細胞培養プロセス
異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞、（例えば、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞）を、３５．１〜３６．５℃、および／またはｐＨ７．１５〜７．２０、および／または１０％以下の溶存ＣＯ２濃度で培養すること。好ましい異種タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子、ＡＤＡＭＴＳ−１３、フューリン、または第ＶＩＩ因子である。本発明の別の実施形態において、細胞培養上清を含む容器の中でのＦＶＩＩＩを分泌する哺乳動物細胞の連続培養の方法が提供される。ここでは、細胞培養上清中での細胞の密度はインラインセンサーによって測定され、容器への新鮮な培地の流入は、所望される範囲内に細胞密度が維持されるように自動的に制御される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１２月２７日に出願された米国仮出願第６１／００９，３２８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞、具体的には、異種タンパク質および／または組み換え体タンパク質を分泌する哺乳動物細胞、そしてさらに具体的には、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（本明細書中以後、「第ＶＩＩＩ因子」または単に「ＦＶＩＩＩ」）、ＡＤＡＭＴＳ−１３、フューリン、あるいは凝固第ＶＩＩ因子（本明細書中以後、「第ＶＩＩ因子」または単に「ＦＶＩＩ」のような血中タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、哺乳動物においてみられる微量の血漿糖タンパク質であり、第Ｘ因子の活性化にＩＸａの補因子として関与している。第ＶＩＩＩ因子の遺伝的欠損は、出血性障害である血友病Ａを生じる。血友病Ａは、精製された第ＶＩＩＩ因子での治療が可能である。第ＶＩＩＩ因子は、血漿から抽出することができるか、または組み換えＤＮＡをベースとする技術によって生産することができる。血漿中では、これは、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）との複合体として循環している。
【０００４】
組み換え体である第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）は、第ＶＩＩＩ因子分子をコードするＤＮＡ配列を持つベクターがトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって生産させることができる。いくつかの場合には、組み換え体である第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させる組み換え体であるフォン・ヴィレブランド因子（ｒｖＷＦ）と同時に生産される。そのような同時生産には、ＦＶＩＩＩとｖＷＦを発現するそれぞれの細胞株の同時培養、または同じ細胞の中での２種類のタンパク質の同時発現が含まれ得る。特許文献１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）および非特許文献１参照のこと。
【０００５】
組み換え体である第ＶＩＩＩ因子を調製するための典型的なプロセスにおいては、細胞は培地中で培養され、第ＶＩＩＩ因子が培地中に分泌される。その後、第ＶＩＩＩ因子が培地から、状況によってはｖＷＦとの複合体として、精製され得る。
【０００６】
組み換え体である第ＶＩＩＩ因子は、当該分野で公知のプロセスでは比較的低い収率でしか得られないことが原因で、生産コストが高い。細胞あたりの収率は、他の組み換え体タンパク質について得ることができる収率と比較して低い傾向にある。培養培地に動物性の生成物（例えば、血清）が補充されていなければ、培地は、比較的低い細胞密度しかサポートすることができない。これにより、培地の容量あたりの収率が減少する。しかし、ウイルスや他の伝染性物質の混入のリスクを低下させるためには、動物性の生成物が培養培地に補充されないことが望ましい。ＦＶＩＩＩの生産のための動物性タンパク質を含まない培地は、例えば、特許文献２（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）から公知である。
【０００７】
本発明により、当該分野で公知のプロセスと比較して収率が改善された、ｒＦＶＩＩＩを含む血中タンパク質を生産するためのプロセスが提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，２５０，４２１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，９３６，４４１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）９，１２３３〜１２４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様により、細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法が提供される。ここでは、細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持される。ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし温度は３７℃未満に設定される。
【００１１】
本発明の第２の態様により、細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法が提供される。ここでは、細胞培養上清は、Ｘ±０．０５に設定されたｐＨで維持される。ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有し、ただしｐＨは７．１０より大きく設定される。
【００１２】
本発明の第３の態様により、細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法が提供される。ここでは、細胞培養上清は、１〜１０％のＣＯ２濃度を有する。
【００１３】
本発明の第４の態様により、細胞培養上清を含む容器の中でのＦＶＩＩＩを分泌する哺乳動物細胞の連続培養の方法が提供される。ここでは、細胞培養上清中での細胞の密度はインラインセンサーによって測定され、容器への新鮮な培地の流入は、所望される範囲内に細胞密度が維持されるように自動的に制御される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様のプロセスにおいては、哺乳動物細胞がその中で培養される細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持される。ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし温度は３７℃未満に設定される。好ましい実施形態では、温度は、３６±０．９℃、好ましくは３６±０．５℃、より好ましくは３６±０．２℃、そして最も好ましくは３６℃；または３５．１±０．９℃、好ましくは３５．１±０．５℃、より好ましくは３５．１±０．２℃、そして最も好ましくは３５．１℃；または３６．５±０．９℃、３６．５±０．５℃、より好ましくは３６．５±０．２℃、そして最も好ましくは３６．５℃に設定される。
【００１５】
「細胞培養上清」は、その中で哺乳動物細胞が培養される培地である。この培地は、培養物に対して添加され得る供給培地と混同してはならないが、供給培地もまた、細胞培養上清について設定される温度で培養物に添加させることが好ましい。「培養物」によって、本発明者らは、細胞培養上清とその中で培養された哺乳動物細胞とを意味する。従来法では、哺乳動物細胞は３７℃で培養される。驚くべきことに、本出願では、より低温（例えば、３６℃）での哺乳動物細胞の培養により、組み換え体タンパク質の収率が増大することが見出された。
【００１６】
ある温度で「培養すること」または「維持すること」により、本発明者らは、プロセスの制御システムが設定される温度、言い換えると、意図される、目的とする、温度をいう。明らかに、経時的な培養物の温度、そして培養容器全体の個々の位置による小さな差異があるであろう。本発明者がＸ±Ｙ℃に設定した温度で「培養すること」または「維持すること」をいう場合は、本発明者らは、設定値がＸ＋Ｙ℃からＸ−Ｙ℃までの値にあることを意味する。したがって、例えば、Ｘが３６．０±０．９℃である場合は、設定値は、３５．１から３６．９までの値に設定される。好ましいＸ値のそれぞれについて、設定値は、範囲Ｘ±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、もしくは±０．１℃内の値である。より狭い範囲が好ましい。Ｘの設定値が最も好ましい。
【００１７】
任意の所定の設定値について、温度においてはわずかな差異が生じ得る。典型的には、そのような差異は、温度が設定値からいくらか外れた後にしか加熱要素および冷却要素が作動しないことが原因で起こり得る。その場合、設定値はＸ（±Ｙ）であり、加熱要素または冷却要素は、必要に応じて、温度が±Ｚ℃変化すると作動する。典型的には、加熱要素または冷却要素が作動する前に温度について強要される設定値からの偏差の程度は、プロセスの制御システムの中にプログラミングされ得る。温度は、サーモスタットによって制御される加熱要素および冷却要素によって、最近±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、またはさらには±０．１℃になるように制御され得る。温度についてのさらに大きな差異（例えば、±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、もしくは±０．６℃）もまたプログラムされ得る。温度はまた、特定の温度の加熱浴中に培養容器を浸すことによっても制御することができる。考えられる限りでは、加熱が継続的に行われるので、設定値からの差異は存在しない。差異の別の原因は、細胞培養上清の温度の測定誤差が原因で生じる。細胞培養装置において使用される一般的な温度計は、±０．３℃、もしくは±０．２℃、またはさらには±０．１℃の変動性を有し得る。
【００１８】
設定値がＸ±Ｙ℃の範囲内の値に設定され、温度の許容誤差が±Ｚ℃である（すなわち、温度が必要に応じて±Ｚ℃外れると、加熱器または冷却器が作動する）場合は、これは、（Ｘ−ＹからＸ＋Ｙ）±Ｚ℃の設定値として表わすこともできる。可能なＸ値のそれぞれについて、上記で示されたような±Ｙ℃と±Ｚ℃との全ての組み合わせが想定されるが、ただし温度は３７℃未満に設定される。
【００１９】
１つの好ましい実施形態では、温度は３６±Ｙ℃に設定される。好ましくは、温度は（３５．４〜３６．６）±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．５〜３６．５）±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．６〜３６．４）±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．７〜３６．３）±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．８〜３６．２）±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．９〜３６．１）±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または３６±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０℃に設定される。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、温度は３５．１±Ｙ℃に設定される。好ましくは、温度は（３４．５〜３５．７）±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．６〜３５．６）±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．７〜３５．５）±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．８〜３５．４）±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．９〜３５．３）±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．０〜３５．２）±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または３５．１±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０℃に設定される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、温度は３６．５±Ｙ℃に設定される。好ましくは、温度は３６．１〜３６．９）±０；または（３６．２〜３６．８）±０．１℃、もしくは±０；または（３６．３〜３６．７）±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３６．４〜３６．６）±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または３６．５±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０に設定される。
【００２２】
本発明の第２の態様のプロセスにおいては、細胞培養上清は、Ｘ±０．０５に設定されたｐＨで維持される。ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有し、ただしｐＨは７．１０より大きく設定される。好ましい実施形態では、ｐＨは７．２０±０．０５、好ましくは７．２０±０．０３、より好ましくは７．２０±０．０１、そして最も好ましくは７．２０；または７．１５±０．０５、好ましくは７．１５±０．０３、より好ましくは７．１５±０．０１、そして最も好ましくは７．１５に設定される。組み換え体タンパク質を生産するための従来のプロセスにおいては、細胞培養上清はｐＨ７．１で維持される。驚くべきことに、本出願では、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ７．２）で哺乳動物細胞を培養することにより、組み換え体タンパク質の収率が増大することが明らかになった。
【００２３】
あるｐＨで「培養すること」または「維持すること」により、本発明者らは、プロセスの制御システムが設定されるｐＨ、言い換えると、意図される、目的とする、ｐＨをいう。本発明者らがＸ±Ｙに設定したｐＨで「培養すること」または「維持すること」という場合は、本発明者らは、設定値がＸ＋ＹからＸ−Ｙまでの値にあることを意味する。好ましいＸ値のそれぞれについて、設定値は、Ｘ±０．０５、±０．０４、±０．０３、±０．０２、または±０．０１の範囲内の値である。より狭い範囲が好ましい。Ｘの設定値が最も好ましい。
【００２４】
任意の所定設定値について、ｐＨのわずかな差異が生じ得る。通常は、そのような差異は、ｐＨを制御する手段（例えば、酸または塩基を添加すること、あるいはスパージング速度を変化させることによる）が、ｐＨが設定値からいくらか外れた後でしか作動しないことが原因で起こり得る。通常、ｐＨは、最近±０．０５、±０．０４、±０．０３、±０．０２、または±０．０１のｐＨ単位になるように制御される。
【００２５】
ｐＨの設定値がＸ±Ｙの範囲内の値に設定され、そして許容範囲が±Ｚである場合は、これは、（Ｘ−ＹからＸ＋Ｙ）±Ｚの設定値として表わすこともできる。可能なＸの値のそれぞれについて、上記に示したような±Ｙと±Ｚとの全ての組み合わせが想定され、ただしｐＨは７．１０より大きく設定される。
【００２６】
１つの好ましい実施形態では、ｐＨは、７．２０±Ｙに設定される。好ましくは、ｐＨは（７．１５〜７．２５）±０；または（７．１６〜７．２４）±０．１、もしくは±０；または（７．１７〜７．２３）±０．２、±０．１、もしくは±０；または（７．１８〜７．２２）±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０；または（７．１９〜７．２１）±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０；または７．２０±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０に設定される。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、ｐＨは７．１５±Ｙに設定される。好ましくは、ｐＨは（７．１１〜７．１９）±０；または（７．１２〜７．１８）±０．１、もしくは±０；または（７．１３〜７．１７）±０．２、±０．１、もしくは±０；または（７．１４〜７．１６）±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０；または７．１５±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０に設定される。
【００２８】
本発明の第３の態様のプロセスにおいては、細胞培養上清は、１％〜１０％のＣＯ２濃度、例えば、４．０％〜９．０％、５．５％〜８．５％、または約６％〜８％のＣＯ２濃度を有する。従来法では、ＣＯ２濃度は、細胞培養上清から取り出されていない細胞によって生産されたＣＯ２が原因でこれよりも高い。驚くべきことに、出願人は、１０％以下のＣＯ２濃度を維持することにより組み換え体タンパク質の収率が増大することを見出した。これは、供給培地が脱気される場合（例えば、供給培地全体に空気を泡立てることによる）、ならびにバイオリアクター中の細胞培養上清がスパージングされる場合に、ｄＣＯ２を低く維持するために役立つ。
【００２９】
好ましくは、本発明の最初の３つの態様のそれぞれについてのプロセスは、本発明の他の態様の１つ以上のプロセスに関して定められている特定の特徴を含むように操作される。言い換えると、温度がＸ±０．９℃に維持される（ここでは、Ｘは３５．１から３６．５℃までの値を有する）場合には、ｐＨをＸ±０．０５に（ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有する）、そして／またはＣＯ２濃度を１０％以下に維持することもまた有効である。ｐＨがＸ±０．０５に維持される（ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有する）場合には、温度をＸ±０．９℃に（ここでは、Ｘは３５．１から３６．５℃までの値を有する）、および／またはＣＯ２濃度を１０％以下に維持することもまた有効である。ＣＯ２濃度が１０％以下に維持される場合は、ｐＨをＸ±０．０５に（ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有する）、および／または温度をＸ±０．９℃に（ここでは、Ｘは３５．１から３６．５℃までの値を有する）維持することもまた有効である。
【００３０】
３種類の定義されたパラメーター（温度、ｐＨ、およびＣＯ２濃度）をモニタリングする方法は当該分野で周知であり、通常は、バイオリアクターに挿入されるか、または培養培地が循環させられるループの中に含まれるか、または培養培地の抽出された試料に挿入されるプローブに依存する。適切なインラインｄＣＯ２センサーとその使用については、Ｐａｔｔｉｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：７６９−７７４に記載されている。適しているインラインｐＨセンサーはＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＰｒｏ ３１００／１２５／Ｐｔ１００（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ Ｉｎｇｏｌｄ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）である。ｐＨおよびｐＯ２に加えてｄＣＯ２を測定するために適しているオフラインシステムは、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ｐＨＯｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）である。このシステムでは、ｄＣＯ２は、５％の不正確性の分解能（ｉｍｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、３ｍｍＨｇ〜２００ｍｍＨｇの範囲にある電位電極によって測定される。ｐＨは、バイオリアクター中の細胞培養上清の温度に近い３７℃の温度で、このシステムの中で測定され得る。これを予め決定された値に維持するために特異的なパラメーターを変化させる方法もまた周知である。例えば、温度を一定に保つことには、通常は、バイオリアクターもしくは供給培地を加熱または冷却すること（これが流加培養または連続プロセスである場合）が含まれる。ｐＨを一定に保つことには、通常は、適切な緩衝液（典型的には、重炭酸塩）を選択し、充分な量を供給すること、および酸（例えば、塩酸）またはアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、もしくはそれらの混合物）を必要に応じて供給培地に添加することが含まれる。そしてＣＯ２濃度を一定に保つことには、通常は、スパージング速度を調整すること（下記を参照のこと）、または上部空間中でのＣＯ２の流れを調節することが含まれる。インラインｐＨプローブの較正は、細胞が培養される間に経時的に（例えば、数日間または数週間の期間にわたって）ドリフトする可能性がある。そのような場合は、最近較正されたオフラインプローブから得られた測定値を使用することにより、インラインプローブをリセットすることが有効であり得る。適切なオフラインプローブはＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ｐＨＯｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）である。
【００３１】
本発明者らは、（例えば、ＮａＯＨを添加することにより）ｐＨを増大させることでは、活性タンパク質の生産に関して最大の利点を得るにはそれ自体は充分ではないことを明らかにした。それよりもむしろ、ＣＯ２濃度を下げることが所望される。通常は、このプロセスの他のパラメーターが一定に維持されるであろう。しかし、本発明者らは、ＣＯ２濃度を下げること、しかし、好ましくはＮａＯＨを添加することなく、ｐＨを７．１から、例えば、７．１５または７．２に上昇させることが有効であることを見出した。
【００３２】
哺乳動物細胞の培養には、細胞を増殖させるための酸素が必要である。通常は、これは、注入口を通じて培養物中に酸素を送り込むことによって提供される。細胞の呼吸が原因で蓄積するＣＯ２を除去することも必要である。これは「スパージング」、すなわち、ＣＯ２を取り込み、流し出すためにバイオリアクター全体に気体を通すことによって行われる。従来法では、これは酸素を使用して行うこともできる。しかし、本発明者らは、代わりに空気を使用することが有効であることを見出した。通常、従来の不活性ガス（例えば、窒素）は、空気を使用するよりもＣＯ２のスパージングには効果が低いことが明らかにされている。空気に約２０％の酸素が含まれているとすると、はるかに多い５倍量の空気が使用されるであろうと当業者は考える。しかし、これは、大規模な培養（特に、２５００Ｌの規模での培養）には適さないことが明らかにされている。２５００Ｌのバイオリアクターの中では、７倍から１０倍量の空気、好ましくは約９倍量の空気が使用される。例えば、標準的な条件下では、２５００Ｌのバイオリアクターに、１０μｍの気泡の大きさのＯ２が、０．０２ＶＶＨ（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）がスパージングされる。本発明の方法にしたがって使用される同じ２５００Ｌのバイオリアクターには、１０μｍの気泡の大きさの空気は、０．１８ＶＶＨの速度でスパージングされるであろう。
【００３３】
したがって、驚くほど多量の空気の使用により、適切な酸素供給が提供され、そして望ましくないＣＯ２が除去されることが明らかにされている。
【００３４】
生産フェーズの間には、上記のような空気のスパージングによってＣＯ２が除去されることが好ましい。これは、別の方法によって細胞培養上清に有害なほど高濃度にまでＣＯ２を蓄積する大容量のバイオリアクターが使用される場合に特にそのとおりである。しかし、培養の開始時、または小規模（例えば、１Ｌまたは２．５Ｌの規模）での培養では、上部空間にはＣＯ２が重層される場合がある。そのような条件下では、低いｄＣＯ２濃度に達する場合がある。上部空間のＣＯ２の重層はまた、ｐＨがあまりに塩基性側にある場合には、ｐＨを設定値にまで下げるためにも使用され得る。
【００３５】
細胞は、所望されるタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）を生産するための、好ましくは、製造プロセス（すなわち、少なくとも１リットル）の中で培養することができる任意の哺乳動物細胞であり得る。例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９９７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（例えば、ＤＵＫＸ−Ｂ１１サブクローン）（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サルの腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましくは、細胞株は齧歯類の細胞株、特に、ＣＨＯまたはＢＨＫのようなハムスターの細胞株である。
【００３６】
組み換え体タンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを調製する好ましい方法は以下のとおりである。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＵＫＸ−ＢＩＩは、原則として米国特許第５，２５０，４２１号（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、関連する組み換え体タンパク質の発現が可能なＤＨＦＲ発現ベクターでトランスフェクトされる。トランスフェクションは、メトトレキセートについて選択される。組み換え体タンパク質の発現をコードする関連領域とＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、漸増濃度のメトトレキセートの中での細胞の増殖によって行われる。適切である場合には、ＣＨＯ細胞株は、原則として米国特許第６，１００，０６１号（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）に記載されているとおりに、血清および／またはタンパク質を含まない培地の中での増殖に適応させられ得る。
【００３７】
宿主細胞株を培養するために選択される基底培地は本発明については重要ではなく、哺乳動物細胞を培養するために適している当該分野で公知のもののうちの任意の１つ、またはそれらの組み合わせであり得る。ダルベッコ改変イーグル培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地が市販されている。組み換え体インシュリンのような増殖因子の添加は随意である。
【００３８】
歴史的には、動物細胞は、動物の血清を含む培地中で培養されてきた。しかし、そのような培地は不完全にしか定義されておらず、感染のリスクがある。したがって、当業者は、いずれのタンパク質も全く含まれていないか、または組み換え生産されない任意のタンパク質が少なくとも含まれていないかのいずれかである、「タンパク質を含まない」培地を考案した。第ＶＩＩＩ因子の不安定な性質が原因で、操作された宿主細胞の生産性は、タンパク質を含まない条件下ではかなり低下する。ヒト血清アルブミンが、組み換え体タンパク質の生産のための無血清培地補充物として一般的に使用されている。アルブミン自体がＦＶＩＩＩを安定化させ、血清由来のアルブミン調製物中に存在する不純物もまた、アルブミンの安定化作用に寄与し得る。リポタンパク質のような因子は、血清を含まない条件下での組み換え体である第ＶＩＩＩ因子の生産のための、ヒト血清アルブミンの代わりとなるものとして同定されている。
【００３９】
好ましい培地としては、米国特許第６，１７１，８２５号（Ｂａｙｅｒ，Ｉｎｃ）および米国特許第６，９３６，４４１号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に開示されているものが挙げられる。
【００４０】
米国特許第６，１７１，８２５号の培地は、組み換え体インシュリン、鉄、ポリオール、銅、および状況に応じた他の微量金属が補充された、改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最少必須培地とＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（重量で５０：５０）からなる。
【００４１】
インシュリンは組み換え体でなければならず、「Ｎｕｃｅｌｌｉｎ」インシュリンとしてＥｌｉ Ｌｉｌｌｙから入手することができる。これは、０．１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ（好ましくは、５μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌ）で添加することができる。鉄は、好ましくは、Ｆｅ２＋イオンの形態（例えば、ＦｅＳＯ４・ＥＤＴＡとして提供される）であり、５μＭ〜１００μＭ（好ましくは、約５０μｍ）で存在し得る。適切なポリオールとしては、約１０００〜約１６０００までの範囲の分子量を有しているポリ（オキシエチレン）とポリ（オキシプロピレン）の非イオン性ブロックコポリマーが挙げられる。特に好ましいポリオールはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）であり、これは、８４００の平均分子量を有し、ポリ（オキシプロピレン）（２０重量％）のセンターブロックと、両方の末端にあるポリ（オキシエチレン）のブロックからなる。これは、Ｕｎｉｃｈｅｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＢＶからＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ−６８として入手することもできる。他のものとしては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ−６１、Ｆ−７１、およびＦ−１０８が挙げられる。銅（Ｃｕ２＋）は、５０ｎＭ〜８００ｎＭのＣｕＳＯ４、好ましくは１００ｎＭ〜４００ｎＭ、便宜的には約２５０ｎＭ等量で添加され得る。微量金属（例えば、マンガン、モリブデン、ケイ素、リチウム、およびクロム）のパネルを含めることにより、第ＶＩＩＩ因子の生産のさらなる増大を誘導することができる。ＢＨＫ細胞は、このタンパク質を含まない基本培地の中ではかなり増殖する。
【００４２】
米国特許第６，９３６，４４１号の培地もまた、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ Ｆ１２との５０／５０混合物をベースとするが、これには、０．１ｇ／ｌから１００ｇ／ｌの間、好ましくは１ｇ／ｌから５ｇ／ｌの間で大豆ペプトンまたは酵母抽出物も含まれる。特に好ましい実施形態では、大豆抽出物（例えば、大豆ペプトン）が使用され得る。大豆ペプトンの分子量は５０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満であり得る。３５０ダルトンの平均分子量を有している限外濾過された大豆ペプトンの添加は、組み換え体である細胞株の生産性に特に有効であることが証明されている。これは、全部で約９．５％の窒素含有量と、約１３％または約７％〜１０％の遊離のアミノ酸の含有量を有している大豆単離物である。
【００４３】
特に好ましい培地は、以下の組成を有する：合成の最少培地（例えば、５０／５０のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２）１ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ；大豆ペプトン０．５ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ；Ｌ−グルタミン０．０５ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；ＮａＨＣＯ３ ０．１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸０．０００５ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；エタノールアミン０．０００５〜０．０５；および亜セレン酸ナトリウム１μｇ／ｌ〜１５μｇ／ｌ。状況に応じて、ポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６１、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−７１、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１０８）が、消泡剤として培地に添加され得る。この薬剤は、一般的には、エアレーション（「スパージング」）のネガティブ効果から細胞を保護するために使用される。なぜなら、界面活性剤を添加しなければ、気泡の上昇および破裂によって、気泡の表面に存在する細胞が傷つく可能性があるからである。
【００４４】
非イオン性界面活性剤の量は、０．０５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの間、好ましくは０．１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの間の範囲であり得る。さらに、培地には、シクロデキストリンまたはその誘導体が含まれ得る。好ましくは、血清およびタンパク質を含まない培地には、組織培養に適しており、合成起源または植物起源のものであるプロテアーゼ阻害剤（例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤）が含まれる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、以下のアミノ酸混合物が、上記培地にさらに添加される：Ｌ−アスパラギン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ−システイン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．００５ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ−シスチン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（０．００１ｇ／ｌ〜１．５ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０７ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０２ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、およびＬ−グルタミン（０．０５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ；好ましくは、０．１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ）。これらのアミノ酸は、個別に、または組み合わせて培地に添加され得る。上記アミノ酸を全て含むアミノ酸混合物の組み合わせた添加が特に好ましい。
【００４６】
特定の実施形態では、上記アミノ酸混合物と、精製された限外濾過された大豆ペプトンとの組み合わせを含む血清およびタンパク質を含まない培地がさらに使用される。
【００４７】
米国特許第６，９３６，４４１号の培地は、ＣＨＯ細胞を培養するために特によく適しているが、これはさらに他の細胞とともに使用することもできる。
【００４８】
さらなる適切な培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されているオリゴペプチドを含まない培地である。
【００４９】
好ましくは、培養培地は、重炭酸塩イオン（通常は、重炭酸ナトリウムとして供給される）の使用によって緩衝化される。
【００５０】
培養培地が、２１０ｍＯｓｍ〜６５０ｍＯｓｍの間、好ましくは２７０ｍＯｓｍ〜４５０ｍＯｓｍの間、より好ましくは３１０ｍＯｓｍ〜３５０ｍＯｓｍの間、そして最も好ましくは３２０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有していることが適している。好ましくは、上清のオスモル濃度は、本発明の方法全体を通じてこれらの範囲のうちの１つ以上の中で維持される。
【００５１】
培養は、任意の従来のタイプの培養（例えば、バッチ培養、流加培養、または連続培養）であり得るが、流加培養または連続培養が好ましい。適切な連続培養には、反復バッチ、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養が含まれる。
【００５２】
バッチ培養は、必要な全ての栄養素を含んだ状態で開始され、培養が完了するまで、すなわち、栄養素が使い尽くされるか、または培養が何らかの理由によって停止するまで進められる。
【００５３】
流加培養は、細胞と栄養素を含んだ状態で開始されるが、細胞の増殖を制限するために制御された方法で、その後にさらに栄養素が供給される意味でのバッチプロセスである。流加培養のストラテジーは、通常は、バイオリアクターの中で高い細胞密度に到達させるための生物産業的プロセスにおいて使用される。供給される溶液は、通常は、バイオリアクターの希釈を避けるために高度に濃縮される。栄養素の制御された添加は、培養物の増殖速度に直接影響を与え、代謝のオーバーフロー（代謝による副産物の形成）および酸素制限（嫌気生活）を回避することができる。ほとんどの場合は、増殖を制限する栄養素はグルコースであり、これは、高度に濃縮されたグルコースシロップ（例えば、６００ｇ／ｌ〜８５０ｇ／ｌ）として培養物に供給される。
【００５４】
様々なストラテジーを、流加培養プロセスにおいて増殖を制御するために使用することができる。例えば、溶存酸素張力（ＤＯＴ、ｐＯ２）、酸素摂取速度（ＯＵＲ）、グルコース濃度、乳酸塩濃度、ｐＨ、およびアンモニア濃度のいずれかを、そのパラメーターを一定に維持することによって培養物の増殖をモニターし、制御するために使用することができる。連続培養においては、栄養素が添加され、通常は、培地は、望ましくない副産物を除去して安定した状態を維持するために抽出される。適切な連続培養法は、反復バッチ培養、ケモスタット、タービドスタット、および灌流培養である。
【００５５】
例えば、ＣＨＯ細胞は、攪拌槽またはエアリフトタンクの中で培養され得る。これは、１日あたり２〜１０容量の交換の灌流速度で、そして４０％〜６０％の間、好ましくは約５０％の酸素濃度で、適切な培地で灌流される。さらに、細胞は、ケモスタット法によって、上記の好ましいｐＨ値、１０％〜６０％の間（好ましくは、約２０％）の酸素濃度、および０．２５〜１．０（好ましくは約０．５）の希釈速度Ｄを使用して培養され得る。
【００５６】
反復バッチ培養（連続継代培養としても知られている）では、細胞は培養培地中に入れられ、所望される細胞密度になるまで増殖させられる。減衰期および細胞死が始まることを避けるために、培養物は、細胞がそれらの最大濃度に達する前に完全増殖培地で希釈される。希釈の量と頻度は広く変化し、細胞株の増殖特性および培養プロセスの利便性に応じて様々である。このプロセスは必要に応じて複数回繰り返すことができ、そして細胞および培地が継代時に廃棄されない限りは、培養物の容量は希釈が行われるたびに段階的に増大する。容量の増大は、容器内で希釈できるような十分な大きさの反応器を用いることによって、または希釈された培養物をいくつかの容器に分けることによって取り扱うことができる。このタイプの培養の原理は、細胞を指数増殖の状態で維持することである。連続継代培養は、培養物の容量が常に段階的に増加し、集菌を複数回行うことができ、細胞は増殖し続け、そしてこのプロセスは所望される限り継続することができることを特徴とする。
【００５７】
ケモスタットおよびタービドスタット法においては、抽出された培地に細胞が含まれる。したがって、細胞培養容器の中に残っている細胞は一定の状態を維持するために増殖しなければならない。ケモスタット法では、増殖速度は、通常、希釈速度、すなわち、新鮮な培地が添加される速度を制御することによって制御される。細胞は、最大増殖速度未満で培養され、これは希釈速度を制限することによって行われる。増殖速度は通常は早い。対照的に、タービドスタット法では、希釈速度は、ｐＨおよび温度のような所定の操作条件で細胞が到達することができる最大増殖速度が可能となるように設定される。
【００５８】
灌流培養においては、抽出された培地は、細胞の大部分が培養容器の中に保持される（例えば、抽出培地が通過させられる膜の上に保持させることによって）ので、細胞が取り除かれる。しかし、通常は、そのような膜は細胞を１００％保持することはできず、そのため、一部は培地が抽出される際に取り出されてしまう。これは極めて早い増殖速度で灌流培養を操作するためには重要ではない。なぜなら、細胞の大部分が培養容器の中に保持されるからである。
【００５９】
連続培養（特に、反復バッチ培養、ケモスタット培養、およびタービドスタット培養）は、通常は、早い増殖速度で操作される。一般的な実施方法にしたがうと、これは、通常、最大の容量生産性を得ようとする目的で、最大増殖速度、または最大に近い増殖速度を維持するように追求される。容量生産性は、時間間隔あたりの培養物の容量あたりのタンパク質量または活性の単位で測定される。より速い細胞増殖は、１日あたりに生産される培養物の量がより多いことと考えられ、より高い容量生産性を反映すると従来から考えられている。本発明者らは、特定の実施形態では、最大の容量生産性が、細胞の最大増殖速度では得られないことを思いがけず発見した。実施例に記載されるように、フューリンを発現するＣＨＯ細胞クローンのケモスタット培養における最大増殖速度は、３６．５℃の温度で観察されたが、最大容量生産性は３５．１℃で観察された。低温でのより遅い増殖に起因して、得られた回収量が少なかったにもかかわらず、生産された組み換え体タンパク質の量は多量であり、低温の培養物は、全体として生産性がより高かった。
【００６０】
本発明の第１、第２、または第３の態様のいずれにおいても、細胞培養上清は最大増殖速度が観察される温度よりも少なくとも０．５℃、好ましくは、少なくとも１．０℃低い温度に設定される温度で維持されることが適している。この実施形態では、培養は連続培養（特に、反復バッチ培養、ケモスタット培養、またはタービドスタット培養）であることが好ましい。
【００６１】
哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞）は、一般的には、懸濁培養物として培養される。言い換えると、細胞は、固体支持体に付着させられるのではなく、培地の中に懸濁される。あるいは、細胞は、担体（特に、マイクロキャリア）の中に固定され得る。多孔性の担体（例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、またはＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標））が特に適している。
【００６２】
細胞密度は、一般的には細胞培養物の中でモニターされる。原則として、高い細胞密度が望ましいと考えられるであろう。なぜなら、細胞あたりの生産性が維持される限りは、これによって、バイオリアクターの容量あたりの高い生産性が得られるはずであるからである。しかし、細胞密度の増大は、実際には、細胞にとっては有害となり得、細胞あたりの生産性が下がる。したがって、細胞密度をモニターする必要がある。今日までのところは、哺乳動物の細胞培養プロセスにおいては、これは培養物の試料を抽出し、そして顕微鏡下で、またはＳｃｈａｅｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているＣＡＳＹ ＴＴデバイスのような細胞計数デバイスを使用してそれらを分析することによって行われている。本発明者らは、バイオリアクター自体に（または培地および懸濁された細胞がその中を通過させられ、その後、バイオリアクターに戻されるループの中に）導入された適切なプローブによって細胞密度を分析することが有効であることを、本発明において明らかにする。そのようなプローブは、Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから市販されている（例えば、Ｂｉｏｍａｓｓ Ｍｏｎｉｔｏｒ ２２０、２１０、２２０、または２３０）。培養物中の細胞は、電場の影響を受けて極めて小さいコンデンサーとして作用する。なぜなら、非伝導性の細胞膜は電荷を蓄積できるからである。得られる電気容量を測定することができる。これは細胞のタイプに依存し、そして生存している細胞の濃度に正比例する。１０ｍｍ〜２５ｍｍの直径のプローブは、バイオマスに対して無線周波磁場をかけるための２つの電極と、極性細胞の得られる電気容量を測定するための第２の一対の電極とを使用する。得られるシグナルの電気的処理により、生存している細胞の濃度の正確な測定値である出力が生じる。このシステムは、漏れがある膜、培地、気泡、および破片を含む細胞には反応しない。
【００６３】
典型的には、細胞密度は、１．０×１０６細胞／ｍｌ〜５．０×１０６細胞／ｍｌ、適しているのは１．０×１０６細胞／ｍｌ〜３．５×１０６細胞／ｍｌ、適しているのは１．４×１０６細胞／ｍｌ〜２．８×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１．６×１０６細胞／ｍｌ〜２．６×１０６細胞／ｍｌ、最も好ましくは、１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌである。好ましい範囲のより高いほうの限界に向かって細胞濃度を増大させることにより、容量生産性を改善することができる。それにもかかわらず、範囲の下端または上端としての任意の上記の点の値を含む細胞密度の範囲が想定される。
【００６４】
培養は、通常はバイオリアクターの中で行われる。バイオリアクターは、通常は、１リットルから１００００リットルの容量（例えば、５、１０、５０、１００、１０００、２５００、５０００、または８０００リットル）のステンレス鋼、硝子、またはプラスチック製の容器である。この容器は、通常は硬いが、小さい容量については特に、柔軟性のあるプラスチックバッグを使用することができる。これらは一般的には、「使い捨て」型である。
【００６５】
本発明の最初の３つの態様のいずれかの方法によって生産された異種タンパク質または組み換え体タンパク質は、好ましくは、血中タンパク質である。「血中タンパク質」には、本発明者らは、ヒトまたは動物の血液中に存在するか、または存在する可能性がある任意のタンパクを含め、これには、静脈内使用のために操作されたタンパク質が含まれる。適している血中タンパク質としては、血清アルブミン、血液凝固第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ因子、フューリン、フォン・ヴィレブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン、インターフェロン、メタロプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１３））、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ）および免疫グロブリン断片が挙げられる。適している抗体または免疫グロブリン断片としては、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８）：ＶＨおよびＶＬパートナードメインが可撓性オリゴペプチドを介して連結させられた単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３：Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，５８７９）、および単離されたＶ領域を含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４）が挙げられる。免疫グロブリンおよびそれらの断片は「ヒト化」することができる。言い換えると、齧歯類起源の可変ドメインを、ヒト起源の定常ドメインに融合させることができる。その結果、得られる抗体は、齧歯類のもとの抗体の抗原特異性を保持する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１−６８５５）。
【００６６】
好ましい実施形態では、細胞培養は、状況に応じてフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）とともに第ＶＩＩＩ因子を生産させるために使用される。ｖＷＦは培養培地に対して別に加えることができ、これは好ましくは、組み換え体である。あるいは、ｖＷＦは、培養物中にｖＷＦを分泌する細胞、ならびにＦＶＩＩＩを分泌する細胞を含めることによって同時に生産させることができる。しかし、好ましくは、ＦＶＩＩＩとｖＷＦとが同時に発現させられる、すなわち、それぞれの細胞がＦＶＩＩＩとｖＷＦとの両方を分泌する。組み換え体であるｖＷＦは、Ｓｃｈｌｏｋａｔら（１９９５），「Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ」，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７８，１１６０または米国特許第６，１１４，１４６号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に記載されているようにして得ることができる。後者の特許にはまた、ＦＶＩＩＩを分泌する細胞を用いてｖＷＦを同時に生産させるために使用することができる細胞も開示されている。両方のタンパク質を同時に発現する細胞は、米国特許第５，２５０，４２１号（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびＫａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，１２３３−１２４２に開示されている。
【００６７】
用語第ＶＩＩＩ因子は、凝固第ＶＩＩＩ因子活性を有している任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体を言うように本明細書中で使用される。活性化された第ＶＩＩＩ因子は、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下での活性化された第ＩＸａ因子による第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換において補因子として機能する。便宜上、活性な第ＶＩＩＩ因子の量は、適切なアッセイにおいて第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換を促進する程度から推定することができる。典型的なアッセイにおいては、第Ｘａ因子は、特定の発色性基質を加水分解し、それによって発色団を遊離させる。発色団の量が分光光度法で決定される。市販されているアッセイキットとしては、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ａｓｓａｙキット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；米国特許第６，１００，０５０号）；およびＣｏａｔｅｓｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。ヒトにおける第ＶＩＩＩ因子の濃度は、１ＩＵ／ｍＬ血液として定義される。Ｃｏａｔｅｓｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩキットでは、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌ血液に相当するＦＶＩＩＩ活性を決定することができる。上記で定義されたように第ＶＩＩＩ因子として考えると、ポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、天然の第ＶＩＩＩ因子と同じナノモル濃度で血中に存在する場合に、その活性をＣｏａｔｅｓｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩアッセイによって決定できるように、天然の第ＶＩＩＩ因子の活性の少なくとも１％を有していなければならない。
【００６８】
本発明の方法による生産に適しているＦＶＩＩＩは、天然の全長ＦＶＩＩＩである。ブタＦＶＩＩＩを本発明にしたがって生産することができるが、ＦＶＩＩＩは、ヒトのものであることがより好ましい。天然のＦＶＩＩＩの代わりとして、変異体およびアナログを生産することができる。多くのもの（例えば、変異体および欠失誘導体は、米国特許第５，４２２，２６０号、同第４，７４９，７８０号、同第４，８６８，１１２号、同第４，８７７，６１４号、および同第５，１７１，８４４号に記載されている変異体および欠失誘導体）が当該分野で公知である。用語「組み換え体である第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体」は、１つ以上のアミノ酸を欠失させることによって全長の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドから誘導された、第ＶＩＩＩ因子活性を有している１つ以上のポリペプチド鎖として定義される。好ましくは、上記欠失誘導体は、Ｂドメインのほとんどを欠いているが、一次翻訳産物の２つのポリペプチド鎖へのインビボでのタンパク質分解（によるプロセシング）に不可欠なＢドメインのアミノ末端配列とカルボキシ末端配列の部分は保持する。そのような第ＶＩＩＩ因子欠失誘導体の産物は「ｒ−ＶＩＩＩ ＳＱ」として同定されており、ＷＯ９１／０９１２２に記載されている。用語「ｒ−ＶＩＩＩ ＳＱ」は、全長の第ＶＩＩＩ因子から誘導された、アミノ酸７４３から１６３６を欠失しているポリペプチド鎖として同定されている。Ｂドメイン全体またはその一部を欠いているさらなるＦＶＩＩＩ変異体は、米国特許第６，３５８，７０３号に記載されている。
【００６９】
ＣＨＯ細胞および２９３Ｓ細胞を形質転換するために適しているベクターは、米国特許第５，８５４，０２１号に開示されている。ＦＶＩＩＩを発現するＢＨＫ細胞は、Ｗｏｏｄら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，３３０−３３７に開示されているように調製することができ、また、培養物ＣＲＬ−８５４４としてＡＴＣＣから入手することもできる。ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失変異体を発現するＣＨＯ細胞は、Ｌｉｎｄら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２，１９−２７、および米国特許第５，６６１，００８号に記載されている。３種類のそのような細胞のタイプが、ＤＳＭ ６４１５、ＤＳＭ ６４１７、およびＤＳＭ ６４１６としてＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている。
【００７０】
ＦＶＩＩＩとｖＷＦとが同時に生産される場合は、それらの複合体を培地を遠心分離することによって精製して細胞を取り除くことができ、その後、得られる液体は、複合体の解離を生じないであろう条件下で、ＦＶＩＩＩまたはｖＷＦのいずれかに対する抗体、あるいはＦＶＩＩＩまたはｖＷＦに特異的に結合するペプチドを含む固定化された固体支持体にさらされる。適切な方法は、米国特許第６，３０７，０３２号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）および米国特許第５，２００，５１０号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に教示されている。
【００７１】
ＦＶＩＩＩ（状況によってはｖＷＦとの複合体である）を、その後、公知の方法で処方し、使用することができる。例えば、動物性のタンパク質を含まない培養物中で生産されたＦＶＩＩＩは、好ましくは、例えば、米国特許第６，５８６，５７３号（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＷＯ９４／０７５１０、または米国特許第６，５９９，７２４号に開示されているように、タンパク質を含まない組成物の中に処方され、そして血友病Ａ患者を処置するために使用される。
【００７２】
本発明の方法がＦＶＩＩＩを生産するために使用される場合は、細胞培養上清が、３６±０．９℃、好ましくは、３６±０．５℃、より好ましくは３６±０．２℃、そして最も好ましくは３６℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．２０±０．０５、好ましくは７．２０±０．０３、より好ましくは７．２０±０．０１、最も好ましくは、７．２０に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【００７３】
実施例に示されるように、本発明がＦＶＩＩＩを生産するために使用される場合には、細胞培養上清中に銅を含めることが有効である。典型的には、細胞は、４ｐｐｂのＣｕ２＋を含む細胞培養上清中で培養される。細胞培養上清中でのＣｕ２＋の濃度は、少なくとも５ｐｐｂであり、好ましくは少なくとも７ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１５ｐｐｂ、または２５ｐｐｂであることが有利である。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、細胞培養はＡＤＡＭＴＳ−１３を生産するために使用される。
【００７５】
ＡＤＡＭＴＳ−１３はフォン・ヴィレブランド因子を切断するプロテアーゼ（ＶＷＦ−ｃｐ）としても知られており、メタロプロテアーゼファミリーのメンバーである。これは、ＶＷＦの残基Ｔｙｒ−８４２とＭｅｔ−８４３との間のペプチド結合を切断することによって、大きなＶＷＦ多量体をより小さな形態になるように代謝する能力を有している。このメタロプロテアーゼは、Ｃａ２ ／Ｂａ２によって活性化され、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼの阻害剤によっては阻害されない。欠失型のフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の分解は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）と関係がある。遺伝性のＴＴＰにおいては、ＡＤＡＭＴＳ−１３は存在しないかまたは機能的に異常であるが、ＴＴＰの家族性ではない後天性の形態においては、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を阻害する自己抗体がほとんどの患者において一次的に見られる。
【００７６】
ヒトＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子のクローニングと発現は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、２００２，Ｂｌｏｏｄ．１５；１００（１０）：３６２６−３２に記載されている。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子のクローニングと発現は、ｃＤＮＡの完全な配列とともに、ＵＳ２００５／０２６６５２８ Ａ１（Ｌａｅｍｍｌｅら）にも開示されている。本発明の方法による生産に適しているＡＤＡＭＴＳ−１３は、天然の全長ＡＤＡＭＴＳ−１３、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ−１３である。天然のＦＶＩＩＩの代わりとして、変異体およびアナログを生産することができる。
【００７７】
用語ＡＤＡＭＴＳ−１３は、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性（特に、ＶＷＦの残基Ｔｙｒ−８４２とＭｅｔ−８４３との間のペプチド結合を切断する能力）を持つ任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体をいうように、本明細書中で使用される。便宜上、活性のあるＡＤＡＭＴＳ−１３の量は、機能性アッセイ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１３の基質として修飾されたフォン・ヴィレブランド因子ペプチドを使用する機能性アッセイ）によって決定することができる（Ｔｒｉｐｏｄｉら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８年９月；６（９）：１５３４−４１）。ｒ−ｈｕ ＡＤＡＭＴＳ１３活性を決定する好ましい方法は、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎら：Ａｓｓａｙ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｖＷＦ：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ（ＴＴＰ）．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９９；８２：１３８６−１３８９に開示されている。このアッセイでは、１Ｕは、プールされた正常なヒト血漿中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性のレベルに相当する。上記で定義されたようなＡＤＡＭＴＳ−１３として考えると、ポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、天然のＡＤＡＭＴＳ−１３の活性の少なくとも１％を有していなければならない。ＡＤＡＭＴＳ−１３の量もまた、ＡＤＡＭＴＳ−１３抗原の測定によって、例えば、Ｒｉｅｇｅｒら、２００６，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００６ ９５（２）：２１２−２０に開示されているＥＬＩＳＡ法を使用して決定することができる。
【００７８】
タンパク質分解活性がある組み換え体ＡＤＡＭＴＳ−１３は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、２００２（前出）およびＵＳ２００５／０２６６５２８ Ａ１に記載されているように、哺乳動物細胞培養物中での発現によって調製することができる。ＡＤＡＭＴＳ−１３を発現する細胞の組み換え培養の方法は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ Ｂ，Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ Ｆ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４年１月；４１（１）：２４−３３に開示されている。ＡＤＡＭＴＳ−１３の発現に好ましい細胞のタイプとしては、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００７９】
ＵＳ２００５／０２６６５２８ Ａ１およびＺｈｅｎｇら、２００１，Ｂｌｏｏｄ，９８：１６６２−１６６６には、ＡＤＡＭＴＳ−１３を精製する方法が開示されている。精製されたＡＤＡＭＴＳ−１３は、従来の方法にしたがって処方することができ、例えば、ＴＴＰを処置するために治療的に使用される。
【００８０】
本発明の方法がＡＤＡＭＴＳ−１３を生産するために使用される場合は、細胞培養上清が、３６．０±０．９℃、好ましくは、３６．０±０．５℃、より好ましくは３６．０±０．２℃、そして最も好ましくは３６．０℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．１５±０．０５、好ましくは７．１５±０．０３、より好ましくは７．１５±０．０１、最も好ましくは、７．１５に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【００８１】
代わりの好ましい実施形態においては、細胞培養はフューリンを生産するために使用される。
【００８２】
フューリンはＰＡＣＥ（対合した塩基性アミノ酸を切断する酵素（ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ））とも呼ばれ、スブチリシン様セリンプロテアーゼのグループに属する。これは、プロタンパク質の切断（特に、分泌合成（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）において）重要な役割を担っている（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．，４：１１５−１３６，１９９３）。これは、いくつかのドメイン（すなわち、シグナルペプチド、プロペプチド、触媒ドメイン、ホモ−ＢまたはＰ−ドメイン、Ｃ末端に配置されたシステインリッチドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テール）に構造的に配置されたカルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼである。プロテアーゼ切断部位には、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを特徴とする認識配列が含まれる。プロテアーゼであるフューリンは、このコンセンサス配列の後ろで、プロタンパク質を特異的に切断する（Ｈｏｓａｋａら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０）。
【００８３】
完全なフューリンはＧｏｌｇｉ装置の膜システムの中に取り込まれ、ここで機能的に活性となる（Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；１１１：２８５１−９）。小胞体からゴルジ画分へと新しく合成されたフューリン前駆体が移動すると、プロペプチドは、２工程のプロセシング事象において自己触媒によって除去される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９７；１６：１５０８−１８）。フューリンはまた、ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉネットワークと細胞表面との間をエンドソーム小胞を介して循環し、それによって、恒常的な分泌経路を通じるそれらの輸送の間に両方の前駆体タンパク質をプロセシングし、分子はエンドサイトーシス経路に入る。プロセシング区画へのフューリンの細胞性の分配は、その細胞質テールの中での定義された構造的特徴によって示される（Ｔｅｕｃｈｅｒｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：８１９９−０７）。
【００８４】
天然のフューリンプロテアーゼの過剰発現は、連続して増殖させられる細胞培養物の増殖にネガティブな影響を与えるので、溶液は、細胞に対するフューリンの毒性の影響を減らすように考えられている。Ｃ末端ドメインは、フューリンの機能的活性には不必要であることが明らかにされており、そして７５〜８０ｋＤの過剰発現された天然のフューリンの短縮型は、分泌型のタンパク質として細胞上清中で検出することができる（Ｗｉｓｅら、ＰＮＡＳ．１９９０；８７：９３７８−８２）。この自然界において分泌される短縮型のフューリンは「シェッドフューリン」としてもしられており（Ｖｉｄｒｉｃａｉｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．１９９３；１９５：１０１１−８；Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００１；３５４：６８９−９５）、膜貫通部分のＮ末端で切断されている（Ｖｅｙら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；１２７：１８２９−４２）。
【００８５】
遺伝子操作によって短縮型となったフューリンタンパク質（膜貫通ドメインと細胞質ドメインのコード部分が欠失させられている）は、例えば、アミノ酸Δ７１４−７９４について（Ｌｅｄｕｃら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１４３０４−８；Ｍｏｌｌｏｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１６３９６−４０２）、およびアミノ酸Δ７１６−７９４について（「Ｓｏｌ−ＰＡＣＥ」，Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８４５８−６５；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｂｌｏｏｄ．１９９２；７９：２３４９−５５）、およびアミノ酸Δ７０５−７９４について（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１６０９４−９）記載されている。システインリッチ領域の欠失をさらに含むフューリン突然変異体もまた記載されている（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２；１０１：２９６−３０１；Ｃｒｅｅｍｅｒｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１８２６−３４）。
【００８６】
ＷＯ２００８／１４１８２４（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）には、アミノ酸５７８〜７９４が欠失している（すなわち、Δ５７８−７９４）短縮型のヒトフューリンが開示されている。
【００８７】
用語「フューリン」は、フューリンのタンパク質分解活性を持つ任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体をいうように本明細書中で使用される。
【００８８】
フューリン、短縮型フューリン、またはフューリン誘導体のタンパク質分解活性の評価は、任意の適切な試験によって、例えば、フューリンがそれに対して特異的である２塩基の切断部位を含む蛍光発生基質を使用することによって行うことができる（Ｓｃｈｌｏｋａｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６；２４：２５７−６７）。上記のアッセイが用いられる場合は、１単位は、３０℃で１分間のうちに、蛍光発生基質であるＢｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ から１ｐｍｏｌの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を遊離させるであろうフューリンの量として定義される。この試験についての定量限界は、典型的には０．６２５Ｕ／ｍＬである。あるいは、タンパク質分解活性は、フューリンをプロタンパク質（例えば、ｐｒｏ−ｒｖＷＦ）とともに十分な時間インキュベートすることによっても測定することができる。プロ−ｒｖＷＦのプロセシングの程度は、例えば、ウェスタンブロッティングによって分析することができる。フューリン抗原の量はＥＬＩＳＡ試験によって測定することができる。適しているＥＬＩＳＡ試験は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ（カタログ番号ＤＹ１５０３）から入手することができるヒトフューリンＤｕｏＳｅｔであり、ここでは、マウス抗ヒトフューリンが捕捉抗体として使用され、ビオチニル化ヤギ抗ヒトフューリンが検出抗体として使用される。
【００８９】
本発明の方法による生産に適しているフューリンは、天然の全長フューリン、好ましくはヒトフューリンである。天然のフューリンの代わりとして、上記のものを含む変異体およびアナログを生産することができる。
【００９０】
哺乳動物細胞（特に、ＣＨＯ細胞）を、フューリンまたはフューリンの変異体で形質転換するために適しているベクターは、そのように生産されたフューリンを精製するための方法とともに、ＷＯ２００８／１４１８２４（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に記載されている。ＷＯ９１／０６３１４（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）には、フューリン発現ベクター、哺乳動物細胞（特に、ＣＯＳ−１細胞）中でフューリンを発現させる方法、および組み換えによって生産されたフューリンの精製が記載されている。ＷＯ９２／０９６９８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）には、ＣＨＯ細胞中での単独で、またはｖＷＦもしくは第ＩＸ因子と組み合わせてのいずれかでのフューリンの発現が記載されている。
【００９１】
プロ−ｒＶＷＦは、多くの細胞タイプの中で比較的低レベルで発現される内因的に生産されたフューリンによって、細胞培養の間にその成熟形態へとプロセシングされる（Ｗｉｓｅら、１９９０，ＰＮＡＳ ８７：９３７８−９３８２）。プロ−ｒＶＷＦのプロセシングは、異種フューリンをプロ−ｒＶＷＦと同時に発現させることによってより効率的に行わせることができる。あるいは、ＷＯ２００８／１４１８２４は、精製されたフューリンがｒＶＷＦのプロセシングを促進するための試薬としての使用に適している可能性があることを示唆している。
【００９２】
本発明の方法がフューリンを生産するために使用される場合は、細胞培養上清が、３５．１±０．９℃、好ましくは、３５．１±０．５℃、より好ましくは３５．１±０．２℃．そして最も好ましくは３５．１℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．１５±０．０５、好ましくは７．１５±０．０３、より好ましくは７．１５±０．０１，最も好ましくは、７．１５に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、細胞培養は、第ＶＩＩ因子を生産するために使用される。
【００９４】
「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」には、野生型の第ＶＩＩ因子（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有しているポリペプチド）、ならびに野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に同じであるかまたは改善された生物学的活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体、および野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に改変されたかまたは低い生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体が含まれる。用語「第ＶＩＩ因子」は、それらの切断されていない（酵素前駆体）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、ならびにそれらのそれぞれの生体活性形態が生じるようにタンパク質分解によってプロセシングされているものが含まれるように意図される（これらも第ＶＩＩａ因子と呼ぶことができる）。典型的には、第ＶＩＩ因子は、残基１５２と１５３との間で切断されて第ＶｉＩａ因子を生じる。用語「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」にはまた、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性が野生型第ＶＩＩａ因子の活性と比較して実質的に改変されているかまたはいくらか低下している変異体を含むポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、その中に、そのポリペプチドの生体活性を改変するかまたは破壊するように特定のアミノ酸配列の変更が導入されている第ＶＩＩ因子あるいは第ＶＩＩａ因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
血液の凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合するその能力、および（ｉｉ）第ＩＸ因子または第Ｘ因子のタンパク分解的切断を触媒して、活性化された第ＩＸ因子または第Ｘ因子（それぞれ、第ＩＸａ因子または第Ｘａ因子）を生じるその能力に由来する。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性（「第ＶＩＩ因子の生物学的活性」）は、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号またはＷＯ９２／１５６８６に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠損血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液の凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量され得る。このアッセイでは、生物学的活性は、対照試料と比較した凝固時間の短縮として表され、１単位／ｍＬの第ＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準物との比較によって「第ＶＩＩ因子単位」に変換される。あるいは、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）脂質膜の中に包埋されたＴＦと第Ｘ因子とを含む系の中で活性化させられた第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生産する第ＶＩＩａ因子（または第ＶＩＩ因子ポリペプチド）の能力を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水性の系の中での第Ｘ因子の加水分解を測定すること；（ｉｉｉ）第ＶＩＩａ因子（または第ＶＩＩ因子ポリペプチド）のＴＦに対する物理的結合を、表面プラスモン共鳴に基づいて機器を使用して測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４１３：３５９−３６３，１９９７）；（ｉｖ）第ＶＩＩａ因子（または第ＶＩＩ因子ポリペプチド）による合成の基質のインビトロでの加水分解を測定すること；あるいは、（ｖ）インビトロ系の中でＴＦ依存性のトロンビンの生成を測定することによって定量され得る。あるいは、ＦＶＩＩ抗原はＥＬＩＳＡによって決定され得る。適しているＥＬＩＳＡは、Ａｓｓａｙ Ｐｒｏ（Ｓｔ Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｍｏ．）カタログ番号ＥＦ１００７−１から入手することができるＡｓｓａｙＭａｘ Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔである。これは、捕捉抗体としてモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩを、そして検出抗体としてビオチニル化ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩを使用する。
【００９６】
天然の（野生型）第ＶＩＩａ因子および／または第ＶＩＩａ因子の変異体についての好ましいインビトロでのタンパク質分解アッセイは、ＵＳ２００７／０２１９１３５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ａ／Ｇ）に記載されているように、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の中で行われる。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む１００μＬの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中の第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）と第Ｘ因子（０．８μＭ）は、１５分間インキュベートされる。その後、第Ｘ因子の切断が、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０μＬの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の添加によって停止させられる。生成された第Ｘａ因子の量は、発色性基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）（最終濃度０．５ｍＭ）の添加によって測定される。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）３４０プレートの中で継続的に測定される。１０分間で生じた吸光度が、ＦＶＩＩａを含まないブランクのウェル中での吸光度の減算の後、変異体第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性と野生型第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性との比を計算するために使用され得る：
比＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子の変異体）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。
【００９７】
このアッセイのバリエーションにおいては、ＦＶＩＩが決定される。トロンボプラスチンが含められる。試料中のＦＶＩＩはＣａ２＋イオンおよび組織因子と複合体を形成し、これは少量のＦＸａを生じる。ＦＸａはＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化させる。
【００９８】
市販されているＦＶＩＩ活性アッセイは、Ａｎｉａｒａ（Ｍａｓｏｎ，ＯＨ）カタログ番号ＡＣＫ０８１Ｋから入手することができるＨＥＭＯＣＬＯＴ ＦＶＩＩ試薬キットである。ここでは、カルシウムトロンボプラスチンによって誘発された凝固が測定される。
【００９９】
野生型第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じであるか改善された生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体には、上記に記載されたような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイのうちの１つ以上において試験された場合に、同じ細胞のタイプの中で生産される第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％を示す変異体が含まれる。野生型第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に低い生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体は、上記に記載されたような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイのうちの１つ以上において試験された場合に、同じ細胞のタイプの中で生産された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、そして最も好ましくは約１％未満を示す変異体である。野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に改変された生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体としては、ＴＦ依存性の第Ｘ因子タンパク質分解活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体、およびＴＦに結合するが第Ｘ因子は切断しない第ＶＩＩ因子の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。第ＶＩＩ因子の変異体には、野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じまたはそれよりも優れた生体活性を示すかどうか、あるいは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に改変されたかまたは低い生体活性を示すかにはかかわらず、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じ生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体の限定ではない例としては、以下が挙げられる：Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｌｉｎｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１８２−１９２，１９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような、高いタンパク質分解安定性を示す第ＶｉＩａ因子の変異体；残基２９０と２９１との間または残基３１５と３１６との間がタンパク質分解的に切断されている第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：５０１−５０５，１９９５）；酸化型の第ＶＩＩａ因子（Ｋｏｒｎｆｅｌｔら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６３：４３−５４，１９９９）；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９に開示されているような第ＶＩＩ因子の変異体；およびＷＯ０２／３８１６２（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されているような高いタンパク質分解安定性を示す第ＶＩＩ因子の変異体；ＷＯ９９／２０７６７（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）に開示されているような、改変されたＧｌａドメインを有しており、高い膜結合を示す第ＶＩＩ因子の変異体；およびＷＯ０１／５８９３５（Ｍａｘｙｇｅｎ ＡｐＳ）に開示されているような第ＶＩＩ因子の変異体。
【０１０１】
野生型第ＶＩＩａ因子と比較して高い生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体の限定ではない例としては、以下が挙げられる：ＷＯ０１／８３７２５、ＷＯ０２／２２７７６、ＷＯ０２／０７７２１８、ＷＯ０３／２７１４７、ＷＯ０３／３７９３２；ＷＯ０２／３８１６２（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されているような第ＶＩＩ因子の変異体；およびＪＰ２００１０６１４７９（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓ Ｉｎｓｔ．）に開示されているような高い活性を持つ第ＶＩＩａ因子の変異体。野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に低いかまたは改変された生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体の限定ではない例としては、以下が挙げられる：ＲＩ ５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄ−ｇｏｏｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６６−７２，１９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：５１５−５２０，１９９８）、およびＧｌａドメインを欠いている第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３１７：２４５−２４９，１９９３）。
【０１０２】
ＦＶＩＩの生産後、ポリペプチドは培地から精製され得る。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの精製には、例えば、抗第ＶＩＩ因子抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１０９７，１９８６；およびＴｈｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７７８５，１９８８を参照のこと）、および第ＸＩＩａ因子またはトリプシン様特異性を有している他のプロテアーゼ（例えば、第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、およびトロンビン）を使用するタンパク質分解的切断による活性化が含まれる。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ，米国特許第４，４５６，５９１号；およびＨｅｄｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６（１９８３）を参照のこと。あるいは、第ＶＩＩ因子は、これをイオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｍｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など）に通すことによって活性化され得る。
【０１０３】
第ＶＩＩ因子または活性化された第ＶＩＩ因子は、公知の方法で処方され、使用され得る。例えば、血友病において出血の処置に使用され得る。
【０１０４】
本発明の方法が第ＶＩＩ因子を生産するために使用される場合は、細胞培養上清が３６．５±０．９℃、好ましくは、３６．５±０．５℃、より好ましくは３６．５±０．２℃．そして最も好ましくは３６．５℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．２０±０．０５、好ましくは７．２０±０．０３、より好ましくは７．２９±０．０１、最も好ましくは、７．２９に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【０１０５】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらには決して限定されない。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）
基本的な細胞培養
ＦＶＩＩＩの生産
典型的な培養物は、Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１２３３−１２４２および米国特許第５，２５０，４２１号に記載されている、第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィレブランド因子とを同時に発現するように形質転換された１０Ａ１Ｃ６ ＣＨＯ細胞株のサブクローンを使用して、バイオリアクターの中で確立される。特定のサブクローンを、動物に由来する生成物を含まない標準的な培地への適応と、マイクロプレートの中でのサブクローニングによって得た。
【０１０７】
標準的な培養培地は以下のとおりである：
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ５０／５０ １１．７６ｇ／ｋｇ
これには以下を添加した：
Ｌ−グルタミン ０．６ｇ／ｋｇ
エタノールアミン １．５３ｍｇ／ｋｇ
Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８ ０．２５ｇ／ｋｇ
ＮａＨＣＯ３ ２ｇ／ｋｇ
大豆ペプトン ４ｇ／ｋｇ
ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ １７．０２ｍｇ／ｋｇ 。
【０１０８】
基本のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ５０／５０培地には、４．３ｐｐｂのＣｕ２＋を完全培地に含めるために十分な１．３ｍｇ／ｋｇのＣｕ２＋が含まれる。
【０１０９】
ＡＤＡＭＴＳ−１３の生産
ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を、ＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子を導入するためにリン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。細胞をネオマイシン選択条件下で培養し、メトトレキセートとＧ４１８での処理の後で選択した。無血清への適応後、細胞をサブクローニングし、サブクローン６４０−２を生産用クローン（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｅ）として選択した。
【０１１０】
標準的な培養培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されている培地をベースとする、血清を含まない、インシュリンを含まない、オリゴペプチドを含まない培地である。
【０１１１】
フューリンの生産
ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を、フューリン遺伝子を導入するために、リン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。細胞を、ヒポキサンチン、チミジン、およびグリシンを含まないＤＨＦＲ培地で選択した。生産用クローン４８８−３は、サブクローニングと１００ｎＭのメトトレキセートを含む培地中での選択によって同定し、その後、無血清に適応させた。
【０１１２】
標準的な培養培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されている培地をベースとする、血清を含まない、インシュリンを含まない、オリゴペプチドを含まない培地である。
【０１１３】
ＦＶＩＩの生産
ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を、ＦＶＩＩとＶＫＯＲＣ（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体）を同時発現することができる２シストロン性のベクターでトランスフェクトした。遺伝子発現はＣＭＶプロモーターによって駆動され、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）はＦＶＩＩ遺伝子とＶＫＯＲＣ遺伝子との間に配置されている。細胞を、リン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。選択培地には、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含めた。細胞を無血清条件下でサブクローニングし、高発現サブクローン１Ｅ９を生産用クローンとして選択した。１Ｅ９を、連続培養条件下での増殖、生産性、および安定性に関して有利な特性を有しているとして選択した。安定性は、ケモスタット様式で２ヶ月間評価した。
【０１１４】
標準的な培養培地は、米国特許第６，９３６，４４１号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に開示されている培養培地をベースとし、特に、２．５ｇ／Ｌのダイズペプトンと５ｍｇ／Ｌのインシュリン（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ（登録商標）；Ｅｌｉ ＬｉｌｌｙまたはＮｏｖｏｌｉｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）とを含めた。
【０１１５】
ＦＶＩＩＩの生産に使用した標準的なプロセス
５Ｌの連続培養
培地を、３７℃でＣＯ２インキュベーター（５％〜１５％のＣＯ２）の中で数時間、予め馴化させた。培養物を確立させるために、少なくとも１つの１ｍｌのバイアル（１０７個のＣＨＯ細胞／ｍｌ）を解凍し、細胞を、Ｒｏｕｘフラスコ（２００ｍｌ）中の６０ｍｌの予め馴化させた培地の中に希釈し、そして３７℃でＣＯ２インキュベーター中で培養した。約３日後、６０ｍｌの培養物を、１つのローラーボトル（１．８Ｌ）中の１４０ｍｌの新鮮な培地に添加した。このローラーボトルに１５％のＣＯ２をスパージングし、回転させながら３７℃で培養した。２日後、細胞を１／３に分け、２つのローラーボトルの中で新鮮な培地の中で培養した（２００ｍｌの培地＋１００ｍｌの培養物＝１つのローラーボトルあたり３００ｍｌ）。さらに２日または３日後、細胞を再び１／３に分け、全部で６個のローラーボトルの中で上記のように新鮮な培地の中で培養した。およそ１×１０６細胞／ｍｌの必要な細胞密度に達したら、１８００ｍｌの接種材料を、上記のように予め馴化させた３．２Ｌの培地に接種し、５Ｌのバイオリアクターの中で培養した。標準的な条件下で、５Ｌのバイオリアクターを、ｐＨ７．２、１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度、および３７℃の温度で操作した。標準的な条件下で、培養物に、１０μｍの気泡の大きさを有しているＯ２を、０．２５ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）でスパージングした。
【０１１６】
４０Ｌのバイオリアクター中での接種材料の構築
接種材料のプールは、原則として５Ｌの連続培養に関して上記に記載したように得た。しかし、このプールはおよそ５Ｌであり、６個のローラーボトルからではなく１８個のローラーボトルから得た。ＢＲ−４０バイオリアクターを洗浄し、操作前に滅菌し、そしておよそ８Ｌの培地を、接種前にＢＲ−４０に移した。およそ５Ｌの接種物のプールを、プールタンクからバイオリアクターに、移送ラインを介して、およそ１３Ｌの全培養容量に達するまで移した。細胞密度が≧９×１０５細胞／ｍＬに達したら、培養物を培地で希釈した（１：３）。さらに１〜３日の後、細胞濃度は再び≧９×１０５細胞／ｍＬに達し、３２０Ｌのバイオリアクターへの接種材料の移送を行った。
【０１１７】
３２０Ｌのバイオリアクターの中での増殖
ＢＲ−３２０バイオリアクターを洗浄し、操作前に滅菌し、そしておよそ８０Ｌの培地を、接種の前にＢＲ−３２０に移した。およそ４０Ｌの接種材料を、ＢＲ−４０バイオリアクターからＢＲ−３２０バイオリアクターに、移送ラインを介して、およそ１２０Ｌの最初の培養容量に達するまで移した。細胞密度が≧９×１０５細胞／ｍＬに達したら、培養物を培地で希釈した（１：３）。（全部で）３〜６日の後、細胞濃度は再び≧９×１０５細胞／ｍＬに達し、２５００Ｌのバイオリアクターへの接種材料の移送を行った。
【０１１８】
２５００Ｌのバイオリアクター
構築
およそ３２０Ｌの接種材料を、ＢＲ−３２０からすでにおよそ６３０Ｌの培地を含むＢＲ１バイオリアクターに、移送ラインを介して、およそ９５０Ｌの最初の培養容量に達するまで移した。細胞密度が≧９×１０５細胞／ｍＬに達したら、培養物を、およそ２５００Ｌの最終容量となるように培地で希釈した（〜１：３）。（全部で）４〜７日の後、細胞濃度は再び≧９×１０５細胞／ｍＬに達し、およそ１１５０Ｌの接種材料を、ＢＲ１からおよそ１３５０Ｌの培地を含むＢＲ２バイオリアクターに移した。移送後、およそ１１５０Ｌの培地を、バイオリアクターＢＲ１に、およそ２５００Ｌの最終培養容量に達するまで添加した。
【０１１９】
ケモスタット
「ケモスタット」培養様式は、それぞれのバイオリアクター中での細胞濃度が≧１．２×１０６細胞／ｍＬに達するとすぐに開始した。１日あたりおよそ１２５０Ｌの培地を、それぞれのバイオリアクターに対して連続様式で添加した。細胞濃度は、個々の２５００Ｌのバイオリアクター中で９×１０５細胞／ｍＬ〜１．６×１０６細胞／ｍＬの間とした。およそ１２５０Ｌ／日／バイオリアクターの複数の回収物を、滅菌バッグの中で２℃〜８℃で保存した。培養は、ケモスタット様式で約５０日〜５７日間維持した。標準的な条件下では、ｐＨは７．２に設定し、温度は３７℃に設定し、そして培養物には、１０μｍの気泡の大きさを有しているＯ２を、０．０２ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）をスパージングした。
【０１２０】
同様の培養方法を、ＡＤＡＭＴＳ−１３、フューリン、またはＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞の培養にも適用することができる。
【０１２１】
（実施例２）
ＦＶＩＩＩの生産性に対する様々なパラメーターの変更の影響
実施例１に記載したＦＶＩＩＩとｖＷＦとを発現するＣＨＯ細胞クローンのＦＶＩＩＩ生産性を、様々な培養条件下で決定した。
【０１２２】
別の実験では、ｐＨ、細胞密度、および温度を、５Ｌの規模の連続培養において変化させた。それぞれの場合において、ｐＨ７．１、１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度、および３７℃の対照実験を使用した。
【０１２３】
細胞密度を増大させると、ＦＶＩＩＩの容量生産性（１日あたりの１リットルあたりのＩＵ）は、１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度についての値と比較して、以下のように増大した：
【０１２４】
【表１】
したがって、生産性の実質的な増大は、細胞密度を増大させることによって得ることができた。これは予想できなかった。なぜなら、細胞密度の増大によっては細胞あたりの生産性が低下する可能性があるからである。さらに、特定の細胞密度では、生産性の増大が、細胞密度の増大よりも大きいことが明らかになった。これはさらに驚くべきことであった。
【０１２５】
ｐＨを、スパージングパラメーターを変化させることによって７．２に挙げた。ｐＨ７．１の対照容器の中では、培養物に、１０μｍの気泡の大きさを有しているＯ２を、０．２５ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）でスパージングした。ｐＨ７．２の試験容器の中では、培養物に、１０μｍの気泡の大きさを有している空気を、１．２５ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりの空気の容量）をスパージングした。ｐＨを７．１から７．２に上げることにより、生産性を約１６％増大させることができた。
【０１２６】
温度を３７℃から３６℃に下げることによっては、生産性は約２２％増大した。
【０１２７】
（実施例３）
ＦＶＩＩＩの生産性に対する細胞密度と銅濃度の影響
実施例１に記載したＦＶＩＩＩとｖＷＦとを発現するＣＨＯ細胞クローンのＦＶＩＩＩの生産性を、様々な培養条件下で決定した。
【０１２８】
対照培養物は、ｐＨ７．１、３７℃、４ｐｐｂのＣｕ２＋、および１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で操作した。
【０１２９】
比較用の培養物は、ｐＨ７．２、および３６℃で操作した。１つの培養物の中では、細胞密度を１．６×１０６細胞／ｍｌに増大させ、そして別の培養物の中では、２．０×１０６細胞／ｍｌに増大させた。第３の培養物では、細胞密度は２．０×１０６細胞／ｍｌとし、銅濃度を４ｐｐｂから６ｐｐｂに増大させた。
【０１３０】
結果：温度を下げ、ｐＨを上げ、そして細胞密度を１．６×１０６細胞／ｍｌに増大（１４％の増大）させることにより、ＦＶＩＩＩの生産性は４１％〜５０％高くなった。細胞密度を２．０×１０６細胞／ｍｌ（４３％）にさらに増大させると、生産性は（対照培養物と比較して）３９％〜７７％増大した。２．０×１０６細胞／ｍｌの培養物中の銅を６ｐｐｂに増大させると、生産性は（対照培養物と比較して）４８％〜９８％増大した。
【０１３１】
したがって、ｐＨをわずかに上げ、温度をわずかに上げ、細胞密度をわずか４３％増大させ、そして銅濃度を５０％増大させることにより、ＦＶＩＩＩの生産性をほぼ２倍にすることができる。
【０１３２】
（実施例４）
ｖＷＦの生産性に対する細胞密度と銅濃度の影響
実施例３を繰り返したが、ｖＷＦの容量生産性を測定した。１．６×１０６細胞／ｍｌおよび４ｐｐｂの銅（３６℃、ｐＨ７．２）では、生産性は対照の１２４％であった。２．０×１０６細胞／ｍｌおよび６ｐｐｂの銅では、生産性は１８２％であった。
【０１３３】
したがって、重ねて、生産性の実質的な増大は、このプロセスのパラメーターを一見小さく変化させることによって得ることができる。
【０１３４】
（実施例５）
細胞密度、ｐＨ、およびｄＣＯ２の影響
実施例１に記載したＦＶＩＩＩとｖＷＦとを発現するＣＨＯ細胞クローンのＦＶＩＩＩの生産性を、様々な培養条件下で決定した。
【０１３５】
この実験では、細胞密度を１．４１×１０６細胞／ｍｌから２．０３×１０６細胞／ｍｌに増大させ、ｐＨを７．１から７．２に上げ、そしてｄＣＯ２濃度を９．５％から６．２％に下げた。
【０１３６】
ＦＶＩＩＩの容量生産性（１日あたりの１リットルあたりのＩＵ）は９８％増大し、そしてＦＶＩＩＩの比生産性（１日あたりの細胞１００万個あたりのＩＵ）は３６％増大した。
【０１３７】
（実施例６）
フューリンの生産に対するｐＨと温度の影響
フューリンを発現するＣＨＯ細胞を、ケモスタット様式で２．５Ｌのバイオリアクターの中で培養した。細胞密度は、連続する５日間の間中、個々の培養物について１．５２×１０６細胞／ｍｌ〜１．７８×１０６細胞／ｍｌの間の平均で維持した。溶存酸素は、全ての実験において、２０％の空気飽和度の設定値で制御した。溶存ＣＯ２濃度は、バイオリアクターの上部空間にＣＯ２を重層することによって、５％〜６％の間で維持した。
【０１３８】
「実験方法の設計」によって、フューリンの最大容量生産性を生じる条件を確定するために、様々な温度を様々なｐＨ値と組み合わせた。５種類の温度を、「Ｄｏｅｈｌｅｒｔ Ｍａｔｒｉｘ」にしたがって３種類のｐＨ値と組み合わせ、これによって以下のような温度とｐＨの７つの組み合わせが得られた：
【０１３９】
【表２】
３６．５℃とｐＨ７．２０との組み合わせを、２つの醗酵ロット（上の表の４と５）に適用した中心点として選択した。
【０１４０】
容量生産性と比生産性、および増殖速度を含むデータを、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウェアを使用してＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）によって統計学的に分析した。
【０１４１】
ｐＨではなく温度が増殖速度に有意な影響を与え、増殖速度についての最大は３６．５℃で起こった。温度を３７℃から３５．１℃に下げることにより、容量生産性を、およそ２．７倍に増大させることができた。同様の傾向は比生産性についても見られた。これは、最大の容量生産性は、増殖速度が最大である温度で観察されるであろうと予想していたので、驚くべき結果であった。比生産性および容量生産性に対するｐＨの影響は、７．２０＋／−０．１の研究した範囲では小さかった。わずかに高い生産性が、７．１５＋／−０．０５（または７．１０から７．２０の間）の低いｐＨ範囲で観察され、したがって、ｐＨ７．１５をフューリンの生産についての設定値として選択した。
【０１４２】
（実施例７）
フューリンの生産に対するｄＣＯ２の影響
２種類の醗酵操作を、２．５Ｌのバイオリアクターの中でケモスタット様式で平行して行った。一方は、およそ７．５％のＣＯ２濃度で操作し、そして他方はおよそ１２％のＣＯ２濃度で操作した。ＣＯ２濃度は、上部空間を流れるＣＯ２の割合を変化させることによって調整した。醗酵は、３７℃、７．１５のｐＨで、そして２０％のｐＯ２を用いて行った。細胞数は、高ＣＯ２培養物中では１２日間にわたり、およそ１．０７×１０６細胞／ｍｌとし、そして低ＣＯ２培養物中では１．４９×１０６細胞／ｍｌとした。
【０１４３】
ＣＯ２濃度を１２％から７．５％に下げることにより、容量生産性についてはおよそ２．７８倍の増大の効果が、そして比生産性については２倍の効果があった。細胞増殖速度もまた、低ＣＯ２培養物中で高かった。
【０１４４】
（実施例８）
ＦＶＩＩの生産に対するｐＨと温度の影響
ＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞を、ケモスタット様式で２．５Ｌのバイオリアクターの中で培養した。ここでは、細胞密度は、連続する４週間にわたり、それぞれの培養物について約２．５×１０６細胞／ｍｌ（２×１０６細胞／ｍｌと３×１０６細胞／ｍｌとの間）の平均で維持した。溶存酸素は、全ての実験において２０％の空気飽和の設定値で制御した。溶存ＣＯ２濃度は、バイオリアクターの上部空間にＣＯ２を重層することによって、４％〜７％の間で維持した。
【０１４５】
「実験方法の設計」によって、ＦＶＩＩの最大容量生産性を生じる条件を確定するために、様々な温度を様々なｐＨ値と組み合わせた。３種類の温度を、「Ｄｏｅｈｌｅｒｔ Ｍａｔｒｉｘ」にしたがって３種類のｐＨ値と組み合わせ、これによって以下のような温度とｐＨとの５つの組み合わせが得られた：
【０１４６】
【表３】
平均の最大の容量速度論的生産性には、３６．５℃、および７．２０のｐＨ設定値で到達した。パラメーターの間にはポジティブな相互作用があり、結果として、両方のパラメーターを最適化した結果は、個々のパラメーターを個別に最適化した効果を組み合わせたよりも大きかった。
【０１４７】
（実施例９）
ＦＶＩＩの生産に対するｄＣＯ２の影響
４種類の異なるＣＯ２濃度（５．０％、６．３％、７．６％、および８．９％）のＦＶＩＩの生産性に対する効果を、小規模の連続培養において試験した。
【０１４８】
細胞を、ケモスタットまで８日間培養し、その後、２．５ＬのＲｕｓｈｔｏｎバイオリアクターに移し、ｐＨ７．２０および３６．５℃での連続条件下でおよそ４週間培養した。最初の１週間の間に、様々なＣＯ２濃度に平衡化させる必要があったので、最後の３週間だけのデータを分析した。ＣＯ２濃度は、オフライン測定と、バイオリアクターの上部空間へのＣＯ２の添加によって制御した。
【０１４９】
記録した細胞密度は、８．９％のＣＯ２濃度での２．３６×１０６細胞／ｍｌから、５．０％のＣＯ２濃度での２．８７×１０６細胞／ｍｌにまで変化した。同じ範囲について増殖速度は、０．４２ｄ−１および０．４９ｄ−１であった。低いＣＯ２濃度での高い比増殖速度は、高い比生産性と関係していた。増殖速度と比生産性に対するＣＯ２の複合作用により、容量生産性に対する実質的な効果が生じた。
【０１５０】
８．９％から５％にＣＯ２濃度を下げることにより、比増殖速度は１７％、比生産性は１０％、そして容量力学的生産性は３５％増大した。
【０１５１】
（実施例１０）
ＡＤＡＭＴＳ−１３の生産に対する温度とｐＨの影響
組み換え体ＡＤＡＭＴＳ−１３を発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１．５Ｌのバイオリアクターの中でケモスタット培養で培養した。
【０１５２】
最初の実験では、ｐＨと温度を、３６℃から３８℃と、ｐＨ７．１０から７．３０の範囲にある様々な設定値に設定した。定常状態に由来する試料を、細胞数とＥＬＩＳＡによるＡＤＡＭＴＳ−１３の発現について分析し、ケモスタット培養による希釈速度を、増殖速度とＡＤＡＭＴＳ−１３の容量発現を計算するために測定した。最適値が設計空間の外側の範囲にあることが明らかになったので、第２の実験を、３５℃から３７℃までの温度範囲、そしてｐＨ７．０５から７．１５で設定し、データを定常状態から分析した。細胞密度は、１．１７〜１．７１×１０６細胞／ｍｌの範囲であった。ＣＯ２を、４％〜６％の溶存ＣＯ２濃度に達するように、上部空間にＣＯ２を重層することによって制御した。
【０１５３】
両方の実験によるデータを標準化し、統計ソフトウェアＭｉｎｉｔａｂを使用して分析した。
【０１５４】
比増殖速度は、ｐＨ７．１３および３６．０℃にその最適値があることを、ｐＨと温度についての二次モデルを使用して明らかにした。増殖速度に対する温度の影響は弱かった。
【０１５５】
容量生産性は、ｐＨ７．１５および３６．０℃にその最適値があることが明らかになった。増殖速度に対する温度の影響は弱いにもかかわらず、温度は、容量生産性に対しては比較的強い影響があった。
【０１５６】
３７℃の定温と仮定すると、７．１０から７．１５にｐＨを上げることの効果は、容量生産性の１０％の増大であった。７．１０の一定のｐＨを仮定すると、温度を３７℃から３６℃に下げることの効果は、容量生産性の１４％の増大であった。ｐＨ７．１０および３７℃の温度から、ｐＨ７．１５および３６℃の温度に条件を変化させることの全体的な効果は、容量生産性の２４％の増大であった。
【０１５７】
本明細書中で引用された全ての参考文献の内容は、参照することにより含められる。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１２月２７日に出願された米国仮出願第６１／００９，３２８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞、具体的には、異種タンパク質および／または組み換え体タンパク質を分泌する哺乳動物細胞、そしてさらに具体的には、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（本明細書中以後、「第ＶＩＩＩ因子」または単に「ＦＶＩＩＩ」）、ＡＤＡＭＴＳ−１３、フューリン、あるいは凝固第ＶＩＩ因子（本明細書中以後、「第ＶＩＩ因子」または単に「ＦＶＩＩ」のような血中タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、哺乳動物においてみられる微量の血漿糖タンパク質であり、第Ｘ因子の活性化にＩＸａの補因子として関与している。第ＶＩＩＩ因子の遺伝的欠損は、出血性障害である血友病Ａを生じる。血友病Ａは、精製された第ＶＩＩＩ因子での治療が可能である。第ＶＩＩＩ因子は、血漿から抽出することができるか、または組み換えＤＮＡをベースとする技術によって生産することができる。血漿中では、これは、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）との複合体として循環している。
【０００４】
組み換え体である第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）は、第ＶＩＩＩ因子分子をコードするＤＮＡ配列を持つベクターがトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって生産させることができる。いくつかの場合には、組み換え体である第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させる組み換え体であるフォン・ヴィレブランド因子（ｒｖＷＦ）と同時に生産される。そのような同時生産には、ＦＶＩＩＩとｖＷＦを発現するそれぞれの細胞株の同時培養、または同じ細胞の中での２種類のタンパク質の同時発現が含まれ得る。特許文献１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）および非特許文献１参照のこと。
【０００５】
組み換え体である第ＶＩＩＩ因子を調製するための典型的なプロセスにおいては、細胞は培地中で培養され、第ＶＩＩＩ因子が培地中に分泌される。その後、第ＶＩＩＩ因子が培地から、状況によってはｖＷＦとの複合体として、精製され得る。
【０００６】
組み換え体である第ＶＩＩＩ因子は、当該分野で公知のプロセスでは比較的低い収率でしか得られないことが原因で、生産コストが高い。細胞あたりの収率は、他の組み換え体タンパク質について得ることができる収率と比較して低い傾向にある。培養培地に動物性の生成物（例えば、血清）が補充されていなければ、培地は、比較的低い細胞密度しかサポートすることができない。これにより、培地の容量あたりの収率が減少する。しかし、ウイルスや他の伝染性物質の混入のリスクを低下させるためには、動物性の生成物が培養培地に補充されないことが望ましい。ＦＶＩＩＩの生産のための動物性タンパク質を含まない培地は、例えば、特許文献２（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）から公知である。
【０００７】
本発明により、当該分野で公知のプロセスと比較して収率が改善された、ｒＦＶＩＩＩを含む血中タンパク質を生産するためのプロセスが提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，２５０，４２１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，９３６，４４１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）９，１２３３〜１２４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様により、細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法が提供される。ここでは、細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持される。ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし温度は３７℃未満に設定される。
【００１１】
本発明の第２の態様により、細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法が提供される。ここでは、細胞培養上清は、Ｘ±０．０５に設定されたｐＨで維持される。ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有し、ただしｐＨは７．１０より大きく設定される。
【００１２】
本発明の第３の態様により、細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法が提供される。ここでは、細胞培養上清は、１〜１０％のＣＯ２濃度を有する。
【００１３】
本発明の第４の態様により、細胞培養上清を含む容器の中でのＦＶＩＩＩを分泌する哺乳動物細胞の連続培養の方法が提供される。ここでは、細胞培養上清中での細胞の密度はインラインセンサーによって測定され、容器への新鮮な培地の流入は、所望される範囲内に細胞密度が維持されるように自動的に制御される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様のプロセスにおいては、哺乳動物細胞がその中で培養される細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持される。ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし温度は３７℃未満に設定される。好ましい実施形態では、温度は、３６±０．９℃、好ましくは３６±０．５℃、より好ましくは３６±０．２℃、そして最も好ましくは３６℃；または３５．１±０．９℃、好ましくは３５．１±０．５℃、より好ましくは３５．１±０．２℃、そして最も好ましくは３５．１℃；または３６．５±０．９℃、３６．５±０．５℃、より好ましくは３６．５±０．２℃、そして最も好ましくは３６．５℃に設定される。
【００１５】
「細胞培養上清」は、その中で哺乳動物細胞が培養される培地である。この培地は、培養物に対して添加され得る供給培地と混同してはならないが、供給培地もまた、細胞培養上清について設定される温度で培養物に添加させることが好ましい。「培養物」によって、本発明者らは、細胞培養上清とその中で培養された哺乳動物細胞とを意味する。従来法では、哺乳動物細胞は３７℃で培養される。驚くべきことに、本出願では、より低温（例えば、３６℃）での哺乳動物細胞の培養により、組み換え体タンパク質の収率が増大することが見出された。
【００１６】
ある温度で「培養すること」または「維持すること」により、本発明者らは、プロセスの制御システムが設定される温度、言い換えると、意図される、目的とする、温度をいう。明らかに、経時的な培養物の温度、そして培養容器全体の個々の位置による小さな差異があるであろう。本発明者がＸ±Ｙ℃に設定した温度で「培養すること」または「維持すること」をいう場合は、本発明者らは、設定値がＸ＋Ｙ℃からＸ−Ｙ℃までの値にあることを意味する。したがって、例えば、Ｘが３６．０±０．９℃である場合は、設定値は、３５．１から３６．９までの値に設定される。好ましいＸ値のそれぞれについて、設定値は、範囲Ｘ±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、もしくは±０．１℃内の値である。より狭い範囲が好ましい。Ｘの設定値が最も好ましい。
【００１７】
任意の所定の設定値について、温度においてはわずかな差異が生じ得る。典型的には、そのような差異は、温度が設定値からいくらか外れた後にしか加熱要素および冷却要素が作動しないことが原因で起こり得る。その場合、設定値はＸ（±Ｙ）であり、加熱要素または冷却要素は、必要に応じて、温度が±Ｚ℃変化すると作動する。典型的には、加熱要素または冷却要素が作動する前に温度について強要される設定値からの偏差の程度は、プロセスの制御システムの中にプログラミングされ得る。温度は、サーモスタットによって制御される加熱要素および冷却要素によって、最近±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、またはさらには±０．１℃になるように制御され得る。温度についてのさらに大きな差異（例えば、±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、もしくは±０．６℃）もまたプログラムされ得る。温度はまた、特定の温度の加熱浴中に培養容器を浸すことによっても制御することができる。考えられる限りでは、加熱が継続的に行われるので、設定値からの差異は存在しない。差異の別の原因は、細胞培養上清の温度の測定誤差が原因で生じる。細胞培養装置において使用される一般的な温度計は、±０．３℃、もしくは±０．２℃、またはさらには±０．１℃の変動性を有し得る。
【００１８】
設定値がＸ±Ｙ℃の範囲内の値に設定され、温度の許容誤差が±Ｚ℃である（すなわち、温度が必要に応じて±Ｚ℃外れると、加熱器または冷却器が作動する）場合は、これは、（Ｘ−ＹからＸ＋Ｙ）±Ｚ℃の設定値として表わすこともできる。可能なＸ値のそれぞれについて、上記で示されたような±Ｙ℃と±Ｚ℃との全ての組み合わせが想定されるが、ただし温度は３７℃未満に設定される。
【００１９】
１つの好ましい実施形態では、温度は３６±Ｙ℃に設定される。好ましくは、温度は（３５．４〜３６．６）±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．５〜３６．５）±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．６〜３６．４）±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．７〜３６．３）±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．８〜３６．２）±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．９〜３６．１）±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または３６±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０℃に設定される。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、温度は３５．１±Ｙ℃に設定される。好ましくは、温度は（３４．５〜３５．７）±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．６〜３５．６）±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．７〜３５．５）±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．８〜３５．４）±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３４．９〜３５．３）±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３５．０〜３５．２）±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または３５．１±０．９℃、±０．８℃、±０．７℃、±０．６℃、±０．５℃、±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０℃に設定される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、温度は３６．５±Ｙ℃に設定される。好ましくは、温度は３６．１〜３６．９）±０；または（３６．２〜３６．８）±０．１℃、もしくは±０；または（３６．３〜３６．７）±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または（３６．４〜３６．６）±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０；または３６．５±０．４℃、±０．３℃、±０．２℃、±０．１℃、もしくは±０に設定される。
【００２２】
本発明の第２の態様のプロセスにおいては、細胞培養上清は、Ｘ±０．０５に設定されたｐＨで維持される。ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有し、ただしｐＨは７．１０より大きく設定される。好ましい実施形態では、ｐＨは７．２０±０．０５、好ましくは７．２０±０．０３、より好ましくは７．２０±０．０１、そして最も好ましくは７．２０；または７．１５±０．０５、好ましくは７．１５±０．０３、より好ましくは７．１５±０．０１、そして最も好ましくは７．１５に設定される。組み換え体タンパク質を生産するための従来のプロセスにおいては、細胞培養上清はｐＨ７．１で維持される。驚くべきことに、本出願では、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ７．２）で哺乳動物細胞を培養することにより、組み換え体タンパク質の収率が増大することが明らかになった。
【００２３】
あるｐＨで「培養すること」または「維持すること」により、本発明者らは、プロセスの制御システムが設定されるｐＨ、言い換えると、意図される、目的とする、ｐＨをいう。本発明者らがＸ±Ｙに設定したｐＨで「培養すること」または「維持すること」という場合は、本発明者らは、設定値がＸ＋ＹからＸ−Ｙまでの値にあることを意味する。好ましいＸ値のそれぞれについて、設定値は、Ｘ±０．０５、±０．０４、±０．０３、±０．０２、または±０．０１の範囲内の値である。より狭い範囲が好ましい。Ｘの設定値が最も好ましい。
【００２４】
任意の所定設定値について、ｐＨのわずかな差異が生じ得る。通常は、そのような差異は、ｐＨを制御する手段（例えば、酸または塩基を添加すること、あるいはスパージング速度を変化させることによる）が、ｐＨが設定値からいくらか外れた後でしか作動しないことが原因で起こり得る。通常、ｐＨは、最近±０．０５、±０．０４、±０．０３、±０．０２、または±０．０１のｐＨ単位になるように制御される。
【００２５】
ｐＨの設定値がＸ±Ｙの範囲内の値に設定され、そして許容範囲が±Ｚである場合は、これは、（Ｘ−ＹからＸ＋Ｙ）±Ｚの設定値として表わすこともできる。可能なＸの値のそれぞれについて、上記に示したような±Ｙと±Ｚとの全ての組み合わせが想定され、ただしｐＨは７．１０より大きく設定される。
【００２６】
１つの好ましい実施形態では、ｐＨは、７．２０±Ｙに設定される。好ましくは、ｐＨは（７．１５〜７．２５）±０；または（７．１６〜７．２４）±０．１、もしくは±０；または（７．１７〜７．２３）±０．２、±０．１、もしくは±０；または（７．１８〜７．２２）±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０；または（７．１９〜７．２１）±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０；または７．２０±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０に設定される。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、ｐＨは７．１５±Ｙに設定される。好ましくは、ｐＨは（７．１１〜７．１９）±０；または（７．１２〜７．１８）±０．１、もしくは±０；または（７．１３〜７．１７）±０．２、±０．１、もしくは±０；または（７．１４〜７．１６）±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０；または７．１５±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、もしくは±０に設定される。
【００２８】
本発明の第３の態様のプロセスにおいては、細胞培養上清は、１％〜１０％のＣＯ２濃度、例えば、４．０％〜９．０％、５．５％〜８．５％、または約６％〜８％のＣＯ２濃度を有する。従来法では、ＣＯ２濃度は、細胞培養上清から取り出されていない細胞によって生産されたＣＯ２が原因でこれよりも高い。驚くべきことに、出願人は、１０％以下のＣＯ２濃度を維持することにより組み換え体タンパク質の収率が増大することを見出した。これは、供給培地が脱気される場合（例えば、供給培地全体に空気を泡立てることによる）、ならびにバイオリアクター中の細胞培養上清がスパージングされる場合に、ｄＣＯ２を低く維持するために役立つ。
【００２９】
好ましくは、本発明の最初の３つの態様のそれぞれについてのプロセスは、本発明の他の態様の１つ以上のプロセスに関して定められている特定の特徴を含むように操作される。言い換えると、温度がＸ±０．９℃に維持される（ここでは、Ｘは３５．１から３６．５℃までの値を有する）場合には、ｐＨをＸ±０．０５に（ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有する）、そして／またはＣＯ２濃度を１０％以下に維持することもまた有効である。ｐＨがＸ±０．０５に維持される（ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有する）場合には、温度をＸ±０．９℃に（ここでは、Ｘは３５．１から３６．５℃までの値を有する）、および／またはＣＯ２濃度を１０％以下に維持することもまた有効である。ＣＯ２濃度が１０％以下に維持される場合は、ｐＨをＸ±０．０５に（ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有する）、および／または温度をＸ±０．９℃に（ここでは、Ｘは３５．１から３６．５℃までの値を有する）維持することもまた有効である。
【００３０】
３種類の定義されたパラメーター（温度、ｐＨ、およびＣＯ２濃度）をモニタリングする方法は当該分野で周知であり、通常は、バイオリアクターに挿入されるか、または培養培地が循環させられるループの中に含まれるか、または培養培地の抽出された試料に挿入されるプローブに依存する。適切なインラインｄＣＯ２センサーとその使用については、Ｐａｔｔｉｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：７６９−７７４に記載されている。適しているインラインｐＨセンサーはＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＰｒｏ ３１００／１２５／Ｐｔ１００（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ Ｉｎｇｏｌｄ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）である。ｐＨおよびｐＯ２に加えてｄＣＯ２を測定するために適しているオフラインシステムは、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ｐＨＯｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）である。このシステムでは、ｄＣＯ２は、５％の不正確性の分解能（ｉｍｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、３ｍｍＨｇ〜２００ｍｍＨｇの範囲にある電位電極によって測定される。ｐＨは、バイオリアクター中の細胞培養上清の温度に近い３７℃の温度で、このシステムの中で測定され得る。これを予め決定された値に維持するために特異的なパラメーターを変化させる方法もまた周知である。例えば、温度を一定に保つことには、通常は、バイオリアクターもしくは供給培地を加熱または冷却すること（これが流加培養または連続プロセスである場合）が含まれる。ｐＨを一定に保つことには、通常は、適切な緩衝液（典型的には、重炭酸塩）を選択し、充分な量を供給すること、および酸（例えば、塩酸）またはアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、もしくはそれらの混合物）を必要に応じて供給培地に添加することが含まれる。そしてＣＯ２濃度を一定に保つことには、通常は、スパージング速度を調整すること（下記を参照のこと）、または上部空間中でのＣＯ２の流れを調節することが含まれる。インラインｐＨプローブの較正は、細胞が培養される間に経時的に（例えば、数日間または数週間の期間にわたって）ドリフトする可能性がある。そのような場合は、最近較正されたオフラインプローブから得られた測定値を使用することにより、インラインプローブをリセットすることが有効であり得る。適切なオフラインプローブはＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ｐＨＯｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）である。
【００３１】
本発明者らは、（例えば、ＮａＯＨを添加することにより）ｐＨを増大させることでは、活性タンパク質の生産に関して最大の利点を得るにはそれ自体は充分ではないことを明らかにした。それよりもむしろ、ＣＯ２濃度を下げることが所望される。通常は、このプロセスの他のパラメーターが一定に維持されるであろう。しかし、本発明者らは、ＣＯ２濃度を下げること、しかし、好ましくはＮａＯＨを添加することなく、ｐＨを７．１から、例えば、７．１５または７．２に上昇させることが有効であることを見出した。
【００３２】
哺乳動物細胞の培養には、細胞を増殖させるための酸素が必要である。通常は、これは、注入口を通じて培養物中に酸素を送り込むことによって提供される。細胞の呼吸が原因で蓄積するＣＯ２を除去することも必要である。これは「スパージング」、すなわち、ＣＯ２を取り込み、流し出すためにバイオリアクター全体に気体を通すことによって行われる。従来法では、これは酸素を使用して行うこともできる。しかし、本発明者らは、代わりに空気を使用することが有効であることを見出した。通常、従来の不活性ガス（例えば、窒素）は、空気を使用するよりもＣＯ２のスパージングには効果が低いことが明らかにされている。空気に約２０％の酸素が含まれているとすると、はるかに多い５倍量の空気が使用されるであろうと当業者は考える。しかし、これは、大規模な培養（特に、２５００Ｌの規模での培養）には適さないことが明らかにされている。２５００Ｌのバイオリアクターの中では、７倍から１０倍量の空気、好ましくは約９倍量の空気が使用される。例えば、標準的な条件下では、２５００Ｌのバイオリアクターに、１０μｍの気泡の大きさのＯ２が、０．０２ＶＶＨ（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）がスパージングされる。本発明の方法にしたがって使用される同じ２５００Ｌのバイオリアクターには、１０μｍの気泡の大きさの空気は、０．１８ＶＶＨの速度でスパージングされるであろう。
【００３３】
したがって、驚くほど多量の空気の使用により、適切な酸素供給が提供され、そして望ましくないＣＯ２が除去されることが明らかにされている。
【００３４】
生産フェーズの間には、上記のような空気のスパージングによってＣＯ２が除去されることが好ましい。これは、別の方法によって細胞培養上清に有害なほど高濃度にまでＣＯ２を蓄積する大容量のバイオリアクターが使用される場合に特にそのとおりである。しかし、培養の開始時、または小規模（例えば、１Ｌまたは２．５Ｌの規模）での培養では、上部空間にはＣＯ２が重層される場合がある。そのような条件下では、低いｄＣＯ２濃度に達する場合がある。上部空間のＣＯ２の重層はまた、ｐＨがあまりに塩基性側にある場合には、ｐＨを設定値にまで下げるためにも使用され得る。
【００３５】
細胞は、所望されるタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）を生産するための、好ましくは、製造プロセス（すなわち、少なくとも１リットル）の中で培養することができる任意の哺乳動物細胞であり得る。例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９９７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（例えば、ＤＵＫＸ−Ｂ１１サブクローン）（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サルの腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましくは、細胞株は齧歯類の細胞株、特に、ＣＨＯまたはＢＨＫのようなハムスターの細胞株である。
【００３６】
組み換え体タンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを調製する好ましい方法は以下のとおりである。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＵＫＸ−ＢＩＩは、原則として米国特許第５，２５０，４２１号（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、関連する組み換え体タンパク質の発現が可能なＤＨＦＲ発現ベクターでトランスフェクトされる。トランスフェクションは、メトトレキセートについて選択される。組み換え体タンパク質の発現をコードする関連領域とＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、漸増濃度のメトトレキセートの中での細胞の増殖によって行われる。適切である場合には、ＣＨＯ細胞株は、原則として米国特許第６，１００，０６１号（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）に記載されているとおりに、血清および／またはタンパク質を含まない培地の中での増殖に適応させられ得る。
【００３７】
宿主細胞株を培養するために選択される基底培地は本発明については重要ではなく、哺乳動物細胞を培養するために適している当該分野で公知のもののうちの任意の１つ、またはそれらの組み合わせであり得る。ダルベッコ改変イーグル培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地が市販されている。組み換え体インシュリンのような増殖因子の添加は随意である。
【００３８】
歴史的には、動物細胞は、動物の血清を含む培地中で培養されてきた。しかし、そのような培地は不完全にしか定義されておらず、感染のリスクがある。したがって、当業者は、いずれのタンパク質も全く含まれていないか、または組み換え生産されない任意のタンパク質が少なくとも含まれていないかのいずれかである、「タンパク質を含まない」培地を考案した。第ＶＩＩＩ因子の不安定な性質が原因で、操作された宿主細胞の生産性は、タンパク質を含まない条件下ではかなり低下する。ヒト血清アルブミンが、組み換え体タンパク質の生産のための無血清培地補充物として一般的に使用されている。アルブミン自体がＦＶＩＩＩを安定化させ、血清由来のアルブミン調製物中に存在する不純物もまた、アルブミンの安定化作用に寄与し得る。リポタンパク質のような因子は、血清を含まない条件下での組み換え体である第ＶＩＩＩ因子の生産のための、ヒト血清アルブミンの代わりとなるものとして同定されている。
【００３９】
好ましい培地としては、米国特許第６，１７１，８２５号（Ｂａｙｅｒ，Ｉｎｃ）および米国特許第６，９３６，４４１号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に開示されているものが挙げられる。
【００４０】
米国特許第６，１７１，８２５号の培地は、組み換え体インシュリン、鉄、ポリオール、銅、および状況に応じた他の微量金属が補充された、改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最少必須培地とＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（重量で５０：５０）からなる。
【００４１】
インシュリンは組み換え体でなければならず、「Ｎｕｃｅｌｌｉｎ」インシュリンとしてＥｌｉ Ｌｉｌｌｙから入手することができる。これは、０．１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ（好ましくは、５μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌ）で添加することができる。鉄は、好ましくは、Ｆｅ２＋イオンの形態（例えば、ＦｅＳＯ４・ＥＤＴＡとして提供される）であり、５μＭ〜１００μＭ（好ましくは、約５０μｍ）で存在し得る。適切なポリオールとしては、約１０００〜約１６０００までの範囲の分子量を有しているポリ（オキシエチレン）とポリ（オキシプロピレン）の非イオン性ブロックコポリマーが挙げられる。特に好ましいポリオールはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）であり、これは、８４００の平均分子量を有し、ポリ（オキシプロピレン）（２０重量％）のセンターブロックと、両方の末端にあるポリ（オキシエチレン）のブロックからなる。これは、Ｕｎｉｃｈｅｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＢＶからＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ−６８として入手することもできる。他のものとしては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ−６１、Ｆ−７１、およびＦ−１０８が挙げられる。銅（Ｃｕ２＋）は、５０ｎＭ〜８００ｎＭのＣｕＳＯ４、好ましくは１００ｎＭ〜４００ｎＭ、便宜的には約２５０ｎＭ等量で添加され得る。微量金属（例えば、マンガン、モリブデン、ケイ素、リチウム、およびクロム）のパネルを含めることにより、第ＶＩＩＩ因子の生産のさらなる増大を誘導することができる。ＢＨＫ細胞は、このタンパク質を含まない基本培地の中ではかなり増殖する。
【００４２】
米国特許第６，９３６，４４１号の培地もまた、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ Ｆ１２との５０／５０混合物をベースとするが、これには、０．１ｇ／ｌから１００ｇ／ｌの間、好ましくは１ｇ／ｌから５ｇ／ｌの間で大豆ペプトンまたは酵母抽出物も含まれる。特に好ましい実施形態では、大豆抽出物（例えば、大豆ペプトン）が使用され得る。大豆ペプトンの分子量は５０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満であり得る。３５０ダルトンの平均分子量を有している限外濾過された大豆ペプトンの添加は、組み換え体である細胞株の生産性に特に有効であることが証明されている。これは、全部で約９．５％の窒素含有量と、約１３％または約７％〜１０％の遊離のアミノ酸の含有量を有している大豆単離物である。
【００４３】
特に好ましい培地は、以下の組成を有する：合成の最少培地（例えば、５０／５０のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２）１ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ；大豆ペプトン０．５ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ；Ｌ−グルタミン０．０５ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；ＮａＨＣＯ３ ０．１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸０．０００５ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；エタノールアミン０．０００５〜０．０５；および亜セレン酸ナトリウム１μｇ／ｌ〜１５μｇ／ｌ。状況に応じて、ポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６１、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−７１、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１０８）が、消泡剤として培地に添加され得る。この薬剤は、一般的には、エアレーション（「スパージング」）のネガティブ効果から細胞を保護するために使用される。なぜなら、界面活性剤を添加しなければ、気泡の上昇および破裂によって、気泡の表面に存在する細胞が傷つく可能性があるからである。
【００４４】
非イオン性界面活性剤の量は、０．０５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの間、好ましくは０．１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの間の範囲であり得る。さらに、培地には、シクロデキストリンまたはその誘導体が含まれ得る。好ましくは、血清およびタンパク質を含まない培地には、組織培養に適しており、合成起源または植物起源のものであるプロテアーゼ阻害剤（例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤）が含まれる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、以下のアミノ酸混合物が、上記培地にさらに添加される：Ｌ−アスパラギン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ−システイン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．００５ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ−シスチン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（０．００１ｇ／ｌ〜１．５ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０７ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０２ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（０．００１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ〜０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ〜０．０３ｇ／ｌ）、およびＬ−グルタミン（０．０５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ；好ましくは、０．１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ）。これらのアミノ酸は、個別に、または組み合わせて培地に添加され得る。上記アミノ酸を全て含むアミノ酸混合物の組み合わせた添加が特に好ましい。
【００４６】
特定の実施形態では、上記アミノ酸混合物と、精製された限外濾過された大豆ペプトンとの組み合わせを含む血清およびタンパク質を含まない培地がさらに使用される。
【００４７】
米国特許第６，９３６，４４１号の培地は、ＣＨＯ細胞を培養するために特によく適しているが、これはさらに他の細胞とともに使用することもできる。
【００４８】
さらなる適切な培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されているオリゴペプチドを含まない培地である。
【００４９】
好ましくは、培養培地は、重炭酸塩イオン（通常は、重炭酸ナトリウムとして供給される）の使用によって緩衝化される。
【００５０】
培養培地が、２１０ｍＯｓｍ〜６５０ｍＯｓｍの間、好ましくは２７０ｍＯｓｍ〜４５０ｍＯｓｍの間、より好ましくは３１０ｍＯｓｍ〜３５０ｍＯｓｍの間、そして最も好ましくは３２０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有していることが適している。好ましくは、上清のオスモル濃度は、本発明の方法全体を通じてこれらの範囲のうちの１つ以上の中で維持される。
【００５１】
培養は、任意の従来のタイプの培養（例えば、バッチ培養、流加培養、または連続培養）であり得るが、流加培養または連続培養が好ましい。適切な連続培養には、反復バッチ、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養が含まれる。
【００５２】
バッチ培養は、必要な全ての栄養素を含んだ状態で開始され、培養が完了するまで、すなわち、栄養素が使い尽くされるか、または培養が何らかの理由によって停止するまで進められる。
【００５３】
流加培養は、細胞と栄養素を含んだ状態で開始されるが、細胞の増殖を制限するために制御された方法で、その後にさらに栄養素が供給される意味でのバッチプロセスである。流加培養のストラテジーは、通常は、バイオリアクターの中で高い細胞密度に到達させるための生物産業的プロセスにおいて使用される。供給される溶液は、通常は、バイオリアクターの希釈を避けるために高度に濃縮される。栄養素の制御された添加は、培養物の増殖速度に直接影響を与え、代謝のオーバーフロー（代謝による副産物の形成）および酸素制限（嫌気生活）を回避することができる。ほとんどの場合は、増殖を制限する栄養素はグルコースであり、これは、高度に濃縮されたグルコースシロップ（例えば、６００ｇ／ｌ〜８５０ｇ／ｌ）として培養物に供給される。
【００５４】
様々なストラテジーを、流加培養プロセスにおいて増殖を制御するために使用することができる。例えば、溶存酸素張力（ＤＯＴ、ｐＯ２）、酸素摂取速度（ＯＵＲ）、グルコース濃度、乳酸塩濃度、ｐＨ、およびアンモニア濃度のいずれかを、そのパラメーターを一定に維持することによって培養物の増殖をモニターし、制御するために使用することができる。連続培養においては、栄養素が添加され、通常は、培地は、望ましくない副産物を除去して安定した状態を維持するために抽出される。適切な連続培養法は、反復バッチ培養、ケモスタット、タービドスタット、および灌流培養である。
【００５５】
例えば、ＣＨＯ細胞は、攪拌槽またはエアリフトタンクの中で培養され得る。これは、１日あたり２〜１０容量の交換の灌流速度で、そして４０％〜６０％の間、好ましくは約５０％の酸素濃度で、適切な培地で灌流される。さらに、細胞は、ケモスタット法によって、上記の好ましいｐＨ値、１０％〜６０％の間（好ましくは、約２０％）の酸素濃度、および０．２５〜１．０（好ましくは約０．５）の希釈速度Ｄを使用して培養され得る。
【００５６】
反復バッチ培養（連続継代培養としても知られている）では、細胞は培養培地中に入れられ、所望される細胞密度になるまで増殖させられる。減衰期および細胞死が始まることを避けるために、培養物は、細胞がそれらの最大濃度に達する前に完全増殖培地で希釈される。希釈の量と頻度は広く変化し、細胞株の増殖特性および培養プロセスの利便性に応じて様々である。このプロセスは必要に応じて複数回繰り返すことができ、そして細胞および培地が継代時に廃棄されない限りは、培養物の容量は希釈が行われるたびに段階的に増大する。容量の増大は、容器内で希釈できるような十分な大きさの反応器を用いることによって、または希釈された培養物をいくつかの容器に分けることによって取り扱うことができる。このタイプの培養の原理は、細胞を指数増殖の状態で維持することである。連続継代培養は、培養物の容量が常に段階的に増加し、集菌を複数回行うことができ、細胞は増殖し続け、そしてこのプロセスは所望される限り継続することができることを特徴とする。
【００５７】
ケモスタットおよびタービドスタット法においては、抽出された培地に細胞が含まれる。したがって、細胞培養容器の中に残っている細胞は一定の状態を維持するために増殖しなければならない。ケモスタット法では、増殖速度は、通常、希釈速度、すなわち、新鮮な培地が添加される速度を制御することによって制御される。細胞は、最大増殖速度未満で培養され、これは希釈速度を制限することによって行われる。増殖速度は通常は早い。対照的に、タービドスタット法では、希釈速度は、ｐＨおよび温度のような所定の操作条件で細胞が到達することができる最大増殖速度が可能となるように設定される。
【００５８】
灌流培養においては、抽出された培地は、細胞の大部分が培養容器の中に保持される（例えば、抽出培地が通過させられる膜の上に保持させることによって）ので、細胞が取り除かれる。しかし、通常は、そのような膜は細胞を１００％保持することはできず、そのため、一部は培地が抽出される際に取り出されてしまう。これは極めて早い増殖速度で灌流培養を操作するためには重要ではない。なぜなら、細胞の大部分が培養容器の中に保持されるからである。
【００５９】
連続培養（特に、反復バッチ培養、ケモスタット培養、およびタービドスタット培養）は、通常は、早い増殖速度で操作される。一般的な実施方法にしたがうと、これは、通常、最大の容量生産性を得ようとする目的で、最大増殖速度、または最大に近い増殖速度を維持するように追求される。容量生産性は、時間間隔あたりの培養物の容量あたりのタンパク質量または活性の単位で測定される。より速い細胞増殖は、１日あたりに生産される培養物の量がより多いことと考えられ、より高い容量生産性を反映すると従来から考えられている。本発明者らは、特定の実施形態では、最大の容量生産性が、細胞の最大増殖速度では得られないことを思いがけず発見した。実施例に記載されるように、フューリンを発現するＣＨＯ細胞クローンのケモスタット培養における最大増殖速度は、３６．５℃の温度で観察されたが、最大容量生産性は３５．１℃で観察された。低温でのより遅い増殖に起因して、得られた回収量が少なかったにもかかわらず、生産された組み換え体タンパク質の量は多量であり、低温の培養物は、全体として生産性がより高かった。
【００６０】
本発明の第１、第２、または第３の態様のいずれにおいても、細胞培養上清は最大増殖速度が観察される温度よりも少なくとも０．５℃、好ましくは、少なくとも１．０℃低い温度に設定される温度で維持されることが適している。この実施形態では、培養は連続培養（特に、反復バッチ培養、ケモスタット培養、またはタービドスタット培養）であることが好ましい。
【００６１】
哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞）は、一般的には、懸濁培養物として培養される。言い換えると、細胞は、固体支持体に付着させられるのではなく、培地の中に懸濁される。あるいは、細胞は、担体（特に、マイクロキャリア）の中に固定され得る。多孔性の担体（例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、またはＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標））が特に適している。
【００６２】
細胞密度は、一般的には細胞培養物の中でモニターされる。原則として、高い細胞密度が望ましいと考えられるであろう。なぜなら、細胞あたりの生産性が維持される限りは、これによって、バイオリアクターの容量あたりの高い生産性が得られるはずであるからである。しかし、細胞密度の増大は、実際には、細胞にとっては有害となり得、細胞あたりの生産性が下がる。したがって、細胞密度をモニターする必要がある。今日までのところは、哺乳動物の細胞培養プロセスにおいては、これは培養物の試料を抽出し、そして顕微鏡下で、またはＳｃｈａｅｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているＣＡＳＹ ＴＴデバイスのような細胞計数デバイスを使用してそれらを分析することによって行われている。本発明者らは、バイオリアクター自体に（または培地および懸濁された細胞がその中を通過させられ、その後、バイオリアクターに戻されるループの中に）導入された適切なプローブによって細胞密度を分析することが有効であることを、本発明において明らかにする。そのようなプローブは、Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから市販されている（例えば、Ｂｉｏｍａｓｓ Ｍｏｎｉｔｏｒ ２２０、２１０、２２０、または２３０）。培養物中の細胞は、電場の影響を受けて極めて小さいコンデンサーとして作用する。なぜなら、非伝導性の細胞膜は電荷を蓄積できるからである。得られる電気容量を測定することができる。これは細胞のタイプに依存し、そして生存している細胞の濃度に正比例する。１０ｍｍ〜２５ｍｍの直径のプローブは、バイオマスに対して無線周波磁場をかけるための２つの電極と、極性細胞の得られる電気容量を測定するための第２の一対の電極とを使用する。得られるシグナルの電気的処理により、生存している細胞の濃度の正確な測定値である出力が生じる。このシステムは、漏れがある膜、培地、気泡、および破片を含む細胞には反応しない。
【００６３】
典型的には、細胞密度は、１．０×１０６細胞／ｍｌ〜５．０×１０６細胞／ｍｌ、適しているのは１．０×１０６細胞／ｍｌ〜３．５×１０６細胞／ｍｌ、適しているのは１．４×１０６細胞／ｍｌ〜２．８×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１．６×１０６細胞／ｍｌ〜２．６×１０６細胞／ｍｌ、最も好ましくは、１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌである。好ましい範囲のより高いほうの限界に向かって細胞濃度を増大させることにより、容量生産性を改善することができる。それにもかかわらず、範囲の下端または上端としての任意の上記の点の値を含む細胞密度の範囲が想定される。
【００６４】
培養は、通常はバイオリアクターの中で行われる。バイオリアクターは、通常は、１リットルから１００００リットルの容量（例えば、５、１０、５０、１００、１０００、２５００、５０００、または８０００リットル）のステンレス鋼、硝子、またはプラスチック製の容器である。この容器は、通常は硬いが、小さい容量については特に、柔軟性のあるプラスチックバッグを使用することができる。これらは一般的には、「使い捨て」型である。
【００６５】
本発明の最初の３つの態様のいずれかの方法によって生産された異種タンパク質または組み換え体タンパク質は、好ましくは、血中タンパク質である。「血中タンパク質」には、本発明者らは、ヒトまたは動物の血液中に存在するか、または存在する可能性がある任意のタンパクを含め、これには、静脈内使用のために操作されたタンパク質が含まれる。適している血中タンパク質としては、血清アルブミン、血液凝固第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ因子、フューリン、フォン・ヴィレブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン、インターフェロン、メタロプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１３））、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ）および免疫グロブリン断片が挙げられる。適している抗体または免疫グロブリン断片としては、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８）：ＶＨおよびＶＬパートナードメインが可撓性オリゴペプチドを介して連結させられた単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３：Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，５８７９）、および単離されたＶ領域を含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４）が挙げられる。免疫グロブリンおよびそれらの断片は「ヒト化」することができる。言い換えると、齧歯類起源の可変ドメインを、ヒト起源の定常ドメインに融合させることができる。その結果、得られる抗体は、齧歯類のもとの抗体の抗原特異性を保持する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１−６８５５）。
【００６６】
好ましい実施形態では、細胞培養は、状況に応じてフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）とともに第ＶＩＩＩ因子を生産させるために使用される。ｖＷＦは培養培地に対して別に加えることができ、これは好ましくは、組み換え体である。あるいは、ｖＷＦは、培養物中にｖＷＦを分泌する細胞、ならびにＦＶＩＩＩを分泌する細胞を含めることによって同時に生産させることができる。しかし、好ましくは、ＦＶＩＩＩとｖＷＦとが同時に発現させられる、すなわち、それぞれの細胞がＦＶＩＩＩとｖＷＦとの両方を分泌する。組み換え体であるｖＷＦは、Ｓｃｈｌｏｋａｔら（１９９５），「Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ」，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７８，１１６０または米国特許第６，１１４，１４６号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に記載されているようにして得ることができる。後者の特許にはまた、ＦＶＩＩＩを分泌する細胞を用いてｖＷＦを同時に生産させるために使用することができる細胞も開示されている。両方のタンパク質を同時に発現する細胞は、米国特許第５，２５０，４２１号（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびＫａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，１２３３−１２４２に開示されている。
【００６７】
用語第ＶＩＩＩ因子は、凝固第ＶＩＩＩ因子活性を有している任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体を言うように本明細書中で使用される。活性化された第ＶＩＩＩ因子は、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下での活性化された第ＩＸａ因子による第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換において補因子として機能する。便宜上、活性な第ＶＩＩＩ因子の量は、適切なアッセイにおいて第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換を促進する程度から推定することができる。典型的なアッセイにおいては、第Ｘａ因子は、特定の発色性基質を加水分解し、それによって発色団を遊離させる。発色団の量が分光光度法で決定される。市販されているアッセイキットとしては、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ａｓｓａｙキット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；米国特許第６，１００，０５０号）；およびＣｏａｔｅｓｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。ヒトにおける第ＶＩＩＩ因子の濃度は、１ＩＵ／ｍＬ血液として定義される。Ｃｏａｔｅｓｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩキットでは、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌ血液に相当するＦＶＩＩＩ活性を決定することができる。上記で定義されたように第ＶＩＩＩ因子として考えると、ポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、天然の第ＶＩＩＩ因子と同じナノモル濃度で血中に存在する場合に、その活性をＣｏａｔｅｓｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩアッセイによって決定できるように、天然の第ＶＩＩＩ因子の活性の少なくとも１％を有していなければならない。
【００６８】
本発明の方法による生産に適しているＦＶＩＩＩは、天然の全長ＦＶＩＩＩである。ブタＦＶＩＩＩを本発明にしたがって生産することができるが、ＦＶＩＩＩは、ヒトのものであることがより好ましい。天然のＦＶＩＩＩの代わりとして、変異体およびアナログを生産することができる。多くのもの（例えば、変異体および欠失誘導体は、米国特許第５，４２２，２６０号、同第４，７４９，７８０号、同第４，８６８，１１２号、同第４，８７７，６１４号、および同第５，１７１，８４４号に記載されている変異体および欠失誘導体）が当該分野で公知である。用語「組み換え体である第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体」は、１つ以上のアミノ酸を欠失させることによって全長の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドから誘導された、第ＶＩＩＩ因子活性を有している１つ以上のポリペプチド鎖として定義される。好ましくは、上記欠失誘導体は、Ｂドメインのほとんどを欠いているが、一次翻訳産物の２つのポリペプチド鎖へのインビボでのタンパク質分解（によるプロセシング）に不可欠なＢドメインのアミノ末端配列とカルボキシ末端配列の部分は保持する。そのような第ＶＩＩＩ因子欠失誘導体の産物は「ｒ−ＶＩＩＩ ＳＱ」として同定されており、ＷＯ９１／０９１２２に記載されている。用語「ｒ−ＶＩＩＩ ＳＱ」は、全長の第ＶＩＩＩ因子から誘導された、アミノ酸７４３から１６３６を欠失しているポリペプチド鎖として同定されている。Ｂドメイン全体またはその一部を欠いているさらなるＦＶＩＩＩ変異体は、米国特許第６，３５８，７０３号に記載されている。
【００６９】
ＣＨＯ細胞および２９３Ｓ細胞を形質転換するために適しているベクターは、米国特許第５，８５４，０２１号に開示されている。ＦＶＩＩＩを発現するＢＨＫ細胞は、Ｗｏｏｄら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，３３０−３３７に開示されているように調製することができ、また、培養物ＣＲＬ−８５４４としてＡＴＣＣから入手することもできる。ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失変異体を発現するＣＨＯ細胞は、Ｌｉｎｄら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２，１９−２７、および米国特許第５，６６１，００８号に記載されている。３種類のそのような細胞のタイプが、ＤＳＭ ６４１５、ＤＳＭ ６４１７、およびＤＳＭ ６４１６としてＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている。
【００７０】
ＦＶＩＩＩとｖＷＦとが同時に生産される場合は、それらの複合体を培地を遠心分離することによって精製して細胞を取り除くことができ、その後、得られる液体は、複合体の解離を生じないであろう条件下で、ＦＶＩＩＩまたはｖＷＦのいずれかに対する抗体、あるいはＦＶＩＩＩまたはｖＷＦに特異的に結合するペプチドを含む固定化された固体支持体にさらされる。適切な方法は、米国特許第６，３０７，０３２号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）および米国特許第５，２００，５１０号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に教示されている。
【００７１】
ＦＶＩＩＩ（状況によってはｖＷＦとの複合体である）を、その後、公知の方法で処方し、使用することができる。例えば、動物性のタンパク質を含まない培養物中で生産されたＦＶＩＩＩは、好ましくは、例えば、米国特許第６，５８６，５７３号（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＷＯ９４／０７５１０、または米国特許第６，５９９，７２４号に開示されているように、タンパク質を含まない組成物の中に処方され、そして血友病Ａ患者を処置するために使用される。
【００７２】
本発明の方法がＦＶＩＩＩを生産するために使用される場合は、細胞培養上清が、３６±０．９℃、好ましくは、３６±０．５℃、より好ましくは３６±０．２℃、そして最も好ましくは３６℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．２０±０．０５、好ましくは７．２０±０．０３、より好ましくは７．２０±０．０１、最も好ましくは、７．２０に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【００７３】
実施例に示されるように、本発明がＦＶＩＩＩを生産するために使用される場合には、細胞培養上清中に銅を含めることが有効である。典型的には、細胞は、４ｐｐｂのＣｕ２＋を含む細胞培養上清中で培養される。細胞培養上清中でのＣｕ２＋の濃度は、少なくとも５ｐｐｂであり、好ましくは少なくとも７ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１５ｐｐｂ、または２５ｐｐｂであることが有利である。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、細胞培養はＡＤＡＭＴＳ−１３を生産するために使用される。
【００７５】
ＡＤＡＭＴＳ−１３はフォン・ヴィレブランド因子を切断するプロテアーゼ（ＶＷＦ−ｃｐ）としても知られており、メタロプロテアーゼファミリーのメンバーである。これは、ＶＷＦの残基Ｔｙｒ−８４２とＭｅｔ−８４３との間のペプチド結合を切断することによって、大きなＶＷＦ多量体をより小さな形態になるように代謝する能力を有している。このメタロプロテアーゼは、Ｃａ２ ／Ｂａ２によって活性化され、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼの阻害剤によっては阻害されない。欠失型のフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の分解は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）と関係がある。遺伝性のＴＴＰにおいては、ＡＤＡＭＴＳ−１３は存在しないかまたは機能的に異常であるが、ＴＴＰの家族性ではない後天性の形態においては、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を阻害する自己抗体がほとんどの患者において一次的に見られる。
【００７６】
ヒトＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子のクローニングと発現は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、２００２，Ｂｌｏｏｄ．１５；１００（１０）：３６２６−３２に記載されている。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子のクローニングと発現は、ｃＤＮＡの完全な配列とともに、ＵＳ２００５／０２６６５２８ Ａ１（Ｌａｅｍｍｌｅら）にも開示されている。本発明の方法による生産に適しているＡＤＡＭＴＳ−１３は、天然の全長ＡＤＡＭＴＳ−１３、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ−１３である。天然のＦＶＩＩＩの代わりとして、変異体およびアナログを生産することができる。
【００７７】
用語ＡＤＡＭＴＳ−１３は、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性（特に、ＶＷＦの残基Ｔｙｒ−８４２とＭｅｔ−８４３との間のペプチド結合を切断する能力）を持つ任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体をいうように、本明細書中で使用される。便宜上、活性のあるＡＤＡＭＴＳ−１３の量は、機能性アッセイ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１３の基質として修飾されたフォン・ヴィレブランド因子ペプチドを使用する機能性アッセイ）によって決定することができる（Ｔｒｉｐｏｄｉら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８年９月；６（９）：１５３４−４１）。ｒ−ｈｕ ＡＤＡＭＴＳ１３活性を決定する好ましい方法は、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎら：Ａｓｓａｙ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｖＷＦ：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ（ＴＴＰ）．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９９；８２：１３８６−１３８９に開示されている。このアッセイでは、１Ｕは、プールされた正常なヒト血漿中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性のレベルに相当する。上記で定義されたようなＡＤＡＭＴＳ−１３として考えると、ポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、天然のＡＤＡＭＴＳ−１３の活性の少なくとも１％を有していなければならない。ＡＤＡＭＴＳ−１３の量もまた、ＡＤＡＭＴＳ−１３抗原の測定によって、例えば、Ｒｉｅｇｅｒら、２００６，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００６ ９５（２）：２１２−２０に開示されているＥＬＩＳＡ法を使用して決定することができる。
【００７８】
タンパク質分解活性がある組み換え体ＡＤＡＭＴＳ−１３は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、２００２（前出）およびＵＳ２００５／０２６６５２８ Ａ１に記載されているように、哺乳動物細胞培養物中での発現によって調製することができる。ＡＤＡＭＴＳ−１３を発現する細胞の組み換え培養の方法は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ Ｂ，Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ Ｆ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４年１月；４１（１）：２４−３３に開示されている。ＡＤＡＭＴＳ−１３の発現に好ましい細胞のタイプとしては、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００７９】
ＵＳ２００５／０２６６５２８ Ａ１およびＺｈｅｎｇら、２００１，Ｂｌｏｏｄ，９８：１６６２−１６６６には、ＡＤＡＭＴＳ−１３を精製する方法が開示されている。精製されたＡＤＡＭＴＳ−１３は、従来の方法にしたがって処方することができ、例えば、ＴＴＰを処置するために治療的に使用される。
【００８０】
本発明の方法がＡＤＡＭＴＳ−１３を生産するために使用される場合は、細胞培養上清が、３６．０±０．９℃、好ましくは、３６．０±０．５℃、より好ましくは３６．０±０．２℃、そして最も好ましくは３６．０℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．１５±０．０５、好ましくは７．１５±０．０３、より好ましくは７．１５±０．０１、最も好ましくは、７．１５に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【００８１】
代わりの好ましい実施形態においては、細胞培養はフューリンを生産するために使用される。
【００８２】
フューリンはＰＡＣＥ（対合した塩基性アミノ酸を切断する酵素（ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ））とも呼ばれ、スブチリシン様セリンプロテアーゼのグループに属する。これは、プロタンパク質の切断（特に、分泌合成（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）において）重要な役割を担っている（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．，４：１１５−１３６，１９９３）。これは、いくつかのドメイン（すなわち、シグナルペプチド、プロペプチド、触媒ドメイン、ホモ−ＢまたはＰ−ドメイン、Ｃ末端に配置されたシステインリッチドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テール）に構造的に配置されたカルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼである。プロテアーゼ切断部位には、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを特徴とする認識配列が含まれる。プロテアーゼであるフューリンは、このコンセンサス配列の後ろで、プロタンパク質を特異的に切断する（Ｈｏｓａｋａら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０）。
【００８３】
完全なフューリンはＧｏｌｇｉ装置の膜システムの中に取り込まれ、ここで機能的に活性となる（Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；１１１：２８５１−９）。小胞体からゴルジ画分へと新しく合成されたフューリン前駆体が移動すると、プロペプチドは、２工程のプロセシング事象において自己触媒によって除去される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９７；１６：１５０８−１８）。フューリンはまた、ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉネットワークと細胞表面との間をエンドソーム小胞を介して循環し、それによって、恒常的な分泌経路を通じるそれらの輸送の間に両方の前駆体タンパク質をプロセシングし、分子はエンドサイトーシス経路に入る。プロセシング区画へのフューリンの細胞性の分配は、その細胞質テールの中での定義された構造的特徴によって示される（Ｔｅｕｃｈｅｒｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：８１９９−０７）。
【００８４】
天然のフューリンプロテアーゼの過剰発現は、連続して増殖させられる細胞培養物の増殖にネガティブな影響を与えるので、溶液は、細胞に対するフューリンの毒性の影響を減らすように考えられている。Ｃ末端ドメインは、フューリンの機能的活性には不必要であることが明らかにされており、そして７５〜８０ｋＤの過剰発現された天然のフューリンの短縮型は、分泌型のタンパク質として細胞上清中で検出することができる（Ｗｉｓｅら、ＰＮＡＳ．１９９０；８７：９３７８−８２）。この自然界において分泌される短縮型のフューリンは「シェッドフューリン」としてもしられており（Ｖｉｄｒｉｃａｉｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．１９９３；１９５：１０１１−８；Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００１；３５４：６８９−９５）、膜貫通部分のＮ末端で切断されている（Ｖｅｙら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；１２７：１８２９−４２）。
【００８５】
遺伝子操作によって短縮型となったフューリンタンパク質（膜貫通ドメインと細胞質ドメインのコード部分が欠失させられている）は、例えば、アミノ酸Δ７１４−７９４について（Ｌｅｄｕｃら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１４３０４−８；Ｍｏｌｌｏｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１６３９６−４０２）、およびアミノ酸Δ７１６−７９４について（「Ｓｏｌ−ＰＡＣＥ」，Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８４５８−６５；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｂｌｏｏｄ．１９９２；７９：２３４９−５５）、およびアミノ酸Δ７０５−７９４について（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１６０９４−９）記載されている。システインリッチ領域の欠失をさらに含むフューリン突然変異体もまた記載されている（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２；１０１：２９６−３０１；Ｃｒｅｅｍｅｒｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１８２６−３４）。
【００８６】
ＷＯ２００８／１４１８２４（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）には、アミノ酸５７８〜７９４が欠失している（すなわち、Δ５７８−７９４）短縮型のヒトフューリンが開示されている。
【００８７】
用語「フューリン」は、フューリンのタンパク質分解活性を持つ任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体をいうように本明細書中で使用される。
【００８８】
フューリン、短縮型フューリン、またはフューリン誘導体のタンパク質分解活性の評価は、任意の適切な試験によって、例えば、フューリンがそれに対して特異的である２塩基の切断部位を含む蛍光発生基質を使用することによって行うことができる（Ｓｃｈｌｏｋａｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６；２４：２５７−６７）。上記のアッセイが用いられる場合は、１単位は、３０℃で１分間のうちに、蛍光発生基質であるＢｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ から１ｐｍｏｌの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を遊離させるであろうフューリンの量として定義される。この試験についての定量限界は、典型的には０．６２５Ｕ／ｍＬである。あるいは、タンパク質分解活性は、フューリンをプロタンパク質（例えば、ｐｒｏ−ｒｖＷＦ）とともに十分な時間インキュベートすることによっても測定することができる。プロ−ｒｖＷＦのプロセシングの程度は、例えば、ウェスタンブロッティングによって分析することができる。フューリン抗原の量はＥＬＩＳＡ試験によって測定することができる。適しているＥＬＩＳＡ試験は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ（カタログ番号ＤＹ１５０３）から入手することができるヒトフューリンＤｕｏＳｅｔであり、ここでは、マウス抗ヒトフューリンが捕捉抗体として使用され、ビオチニル化ヤギ抗ヒトフューリンが検出抗体として使用される。
【００８９】
本発明の方法による生産に適しているフューリンは、天然の全長フューリン、好ましくはヒトフューリンである。天然のフューリンの代わりとして、上記のものを含む変異体およびアナログを生産することができる。
【００９０】
哺乳動物細胞（特に、ＣＨＯ細胞）を、フューリンまたはフューリンの変異体で形質転換するために適しているベクターは、そのように生産されたフューリンを精製するための方法とともに、ＷＯ２００８／１４１８２４（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に記載されている。ＷＯ９１／０６３１４（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）には、フューリン発現ベクター、哺乳動物細胞（特に、ＣＯＳ−１細胞）中でフューリンを発現させる方法、および組み換えによって生産されたフューリンの精製が記載されている。ＷＯ９２／０９６９８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）には、ＣＨＯ細胞中での単独で、またはｖＷＦもしくは第ＩＸ因子と組み合わせてのいずれかでのフューリンの発現が記載されている。
【００９１】
プロ−ｒＶＷＦは、多くの細胞タイプの中で比較的低レベルで発現される内因的に生産されたフューリンによって、細胞培養の間にその成熟形態へとプロセシングされる（Ｗｉｓｅら、１９９０，ＰＮＡＳ ８７：９３７８−９３８２）。プロ−ｒＶＷＦのプロセシングは、異種フューリンをプロ−ｒＶＷＦと同時に発現させることによってより効率的に行わせることができる。あるいは、ＷＯ２００８／１４１８２４は、精製されたフューリンがｒＶＷＦのプロセシングを促進するための試薬としての使用に適している可能性があることを示唆している。
【００９２】
本発明の方法がフューリンを生産するために使用される場合は、細胞培養上清が、３５．１±０．９℃、好ましくは、３５．１±０．５℃、より好ましくは３５．１±０．２℃．そして最も好ましくは３５．１℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．１５±０．０５、好ましくは７．１５±０．０３、より好ましくは７．１５±０．０１，最も好ましくは、７．１５に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、細胞培養は、第ＶＩＩ因子を生産するために使用される。
【００９４】
「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」には、野生型の第ＶＩＩ因子（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有しているポリペプチド）、ならびに野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に同じであるかまたは改善された生物学的活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体、および野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に改変されたかまたは低い生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体が含まれる。用語「第ＶＩＩ因子」は、それらの切断されていない（酵素前駆体）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、ならびにそれらのそれぞれの生体活性形態が生じるようにタンパク質分解によってプロセシングされているものが含まれるように意図される（これらも第ＶＩＩａ因子と呼ぶことができる）。典型的には、第ＶＩＩ因子は、残基１５２と１５３との間で切断されて第ＶｉＩａ因子を生じる。用語「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」にはまた、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性が野生型第ＶＩＩａ因子の活性と比較して実質的に改変されているかまたはいくらか低下している変異体を含むポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、その中に、そのポリペプチドの生体活性を改変するかまたは破壊するように特定のアミノ酸配列の変更が導入されている第ＶＩＩ因子あるいは第ＶＩＩａ因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
血液の凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合するその能力、および（ｉｉ）第ＩＸ因子または第Ｘ因子のタンパク分解的切断を触媒して、活性化された第ＩＸ因子または第Ｘ因子（それぞれ、第ＩＸａ因子または第Ｘａ因子）を生じるその能力に由来する。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性（「第ＶＩＩ因子の生物学的活性」）は、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号またはＷＯ９２／１５６８６に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠損血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液の凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量され得る。このアッセイでは、生物学的活性は、対照試料と比較した凝固時間の短縮として表され、１単位／ｍＬの第ＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準物との比較によって「第ＶＩＩ因子単位」に変換される。あるいは、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）脂質膜の中に包埋されたＴＦと第Ｘ因子とを含む系の中で活性化させられた第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生産する第ＶＩＩａ因子（または第ＶＩＩ因子ポリペプチド）の能力を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水性の系の中での第Ｘ因子の加水分解を測定すること；（ｉｉｉ）第ＶＩＩａ因子（または第ＶＩＩ因子ポリペプチド）のＴＦに対する物理的結合を、表面プラスモン共鳴に基づいて機器を使用して測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４１３：３５９−３６３，１９９７）；（ｉｖ）第ＶＩＩａ因子（または第ＶＩＩ因子ポリペプチド）による合成の基質のインビトロでの加水分解を測定すること；あるいは、（ｖ）インビトロ系の中でＴＦ依存性のトロンビンの生成を測定することによって定量され得る。あるいは、ＦＶＩＩ抗原はＥＬＩＳＡによって決定され得る。適しているＥＬＩＳＡは、Ａｓｓａｙ Ｐｒｏ（Ｓｔ Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｍｏ．）カタログ番号ＥＦ１００７−１から入手することができるＡｓｓａｙＭａｘ Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔである。これは、捕捉抗体としてモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩを、そして検出抗体としてビオチニル化ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩを使用する。
【００９６】
天然の（野生型）第ＶＩＩａ因子および／または第ＶＩＩａ因子の変異体についての好ましいインビトロでのタンパク質分解アッセイは、ＵＳ２００７／０２１９１３５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ａ／Ｇ）に記載されているように、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の中で行われる。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む１００μＬの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中の第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）と第Ｘ因子（０．８μＭ）は、１５分間インキュベートされる。その後、第Ｘ因子の切断が、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０μＬの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の添加によって停止させられる。生成された第Ｘａ因子の量は、発色性基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）（最終濃度０．５ｍＭ）の添加によって測定される。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）３４０プレートの中で継続的に測定される。１０分間で生じた吸光度が、ＦＶＩＩａを含まないブランクのウェル中での吸光度の減算の後、変異体第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性と野生型第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性との比を計算するために使用され得る：
比＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子の変異体）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。
【００９７】
このアッセイのバリエーションにおいては、ＦＶＩＩが決定される。トロンボプラスチンが含められる。試料中のＦＶＩＩはＣａ２＋イオンおよび組織因子と複合体を形成し、これは少量のＦＸａを生じる。ＦＸａはＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化させる。
【００９８】
市販されているＦＶＩＩ活性アッセイは、Ａｎｉａｒａ（Ｍａｓｏｎ，ＯＨ）カタログ番号ＡＣＫ０８１Ｋから入手することができるＨＥＭＯＣＬＯＴ ＦＶＩＩ試薬キットである。ここでは、カルシウムトロンボプラスチンによって誘発された凝固が測定される。
【００９９】
野生型第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じであるか改善された生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体には、上記に記載されたような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイのうちの１つ以上において試験された場合に、同じ細胞のタイプの中で生産される第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％を示す変異体が含まれる。野生型第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に低い生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体は、上記に記載されたような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイのうちの１つ以上において試験された場合に、同じ細胞のタイプの中で生産された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、そして最も好ましくは約１％未満を示す変異体である。野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に改変された生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体としては、ＴＦ依存性の第Ｘ因子タンパク質分解活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体、およびＴＦに結合するが第Ｘ因子は切断しない第ＶＩＩ因子の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。第ＶＩＩ因子の変異体には、野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じまたはそれよりも優れた生体活性を示すかどうか、あるいは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に改変されたかまたは低い生体活性を示すかにはかかわらず、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じ生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体の限定ではない例としては、以下が挙げられる：Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｌｉｎｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１８２−１９２，１９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような、高いタンパク質分解安定性を示す第ＶｉＩａ因子の変異体；残基２９０と２９１との間または残基３１５と３１６との間がタンパク質分解的に切断されている第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：５０１−５０５，１９９５）；酸化型の第ＶＩＩａ因子（Ｋｏｒｎｆｅｌｔら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６３：４３−５４，１９９９）；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９に開示されているような第ＶＩＩ因子の変異体；およびＷＯ０２／３８１６２（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されているような高いタンパク質分解安定性を示す第ＶＩＩ因子の変異体；ＷＯ９９／２０７６７（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）に開示されているような、改変されたＧｌａドメインを有しており、高い膜結合を示す第ＶＩＩ因子の変異体；およびＷＯ０１／５８９３５（Ｍａｘｙｇｅｎ ＡｐＳ）に開示されているような第ＶＩＩ因子の変異体。
【０１０１】
野生型第ＶＩＩａ因子と比較して高い生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体の限定ではない例としては、以下が挙げられる：ＷＯ０１／８３７２５、ＷＯ０２／２２７７６、ＷＯ０２／０７７２１８、ＷＯ０３／２７１４７、ＷＯ０３／３７９３２；ＷＯ０２／３８１６２（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されているような第ＶＩＩ因子の変異体；およびＪＰ２００１０６１４７９（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓ Ｉｎｓｔ．）に開示されているような高い活性を持つ第ＶＩＩａ因子の変異体。野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に低いかまたは改変された生物学的活性を有している第ＶＩＩ因子の変異体の限定ではない例としては、以下が挙げられる：ＲＩ ５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄ−ｇｏｏｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６６−７２，１９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：５１５−５２０，１９９８）、およびＧｌａドメインを欠いている第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３１７：２４５−２４９，１９９３）。
【０１０２】
ＦＶＩＩの生産後、ポリペプチドは培地から精製され得る。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの精製には、例えば、抗第ＶＩＩ因子抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１０９７，１９８６；およびＴｈｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７７８５，１９８８を参照のこと）、および第ＸＩＩａ因子またはトリプシン様特異性を有している他のプロテアーゼ（例えば、第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、およびトロンビン）を使用するタンパク質分解的切断による活性化が含まれる。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ，米国特許第４，４５６，５９１号；およびＨｅｄｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６（１９８３）を参照のこと。あるいは、第ＶＩＩ因子は、これをイオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｍｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など）に通すことによって活性化され得る。
【０１０３】
第ＶＩＩ因子または活性化された第ＶＩＩ因子は、公知の方法で処方され、使用され得る。例えば、血友病において出血の処置に使用され得る。
【０１０４】
本発明の方法が第ＶＩＩ因子を生産するために使用される場合は、細胞培養上清が３６．５±０．９℃、好ましくは、３６．５±０．５℃、より好ましくは３６．５±０．２℃．そして最も好ましくは３６．５℃に設定される温度で維持されること、そして／またはｐＨが、７．２０±０．０５、好ましくは７．２０±０．０３、より好ましくは７．２９±０．０１、最も好ましくは、７．２９に設定されること、そして／または細胞培養上清が、１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度、好ましくは４．０％〜９．０％、より好ましくは５．５％〜８．５％の溶存ＣＯ２濃度を有することが好ましい。これらのパラメーターのうちの少なくとも２つ（すなわち、温度とｐＨ、温度とｄＣＯ２、またはｐＨとｄＣＯ２）が好ましい範囲内にあることが好ましい。３つのパラメーターの全てが好ましい範囲内で操作されることが最も好ましい。
【０１０５】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらには決して限定されない。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）
基本的な細胞培養
ＦＶＩＩＩの生産
典型的な培養物は、Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１２３３−１２４２および米国特許第５，２５０，４２１号に記載されている、第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィレブランド因子とを同時に発現するように形質転換された１０Ａ１Ｃ６ ＣＨＯ細胞株のサブクローンを使用して、バイオリアクターの中で確立される。特定のサブクローンを、動物に由来する生成物を含まない標準的な培地への適応と、マイクロプレートの中でのサブクローニングによって得た。
【０１０７】
標準的な培養培地は以下のとおりである：
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ５０／５０ １１．７６ｇ／ｋｇ
これには以下を添加した：
Ｌ−グルタミン ０．６ｇ／ｋｇ
エタノールアミン １．５３ｍｇ／ｋｇ
Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８ ０．２５ｇ／ｋｇ
ＮａＨＣＯ３ ２ｇ／ｋｇ
大豆ペプトン ４ｇ／ｋｇ
ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ １７．０２ｍｇ／ｋｇ 。
【０１０８】
基本のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ５０／５０培地には、４．３ｐｐｂのＣｕ２＋を完全培地に含めるために十分な１．３ｍｇ／ｋｇのＣｕ２＋が含まれる。
【０１０９】
ＡＤＡＭＴＳ−１３の生産
ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を、ＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子を導入するためにリン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。細胞をネオマイシン選択条件下で培養し、メトトレキセートとＧ４１８での処理の後で選択した。無血清への適応後、細胞をサブクローニングし、サブクローン６４０−２を生産用クローン（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｅ）として選択した。
【０１１０】
標準的な培養培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されている培地をベースとする、血清を含まない、インシュリンを含まない、オリゴペプチドを含まない培地である。
【０１１１】
フューリンの生産
ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を、フューリン遺伝子を導入するために、リン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。細胞を、ヒポキサンチン、チミジン、およびグリシンを含まないＤＨＦＲ培地で選択した。生産用クローン４８８−３は、サブクローニングと１００ｎＭのメトトレキセートを含む培地中での選択によって同定し、その後、無血清に適応させた。
【０１１２】
標準的な培養培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されている培地をベースとする、血清を含まない、インシュリンを含まない、オリゴペプチドを含まない培地である。
【０１１３】
ＦＶＩＩの生産
ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を、ＦＶＩＩとＶＫＯＲＣ（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体）を同時発現することができる２シストロン性のベクターでトランスフェクトした。遺伝子発現はＣＭＶプロモーターによって駆動され、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）はＦＶＩＩ遺伝子とＶＫＯＲＣ遺伝子との間に配置されている。細胞を、リン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。選択培地には、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含めた。細胞を無血清条件下でサブクローニングし、高発現サブクローン１Ｅ９を生産用クローンとして選択した。１Ｅ９を、連続培養条件下での増殖、生産性、および安定性に関して有利な特性を有しているとして選択した。安定性は、ケモスタット様式で２ヶ月間評価した。
【０１１４】
標準的な培養培地は、米国特許第６，９３６，４４１号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に開示されている培養培地をベースとし、特に、２．５ｇ／Ｌのダイズペプトンと５ｍｇ／Ｌのインシュリン（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ（登録商標）；Ｅｌｉ ＬｉｌｌｙまたはＮｏｖｏｌｉｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）とを含めた。
【０１１５】
ＦＶＩＩＩの生産に使用した標準的なプロセス
５Ｌの連続培養
培地を、３７℃でＣＯ２インキュベーター（５％〜１５％のＣＯ２）の中で数時間、予め馴化させた。培養物を確立させるために、少なくとも１つの１ｍｌのバイアル（１０７個のＣＨＯ細胞／ｍｌ）を解凍し、細胞を、Ｒｏｕｘフラスコ（２００ｍｌ）中の６０ｍｌの予め馴化させた培地の中に希釈し、そして３７℃でＣＯ２インキュベーター中で培養した。約３日後、６０ｍｌの培養物を、１つのローラーボトル（１．８Ｌ）中の１４０ｍｌの新鮮な培地に添加した。このローラーボトルに１５％のＣＯ２をスパージングし、回転させながら３７℃で培養した。２日後、細胞を１／３に分け、２つのローラーボトルの中で新鮮な培地の中で培養した（２００ｍｌの培地＋１００ｍｌの培養物＝１つのローラーボトルあたり３００ｍｌ）。さらに２日または３日後、細胞を再び１／３に分け、全部で６個のローラーボトルの中で上記のように新鮮な培地の中で培養した。およそ１×１０６細胞／ｍｌの必要な細胞密度に達したら、１８００ｍｌの接種材料を、上記のように予め馴化させた３．２Ｌの培地に接種し、５Ｌのバイオリアクターの中で培養した。標準的な条件下で、５Ｌのバイオリアクターを、ｐＨ７．２、１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度、および３７℃の温度で操作した。標準的な条件下で、培養物に、１０μｍの気泡の大きさを有しているＯ２を、０．２５ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）でスパージングした。
【０１１６】
４０Ｌのバイオリアクター中での接種材料の構築
接種材料のプールは、原則として５Ｌの連続培養に関して上記に記載したように得た。しかし、このプールはおよそ５Ｌであり、６個のローラーボトルからではなく１８個のローラーボトルから得た。ＢＲ−４０バイオリアクターを洗浄し、操作前に滅菌し、そしておよそ８Ｌの培地を、接種前にＢＲ−４０に移した。およそ５Ｌの接種物のプールを、プールタンクからバイオリアクターに、移送ラインを介して、およそ１３Ｌの全培養容量に達するまで移した。細胞密度が≧９×１０５細胞／ｍＬに達したら、培養物を培地で希釈した（１：３）。さらに１〜３日の後、細胞濃度は再び≧９×１０５細胞／ｍＬに達し、３２０Ｌのバイオリアクターへの接種材料の移送を行った。
【０１１７】
３２０Ｌのバイオリアクターの中での増殖
ＢＲ−３２０バイオリアクターを洗浄し、操作前に滅菌し、そしておよそ８０Ｌの培地を、接種の前にＢＲ−３２０に移した。およそ４０Ｌの接種材料を、ＢＲ−４０バイオリアクターからＢＲ−３２０バイオリアクターに、移送ラインを介して、およそ１２０Ｌの最初の培養容量に達するまで移した。細胞密度が≧９×１０５細胞／ｍＬに達したら、培養物を培地で希釈した（１：３）。（全部で）３〜６日の後、細胞濃度は再び≧９×１０５細胞／ｍＬに達し、２５００Ｌのバイオリアクターへの接種材料の移送を行った。
【０１１８】
２５００Ｌのバイオリアクター
構築
およそ３２０Ｌの接種材料を、ＢＲ−３２０からすでにおよそ６３０Ｌの培地を含むＢＲ１バイオリアクターに、移送ラインを介して、およそ９５０Ｌの最初の培養容量に達するまで移した。細胞密度が≧９×１０５細胞／ｍＬに達したら、培養物を、およそ２５００Ｌの最終容量となるように培地で希釈した（〜１：３）。（全部で）４〜７日の後、細胞濃度は再び≧９×１０５細胞／ｍＬに達し、およそ１１５０Ｌの接種材料を、ＢＲ１からおよそ１３５０Ｌの培地を含むＢＲ２バイオリアクターに移した。移送後、およそ１１５０Ｌの培地を、バイオリアクターＢＲ１に、およそ２５００Ｌの最終培養容量に達するまで添加した。
【０１１９】
ケモスタット
「ケモスタット」培養様式は、それぞれのバイオリアクター中での細胞濃度が≧１．２×１０６細胞／ｍＬに達するとすぐに開始した。１日あたりおよそ１２５０Ｌの培地を、それぞれのバイオリアクターに対して連続様式で添加した。細胞濃度は、個々の２５００Ｌのバイオリアクター中で９×１０５細胞／ｍＬ〜１．６×１０６細胞／ｍＬの間とした。およそ１２５０Ｌ／日／バイオリアクターの複数の回収物を、滅菌バッグの中で２℃〜８℃で保存した。培養は、ケモスタット様式で約５０日〜５７日間維持した。標準的な条件下では、ｐＨは７．２に設定し、温度は３７℃に設定し、そして培養物には、１０μｍの気泡の大きさを有しているＯ２を、０．０２ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）をスパージングした。
【０１２０】
同様の培養方法を、ＡＤＡＭＴＳ−１３、フューリン、またはＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞の培養にも適用することができる。
【０１２１】
（実施例２）
ＦＶＩＩＩの生産性に対する様々なパラメーターの変更の影響
実施例１に記載したＦＶＩＩＩとｖＷＦとを発現するＣＨＯ細胞クローンのＦＶＩＩＩ生産性を、様々な培養条件下で決定した。
【０１２２】
別の実験では、ｐＨ、細胞密度、および温度を、５Ｌの規模の連続培養において変化させた。それぞれの場合において、ｐＨ７．１、１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度、および３７℃の対照実験を使用した。
【０１２３】
細胞密度を増大させると、ＦＶＩＩＩの容量生産性（１日あたりの１リットルあたりのＩＵ）は、１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度についての値と比較して、以下のように増大した：
【０１２４】
【表１】
したがって、生産性の実質的な増大は、細胞密度を増大させることによって得ることができた。これは予想できなかった。なぜなら、細胞密度の増大によっては細胞あたりの生産性が低下する可能性があるからである。さらに、特定の細胞密度では、生産性の増大が、細胞密度の増大よりも大きいことが明らかになった。これはさらに驚くべきことであった。
【０１２５】
ｐＨを、スパージングパラメーターを変化させることによって７．２に挙げた。ｐＨ７．１の対照容器の中では、培養物に、１０μｍの気泡の大きさを有しているＯ２を、０．２５ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりのＯ２の容量）でスパージングした。ｐＨ７．２の試験容器の中では、培養物に、１０μｍの気泡の大きさを有している空気を、１．２５ＶＶＨの速度（１時間あたりの培養物の容量あたりの空気の容量）をスパージングした。ｐＨを７．１から７．２に上げることにより、生産性を約１６％増大させることができた。
【０１２６】
温度を３７℃から３６℃に下げることによっては、生産性は約２２％増大した。
【０１２７】
（実施例３）
ＦＶＩＩＩの生産性に対する細胞密度と銅濃度の影響
実施例１に記載したＦＶＩＩＩとｖＷＦとを発現するＣＨＯ細胞クローンのＦＶＩＩＩの生産性を、様々な培養条件下で決定した。
【０１２８】
対照培養物は、ｐＨ７．１、３７℃、４ｐｐｂのＣｕ２＋、および１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で操作した。
【０１２９】
比較用の培養物は、ｐＨ７．２、および３６℃で操作した。１つの培養物の中では、細胞密度を１．６×１０６細胞／ｍｌに増大させ、そして別の培養物の中では、２．０×１０６細胞／ｍｌに増大させた。第３の培養物では、細胞密度は２．０×１０６細胞／ｍｌとし、銅濃度を４ｐｐｂから６ｐｐｂに増大させた。
【０１３０】
結果：温度を下げ、ｐＨを上げ、そして細胞密度を１．６×１０６細胞／ｍｌに増大（１４％の増大）させることにより、ＦＶＩＩＩの生産性は４１％〜５０％高くなった。細胞密度を２．０×１０６細胞／ｍｌ（４３％）にさらに増大させると、生産性は（対照培養物と比較して）３９％〜７７％増大した。２．０×１０６細胞／ｍｌの培養物中の銅を６ｐｐｂに増大させると、生産性は（対照培養物と比較して）４８％〜９８％増大した。
【０１３１】
したがって、ｐＨをわずかに上げ、温度をわずかに上げ、細胞密度をわずか４３％増大させ、そして銅濃度を５０％増大させることにより、ＦＶＩＩＩの生産性をほぼ２倍にすることができる。
【０１３２】
（実施例４）
ｖＷＦの生産性に対する細胞密度と銅濃度の影響
実施例３を繰り返したが、ｖＷＦの容量生産性を測定した。１．６×１０６細胞／ｍｌおよび４ｐｐｂの銅（３６℃、ｐＨ７．２）では、生産性は対照の１２４％であった。２．０×１０６細胞／ｍｌおよび６ｐｐｂの銅では、生産性は１８２％であった。
【０１３３】
したがって、重ねて、生産性の実質的な増大は、このプロセスのパラメーターを一見小さく変化させることによって得ることができる。
【０１３４】
（実施例５）
細胞密度、ｐＨ、およびｄＣＯ２の影響
実施例１に記載したＦＶＩＩＩとｖＷＦとを発現するＣＨＯ細胞クローンのＦＶＩＩＩの生産性を、様々な培養条件下で決定した。
【０１３５】
この実験では、細胞密度を１．４１×１０６細胞／ｍｌから２．０３×１０６細胞／ｍｌに増大させ、ｐＨを７．１から７．２に上げ、そしてｄＣＯ２濃度を９．５％から６．２％に下げた。
【０１３６】
ＦＶＩＩＩの容量生産性（１日あたりの１リットルあたりのＩＵ）は９８％増大し、そしてＦＶＩＩＩの比生産性（１日あたりの細胞１００万個あたりのＩＵ）は３６％増大した。
【０１３７】
（実施例６）
フューリンの生産に対するｐＨと温度の影響
フューリンを発現するＣＨＯ細胞を、ケモスタット様式で２．５Ｌのバイオリアクターの中で培養した。細胞密度は、連続する５日間の間中、個々の培養物について１．５２×１０６細胞／ｍｌ〜１．７８×１０６細胞／ｍｌの間の平均で維持した。溶存酸素は、全ての実験において、２０％の空気飽和度の設定値で制御した。溶存ＣＯ２濃度は、バイオリアクターの上部空間にＣＯ２を重層することによって、５％〜６％の間で維持した。
【０１３８】
「実験方法の設計」によって、フューリンの最大容量生産性を生じる条件を確定するために、様々な温度を様々なｐＨ値と組み合わせた。５種類の温度を、「Ｄｏｅｈｌｅｒｔ Ｍａｔｒｉｘ」にしたがって３種類のｐＨ値と組み合わせ、これによって以下のような温度とｐＨの７つの組み合わせが得られた：
【０１３９】
【表２】
３６．５℃とｐＨ７．２０との組み合わせを、２つの醗酵ロット（上の表の４と５）に適用した中心点として選択した。
【０１４０】
容量生産性と比生産性、および増殖速度を含むデータを、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウェアを使用してＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）によって統計学的に分析した。
【０１４１】
ｐＨではなく温度が増殖速度に有意な影響を与え、増殖速度についての最大は３６．５℃で起こった。温度を３７℃から３５．１℃に下げることにより、容量生産性を、およそ２．７倍に増大させることができた。同様の傾向は比生産性についても見られた。これは、最大の容量生産性は、増殖速度が最大である温度で観察されるであろうと予想していたので、驚くべき結果であった。比生産性および容量生産性に対するｐＨの影響は、７．２０＋／−０．１の研究した範囲では小さかった。わずかに高い生産性が、７．１５＋／−０．０５（または７．１０から７．２０の間）の低いｐＨ範囲で観察され、したがって、ｐＨ７．１５をフューリンの生産についての設定値として選択した。
【０１４２】
（実施例７）
フューリンの生産に対するｄＣＯ２の影響
２種類の醗酵操作を、２．５Ｌのバイオリアクターの中でケモスタット様式で平行して行った。一方は、およそ７．５％のＣＯ２濃度で操作し、そして他方はおよそ１２％のＣＯ２濃度で操作した。ＣＯ２濃度は、上部空間を流れるＣＯ２の割合を変化させることによって調整した。醗酵は、３７℃、７．１５のｐＨで、そして２０％のｐＯ２を用いて行った。細胞数は、高ＣＯ２培養物中では１２日間にわたり、およそ１．０７×１０６細胞／ｍｌとし、そして低ＣＯ２培養物中では１．４９×１０６細胞／ｍｌとした。
【０１４３】
ＣＯ２濃度を１２％から７．５％に下げることにより、容量生産性についてはおよそ２．７８倍の増大の効果が、そして比生産性については２倍の効果があった。細胞増殖速度もまた、低ＣＯ２培養物中で高かった。
【０１４４】
（実施例８）
ＦＶＩＩの生産に対するｐＨと温度の影響
ＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞を、ケモスタット様式で２．５Ｌのバイオリアクターの中で培養した。ここでは、細胞密度は、連続する４週間にわたり、それぞれの培養物について約２．５×１０６細胞／ｍｌ（２×１０６細胞／ｍｌと３×１０６細胞／ｍｌとの間）の平均で維持した。溶存酸素は、全ての実験において２０％の空気飽和の設定値で制御した。溶存ＣＯ２濃度は、バイオリアクターの上部空間にＣＯ２を重層することによって、４％〜７％の間で維持した。
【０１４５】
「実験方法の設計」によって、ＦＶＩＩの最大容量生産性を生じる条件を確定するために、様々な温度を様々なｐＨ値と組み合わせた。３種類の温度を、「Ｄｏｅｈｌｅｒｔ Ｍａｔｒｉｘ」にしたがって３種類のｐＨ値と組み合わせ、これによって以下のような温度とｐＨとの５つの組み合わせが得られた：
【０１４６】
【表３】
平均の最大の容量速度論的生産性には、３６．５℃、および７．２０のｐＨ設定値で到達した。パラメーターの間にはポジティブな相互作用があり、結果として、両方のパラメーターを最適化した結果は、個々のパラメーターを個別に最適化した効果を組み合わせたよりも大きかった。
【０１４７】
（実施例９）
ＦＶＩＩの生産に対するｄＣＯ２の影響
４種類の異なるＣＯ２濃度（５．０％、６．３％、７．６％、および８．９％）のＦＶＩＩの生産性に対する効果を、小規模の連続培養において試験した。
【０１４８】
細胞を、ケモスタットまで８日間培養し、その後、２．５ＬのＲｕｓｈｔｏｎバイオリアクターに移し、ｐＨ７．２０および３６．５℃での連続条件下でおよそ４週間培養した。最初の１週間の間に、様々なＣＯ２濃度に平衡化させる必要があったので、最後の３週間だけのデータを分析した。ＣＯ２濃度は、オフライン測定と、バイオリアクターの上部空間へのＣＯ２の添加によって制御した。
【０１４９】
記録した細胞密度は、８．９％のＣＯ２濃度での２．３６×１０６細胞／ｍｌから、５．０％のＣＯ２濃度での２．８７×１０６細胞／ｍｌにまで変化した。同じ範囲について増殖速度は、０．４２ｄ−１および０．４９ｄ−１であった。低いＣＯ２濃度での高い比増殖速度は、高い比生産性と関係していた。増殖速度と比生産性に対するＣＯ２の複合作用により、容量生産性に対する実質的な効果が生じた。
【０１５０】
８．９％から５％にＣＯ２濃度を下げることにより、比増殖速度は１７％、比生産性は１０％、そして容量力学的生産性は３５％増大した。
【０１５１】
（実施例１０）
ＡＤＡＭＴＳ−１３の生産に対する温度とｐＨの影響
組み換え体ＡＤＡＭＴＳ−１３を発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１．５Ｌのバイオリアクターの中でケモスタット培養で培養した。
【０１５２】
最初の実験では、ｐＨと温度を、３６℃から３８℃と、ｐＨ７．１０から７．３０の範囲にある様々な設定値に設定した。定常状態に由来する試料を、細胞数とＥＬＩＳＡによるＡＤＡＭＴＳ−１３の発現について分析し、ケモスタット培養による希釈速度を、増殖速度とＡＤＡＭＴＳ−１３の容量発現を計算するために測定した。最適値が設計空間の外側の範囲にあることが明らかになったので、第２の実験を、３５℃から３７℃までの温度範囲、そしてｐＨ７．０５から７．１５で設定し、データを定常状態から分析した。細胞密度は、１．１７〜１．７１×１０６細胞／ｍｌの範囲であった。ＣＯ２を、４％〜６％の溶存ＣＯ２濃度に達するように、上部空間にＣＯ２を重層することによって制御した。
【０１５３】
両方の実験によるデータを標準化し、統計ソフトウェアＭｉｎｉｔａｂを使用して分析した。
【０１５４】
比増殖速度は、ｐＨ７．１３および３６．０℃にその最適値があることを、ｐＨと温度についての二次モデルを使用して明らかにした。増殖速度に対する温度の影響は弱かった。
【０１５５】
容量生産性は、ｐＨ７．１５および３６．０℃にその最適値があることが明らかになった。増殖速度に対する温度の影響は弱いにもかかわらず、温度は、容量生産性に対しては比較的強い影響があった。
【０１５６】
３７℃の定温と仮定すると、７．１０から７．１５にｐＨを上げることの効果は、容量生産性の１０％の増大であった。７．１０の一定のｐＨを仮定すると、温度を３７℃から３６℃に下げることの効果は、容量生産性の１４％の増大であった。ｐＨ７．１０および３７℃の温度から、ｐＨ７．１５および３６℃の温度に条件を変化させることの全体的な効果は、容量生産性の２４％の増大であった。
【０１５７】
本明細書中で引用された全ての参考文献の内容は、参照することにより含められる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持され、ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし該温度は３７℃未満に設定される、方法。
【請求項２】
前記温度が３６±０．９℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度が３６±０．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記温度が３６±０．２℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記温度が３６℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記温度が３５．１±０．９℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度が３５．１±０．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記温度が３５．１±０．２℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が３５．１℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度が３６．５±０．９℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度が３６．５±０．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記温度が３６．５±０．２℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記温度が３６．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清は、Ｘ±０．０５に設定されるｐＨで維持され、ここではＸは、７．１５から７．２０までの値を有し、ただし該ｐＨは７．１０より大きく設定される、方法。
【請求項１５】
前記ｐＨが７．２０±０．０５に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＨが７．２０±０．０３に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｐＨが７．２０±０．０１に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＨが７．２０に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐＨが７．１５±０．０５に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｐＨが７．１５±０．０３に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐＨが７．１５±０．０１に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｐＨが７．１５に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清が１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度を有する、方法。
【請求項２４】
前記ＣＯ２濃度が４．０％〜９．０％である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＯ２濃度が５．５％〜８．５％である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞培養上清が、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持され、ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし該温度は３７℃未満に設定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度が３６±０．９℃に設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度が３５．１±０．９℃に設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記温度が３６．５±０．９℃に設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞培養上清が、Ｘ±０．５に設定されるｐＨで維持され、ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有し、ただし該ｐＨは７．１０より大きく設定される、請求項１、２３、または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞培養上清が重炭酸塩で緩衝化される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記上清に空気がスパージングされる、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞密度が１．０×１０６細胞／ｍｌ〜５．０×１０６細胞／ｍｌである、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞密度が１．０×１０６細胞／ｍｌ〜３．５×１０６細胞／ｍｌである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞密度が１．４×１０６細胞／ｍｌ〜２．８×１０６細胞／ｍｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞密度が１．６×１０６細胞／ｍｌ〜２．６×１０６細胞／ｍｌである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞密度が１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記異種タンパク質が血中タンパク質である、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記血中タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項２、１５、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第ＶＩＩＩ因子がフォン・ヴィレブランド因子と同時に発現させられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞培養上清中でのＣｕ２＋の濃度が少なくとも５ｐｐｂである、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｃｕ２濃度が少なくとも７ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１５ｐｐｂ、または２５ｐｐｂである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記血中タンパク質がＡＤＡＭＴＳ−１３である、請求項２、１９、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記血中タンパク質がフューリンである、請求項６、１９、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記血中タンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項１０、１５、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞のような齧歯類の細胞である、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記培養がバッチ培養である、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記培養が流加培養である、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記培養が連続培養であり、特に、反復バッチ培養、ケモスタット培養、またはタービドスタット培養である、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
第ＶＩＩＩ因子を分泌する哺乳動物細胞を細胞培養上清を含む容器中で培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清中の細胞の密度はインラインセンサーによって測定され、該容器への新鮮な培地の流入は、所望される範囲内に細胞の密度を維持するように自動的に制御される、方法。
【請求項５１】
前記細胞密度が少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌである、請求項５０に記載の方法。
【請求項１】
細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持され、ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし該温度は３７℃未満に設定される、方法。
【請求項２】
前記温度が３６±０．９℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度が３６±０．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記温度が３６±０．２℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記温度が３６℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記温度が３５．１±０．９℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度が３５．１±０．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記温度が３５．１±０．２℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が３５．１℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度が３６．５±０．９℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度が３６．５±０．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記温度が３６．５±０．２℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記温度が３６．５℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清は、Ｘ±０．０５に設定されるｐＨで維持され、ここではＸは、７．１５から７．２０までの値を有し、ただし該ｐＨは７．１０より大きく設定される、方法。
【請求項１５】
前記ｐＨが７．２０±０．０５に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＨが７．２０±０．０３に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｐＨが７．２０±０．０１に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＨが７．２０に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐＨが７．１５±０．０５に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｐＨが７．１５±０．０３に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐＨが７．１５±０．０１に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｐＨが７．１５に設定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清が１％〜１０％の溶存ＣＯ２濃度を有する、方法。
【請求項２４】
前記ＣＯ２濃度が４．０％〜９．０％である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＯ２濃度が５．５％〜８．５％である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞培養上清が、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持され、ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし該温度は３７℃未満に設定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度が３６±０．９℃に設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度が３５．１±０．９℃に設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記温度が３６．５±０．９℃に設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞培養上清が、Ｘ±０．５に設定されるｐＨで維持され、ここでは、Ｘは７．１５から７．２０までの値を有し、ただし該ｐＨは７．１０より大きく設定される、請求項１、２３、または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞培養上清が重炭酸塩で緩衝化される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記上清に空気がスパージングされる、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞密度が１．０×１０６細胞／ｍｌ〜５．０×１０６細胞／ｍｌである、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞密度が１．０×１０６細胞／ｍｌ〜３．５×１０６細胞／ｍｌである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞密度が１．４×１０６細胞／ｍｌ〜２．８×１０６細胞／ｍｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞密度が１．６×１０６細胞／ｍｌ〜２．６×１０６細胞／ｍｌである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞密度が１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記異種タンパク質が血中タンパク質である、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記血中タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項２、１５、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第ＶＩＩＩ因子がフォン・ヴィレブランド因子と同時に発現させられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞培養上清中でのＣｕ２＋の濃度が少なくとも５ｐｐｂである、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｃｕ２濃度が少なくとも７ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１５ｐｐｂ、または２５ｐｐｂである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記血中タンパク質がＡＤＡＭＴＳ−１３である、請求項２、１９、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記血中タンパク質がフューリンである、請求項６、１９、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記血中タンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項１０、１５、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞のような齧歯類の細胞である、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記培養がバッチ培養である、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記培養が流加培養である、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記培養が連続培養であり、特に、反復バッチ培養、ケモスタット培養、またはタービドスタット培養である、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
第ＶＩＩＩ因子を分泌する哺乳動物細胞を細胞培養上清を含む容器中で培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清中の細胞の密度はインラインセンサーによって測定され、該容器への新鮮な培地の流入は、所望される範囲内に細胞の密度を維持するように自動的に制御される、方法。
【請求項５１】
前記細胞密度が少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌである、請求項５０に記載の方法。
【公表番号】特表２０１１−５０７５５１（Ｐ２０１１−５０７５５１Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４０８４４（Ｐ２０１０−５４０８４４）
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８８０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６３０９
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８８０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６３０９
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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