細胞培養装置
【課題】自動培養のための培養容器自身を閉鎖系構造とし、内部は滅菌処理可能で、外部から駆動力を供給して細胞を培養する細胞培養装置を提供する。
【解決手段】モジュールごとの閉鎖系流路構成と、駆動ベースを中心とした機器の配置、冷蔵庫と細胞培養室との間にある中間室を用いる。すなわち、自動培養装置１０は、培地と細胞液を送る複数の流路４０と、第一空間内に配置され、ポンプ２３、弁２４、タンク２５が設置された駆動ベース２７と、駆動ベースと流路を介して接続される培養容器２０と、第一空間に対する第二象限に配置され、培養容器が設置される培養容器ベース２１と、培地と細胞液を冷蔵する冷蔵庫１４と、駆動ベースの下方で第一空間に対する第四象限に位置し、内部に設置される冷蔵庫１４と細胞培養室１３とを仕切る中間室１６を備える。
【解決手段】モジュールごとの閉鎖系流路構成と、駆動ベースを中心とした機器の配置、冷蔵庫と細胞培養室との間にある中間室を用いる。すなわち、自動培養装置１０は、培地と細胞液を送る複数の流路４０と、第一空間内に配置され、ポンプ２３、弁２４、タンク２５が設置された駆動ベース２７と、駆動ベースと流路を介して接続される培養容器２０と、第一空間に対する第二象限に配置され、培養容器が設置される培養容器ベース２１と、培地と細胞液を冷蔵する冷蔵庫１４と、駆動ベースの下方で第一空間に対する第四象限に位置し、内部に設置される冷蔵庫１４と細胞培養室１３とを仕切る中間室１６を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する細胞培養装置に係り、特に無菌的なクリーン度で効率よく細胞を培養する自動培養技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養の作業は限りなく除菌されたクリーンルームの中で、厳格な製造工程の下で熟練された作業者の手作業により行われていた。そのため産業化に向けて細胞を大量に培養する場合、作業者の負担の増加と作業者への教育・育成に必要な時間とコスト、人為的なミスや検体の取り違え、さらに菌などを保有するヒトによる生物学的汚染（コンタミネーション）等が生じる可能性があり、それらの対策に多くのコストを要する。そのことが細胞大量培養の産業化において大きな壁となっている。
【０００３】
そのため、機器により一連の培養作業を自動化することで、それら問題点を解決させることが期待されている。そこで、現在は多関節型ロボットマニピュレータを用いて、人手の培養作業を模倣する自動培養装置が主に開発されている。しかし、人手での培養作業は煩雑な動作によってなされる。そのような培養装置では、人手と同等もしくは単純化し、如何に無菌的に培養容器や培養液のハンドリングを実施する必要がある。
【０００４】
このために、例えば特許文献１は、多関節型ロボットマニピュレータにより培養容器の搬送操作や培地交換等を処理する例を提供している。この多関節型ロボットマニピュレータにおいては、それ自身を滅菌することが可能な構成を提示している。
【０００５】
また、例えば特許文献２は培養容器と流路自身を密閉系にして処理する方式を提供している。これは、軟骨細胞に高い圧力をかけて培養する装置で、培養容器や流路内を密閉系にして、培養終了後に外気に触れないよう培養容器と一部栓をした流路を取りだす方式で、無菌的に生成した軟骨組織を回収する手段を備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４９２６８号公報
【特許文献２】特開２００２−３１５５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載のような自動培養装置においては、培養容器自身が開放系であるために、フタをあけて培養容器内部を開放する動作が必要となる。そのため、自動培養装置内部の清浄性を保持するため空調機器の大型化を伴う。それにより全体システムが大きくなり、コストがかかる課題がある。
【０００８】
特許文献２のような自動培養装置においては、密閉系であるために、内部の無菌性を保持したまま流路を取り付け、かつ培地（培養液）や細胞（細胞懸濁液）を流路内に注入するかが課題である。また、複雑な培養作業を実施する際に、その密閉した流路を装置へ容易に設置ができ、かつ効率的に駆動力を与えるかが課題である。
【０００９】
現在、ヒト細胞を使用し、培養で作成した細胞や組織をヒトへ移植する再生医療では、手術室で採取した組織を無菌処理した試験管等に入れて、内部が無菌的状態で運び出し、適正製造基準（GMP：Good Manufacturing Practice）に準拠したクリーンルーム（CPC: Cell Processing Center）内で組織から必要な細胞を単離し、目的の調整を実施して培養する。採取された細胞が製造工程内で一切の汚染なく培養するために、とりわけ厳格なレギュレーションに適合した工程、環境下で人手により製造しなければならない。細胞の培養処理を機械により自動的におこなう自動培養装置においても、その装置で製造した細胞もしくは組織は、製造工程内で一切の菌やウィルス等による生物学的汚染があってはならない。そのような状況下で、上述の開放系培養容器を使用した自動培養装置のシステムをかんがみると、自動培養装置内部を滅菌し、内部を高度なクリーン環境の保持を可能にするには、巨大な空調設備と滅菌設備を要し、その設備自身の製造コストと維持コストが必要となる。また滅菌処理の際にはモーター類の駆動系が耐えられない。
【００１０】
そこで、自動培養のための培養容器自身を閉鎖系構造とし、その内部は滅菌処理可能で、外部から駆動力を供給して細胞を培養するシステムが好ましい。しかし、閉鎖系構造の培養容器で培養するためには、その内部へ無菌的に培地や細胞を入れ、培養処理を実施する機構と制御方法を如何に効率化するかが課題である。
【００１１】
本発明の目的は、上記の課題を解決するために、細胞等を用いて組織をつくることのできる適正製造基準の準拠を目指した細胞培養装置、更には要素機器と閉鎖系流路の構成と省スペース配置、流路のための無菌的な送液機構を備えた細胞培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するため、本発明においては、培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、培地と細胞を送る複数の流路と、第一空間内に配置される駆動ベースと、駆動ベースと流路を介して接続される培養容器と、培養容器を保持する保持部材と、駆動ベースよりも下方に形成され、冷蔵空間を形成する冷蔵部と、第一空間と冷蔵空間を仕切る中間室とを備える構成の細胞培養装置を提供する。
【００１３】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を培養する細胞培養装置であって、培地と細胞液を送る複数の流路と、第一空間内に配置される駆動ベースと、駆動ベースと流路を介して接続される培養容器と、第一空間に対する第二象限に配置され、培養容器が設置される培養容器ベースと、培地と細胞液を冷蔵する冷蔵部と、駆動ベースよりも下方であって、第一空間に対する第四象限に位置し、その内部に設置される冷蔵部と第一空間とを仕切る中間室を備える構成の細胞培養装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、培養容器を有する閉鎖系流路の設置容易性を備え、細胞を適正製造基準レベルの無菌的なクリーン度で無菌的に効率よく培養する細胞培養装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第一の実施例に係る、駆動ベースを設置した自動培養装置の全体概略構成を示す図である。
【図２】第一の実施例に係る、扉を開けた自動培養装置を示す正面図である。
【図３】第一の実施例に係る、自動培養装置の内部を示す側面図である。
【図４Ａ】第一の実施例に係る、ツメにシール機構を接続前の状態を示す構成図である。
【図４Ｂ】第一の実施例に係る、ツメにシールを接続後の状態を示す構成図である。
【図５】第一の実施例に係る、流路を駆動ベースに設置した状態を示す上面構成図である。
【図６】第一の実施例に係る、タンクの構成を示す側面図である。
【図７Ａ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続する前の状態を示す上面図である。
【図７Ｂ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続した後の状態を示す上面図である。
【図７Ｃ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続する前の状態を示す側面図である。
【図７Ｄ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続している状態を示す側面図である。
【図７Ｅ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続した後の状態を示す側面図である。
【図８Ａ】第一の実施例に係る、搬送治具に載った状態で細胞バッグへ細胞懸濁液を注入していない状態を示した側面構成図である。
【図８Ｂ】第一の実施例に係る、搬送治具に載った状態で細胞バッグへ細胞懸濁液を注入している状態を示した側面構成図である。
【図９】第一の実施例に係る、自動培養装置全体の制御の構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、添付図面を参照して本発明の一実施例について説明するが、本発明の実施例を詳細に説明する前に、本発明を概説すると以下の通りである。
【００１７】
すなわち、自動培養装置の最も好適な態様においては、閉鎖系流路とその閉鎖系流路内の送液のための駆動ベースと呼ぶ機構を用いて、装置内部の冷蔵室内（４℃程度）にある細胞液や培地を、培養室内（３７℃程度）で温めて、培養容器内細胞培養空間に供給する。そのため、閉鎖系流路は主に３つのモジュールから構成した。５℃で冷蔵保存が必要な細胞液や培地、洗浄液や廃液等による培地モジュールと、それら液体をポンプで培養室内へ送液して、タンクで３７℃まで温める駆動モジュール、細胞液や培地をタンクから培養容器内部の培養空間へ送り培養処理をおこなう培養容器モジュールである。培養容器モジュール周辺には顕微鏡があり、培養面の細胞を撮像できる。各モジュールは各々ベースと呼ぶ、一部に駆動機構を有する保持具に設置する。このベースを脱着可能な搬送治具により、閉鎖系流路は一体で培養装置内部から出入できる。自動培養装置の内部は培養室と冷蔵室、その中間室からなり、各々に扉がある。冷蔵室はおよそ４℃を保持し、培養室内部は３７℃、５％二酸化炭素濃度、湿度100％に近い状態を保持する。冷蔵室内に細胞懸濁液や培地、洗浄液と廃液入れ、逆止弁がついた廃液回収口を有する。全く環境の異なる培養室内部と冷蔵室内部それぞれが直接接続して結露と温度ムラが発生しないように、間に中間室を設けることで、送液用のチューブ以外はゴム栓等のシールで区域を分けられる。また中間室にはフィルタ付ファンが設けられ、自動培養装置外部の環境を保持することが可能である。これにより、同一装置内に全く異なる環境であるが細胞にとって最良の環境を設置でき、省スペース化が可能となる。
【００１８】
また、ベースを搬送治具にて安全キャビネット（もしくはクリーンベンチ）近くへ移動し、内部が滅菌済みの閉鎖系流路内の空のバッグを消毒して安全キャビネット内部に入れ、細胞懸濁液（もしくは、培地や洗浄液など）をバッグ内部に注入して、注入口をシールすることで、閉鎖系流路外部の環境を問わず、閉鎖系流路内部は無菌状態を保持することができる。本発明の方式では、その閉鎖系流路をベースごと自動培養装置に入れると、駆動機構は閉鎖系流路外部に設置してあるため、自動培養装置の設置場所を問わず、閉鎖系流路内部は無菌状態を保持しながら、細胞播種、培地交換、顕微鏡観察、検査のための廃液回収といった自動細胞培養作業の実施を可能にできる。
【００１９】
さらなる本発明の特徴は、添付図面を用いて具体的に説明する以下の実施例によって明らかになるものである。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【実施例１】
【００２０】
図１は、第一の実施例に係る自動培養装置１０の全体概略図である。図２は自動培養装置１０の正面図である。図３は自動培養装置１０の側面図である。図４Ａ及び４Ｂは細胞培養室１３と冷蔵庫１４間のシール３３に関する概略図である。図５は流路４０の構成に関する概略図である。図６は流路４０の構成部品の一つであるタンク２５に関する概略図である。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、及び７Ｅは流路４０の構成部品の一つであるポンプ２３に関する概略図である。図８Ａ，及び８Ｂは流路４０内へ無菌的な細胞液や培地の供給に関する概略図である。図９は自動培養装置１０を動作させるための回路を示すブロック図である。
【００２１】
＜自動培養装置の構成＞
図１、図２、図３及び図４Ａ、図４Ｂを用いて、自動培養装置１０の全体構成について説明する。自動培養装置１０は基本的な構成要素として、細胞培養室１３、冷蔵庫１４、制御部１５、中間室１６によって構成されている。以下、それぞれの基本構成について説明する。
【００２２】
図１に示されるように、自動培養装置１０全体は細胞培養室１３、冷蔵部を構成する冷蔵庫１４、制御部１５、中間室１６の４区画によって構成されており、細胞培養室扉１１と冷蔵庫扉１２、中間室扉１７を開けることで自動培養装置１０内部とアクセスすることが可能である。細胞培養室１３には、培養容器２０を保持、設置する保持部材である培養容器ベース２１とそれに接続して回転する回転機構２２、培養容器２０内の細胞画像を撮像する顕微鏡２８とそのステージ２９、ポンプ２３や弁２４といった駆動機構を有してタンク２６を含む閉鎖系構造の流路４０と接続する駆動ベース２７で構成している。さらに内部の駆動機構全てに接続して制御部１５と配線するコネクタボード３０がある。なお、制御部１５とコネクタボード３０間の配線は図示を省略した。細胞培養時には、細胞培養室１３内部は温度３７℃、湿度１００％、５％二酸化炭素に近い環境を保持する。ただし、必要に応じて培養容器２０を含む周辺部分だけ前述の環境を保持する構造とすることができる。冷蔵庫１４には培地ベース３２を入れることができ、細胞培養室１３、冷蔵庫１４、中間室１６の３区画を独立したまま流路４０のチューブ４１のみ通すシール３３で、細胞培養室１３と冷蔵室１４内部の温度を保持して結露を防止することを可能にする。中間室１６にはフィルタ５１付ファン５０がある。フィルタ５１は排気口に設置される。このファン５０による気流の動きを起し湿度上昇を防止することができる。また、後で詳細に説明する中間室１６の入り口には、細胞培養室１３内部と冷蔵庫１４内部を遮断し、培養液だけ流すシール機構が用いられる。
【００２３】
制御部１５は他の区画から独立しており、細胞培養質１３や中間室１６の下方に設置される。これにより、細胞培養室１３内の温度、湿度、二酸化炭素を遮断して、内部の電気機器類を保護している。制御部１５には、ファン５２があり吸気用フィルタ５３と排気用フィルタ５４で無菌的に内部の熱を外部に逃がすことを可能にする。ファン５２とフィルタ５３、５４で制御部１５の冷却部を構成していることになる。５７は制御部１５の制御用パネルであり、通常の操作パネル同様、各種ボタンや表示部などを備えており、制御部１５の操作に用いる。制御部１５は、図示を省略した処理部である中央処理部（ＣＰＵ）や、制御プログラムやデータを記憶する記憶部であるメモリ等で構成されることはいうまでもない。
【００２４】
図２に細胞培養室扉１１、冷蔵庫扉１２を開けた状態の自動培養装置１０の正面からみた各要素機器の配置を示している。細胞培養室１３内部の駆動ベース２７を中心として、水平方向に、回転を可能とした培養容器２０、垂直方向に、細胞液や培地が入った培地ベース３２を設置できる冷蔵庫１４により構成している。同図や図１から明らかなように、本実施例の自動培養装置１０においては、駆動ベース２７が設置される空間（第一空間）を第一象限とすると、第一空間と冷蔵部である冷蔵庫１４とを仕切る中間室１６が第四象限に、培養容器２０が保持、戴置される保持部材である培養容器ベース２１が第二象限、あるいは回転により第三象限に位置することになる。本実施例の配置構成により、省スペースで、各機器間距離が短い構成となり、第四象限に位置する冷蔵庫１４で４℃前後に保存した培地を、第一象限に位置する駆動ベース２７上のタンク２５で温めて、素早く第二象限に位置する培養空間へ供給することができ、移動による細胞のダメージを最小にすることができる。
【００２５】
さて、図２に見るように、細胞を撮像する顕微鏡２８は正面から見て第二象限に位置する培養容器２０から鉛直方向に構成している。顕微鏡２８は、移動やピント合わせのためのステージ２９に固定している。これらの配置に関しては、第一象限に位置する駆動ベース２７を中心として、全て水平方向に配置や全て鉛直方向に配置なども可能とするが、培養する細胞に応じて最適な配置を選択することができる。冷蔵庫１４は、第四象限に位置する中間室１６内部にあり、シール３３により各々の区間を切り離しているため、流路４０内部以外は細胞培養室１３と空間が分離している。この構成については図３で詳細を記載したので後で説明する。
【００２６】
駆動ベース２７には流路４０内の送液をするポンプ２３、送液の回路を切り替える弁２４、培地等をためて温めや液の流れ方向を変えるタンク２５といった駆動機構が配置している。これについては詳細を後述する。駆動機構を動作させるため、駆動ベース２７背面にコネクタボード３０があり、駆動ベース２７のコネクタ３１に接続できる。コネクタボード３０から制御部１５へ配線できる。その際、コネクタボード３０は細胞培養室１３内部の環境を保持したまま、コネクタ３１配線を外部の制御部１５と接続するため、断熱・防水構造を有している。本図で制御部１５は細胞培養室１３の鉛直方向に記載しているが、例えば卓上で使用する際には水平方向に設置や、余剰空間に設置してもよい。
【００２７】
図３に自動培養装置１０の側面からみた各要素機器の配置を示している。温度、湿度といった環境が全く異なる細胞培養室１３と冷蔵庫１４を同一装置内に配置して、流路４０をつなげるため、中間室１６とシール３３を設置した。細胞培養室１３は一般的に37℃、100％湿度を有しており、冷蔵庫１４は一般的に内部を4〜5℃で保持しているため、細胞培養室１３直近に設置すると結露を発生し、また細胞培養室１３内部の温度ムラを生じる。一般的なインキュベーター（細胞培養室）や冷蔵庫は室温や室内の湿度で使用することを想定して設計している。そこで、室内の環境を保持する中間室１６を冷蔵庫１４と細胞培養室１３の間に設けることで、急激な温度変化による結露の発生を防止する。しかし、冷蔵庫１４内の培地や洗浄液、細胞懸濁液は流路４０を構成するチューブ４１を通して細胞培養室１３内へ送液可能としたい。
【００２８】
そこで、図４Ａ、図４Ｂに示すようなシール３３の溝４２にチューブ４１を通して、ツメ３４にはめ込むことで冷蔵庫１４、中間室１６、細胞培養室１３の空間を分離して、培地や洗浄液、細胞懸濁液を冷蔵庫１４から細胞培養室１３へ送液可能になる。ツメ３４は、細胞培養装置１３と中間室１６を仕切る壁１３Ａと、冷蔵庫１４と中間室１６とを仕切る壁１４Ａにそれぞれ設けられる。
【００２９】
図３において、冷蔵庫１４にはその内部を冷却するための冷却器１８がある。これは冷却した分の熱を冷蔵庫１４外部へ排出する。中間室１４内部の温度が上昇しないようにするため、ファン５０で自動培養装置１０外部からフィルタ５１を通した空気を吸入して冷却器１８に当て、またフィルタ５１を通して自動培養装置１０外部へ放出する構成とした。すなわち、冷却器１８とファン５０、更にはフィルタ５１で中間室の冷却部が構成されることとなる。
【００３０】
図３の矢印５５で空気の流れを示した。これにより中間室１６内部の気温と湿度は自動培養装置１０外部と同じ状態を保持できる。制御部１５内部はコンピューターや電源等発熱するものが多く存在し、内部の熱を放出しなければならない。制御部１５内部にホコリが入らないように吸気用フィルタ５３を通してファン５２で制御部１５外部の空気を入れ、また排気用フィルタ５４を通して制御部１５外部に戻す。空気の流れ５６を図３の矢印に示した。これにより例えばクリーンルームの清浄区域で、ホコリなどをまき散らすことを防止して、清浄度を維持可能である。
【００３１】
＜流路と駆動ベースの構成＞
図５、図６、及び図７Ａ−７Ｅを用いて、流路４０の構成とその駆動方法について説明する。図５は流路４０と駆動ベース２７の全体構成を示した概略図である。図６はタンク２５の構成を示した正面図である。図７Ａはシリンジ４３とポンプ２３が分離した状態の上面図を示し、図７Ｂはシリンジ４３とポンプ２３が一体になった状態の上面図を示し、図７Ｃはシリンジ４３とポンプ２３が分離した状態の側面図を示し、図７Ｄはシリンジ４３をポンプ２３にセットしている状態の側面図を示し、図７Ｅはシリンジ４３とポンプ２３が一体でシリンジポンプ４４となった状態の側面図を示している。シリンジ４３は同一軸上を並進することができる。
【００３２】
まず、図５にて閉鎖系構造の流路４０の構成について説明する。流路４０は、交換可能な、チューブ４１、培養容器２０、シリンジ４３、フィルタ４５、フィッティング４６、タンク２５、細胞バッグ６０、培地バッグ６１、洗浄液バッグ６２、廃液バッグ６３、回収バッグ６４から構成している。その流路４０は駆動機構である流れの方向を変える弁２４、送液を行うポンプ２３、第二象限に位置する水平方向から、第三象限に位置する垂直方向へ回転して培養容器２０内の気泡を排除する回転機構２２と接続することで、培養容器２０内へ細胞液や培地の送液による細胞播種と培地交換、洗浄液による流路洗浄をおこなうことが可能になる。ここで、培養容器２０が設置される培養容器ベース２２の第二象限から第三象限への回転とは、図２に見る水平位置から培養容器ベースを回転機構２２により、反時計方向回りに下方に回転させることで実現できる。
【００３３】
駆動機構は駆動ベース２７に配置しており、湿度等にさらすことのできない配線や機構は全て駆動ベース２７内部に入れて、高湿度環境に設置できる。制御部１５と接続するため、駆動ベース２７には防水対応のコネクタ３１があり、駆動ベース２７を自動培養装置１０内部へ設置した際にこのコネクタ３１と接続することで、駆動機構を動作させることができる。流路４０の配置については、タンク２５を中心として、培養容器２０へ送液する培養容器モジュール３５、冷蔵庫１４内の培地類をタンク２５へ送液する培地モジュール３６、流路４０内部の送液をするため気体の流れ（方向、流速）を制御するポンプモジュール３７、の独立した３つのモジュールに分けられる。このモジュール化により、駆動機構の最適な配置と流路の設置容易性を向上できる。
【００３４】
図６により、モジュールの中心となるタンク２５の構成について説明する。タンク２５には培養容器２０に対して、注入タンク６５と廃液タンク６６がある。また、高さに応じて役割の異なるフィッティング４６がある。下から第１のフィッティング６７、第２のフィッティング６８、第３のフィッティング６９に分かれている。第１のフィッティング６７は注入タンク６５側が培養容器２０への送液、廃液タンク６６側は廃液バッグ６３や回収バッグ６４への送液口である。第２のフィッティング６８は注入タンク６５側が培地モジュール３６から送られた細胞懸濁液や培地、洗浄液を注入タンク６５内部への注入口で、廃液タンク６６側が培養容器２０からの廃液を廃液タンク６５内部への注入口である。タンク２５内に入りうる液体は全てこの第２のフィッティング６８に到達しない容量とする。第３のフィッティング６９はポンプモジュール３７と接続し流路４０内送液のための気流制御に使用する。タンク２５には送液時、壁面に細胞が残存しないようテーパー４７がある。この傾きにより、細胞懸濁液内の細胞のタンク２５内残存を防止することができる。細胞播種や培地交換の培養容器２０内部へ液体を送液する際には、一度このタンク２５内で周辺温度まで温めることが可能である。ヒーターを注入タンク６５に設置することも可能である。
【００３５】
図７により、シリンジポンプ４４について構成を説明する。ポンプ２３はモーター７０、ボールねじ７１、エンコーダー７２、駆動台７３、シリンジストッパ７４、留め具７５により図７Ａ、７Ｃの状態で構成している。シリンジ４３内部の気体の流れを一方にする弁７６を接続したシリンジ４３を２本対向でシリンジストッパ７４と駆動台７３に設置する。留め具７５を引き上げ、図７Ｄのように回転させて、図７Ｂ、７Ｅのようにシリンジ４３を固定する。モーター７０の回転により、ボールねじ７１で駆動台７３が左右に移動することで、常に片側が吸引、一方が吐出の繰り返しが可能となり、層流に近い状態で連続送液を可能とする。ポンプモジュール３７の弁２４の配置方法でタンク２５への気体の吐出、吸引を切り替えることが可能である。閉鎖系状態を保持したまま、シリンジポンプ４４を駆動することができる。エンコーダー７２による精密制御が可能なため、正確に必要量を送液できる。
＜培養容器への細胞懸濁液もしくは培地の注入に関する一連の動作＞
以上の各部の構成に基づき、自動培養装置の一連の細胞培養動作の一例について説明する。細胞懸濁液もしくは培地をシリンジポンプ４４でタンク２５の注入タンク６５側へ送液する。所定量入ったらフィルタ４５から気体を通してチューブ４１内の液体を排除したり、また逆向きに送り液体を原点位置まで戻す処理を施して、次回も正確に送液を可能とする。注入タンク６５で細胞懸濁液もしくは培地を温める。弁２４を介して、シリンジポンプ４４で培養容器２０へ送液する。その際、培養容器２０内の気体や廃液はタンク２５内の廃液タンク６６側に送られる。ポンプモジュール３７の弁２４を切り替え、廃液を廃液バッグ６３もしくは回収バック６４に送る。ポンプモジュール３７の弁２４を切り替え、洗浄バッグ６２内の洗浄液をタンク２５の注入タンク６５側へ送液する。所定量入ったらフィルタ４５から気体を通してチューブ４１内の液体を排除したり、また逆向きに送り液体を原点位置まで戻す処理を施して、次回も正確に送液を可能とする。弁２４を介して、培養容器２０へ洗浄液を送液しないようタンク２５内の廃液タンク６６側に送る。ポンプモジュール３７の弁２４を切り替え、廃液を廃液バッグ６６に送る。以上の動作を培養期間中、所定の回数繰り返す。流路４０内部特に培養容器モジュール３５では一方通行で液が流れる。それにより、廃液が培養容器２０内の培養空間と培地バッグ６１類の回路に戻らずに細胞には常に清潔で新鮮な培地が供給されるため、菌等が入らず清浄環境を保持することを可能にする。
＜閉鎖系流路内部への液体注入＞
図８Ａ，８Ｂにおいて、閉鎖系構造を有した流路４０内へ細胞懸濁液４８の無菌的な注入方法について説明する。図８Ａは流路４０内部に細胞懸濁液４８を注入していない駆動ベース２７と培地ベース３２の状態を示し、図８Ｂは流路４０の細胞バッグ６０内部に細胞懸濁液４８を注入している状態を示す。
まず、各要素の構成について図８Ａから説明する。流路４０が設置している駆動ベース２７と培地ベース３２は自動培養装置１０に設置する前は搬送治具１９に設置している。この搬送治具１９は駆動ベース２７等を自動培養装置１０内部に設置、取出をすることが可能で、設置後には搬送治具１９だけ取り出すことが可能である。培地ベース３２の内部には空の細胞バッグ６０が入っている。例えば細胞培養用クリーンルーム（CPC）内部であると、これら搬送治具１９はクラス10,000の空間７７に置ける。適正製造基準（GMP）においては、細胞直接処理区域は安全キャビネット７９（クリーンベンチを含む）内部のクラス100の空間７８のみである。そこで、エタノール等で入念な消毒処理した、細胞バッグ６０のみを安全キャビネット７９内部に入れる。
【００３６】
図８Ｂのように、安全キャビネット７９内で処理した細胞懸濁液４８をシリンジ等で細胞バッグ６０の中に注入する。注入後、注入口はシールして流路４０の閉鎖系を保持する。細胞懸濁液４８が入った細胞バッグ６０をクラス100空間７８の外に出し、培地ベース３２の中に入れる。事前に流路４０は滅菌処理により、クラス100空間７８を保持しているため、流路４０は図８Ａのようにクラス10,000空間７７で存在しても、その内部はクラス100空間７８を保持できる。この後、自動培養装置１０内へ設置をしても、駆動機構は流路４０内部とは接続しないため、自動培養装置１０の設置空間に関わらず、閉鎖系構造の流路４０内部は常にクラス100空間７８を保持することが可能である。
【００３７】
＜自動培養装置の回路構成＞
図９は、自動培養装置１０における内部機器を制御するための制御系回路の構成を示すブロック図である。
【００３８】
自動培養装置１０の制御系回路は、データや指示を入力するための入力部（キーボード、マウス等）８１と、自動培養装置１０の各動作を制御する制御部８２と、制御の状況をユーザーに示す表示部８０と、プログラムやパラメータ等を格納するＲＯＭ８５と、一時的にデータや処理結果を格納するＲＡＭ８６と、キャッシュ等の動作を行うためのメモリ８５と、滅菌処理、ヒータ、ファン、二酸化炭素供給、水供給等の処理をおこない、それらをのセンサによる環境保持装置８７と、駆動ベース２７と接続して回転機構２２、駆動ベース２７、冷蔵庫内の環境を制御する冷蔵庫制御８８を備えている。
【００３９】
ユーザが入力部８１や通信部８４から処理するべき培養工程を指示すると、制御部８２は、ＲＯＭ８５に格納された培養準備プログラムに従って、環境保持装置８７の滅菌機能で自動培養装置１０の内部を滅菌し、処理終了後に培養環境保持処理を進め、温度３７℃、５％二酸化炭素濃度、湿度１００％、清潔環境野とし、同時に冷蔵庫制御８８をおこなう。そして、制御部８２は、ＲＯＭ８５に格納された自動培養プログラムに従って、駆動ベース２７のセットを位置センサで感知し、コネクタ３１の設置を感知したら、回転機構２２、駆動ベース２７により、培養容器２０での細胞培養処理を実施する。随時、表示部８０と通信部８４でその処理状況をユーザに示すことができる。細胞培養処理が終了したら、表示部８０と通信部８４で終了をユーザに示し、駆動ベース２７の脱着を感知したら、制御部８２は、ＲＯＭ８５に格納された終了プログラムに従い、終了処理をおこなう。以上により、自動培養装置１０による一連の細胞培養処理を実現することが可能となる。
【００４０】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。
【００４１】
また、上述した自動培養装置の制御機構の各構成、機能、処理部等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いし、それらの一部又は全部を処理部であるCPUで実行するプログラムを作成することによりソフトウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００４２】
１０ 自動培養装置
１１ 細胞培養室扉
１２ 冷蔵庫扉
１３ 細胞培養室
１４ 冷蔵庫
１５ 制御部
１６ 中間室
１７ 中間室扉
１８ 冷却器
１９ 搬送治具
２０ 培養容器
２１ 培養容器ベース
２２ 回転機構
２３ ポンプ
２４ 弁
２５ タンク
２７ 駆動ベース
２８ 顕微鏡
２９ ステージ
３０ コネクタボード
３１ コネクタ
３２ 培地ベース
３３ シール
３４ ツメ
３５ 培養容器モジュール
３６ 培地モジュール
３７ ポンプモジュール
４０ 流路
４１ チューブ
４２ 溝
４３ シリンジ
４４ シリンジポンプ
４５ フィルタ
４６ フィッティング
４７ テーパー
４８ 細胞懸濁液
５０ ファン（中間室）
５１ フィルタ（中間室）
５２ ファン（制御部）
５３ 吸気用フィルタ
５４ 排気用フィルタ
５５ 空気の流れ（中間室）
５６ 空気の流れ（制御部）
５７ 制御パネル（制御部）
６０ 細胞バッグ
６１ 培地バッグ
６２ 洗浄液バッグ
６３ 廃液バッグ
６４ 回収バッグ
６５ 注入タンク
６６ 廃液タンク
６７ 第１のフィッティング
６８ 第２のフィッティング
６９ 第３のフィッティング
７０ モーター
７１ ボールねじ
７２ エンコーダ
７３ 駆動台
７４ シリンジストッパ
７５ 留め具
７６ 弁
７７ クラス100の空間
７８ クラス10,000の空間
７９ 安全キャビネット
８０ 表示部
８１ 入力部
８２ 制御部
８３ メモリ
８４ 通信部
８５ ＲＯＭ
８６ ＲＡＭ
８７ 環境保持装置
８８ 冷蔵庫制御。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する細胞培養装置に係り、特に無菌的なクリーン度で効率よく細胞を培養する自動培養技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養の作業は限りなく除菌されたクリーンルームの中で、厳格な製造工程の下で熟練された作業者の手作業により行われていた。そのため産業化に向けて細胞を大量に培養する場合、作業者の負担の増加と作業者への教育・育成に必要な時間とコスト、人為的なミスや検体の取り違え、さらに菌などを保有するヒトによる生物学的汚染（コンタミネーション）等が生じる可能性があり、それらの対策に多くのコストを要する。そのことが細胞大量培養の産業化において大きな壁となっている。
【０００３】
そのため、機器により一連の培養作業を自動化することで、それら問題点を解決させることが期待されている。そこで、現在は多関節型ロボットマニピュレータを用いて、人手の培養作業を模倣する自動培養装置が主に開発されている。しかし、人手での培養作業は煩雑な動作によってなされる。そのような培養装置では、人手と同等もしくは単純化し、如何に無菌的に培養容器や培養液のハンドリングを実施する必要がある。
【０００４】
このために、例えば特許文献１は、多関節型ロボットマニピュレータにより培養容器の搬送操作や培地交換等を処理する例を提供している。この多関節型ロボットマニピュレータにおいては、それ自身を滅菌することが可能な構成を提示している。
【０００５】
また、例えば特許文献２は培養容器と流路自身を密閉系にして処理する方式を提供している。これは、軟骨細胞に高い圧力をかけて培養する装置で、培養容器や流路内を密閉系にして、培養終了後に外気に触れないよう培養容器と一部栓をした流路を取りだす方式で、無菌的に生成した軟骨組織を回収する手段を備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４９２６８号公報
【特許文献２】特開２００２−３１５５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載のような自動培養装置においては、培養容器自身が開放系であるために、フタをあけて培養容器内部を開放する動作が必要となる。そのため、自動培養装置内部の清浄性を保持するため空調機器の大型化を伴う。それにより全体システムが大きくなり、コストがかかる課題がある。
【０００８】
特許文献２のような自動培養装置においては、密閉系であるために、内部の無菌性を保持したまま流路を取り付け、かつ培地（培養液）や細胞（細胞懸濁液）を流路内に注入するかが課題である。また、複雑な培養作業を実施する際に、その密閉した流路を装置へ容易に設置ができ、かつ効率的に駆動力を与えるかが課題である。
【０００９】
現在、ヒト細胞を使用し、培養で作成した細胞や組織をヒトへ移植する再生医療では、手術室で採取した組織を無菌処理した試験管等に入れて、内部が無菌的状態で運び出し、適正製造基準（GMP：Good Manufacturing Practice）に準拠したクリーンルーム（CPC: Cell Processing Center）内で組織から必要な細胞を単離し、目的の調整を実施して培養する。採取された細胞が製造工程内で一切の汚染なく培養するために、とりわけ厳格なレギュレーションに適合した工程、環境下で人手により製造しなければならない。細胞の培養処理を機械により自動的におこなう自動培養装置においても、その装置で製造した細胞もしくは組織は、製造工程内で一切の菌やウィルス等による生物学的汚染があってはならない。そのような状況下で、上述の開放系培養容器を使用した自動培養装置のシステムをかんがみると、自動培養装置内部を滅菌し、内部を高度なクリーン環境の保持を可能にするには、巨大な空調設備と滅菌設備を要し、その設備自身の製造コストと維持コストが必要となる。また滅菌処理の際にはモーター類の駆動系が耐えられない。
【００１０】
そこで、自動培養のための培養容器自身を閉鎖系構造とし、その内部は滅菌処理可能で、外部から駆動力を供給して細胞を培養するシステムが好ましい。しかし、閉鎖系構造の培養容器で培養するためには、その内部へ無菌的に培地や細胞を入れ、培養処理を実施する機構と制御方法を如何に効率化するかが課題である。
【００１１】
本発明の目的は、上記の課題を解決するために、細胞等を用いて組織をつくることのできる適正製造基準の準拠を目指した細胞培養装置、更には要素機器と閉鎖系流路の構成と省スペース配置、流路のための無菌的な送液機構を備えた細胞培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するため、本発明においては、培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、培地と細胞を送る複数の流路と、第一空間内に配置される駆動ベースと、駆動ベースと流路を介して接続される培養容器と、培養容器を保持する保持部材と、駆動ベースよりも下方に形成され、冷蔵空間を形成する冷蔵部と、第一空間と冷蔵空間を仕切る中間室とを備える構成の細胞培養装置を提供する。
【００１３】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を培養する細胞培養装置であって、培地と細胞液を送る複数の流路と、第一空間内に配置される駆動ベースと、駆動ベースと流路を介して接続される培養容器と、第一空間に対する第二象限に配置され、培養容器が設置される培養容器ベースと、培地と細胞液を冷蔵する冷蔵部と、駆動ベースよりも下方であって、第一空間に対する第四象限に位置し、その内部に設置される冷蔵部と第一空間とを仕切る中間室を備える構成の細胞培養装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、培養容器を有する閉鎖系流路の設置容易性を備え、細胞を適正製造基準レベルの無菌的なクリーン度で無菌的に効率よく培養する細胞培養装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第一の実施例に係る、駆動ベースを設置した自動培養装置の全体概略構成を示す図である。
【図２】第一の実施例に係る、扉を開けた自動培養装置を示す正面図である。
【図３】第一の実施例に係る、自動培養装置の内部を示す側面図である。
【図４Ａ】第一の実施例に係る、ツメにシール機構を接続前の状態を示す構成図である。
【図４Ｂ】第一の実施例に係る、ツメにシールを接続後の状態を示す構成図である。
【図５】第一の実施例に係る、流路を駆動ベースに設置した状態を示す上面構成図である。
【図６】第一の実施例に係る、タンクの構成を示す側面図である。
【図７Ａ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続する前の状態を示す上面図である。
【図７Ｂ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続した後の状態を示す上面図である。
【図７Ｃ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続する前の状態を示す側面図である。
【図７Ｄ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続している状態を示す側面図である。
【図７Ｅ】第一の実施例に係る、ポンプがシリンジと接続した後の状態を示す側面図である。
【図８Ａ】第一の実施例に係る、搬送治具に載った状態で細胞バッグへ細胞懸濁液を注入していない状態を示した側面構成図である。
【図８Ｂ】第一の実施例に係る、搬送治具に載った状態で細胞バッグへ細胞懸濁液を注入している状態を示した側面構成図である。
【図９】第一の実施例に係る、自動培養装置全体の制御の構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、添付図面を参照して本発明の一実施例について説明するが、本発明の実施例を詳細に説明する前に、本発明を概説すると以下の通りである。
【００１７】
すなわち、自動培養装置の最も好適な態様においては、閉鎖系流路とその閉鎖系流路内の送液のための駆動ベースと呼ぶ機構を用いて、装置内部の冷蔵室内（４℃程度）にある細胞液や培地を、培養室内（３７℃程度）で温めて、培養容器内細胞培養空間に供給する。そのため、閉鎖系流路は主に３つのモジュールから構成した。５℃で冷蔵保存が必要な細胞液や培地、洗浄液や廃液等による培地モジュールと、それら液体をポンプで培養室内へ送液して、タンクで３７℃まで温める駆動モジュール、細胞液や培地をタンクから培養容器内部の培養空間へ送り培養処理をおこなう培養容器モジュールである。培養容器モジュール周辺には顕微鏡があり、培養面の細胞を撮像できる。各モジュールは各々ベースと呼ぶ、一部に駆動機構を有する保持具に設置する。このベースを脱着可能な搬送治具により、閉鎖系流路は一体で培養装置内部から出入できる。自動培養装置の内部は培養室と冷蔵室、その中間室からなり、各々に扉がある。冷蔵室はおよそ４℃を保持し、培養室内部は３７℃、５％二酸化炭素濃度、湿度100％に近い状態を保持する。冷蔵室内に細胞懸濁液や培地、洗浄液と廃液入れ、逆止弁がついた廃液回収口を有する。全く環境の異なる培養室内部と冷蔵室内部それぞれが直接接続して結露と温度ムラが発生しないように、間に中間室を設けることで、送液用のチューブ以外はゴム栓等のシールで区域を分けられる。また中間室にはフィルタ付ファンが設けられ、自動培養装置外部の環境を保持することが可能である。これにより、同一装置内に全く異なる環境であるが細胞にとって最良の環境を設置でき、省スペース化が可能となる。
【００１８】
また、ベースを搬送治具にて安全キャビネット（もしくはクリーンベンチ）近くへ移動し、内部が滅菌済みの閉鎖系流路内の空のバッグを消毒して安全キャビネット内部に入れ、細胞懸濁液（もしくは、培地や洗浄液など）をバッグ内部に注入して、注入口をシールすることで、閉鎖系流路外部の環境を問わず、閉鎖系流路内部は無菌状態を保持することができる。本発明の方式では、その閉鎖系流路をベースごと自動培養装置に入れると、駆動機構は閉鎖系流路外部に設置してあるため、自動培養装置の設置場所を問わず、閉鎖系流路内部は無菌状態を保持しながら、細胞播種、培地交換、顕微鏡観察、検査のための廃液回収といった自動細胞培養作業の実施を可能にできる。
【００１９】
さらなる本発明の特徴は、添付図面を用いて具体的に説明する以下の実施例によって明らかになるものである。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【実施例１】
【００２０】
図１は、第一の実施例に係る自動培養装置１０の全体概略図である。図２は自動培養装置１０の正面図である。図３は自動培養装置１０の側面図である。図４Ａ及び４Ｂは細胞培養室１３と冷蔵庫１４間のシール３３に関する概略図である。図５は流路４０の構成に関する概略図である。図６は流路４０の構成部品の一つであるタンク２５に関する概略図である。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、及び７Ｅは流路４０の構成部品の一つであるポンプ２３に関する概略図である。図８Ａ，及び８Ｂは流路４０内へ無菌的な細胞液や培地の供給に関する概略図である。図９は自動培養装置１０を動作させるための回路を示すブロック図である。
【００２１】
＜自動培養装置の構成＞
図１、図２、図３及び図４Ａ、図４Ｂを用いて、自動培養装置１０の全体構成について説明する。自動培養装置１０は基本的な構成要素として、細胞培養室１３、冷蔵庫１４、制御部１５、中間室１６によって構成されている。以下、それぞれの基本構成について説明する。
【００２２】
図１に示されるように、自動培養装置１０全体は細胞培養室１３、冷蔵部を構成する冷蔵庫１４、制御部１５、中間室１６の４区画によって構成されており、細胞培養室扉１１と冷蔵庫扉１２、中間室扉１７を開けることで自動培養装置１０内部とアクセスすることが可能である。細胞培養室１３には、培養容器２０を保持、設置する保持部材である培養容器ベース２１とそれに接続して回転する回転機構２２、培養容器２０内の細胞画像を撮像する顕微鏡２８とそのステージ２９、ポンプ２３や弁２４といった駆動機構を有してタンク２６を含む閉鎖系構造の流路４０と接続する駆動ベース２７で構成している。さらに内部の駆動機構全てに接続して制御部１５と配線するコネクタボード３０がある。なお、制御部１５とコネクタボード３０間の配線は図示を省略した。細胞培養時には、細胞培養室１３内部は温度３７℃、湿度１００％、５％二酸化炭素に近い環境を保持する。ただし、必要に応じて培養容器２０を含む周辺部分だけ前述の環境を保持する構造とすることができる。冷蔵庫１４には培地ベース３２を入れることができ、細胞培養室１３、冷蔵庫１４、中間室１６の３区画を独立したまま流路４０のチューブ４１のみ通すシール３３で、細胞培養室１３と冷蔵室１４内部の温度を保持して結露を防止することを可能にする。中間室１６にはフィルタ５１付ファン５０がある。フィルタ５１は排気口に設置される。このファン５０による気流の動きを起し湿度上昇を防止することができる。また、後で詳細に説明する中間室１６の入り口には、細胞培養室１３内部と冷蔵庫１４内部を遮断し、培養液だけ流すシール機構が用いられる。
【００２３】
制御部１５は他の区画から独立しており、細胞培養質１３や中間室１６の下方に設置される。これにより、細胞培養室１３内の温度、湿度、二酸化炭素を遮断して、内部の電気機器類を保護している。制御部１５には、ファン５２があり吸気用フィルタ５３と排気用フィルタ５４で無菌的に内部の熱を外部に逃がすことを可能にする。ファン５２とフィルタ５３、５４で制御部１５の冷却部を構成していることになる。５７は制御部１５の制御用パネルであり、通常の操作パネル同様、各種ボタンや表示部などを備えており、制御部１５の操作に用いる。制御部１５は、図示を省略した処理部である中央処理部（ＣＰＵ）や、制御プログラムやデータを記憶する記憶部であるメモリ等で構成されることはいうまでもない。
【００２４】
図２に細胞培養室扉１１、冷蔵庫扉１２を開けた状態の自動培養装置１０の正面からみた各要素機器の配置を示している。細胞培養室１３内部の駆動ベース２７を中心として、水平方向に、回転を可能とした培養容器２０、垂直方向に、細胞液や培地が入った培地ベース３２を設置できる冷蔵庫１４により構成している。同図や図１から明らかなように、本実施例の自動培養装置１０においては、駆動ベース２７が設置される空間（第一空間）を第一象限とすると、第一空間と冷蔵部である冷蔵庫１４とを仕切る中間室１６が第四象限に、培養容器２０が保持、戴置される保持部材である培養容器ベース２１が第二象限、あるいは回転により第三象限に位置することになる。本実施例の配置構成により、省スペースで、各機器間距離が短い構成となり、第四象限に位置する冷蔵庫１４で４℃前後に保存した培地を、第一象限に位置する駆動ベース２７上のタンク２５で温めて、素早く第二象限に位置する培養空間へ供給することができ、移動による細胞のダメージを最小にすることができる。
【００２５】
さて、図２に見るように、細胞を撮像する顕微鏡２８は正面から見て第二象限に位置する培養容器２０から鉛直方向に構成している。顕微鏡２８は、移動やピント合わせのためのステージ２９に固定している。これらの配置に関しては、第一象限に位置する駆動ベース２７を中心として、全て水平方向に配置や全て鉛直方向に配置なども可能とするが、培養する細胞に応じて最適な配置を選択することができる。冷蔵庫１４は、第四象限に位置する中間室１６内部にあり、シール３３により各々の区間を切り離しているため、流路４０内部以外は細胞培養室１３と空間が分離している。この構成については図３で詳細を記載したので後で説明する。
【００２６】
駆動ベース２７には流路４０内の送液をするポンプ２３、送液の回路を切り替える弁２４、培地等をためて温めや液の流れ方向を変えるタンク２５といった駆動機構が配置している。これについては詳細を後述する。駆動機構を動作させるため、駆動ベース２７背面にコネクタボード３０があり、駆動ベース２７のコネクタ３１に接続できる。コネクタボード３０から制御部１５へ配線できる。その際、コネクタボード３０は細胞培養室１３内部の環境を保持したまま、コネクタ３１配線を外部の制御部１５と接続するため、断熱・防水構造を有している。本図で制御部１５は細胞培養室１３の鉛直方向に記載しているが、例えば卓上で使用する際には水平方向に設置や、余剰空間に設置してもよい。
【００２７】
図３に自動培養装置１０の側面からみた各要素機器の配置を示している。温度、湿度といった環境が全く異なる細胞培養室１３と冷蔵庫１４を同一装置内に配置して、流路４０をつなげるため、中間室１６とシール３３を設置した。細胞培養室１３は一般的に37℃、100％湿度を有しており、冷蔵庫１４は一般的に内部を4〜5℃で保持しているため、細胞培養室１３直近に設置すると結露を発生し、また細胞培養室１３内部の温度ムラを生じる。一般的なインキュベーター（細胞培養室）や冷蔵庫は室温や室内の湿度で使用することを想定して設計している。そこで、室内の環境を保持する中間室１６を冷蔵庫１４と細胞培養室１３の間に設けることで、急激な温度変化による結露の発生を防止する。しかし、冷蔵庫１４内の培地や洗浄液、細胞懸濁液は流路４０を構成するチューブ４１を通して細胞培養室１３内へ送液可能としたい。
【００２８】
そこで、図４Ａ、図４Ｂに示すようなシール３３の溝４２にチューブ４１を通して、ツメ３４にはめ込むことで冷蔵庫１４、中間室１６、細胞培養室１３の空間を分離して、培地や洗浄液、細胞懸濁液を冷蔵庫１４から細胞培養室１３へ送液可能になる。ツメ３４は、細胞培養装置１３と中間室１６を仕切る壁１３Ａと、冷蔵庫１４と中間室１６とを仕切る壁１４Ａにそれぞれ設けられる。
【００２９】
図３において、冷蔵庫１４にはその内部を冷却するための冷却器１８がある。これは冷却した分の熱を冷蔵庫１４外部へ排出する。中間室１４内部の温度が上昇しないようにするため、ファン５０で自動培養装置１０外部からフィルタ５１を通した空気を吸入して冷却器１８に当て、またフィルタ５１を通して自動培養装置１０外部へ放出する構成とした。すなわち、冷却器１８とファン５０、更にはフィルタ５１で中間室の冷却部が構成されることとなる。
【００３０】
図３の矢印５５で空気の流れを示した。これにより中間室１６内部の気温と湿度は自動培養装置１０外部と同じ状態を保持できる。制御部１５内部はコンピューターや電源等発熱するものが多く存在し、内部の熱を放出しなければならない。制御部１５内部にホコリが入らないように吸気用フィルタ５３を通してファン５２で制御部１５外部の空気を入れ、また排気用フィルタ５４を通して制御部１５外部に戻す。空気の流れ５６を図３の矢印に示した。これにより例えばクリーンルームの清浄区域で、ホコリなどをまき散らすことを防止して、清浄度を維持可能である。
【００３１】
＜流路と駆動ベースの構成＞
図５、図６、及び図７Ａ−７Ｅを用いて、流路４０の構成とその駆動方法について説明する。図５は流路４０と駆動ベース２７の全体構成を示した概略図である。図６はタンク２５の構成を示した正面図である。図７Ａはシリンジ４３とポンプ２３が分離した状態の上面図を示し、図７Ｂはシリンジ４３とポンプ２３が一体になった状態の上面図を示し、図７Ｃはシリンジ４３とポンプ２３が分離した状態の側面図を示し、図７Ｄはシリンジ４３をポンプ２３にセットしている状態の側面図を示し、図７Ｅはシリンジ４３とポンプ２３が一体でシリンジポンプ４４となった状態の側面図を示している。シリンジ４３は同一軸上を並進することができる。
【００３２】
まず、図５にて閉鎖系構造の流路４０の構成について説明する。流路４０は、交換可能な、チューブ４１、培養容器２０、シリンジ４３、フィルタ４５、フィッティング４６、タンク２５、細胞バッグ６０、培地バッグ６１、洗浄液バッグ６２、廃液バッグ６３、回収バッグ６４から構成している。その流路４０は駆動機構である流れの方向を変える弁２４、送液を行うポンプ２３、第二象限に位置する水平方向から、第三象限に位置する垂直方向へ回転して培養容器２０内の気泡を排除する回転機構２２と接続することで、培養容器２０内へ細胞液や培地の送液による細胞播種と培地交換、洗浄液による流路洗浄をおこなうことが可能になる。ここで、培養容器２０が設置される培養容器ベース２２の第二象限から第三象限への回転とは、図２に見る水平位置から培養容器ベースを回転機構２２により、反時計方向回りに下方に回転させることで実現できる。
【００３３】
駆動機構は駆動ベース２７に配置しており、湿度等にさらすことのできない配線や機構は全て駆動ベース２７内部に入れて、高湿度環境に設置できる。制御部１５と接続するため、駆動ベース２７には防水対応のコネクタ３１があり、駆動ベース２７を自動培養装置１０内部へ設置した際にこのコネクタ３１と接続することで、駆動機構を動作させることができる。流路４０の配置については、タンク２５を中心として、培養容器２０へ送液する培養容器モジュール３５、冷蔵庫１４内の培地類をタンク２５へ送液する培地モジュール３６、流路４０内部の送液をするため気体の流れ（方向、流速）を制御するポンプモジュール３７、の独立した３つのモジュールに分けられる。このモジュール化により、駆動機構の最適な配置と流路の設置容易性を向上できる。
【００３４】
図６により、モジュールの中心となるタンク２５の構成について説明する。タンク２５には培養容器２０に対して、注入タンク６５と廃液タンク６６がある。また、高さに応じて役割の異なるフィッティング４６がある。下から第１のフィッティング６７、第２のフィッティング６８、第３のフィッティング６９に分かれている。第１のフィッティング６７は注入タンク６５側が培養容器２０への送液、廃液タンク６６側は廃液バッグ６３や回収バッグ６４への送液口である。第２のフィッティング６８は注入タンク６５側が培地モジュール３６から送られた細胞懸濁液や培地、洗浄液を注入タンク６５内部への注入口で、廃液タンク６６側が培養容器２０からの廃液を廃液タンク６５内部への注入口である。タンク２５内に入りうる液体は全てこの第２のフィッティング６８に到達しない容量とする。第３のフィッティング６９はポンプモジュール３７と接続し流路４０内送液のための気流制御に使用する。タンク２５には送液時、壁面に細胞が残存しないようテーパー４７がある。この傾きにより、細胞懸濁液内の細胞のタンク２５内残存を防止することができる。細胞播種や培地交換の培養容器２０内部へ液体を送液する際には、一度このタンク２５内で周辺温度まで温めることが可能である。ヒーターを注入タンク６５に設置することも可能である。
【００３５】
図７により、シリンジポンプ４４について構成を説明する。ポンプ２３はモーター７０、ボールねじ７１、エンコーダー７２、駆動台７３、シリンジストッパ７４、留め具７５により図７Ａ、７Ｃの状態で構成している。シリンジ４３内部の気体の流れを一方にする弁７６を接続したシリンジ４３を２本対向でシリンジストッパ７４と駆動台７３に設置する。留め具７５を引き上げ、図７Ｄのように回転させて、図７Ｂ、７Ｅのようにシリンジ４３を固定する。モーター７０の回転により、ボールねじ７１で駆動台７３が左右に移動することで、常に片側が吸引、一方が吐出の繰り返しが可能となり、層流に近い状態で連続送液を可能とする。ポンプモジュール３７の弁２４の配置方法でタンク２５への気体の吐出、吸引を切り替えることが可能である。閉鎖系状態を保持したまま、シリンジポンプ４４を駆動することができる。エンコーダー７２による精密制御が可能なため、正確に必要量を送液できる。
＜培養容器への細胞懸濁液もしくは培地の注入に関する一連の動作＞
以上の各部の構成に基づき、自動培養装置の一連の細胞培養動作の一例について説明する。細胞懸濁液もしくは培地をシリンジポンプ４４でタンク２５の注入タンク６５側へ送液する。所定量入ったらフィルタ４５から気体を通してチューブ４１内の液体を排除したり、また逆向きに送り液体を原点位置まで戻す処理を施して、次回も正確に送液を可能とする。注入タンク６５で細胞懸濁液もしくは培地を温める。弁２４を介して、シリンジポンプ４４で培養容器２０へ送液する。その際、培養容器２０内の気体や廃液はタンク２５内の廃液タンク６６側に送られる。ポンプモジュール３７の弁２４を切り替え、廃液を廃液バッグ６３もしくは回収バック６４に送る。ポンプモジュール３７の弁２４を切り替え、洗浄バッグ６２内の洗浄液をタンク２５の注入タンク６５側へ送液する。所定量入ったらフィルタ４５から気体を通してチューブ４１内の液体を排除したり、また逆向きに送り液体を原点位置まで戻す処理を施して、次回も正確に送液を可能とする。弁２４を介して、培養容器２０へ洗浄液を送液しないようタンク２５内の廃液タンク６６側に送る。ポンプモジュール３７の弁２４を切り替え、廃液を廃液バッグ６６に送る。以上の動作を培養期間中、所定の回数繰り返す。流路４０内部特に培養容器モジュール３５では一方通行で液が流れる。それにより、廃液が培養容器２０内の培養空間と培地バッグ６１類の回路に戻らずに細胞には常に清潔で新鮮な培地が供給されるため、菌等が入らず清浄環境を保持することを可能にする。
＜閉鎖系流路内部への液体注入＞
図８Ａ，８Ｂにおいて、閉鎖系構造を有した流路４０内へ細胞懸濁液４８の無菌的な注入方法について説明する。図８Ａは流路４０内部に細胞懸濁液４８を注入していない駆動ベース２７と培地ベース３２の状態を示し、図８Ｂは流路４０の細胞バッグ６０内部に細胞懸濁液４８を注入している状態を示す。
まず、各要素の構成について図８Ａから説明する。流路４０が設置している駆動ベース２７と培地ベース３２は自動培養装置１０に設置する前は搬送治具１９に設置している。この搬送治具１９は駆動ベース２７等を自動培養装置１０内部に設置、取出をすることが可能で、設置後には搬送治具１９だけ取り出すことが可能である。培地ベース３２の内部には空の細胞バッグ６０が入っている。例えば細胞培養用クリーンルーム（CPC）内部であると、これら搬送治具１９はクラス10,000の空間７７に置ける。適正製造基準（GMP）においては、細胞直接処理区域は安全キャビネット７９（クリーンベンチを含む）内部のクラス100の空間７８のみである。そこで、エタノール等で入念な消毒処理した、細胞バッグ６０のみを安全キャビネット７９内部に入れる。
【００３６】
図８Ｂのように、安全キャビネット７９内で処理した細胞懸濁液４８をシリンジ等で細胞バッグ６０の中に注入する。注入後、注入口はシールして流路４０の閉鎖系を保持する。細胞懸濁液４８が入った細胞バッグ６０をクラス100空間７８の外に出し、培地ベース３２の中に入れる。事前に流路４０は滅菌処理により、クラス100空間７８を保持しているため、流路４０は図８Ａのようにクラス10,000空間７７で存在しても、その内部はクラス100空間７８を保持できる。この後、自動培養装置１０内へ設置をしても、駆動機構は流路４０内部とは接続しないため、自動培養装置１０の設置空間に関わらず、閉鎖系構造の流路４０内部は常にクラス100空間７８を保持することが可能である。
【００３７】
＜自動培養装置の回路構成＞
図９は、自動培養装置１０における内部機器を制御するための制御系回路の構成を示すブロック図である。
【００３８】
自動培養装置１０の制御系回路は、データや指示を入力するための入力部（キーボード、マウス等）８１と、自動培養装置１０の各動作を制御する制御部８２と、制御の状況をユーザーに示す表示部８０と、プログラムやパラメータ等を格納するＲＯＭ８５と、一時的にデータや処理結果を格納するＲＡＭ８６と、キャッシュ等の動作を行うためのメモリ８５と、滅菌処理、ヒータ、ファン、二酸化炭素供給、水供給等の処理をおこない、それらをのセンサによる環境保持装置８７と、駆動ベース２７と接続して回転機構２２、駆動ベース２７、冷蔵庫内の環境を制御する冷蔵庫制御８８を備えている。
【００３９】
ユーザが入力部８１や通信部８４から処理するべき培養工程を指示すると、制御部８２は、ＲＯＭ８５に格納された培養準備プログラムに従って、環境保持装置８７の滅菌機能で自動培養装置１０の内部を滅菌し、処理終了後に培養環境保持処理を進め、温度３７℃、５％二酸化炭素濃度、湿度１００％、清潔環境野とし、同時に冷蔵庫制御８８をおこなう。そして、制御部８２は、ＲＯＭ８５に格納された自動培養プログラムに従って、駆動ベース２７のセットを位置センサで感知し、コネクタ３１の設置を感知したら、回転機構２２、駆動ベース２７により、培養容器２０での細胞培養処理を実施する。随時、表示部８０と通信部８４でその処理状況をユーザに示すことができる。細胞培養処理が終了したら、表示部８０と通信部８４で終了をユーザに示し、駆動ベース２７の脱着を感知したら、制御部８２は、ＲＯＭ８５に格納された終了プログラムに従い、終了処理をおこなう。以上により、自動培養装置１０による一連の細胞培養処理を実現することが可能となる。
【００４０】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。
【００４１】
また、上述した自動培養装置の制御機構の各構成、機能、処理部等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いし、それらの一部又は全部を処理部であるCPUで実行するプログラムを作成することによりソフトウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００４２】
１０ 自動培養装置
１１ 細胞培養室扉
１２ 冷蔵庫扉
１３ 細胞培養室
１４ 冷蔵庫
１５ 制御部
１６ 中間室
１７ 中間室扉
１８ 冷却器
１９ 搬送治具
２０ 培養容器
２１ 培養容器ベース
２２ 回転機構
２３ ポンプ
２４ 弁
２５ タンク
２７ 駆動ベース
２８ 顕微鏡
２９ ステージ
３０ コネクタボード
３１ コネクタ
３２ 培地ベース
３３ シール
３４ ツメ
３５ 培養容器モジュール
３６ 培地モジュール
３７ ポンプモジュール
４０ 流路
４１ チューブ
４２ 溝
４３ シリンジ
４４ シリンジポンプ
４５ フィルタ
４６ フィッティング
４７ テーパー
４８ 細胞懸濁液
５０ ファン（中間室）
５１ フィルタ（中間室）
５２ ファン（制御部）
５３ 吸気用フィルタ
５４ 排気用フィルタ
５５ 空気の流れ（中間室）
５６ 空気の流れ（制御部）
５７ 制御パネル（制御部）
６０ 細胞バッグ
６１ 培地バッグ
６２ 洗浄液バッグ
６３ 廃液バッグ
６４ 回収バッグ
６５ 注入タンク
６６ 廃液タンク
６７ 第１のフィッティング
６８ 第２のフィッティング
６９ 第３のフィッティング
７０ モーター
７１ ボールねじ
７２ エンコーダ
７３ 駆動台
７４ シリンジストッパ
７５ 留め具
７６ 弁
７７ クラス100の空間
７８ クラス10,000の空間
７９ 安全キャビネット
８０ 表示部
８１ 入力部
８２ 制御部
８３ メモリ
８４ 通信部
８５ ＲＯＭ
８６ ＲＡＭ
８７ 環境保持装置
８８ 冷蔵庫制御。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、
前記培地と前記細胞を送る複数の流路と、
第一空間内に配置される駆動ベースと、
前記駆動ベースと前記流路を介して接続される培養容器と、
前記培養容器を保持する保持部材と、
前記駆動ベースよりも下方に形成され、冷蔵空間を形成する冷蔵部と、
前記第一空間と前記冷蔵空間を仕切る中間室とを備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記冷蔵部は前記培地と前記細胞を保存可能であり、
前記冷蔵部と前記前記駆動ベースを接続する前記流路を保持し、前記第一空間と前記中間室と前記冷蔵空間を繋ぐ、着脱可能な流路保持部材を更に備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記中間室に、前記中間室を冷却する冷却部を設けた、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記保持部材は、前記第一空間に対する第二象限の位置に配置される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記中間室は、前記第一空間に対する第四象限の位置に配置される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記流路の内部で前記培地と前記細胞を送るポンプと弁と、前記ポンプと前記弁を制御する制御部を更に備え、
前記ポンプと前記弁と前記流路の一部が前記駆動ベース上に設置される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養装置であって、
前記ポンプは、同一軸上を並進可能なシリンジを備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
細胞を培養する細胞培養装置であって、
培地と細胞液を送る複数の流路と、
第一空間内に配置される駆動ベースと、
前記駆動ベースと前記流路を介して接続される培養容器と、
前記第一空間に対する第二象限に配置され、前記培養容器が設置される培養容器ベースと、
前記培地と前記細胞液を冷蔵する冷蔵部と、
前記駆動ベースよりも下方であって、前記第一空間に対する第四象限に位置し、その内部に設置される前記冷蔵部と前記第一空間とを仕切る中間室を備えることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記駆動ベース上に設置された、前記流路に接続されるタンクとポンプと前記流路を開閉する弁、並びに
前記ポンプと前記弁を制御する制御部を更に備えた、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記冷蔵部に保持された前記培地と前記細胞液を、前記駆動ベース上の前記タンクに流す前記流路を保持し、前記第一空間と前記中間室と前記冷蔵部を繋ぐ、着脱可能なシール機構を更に備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記ポンプは、同一軸上を並進するシリンジを備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記流路は前記ポンプと前記弁から着脱可能である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１３】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記制御部は、前記制御部を冷却する冷却部を備え、
前記制御部は、前記細胞培養室および前記中間室より下方に位置する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１４】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記中間室は、前記中間室を冷却する冷却部を備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１５】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記培養容器ベースを、前記第一空間に対する第二象限から第三象限の位置に回転可能な回転機構を更に有する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１】
培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、
前記培地と前記細胞を送る複数の流路と、
第一空間内に配置される駆動ベースと、
前記駆動ベースと前記流路を介して接続される培養容器と、
前記培養容器を保持する保持部材と、
前記駆動ベースよりも下方に形成され、冷蔵空間を形成する冷蔵部と、
前記第一空間と前記冷蔵空間を仕切る中間室とを備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記冷蔵部は前記培地と前記細胞を保存可能であり、
前記冷蔵部と前記前記駆動ベースを接続する前記流路を保持し、前記第一空間と前記中間室と前記冷蔵空間を繋ぐ、着脱可能な流路保持部材を更に備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記中間室に、前記中間室を冷却する冷却部を設けた、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記保持部材は、前記第一空間に対する第二象限の位置に配置される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記中間室は、前記第一空間に対する第四象限の位置に配置される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記流路の内部で前記培地と前記細胞を送るポンプと弁と、前記ポンプと前記弁を制御する制御部を更に備え、
前記ポンプと前記弁と前記流路の一部が前記駆動ベース上に設置される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養装置であって、
前記ポンプは、同一軸上を並進可能なシリンジを備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
細胞を培養する細胞培養装置であって、
培地と細胞液を送る複数の流路と、
第一空間内に配置される駆動ベースと、
前記駆動ベースと前記流路を介して接続される培養容器と、
前記第一空間に対する第二象限に配置され、前記培養容器が設置される培養容器ベースと、
前記培地と前記細胞液を冷蔵する冷蔵部と、
前記駆動ベースよりも下方であって、前記第一空間に対する第四象限に位置し、その内部に設置される前記冷蔵部と前記第一空間とを仕切る中間室を備えることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記駆動ベース上に設置された、前記流路に接続されるタンクとポンプと前記流路を開閉する弁、並びに
前記ポンプと前記弁を制御する制御部を更に備えた、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記冷蔵部に保持された前記培地と前記細胞液を、前記駆動ベース上の前記タンクに流す前記流路を保持し、前記第一空間と前記中間室と前記冷蔵部を繋ぐ、着脱可能なシール機構を更に備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記ポンプは、同一軸上を並進するシリンジを備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記流路は前記ポンプと前記弁から着脱可能である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１３】
請求項９に記載の細胞培養装置であって、
前記制御部は、前記制御部を冷却する冷却部を備え、
前記制御部は、前記細胞培養室および前記中間室より下方に位置する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１４】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記中間室は、前記中間室を冷却する冷却部を備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１５】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記培養容器ベースを、前記第一空間に対する第二象限から第三象限の位置に回転可能な回転機構を更に有する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１３０２９７（Ｐ２０１２−１３０２９７Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８５８４９（Ｐ２０１０−２８５８４９）
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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