-4408 (2009)参照）
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１・・・光分解性架橋剤、２・・・主鎖、３・・・ニトロベンジル基、４・・・活性エステル基、５・・・アミド結合部、６・・・高分子化合物、１０・・・光分解性ゲル、
１３・・・照射部、１４・・・照射領域調整部、３２・・・光分解性ゲル層、１０１・・・細胞分別用マイクロチップ、１０２・・・上流側分配流路（第１分配流路）、１０３・・・チャンバ、１０３ａ・・・一方縁部、１０３ｂ・・・他方縁部、１０４・・・下流側分配流路（第２分配流路）、１０７・・・上流側連絡流路（一方側の連絡流路）、１０８・・・下流側連絡流路（他方側の連絡流路）、１０９・・・行、１１０・・・列、Ａ１・・・光が照射される一部領域。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１分配流路と、前記第１分配流路に連通する１または複数のチャンバと、前記チャンバに接続された第２分配流路とを備え、
前記チャンバの内面の少なくとも一部に、光応答性材料が用いられ、
前記第１分配流路は、前記チャンバの流通方向の一方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の一方側の連絡流路が、前記一方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列され、
前記第２分配流路は、前記チャンバの前記一方側の縁部に対向する他方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の他方側の連絡流路が、前記他方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列されていることを特徴とする細胞分別用マイクロチップ。
【請求項２】
前記チャンバが、平面視矩形状に形成され、
前記一方側と他方側の縁部は、前記チャンバの向かい合う一対の辺部であり、
前記一方側と他方側の連絡流路は、前記チャンバを介して向かい合って形成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項３】
前記複数のチャンバが、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項４】
前記光応答性材料は、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られる光分解性ゲルであり、
前記光分解性架橋剤が、ポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基と、前記ニトロベンジル基の末端側に配置された活性エステル基とを含み、前記活性エステル基が、アミノ基またはヒドロキシル基に対する反応性を有し、
前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項５】
前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であることを特徴とする請求項４に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項６】
前記高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項４または５に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項７】
前記チャンバの内面には、前記光応答性材料からなる層が形成されていることを特徴とする請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップと、
前記細胞分別用マイクロチップに光を照射する照射部とを備え、
前記照射部は、光源と、前記光源からの光を前記チャンバの内面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞分別装置。
【請求項９】
請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップを使用し、
前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面に細胞を付着させた後、前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面のうち、一部領域にのみ前記光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させ、前記一方側の連絡流路から前記他方側の連絡流路に分別用液体を流すことで前記細胞を同伴して前記チャンバから流出させることによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することを特徴とする細胞分別方法。
【請求項１０】
前記光応答性材料が光分解性ゲルであり、前記一部領域への前記光の照射により前記光分解性ゲルを選択的に分解することによって前記細胞接着性を低下させることを特徴とする請求項９に記載の細胞分別方法。
【請求項１】
第１分配流路と、前記第１分配流路に連通する１または複数のチャンバと、前記チャンバに接続された第２分配流路とを備え、
前記チャンバの内面の少なくとも一部に、光応答性材料が用いられ、
前記第１分配流路は、前記チャンバの流通方向の一方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の一方側の連絡流路が、前記一方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列され、
前記第２分配流路は、前記チャンバの前記一方側の縁部に対向する他方側の縁部に、複数の連絡流路を介して接続され、これら複数の他方側の連絡流路が、前記他方側の縁部の延在方向に互いに間隔をおいて配列されていることを特徴とする細胞分別用マイクロチップ。
【請求項２】
前記チャンバが、平面視矩形状に形成され、
前記一方側と他方側の縁部は、前記チャンバの向かい合う一対の辺部であり、
前記一方側と他方側の連絡流路は、前記チャンバを介して向かい合って形成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項３】
前記複数のチャンバが、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項４】
前記光応答性材料は、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られる光分解性ゲルであり、
前記光分解性架橋剤が、ポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基と、前記ニトロベンジル基の末端側に配置された活性エステル基とを含み、前記活性エステル基が、アミノ基またはヒドロキシル基に対する反応性を有し、
前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項５】
前記活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であることを特徴とする請求項４に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項６】
前記高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項４または５に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項７】
前記チャンバの内面には、前記光応答性材料からなる層が形成されていることを特徴とする請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップ。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップと、
前記細胞分別用マイクロチップに光を照射する照射部とを備え、
前記照射部は、光源と、前記光源からの光を前記チャンバの内面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞分別装置。
【請求項９】
請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞分別用マイクロチップを使用し、
前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面に細胞を付着させた後、前記光応答性材料が用いられた前記チャンバの内面のうち、一部領域にのみ前記光を照射することにより前記一部領域の光応答性材料の細胞接着性を変化させ、前記一方側の連絡流路から前記他方側の連絡流路に分別用液体を流すことで前記細胞を同伴して前記チャンバから流出させることによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することを特徴とする細胞分別方法。
【請求項１０】
前記光応答性材料が光分解性ゲルであり、前記一部領域への前記光の照射により前記光分解性ゲルを選択的に分解することによって前記細胞接着性を低下させることを特徴とする請求項９に記載の細胞分別方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−１２５２１８（Ｐ２０１２−１２５２１８Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８１７５０（Ｐ２０１０−２８１７５０）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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