細胞洗浄液、細胞剥離液及び細胞製造方法
【課題】
架橋ポリアクリル酸塩や、カルボキシル基を有する糖鎖高分子ゲル等の保水量の比較的大きい担体を用いて増殖した細胞は、従来の細胞剥離操作では細胞を剥離することが困難である。
【解決手段】
保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を洗浄するための細胞洗浄液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液（Ｃ）を用いる、及び／又は、保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離するための細胞剥離液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液（Ｄ）を用いる。
架橋ポリアクリル酸塩や、カルボキシル基を有する糖鎖高分子ゲル等の保水量の比較的大きい担体を用いて増殖した細胞は、従来の細胞剥離操作では細胞を剥離することが困難である。
【解決手段】
保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を洗浄するための細胞洗浄液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液（Ｃ）を用いる、及び／又は、保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離するための細胞剥離液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液（Ｄ）を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞洗浄液、細胞剥離液及び細胞製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養担体と培養液を用いて細胞培養担体上で細胞を製造する方法において、細胞培養担体の表面から細胞を剥離する際には、０．２５％トリプシン、０．０２％エチレンジアミン四酢酸、０．８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウム、０．１１５％リン酸水素二ナトリウム及び０．０２％リン酸二水素カリウムからなる剥離液が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】組織培養の技術 第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、架橋ポリアクリル酸塩や、カルボキシル基を有する糖鎖高分子ゲル等の保水量の比較的大きい細胞培養担体を用いて増殖させた細胞は、この担体への細胞の接着力が強いために、上記トリプシン等からなる剥離液を用いた細胞剥離操作では細胞を剥離することが困難である。本発明の目的は、保水量の比較的大きい細胞培養担体に付着した細胞を容易かつ確実に剥離できる細胞洗浄液、細胞剥離液および剥離した細胞の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、特定の細胞洗浄液及び細胞剥離液が、特定の細胞培養担体を使用してこの担体表面で増殖させた細胞を容易かつ確実に剥離できることを見いだし、本発明に到達した。すなわち、本発明は、下記の３発明である。
（１）保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を洗浄するための細胞洗浄液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液（Ｃ）。
（２）保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離するための細胞剥離液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液（Ｄ）。
（３）培養液と保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体とを用いて細胞を培養した後、（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離してなる細胞の製造方法であって、下記洗浄工程及び剥離工程を含み、洗浄工程で細胞洗浄液（Ｃ）を使用する及び／又は剥離工程で細胞剥離液（Ｄ）を使用する細胞の製造方法。
洗浄工程：培養液から取り出した、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に細胞洗浄液を添加した後、細胞洗浄液を除去する工程
剥離工程：洗浄工程後、細胞の付着した細胞培養担体に細胞剥離液を添加し、細胞を剥離する工程
【発明の効果】
【０００５】
本発明の細胞洗浄液、細胞剥離液及び剥離した細胞の製造方法は、以下の効果を奏する。
（１）吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体からの細胞剥離が容易である。
（２）吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体からの細胞剥離が確実であり、培養細胞の収率が高く(高回収率及び高生存率)、培養細胞の生産性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
吸水性樹脂（Ａ）の生理食塩水に対する保水量（ｇ／ｇ）（以下、保水量）は、２〜５０であり、好ましくは４〜４０、さらに好ましくは８〜３０であり、特に好ましくは１０〜２５である。該保水量が２未満では細胞増殖性が悪くなり、５０を超えると（Ａ）の物理的強度が低くなるため増殖性が悪くなる。
なお、保水量は、次の方法で測定される。生理食塩水約１００ｍＬを入れたビーカーに、撹拌しながら乾燥した（Ａ）１．０ｇを投入し、あらかじめ膨潤させて膨潤樹脂を得た後、目開き５７μｍのナイロン網で作製した袋（縦２０ｃｍ、横１０ｃｍ）に移し、過剰の生理食塩水中に６０分間浸漬する。次いで、膨潤樹脂を袋ごと遠心脱水機に入れて、１５０Ｇで９０秒間遠心脱水を行い、余剰水を取り除く。遠心脱水後の重量（ｇ２）を測定し、次式から算出した値を保水量とする。なお、ナイロン網で作製した袋および生理食塩水については、ＪＩＳ Ｋ７２２３−１９９６に準拠する。
（保水量）＝（ｇ２）−１．０
【０００７】
吸水性樹脂（Ａ）としては、（Ａ）を含んでなる担体への細胞の接着性の観点から、アニオン性（塩）官能基を有するポリマーが好ましく、さらに好ましいのはアニオン性（塩）官能基がカルボキシル基であるポリマー、特に好ましいのは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）、アルギン酸（塩）、ヒアルロン酸（塩）、最も好ましいのは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
なお、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及び／又はメタクリル酸を意味し、酸（塩）とは、酸及び／又は酸塩を意味し、以下の記載において同様である。
【０００８】
（メタ）アクリル酸（塩）としては、アクリル酸又はメタクリル酸のアルカリ金属（リチウム、カリウム及びナトリウム等）塩、アルカリ土類金属（マグネシウム及びカルシウム等）塩及びアンモニウム塩等が用いられる。これらのうち、保水量の観点から、アルカリ金属塩が好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩、リチウム塩及びカリウム塩、特に好ましくはナトリウム塩及びリチウム塩、最も好ましくはナトリウム塩である。
【０００９】
架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）とは、（メタ）アクリル酸（塩）を必須成分とするモノマーを重合して得られる架橋重合体であり、特開２００６−５７０３９号公報、特開２００６−２１９６６１号公報、特開平９−１２４８７９号公報等に記載のものが含まれる。
【００１０】
吸水性樹脂（Ａ）の形状としては特に制限はなく、粒子状、塊状、シート状等が使用できる。細胞培養の効率の観点から、粒子状、シート状であることが好ましく、さらに好ましくは粒子状である。
【００１１】
吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体としては、（Ａ）をそのまま使用してもよいし、必要により細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチドを結合してもよい。
【００１２】
細胞培養担体の形状としては特に制限はなく、粒子状、塊状、シート状等が使用できる。細胞培養の効率の観点から、粒子状、シート状であることが好ましく、さらに好ましくは粒子状である。また、（Ａ）を基材にコーティングしたものも使用することができる。
コーティングする基材としては、シャーレ、フラスコ、ローラーボトル、プレート等が含まれる。材質としては、プラスチック、ガラス、天然由来材料（デキストラン、セルロース等）及び無機材料（ヒドロキシアパタイト等）等が挙げられる。
【００１３】
細胞培養担体の形状が粒子状の場合、その生理食塩水で膨潤された状態での直径（μｍ）としては、細胞の増殖性の観点から、２０〜５００が好ましく、さらに好ましくは５０〜４００、特に好ましくは８０〜３００、最も好ましくは１００〜２５０である。
【００１４】
（Ａ）を含んでなる細胞培養担体は、上記のとおり細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチドを結合してもよい。
細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が挙げられる。
これらのうち、細胞接着性の観点から、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列、Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ配列、Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ配列、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ 配列（８）、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（１０）、Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ配列（１１）、Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ配列（１２）、Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ配列（１３）、Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ配列（１４）、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ（１５）及びＰｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ（１５）及びＰｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列である。
【００１５】
（Ａ）とポリペプチドは、化学結合（イオン結合、水素結合及び／又は共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって結合されていてもよい。（Ａ）とポリペプチドが強固に結合される点で、化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００１６】
（Ａ）にポリペプチドを共有結合させる方法としては、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法等が挙げられ、具体的には、以下の（１）〜（２）の通りである。
（１）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ａ）のカルボキシル基とを反応させる場合、カルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが細胞培養用担体に由来する部分）｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、（Ａ）とポリペプチドとをアミド結合させる。
カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００１７】
（２）ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものと（Ａ）のカルボキシル基とを反応させる場合、（Ａ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、（Ａ）とポリペプチドとをエステル結合させる。
【００１８】
（Ａ）の表面積（ｃｍ2）当たりのポリペプチド含有量（μｇ）としては、細胞増殖性の観点から、０．００１〜１００であることが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜５０、特に好ましくは０．０２〜１０、最も好ましくは０．０５〜５である。
【００１９】
キレート剤（Ｂ）には、特開２００４−１３５５７１号公報、特開２００４−２６７０７１号公報等に記載の、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物、カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物、ジカルボン酸、アミノ基を少なくとも２個有する化合物、ヒドロキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物、メルカプト基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物並びにこれらの塩等が含まれる。
ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物並びにこの塩としては、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ウラミル二酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸及びこれらの金属塩等が挙げられる。
カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物としては、α−アラニン、グルタミン酸、チロシン、システイン及びグリシン等が挙げられる。
ジカルボン酸としては、シュウ酸、フタル酸、サリチル酸、酒石酸及びクエン酸等が挙げられる。
アミノ基を少なくとも２個有する化合物としては、フェナントロリン及びジメチルグリオキシム等が挙げられる。
ヒドロキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物としては、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸及びオキシン等が挙げられる。
メルカプト基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物としては、ジチゾン等が挙げられる。
これらのうち、細胞への毒性およびキレート化能の観点から、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物並びにこの塩が好ましく、さらに好ましくはエチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ウラミル二酢酸並びにこれらの塩が好ましく、特に好ましくはエチレンジアミン四酢酸及びこの塩、最も好ましくはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩及びエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩である。
【００２０】
細胞洗浄液（Ｃ）又は細胞剥離液（Ｄ）中の（Ｂ）の含有量（重量％）は、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５であり、好ましくは０．１２〜２．５、さらに好ましくは０．１５〜１．５、特に好ましくは０．２〜１．０である。（Ｂ）の含有量が０．１未満では細胞剥離性が悪くなり、５を超えると細胞への損傷が悪くなる。
【００２１】
溶媒としては特に制限はないが、細胞への損傷及び取り扱い性等の観点から、水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等が使用できる。
また、溶媒としての水には、無機塩｛リン酸塩（リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等）、塩化物（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）等｝、有機酸塩（ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム等）、アミノ酸（塩）｛必須アミノ酸（リジン、スレオニン、フェニルアラニン等）、非必須アミノ酸（グリシン、グルタミン、セリン等｝、ビタミン（葉酸、イノシトール、ニコチンアミド等）、糖（グルコース等）、酸（塩酸、酢酸、リン酸等）及び／又は塩基（水酸化ナトリウム等）等の溶質を、溶質及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５０重量％含有することができる。細胞への損傷の観点から、無機塩、有機酸、糖、酸及び／又は塩基を含有することが好ましい。
【００２２】
無機塩の含有量（重量％）は、（Ｃ）及び（Ｄ）を等張液として調整する観点並びに細胞への損傷の観点から、無機塩及び溶媒の合計重量を基準として、０．２〜１．５が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．０、特に好ましくは０．７〜０．９である。
【００２３】
糖の含有量（重量％）は、細胞への損傷の観点から、糖及び溶媒の合計重量を基準として、０．００５〜０．５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．２、特に好ましくは０．０５〜０．１である。
【００２４】
有機酸塩の含有量（重量％）は、細胞への損傷の観点から、有機酸塩及び溶媒の合計重量を基準として、０．００１〜０．１が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．０５である。
【００２５】
細胞洗浄液（Ｃ）及び細胞剥離液（Ｄ）はキレート剤（Ｂ）及び溶媒を必須成分として含有してなるが、必要により蛋白質分解酵素を含有させることができる。
細胞洗浄液（Ｃ）は、細胞の回収率の観点から、蛋白質分解酵素を含まないことが好ましい。蛋白質分解酵素を含有する場合、蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、細胞の剥離性及び細胞への損傷の観点から、蛋白質分解酵素、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．５以下が好ましく、さらに好ましくは０．１以下、特に好ましくは０．０１以下である。
細胞剥離液（Ｄ）の蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、細胞の剥離性および細胞への損傷の観点から、蛋白質分解酵素、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．０００１〜２．５が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１．０、特に好ましくは０．０１〜０．５である。
【００２６】
蛋白質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、プラスミン等）、チオールプロテアーゼ（パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＬ等）、カルボキシプロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、レニン等）、メタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ディスパ−ゼ等）、等が挙げられる。市場から容易に入手可能なものとしては、トリプシン、商品名「プロナーゼ」（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、商品名「ディスパーゼ」（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）、商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）、商品名「Ａｃｃｕｔａｓｅ」（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）等が挙げられる。このうち、細胞剥離性の観点から、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔが好ましい。ウイルス感染等の危険性の観点から、さらに好ましくはＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔである。
【００２７】
（Ｃ）及び（Ｄ）のｐＨは、細胞への損傷及び細胞剥離性の観点から、７．０〜８．５が好ましく、さらに好ましくは７．４〜８．０である。該ｐＨはリン酸緩衝液等の緩衝液を使用することで調整することができる。また、（Ｃ）及び（Ｄ）のｐＨは、同一でも異なっていてもよい。
【００２８】
本発明の細胞洗浄液（Ｃ）及び細胞剥離液（Ｄ）は、細胞培養担体表面に接着した接着依存性細胞を洗浄及び剥離するのに使用される。接着依存性細胞としては特に制限はなく、例えば哺乳類動物由来の正常細胞、哺乳類動物由来の株化細胞及び昆虫細胞等が挙げられる。
【００２９】
細胞培養に用いる培地としては特に制限はなく、血清培地及び無血清培地のいずれも使用可能である。血清培地としては、用いる細胞の種類に応じて、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、ＯＰＴＩ ＰＲＯTM ＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ ＡＴＧTM培地及びこれらの混合培地が挙げられる。
【００３０】
培養条件としては、特に制限なく、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２９体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しながら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【００３１】
播種する細胞の量としては、用いる細胞培養担体の種類や、細胞の種類等によって異なるが、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１０００万個が好ましく、さらに好ましくは１００〜１００万個、特に好ましくは１０００〜１０万個である。
【００３２】
本発明の剥離した細胞の製造方法は、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体を洗浄する洗浄工程と、洗浄後の細胞培養担体から付着した細胞を剥離する剥離工程を含んでなる。以下、各工程について順次説明する。
【００３３】
＜洗浄工程＞
洗浄工程では、培養液から取り出した細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着する培養液成分を除去する。洗浄方法としては以下の手順である。
培養液から取り出した、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体が入った容器内に細胞洗浄液を添加し、静置又は穏やかに攪拌する。次いで、静置することにより、（Ａ）を含んでなる細胞培養担体を容器内に沈降させ、上澄みの（Ａ）に残存していた培養液成分および細胞洗浄液を除去して廃棄する。
【００３４】
洗浄工程で用いる細胞洗浄液としては、従来の細胞洗浄液又はリン酸緩衝液（「組織培養の技術」 第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行に記載等）を用いることができる。
洗浄工程で用いる細胞洗浄液としては、細胞への損傷の観点から、等張液（細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好ましい。
洗浄工程で用いる細胞洗浄液としては、細胞への損傷、細胞回収率の観点から、蛋白質分解酵素を含まない細胞洗浄液を用いることが好ましい。
【００３５】
洗浄工程は、必要に応じて複数回繰り返して行うことができる。細胞の回収率及び細胞への損傷の観点から、洗浄工程の回数は１〜１０回が好ましく、さらに好ましくは２〜５回である。この洗浄工程の回数の範囲であると、（Ａ）に残存する培養液成分をより確実に除去することができ、細胞の（Ａ）への付着力をより低下させることができる。
【００３６】
＜剥離工程＞
剥離工程では、洗浄工程後の細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体から、付着した細胞を剥離する。剥離方法としては以下の手順である。
洗浄工程後の（Ａ）を含んでなる細胞付着担体の入った容器内に、細胞剥離液を添加し、好ましくは穏やかに攪拌することにより、付着した細胞を剥離する。また、必要に応じて、この工程において細胞剥離液をピペットにて吸引及び吐出し、穏やかに撹拌してもよい。
【００３７】
剥離工程で用いる細胞剥離液としては、従来の細胞剥離液（「組織培養の技術」 第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行に記載等）を用いることができる。
剥離工程で用いる細胞剥離液としては、細胞の回収率の観点から、蛋白質分解酵素を含む細胞剥離液を用いることが好ましい。
剥離工程で使用する細胞剥離液の蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、蛋白質分解酵素、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．００１〜２．５が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜１．０、特に好ましくは０．０１〜０．５である。
【００３８】
本発明の剥離した細胞の製造方法において、洗浄工程で細胞洗浄液（Ｃ）を用いる、又は剥離工程で細胞剥離液（Ｄ）を用いることが必須である。剥離の容易さの観点から、少なくとも洗浄工程で（Ｃ）を用いることが好ましく、さらに好ましくは洗浄工程で（Ｃ）を用い、且つ、剥離工程で（Ｄ）を用いることである。
【００３９】
洗浄工程及び剥離工程での、細胞洗浄液（Ｃ）又は細胞剥離液（Ｄ）の使用量（ｍＬ）は、用いる細胞培養担体の種類や細胞の種類によって異なるが、細胞への損傷、細胞の回収率の観点から、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当り、０．０００１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１、特に好ましくは０．００２〜０．５である。なお、洗浄工程および剥離工程での（Ｃ）及び（Ｄ）の使用量は、同一でも異なっていてもかまわない。
【００４０】
洗浄工程及び剥離工程での処理温度としては、細胞への損傷、細胞回収率の観点から、５〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは１５〜４５、特に好ましくは２５〜４０である。なお、洗浄工程および剥離工程での処理温度は、同一でも異なっていてもかまわない。
【００４１】
洗浄工程及び剥離工程での、（Ｃ）又は（Ｄ）による１回の処理時間は、細胞への損傷、細胞回収率の観点から、１〜６０分が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは５〜２０である。
【００４２】
細胞と細胞培養担体とを剥離した後、必要に応じて遠心分離等の操作により本発明の細胞剥離液を除去し、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳ）又は使用した培地で洗浄することで、目的の細胞が得られる。
細胞培養担体の形状が粒子状である場合、細胞と細胞担体との分離方法としては、沈降速度法、濾過、密度勾配遠心法等が使用できる。
この細胞はそのまま又は公知の支持体に貼付することにより、再生医療等に応用することができる。また、ＰＢＳ又は使用した培地に分散することで細胞懸濁液を得ることができる。この細胞懸濁液は、そのまま細胞培養に使用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例として掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
【００４４】
＜製造例１＞
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン６２４部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート３．１部を仕込み、窒素バブリングを３０分以上行って、溶存空気を追い出し７５℃まで昇温した。
別の反応器に８０％アクリル酸水溶液１７３部を仕込み、冷却しながら２８％水酸化ナトリウム水溶液２０７部を加えて中和した。この水溶液に架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝０．９０部及び重合開始剤｛過硫酸カリウム｝０．２７８部、連鎖移動剤｛次亜リン酸ナトリウム｝０．０５３部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より６．５ｍｌ／分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中（撹拌速度は５００ｒｐｍ）のシクロヘキサン液中に約１時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって１６０部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に１２０℃で２時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが６３μｍのふるい及び５３μｍのふるい（ＪＩＳ Ｚ８８０１−１：２０００）により分級して、粒子径５３〜６３μｍの粒子｛架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子｝を得た。
次に、得られた粒子に対して、エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として２％含むメタノール／イオン交換水（体積比７０／３０）溶液７．５部を添加し均一混合した。次いで、メタノールを風乾した後に密閉容器に入れ、８０℃で１時間保持し、表面架橋を行った。その後、順風乾燥機中で１２０℃で３０分間乾燥させて、吸水性樹脂（Ａ−１）を得た。（Ａ−１）の保水量は２１ｇ／ｇであった。
【００４５】
＜製造例２＞
「架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝の使用量を０．９０部から０．０１０６部に変更すること」及び「表面架橋しなかったこと｛エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として２％含むメタノール／イオン交換水溶液を添加せず、８０℃で１時間保持しなかったこと｝」以外、製造例１と同様にして、吸水性樹脂（Ａ−２）を得た。（Ａ−２）の保水量は５０ｇ／ｇであった。
【００４６】
＜製造例３＞
「架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝の使用量を０．９０部から４．５２部に変更すること」及び「２８％水酸化ナトリウム水溶液の使用量を２０７部から１１０部に変更すること」以外、製造例１と同様にして、吸水性樹脂（Ａ−３）を得た。（Ａ−３）の保水量は４ｇ／ｇであった。
【００４７】
＜製造例４＞
「架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝の使用量を０．９０部から４．５２部に変更すること」及び「８０％アクリル酸水溶液１７３部の代わりに８０％メタクリル酸水溶液２０７部を使用すること」以外、製造例１と同様にして、吸水性樹脂（Ａ−４）を得た。（Ａ−４）の保水量は２０ｇ／ｇであった。
【００４８】
＜実施例１＞
スピンナーフラスコへ、吸水性樹脂（Ａ−１）０．０３ｇおよびｐＨ＝７．２に調製したリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム０．０２％、リン酸二水素カリウム０．０７６％および塩化ナトリウム０．８５％を含む。以下、ＰＢＳと略記する。）１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、無血清培地（商品名：ＶＰ−ＳＦＭ、インビトロジェン（株）製）に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＶＥＲＯ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面を細胞で覆われるまで７日間培養を行い７日後の細胞培養液中の細胞が付着した（Ａ−１）を得た。
無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．２％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１）を除去した（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩を０．２％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。
この細胞懸濁液を５０μＬ採り、エリスロシンＢを０．０２％含むＰＢＳ溶液を５０μＬ添加し、赤血球計数板を用いて死細胞数と生細胞数を顕微鏡下目視により計数した。これらの細胞数より、下式に従って生存率を求め、表１に示した。
生存率（％）＝｛（総細胞数−死細胞数）／（総細胞数）｝×１００
７日後の細胞培養液を０．５ｍＬ採り、培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％およびクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数しこの数を（ａ）とした。細胞懸濁液を、目開き５７μｍのナイロン網でろ過し、細胞懸濁液から（Ａ−１）を除去した。ろ液を遠心操作することにより培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％およびクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数しこの数を（ｂ）とした。これらの細胞核数（ａ）及び（ｂ）より、下式に従って回収率を求め、表１に示した。
回収率（％）＝（ｂ）／（ａ）×１００
【００４９】
＜実施例２＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５０】
＜実施例３＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５１】
＜実施例４＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）５．０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−２）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで５分間保持した後、（Ｃ−２）を除去した（洗浄工程）。次いで、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−２）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５２】
＜実施例５＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例４と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５３】
＜実施例６＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例４と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５４】
＜実施例７＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．１％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−３）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−３）を除去した。同様にして再度（Ｃ−３）を加え除去する操作をもう１度行った（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）を０．１％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−３）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５５】
＜実施例８＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例７と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５６】
＜実施例９＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例７と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５７】
＜実施例１０＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．４０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−４）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−４）を除去した。エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．０３８％を含むＰＢＳ溶液[細胞洗浄液（Ｃ−５）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−５）を除去した（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩を０．０３８％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−４）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５８】
＜実施例１１＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１０と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５９】
＜実施例１２＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１０と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６０】
＜実施例１３＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．８０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−６）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−６）を除去した。ＰＢＳ溶液を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、ＰＢＳを除去した。（洗浄工程）。次いで、細胞剥離液（Ｄ−２）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６１】
＜実施例１４＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６２】
＜実施例１５＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６３】
＜実施例１６＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、ＰＢＳ溶液を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、ＰＢＳを除去した（洗浄工程）。エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）を０．４％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−５）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６４】
＜実施例１７＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１６と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６５】
＜実施例１８＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１６と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６６】
＜実施例１９＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６７】
＜実施例２０＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例４と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６８】
＜実施例２１＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例７と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６９】
＜実施例２２＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例１０と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７０】
＜実施例２３＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例１３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７１】
＜実施例２４＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、ニトリロ三酢酸二ナトリウム塩（Ｂ−２）１％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−７）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−７）を除去した（洗浄工程）。次いで、ニトリロ三酢酸二ナトリウム塩（Ｂ−２）を０．１％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−６）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７２】
＜実施例２５＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例２１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７３】
＜実施例２６＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、ジエチレントリアミン五酢酸三ナトリウム塩（Ｂ−３）１．５％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−８）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−８）を除去した（洗浄工程）。次いで、ジエチレントリアミン五酢酸三ナトリウム塩（Ｂ−３）を０．１５％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−７）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７４】
＜実施例２７＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例２３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７５】
＜実施例２８＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、細胞洗浄液（Ｃ−３）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−３）を除去した（洗浄工程）。次いで、インビトロジェン社製トリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩溶液（トリプシン濃度：０．２５％、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（Ｂ−１）濃度：０．０３８％）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７６】
＜実施例２９＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例２５と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７７】
＜実施例３０＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）１．０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１０）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１０）を除去した（洗浄工程）。次いで、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）を１．０％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−９）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７８】
＜実施例３１＞
スピンナーフラスコへ、吸水性樹脂（Ａ−１）０．０２５ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したＰＢＳ１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、無血清培地（商品名：ＯＰＴＩ ＰＲＯTM ＳＦＭ培地、インビトロジェン（株）製）を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＭＤＣＫ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、９０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面を細胞で覆われるまで４日間培養を行い４日後の細胞培養液中の細胞が付着した（Ａ−１）を得た。
無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．４％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１）を除去した（洗浄工程）。蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７９】
＜比較例１＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．０２％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−９）｝に１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−９）を除去した（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）を０．０２％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−８）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８０】
＜比較例２＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、細胞洗浄液（Ｃ−９）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−９）を除去した（洗浄工程）。次いで、インビトロジェン社製トリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩溶液（トリプシン濃度：０．２５％、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム濃度（Ｂ−１）：０．０３８％）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８１】
＜比較例３＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、比較例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８２】
＜比較例４＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、比較例２と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８３】
＜比較例５＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）０．０２％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１０）｝に１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１０）を除去した（洗浄工程）。次いで、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）を０．０２％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−９）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８４】
＜比較例６＞
実施例３１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。比較例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
以上の実施例及び比較例から、本発明の細胞洗浄液又は細胞剥離液を用いた場合、簡単に、高回収率で細胞を剥離することができることが明らかである。一方、本発明の細胞洗浄液及び細胞剥離液を使用しない比較例では、細胞の剥離性が悪く、回収率が低かった。すなわち、本発明の細胞洗浄液又は細胞剥離液を用いた場合のみ、細胞懸濁液が容易に得られ、また高回収率で細胞を回収できる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の細胞洗浄液、細胞剥離液及び剥離方法は、研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用することができる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用することができる。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の再生医療用細胞の培養に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞洗浄液、細胞剥離液及び細胞製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養担体と培養液を用いて細胞培養担体上で細胞を製造する方法において、細胞培養担体の表面から細胞を剥離する際には、０．２５％トリプシン、０．０２％エチレンジアミン四酢酸、０．８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウム、０．１１５％リン酸水素二ナトリウム及び０．０２％リン酸二水素カリウムからなる剥離液が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】組織培養の技術 第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、架橋ポリアクリル酸塩や、カルボキシル基を有する糖鎖高分子ゲル等の保水量の比較的大きい細胞培養担体を用いて増殖させた細胞は、この担体への細胞の接着力が強いために、上記トリプシン等からなる剥離液を用いた細胞剥離操作では細胞を剥離することが困難である。本発明の目的は、保水量の比較的大きい細胞培養担体に付着した細胞を容易かつ確実に剥離できる細胞洗浄液、細胞剥離液および剥離した細胞の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、特定の細胞洗浄液及び細胞剥離液が、特定の細胞培養担体を使用してこの担体表面で増殖させた細胞を容易かつ確実に剥離できることを見いだし、本発明に到達した。すなわち、本発明は、下記の３発明である。
（１）保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を洗浄するための細胞洗浄液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液（Ｃ）。
（２）保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離するための細胞剥離液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液（Ｄ）。
（３）培養液と保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体とを用いて細胞を培養した後、（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離してなる細胞の製造方法であって、下記洗浄工程及び剥離工程を含み、洗浄工程で細胞洗浄液（Ｃ）を使用する及び／又は剥離工程で細胞剥離液（Ｄ）を使用する細胞の製造方法。
洗浄工程：培養液から取り出した、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に細胞洗浄液を添加した後、細胞洗浄液を除去する工程
剥離工程：洗浄工程後、細胞の付着した細胞培養担体に細胞剥離液を添加し、細胞を剥離する工程
【発明の効果】
【０００５】
本発明の細胞洗浄液、細胞剥離液及び剥離した細胞の製造方法は、以下の効果を奏する。
（１）吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体からの細胞剥離が容易である。
（２）吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体からの細胞剥離が確実であり、培養細胞の収率が高く(高回収率及び高生存率)、培養細胞の生産性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
吸水性樹脂（Ａ）の生理食塩水に対する保水量（ｇ／ｇ）（以下、保水量）は、２〜５０であり、好ましくは４〜４０、さらに好ましくは８〜３０であり、特に好ましくは１０〜２５である。該保水量が２未満では細胞増殖性が悪くなり、５０を超えると（Ａ）の物理的強度が低くなるため増殖性が悪くなる。
なお、保水量は、次の方法で測定される。生理食塩水約１００ｍＬを入れたビーカーに、撹拌しながら乾燥した（Ａ）１．０ｇを投入し、あらかじめ膨潤させて膨潤樹脂を得た後、目開き５７μｍのナイロン網で作製した袋（縦２０ｃｍ、横１０ｃｍ）に移し、過剰の生理食塩水中に６０分間浸漬する。次いで、膨潤樹脂を袋ごと遠心脱水機に入れて、１５０Ｇで９０秒間遠心脱水を行い、余剰水を取り除く。遠心脱水後の重量（ｇ２）を測定し、次式から算出した値を保水量とする。なお、ナイロン網で作製した袋および生理食塩水については、ＪＩＳ Ｋ７２２３−１９９６に準拠する。
（保水量）＝（ｇ２）−１．０
【０００７】
吸水性樹脂（Ａ）としては、（Ａ）を含んでなる担体への細胞の接着性の観点から、アニオン性（塩）官能基を有するポリマーが好ましく、さらに好ましいのはアニオン性（塩）官能基がカルボキシル基であるポリマー、特に好ましいのは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）、アルギン酸（塩）、ヒアルロン酸（塩）、最も好ましいのは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
なお、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及び／又はメタクリル酸を意味し、酸（塩）とは、酸及び／又は酸塩を意味し、以下の記載において同様である。
【０００８】
（メタ）アクリル酸（塩）としては、アクリル酸又はメタクリル酸のアルカリ金属（リチウム、カリウム及びナトリウム等）塩、アルカリ土類金属（マグネシウム及びカルシウム等）塩及びアンモニウム塩等が用いられる。これらのうち、保水量の観点から、アルカリ金属塩が好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩、リチウム塩及びカリウム塩、特に好ましくはナトリウム塩及びリチウム塩、最も好ましくはナトリウム塩である。
【０００９】
架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）とは、（メタ）アクリル酸（塩）を必須成分とするモノマーを重合して得られる架橋重合体であり、特開２００６−５７０３９号公報、特開２００６−２１９６６１号公報、特開平９−１２４８７９号公報等に記載のものが含まれる。
【００１０】
吸水性樹脂（Ａ）の形状としては特に制限はなく、粒子状、塊状、シート状等が使用できる。細胞培養の効率の観点から、粒子状、シート状であることが好ましく、さらに好ましくは粒子状である。
【００１１】
吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体としては、（Ａ）をそのまま使用してもよいし、必要により細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチドを結合してもよい。
【００１２】
細胞培養担体の形状としては特に制限はなく、粒子状、塊状、シート状等が使用できる。細胞培養の効率の観点から、粒子状、シート状であることが好ましく、さらに好ましくは粒子状である。また、（Ａ）を基材にコーティングしたものも使用することができる。
コーティングする基材としては、シャーレ、フラスコ、ローラーボトル、プレート等が含まれる。材質としては、プラスチック、ガラス、天然由来材料（デキストラン、セルロース等）及び無機材料（ヒドロキシアパタイト等）等が挙げられる。
【００１３】
細胞培養担体の形状が粒子状の場合、その生理食塩水で膨潤された状態での直径（μｍ）としては、細胞の増殖性の観点から、２０〜５００が好ましく、さらに好ましくは５０〜４００、特に好ましくは８０〜３００、最も好ましくは１００〜２５０である。
【００１４】
（Ａ）を含んでなる細胞培養担体は、上記のとおり細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチドを結合してもよい。
細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が挙げられる。
これらのうち、細胞接着性の観点から、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列、Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ配列、Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ配列、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ 配列（８）、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（１０）、Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ配列（１１）、Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ配列（１２）、Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ配列（１３）、Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ配列（１４）、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ（１５）及びＰｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ（１５）及びＰｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列である。
【００１５】
（Ａ）とポリペプチドは、化学結合（イオン結合、水素結合及び／又は共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって結合されていてもよい。（Ａ）とポリペプチドが強固に結合される点で、化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００１６】
（Ａ）にポリペプチドを共有結合させる方法としては、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法等が挙げられ、具体的には、以下の（１）〜（２）の通りである。
（１）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ａ）のカルボキシル基とを反応させる場合、カルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが細胞培養用担体に由来する部分）｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、（Ａ）とポリペプチドとをアミド結合させる。
カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００１７】
（２）ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものと（Ａ）のカルボキシル基とを反応させる場合、（Ａ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、（Ａ）とポリペプチドとをエステル結合させる。
【００１８】
（Ａ）の表面積（ｃｍ2）当たりのポリペプチド含有量（μｇ）としては、細胞増殖性の観点から、０．００１〜１００であることが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜５０、特に好ましくは０．０２〜１０、最も好ましくは０．０５〜５である。
【００１９】
キレート剤（Ｂ）には、特開２００４−１３５５７１号公報、特開２００４−２６７０７１号公報等に記載の、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物、カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物、ジカルボン酸、アミノ基を少なくとも２個有する化合物、ヒドロキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物、メルカプト基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物並びにこれらの塩等が含まれる。
ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物並びにこの塩としては、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ウラミル二酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸及びこれらの金属塩等が挙げられる。
カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物としては、α−アラニン、グルタミン酸、チロシン、システイン及びグリシン等が挙げられる。
ジカルボン酸としては、シュウ酸、フタル酸、サリチル酸、酒石酸及びクエン酸等が挙げられる。
アミノ基を少なくとも２個有する化合物としては、フェナントロリン及びジメチルグリオキシム等が挙げられる。
ヒドロキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物としては、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸及びオキシン等が挙げられる。
メルカプト基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物としては、ジチゾン等が挙げられる。
これらのうち、細胞への毒性およびキレート化能の観点から、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物並びにこの塩が好ましく、さらに好ましくはエチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ウラミル二酢酸並びにこれらの塩が好ましく、特に好ましくはエチレンジアミン四酢酸及びこの塩、最も好ましくはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩及びエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩である。
【００２０】
細胞洗浄液（Ｃ）又は細胞剥離液（Ｄ）中の（Ｂ）の含有量（重量％）は、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５であり、好ましくは０．１２〜２．５、さらに好ましくは０．１５〜１．５、特に好ましくは０．２〜１．０である。（Ｂ）の含有量が０．１未満では細胞剥離性が悪くなり、５を超えると細胞への損傷が悪くなる。
【００２１】
溶媒としては特に制限はないが、細胞への損傷及び取り扱い性等の観点から、水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等が使用できる。
また、溶媒としての水には、無機塩｛リン酸塩（リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等）、塩化物（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）等｝、有機酸塩（ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム等）、アミノ酸（塩）｛必須アミノ酸（リジン、スレオニン、フェニルアラニン等）、非必須アミノ酸（グリシン、グルタミン、セリン等｝、ビタミン（葉酸、イノシトール、ニコチンアミド等）、糖（グルコース等）、酸（塩酸、酢酸、リン酸等）及び／又は塩基（水酸化ナトリウム等）等の溶質を、溶質及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５０重量％含有することができる。細胞への損傷の観点から、無機塩、有機酸、糖、酸及び／又は塩基を含有することが好ましい。
【００２２】
無機塩の含有量（重量％）は、（Ｃ）及び（Ｄ）を等張液として調整する観点並びに細胞への損傷の観点から、無機塩及び溶媒の合計重量を基準として、０．２〜１．５が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．０、特に好ましくは０．７〜０．９である。
【００２３】
糖の含有量（重量％）は、細胞への損傷の観点から、糖及び溶媒の合計重量を基準として、０．００５〜０．５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．２、特に好ましくは０．０５〜０．１である。
【００２４】
有機酸塩の含有量（重量％）は、細胞への損傷の観点から、有機酸塩及び溶媒の合計重量を基準として、０．００１〜０．１が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．０５である。
【００２５】
細胞洗浄液（Ｃ）及び細胞剥離液（Ｄ）はキレート剤（Ｂ）及び溶媒を必須成分として含有してなるが、必要により蛋白質分解酵素を含有させることができる。
細胞洗浄液（Ｃ）は、細胞の回収率の観点から、蛋白質分解酵素を含まないことが好ましい。蛋白質分解酵素を含有する場合、蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、細胞の剥離性及び細胞への損傷の観点から、蛋白質分解酵素、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．５以下が好ましく、さらに好ましくは０．１以下、特に好ましくは０．０１以下である。
細胞剥離液（Ｄ）の蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、細胞の剥離性および細胞への損傷の観点から、蛋白質分解酵素、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．０００１〜２．５が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１．０、特に好ましくは０．０１〜０．５である。
【００２６】
蛋白質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、プラスミン等）、チオールプロテアーゼ（パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＬ等）、カルボキシプロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、レニン等）、メタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ディスパ−ゼ等）、等が挙げられる。市場から容易に入手可能なものとしては、トリプシン、商品名「プロナーゼ」（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、商品名「ディスパーゼ」（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）、商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）、商品名「Ａｃｃｕｔａｓｅ」（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）等が挙げられる。このうち、細胞剥離性の観点から、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔが好ましい。ウイルス感染等の危険性の観点から、さらに好ましくはＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔである。
【００２７】
（Ｃ）及び（Ｄ）のｐＨは、細胞への損傷及び細胞剥離性の観点から、７．０〜８．５が好ましく、さらに好ましくは７．４〜８．０である。該ｐＨはリン酸緩衝液等の緩衝液を使用することで調整することができる。また、（Ｃ）及び（Ｄ）のｐＨは、同一でも異なっていてもよい。
【００２８】
本発明の細胞洗浄液（Ｃ）及び細胞剥離液（Ｄ）は、細胞培養担体表面に接着した接着依存性細胞を洗浄及び剥離するのに使用される。接着依存性細胞としては特に制限はなく、例えば哺乳類動物由来の正常細胞、哺乳類動物由来の株化細胞及び昆虫細胞等が挙げられる。
【００２９】
細胞培養に用いる培地としては特に制限はなく、血清培地及び無血清培地のいずれも使用可能である。血清培地としては、用いる細胞の種類に応じて、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、ＯＰＴＩ ＰＲＯTM ＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ ＡＴＧTM培地及びこれらの混合培地が挙げられる。
【００３０】
培養条件としては、特に制限なく、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２９体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しながら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【００３１】
播種する細胞の量としては、用いる細胞培養担体の種類や、細胞の種類等によって異なるが、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１０００万個が好ましく、さらに好ましくは１００〜１００万個、特に好ましくは１０００〜１０万個である。
【００３２】
本発明の剥離した細胞の製造方法は、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体を洗浄する洗浄工程と、洗浄後の細胞培養担体から付着した細胞を剥離する剥離工程を含んでなる。以下、各工程について順次説明する。
【００３３】
＜洗浄工程＞
洗浄工程では、培養液から取り出した細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着する培養液成分を除去する。洗浄方法としては以下の手順である。
培養液から取り出した、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体が入った容器内に細胞洗浄液を添加し、静置又は穏やかに攪拌する。次いで、静置することにより、（Ａ）を含んでなる細胞培養担体を容器内に沈降させ、上澄みの（Ａ）に残存していた培養液成分および細胞洗浄液を除去して廃棄する。
【００３４】
洗浄工程で用いる細胞洗浄液としては、従来の細胞洗浄液又はリン酸緩衝液（「組織培養の技術」 第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行に記載等）を用いることができる。
洗浄工程で用いる細胞洗浄液としては、細胞への損傷の観点から、等張液（細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好ましい。
洗浄工程で用いる細胞洗浄液としては、細胞への損傷、細胞回収率の観点から、蛋白質分解酵素を含まない細胞洗浄液を用いることが好ましい。
【００３５】
洗浄工程は、必要に応じて複数回繰り返して行うことができる。細胞の回収率及び細胞への損傷の観点から、洗浄工程の回数は１〜１０回が好ましく、さらに好ましくは２〜５回である。この洗浄工程の回数の範囲であると、（Ａ）に残存する培養液成分をより確実に除去することができ、細胞の（Ａ）への付着力をより低下させることができる。
【００３６】
＜剥離工程＞
剥離工程では、洗浄工程後の細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体から、付着した細胞を剥離する。剥離方法としては以下の手順である。
洗浄工程後の（Ａ）を含んでなる細胞付着担体の入った容器内に、細胞剥離液を添加し、好ましくは穏やかに攪拌することにより、付着した細胞を剥離する。また、必要に応じて、この工程において細胞剥離液をピペットにて吸引及び吐出し、穏やかに撹拌してもよい。
【００３７】
剥離工程で用いる細胞剥離液としては、従来の細胞剥離液（「組織培養の技術」 第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行に記載等）を用いることができる。
剥離工程で用いる細胞剥離液としては、細胞の回収率の観点から、蛋白質分解酵素を含む細胞剥離液を用いることが好ましい。
剥離工程で使用する細胞剥離液の蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、蛋白質分解酵素、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．００１〜２．５が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜１．０、特に好ましくは０．０１〜０．５である。
【００３８】
本発明の剥離した細胞の製造方法において、洗浄工程で細胞洗浄液（Ｃ）を用いる、又は剥離工程で細胞剥離液（Ｄ）を用いることが必須である。剥離の容易さの観点から、少なくとも洗浄工程で（Ｃ）を用いることが好ましく、さらに好ましくは洗浄工程で（Ｃ）を用い、且つ、剥離工程で（Ｄ）を用いることである。
【００３９】
洗浄工程及び剥離工程での、細胞洗浄液（Ｃ）又は細胞剥離液（Ｄ）の使用量（ｍＬ）は、用いる細胞培養担体の種類や細胞の種類によって異なるが、細胞への損傷、細胞の回収率の観点から、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当り、０．０００１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１、特に好ましくは０．００２〜０．５である。なお、洗浄工程および剥離工程での（Ｃ）及び（Ｄ）の使用量は、同一でも異なっていてもかまわない。
【００４０】
洗浄工程及び剥離工程での処理温度としては、細胞への損傷、細胞回収率の観点から、５〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは１５〜４５、特に好ましくは２５〜４０である。なお、洗浄工程および剥離工程での処理温度は、同一でも異なっていてもかまわない。
【００４１】
洗浄工程及び剥離工程での、（Ｃ）又は（Ｄ）による１回の処理時間は、細胞への損傷、細胞回収率の観点から、１〜６０分が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは５〜２０である。
【００４２】
細胞と細胞培養担体とを剥離した後、必要に応じて遠心分離等の操作により本発明の細胞剥離液を除去し、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳ）又は使用した培地で洗浄することで、目的の細胞が得られる。
細胞培養担体の形状が粒子状である場合、細胞と細胞担体との分離方法としては、沈降速度法、濾過、密度勾配遠心法等が使用できる。
この細胞はそのまま又は公知の支持体に貼付することにより、再生医療等に応用することができる。また、ＰＢＳ又は使用した培地に分散することで細胞懸濁液を得ることができる。この細胞懸濁液は、そのまま細胞培養に使用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例として掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
【００４４】
＜製造例１＞
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン６２４部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート３．１部を仕込み、窒素バブリングを３０分以上行って、溶存空気を追い出し７５℃まで昇温した。
別の反応器に８０％アクリル酸水溶液１７３部を仕込み、冷却しながら２８％水酸化ナトリウム水溶液２０７部を加えて中和した。この水溶液に架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝０．９０部及び重合開始剤｛過硫酸カリウム｝０．２７８部、連鎖移動剤｛次亜リン酸ナトリウム｝０．０５３部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より６．５ｍｌ／分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中（撹拌速度は５００ｒｐｍ）のシクロヘキサン液中に約１時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって１６０部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に１２０℃で２時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが６３μｍのふるい及び５３μｍのふるい（ＪＩＳ Ｚ８８０１−１：２０００）により分級して、粒子径５３〜６３μｍの粒子｛架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子｝を得た。
次に、得られた粒子に対して、エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として２％含むメタノール／イオン交換水（体積比７０／３０）溶液７．５部を添加し均一混合した。次いで、メタノールを風乾した後に密閉容器に入れ、８０℃で１時間保持し、表面架橋を行った。その後、順風乾燥機中で１２０℃で３０分間乾燥させて、吸水性樹脂（Ａ−１）を得た。（Ａ−１）の保水量は２１ｇ／ｇであった。
【００４５】
＜製造例２＞
「架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝の使用量を０．９０部から０．０１０６部に変更すること」及び「表面架橋しなかったこと｛エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として２％含むメタノール／イオン交換水溶液を添加せず、８０℃で１時間保持しなかったこと｝」以外、製造例１と同様にして、吸水性樹脂（Ａ−２）を得た。（Ａ−２）の保水量は５０ｇ／ｇであった。
【００４６】
＜製造例３＞
「架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝の使用量を０．９０部から４．５２部に変更すること」及び「２８％水酸化ナトリウム水溶液の使用量を２０７部から１１０部に変更すること」以外、製造例１と同様にして、吸水性樹脂（Ａ−３）を得た。（Ａ−３）の保水量は４ｇ／ｇであった。
【００４７】
＜製造例４＞
「架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝の使用量を０．９０部から４．５２部に変更すること」及び「８０％アクリル酸水溶液１７３部の代わりに８０％メタクリル酸水溶液２０７部を使用すること」以外、製造例１と同様にして、吸水性樹脂（Ａ−４）を得た。（Ａ−４）の保水量は２０ｇ／ｇであった。
【００４８】
＜実施例１＞
スピンナーフラスコへ、吸水性樹脂（Ａ−１）０．０３ｇおよびｐＨ＝７．２に調製したリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム０．０２％、リン酸二水素カリウム０．０７６％および塩化ナトリウム０．８５％を含む。以下、ＰＢＳと略記する。）１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、無血清培地（商品名：ＶＰ−ＳＦＭ、インビトロジェン（株）製）に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＶＥＲＯ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面を細胞で覆われるまで７日間培養を行い７日後の細胞培養液中の細胞が付着した（Ａ−１）を得た。
無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．２％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１）を除去した（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩を０．２％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。
この細胞懸濁液を５０μＬ採り、エリスロシンＢを０．０２％含むＰＢＳ溶液を５０μＬ添加し、赤血球計数板を用いて死細胞数と生細胞数を顕微鏡下目視により計数した。これらの細胞数より、下式に従って生存率を求め、表１に示した。
生存率（％）＝｛（総細胞数−死細胞数）／（総細胞数）｝×１００
７日後の細胞培養液を０．５ｍＬ採り、培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％およびクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数しこの数を（ａ）とした。細胞懸濁液を、目開き５７μｍのナイロン網でろ過し、細胞懸濁液から（Ａ−１）を除去した。ろ液を遠心操作することにより培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％およびクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数しこの数を（ｂ）とした。これらの細胞核数（ａ）及び（ｂ）より、下式に従って回収率を求め、表１に示した。
回収率（％）＝（ｂ）／（ａ）×１００
【００４９】
＜実施例２＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５０】
＜実施例３＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５１】
＜実施例４＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）５．０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−２）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで５分間保持した後、（Ｃ−２）を除去した（洗浄工程）。次いで、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−２）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５２】
＜実施例５＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例４と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５３】
＜実施例６＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例４と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５４】
＜実施例７＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．１％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−３）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−３）を除去した。同様にして再度（Ｃ−３）を加え除去する操作をもう１度行った（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）を０．１％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−３）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５５】
＜実施例８＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例７と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５６】
＜実施例９＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例７と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５７】
＜実施例１０＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．４０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−４）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−４）を除去した。エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．０３８％を含むＰＢＳ溶液[細胞洗浄液（Ｃ−５）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−５）を除去した（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩を０．０３８％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−４）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５８】
＜実施例１１＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１０と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００５９】
＜実施例１２＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１０と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６０】
＜実施例１３＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．８０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−６）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−６）を除去した。ＰＢＳ溶液を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、ＰＢＳを除去した。（洗浄工程）。次いで、細胞剥離液（Ｄ−２）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６１】
＜実施例１４＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６２】
＜実施例１５＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６３】
＜実施例１６＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、ＰＢＳ溶液を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、ＰＢＳを除去した（洗浄工程）。エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）を０．４％、蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−５）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６４】
＜実施例１７＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−２）を使用すること以外、実施例１６と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６５】
＜実施例１８＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−３）を使用すること以外、実施例１６と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６６】
＜実施例１９＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６７】
＜実施例２０＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例４と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６８】
＜実施例２１＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例７と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００６９】
＜実施例２２＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例１０と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７０】
＜実施例２３＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例１３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７１】
＜実施例２４＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、ニトリロ三酢酸二ナトリウム塩（Ｂ−２）１％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−７）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−７）を除去した（洗浄工程）。次いで、ニトリロ三酢酸二ナトリウム塩（Ｂ−２）を０．１％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−６）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７２】
＜実施例２５＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例２１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７３】
＜実施例２６＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、ジエチレントリアミン五酢酸三ナトリウム塩（Ｂ−３）１．５％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−８）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−８）を除去した（洗浄工程）。次いで、ジエチレントリアミン五酢酸三ナトリウム塩（Ｂ−３）を０．１５％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−７）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７４】
＜実施例２７＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例２３と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７５】
＜実施例２８＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、細胞洗浄液（Ｃ−３）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−３）を除去した（洗浄工程）。次いで、インビトロジェン社製トリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩溶液（トリプシン濃度：０．２５％、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（Ｂ−１）濃度：０．０３８％）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７６】
＜実施例２９＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、実施例２５と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７７】
＜実施例３０＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）１．０％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１０）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１０）を除去した（洗浄工程）。次いで、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）を１．０％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−９）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７８】
＜実施例３１＞
スピンナーフラスコへ、吸水性樹脂（Ａ−１）０．０２５ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したＰＢＳ１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、無血清培地（商品名：ＯＰＴＩ ＰＲＯTM ＳＦＭ培地、インビトロジェン（株）製）を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＭＤＣＫ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、９０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面を細胞で覆われるまで４日間培養を行い４日後の細胞培養液中の細胞が付着した（Ａ−１）を得た。
無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．４％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１）を除去した（洗浄工程）。蛋白質分解酵素（商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ」、インビトロジェン（株）製）を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−１）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００７９】
＜比較例１＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）０．０２％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−９）｝に１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−９）を除去した（洗浄工程）。次いで、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（Ｂ−１）を０．０２％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−８）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８０】
＜比較例２＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、細胞洗浄液（Ｃ−９）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−９）を除去した（洗浄工程）。次いで、インビトロジェン社製トリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩溶液（トリプシン濃度：０．２５％、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム濃度（Ｂ−１）：０．０３８％）を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８１】
＜比較例３＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、比較例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８２】
＜比較例４＞
吸水性樹脂（Ａ−１）の代わりに吸水性樹脂（Ａ−４）を使用すること以外、比較例２と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８３】
＜比較例５＞
実施例１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。無血清培地を除去し、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）０．０２％を含むＰＢＳ溶液｛細胞洗浄液（Ｃ−１０）｝に１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持した後、（Ｃ−１０）を除去した（洗浄工程）。次いで、クエン酸ナトリウム塩（Ｂ−４）を０．０２％、蛋白質分解酵素｛商品名「ＴｒｙｐＬＥTM Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン（株）製）｝を１０％含むＰＢＳ溶液｛細胞剥離液（Ｄ−９）｝を１０ｍＬ加え、３７℃、６０ｒｐｍで１０分間保持し、細胞懸濁液を得た（剥離工程）。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８４】
＜比較例６＞
実施例３１と同様にして細胞が付着した（Ａ−１）を得た。比較例１と同様にして細胞懸濁液を得た。実施例１と同様にして、生存率及び回収率を求め、その結果を表１に示した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
以上の実施例及び比較例から、本発明の細胞洗浄液又は細胞剥離液を用いた場合、簡単に、高回収率で細胞を剥離することができることが明らかである。一方、本発明の細胞洗浄液及び細胞剥離液を使用しない比較例では、細胞の剥離性が悪く、回収率が低かった。すなわち、本発明の細胞洗浄液又は細胞剥離液を用いた場合のみ、細胞懸濁液が容易に得られ、また高回収率で細胞を回収できる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の細胞洗浄液、細胞剥離液及び剥離方法は、研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用することができる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用することができる。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の再生医療用細胞の培養に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を洗浄するための細胞洗浄液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液（Ｃ）。
【請求項２】
保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離するための細胞剥離液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液（Ｄ）。
【請求項３】
培養液と保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体とを用いて細胞を培養した後、（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離してなる細胞の製造方法であって、下記洗浄工程及び剥離工程を含み、洗浄工程で下記細胞洗浄液（Ｃ）を使用する及び／又は剥離工程で下記細胞剥離液（Ｄ）を使用する細胞の製造方法。
洗浄工程：培養液から取り出した、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に細胞洗浄液を添加した後、細胞洗浄液を除去する工程
剥離工程：洗浄工程後、細胞の付着した細胞培養担体に細胞剥離液を添加し、細胞を剥離する工程
細胞洗浄液（Ｃ）：キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液
細胞剥離液（Ｄ）：キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液
【請求項４】
洗浄工程で用いる（Ｃ）が蛋白質分解酵素を含まない細胞洗浄液である、及び／又は、剥離工程で用いる（Ｄ）が蛋白質分解酵素を含む細胞剥離液である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
洗浄工程及び剥離工程での細胞洗浄液（Ｃ）又は細胞剥離液（Ｄ）の使用量（ｍＬ）が、用いる細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当り、０．０００１〜１０である請求項３又は４に記載の製造方法。
【請求項１】
保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を洗浄するための細胞洗浄液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液（Ｃ）。
【請求項２】
保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離するための細胞剥離液であって、キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液（Ｄ）。
【請求項３】
培養液と保水量が２〜５０ｇ／ｇである吸水性樹脂（Ａ）を含んでなる細胞培養担体とを用いて細胞を培養した後、（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に付着した細胞を剥離してなる細胞の製造方法であって、下記洗浄工程及び剥離工程を含み、洗浄工程で下記細胞洗浄液（Ｃ）を使用する及び／又は剥離工程で下記細胞剥離液（Ｄ）を使用する細胞の製造方法。
洗浄工程：培養液から取り出した、細胞の付着した（Ａ）を含んでなる細胞培養担体に細胞洗浄液を添加した後、細胞洗浄液を除去する工程
剥離工程：洗浄工程後、細胞の付着した細胞培養担体に細胞剥離液を添加し、細胞を剥離する工程
細胞洗浄液（Ｃ）：キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞洗浄液
細胞剥離液（Ｄ）：キレート剤（Ｂ）及び溶媒を含んでなり、（Ｂ）の含有量が、（Ｂ）及び溶媒の合計重量を基準として、０．１〜５重量％である細胞剥離液
【請求項４】
洗浄工程で用いる（Ｃ）が蛋白質分解酵素を含まない細胞洗浄液である、及び／又は、剥離工程で用いる（Ｄ）が蛋白質分解酵素を含む細胞剥離液である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
洗浄工程及び剥離工程での細胞洗浄液（Ｃ）又は細胞剥離液（Ｄ）の使用量（ｍＬ）が、用いる細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当り、０．０００１〜１０である請求項３又は４に記載の製造方法。
【公開番号】特開２００９−５５９０４（Ｐ２００９−５５９０４Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９８０６８（Ｐ２００８−１９８０６８）
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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