細胞融合制御法、それに用いる遺伝子組換え用ベクターおよび細胞融合制御剤
【課題】細胞内に存在する物質を利用して、細胞融合を制御する方法を提供すること。
【解決手段】本発明の細胞融合制御方法は、動物細胞の細胞融合制御方法であって、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、細胞融合を促進または抑制することを特徴とする。
【解決手段】本発明の細胞融合制御方法は、動物細胞の細胞融合制御方法であって、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、細胞融合を促進または抑制することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合制御法、それに用いる遺伝子組換え用ベクターおよび細胞融合制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞融合は、複数の細胞の細胞膜が融合し、細胞が多核化する現象である。細胞融合は、生体では、筋原細胞の分化、哺乳類の胎盤形成、免疫応答、腫瘍発生、幹細胞による組織再生の際など、様々な生命活動において認められる。例えば、哺乳類の胎盤において、母体血液と接する胎児絨毛組織の最外層は、細胞融合した細胞性栄養膜細胞が分化し、多核合胞体細胞塊構造を形成している。
【０００３】
一方で近年、細胞融合を人為的に生じさせる方法が開発されており、細胞融合方法は、遺伝子発現、染色体マッピング、抗体産生、がん免疫療法等において有力な手段となっている。従来用いられている細胞融合方法としては、センダイウイルス等のウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の化学物質、電気刺激等を用いる方法がある。例えば、抗体産生への応用においては、ＰＥＧまたは電気刺激の利用により、ミエローマ細胞と脾細胞とを細胞融合し、その融合細胞を選択培養したハイブリドーマが利用されている（例えば、下記の非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、化学物質や電気刺激を用いる方法は、融合させる細胞に対して、化学的あるいは物理的な細胞傷害を与えてしまうという問題がある。センダイウイルス等のウイルスを用いる方法は、細胞傷害性は比較的低いものの、融合可能な細胞種が限られる。また、いずれの方法も、通常は細胞内に存在しない物質あるいは刺激等を適用することから、融合処理により、細胞機能に何らかの影響を与える可能性がある。したがって、従来の細胞融合方法は、実験手法としてだけでなく、細胞融合過程に起因する疾病の治療等の生体への応用においても問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】安東・千葉「単クローン抗体実験操作入門」、講談社、ｐ７０−９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、細胞内に存在する物質を利用して、細胞融合を制御する方法を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題の解決のため研究解析を進めた結果、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の２つの分子が、二次元電気泳動による解析により、細胞融合（Ｆｕｓｉｏｎ）特異的に変化することを見出した。さらに、これら２つのタンパク質の発現を抑制したところ、いずれも細胞融合を促進させること等を明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、医学・医療上および産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｋ）の発明を包含するものである。
Ａ） 動物細胞の細胞融合制御方法であって、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
Ｂ） 前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の抑制である上記Ａ）記載の細胞融合制御方法。
Ｃ） 前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の促進である上記Ａ）記載の細胞融合制御方法。
Ｄ） 前記タンパク質の発現の抑制が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による抑制である上記Ｂ）記載の細胞融合制御方法。
Ｅ） 前記ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現によるものである上記Ｄ）記載の細胞融合制御方法。
Ｆ） 動物細胞の細胞融合制御方法であって、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の改変ポリペプチドを細胞内発現させることにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
Ｇ） 前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のリン酸化部位であるＣ末端のアミノ酸残基部分を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである上記Ｆ）記載の細胞融合制御方法。
Ｈ） 前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のＣ末端から最大５６個のアミノ酸残基を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである上記Ｆ）記載の細胞融合制御方法。
Ｉ） フォルスコリン存在下で、前記タンパク質またはその改変ポリペプチドの発現を制御することを特徴とする上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の細胞融合制御方法。
Ｊ） 上記Ａ）〜Ｉ）のいずれかに記載の細胞融合制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、前記タンパク質またはその改変ポリペプチド、あるいは、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも１つを目的細胞内で発現するよう構築された遺伝子組換え用ベクター。
Ｋ） 上記Ｊ）に記載の遺伝子組換え用ベクターを含有する細胞融合制御剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞内に存在する物質を利用して、細胞融合を制御することが可能であり、新たな細胞融合制御方法として種々の分野に適用可能である。例えば、細胞融合過程に起因する疾病の治療法、再生医療技術、抗体産生技術等への利用が例示される。細胞融合過程に起因する疾病としては、例えば、筋ジストロフィーなどの筋肉疾患、骨大理石病、胎盤傷害等が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
前述のように、本発明の細胞融合制御方法は、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下、略して「ＧＡＰＤＨ」という場合がある。）、および、カルポニン３（以下、略して「ＣＮＮ３」という場合がある。）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、動物細胞の細胞融合を促進または抑制するものである。
【００１１】
ＧＡＰＤＨは、解糖系酵素として機能するほか、ＤＮＡ修復や複製、アポトーシス等に関与するタンパク質である。本発明において、ＧＡＰＤＨは、目的細胞種においてＧＡＰＤＨとして機能するタンパク質であればよく、それ以外は特に限定されない。例えば、ヒト胎盤絨毛癌由来細胞であるＢｅＷｏ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧＡＰＤＨを発現する。
【００１２】
カルポニン３は、カルポニンファミリーに属するタンパク質の１つである。本発明において、カルポニン３は、目的細胞種においてカルポニン３として機能するタンパク質であればよく、それ以外は特に限定されない。例えば、ヒト胎盤絨毛癌由来細胞であるＢｅＷｏ細胞は、配列番号２のアミノ酸配列からなるカルポニン３を発現する。
【００１３】
ＧＡＰＤＨおよびカルポニン３（以下、これら２つの分子を総称して「前記タンパク質」という場合がある。）の発現の制御は、目的細胞の細胞融合に変化をもたらしうるものであれば、発現を抑制するものであってもよいし、逆に、発現を促進するものであってもよい。
【００１４】
発現の抑制方法は、特に制限されず、例えば、前記タンパク質の遺伝子の転写の抑制、あるいは翻訳の抑制等が挙げられる。代表的な発現の抑制方法としては、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）やｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）等のｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法等が挙げられる。
【００１５】
一方、発現の促進方法も、特に制限されず、例えば、前記タンパク質の遺伝子の転写の促進、あるいは翻訳の促進等が挙げられる。代表的な発現の促進方法としては、例えば、目的細胞で機能するプロモーターの下流にＧＡＰＤＨ（またはカルポニン３）の遺伝子（ｃＤＮＡ）を配置した発現ベクターを用いて、目的細胞で前記タンパク質の発現を促進する方法等が挙げられる。
【００１６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法による発現抑制方法としては、一般的に使用されている公知の方法を適用することができ、特に制限されるものではない。例えば、前記タンパク質のｍＲＮＡの標的部位のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｄｓＲＮＡを細胞に導入することにより、前記タンパク質の発現を抑制する方法等が挙げられる。ｄｓＲＮＡとしては、例えば、短鎖のｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡや、ヘアピン状に折り畳まれたｓｈＲＮＡが挙げられる。
【００１７】
ｓｉＲＮＡは、前記タンパク質の発現を抑制できる短鎖のｄｓＲＮＡであればよく、特に限定されない。ｓｉＲＮＡの鎖長は、特に限定されないが、例えば、５〜２００塩基対であり、好ましくは、１０〜５０塩基対であり、より好ましくは、１５〜２５塩基対である。また、ｓｉＲＮＡは、前記タンパク質のｍＲＮＡに完全に対合しなくてもよく、ミスマッチやバルジ等の対合しない部分を含んでいてもよい。
【００１８】
ｓｈＲＮＡは、前記タンパク質の発現を抑制できるヘアピン状に折り畳まれたｄｓＲＮＡであればよく、特に限定されない。ｓｈＲＮＡの鎖長については、ｓｈＲＮＡは転写されたのちに切断されてｓｉＲＮＡとなるので、結果として、標的配列に対合して効果を発揮する配列の長さは上記ｓｉＲＮＡと同じであるが、それ以外にヘアピン部分がある。
【００１９】
ＧＡＰＤＨの発現を抑制する前記ｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）用の標的配列（センス）としては、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）の配列が挙げられる。
（Ａ）配列番号３の塩基配列。
（Ｂ）配列番号４の塩基配列。
【００２０】
カルポニン３の発現を抑制する前記ｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）用の標的配列（センス）としては、例えば、以下の（Ｃ）または（Ｄ）の配列が挙げられる。
（Ｃ）配列番号５の塩基配列。
（Ｄ）配列番号６の塩基配列。
【００２１】
また、本発明の細胞融合制御方法は、前記タンパク質（即ち、ＧＡＰＤＨおよびカルポニン３の少なくとも一方のタンパク質）の改変ポリペプチドを目的細胞で発現させることにより、細胞融合を促進または抑制する方法であってもよい。
【００２２】
前記タンパク質の改変ポリペプチドは、その発現により目的細胞の細胞融合に変化をもたらしうるものであれば、特に制限されるものではない。例えば、カルポニン３の改変ポリペプチドとして、Ｃ末端のリン酸化を受ける配列部分を欠失した改変ポリペプチドを用いてもよい。後述の実施例に示すように、Ｃ末端から５６個のアミノ酸の欠失により、カルポニン３改変ポリペプチドはリン酸化部分３つを失い、この改変ポリペプチドを細胞内発現させることにより、細胞融合を抑制することができた。
【００２３】
本発明の遺伝子組換え用ベクターは、目的細胞に導入することで、前記タンパク質（ＧＡＰＤＨもしくはカルポニン３）またはその改変ポリペプチド、あるいは、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも１つを発現するよう構築されたものであればよく、特に限定されない。本発明の遺伝子組換え用ベクターは、さらに、プロモーターや選択マーカー等を有していてもよい。
【００２４】
プロモーターは、目的細胞で機能するものであれば特に制限されるものではなく、例えば、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲプロモーター、Ｔ３プロモーター等が挙げられる。
【００２５】
選択マーカーについても特に制限されるものではなく、例えば、薬剤耐性マーカー、酵素マーカー、蛍光タンパク質マーカー等が挙げられる。本発明の細胞融合制御法において、融合細胞の識別用に、蛍光タンパク質マーカーを用いてもよい。蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ. ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
【００２６】
本発明の遺伝子組換え用ベクターの種類は、特に限定されず、目的細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスベクター、プラスミド等が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。
【００２７】
本発明の細胞融合制御方法において、細胞融合に用いる細胞は、動物細胞であればよく、特に限定されない。例えば、動物の生体から採取した細胞を用いてもよく、樹立された培養細胞株や、形質転換された細胞株等を用いてもよい。一例として、後述の実施例で使用したヒト胎盤絨毛癌由来細胞であるＢｅＷｏ細胞や、２９３細胞等が挙げられる。
【００２８】
細胞融合の方法は、特に制限されず、例えば、本発明の遺伝子組換え用ベクターを導入した細胞をフォルスコリン存在下で培養する方法でもよい。また、細胞融合の方法として、融合した細胞を検出する場合には、例えば、以下のような方法を用いてもよい。
【００２９】
まず、選択マーカーのみが異なる２種類の本発明の遺伝子組換え用ベクターを準備する。選択マーカーとしては、例えば、細胞質で発色するＤｓＲｅｄと、核で発色するＣＦＰ−Ｎｕｃ（核移行シグナルを付加したＣＦＰ）等のように、細胞内の蛍光発色部が異なる２つのマーカーを用いる。融合する細胞として、上記２種類のベクターを１種類ずつ導入した、２つの細胞群を調製する。２つの細胞群は、それぞれ培養液に懸濁してウェルディッシュに同細胞数ずつ播種し、フォルスコリン存在下で２〜３日間培養し、細胞融合させる。融合した細胞の検出方法は、例えば、培養後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察し、２種類の選択マーカーが同時に発色している細胞の割合（細胞融合率）および平均核数（細胞内核数の平均値）を計測し、細胞融合制御を評価する。
【００３０】
本発明の細胞融合制御剤は、特に限定されず、本発明の遺伝子組換え用ベクターを含んでいればよい。本発明の細胞融合制御剤は、例えば、さらに培養液、緩衝液、細胞融合誘導物質、細胞融合抑制物質等を含んでいてもよい。細胞融合誘導物質としては、例えば、フォルスコリン等が挙げられる。
【００３１】
本発明の細胞融合制御剤の用途は、特に限定されず、例えば、細胞融合過程に起因する疾病の治療法、再生医療技術、抗体産生技術等が挙げられる。細胞融合過程に起因する疾病としては、例えば、筋ジストロフィーなどの筋肉疾患、骨大理石病、胎盤傷害等が挙げられる。また、再生医療技術としては、例えば、造血幹細胞等の幹細胞から様々な組織を再生させる方法等が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実験方法の記載等に続いて、本発明の実施例の細胞融合制御法について図面を参照しながら説明するが、本発明はこれら実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
【００３３】
〔実験方法〕
・細胞融合（Ｆｕｓｉｏｎ）の誘導方法
２×１０4の細胞を１２ウェルディッシュに撒き一晩培養後５０μＭのフォルスコリンを添加して２日間培養する。ＢｅＷｏ細胞と２９３細胞の培養の場合は２日間で細胞融合誘導を終えるが、ＢｅＷｏ細胞のみの培養はさらに２日間、培地とフォルスコリンを交換して培養を行った後に蛍光顕微鏡観察を行う。
【００３４】
・Apical plasma membrane protein等の調製と二次元電気泳動、タンパク質の同定
２×１０5の細胞を１５ｃｍディッシュに撒き一晩培養後５０μＭのフォルスコリンを添加して細胞融合誘導を行った細胞から、cationic colloidal silica法により細胞膜を単離した後に、Apical plasma membrane proteinとCytoplasmically attached peripheral membrane proteinとを分離した。それぞれの画分に対して二次元電気泳動を行った後に銀染色あるいは蛍光染色（ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ）で比較解析を行った。細胞融合の非誘導、誘導後で異なったスポットを切り出した後に一晩トリプシン消化をゲル中で行った。得られたペプチド群を精製してMALDI-TOF-MASS解析を行い、peptide mass finger print法でタンパク質の同定を行った。
【００３５】
・多核体解析
ＤｓＲｅｄ発現細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃ発現細胞とを１対１で混ぜ調製した２×１０4の細胞を１２ウェルディッシュに撒き一晩培養後フォルスコリンを添加して、４日間細胞融合の誘導を行った。誘導終了後に４％ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を固定し、ファロイジンおよびＤＡＰＩ（４’,６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いて、常法により染色した。ＤｓＲｅｄ陽性かつＣＦＰ−Ｎｕｃ陽性の多核体を融合した細胞として１細胞あたりの核の数を測定し分布グラフの作成を行った。
【００３６】
・リン酸化ペプチドの同定
ＢｅＷｏ細胞あるいは２９３細胞にレンチウイルスベクターを用いてＦＬＡＧでタグされたカルポニン３（ＣＮＮ３）の遺伝子導入を行った後に、抗ＦＬＡＧ抗体カラムでＣＮＮ３の回収を行った。回収したＣＮＮ３を溶液中でトリプシン消化した後に酸化チタンカラムを用いてリン酸化ペプチドの濃縮と脱リン酸化反応を行った後にMALDI-TOF-MASS解析での同定を試みた。得られたリン酸化ペプチドについて、MALDI-QIT-MASSによるmass解析を行い、ペプチド配列を同定した。
【００３７】
〔ＢｅＷｏ細胞等のフォルスコリン刺激による多核体誘導〕
蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄまたはＣＦＰ−Ｎｕｃを恒常的に発現させたＢｅＷｏ細胞を無刺激下で４８時間培養した結果を図１のＡに示す。ＤｓＲｅｄとＣＦＰ−Ｎｕｃのダブルポジティブ細胞、即ち、細胞融合の結果多核体となった細胞は観察されなかった。
同図Ｂは、同図Ａの条件下でフォルスコリンを添加し４８時間多核体誘導を行った結果である。原図のカラー写真では、核がＣＦＰ−Ｎｕｃ（水色）かつ細胞質がＤｓＲｅｄ（赤色）の細胞が観察された。２種類の細胞の細胞膜、細胞質の融合を伴った多核体が誘導できたことを示している。しかし、融合細胞は一視野に１つ程度と効率は非常に悪い。
ＢｅＷｏ細胞間での融合は効率が低いので、より細胞融合誘導効率の高い系を確立させた。即ち、ＣＦＰ−Ｎｕｃをもつ２９３細胞と、ＧＦＰ−Ｔｕｂｌｉｎ（同図Ｃ）またはＤｓＲｅｄ（同図Ｄ）をもつＢｅＷｏ細胞との間で細胞融合を誘導したところ、フォルスコリン刺激後４８時間で多数の巨大な多核体を誘導することに成功した。
【００３８】
〔二次元電気泳動による、細胞融合特異的に変化する分子の探索１−ＧＡＰＤＨの同定〕
ＤｓＲｅｄ発現ＢｅＷｏ細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃ発現２９３細胞とをフォルスコリン存在下で４８時間混合培養し多核体誘導を行った。この誘導細胞（図２の右）と非誘導細胞（図２の左）とからそれぞれ細胞膜（Apical plasma membrane）タンパク質を調製して二次元電気泳動後に銀染色を行った。同図の下の写真（枠で囲われている部分を拡大したもの）で示すように、多核体誘導を行ったものでは等電点に変化のあるスポットが多数観察された。各スポットを切り出しタンパク質を同定したところ、ＧＡＰＤＨであることが明らかとなった。
このことから、細胞融合の誘導に伴い、通常は細胞質に存在するＧＡＰＤＨが翻訳後修飾を受け、細胞膜に移行すると考えられる。
【００３９】
〔二次元電気泳動による、細胞融合特異的に変化する分子の探索２−カルポニン３の同定〕
上記と同様に、ＤｓＲｅｄ発現ＢｅＷｏ細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃ発現２９３細胞とをフォルスコリン存在下で４８時間混合培養し多核体誘導を行った。この誘導細胞（図３の右）と非誘導細胞（図３の左）とからそれぞれ細胞膜および膜タンパク質に会合しているタンパク質群（Cytoplasmically attached peripheral membrane protein）を調製して二次元電気泳動後に蛍光染色を行った。リン酸化タンパク質特異的なＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄ染色（同図上段）を行った後に、総タンパク質をＳｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ染色（同図下段）で可視化した。細胞融合誘導後リン酸化レベルが亢進していたスポットを拡大したものを同図の左側に示す。矢印で示されたスポットのタンパク質の同定を試みたところ、カルポニン３（ＣＮＮ３）であることが明らかとなった。
【００４０】
〔ＣＮＮ３のリン酸化部位の同定と、細胞融合の誘導によるアクチン骨格からのＣＮＮ３の解離〕
ＹＦＰ−ＣＮＮ３を発現するＢｅＷｏ細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃを発現する２９３細胞とをフォルスコリン存在下（または非存在下）で４８時間混合培養した。非存在下（無刺激下）でＹＦＰ−ＣＮＮ３は主に細胞膜に局在している（図４Ａの左）。これは、細胞骨格を形成しているアクチンに会合しているためと考えられる。一方、フォルスコリン存在下でのＹＦＰ−ＣＮＮ３の局在は細胞全体に広がっており、膜への局在が弱くなっていた（図４Ａの右）。このことから、細胞融合の誘導に伴い、ＣＮＮ３はリン酸化が亢進され、膜直下のアクチン骨格から解離すると考えられる。
【００４１】
Ｆｌａｇ−ＣＮＮ３を細胞内に導入し細胞融合を誘導後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＣＮＮ３の免疫沈降を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄ染色（図４Ｂ上段）とＳｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ染色（図４Ｂ下段）を行ったところ、細胞融合誘導可能なＢｅＷｏ細胞と２９３細胞との混合培養ではフォルスコリン刺激によってＣＮＮ３のリン酸化レベルが亢進していた。また、ＣＮＮ３−アクチン複合体から解離していることを確認した。一方、細胞融合を誘導しない２９３細胞のみではフォルスコリン刺激を行ってもＣＮＮ３のリン酸化は亢進せず、アクチンからの解離も促進されていなかった。
【００４２】
次に、ＣＮＮ３のリン酸化部位を同定するため、精製したＦｌａｇ−ＣＮＮ３を還元・アルキル化した後にトリプシン消化を行った。得られたペプチド群に対してMALDI-TOF-MASS解析を行い、リン酸化ペプチドの有無を確認した。その結果、質量５２８６のペプチドが８０ずつ３つシフトしており、アルカリフォスファターゼ処理により５２８６のペプチド１つになることから、このペプチドに少なくとも３ヶ所のリン酸基が付加されることが考えられた。また、上記５２８６ペプチドのmass解析から、このペプチドがＣＮＮ３のＣ末のａｃｉｄｉｃ ｔａｉｌの一部分であることが明らかになった。
【００４３】
〔実施例１〕
実施例１において、融合用細胞にはＢｅＷｏ細胞を用いた。ＢｅＷｏ細胞は、細胞融合確認のために、ＤｓＲｅｄ発現細胞と、ＣＦＰ−Ｎｕｃ発現細胞との２群の細胞を調製した。また、本例では、ＧＡＰＤＨの発現を抑制するＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１（標的配列（センス）：配列番号３）を同時に導入した。したがって、一方の群には、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１およびＤｓＲｅｄを発現させるベクターを導入し、もう一方の群には、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１およびＣＦＰ−Ｎｕｃを発現させるベクターを導入した。本例における遺伝子組換え用ベクターは、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１の上流側に、ヒトＵ６プロモーターを配置し、ＤｓＲｅｄまたはＣＦＰ−Ｎｕｃ遺伝子の上流側に、ＣＭＶプロモーターを配置した。上記ベクターは、ＢｅＷｏ細胞に対して、２０ＭＯＩで遺伝子導入を行った。
このようにしてベクターを導入し、ＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＤｓＲｅｄ）細胞およびＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＣＦＰ−Ｎｕｃ）細胞を得た。
【００４４】
ＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＤｓＲｅｄ）細胞およびＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＣＦＰ−Ｎｕｃ）細胞は、各々１×１０4細胞／ウェルになるようにハムＦ１２培養液中に懸濁し、１２ウェルディッシュに播種し、一晩培養した。各ウェルにフォルスコリンを５０μＭになるように添加した後、さらに７２時間培養して細胞融合させた。
【００４５】
〔実施例２〕
実施例２では、実施例１のＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１の代わりにＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２（標的配列（センス）：配列番号４）を導入して、融合細胞を作製した。それ以外は、実施例1と同様にして、細胞融合を誘導した。
【００４６】
〔比較例１〕
比較例１では、実施例１のＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１に代えてＣｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉを導入し、融合細胞を作製した。それ以外は、実施例1と同様にして、細胞融合を誘導した。
【００４７】
まず、上記ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１およびＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２を細胞に導入することで、ＧＡＰＤＨの発現をノックダウンできるか確認した結果を図５Ａに示す。この実験では、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１（clone 1）を導入した２９３細胞と、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉ、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１、またはＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２（clone 2）を導入したＢｅＷｏ細胞とを混合し、４８時間フォルスコリン処理（または無刺激）を行った後に細胞を可溶化し、抗ＧＡＰＤＨ抗体でウエスタンブロットを行った。同図に示すように、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１または２をＢｅＷｏ細胞に導入した場合は、いずれも無刺激下でＧＡＰＤＨがほぼノックダウンされており、フォルスコリン処理を行った場合でも安定してＧＡＰＤＨの発現がノックダウンされていた。
【００４８】
細胞融合誘導後、実施例１、２および比較例１の細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。図５Ｃに、観察した顕微鏡写真を示す。同図の３枚の写真のうち、左端の写真（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉ）は比較例１、中央の写真（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１）は実施例１、右端の写真（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２）は実施例２の顕微鏡写真である。ＤｓＲｅｄ発現細胞由来の細胞は、細胞質が赤色に発色し、ＣＦＰ−Ｎｕｃ発現細胞由来の細胞は、核が水色に発色する。したがって、融合した細胞は、細胞質と核の両方が発色する（各写真内の白矢印）。その結果、同図に示すように、実施例１および２は、比較例１に比べて、融合細胞の数が多く観察された。
【００４９】
また、図５Ｂは、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉ、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉを発現させたＢｅＷｏ細胞をそれぞれ９６時間フォルスコリン処理した後に、Apical plasma membraneタンパク質を調製して二次元電気泳動し、抗ＧＡＰＤＨ抗体でウエスタンブロットを行った結果である。コントロールでは多核体誘導に伴ってＧＡＰＤＨの翻訳後修飾（酸性側へのシフト）が誘導されているが、ＧＡＰＤＨノックダウン細胞ではすべてのスポットが消失していることから、これらのスポットの変化はＧＡＰＤＨ遺伝子に対する翻訳後修飾の結果出現したものと判断される。
以上のことから、細胞融合に伴い、ＧＡＰＤＨは翻訳後修飾により細胞膜に移行するが、膜に移行したＧＡＰＤＨは、細胞融合を抑制すると考えられる。
【００５０】
また、実施例１および比較例１について、両蛍光タンパク質マーカーが発色した細胞（Ｄ＋Ｃ細胞）中に含まれるＣＦＰ−Ｎｕｃが発色した核（Ｃ核）の数を計測し、多核化を評価した。図６Ａのグラフは、実施例１および比較例１について、融合培養７２時間および９６時間後の前記Ｃ核数の平均値を示している。同グラフ中、黒色バー（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）は比較例１で、白色バー（ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ）は実施例１である。同図に示すように、実施例１は、比較例１に比べて、融合培養７２時間、９６時間のいずれにおいても、細胞に含まれる核数が増えており、多核化が促進されていた。また、図６ＢおよびＣのグラフは、前記Ｃ核数の分布を表しており、同図Ｂは、融合培養７２時間後、同図Ｃは、融合培養９６時間後の結果である。同グラフの横軸は前記Ｃ核数であり、縦軸は融合細胞頻度（％、Ｄ＋Ｃ細胞中に占める割合）である。比較例１では、両図のグラフに示すように、融合培養７２時間、９６時間共に、２〜４個の核を有する細胞頻度が最も高かった。一方、実施例１では、融合培養７２時間後には５〜７個、同９６時間後には８〜１０個の核を有する細胞が、それぞれ最も多く、比較例１に比べて、多核体の成熟（細胞内の増核化）が促進されていた。また、実施例２についても実施例１と同様の結果が得られた。
【００５１】
〔実施例３〕
実施例３は、実施例１のＤｓＲｅｄに代えてＧＦＰを導入し、さらにＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡに代えて、ＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡ（標的配列（センス）：配列番号５または６）を導入した。本例における遺伝子組換え用ベクターは、レンチウイルスベクターを使用し、ＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡの上流にＵ６プロモーターを配置し、その下流に、ＣＭＶプロモーターでドライブされるＧＦＰまたはＣＦＰ−Ｎｕｃ遺伝子を配置した。
上記ベクターは、ＢｅＷｏ細胞に対して２０ＭＯＩで遺伝子導入を行った。また、実施例３では、培養時にフォルスコリンを添加しなかった。それら以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
また、培養前に、上記ＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡ（２種類のＲＮＡｉベクター）で効率よくＣＮＮ３の発現をノックダウンできることを、抗ＣＮＮ３抗体を用いたウエスタンブロット解析により確認した。
【００５２】
〔実施例４〕
実施例４では、実施例３と異なり、５０μＭフォルスコリン存在下で細胞融合を誘導した。それ以外は、実施例３と同様にして培養を行った。
【００５３】
〔比較例３〕
比較例３は、実施例３のＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡに代えて、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｈＲＮＡを導入した。それ以外は、実施例３と同様にして培養を行った。
【００５４】
〔比較例４〕
比較例４では、５０μＭフォルスコリン存在下で細胞融合を誘導した。それ以外は、比較例３と同様にして培養を行った。
【００５５】
細胞融合誘導後、得られた細胞を４％ＰＦＡで固定し、ファロイジンおよびＤＡＰＩを用いて常法により染色した。ファロイジンは、Ｆ−アクチンを赤色に染色し、ＤＡＰＩは、核を青色に染色する色素である。染色した細胞は、蛍光顕微鏡を用いて観察した。図７に、観察した顕微鏡写真を示す。同図の左上は比較例３、右上は比較例４、左下は実施例３、右下は実施例４の顕微鏡写真である。同図上段の写真に示すように、フォルスコリン無添加の比較例３は、細胞間の接着が強く、細胞塊が形成されたが、フォルスコリンを添加した比較例４は、細胞間の接着が弱く、細胞質が広がった多核体が観察された。一方、同図下段に示すように、実施例３は、フォルスコリン無添加ながら多核体が観察され、実施例４では、さらに多核体数が増加した。また、フォルスコリン無添加の実施例３においても、比較例４のような、細胞間の接着が弱く、細胞質が広がった多核体が多数観察された。
このことから、ＣＮＮ３は細胞融合を負に制御する分子であると考えられる。
【００５６】
〔実施例５〕
実施例５では、カルポニン３（ＣＮＮ３）のａｃｉｄｉｃ ｔａｉｌ（２７４番目以降のアミノ酸配列）を欠失させたタンパク質を発現する変異体（ｄｅｌｔａ Ｃ（１−２７３のアミノ酸からなるポリペプチド））を細胞に発現させ、細胞融合に対する影響を調べた。
上記ｄｅｌｔａ Ｃ変異体は、ＦＬＡＧでタグして発現させた。本例における遺伝子組換え用ベクターは、上記ｄｅｌｔａ Ｃ変異体の遺伝子上流に、ＣＭＶプロモーターを配置した。このベクターをＢｅＷｏ細胞に対して、２０ＭＯＩで遺伝子導入した。
【００５７】
〔比較例５〕
比較例５の遺伝子組換え用ベクターには、実施例５のｄｅｌｔａ Ｃ遺伝子に代えて野生型ＣＮＮ３遺伝子を導入した。それ以外は、実施例５と同様にして比較例５を作製した。
【００５８】
実施例５および比較例５は、細胞融合誘導後、抗ＦＬＡＧ抗体を用い、常法により、ｄｅｌｔａ Ｃおよび野生型ＣＮＮ３を免疫沈降させた。実施例５および比較例５から得られた各免疫沈降サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開後、Ｓｙｐｒｏ−ＲｕｂｙおよびＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄを用いて染色した。Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙは総タンパク質を検出し、ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄはリン酸化タンパクを検出する。図８上段の写真は、ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄによる染色結果であり、図８下段は、Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙによる染色結果である。共に、左レーン（ＷＴ）は、比較例５であり、右レーン（Ｄｅｌｔａ Ｃ ｔａｉｌ）は、実施例５である。また、図８下段の矢印は、野生型ＣＮＮ３（ＷＴ）およびｄｅｌｔａ Ｃのバンド位置を示している。同図に示すように、比較例５には野生型ＣＮＮ３が検出され、実施例５にはｄｅｌｔａ Ｃが検出された。一方、図８上段に示すように、比較例５では野生型ＣＮＮ３のバンドが発色し、実施例５では発色は見られなかった。即ち、野生型ＣＮＮ３はリン酸化を受けるタンパク質であるのに対し、ｄｅｌｔａ Ｃ変異体はリン酸化を受けないタンパク質であり、ＣＮＮ３の少なくとも３ヶ所存在するリン酸化部位はすべてａｃｉｄｉｃ ｔａｉｌに存在すると考えられる。
【００５９】
また、実施例５および比較例５について、ＤｓＲｅｄ発色細胞（Ｄ細胞）および両蛍光タンパク質マーカー（ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰ−Ｎｕｃ）発色細胞（Ｄ＋Ｃ細胞）の細胞数、および両蛍光マーカー発色細胞の核数を計測した。下記表１は、その計測結果である。同表に示すように、比較例５に比べ、実施例５は、融合細胞数を示すＤ＋Ｃ細胞数が減少し、平均核数も約１／２に減少した。このように、Ｃ末端アミノ酸配列を欠失させたＣＮＮ３を発現させることにより、細胞融合が抑制された。このことから、ＢｅＷｏ細胞の細胞融合は、ＣＮＮ３のリン酸化を介して制御を受けていると考えられる。
【００６０】
（表１）
細胞数 平均核数
Ｄ細胞 Ｄ＋Ｃ細胞
実施例５ １６７ １９ ２．８５±１．９３
比較例５ １６０ ２９ ５．８６±３．１１
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の細胞融合制御法は、様々な細胞において細胞融合の制御が可能であり、その用途は、例えば、細胞融合過程に起因する疾病の治療法、再生医療技術、抗体産生技術等が挙げられ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＢｅＷｏ細胞等のフォルスコリン刺激による多核体誘導の実験結果を示す図である。
【図２】二次元電気泳動により、細胞融合特異的に変化する分子として、ＧＡＰＤＨを同定した実験結果を示す図である。
【図３】二次元電気泳動により、細胞融合特異的に変化する分子として、カルポニン３を同定した実験結果を示す図である。
【図４】細胞融合に伴い、カルポニン３のリン酸化が亢進され、膜直下のアクチン骨格から解離することを示唆する実験結果を示す図である。
【図５】ＧＡＰＤＨの発現をノックダウンすることによって、細胞融合が促進されたことを示す図である。
【図６】本発明の実施例１および比較例２の融合細胞数、および融合細胞での核数の分布を比較して示すグラフである。
【図７】本発明の実施例３、４および比較例３、４の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】本発明の実施例５および比較例５のタンパク質検出結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合制御法、それに用いる遺伝子組換え用ベクターおよび細胞融合制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞融合は、複数の細胞の細胞膜が融合し、細胞が多核化する現象である。細胞融合は、生体では、筋原細胞の分化、哺乳類の胎盤形成、免疫応答、腫瘍発生、幹細胞による組織再生の際など、様々な生命活動において認められる。例えば、哺乳類の胎盤において、母体血液と接する胎児絨毛組織の最外層は、細胞融合した細胞性栄養膜細胞が分化し、多核合胞体細胞塊構造を形成している。
【０００３】
一方で近年、細胞融合を人為的に生じさせる方法が開発されており、細胞融合方法は、遺伝子発現、染色体マッピング、抗体産生、がん免疫療法等において有力な手段となっている。従来用いられている細胞融合方法としては、センダイウイルス等のウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の化学物質、電気刺激等を用いる方法がある。例えば、抗体産生への応用においては、ＰＥＧまたは電気刺激の利用により、ミエローマ細胞と脾細胞とを細胞融合し、その融合細胞を選択培養したハイブリドーマが利用されている（例えば、下記の非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、化学物質や電気刺激を用いる方法は、融合させる細胞に対して、化学的あるいは物理的な細胞傷害を与えてしまうという問題がある。センダイウイルス等のウイルスを用いる方法は、細胞傷害性は比較的低いものの、融合可能な細胞種が限られる。また、いずれの方法も、通常は細胞内に存在しない物質あるいは刺激等を適用することから、融合処理により、細胞機能に何らかの影響を与える可能性がある。したがって、従来の細胞融合方法は、実験手法としてだけでなく、細胞融合過程に起因する疾病の治療等の生体への応用においても問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】安東・千葉「単クローン抗体実験操作入門」、講談社、ｐ７０−９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、細胞内に存在する物質を利用して、細胞融合を制御する方法を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題の解決のため研究解析を進めた結果、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の２つの分子が、二次元電気泳動による解析により、細胞融合（Ｆｕｓｉｏｎ）特異的に変化することを見出した。さらに、これら２つのタンパク質の発現を抑制したところ、いずれも細胞融合を促進させること等を明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、医学・医療上および産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｋ）の発明を包含するものである。
Ａ） 動物細胞の細胞融合制御方法であって、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
Ｂ） 前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の抑制である上記Ａ）記載の細胞融合制御方法。
Ｃ） 前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の促進である上記Ａ）記載の細胞融合制御方法。
Ｄ） 前記タンパク質の発現の抑制が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による抑制である上記Ｂ）記載の細胞融合制御方法。
Ｅ） 前記ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現によるものである上記Ｄ）記載の細胞融合制御方法。
Ｆ） 動物細胞の細胞融合制御方法であって、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の改変ポリペプチドを細胞内発現させることにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
Ｇ） 前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のリン酸化部位であるＣ末端のアミノ酸残基部分を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである上記Ｆ）記載の細胞融合制御方法。
Ｈ） 前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のＣ末端から最大５６個のアミノ酸残基を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである上記Ｆ）記載の細胞融合制御方法。
Ｉ） フォルスコリン存在下で、前記タンパク質またはその改変ポリペプチドの発現を制御することを特徴とする上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の細胞融合制御方法。
Ｊ） 上記Ａ）〜Ｉ）のいずれかに記載の細胞融合制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、前記タンパク質またはその改変ポリペプチド、あるいは、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも１つを目的細胞内で発現するよう構築された遺伝子組換え用ベクター。
Ｋ） 上記Ｊ）に記載の遺伝子組換え用ベクターを含有する細胞融合制御剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞内に存在する物質を利用して、細胞融合を制御することが可能であり、新たな細胞融合制御方法として種々の分野に適用可能である。例えば、細胞融合過程に起因する疾病の治療法、再生医療技術、抗体産生技術等への利用が例示される。細胞融合過程に起因する疾病としては、例えば、筋ジストロフィーなどの筋肉疾患、骨大理石病、胎盤傷害等が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
前述のように、本発明の細胞融合制御方法は、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下、略して「ＧＡＰＤＨ」という場合がある。）、および、カルポニン３（以下、略して「ＣＮＮ３」という場合がある。）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、動物細胞の細胞融合を促進または抑制するものである。
【００１１】
ＧＡＰＤＨは、解糖系酵素として機能するほか、ＤＮＡ修復や複製、アポトーシス等に関与するタンパク質である。本発明において、ＧＡＰＤＨは、目的細胞種においてＧＡＰＤＨとして機能するタンパク質であればよく、それ以外は特に限定されない。例えば、ヒト胎盤絨毛癌由来細胞であるＢｅＷｏ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧＡＰＤＨを発現する。
【００１２】
カルポニン３は、カルポニンファミリーに属するタンパク質の１つである。本発明において、カルポニン３は、目的細胞種においてカルポニン３として機能するタンパク質であればよく、それ以外は特に限定されない。例えば、ヒト胎盤絨毛癌由来細胞であるＢｅＷｏ細胞は、配列番号２のアミノ酸配列からなるカルポニン３を発現する。
【００１３】
ＧＡＰＤＨおよびカルポニン３（以下、これら２つの分子を総称して「前記タンパク質」という場合がある。）の発現の制御は、目的細胞の細胞融合に変化をもたらしうるものであれば、発現を抑制するものであってもよいし、逆に、発現を促進するものであってもよい。
【００１４】
発現の抑制方法は、特に制限されず、例えば、前記タンパク質の遺伝子の転写の抑制、あるいは翻訳の抑制等が挙げられる。代表的な発現の抑制方法としては、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）やｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）等のｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法等が挙げられる。
【００１５】
一方、発現の促進方法も、特に制限されず、例えば、前記タンパク質の遺伝子の転写の促進、あるいは翻訳の促進等が挙げられる。代表的な発現の促進方法としては、例えば、目的細胞で機能するプロモーターの下流にＧＡＰＤＨ（またはカルポニン３）の遺伝子（ｃＤＮＡ）を配置した発現ベクターを用いて、目的細胞で前記タンパク質の発現を促進する方法等が挙げられる。
【００１６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法による発現抑制方法としては、一般的に使用されている公知の方法を適用することができ、特に制限されるものではない。例えば、前記タンパク質のｍＲＮＡの標的部位のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｄｓＲＮＡを細胞に導入することにより、前記タンパク質の発現を抑制する方法等が挙げられる。ｄｓＲＮＡとしては、例えば、短鎖のｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡや、ヘアピン状に折り畳まれたｓｈＲＮＡが挙げられる。
【００１７】
ｓｉＲＮＡは、前記タンパク質の発現を抑制できる短鎖のｄｓＲＮＡであればよく、特に限定されない。ｓｉＲＮＡの鎖長は、特に限定されないが、例えば、５〜２００塩基対であり、好ましくは、１０〜５０塩基対であり、より好ましくは、１５〜２５塩基対である。また、ｓｉＲＮＡは、前記タンパク質のｍＲＮＡに完全に対合しなくてもよく、ミスマッチやバルジ等の対合しない部分を含んでいてもよい。
【００１８】
ｓｈＲＮＡは、前記タンパク質の発現を抑制できるヘアピン状に折り畳まれたｄｓＲＮＡであればよく、特に限定されない。ｓｈＲＮＡの鎖長については、ｓｈＲＮＡは転写されたのちに切断されてｓｉＲＮＡとなるので、結果として、標的配列に対合して効果を発揮する配列の長さは上記ｓｉＲＮＡと同じであるが、それ以外にヘアピン部分がある。
【００１９】
ＧＡＰＤＨの発現を抑制する前記ｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）用の標的配列（センス）としては、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）の配列が挙げられる。
（Ａ）配列番号３の塩基配列。
（Ｂ）配列番号４の塩基配列。
【００２０】
カルポニン３の発現を抑制する前記ｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）用の標的配列（センス）としては、例えば、以下の（Ｃ）または（Ｄ）の配列が挙げられる。
（Ｃ）配列番号５の塩基配列。
（Ｄ）配列番号６の塩基配列。
【００２１】
また、本発明の細胞融合制御方法は、前記タンパク質（即ち、ＧＡＰＤＨおよびカルポニン３の少なくとも一方のタンパク質）の改変ポリペプチドを目的細胞で発現させることにより、細胞融合を促進または抑制する方法であってもよい。
【００２２】
前記タンパク質の改変ポリペプチドは、その発現により目的細胞の細胞融合に変化をもたらしうるものであれば、特に制限されるものではない。例えば、カルポニン３の改変ポリペプチドとして、Ｃ末端のリン酸化を受ける配列部分を欠失した改変ポリペプチドを用いてもよい。後述の実施例に示すように、Ｃ末端から５６個のアミノ酸の欠失により、カルポニン３改変ポリペプチドはリン酸化部分３つを失い、この改変ポリペプチドを細胞内発現させることにより、細胞融合を抑制することができた。
【００２３】
本発明の遺伝子組換え用ベクターは、目的細胞に導入することで、前記タンパク質（ＧＡＰＤＨもしくはカルポニン３）またはその改変ポリペプチド、あるいは、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも１つを発現するよう構築されたものであればよく、特に限定されない。本発明の遺伝子組換え用ベクターは、さらに、プロモーターや選択マーカー等を有していてもよい。
【００２４】
プロモーターは、目的細胞で機能するものであれば特に制限されるものではなく、例えば、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲプロモーター、Ｔ３プロモーター等が挙げられる。
【００２５】
選択マーカーについても特に制限されるものではなく、例えば、薬剤耐性マーカー、酵素マーカー、蛍光タンパク質マーカー等が挙げられる。本発明の細胞融合制御法において、融合細胞の識別用に、蛍光タンパク質マーカーを用いてもよい。蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ. ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
【００２６】
本発明の遺伝子組換え用ベクターの種類は、特に限定されず、目的細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスベクター、プラスミド等が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。
【００２７】
本発明の細胞融合制御方法において、細胞融合に用いる細胞は、動物細胞であればよく、特に限定されない。例えば、動物の生体から採取した細胞を用いてもよく、樹立された培養細胞株や、形質転換された細胞株等を用いてもよい。一例として、後述の実施例で使用したヒト胎盤絨毛癌由来細胞であるＢｅＷｏ細胞や、２９３細胞等が挙げられる。
【００２８】
細胞融合の方法は、特に制限されず、例えば、本発明の遺伝子組換え用ベクターを導入した細胞をフォルスコリン存在下で培養する方法でもよい。また、細胞融合の方法として、融合した細胞を検出する場合には、例えば、以下のような方法を用いてもよい。
【００２９】
まず、選択マーカーのみが異なる２種類の本発明の遺伝子組換え用ベクターを準備する。選択マーカーとしては、例えば、細胞質で発色するＤｓＲｅｄと、核で発色するＣＦＰ−Ｎｕｃ（核移行シグナルを付加したＣＦＰ）等のように、細胞内の蛍光発色部が異なる２つのマーカーを用いる。融合する細胞として、上記２種類のベクターを１種類ずつ導入した、２つの細胞群を調製する。２つの細胞群は、それぞれ培養液に懸濁してウェルディッシュに同細胞数ずつ播種し、フォルスコリン存在下で２〜３日間培養し、細胞融合させる。融合した細胞の検出方法は、例えば、培養後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察し、２種類の選択マーカーが同時に発色している細胞の割合（細胞融合率）および平均核数（細胞内核数の平均値）を計測し、細胞融合制御を評価する。
【００３０】
本発明の細胞融合制御剤は、特に限定されず、本発明の遺伝子組換え用ベクターを含んでいればよい。本発明の細胞融合制御剤は、例えば、さらに培養液、緩衝液、細胞融合誘導物質、細胞融合抑制物質等を含んでいてもよい。細胞融合誘導物質としては、例えば、フォルスコリン等が挙げられる。
【００３１】
本発明の細胞融合制御剤の用途は、特に限定されず、例えば、細胞融合過程に起因する疾病の治療法、再生医療技術、抗体産生技術等が挙げられる。細胞融合過程に起因する疾病としては、例えば、筋ジストロフィーなどの筋肉疾患、骨大理石病、胎盤傷害等が挙げられる。また、再生医療技術としては、例えば、造血幹細胞等の幹細胞から様々な組織を再生させる方法等が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実験方法の記載等に続いて、本発明の実施例の細胞融合制御法について図面を参照しながら説明するが、本発明はこれら実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
【００３３】
〔実験方法〕
・細胞融合（Ｆｕｓｉｏｎ）の誘導方法
２×１０4の細胞を１２ウェルディッシュに撒き一晩培養後５０μＭのフォルスコリンを添加して２日間培養する。ＢｅＷｏ細胞と２９３細胞の培養の場合は２日間で細胞融合誘導を終えるが、ＢｅＷｏ細胞のみの培養はさらに２日間、培地とフォルスコリンを交換して培養を行った後に蛍光顕微鏡観察を行う。
【００３４】
・Apical plasma membrane protein等の調製と二次元電気泳動、タンパク質の同定
２×１０5の細胞を１５ｃｍディッシュに撒き一晩培養後５０μＭのフォルスコリンを添加して細胞融合誘導を行った細胞から、cationic colloidal silica法により細胞膜を単離した後に、Apical plasma membrane proteinとCytoplasmically attached peripheral membrane proteinとを分離した。それぞれの画分に対して二次元電気泳動を行った後に銀染色あるいは蛍光染色（ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ）で比較解析を行った。細胞融合の非誘導、誘導後で異なったスポットを切り出した後に一晩トリプシン消化をゲル中で行った。得られたペプチド群を精製してMALDI-TOF-MASS解析を行い、peptide mass finger print法でタンパク質の同定を行った。
【００３５】
・多核体解析
ＤｓＲｅｄ発現細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃ発現細胞とを１対１で混ぜ調製した２×１０4の細胞を１２ウェルディッシュに撒き一晩培養後フォルスコリンを添加して、４日間細胞融合の誘導を行った。誘導終了後に４％ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を固定し、ファロイジンおよびＤＡＰＩ（４’,６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いて、常法により染色した。ＤｓＲｅｄ陽性かつＣＦＰ−Ｎｕｃ陽性の多核体を融合した細胞として１細胞あたりの核の数を測定し分布グラフの作成を行った。
【００３６】
・リン酸化ペプチドの同定
ＢｅＷｏ細胞あるいは２９３細胞にレンチウイルスベクターを用いてＦＬＡＧでタグされたカルポニン３（ＣＮＮ３）の遺伝子導入を行った後に、抗ＦＬＡＧ抗体カラムでＣＮＮ３の回収を行った。回収したＣＮＮ３を溶液中でトリプシン消化した後に酸化チタンカラムを用いてリン酸化ペプチドの濃縮と脱リン酸化反応を行った後にMALDI-TOF-MASS解析での同定を試みた。得られたリン酸化ペプチドについて、MALDI-QIT-MASSによるmass解析を行い、ペプチド配列を同定した。
【００３７】
〔ＢｅＷｏ細胞等のフォルスコリン刺激による多核体誘導〕
蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄまたはＣＦＰ−Ｎｕｃを恒常的に発現させたＢｅＷｏ細胞を無刺激下で４８時間培養した結果を図１のＡに示す。ＤｓＲｅｄとＣＦＰ−Ｎｕｃのダブルポジティブ細胞、即ち、細胞融合の結果多核体となった細胞は観察されなかった。
同図Ｂは、同図Ａの条件下でフォルスコリンを添加し４８時間多核体誘導を行った結果である。原図のカラー写真では、核がＣＦＰ−Ｎｕｃ（水色）かつ細胞質がＤｓＲｅｄ（赤色）の細胞が観察された。２種類の細胞の細胞膜、細胞質の融合を伴った多核体が誘導できたことを示している。しかし、融合細胞は一視野に１つ程度と効率は非常に悪い。
ＢｅＷｏ細胞間での融合は効率が低いので、より細胞融合誘導効率の高い系を確立させた。即ち、ＣＦＰ−Ｎｕｃをもつ２９３細胞と、ＧＦＰ−Ｔｕｂｌｉｎ（同図Ｃ）またはＤｓＲｅｄ（同図Ｄ）をもつＢｅＷｏ細胞との間で細胞融合を誘導したところ、フォルスコリン刺激後４８時間で多数の巨大な多核体を誘導することに成功した。
【００３８】
〔二次元電気泳動による、細胞融合特異的に変化する分子の探索１−ＧＡＰＤＨの同定〕
ＤｓＲｅｄ発現ＢｅＷｏ細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃ発現２９３細胞とをフォルスコリン存在下で４８時間混合培養し多核体誘導を行った。この誘導細胞（図２の右）と非誘導細胞（図２の左）とからそれぞれ細胞膜（Apical plasma membrane）タンパク質を調製して二次元電気泳動後に銀染色を行った。同図の下の写真（枠で囲われている部分を拡大したもの）で示すように、多核体誘導を行ったものでは等電点に変化のあるスポットが多数観察された。各スポットを切り出しタンパク質を同定したところ、ＧＡＰＤＨであることが明らかとなった。
このことから、細胞融合の誘導に伴い、通常は細胞質に存在するＧＡＰＤＨが翻訳後修飾を受け、細胞膜に移行すると考えられる。
【００３９】
〔二次元電気泳動による、細胞融合特異的に変化する分子の探索２−カルポニン３の同定〕
上記と同様に、ＤｓＲｅｄ発現ＢｅＷｏ細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃ発現２９３細胞とをフォルスコリン存在下で４８時間混合培養し多核体誘導を行った。この誘導細胞（図３の右）と非誘導細胞（図３の左）とからそれぞれ細胞膜および膜タンパク質に会合しているタンパク質群（Cytoplasmically attached peripheral membrane protein）を調製して二次元電気泳動後に蛍光染色を行った。リン酸化タンパク質特異的なＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄ染色（同図上段）を行った後に、総タンパク質をＳｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ染色（同図下段）で可視化した。細胞融合誘導後リン酸化レベルが亢進していたスポットを拡大したものを同図の左側に示す。矢印で示されたスポットのタンパク質の同定を試みたところ、カルポニン３（ＣＮＮ３）であることが明らかとなった。
【００４０】
〔ＣＮＮ３のリン酸化部位の同定と、細胞融合の誘導によるアクチン骨格からのＣＮＮ３の解離〕
ＹＦＰ−ＣＮＮ３を発現するＢｅＷｏ細胞とＣＦＰ−Ｎｕｃを発現する２９３細胞とをフォルスコリン存在下（または非存在下）で４８時間混合培養した。非存在下（無刺激下）でＹＦＰ−ＣＮＮ３は主に細胞膜に局在している（図４Ａの左）。これは、細胞骨格を形成しているアクチンに会合しているためと考えられる。一方、フォルスコリン存在下でのＹＦＰ−ＣＮＮ３の局在は細胞全体に広がっており、膜への局在が弱くなっていた（図４Ａの右）。このことから、細胞融合の誘導に伴い、ＣＮＮ３はリン酸化が亢進され、膜直下のアクチン骨格から解離すると考えられる。
【００４１】
Ｆｌａｇ−ＣＮＮ３を細胞内に導入し細胞融合を誘導後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＣＮＮ３の免疫沈降を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄ染色（図４Ｂ上段）とＳｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ染色（図４Ｂ下段）を行ったところ、細胞融合誘導可能なＢｅＷｏ細胞と２９３細胞との混合培養ではフォルスコリン刺激によってＣＮＮ３のリン酸化レベルが亢進していた。また、ＣＮＮ３−アクチン複合体から解離していることを確認した。一方、細胞融合を誘導しない２９３細胞のみではフォルスコリン刺激を行ってもＣＮＮ３のリン酸化は亢進せず、アクチンからの解離も促進されていなかった。
【００４２】
次に、ＣＮＮ３のリン酸化部位を同定するため、精製したＦｌａｇ−ＣＮＮ３を還元・アルキル化した後にトリプシン消化を行った。得られたペプチド群に対してMALDI-TOF-MASS解析を行い、リン酸化ペプチドの有無を確認した。その結果、質量５２８６のペプチドが８０ずつ３つシフトしており、アルカリフォスファターゼ処理により５２８６のペプチド１つになることから、このペプチドに少なくとも３ヶ所のリン酸基が付加されることが考えられた。また、上記５２８６ペプチドのmass解析から、このペプチドがＣＮＮ３のＣ末のａｃｉｄｉｃ ｔａｉｌの一部分であることが明らかになった。
【００４３】
〔実施例１〕
実施例１において、融合用細胞にはＢｅＷｏ細胞を用いた。ＢｅＷｏ細胞は、細胞融合確認のために、ＤｓＲｅｄ発現細胞と、ＣＦＰ−Ｎｕｃ発現細胞との２群の細胞を調製した。また、本例では、ＧＡＰＤＨの発現を抑制するＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１（標的配列（センス）：配列番号３）を同時に導入した。したがって、一方の群には、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１およびＤｓＲｅｄを発現させるベクターを導入し、もう一方の群には、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１およびＣＦＰ−Ｎｕｃを発現させるベクターを導入した。本例における遺伝子組換え用ベクターは、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１の上流側に、ヒトＵ６プロモーターを配置し、ＤｓＲｅｄまたはＣＦＰ−Ｎｕｃ遺伝子の上流側に、ＣＭＶプロモーターを配置した。上記ベクターは、ＢｅＷｏ細胞に対して、２０ＭＯＩで遺伝子導入を行った。
このようにしてベクターを導入し、ＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＤｓＲｅｄ）細胞およびＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＣＦＰ−Ｎｕｃ）細胞を得た。
【００４４】
ＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＤｓＲｅｄ）細胞およびＢｅＷｏ（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ＋ＣＦＰ−Ｎｕｃ）細胞は、各々１×１０4細胞／ウェルになるようにハムＦ１２培養液中に懸濁し、１２ウェルディッシュに播種し、一晩培養した。各ウェルにフォルスコリンを５０μＭになるように添加した後、さらに７２時間培養して細胞融合させた。
【００４５】
〔実施例２〕
実施例２では、実施例１のＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１の代わりにＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２（標的配列（センス）：配列番号４）を導入して、融合細胞を作製した。それ以外は、実施例1と同様にして、細胞融合を誘導した。
【００４６】
〔比較例１〕
比較例１では、実施例１のＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１に代えてＣｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉを導入し、融合細胞を作製した。それ以外は、実施例1と同様にして、細胞融合を誘導した。
【００４７】
まず、上記ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１およびＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２を細胞に導入することで、ＧＡＰＤＨの発現をノックダウンできるか確認した結果を図５Ａに示す。この実験では、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１（clone 1）を導入した２９３細胞と、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉ、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１、またはＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２（clone 2）を導入したＢｅＷｏ細胞とを混合し、４８時間フォルスコリン処理（または無刺激）を行った後に細胞を可溶化し、抗ＧＡＰＤＨ抗体でウエスタンブロットを行った。同図に示すように、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１または２をＢｅＷｏ細胞に導入した場合は、いずれも無刺激下でＧＡＰＤＨがほぼノックダウンされており、フォルスコリン処理を行った場合でも安定してＧＡＰＤＨの発現がノックダウンされていた。
【００４８】
細胞融合誘導後、実施例１、２および比較例１の細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。図５Ｃに、観察した顕微鏡写真を示す。同図の３枚の写真のうち、左端の写真（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉ）は比較例１、中央の写真（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−１）は実施例１、右端の写真（ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉ−２）は実施例２の顕微鏡写真である。ＤｓＲｅｄ発現細胞由来の細胞は、細胞質が赤色に発色し、ＣＦＰ−Ｎｕｃ発現細胞由来の細胞は、核が水色に発色する。したがって、融合した細胞は、細胞質と核の両方が発色する（各写真内の白矢印）。その結果、同図に示すように、実施例１および２は、比較例１に比べて、融合細胞の数が多く観察された。
【００４９】
また、図５Ｂは、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡｉ、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡｉを発現させたＢｅＷｏ細胞をそれぞれ９６時間フォルスコリン処理した後に、Apical plasma membraneタンパク質を調製して二次元電気泳動し、抗ＧＡＰＤＨ抗体でウエスタンブロットを行った結果である。コントロールでは多核体誘導に伴ってＧＡＰＤＨの翻訳後修飾（酸性側へのシフト）が誘導されているが、ＧＡＰＤＨノックダウン細胞ではすべてのスポットが消失していることから、これらのスポットの変化はＧＡＰＤＨ遺伝子に対する翻訳後修飾の結果出現したものと判断される。
以上のことから、細胞融合に伴い、ＧＡＰＤＨは翻訳後修飾により細胞膜に移行するが、膜に移行したＧＡＰＤＨは、細胞融合を抑制すると考えられる。
【００５０】
また、実施例１および比較例１について、両蛍光タンパク質マーカーが発色した細胞（Ｄ＋Ｃ細胞）中に含まれるＣＦＰ−Ｎｕｃが発色した核（Ｃ核）の数を計測し、多核化を評価した。図６Ａのグラフは、実施例１および比較例１について、融合培養７２時間および９６時間後の前記Ｃ核数の平均値を示している。同グラフ中、黒色バー（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）は比較例１で、白色バー（ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ）は実施例１である。同図に示すように、実施例１は、比較例１に比べて、融合培養７２時間、９６時間のいずれにおいても、細胞に含まれる核数が増えており、多核化が促進されていた。また、図６ＢおよびＣのグラフは、前記Ｃ核数の分布を表しており、同図Ｂは、融合培養７２時間後、同図Ｃは、融合培養９６時間後の結果である。同グラフの横軸は前記Ｃ核数であり、縦軸は融合細胞頻度（％、Ｄ＋Ｃ細胞中に占める割合）である。比較例１では、両図のグラフに示すように、融合培養７２時間、９６時間共に、２〜４個の核を有する細胞頻度が最も高かった。一方、実施例１では、融合培養７２時間後には５〜７個、同９６時間後には８〜１０個の核を有する細胞が、それぞれ最も多く、比較例１に比べて、多核体の成熟（細胞内の増核化）が促進されていた。また、実施例２についても実施例１と同様の結果が得られた。
【００５１】
〔実施例３〕
実施例３は、実施例１のＤｓＲｅｄに代えてＧＦＰを導入し、さらにＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡに代えて、ＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡ（標的配列（センス）：配列番号５または６）を導入した。本例における遺伝子組換え用ベクターは、レンチウイルスベクターを使用し、ＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡの上流にＵ６プロモーターを配置し、その下流に、ＣＭＶプロモーターでドライブされるＧＦＰまたはＣＦＰ−Ｎｕｃ遺伝子を配置した。
上記ベクターは、ＢｅＷｏ細胞に対して２０ＭＯＩで遺伝子導入を行った。また、実施例３では、培養時にフォルスコリンを添加しなかった。それら以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
また、培養前に、上記ＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡ（２種類のＲＮＡｉベクター）で効率よくＣＮＮ３の発現をノックダウンできることを、抗ＣＮＮ３抗体を用いたウエスタンブロット解析により確認した。
【００５２】
〔実施例４〕
実施例４では、実施例３と異なり、５０μＭフォルスコリン存在下で細胞融合を誘導した。それ以外は、実施例３と同様にして培養を行った。
【００５３】
〔比較例３〕
比較例３は、実施例３のＣＮＮ３ ｓｈＲＮＡに代えて、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｈＲＮＡを導入した。それ以外は、実施例３と同様にして培養を行った。
【００５４】
〔比較例４〕
比較例４では、５０μＭフォルスコリン存在下で細胞融合を誘導した。それ以外は、比較例３と同様にして培養を行った。
【００５５】
細胞融合誘導後、得られた細胞を４％ＰＦＡで固定し、ファロイジンおよびＤＡＰＩを用いて常法により染色した。ファロイジンは、Ｆ−アクチンを赤色に染色し、ＤＡＰＩは、核を青色に染色する色素である。染色した細胞は、蛍光顕微鏡を用いて観察した。図７に、観察した顕微鏡写真を示す。同図の左上は比較例３、右上は比較例４、左下は実施例３、右下は実施例４の顕微鏡写真である。同図上段の写真に示すように、フォルスコリン無添加の比較例３は、細胞間の接着が強く、細胞塊が形成されたが、フォルスコリンを添加した比較例４は、細胞間の接着が弱く、細胞質が広がった多核体が観察された。一方、同図下段に示すように、実施例３は、フォルスコリン無添加ながら多核体が観察され、実施例４では、さらに多核体数が増加した。また、フォルスコリン無添加の実施例３においても、比較例４のような、細胞間の接着が弱く、細胞質が広がった多核体が多数観察された。
このことから、ＣＮＮ３は細胞融合を負に制御する分子であると考えられる。
【００５６】
〔実施例５〕
実施例５では、カルポニン３（ＣＮＮ３）のａｃｉｄｉｃ ｔａｉｌ（２７４番目以降のアミノ酸配列）を欠失させたタンパク質を発現する変異体（ｄｅｌｔａ Ｃ（１−２７３のアミノ酸からなるポリペプチド））を細胞に発現させ、細胞融合に対する影響を調べた。
上記ｄｅｌｔａ Ｃ変異体は、ＦＬＡＧでタグして発現させた。本例における遺伝子組換え用ベクターは、上記ｄｅｌｔａ Ｃ変異体の遺伝子上流に、ＣＭＶプロモーターを配置した。このベクターをＢｅＷｏ細胞に対して、２０ＭＯＩで遺伝子導入した。
【００５７】
〔比較例５〕
比較例５の遺伝子組換え用ベクターには、実施例５のｄｅｌｔａ Ｃ遺伝子に代えて野生型ＣＮＮ３遺伝子を導入した。それ以外は、実施例５と同様にして比較例５を作製した。
【００５８】
実施例５および比較例５は、細胞融合誘導後、抗ＦＬＡＧ抗体を用い、常法により、ｄｅｌｔａ Ｃおよび野生型ＣＮＮ３を免疫沈降させた。実施例５および比較例５から得られた各免疫沈降サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開後、Ｓｙｐｒｏ−ＲｕｂｙおよびＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄを用いて染色した。Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙは総タンパク質を検出し、ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄはリン酸化タンパクを検出する。図８上段の写真は、ＰｒｏＱ−Ｄｉａｍｏｎｄによる染色結果であり、図８下段は、Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙによる染色結果である。共に、左レーン（ＷＴ）は、比較例５であり、右レーン（Ｄｅｌｔａ Ｃ ｔａｉｌ）は、実施例５である。また、図８下段の矢印は、野生型ＣＮＮ３（ＷＴ）およびｄｅｌｔａ Ｃのバンド位置を示している。同図に示すように、比較例５には野生型ＣＮＮ３が検出され、実施例５にはｄｅｌｔａ Ｃが検出された。一方、図８上段に示すように、比較例５では野生型ＣＮＮ３のバンドが発色し、実施例５では発色は見られなかった。即ち、野生型ＣＮＮ３はリン酸化を受けるタンパク質であるのに対し、ｄｅｌｔａ Ｃ変異体はリン酸化を受けないタンパク質であり、ＣＮＮ３の少なくとも３ヶ所存在するリン酸化部位はすべてａｃｉｄｉｃ ｔａｉｌに存在すると考えられる。
【００５９】
また、実施例５および比較例５について、ＤｓＲｅｄ発色細胞（Ｄ細胞）および両蛍光タンパク質マーカー（ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰ−Ｎｕｃ）発色細胞（Ｄ＋Ｃ細胞）の細胞数、および両蛍光マーカー発色細胞の核数を計測した。下記表１は、その計測結果である。同表に示すように、比較例５に比べ、実施例５は、融合細胞数を示すＤ＋Ｃ細胞数が減少し、平均核数も約１／２に減少した。このように、Ｃ末端アミノ酸配列を欠失させたＣＮＮ３を発現させることにより、細胞融合が抑制された。このことから、ＢｅＷｏ細胞の細胞融合は、ＣＮＮ３のリン酸化を介して制御を受けていると考えられる。
【００６０】
（表１）
細胞数 平均核数
Ｄ細胞 Ｄ＋Ｃ細胞
実施例５ １６７ １９ ２．８５±１．９３
比較例５ １６０ ２９ ５．８６±３．１１
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の細胞融合制御法は、様々な細胞において細胞融合の制御が可能であり、その用途は、例えば、細胞融合過程に起因する疾病の治療法、再生医療技術、抗体産生技術等が挙げられ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＢｅＷｏ細胞等のフォルスコリン刺激による多核体誘導の実験結果を示す図である。
【図２】二次元電気泳動により、細胞融合特異的に変化する分子として、ＧＡＰＤＨを同定した実験結果を示す図である。
【図３】二次元電気泳動により、細胞融合特異的に変化する分子として、カルポニン３を同定した実験結果を示す図である。
【図４】細胞融合に伴い、カルポニン３のリン酸化が亢進され、膜直下のアクチン骨格から解離することを示唆する実験結果を示す図である。
【図５】ＧＡＰＤＨの発現をノックダウンすることによって、細胞融合が促進されたことを示す図である。
【図６】本発明の実施例１および比較例２の融合細胞数、および融合細胞での核数の分布を比較して示すグラフである。
【図７】本発明の実施例３、４および比較例３、４の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】本発明の実施例５および比較例５のタンパク質検出結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞の細胞融合制御方法であって、
グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
【請求項２】
前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の抑制である請求項１記載の細胞融合制御方法。
【請求項３】
前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の促進である請求項１記載の細胞融合制御方法。
【請求項４】
前記タンパク質の発現の抑制が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による抑制である請求項２記載の細胞融合制御方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現によるものである請求項４記載の細胞融合制御方法。
【請求項６】
動物細胞の細胞融合制御方法であって、
グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の改変ポリペプチドを細胞内発現させることにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
【請求項７】
前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のリン酸化部位であるＣ末端のアミノ酸残基部分を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである請求項６記載の細胞融合制御方法。
【請求項８】
前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のＣ末端から最大５６個のアミノ酸残基を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである請求項６記載の細胞融合制御方法。
【請求項９】
フォルスコリン存在下で、前記タンパク質またはその改変ポリペプチドの発現を制御することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞融合制御方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞融合制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、
前記タンパク質またはその改変ポリペプチド、あるいは、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも１つを目的細胞内で発現するよう構築された遺伝子組換え用ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子組換え用ベクターを含有する細胞融合制御剤。
【請求項１】
動物細胞の細胞融合制御方法であって、
グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の発現を制御することにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
【請求項２】
前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の抑制である請求項１記載の細胞融合制御方法。
【請求項３】
前記タンパク質の発現の制御が、前記タンパク質の発現の促進である請求項１記載の細胞融合制御方法。
【請求項４】
前記タンパク質の発現の抑制が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による抑制である請求項２記載の細胞融合制御方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現によるものである請求項４記載の細胞融合制御方法。
【請求項６】
動物細胞の細胞融合制御方法であって、
グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびカルポニン３（ｃａｌｐｏｎｉｎ３）の少なくとも一方のタンパク質の改変ポリペプチドを細胞内発現させることにより、細胞融合を促進または抑制する細胞融合制御方法。
【請求項７】
前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のリン酸化部位であるＣ末端のアミノ酸残基部分を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである請求項６記載の細胞融合制御方法。
【請求項８】
前記タンパク質の改変ポリペプチドが、前記カルポニン３のＣ末端から最大５６個のアミノ酸残基を欠失したカルポニン３改変ポリペプチドである請求項６記載の細胞融合制御方法。
【請求項９】
フォルスコリン存在下で、前記タンパク質またはその改変ポリペプチドの発現を制御することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞融合制御方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞融合制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、
前記タンパク質またはその改変ポリペプチド、あるいは、前記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも１つを目的細胞内で発現するよう構築された遺伝子組換え用ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子組換え用ベクターを含有する細胞融合制御剤。
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１２４９７２（Ｐ２００９−１２４９７２Ａ）
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０１８３２（Ｐ２００７−３０１８３２）
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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