細胞配列システム及び細胞配列方法
【課題】多量の細胞を凝集させずに配列させることが可能な細胞配列システムを提供する。
【解決手段】血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を流す主流路と、一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、前記主流路と前記副流路との間に設けられ、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、前記主流路の順方向へ送液する第１送液ポンプと、前記主流路の前記主流路の順方向とは反対の逆方向に送液する第２送液ポンプと、を有し、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第２送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする細胞配列システム。
【解決手段】血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を流す主流路と、一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、前記主流路と前記副流路との間に設けられ、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、前記主流路の順方向へ送液する第１送液ポンプと、前記主流路の前記主流路の順方向とは反対の逆方向に送液する第２送液ポンプと、を有し、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第２送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする細胞配列システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、血液中における細胞、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Circulating tumor cell）を検出するために、細胞を配列する細胞配列システム及び細胞配列方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌患者の血液中においては腫瘍細胞が存在する。循環する血液中の腫瘍細胞の有無を検出することにより、癌に罹っているか否かあるいは、癌患者に対する治療の効果を判断することができる。
【０００３】
腫瘍細胞の濃度は非常に低く、１０７〜１０８個の細胞中にわずか数個の低濃度で存在する。例えば血液１０ｍｌのサンプルに対して含まれる腫瘍細胞は数個程度である。
【０００４】
特許文献１に開示されている方法では循環腫瘍細胞等の稀な細胞（rare cell）と特異的に反応する生物学的に特異的なリガンドにカップリングされた磁性粒子を用いることにより、稀な細胞を血液中から分離し、分離した稀な細胞を標識させ、標識した稀な細胞を観察することにより、稀な細胞の存在及び個数を検出している。
【０００５】
特許文献２では、メンブレンフィルタに循環腫瘍細胞が含まれる血液を通して、細胞を単離させる方法が記載されている。
【０００６】
特許文献３、特許文献４では、多数の細胞から１細胞レベルで分離、捕捉するためにマイクロ流路の一部に、複数の円筒形状又はすり鉢状の微細貫通孔を有するマイクロメッシュを配置し、微細流路に細胞を含む試料を注入し、マイクロメッシュの下方を所定の吸引圧で吸引する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０３８１４号公報
【特許文献２】特表２００８−５３８５０９号公報
【特許文献３】特開２００７−８９５６６号公報
【特許文献４】国際公開第２００９／０１６８４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１では観察対象である稀少細胞を抽出あるいは稀少細胞に限定する過程で、稀少細胞の取りこぼしが発生し、その結果、検出感度が低下するおそれがある。
【０００９】
取りこぼしが生じないようにするには、観察対象である稀少細胞及び白血球の細胞をすべて観察すればよく、その場合には、観察領域に細胞同士が重ならないように展開しなくてはならないが、ただ単純に広げただけでは、非常に広い観察領域を必要とし、この場合検出機器のサイズが大きくなり現実的ではない。
【００１０】
また特許文献２から４では、フィルタにより濾過して細胞を保持させているが、細胞は凝集しやすいために、凝集した多量の細胞を展開し整列させて光学的に観察することは構造的に難しい。
【００１１】
本願発明はこのような問題に鑑み、多量の細胞を凝集させずに配列させることが可能な細胞配列システム及び細胞配列方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１３】
１．血液中の細胞を配列する細胞配列システムであって、
血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を流す主流路と、
一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、
前記主流路と前記副流路との間に設けられ、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、
前記主流路の順方向及び逆方向への送液を行う送液機構と、
を有し、
前記送液機構によって、細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、その後細胞懸濁液を前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより、前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする細胞配列システム。
【００１４】
２．前記送液機構により前記主流路の順方向への送液及び前記主流路の逆方向への送液を繰り返すことにより、前記細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を複数回往復させることを特徴とする前記１に記載の細胞配列システム。
【００１５】
３．前記送液機構は、前記主流路の順方向へ送液する第１送液ポンプと、前記主流路の逆方向へ送液する第２送液ポンプを有し、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第２送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする前記１又は２に記載の細胞配列システム。
【００１６】
４．前記送液機構は、第１送液ポンプと、前記第１送液ポンプによる送液経路を第１の経路と第２の経路とに切り換える経路切換手段とを有し、
送液経路を前記経路切換手段により第１の経路とした前記第１送液ポンプにより細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、
通過させた細胞懸濁液を、送液経路を前記経路切換手段により第２の経路とした前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする前記１又は２に記載の細胞配列システム。
【００１７】
５．前記送液機構は、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
該第３送液ポンプにより前記副流路内を負圧にすることを特徴とする前記１から４のいずれか一項に記載の細胞配列システム。
【００１８】
６．前記送液機構は、送液方向を前記主流路の順方向と前記主流路の逆方向へ切換可能な第１送液ポンプと、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
前記第３送液ポンプによる前記副流路内を負圧にした状態で、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする前記１又は２に記載の細胞配列システム。
【００１９】
７．前記主流路であって前記主流路の順方向における前記第１フィルタよりも下流側に配置され、前記流路軸方向と交差する方向にフィルタ面が形成され、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有する第２フィルタを有することを特徴とする前記１から６の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【００２０】
８．前記副流路の前記一端とは異なる他端が前記主流路に接続されており、
第３送液ポンプにより、前記副流路内に送液された細胞懸濁液を前記他端から前記主流路に送液させることを特徴とする前記５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【００２１】
９．前記第３送液ポンプにより前記副流路内を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させることを特徴とする前記５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【００２２】
１０．主流路と、一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、前記主流路と前記副流路との間に設けられ配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、を有するチップ構造体の前記第１フィルタに細胞を配列させる細胞配列方法であって、
前記主流路の順方向に血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を送液することにより、該細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を通過させる第１工程と、
前記主流路の逆方向に送液することにより、前記第１フィルタ上を再び通過させる第２工程と、を有することを特徴とする細胞配列方法。
【００２３】
１１．前記第１工程と前記第２工程とを繰り返すことを特徴とする前記１０に記載の細胞配列方法。
【００２４】
１２．前記副流路の内部の圧力を可変にするポンプが接続されており、
前記ポンプにより前記副流路の内部の圧力を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させる振動工程を有することを特徴とする前記１０又は１１に記載の細胞配列方法。
【発明の効果】
【００２５】
本願発明によれば、フィルタの上で細胞懸濁液を往復させて送液することにより、多量の細胞を凝集させずに配列することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図２】図２（ａ）はチップ構造体１０の側面方向の断面図、図２（ｂ）は上方向の断面図である。
【図３】図３（ａ）は第１フィルタ１０１の断面図である、図３（ｂ）は上面図である。
【図４】白血球細胞ｃが孔ｈにトラップされている状態を示す図である。
【図５】チップ構造体１０での配列方法を説明する図である。
【図６】第２の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図７】第３の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図８】図８（ａ）は第４の実施形態に係るチップ構造体１０の側面方向の断面図、図８（ｂ）は上方向の断面図である。
【図９】第４の実施形態に係るチップ構造体１０での配列方法を説明する図である。
【図１０】第５の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図１１】図１１（ａ）はチップ構造体１０の側面方向の断面図、図１１（ｂ）は上方向の断面図である。
【図１２】変形例にかかる細胞配列システムでの各ポンプの動作を示すタイムチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００２８】
図１は、第１の実施形態に係る細胞配列システム１Ａ及びこれを備えた細胞検出システムの概略の構成を示す図である。
【００２９】
同図に示す細胞検出システムは、撮影部２５、画像解析部２０、細胞配列システム１Ａから構成される。そして細胞配列システム１Ａは、第１送液ポンプｐ１、第２送液ポンプｐ２、第３送液ポンプｐ３、チップ構造体１０、制御部１５、供給槽１６、バルブｂ１、及び排出槽１７を備える。制御部１５により各ポンプ及びバルブｂ１の制御を行う。第１の実施形態における送液機構は、正の圧力を付与する第１送液ポンプｐ１、正の圧力を付与する第２送液ポンプｐ２を少なくとも備えており、更に第３送液ポンプｐ３を備えていてもよい。
【００３０】
供給槽１６に供給された血液その他の細胞懸濁液は、第１送液ポンプｐ１により流路ｒ１を介してチップ構造体１０に供給される。チップ構造体１０の内部には第１フィルタ１０１が設けられており、第１フィルタ１０１には細胞懸濁液に含まれる血球その他の細胞を配列する。配列方法については後述する。
【００３１】
第１フィルタ１０１に配列された細胞の撮影を撮影部２５により行い、得られた画像データは画像解析部２０により画像解析される。ここでいう配列とは、理想的には全ての細胞が単層かつ高密度で配置されていることであり、各細胞が重ならずに高密度で配置させることにより撮影により全て細胞の形状を確認することができる。画像解析としては例えば、血液中の含まれる稀少細胞の選別を目的とするものであれば、第１フィルタ１０１に配列された個々の細胞の抽出を行う。そして抽出した細胞の中からその形状に基づき、白血球細胞及び腫瘍細胞その他の稀少細胞（rare cell）の選別を行って、稀少細胞の有無もしくは個数の検出を行う。
【００３２】
図２は、チップ構造体１０の拡大断面図である。図２（ａ）は側面の断面図、図２（ｂ）は上方向の断面図である。チップ構造体１０は主流路１０２、副流路１０３、第１フィルタ１０１を備える。主流路１０２は一方の端部が流路ｒ１を介して第１送液ポンプｐ１に、他方の端部が流路ｒ２を介して第２送液ポンプｐ２に接続されている。副流路１０３はその一端が主流路１０２の側面に接続されており他端は流路ｒ３に接続されている。図示矢印に示すように第１送液ポンプｐ１による送り方向は順方向ｆｄであり、第２送液ポンプｐ２による送り方向はその反対の逆方向ｒｄである。
【００３３】
第１フィルタ１０１の大きさとしては例えば１００ｍｍ□の０．０１ｍ２であり、主流路１０２の流路断面積は１０ｍｍ２（幅１００ｍｍ、高さ０．１ｍｍ）。送液する細胞懸濁液ｂｓの液量は、２０００μｌで、各方向への流量は１〜１０００μｌ／ｍｉｎであり、より好ましくは１０〜１００μｌ／ｍｉｎである。
【００３４】
第１フィルタ１０１は、主流路１０２の側面に設けられており、そのフィルタ面は主流路１０２の流路軸方向と平行な方向であって、かつ、副流路１０３の流線及び流路軸方向とは直交する方向に広がっている。また図２に示すチップ構造体１０の第１フィルタ１０１の真上には撮影部２５が配置されている。チップ構造体１０の筐体は、撮影部２５による光学的な撮影を行うために少なくとも第１フィルタ１０１の上方の部位は光透過性の材料（例えばアルカリガラス、石英ガラス、透明プラスチック類）を用い光が透過するようにしている。
【００３５】
図３は、第１フィルタ１０１の構造を説明する模式図である。図３（ａ）は第１フィルタ１０１の断面図である、図３（ｂ）は上面図である。図４は、図３（ａ）に対応する図であり、第１フィルタ１０１により白血球細胞ｃが孔ｈにトラップされている状態を示す図である。
【００３６】
これらの図に示す、第１フィルタ１０１では、多数の孔ｈが、所定の孔密度で例えば０．０１ｍ２の面積に渡って配置されている。孔密度としては例えば、１×１０１１／ｍ２〜６×１０１２／ｍ２である。それぞれの孔ｈは貫通孔であり、孔ｈの直径は、白血球細胞ｃ及び稀少細胞の直径よりも小さく、例えば０．５μｍである。なお図３に示す実施形態においてはフィルタの貫通孔を平面方向で均等配置としているが特にこれに限定されず、ランダムな配置であってもよい。例えば、焼結金属メッシュフィルタ（富士フィルター工業（株））、ニュークリポア（Nuclepore）メンブレン（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）販売元）である。
【００３７】
図５は、本実施形態におけるチップ構造体１０での配列方法を説明する図であり、図５（ａ）から図５（ｅ）まで時系列的に表示したものである。
【００３８】
図５（ａ）から図５（ｃ）は第１工程を示す図である。第１工程では、細胞懸濁液ｂｓを順方向ｆｄ（図５（ａ）参照）に送液して第１フィルタ１０１を通過させる。
【００３９】
図５（ａ）では、供給槽１６から供給された細胞懸濁液ｂｓを第１送液ポンプｐ１により、流路ｒ１を経由してチップ構造体１０の主流路１０２に送液した状態を示している。
【００４０】
なお各図においては細胞懸濁液ｂｓの前後には空気或いは不活性ガス等の気体が存在しており、気体を間に介して各ポンプから細胞懸濁液ｂｓに送液圧力が付与される。また、ここで用いる細胞懸濁液としては被験者から採取した血液に前処理を行ったものを用いている。前処理としては血液に対して、安定化剤を入れたり、所定の濃度に希釈したり、赤血球と血小板等を除いたりする。例えば採取した血液を安定化剤と混ぜ合わせて、その後に１５００ｒｐｍで５分間遠心後に、上澄みを取り除いて、残った沈澱物を用いる。なお細胞懸濁液ｂｓには少なくとも白血球細胞ｃ（場合によっては白血球細胞及び稀少細胞）が含まれている。
【００４１】
図５（ｂ）では、第１フィルタ１０１上を細胞懸濁液ｂｓが通過している状態を示している。副流路１０３は主流路１０２の下方に設けられているので、重力を受けて細胞懸濁液ｂｓの一部が分岐して副流路１０３に流れる。この際、第１フィルタ１０１の孔ｈの径は白血球細胞ｃの径よりも小さいので、白血球細胞ｃは第１フィルタ１０１でトラップ（捕捉）されることになる。
【００４２】
図５（ｃ）では、上流側から送液された細胞懸濁液ｂｓは第１フィルタ１０１よりも下流側で主流路１０２と副流路１０３に分岐して送液された状態を示している。
【００４３】
図５（ｃ）に示す状態において細胞懸濁液ｂｓの主流路１０２を流れる液量Ｍ２に対する副流路１０３を流れる液量Ｍ３の割合Ｒ（Ｒ＝Ｍ３／Ｍ２）は、２％〜５０％に設定している。割合Ｒは細胞懸濁液ｂｓの流動性や第１フィルタ１０１の抵抗により異なる値となる。
【００４４】
第３送液ポンプｐ３は必ずしも必要ではないが、割合Ｒを増加させたい場合あるいはコントロールしたい場合には有用である。本実施形態では、第３送液ポンプｐ３により、副流路１０３の内部を主流路１０２に対して負圧にすることにより割合Ｒを所定の範囲内に設定している。
【００４５】
図５（ｄ）、図５（ｅ）は、第２工程を示す図である。第２工程では、図５（ｃ）に示す状態で第１フィルタ１０１を通り過ぎて主流路１０２にある細胞懸濁液ｂｓを、第２送液ポンプｐ２により逆方向ｒｄに送液する。図５（ｃ）では、第１工程で第１フィルタ１０１を通過した細胞懸濁液ｂｓが第２送液ポンプｐ２により逆方向に送液されて、再び第１フィルタ１０１上を通過している状態を示している。細胞を配列するためには、第１フィルタ１０１の孔ｈにそれぞれ１個の白血球細胞ｃがトラップされていることが、望ましい。このように整列されている状態では白血球細胞ｃ同士は重ならずに比較的高密度で配置させることができるからである。
【００４６】
しかし、第１工程でトラップされた第１フィルタ１０１上の白血球細胞ｃは、孔ｈにトラップされている白血球細胞ｃだけでなく、これらの孔ｈの間に存在したりトラップされている白血球細胞ｃに重なって凝集したりしている白血球細胞ｃも存在する。図５（ｄ）から図５（ｅ）のように再び細胞懸濁液ｂｓを通過させることにより、これらのトラップされている白血球細胞ｃ以外の白血球細胞ｃの状態を変化させることができ、第１フィルタ１０１でのトラップ率を向上させることができる。なお第１工程で既にトラップされている白血球細胞ｃは、孔ｈに引っ掛かっているので比較的移動されにくく、そのためトラップ状態が維持されることになる。このように第１工程に引き続いて、第２工程を行うことによりトラップ率を向上させることができるので、細胞懸濁液に含まれる細胞を配列させることが可能となる。
【００４７】
なお、第２工程に引き続いて、再び第１工程、第２工程を繰り返して細胞懸濁液ｂｓの第１フィルタ１０１上の往復運動を複数回行うようにしてもよい。往復運動の回数は、前述の割合Ｒの値や供給した細胞懸濁液ｂｓの液量に応じて適宜選択することができる。複数回往復運動させることによりトラップ率をより向上させることができ、多くの細胞を重ならずに高密度で配置させることができるので高いレベルの配列を行うことができる。
【００４８】
更に以下に説明する細胞の固定と染色を行うことにより、より正確に細胞を観察することができる。細胞の固定と染色などの液交換における操作も本発明のチップ構造体を使用して行うと、反応後の細胞を配列し、かつ往復送液により細胞と反応液中の物質との接触回数が増えるため、反応効率を上げることが可能である。
【００４９】
細胞の固定方法としては、例えばホルマリン法、メタノール法などが行われる。細胞の染色方法としては、例えば核内のＤＮＡを染色するＤＡＰＩ染色やヘキスト染色、細胞種に特異的な抗体を用いる免疫染色が行われる。免疫染色としては、例えば白血球共通抗原ＣＤ４５、腫瘍マーカーＣＫ（サイトケラチン）が行われる。液交換の対象となる液体としては、細胞を固定するＰＦＡなどの液体、検体を希釈するための溶解液または希釈液、特定の細胞を検出するための各種反応試薬および洗浄試薬、抗体に蛍光色素等を固定化するための各種試薬（例えば、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ等）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕等）などがある。
【００５０】
第１フィルタ１０１に配列された細胞の撮影を撮影部２５により行い、得られた画像データを解析することにより稀少細胞の検出を行う。なお、撮影の際には第１フィルタ１０１の上には細部懸濁液ｂｓが残らないように、主流路１０２の順方向下流側や、副流路１０３に送液してから観察することが好ましい。
【００５１】
［第２、第３の実施形態］
次に第２、第３の実施形態について説明する。以降において第１の実施形態と異なるものとして記載された実施態様においては、同一構成部分には同一符号を付し、説明に換える。なお図６、図７においては、制御部１５及び、撮影部２５、画像解析部２０の記載は省略している。
【００５２】
図６は、第２の実施形態における細胞配列システム１Ｂの概略構成を示す図である。第２の実施形態においては、第１送液ポンプｐ１ｂは、正の圧力を付与することにより接続している管の内部を正圧にして液体あるいは空気を送り出す突出方向の送液とこれとは逆に負の圧力を付与することにより管の内部を負圧にする吸引方向への送液とを切り換えて行うことが可能である。第２の実施形態における送液機構は、正及び負の圧力を付与する第１送液ポンプｐ１ｂ、及び負の圧力を付与する第３送液ポンプｐ３を少なくとも備えている。
【００５３】
第２の実施形態においても、図５に示すと同様の配列方法を実行する。その際に同図における順方向ｆｄと逆方向ｒｄへの細胞懸濁液ｂｓの送液を、第１送液ポンプｐ１ｂにより行う。具体的には第１工程での順方向ｆｄへの送りは第１送液ポンプｐ１ｂにより正の圧力を付与することにより行い、第２工程での逆方向ｒｄへの送りは同ポンプにより負の圧力を付与することにより行う。なお、その際に第３送液ポンプｐ３は第２工程の間、若しくは第１工程及び第２工程の間に駆動させておき、副流路１０３内部の圧力を主流路１０２に対して負圧にしておくことが好ましい。
【００５４】
図７は、第３の実施形態における細胞配列システム１Ｃの概略構成を示す図である。同図に示す例では、第１送液ポンプｐ１ｃとチップ構造体１０との間の流路は、第１の経路である流路ｒ１と第２の経路である流路ｒ２に分岐しており、分岐部分には三方弁ｂ１０が設けられている。三方弁ｂ１０は、経路切換手段として機能し、第１送液ポンプｐ１ｃによる送液経路を流路ｒ１、ｒ２の何れかの方向に切り換え可能である。第３の実施形態における送液機構は、正の圧力を付与する第１送液ポンプｐ１ｃ、三方弁その他の経路切換手段を少なくとも備えており、更に第３送液ポンプｐ３を備えていてもよい。
【００５５】
第３の実施形態においても図５に示すと同様の配列方法を実行する。その際に同図における細胞懸濁液ｂｓの順方向ｆｄと逆方向ｒｄへの送液は、制御部１５が三方弁ｂ１０を制御することにより第１送液ポンプｐ１ｃによる送液方向を切り換えることにより行う。具体的には第１工程での順方向ｆｄへの送りは、三方弁ｂ１０を制御することにより細胞懸濁液ｂｃへの第１送液ポンプｐ１ｃによる正の圧力の付与が流路ｒ１側から行われるようにし、第２工程での逆方向ｒｄへの送りは正の圧力の付与が流路ｒ２側から行われるようにする。
【００５６】
図７に示す例では流路ｒ３の下流側は、開放された状態を示しているが、図６と同様に第３送液ポンプｐ３を接続し、これにより第１、第２工程の間、副流路１０３の内部を負圧にするようにしてもよい。
【００５７】
第２、第３の実施形態の構成においても、第１の実施形態と同様に、第１工程、第２工程を行うことによりトラップ率を向上させることができるので、細胞懸濁液に含まれる細胞を配列させることが可能となる。また第１工程、第２工程を複数回繰り返すようにしてもよい。これにより更なるトラップ率の向上を図ることが可能となる。
【００５８】
［第４の実施形態］
図８は第４の実施形態におけるチップ構造体１０の構造を説明する図であり、図８（ａ）は側面方向の断面図、図８（ｂ）は上方向の断面図である。第４の実施形態に係る細胞配列システムの構成は、第１〜第３の実施形態の細胞配列システムに適用可能である。
【００５９】
同図に示すように第４の実施形態におけるチップ構造体１０では、第２フィルタ１０６が設けられている。第２フィルタ１０６は、主流路１０２の内部で、順方向ｆｄにおける第１フィルタ１０１よりも下流側に配置されており、そのフィルタ面は主流路１０２の流路軸方向と交差する方向に形成されている。同図においては、主流路１０２の流路軸方向と直交する方向にフィルタ面を形成した例を示している。
【００６０】
第２フィルタ１０６の構成は、第１フィルタ１０１と同様であり説明は省略する。第２フィルタ１０６でも細胞の径よりも小さい径の孔が多数設けられているので、白血球細胞ｃをトラップすることができる。
【００６１】
なお、同図においては主流路１０２は直線状であり、主流路１０２の流路軸方向に平行な第１フィルタ１０１と流路軸方向に直交するな第２フィルタ１０６とは互いに直交する配置関係となっているが、これに限られず、主流路１０２を第１フィルタ１０１の順方向ｆｄの下流側で折り曲げる構成として、第１フィルタ１０１と第２フィルタ１０６とが平行となるようにしてもよい。図８において主流路１０２が下流側で下方向に曲がる構成であれば、第２フィルタ１０６の重力方向で上側に白血球細胞ｃがトラップされることになるので、第２フィルタ１０６を撮影部２５により撮影することにより第１フィルタ１０１と同様に第２フィルタ１０６も観察領域として用いることができる。
【００６２】
図９は、第４の実施形態に係るチップ構造体１０での配列方法を説明する図である。同図の図９（ａ）から図９（ｄ）は、図５（ａ）から図５（ｄ）に対応している。
【００６３】
第４の実施形態においては第２フィルタ１０６が設けられているので、図９（ａ）から図９（ｃ）に示す第１工程において順方向ｆｄに細胞懸濁液ｂｓを送液した際に、白血球細胞ｃは第２フィルタ１０６でトラップされることになる（図９（ｃ）参照）。第２フィルタ１０６にトラップされていた白血球細胞ｃは図９（ｄ）に示す第２工程においては、逆方向ｒｄへの送液により送液開始時に一度にトラップ状態から開放されるので、細胞懸濁液ｂｓの流れの先頭では、開放された多くの白血球細胞ｃが細胞懸濁液ｂｓに含まれていることになり、より高密度に第１フィルタ１０１に白血球細胞ｃを配列させることができる。
【００６４】
またこのようなことから、図９（ｄ）に示すように第２工程で逆方向ｒｄへ送液した細胞懸濁液ｂｓの前方ではこれに含まれる白血球細胞ｃの割合が高く、後方では低くなり場合によってはほとんど含まれないことになる。このことから図９（ｅ）に示すように、全ての細胞懸濁液ｂｓが通過する前に、可動させているポンプを第１送液ポンプｐ１に切り換えて送り方向を逆方向にすることができるので、より短時間で第１フィルタ１０１上への白血球細胞ｃの配列を行うことが可能となる。
【００６５】
［第５の実施形態］
図１０、図１１は、第５の実施形態に係る細胞配列システム１Ｅの概略の構成を示す図である。同図においては図１から図９に示す実施形態と同一の構成部材については同一符号を付すことにより説明に換える。同図に示す実施形態においては、副流路１０３ｂはその一端が主流路１０２に接続されており、他端はバルブｂ２及び流路ｒ１を介して主流路１０２に接続されている。
【００６６】
副流路１０３に送られた細胞懸濁液ｂｓは、副流路１０３の他端側から主流路１０２に環流させる。このようにすることにより副流路１０３に送液した細胞懸濁液を再利用できるので、往復回数により徐々に主流路１０２の内部を流れる細胞懸濁液が減少するということがなく、常に同じ状態で往復運動させるという効果がある。特に細胞懸濁液ｂｓの主流路１０２を流れる液量Ｍ２に対する副流路を流れる液量Ｍ３の割合Ｒを高くした場合に有効である。
【００６７】
［変形例］
図１２は、本実施形態の変形例にかかる細胞配列システムでの各ポンプの動作を示すタイムチャートである。変形例においては、第１工程、第２工程を行って細胞懸濁液の送液を行った後に、振動工程を行うものである。同図に示すタイムチャートでは、第１工程、第２工程をそれぞれ一回ずつ行ってから振動工程を実行しているが、第１工程、第２工程を複数回行ってから振動工程を行うようにしてもよく、また振動工程の後に第１工程、第２工程を行うようにしてもよい。更に振動工程を行うタイミングは、図５（ｂ）、図５（ｄ）のように細胞懸濁液ｂｓが、第１フィルタ１０１上を通過している途中で、第１送液ポンプｐ１あるいは第２送液ポンプｐ２による送液を中断して、振動工程を実行するようにしてもよい。
【００６８】
振動工程においては、第３送液ポンプｐ３による圧力付与方向を図５に示すような順方向からこれと反対方向の逆方向に順次切り換えることにより、副流路１０３の内部の圧力を正圧、負圧にして、第１フィルタ１０１上に存在する白血球細胞ｃあるいはこれが含まれる細胞懸濁液ｂｓに振動を与える。第３送液ポンプｐ３の圧力付与方向を変える周波数としては適宜選択することができる。
【００６９】
白血球細胞ｃあるいはこれが含まれる細胞懸濁液ｂｓに振動を与えることにより、第１フィルタ１０１上で孔ｈにトラップされている白血球細胞ｃに重なって凝集したりしている白血球細胞ｃを引き離す効果が期待できる。これにより白血球細胞ｃ同士を重ならないように配列させることが可能となる。
【符号の説明】
【００７０】
１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ 細胞配列システム
１５ 制御部
１６ 供給槽
１７ 排出槽
２０ 画像解析部
２５ 撮影部
ｐ１、ｐ１ｂ、ｐ１ｃ 第１送液ポンプ
ｐ２ 第２送液ポンプ
ｐ３ 第３送液ポンプ
ｂ１、ｂ２ バルブ
ｒ１、ｒ２、ｒ３ 流路
１０ チップ構造体
１０１ 第１フィルタ
１０２ 主流路
１０３、１０３ｂ 副流路
１０６ 第２フィルタ
ｈ 孔
ｂｓ 細胞懸濁液
ｃ 白血球細胞（腫瘍細胞）
【技術分野】
【０００１】
本願は、血液中における細胞、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Circulating tumor cell）を検出するために、細胞を配列する細胞配列システム及び細胞配列方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌患者の血液中においては腫瘍細胞が存在する。循環する血液中の腫瘍細胞の有無を検出することにより、癌に罹っているか否かあるいは、癌患者に対する治療の効果を判断することができる。
【０００３】
腫瘍細胞の濃度は非常に低く、１０７〜１０８個の細胞中にわずか数個の低濃度で存在する。例えば血液１０ｍｌのサンプルに対して含まれる腫瘍細胞は数個程度である。
【０００４】
特許文献１に開示されている方法では循環腫瘍細胞等の稀な細胞（rare cell）と特異的に反応する生物学的に特異的なリガンドにカップリングされた磁性粒子を用いることにより、稀な細胞を血液中から分離し、分離した稀な細胞を標識させ、標識した稀な細胞を観察することにより、稀な細胞の存在及び個数を検出している。
【０００５】
特許文献２では、メンブレンフィルタに循環腫瘍細胞が含まれる血液を通して、細胞を単離させる方法が記載されている。
【０００６】
特許文献３、特許文献４では、多数の細胞から１細胞レベルで分離、捕捉するためにマイクロ流路の一部に、複数の円筒形状又はすり鉢状の微細貫通孔を有するマイクロメッシュを配置し、微細流路に細胞を含む試料を注入し、マイクロメッシュの下方を所定の吸引圧で吸引する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０３８１４号公報
【特許文献２】特表２００８−５３８５０９号公報
【特許文献３】特開２００７−８９５６６号公報
【特許文献４】国際公開第２００９／０１６８４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１では観察対象である稀少細胞を抽出あるいは稀少細胞に限定する過程で、稀少細胞の取りこぼしが発生し、その結果、検出感度が低下するおそれがある。
【０００９】
取りこぼしが生じないようにするには、観察対象である稀少細胞及び白血球の細胞をすべて観察すればよく、その場合には、観察領域に細胞同士が重ならないように展開しなくてはならないが、ただ単純に広げただけでは、非常に広い観察領域を必要とし、この場合検出機器のサイズが大きくなり現実的ではない。
【００１０】
また特許文献２から４では、フィルタにより濾過して細胞を保持させているが、細胞は凝集しやすいために、凝集した多量の細胞を展開し整列させて光学的に観察することは構造的に難しい。
【００１１】
本願発明はこのような問題に鑑み、多量の細胞を凝集させずに配列させることが可能な細胞配列システム及び細胞配列方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１３】
１．血液中の細胞を配列する細胞配列システムであって、
血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を流す主流路と、
一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、
前記主流路と前記副流路との間に設けられ、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、
前記主流路の順方向及び逆方向への送液を行う送液機構と、
を有し、
前記送液機構によって、細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、その後細胞懸濁液を前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより、前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする細胞配列システム。
【００１４】
２．前記送液機構により前記主流路の順方向への送液及び前記主流路の逆方向への送液を繰り返すことにより、前記細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を複数回往復させることを特徴とする前記１に記載の細胞配列システム。
【００１５】
３．前記送液機構は、前記主流路の順方向へ送液する第１送液ポンプと、前記主流路の逆方向へ送液する第２送液ポンプを有し、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第２送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする前記１又は２に記載の細胞配列システム。
【００１６】
４．前記送液機構は、第１送液ポンプと、前記第１送液ポンプによる送液経路を第１の経路と第２の経路とに切り換える経路切換手段とを有し、
送液経路を前記経路切換手段により第１の経路とした前記第１送液ポンプにより細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、
通過させた細胞懸濁液を、送液経路を前記経路切換手段により第２の経路とした前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする前記１又は２に記載の細胞配列システム。
【００１７】
５．前記送液機構は、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
該第３送液ポンプにより前記副流路内を負圧にすることを特徴とする前記１から４のいずれか一項に記載の細胞配列システム。
【００１８】
６．前記送液機構は、送液方向を前記主流路の順方向と前記主流路の逆方向へ切換可能な第１送液ポンプと、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
前記第３送液ポンプによる前記副流路内を負圧にした状態で、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする前記１又は２に記載の細胞配列システム。
【００１９】
７．前記主流路であって前記主流路の順方向における前記第１フィルタよりも下流側に配置され、前記流路軸方向と交差する方向にフィルタ面が形成され、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有する第２フィルタを有することを特徴とする前記１から６の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【００２０】
８．前記副流路の前記一端とは異なる他端が前記主流路に接続されており、
第３送液ポンプにより、前記副流路内に送液された細胞懸濁液を前記他端から前記主流路に送液させることを特徴とする前記５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【００２１】
９．前記第３送液ポンプにより前記副流路内を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させることを特徴とする前記５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【００２２】
１０．主流路と、一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、前記主流路と前記副流路との間に設けられ配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、を有するチップ構造体の前記第１フィルタに細胞を配列させる細胞配列方法であって、
前記主流路の順方向に血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を送液することにより、該細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を通過させる第１工程と、
前記主流路の逆方向に送液することにより、前記第１フィルタ上を再び通過させる第２工程と、を有することを特徴とする細胞配列方法。
【００２３】
１１．前記第１工程と前記第２工程とを繰り返すことを特徴とする前記１０に記載の細胞配列方法。
【００２４】
１２．前記副流路の内部の圧力を可変にするポンプが接続されており、
前記ポンプにより前記副流路の内部の圧力を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させる振動工程を有することを特徴とする前記１０又は１１に記載の細胞配列方法。
【発明の効果】
【００２５】
本願発明によれば、フィルタの上で細胞懸濁液を往復させて送液することにより、多量の細胞を凝集させずに配列することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図２】図２（ａ）はチップ構造体１０の側面方向の断面図、図２（ｂ）は上方向の断面図である。
【図３】図３（ａ）は第１フィルタ１０１の断面図である、図３（ｂ）は上面図である。
【図４】白血球細胞ｃが孔ｈにトラップされている状態を示す図である。
【図５】チップ構造体１０での配列方法を説明する図である。
【図６】第２の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図７】第３の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図８】図８（ａ）は第４の実施形態に係るチップ構造体１０の側面方向の断面図、図８（ｂ）は上方向の断面図である。
【図９】第４の実施形態に係るチップ構造体１０での配列方法を説明する図である。
【図１０】第５の実施形態に係る細胞配列システムの概略の構成を示す図である。
【図１１】図１１（ａ）はチップ構造体１０の側面方向の断面図、図１１（ｂ）は上方向の断面図である。
【図１２】変形例にかかる細胞配列システムでの各ポンプの動作を示すタイムチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００２８】
図１は、第１の実施形態に係る細胞配列システム１Ａ及びこれを備えた細胞検出システムの概略の構成を示す図である。
【００２９】
同図に示す細胞検出システムは、撮影部２５、画像解析部２０、細胞配列システム１Ａから構成される。そして細胞配列システム１Ａは、第１送液ポンプｐ１、第２送液ポンプｐ２、第３送液ポンプｐ３、チップ構造体１０、制御部１５、供給槽１６、バルブｂ１、及び排出槽１７を備える。制御部１５により各ポンプ及びバルブｂ１の制御を行う。第１の実施形態における送液機構は、正の圧力を付与する第１送液ポンプｐ１、正の圧力を付与する第２送液ポンプｐ２を少なくとも備えており、更に第３送液ポンプｐ３を備えていてもよい。
【００３０】
供給槽１６に供給された血液その他の細胞懸濁液は、第１送液ポンプｐ１により流路ｒ１を介してチップ構造体１０に供給される。チップ構造体１０の内部には第１フィルタ１０１が設けられており、第１フィルタ１０１には細胞懸濁液に含まれる血球その他の細胞を配列する。配列方法については後述する。
【００３１】
第１フィルタ１０１に配列された細胞の撮影を撮影部２５により行い、得られた画像データは画像解析部２０により画像解析される。ここでいう配列とは、理想的には全ての細胞が単層かつ高密度で配置されていることであり、各細胞が重ならずに高密度で配置させることにより撮影により全て細胞の形状を確認することができる。画像解析としては例えば、血液中の含まれる稀少細胞の選別を目的とするものであれば、第１フィルタ１０１に配列された個々の細胞の抽出を行う。そして抽出した細胞の中からその形状に基づき、白血球細胞及び腫瘍細胞その他の稀少細胞（rare cell）の選別を行って、稀少細胞の有無もしくは個数の検出を行う。
【００３２】
図２は、チップ構造体１０の拡大断面図である。図２（ａ）は側面の断面図、図２（ｂ）は上方向の断面図である。チップ構造体１０は主流路１０２、副流路１０３、第１フィルタ１０１を備える。主流路１０２は一方の端部が流路ｒ１を介して第１送液ポンプｐ１に、他方の端部が流路ｒ２を介して第２送液ポンプｐ２に接続されている。副流路１０３はその一端が主流路１０２の側面に接続されており他端は流路ｒ３に接続されている。図示矢印に示すように第１送液ポンプｐ１による送り方向は順方向ｆｄであり、第２送液ポンプｐ２による送り方向はその反対の逆方向ｒｄである。
【００３３】
第１フィルタ１０１の大きさとしては例えば１００ｍｍ□の０．０１ｍ２であり、主流路１０２の流路断面積は１０ｍｍ２（幅１００ｍｍ、高さ０．１ｍｍ）。送液する細胞懸濁液ｂｓの液量は、２０００μｌで、各方向への流量は１〜１０００μｌ／ｍｉｎであり、より好ましくは１０〜１００μｌ／ｍｉｎである。
【００３４】
第１フィルタ１０１は、主流路１０２の側面に設けられており、そのフィルタ面は主流路１０２の流路軸方向と平行な方向であって、かつ、副流路１０３の流線及び流路軸方向とは直交する方向に広がっている。また図２に示すチップ構造体１０の第１フィルタ１０１の真上には撮影部２５が配置されている。チップ構造体１０の筐体は、撮影部２５による光学的な撮影を行うために少なくとも第１フィルタ１０１の上方の部位は光透過性の材料（例えばアルカリガラス、石英ガラス、透明プラスチック類）を用い光が透過するようにしている。
【００３５】
図３は、第１フィルタ１０１の構造を説明する模式図である。図３（ａ）は第１フィルタ１０１の断面図である、図３（ｂ）は上面図である。図４は、図３（ａ）に対応する図であり、第１フィルタ１０１により白血球細胞ｃが孔ｈにトラップされている状態を示す図である。
【００３６】
これらの図に示す、第１フィルタ１０１では、多数の孔ｈが、所定の孔密度で例えば０．０１ｍ２の面積に渡って配置されている。孔密度としては例えば、１×１０１１／ｍ２〜６×１０１２／ｍ２である。それぞれの孔ｈは貫通孔であり、孔ｈの直径は、白血球細胞ｃ及び稀少細胞の直径よりも小さく、例えば０．５μｍである。なお図３に示す実施形態においてはフィルタの貫通孔を平面方向で均等配置としているが特にこれに限定されず、ランダムな配置であってもよい。例えば、焼結金属メッシュフィルタ（富士フィルター工業（株））、ニュークリポア（Nuclepore）メンブレン（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）販売元）である。
【００３７】
図５は、本実施形態におけるチップ構造体１０での配列方法を説明する図であり、図５（ａ）から図５（ｅ）まで時系列的に表示したものである。
【００３８】
図５（ａ）から図５（ｃ）は第１工程を示す図である。第１工程では、細胞懸濁液ｂｓを順方向ｆｄ（図５（ａ）参照）に送液して第１フィルタ１０１を通過させる。
【００３９】
図５（ａ）では、供給槽１６から供給された細胞懸濁液ｂｓを第１送液ポンプｐ１により、流路ｒ１を経由してチップ構造体１０の主流路１０２に送液した状態を示している。
【００４０】
なお各図においては細胞懸濁液ｂｓの前後には空気或いは不活性ガス等の気体が存在しており、気体を間に介して各ポンプから細胞懸濁液ｂｓに送液圧力が付与される。また、ここで用いる細胞懸濁液としては被験者から採取した血液に前処理を行ったものを用いている。前処理としては血液に対して、安定化剤を入れたり、所定の濃度に希釈したり、赤血球と血小板等を除いたりする。例えば採取した血液を安定化剤と混ぜ合わせて、その後に１５００ｒｐｍで５分間遠心後に、上澄みを取り除いて、残った沈澱物を用いる。なお細胞懸濁液ｂｓには少なくとも白血球細胞ｃ（場合によっては白血球細胞及び稀少細胞）が含まれている。
【００４１】
図５（ｂ）では、第１フィルタ１０１上を細胞懸濁液ｂｓが通過している状態を示している。副流路１０３は主流路１０２の下方に設けられているので、重力を受けて細胞懸濁液ｂｓの一部が分岐して副流路１０３に流れる。この際、第１フィルタ１０１の孔ｈの径は白血球細胞ｃの径よりも小さいので、白血球細胞ｃは第１フィルタ１０１でトラップ（捕捉）されることになる。
【００４２】
図５（ｃ）では、上流側から送液された細胞懸濁液ｂｓは第１フィルタ１０１よりも下流側で主流路１０２と副流路１０３に分岐して送液された状態を示している。
【００４３】
図５（ｃ）に示す状態において細胞懸濁液ｂｓの主流路１０２を流れる液量Ｍ２に対する副流路１０３を流れる液量Ｍ３の割合Ｒ（Ｒ＝Ｍ３／Ｍ２）は、２％〜５０％に設定している。割合Ｒは細胞懸濁液ｂｓの流動性や第１フィルタ１０１の抵抗により異なる値となる。
【００４４】
第３送液ポンプｐ３は必ずしも必要ではないが、割合Ｒを増加させたい場合あるいはコントロールしたい場合には有用である。本実施形態では、第３送液ポンプｐ３により、副流路１０３の内部を主流路１０２に対して負圧にすることにより割合Ｒを所定の範囲内に設定している。
【００４５】
図５（ｄ）、図５（ｅ）は、第２工程を示す図である。第２工程では、図５（ｃ）に示す状態で第１フィルタ１０１を通り過ぎて主流路１０２にある細胞懸濁液ｂｓを、第２送液ポンプｐ２により逆方向ｒｄに送液する。図５（ｃ）では、第１工程で第１フィルタ１０１を通過した細胞懸濁液ｂｓが第２送液ポンプｐ２により逆方向に送液されて、再び第１フィルタ１０１上を通過している状態を示している。細胞を配列するためには、第１フィルタ１０１の孔ｈにそれぞれ１個の白血球細胞ｃがトラップされていることが、望ましい。このように整列されている状態では白血球細胞ｃ同士は重ならずに比較的高密度で配置させることができるからである。
【００４６】
しかし、第１工程でトラップされた第１フィルタ１０１上の白血球細胞ｃは、孔ｈにトラップされている白血球細胞ｃだけでなく、これらの孔ｈの間に存在したりトラップされている白血球細胞ｃに重なって凝集したりしている白血球細胞ｃも存在する。図５（ｄ）から図５（ｅ）のように再び細胞懸濁液ｂｓを通過させることにより、これらのトラップされている白血球細胞ｃ以外の白血球細胞ｃの状態を変化させることができ、第１フィルタ１０１でのトラップ率を向上させることができる。なお第１工程で既にトラップされている白血球細胞ｃは、孔ｈに引っ掛かっているので比較的移動されにくく、そのためトラップ状態が維持されることになる。このように第１工程に引き続いて、第２工程を行うことによりトラップ率を向上させることができるので、細胞懸濁液に含まれる細胞を配列させることが可能となる。
【００４７】
なお、第２工程に引き続いて、再び第１工程、第２工程を繰り返して細胞懸濁液ｂｓの第１フィルタ１０１上の往復運動を複数回行うようにしてもよい。往復運動の回数は、前述の割合Ｒの値や供給した細胞懸濁液ｂｓの液量に応じて適宜選択することができる。複数回往復運動させることによりトラップ率をより向上させることができ、多くの細胞を重ならずに高密度で配置させることができるので高いレベルの配列を行うことができる。
【００４８】
更に以下に説明する細胞の固定と染色を行うことにより、より正確に細胞を観察することができる。細胞の固定と染色などの液交換における操作も本発明のチップ構造体を使用して行うと、反応後の細胞を配列し、かつ往復送液により細胞と反応液中の物質との接触回数が増えるため、反応効率を上げることが可能である。
【００４９】
細胞の固定方法としては、例えばホルマリン法、メタノール法などが行われる。細胞の染色方法としては、例えば核内のＤＮＡを染色するＤＡＰＩ染色やヘキスト染色、細胞種に特異的な抗体を用いる免疫染色が行われる。免疫染色としては、例えば白血球共通抗原ＣＤ４５、腫瘍マーカーＣＫ（サイトケラチン）が行われる。液交換の対象となる液体としては、細胞を固定するＰＦＡなどの液体、検体を希釈するための溶解液または希釈液、特定の細胞を検出するための各種反応試薬および洗浄試薬、抗体に蛍光色素等を固定化するための各種試薬（例えば、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ等）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕等）などがある。
【００５０】
第１フィルタ１０１に配列された細胞の撮影を撮影部２５により行い、得られた画像データを解析することにより稀少細胞の検出を行う。なお、撮影の際には第１フィルタ１０１の上には細部懸濁液ｂｓが残らないように、主流路１０２の順方向下流側や、副流路１０３に送液してから観察することが好ましい。
【００５１】
［第２、第３の実施形態］
次に第２、第３の実施形態について説明する。以降において第１の実施形態と異なるものとして記載された実施態様においては、同一構成部分には同一符号を付し、説明に換える。なお図６、図７においては、制御部１５及び、撮影部２５、画像解析部２０の記載は省略している。
【００５２】
図６は、第２の実施形態における細胞配列システム１Ｂの概略構成を示す図である。第２の実施形態においては、第１送液ポンプｐ１ｂは、正の圧力を付与することにより接続している管の内部を正圧にして液体あるいは空気を送り出す突出方向の送液とこれとは逆に負の圧力を付与することにより管の内部を負圧にする吸引方向への送液とを切り換えて行うことが可能である。第２の実施形態における送液機構は、正及び負の圧力を付与する第１送液ポンプｐ１ｂ、及び負の圧力を付与する第３送液ポンプｐ３を少なくとも備えている。
【００５３】
第２の実施形態においても、図５に示すと同様の配列方法を実行する。その際に同図における順方向ｆｄと逆方向ｒｄへの細胞懸濁液ｂｓの送液を、第１送液ポンプｐ１ｂにより行う。具体的には第１工程での順方向ｆｄへの送りは第１送液ポンプｐ１ｂにより正の圧力を付与することにより行い、第２工程での逆方向ｒｄへの送りは同ポンプにより負の圧力を付与することにより行う。なお、その際に第３送液ポンプｐ３は第２工程の間、若しくは第１工程及び第２工程の間に駆動させておき、副流路１０３内部の圧力を主流路１０２に対して負圧にしておくことが好ましい。
【００５４】
図７は、第３の実施形態における細胞配列システム１Ｃの概略構成を示す図である。同図に示す例では、第１送液ポンプｐ１ｃとチップ構造体１０との間の流路は、第１の経路である流路ｒ１と第２の経路である流路ｒ２に分岐しており、分岐部分には三方弁ｂ１０が設けられている。三方弁ｂ１０は、経路切換手段として機能し、第１送液ポンプｐ１ｃによる送液経路を流路ｒ１、ｒ２の何れかの方向に切り換え可能である。第３の実施形態における送液機構は、正の圧力を付与する第１送液ポンプｐ１ｃ、三方弁その他の経路切換手段を少なくとも備えており、更に第３送液ポンプｐ３を備えていてもよい。
【００５５】
第３の実施形態においても図５に示すと同様の配列方法を実行する。その際に同図における細胞懸濁液ｂｓの順方向ｆｄと逆方向ｒｄへの送液は、制御部１５が三方弁ｂ１０を制御することにより第１送液ポンプｐ１ｃによる送液方向を切り換えることにより行う。具体的には第１工程での順方向ｆｄへの送りは、三方弁ｂ１０を制御することにより細胞懸濁液ｂｃへの第１送液ポンプｐ１ｃによる正の圧力の付与が流路ｒ１側から行われるようにし、第２工程での逆方向ｒｄへの送りは正の圧力の付与が流路ｒ２側から行われるようにする。
【００５６】
図７に示す例では流路ｒ３の下流側は、開放された状態を示しているが、図６と同様に第３送液ポンプｐ３を接続し、これにより第１、第２工程の間、副流路１０３の内部を負圧にするようにしてもよい。
【００５７】
第２、第３の実施形態の構成においても、第１の実施形態と同様に、第１工程、第２工程を行うことによりトラップ率を向上させることができるので、細胞懸濁液に含まれる細胞を配列させることが可能となる。また第１工程、第２工程を複数回繰り返すようにしてもよい。これにより更なるトラップ率の向上を図ることが可能となる。
【００５８】
［第４の実施形態］
図８は第４の実施形態におけるチップ構造体１０の構造を説明する図であり、図８（ａ）は側面方向の断面図、図８（ｂ）は上方向の断面図である。第４の実施形態に係る細胞配列システムの構成は、第１〜第３の実施形態の細胞配列システムに適用可能である。
【００５９】
同図に示すように第４の実施形態におけるチップ構造体１０では、第２フィルタ１０６が設けられている。第２フィルタ１０６は、主流路１０２の内部で、順方向ｆｄにおける第１フィルタ１０１よりも下流側に配置されており、そのフィルタ面は主流路１０２の流路軸方向と交差する方向に形成されている。同図においては、主流路１０２の流路軸方向と直交する方向にフィルタ面を形成した例を示している。
【００６０】
第２フィルタ１０６の構成は、第１フィルタ１０１と同様であり説明は省略する。第２フィルタ１０６でも細胞の径よりも小さい径の孔が多数設けられているので、白血球細胞ｃをトラップすることができる。
【００６１】
なお、同図においては主流路１０２は直線状であり、主流路１０２の流路軸方向に平行な第１フィルタ１０１と流路軸方向に直交するな第２フィルタ１０６とは互いに直交する配置関係となっているが、これに限られず、主流路１０２を第１フィルタ１０１の順方向ｆｄの下流側で折り曲げる構成として、第１フィルタ１０１と第２フィルタ１０６とが平行となるようにしてもよい。図８において主流路１０２が下流側で下方向に曲がる構成であれば、第２フィルタ１０６の重力方向で上側に白血球細胞ｃがトラップされることになるので、第２フィルタ１０６を撮影部２５により撮影することにより第１フィルタ１０１と同様に第２フィルタ１０６も観察領域として用いることができる。
【００６２】
図９は、第４の実施形態に係るチップ構造体１０での配列方法を説明する図である。同図の図９（ａ）から図９（ｄ）は、図５（ａ）から図５（ｄ）に対応している。
【００６３】
第４の実施形態においては第２フィルタ１０６が設けられているので、図９（ａ）から図９（ｃ）に示す第１工程において順方向ｆｄに細胞懸濁液ｂｓを送液した際に、白血球細胞ｃは第２フィルタ１０６でトラップされることになる（図９（ｃ）参照）。第２フィルタ１０６にトラップされていた白血球細胞ｃは図９（ｄ）に示す第２工程においては、逆方向ｒｄへの送液により送液開始時に一度にトラップ状態から開放されるので、細胞懸濁液ｂｓの流れの先頭では、開放された多くの白血球細胞ｃが細胞懸濁液ｂｓに含まれていることになり、より高密度に第１フィルタ１０１に白血球細胞ｃを配列させることができる。
【００６４】
またこのようなことから、図９（ｄ）に示すように第２工程で逆方向ｒｄへ送液した細胞懸濁液ｂｓの前方ではこれに含まれる白血球細胞ｃの割合が高く、後方では低くなり場合によってはほとんど含まれないことになる。このことから図９（ｅ）に示すように、全ての細胞懸濁液ｂｓが通過する前に、可動させているポンプを第１送液ポンプｐ１に切り換えて送り方向を逆方向にすることができるので、より短時間で第１フィルタ１０１上への白血球細胞ｃの配列を行うことが可能となる。
【００６５】
［第５の実施形態］
図１０、図１１は、第５の実施形態に係る細胞配列システム１Ｅの概略の構成を示す図である。同図においては図１から図９に示す実施形態と同一の構成部材については同一符号を付すことにより説明に換える。同図に示す実施形態においては、副流路１０３ｂはその一端が主流路１０２に接続されており、他端はバルブｂ２及び流路ｒ１を介して主流路１０２に接続されている。
【００６６】
副流路１０３に送られた細胞懸濁液ｂｓは、副流路１０３の他端側から主流路１０２に環流させる。このようにすることにより副流路１０３に送液した細胞懸濁液を再利用できるので、往復回数により徐々に主流路１０２の内部を流れる細胞懸濁液が減少するということがなく、常に同じ状態で往復運動させるという効果がある。特に細胞懸濁液ｂｓの主流路１０２を流れる液量Ｍ２に対する副流路を流れる液量Ｍ３の割合Ｒを高くした場合に有効である。
【００６７】
［変形例］
図１２は、本実施形態の変形例にかかる細胞配列システムでの各ポンプの動作を示すタイムチャートである。変形例においては、第１工程、第２工程を行って細胞懸濁液の送液を行った後に、振動工程を行うものである。同図に示すタイムチャートでは、第１工程、第２工程をそれぞれ一回ずつ行ってから振動工程を実行しているが、第１工程、第２工程を複数回行ってから振動工程を行うようにしてもよく、また振動工程の後に第１工程、第２工程を行うようにしてもよい。更に振動工程を行うタイミングは、図５（ｂ）、図５（ｄ）のように細胞懸濁液ｂｓが、第１フィルタ１０１上を通過している途中で、第１送液ポンプｐ１あるいは第２送液ポンプｐ２による送液を中断して、振動工程を実行するようにしてもよい。
【００６８】
振動工程においては、第３送液ポンプｐ３による圧力付与方向を図５に示すような順方向からこれと反対方向の逆方向に順次切り換えることにより、副流路１０３の内部の圧力を正圧、負圧にして、第１フィルタ１０１上に存在する白血球細胞ｃあるいはこれが含まれる細胞懸濁液ｂｓに振動を与える。第３送液ポンプｐ３の圧力付与方向を変える周波数としては適宜選択することができる。
【００６９】
白血球細胞ｃあるいはこれが含まれる細胞懸濁液ｂｓに振動を与えることにより、第１フィルタ１０１上で孔ｈにトラップされている白血球細胞ｃに重なって凝集したりしている白血球細胞ｃを引き離す効果が期待できる。これにより白血球細胞ｃ同士を重ならないように配列させることが可能となる。
【符号の説明】
【００７０】
１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ 細胞配列システム
１５ 制御部
１６ 供給槽
１７ 排出槽
２０ 画像解析部
２５ 撮影部
ｐ１、ｐ１ｂ、ｐ１ｃ 第１送液ポンプ
ｐ２ 第２送液ポンプ
ｐ３ 第３送液ポンプ
ｂ１、ｂ２ バルブ
ｒ１、ｒ２、ｒ３ 流路
１０ チップ構造体
１０１ 第１フィルタ
１０２ 主流路
１０３、１０３ｂ 副流路
１０６ 第２フィルタ
ｈ 孔
ｂｓ 細胞懸濁液
ｃ 白血球細胞（腫瘍細胞）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の細胞を配列する細胞配列システムであって、
血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を流す主流路と、
一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、
前記主流路と前記副流路との間に設けられ、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、
前記主流路の順方向及び逆方向への送液を行う送液機構と、
を有し、
前記送液機構によって、細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、その後細胞懸濁液を前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより、前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする細胞配列システム。
【請求項２】
前記送液機構により前記主流路の順方向への送液及び前記主流路の逆方向への送液を繰り返すことにより、前記細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を複数回往復させることを特徴とする請求項１に記載の細胞配列システム。
【請求項３】
前記送液機構は、前記主流路の順方向へ送液する第１送液ポンプと、前記主流路の逆方向へ送液する第２送液ポンプを有し、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第２送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞配列システム。
【請求項４】
前記送液機構は、第１送液ポンプと、前記第１送液ポンプによる送液経路を第１の経路と第２の経路とに切り換える経路切換手段とを有し、
送液経路を前記経路切換手段により第１の経路とした前記第１送液ポンプにより細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、
通過させた細胞懸濁液を、送液経路を前記経路切換手段により第２の経路とした前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞配列システム。
【請求項５】
前記送液機構は、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
該第３送液ポンプにより前記副流路内を負圧にすることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項６】
前記送液機構は、送液方向を前記主流路の順方向と前記主流路の逆方向へ切換可能な第１送液ポンプと、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
前記第３送液ポンプによる前記副流路内を負圧にした状態で、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞配列システム。
【請求項７】
前記主流路であって前記主流路の順方向における前記第１フィルタよりも下流側に配置され、前記流路軸方向と交差する方向にフィルタ面が形成され、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有する第２フィルタを有することを特徴とする請求項１から６の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項８】
前記副流路の前記一端とは異なる他端が前記主流路に接続されており、
第３送液ポンプにより、前記副流路内に送液された細胞懸濁液を前記他端から前記主流路に送液させることを特徴とする請求項５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項９】
前記第３送液ポンプにより前記副流路内を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させることを特徴とする請求項５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項１０】
主流路と、一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、前記主流路と前記副流路との間に設けられ配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、を有するチップ構造体の前記第１フィルタに細胞を配列させる細胞配列方法であって、
前記主流路の順方向に血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を送液することにより、該細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を通過させる第１工程と、
前記主流路の逆方向に送液することにより、前記第１フィルタ上を再び通過させる第２工程と、を有することを特徴とする細胞配列方法。
【請求項１１】
前記第１工程と前記第２工程とを繰り返すことを特徴とする請求項１０に記載の細胞配列方法。
【請求項１２】
前記副流路の内部の圧力を可変にするポンプが接続されており、
前記ポンプにより前記副流路の内部の圧力を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させる振動工程を有することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞配列方法。
【請求項１】
血液中の細胞を配列する細胞配列システムであって、
血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を流す主流路と、
一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、
前記主流路と前記副流路との間に設けられ、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、
前記主流路の順方向及び逆方向への送液を行う送液機構と、
を有し、
前記送液機構によって、細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、その後細胞懸濁液を前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより、前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする細胞配列システム。
【請求項２】
前記送液機構により前記主流路の順方向への送液及び前記主流路の逆方向への送液を繰り返すことにより、前記細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を複数回往復させることを特徴とする請求項１に記載の細胞配列システム。
【請求項３】
前記送液機構は、前記主流路の順方向へ送液する第１送液ポンプと、前記主流路の逆方向へ送液する第２送液ポンプを有し、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第２送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞配列システム。
【請求項４】
前記送液機構は、第１送液ポンプと、前記第１送液ポンプによる送液経路を第１の経路と第２の経路とに切り換える経路切換手段とを有し、
送液経路を前記経路切換手段により第１の経路とした前記第１送液ポンプにより細胞懸濁液を前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、
通過させた細胞懸濁液を、送液経路を前記経路切換手段により第２の経路とした前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞配列システム。
【請求項５】
前記送液機構は、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
該第３送液ポンプにより前記副流路内を負圧にすることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項６】
前記送液機構は、送液方向を前記主流路の順方向と前記主流路の逆方向へ切換可能な第１送液ポンプと、前記副流路の下流側に接続された第３送液ポンプを有し、
前記第３送液ポンプによる前記副流路内を負圧にした状態で、
細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の順方向に送液して前記第１フィルタ上を通過させ、通過させた細胞懸濁液を前記第１送液ポンプにより前記主流路の逆方向に送液して前記第１フィルタ上を再び通過させることにより前記第１フィルタに前記配列対象である細胞を配列させることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞配列システム。
【請求項７】
前記主流路であって前記主流路の順方向における前記第１フィルタよりも下流側に配置され、前記流路軸方向と交差する方向にフィルタ面が形成され、配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有する第２フィルタを有することを特徴とする請求項１から６の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項８】
前記副流路の前記一端とは異なる他端が前記主流路に接続されており、
第３送液ポンプにより、前記副流路内に送液された細胞懸濁液を前記他端から前記主流路に送液させることを特徴とする請求項５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項９】
前記第３送液ポンプにより前記副流路内を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させることを特徴とする請求項５から７の何れか一項に記載の細胞配列システム。
【請求項１０】
主流路と、一端が前記主流路の側面と接続する副流路と、前記主流路と前記副流路との間に設けられ配列対象である細胞の径よりも小さい開孔を有するフィルタ面が形成された第１フィルタと、を有するチップ構造体の前記第１フィルタに細胞を配列させる細胞配列方法であって、
前記主流路の順方向に血液中の細胞が含まれる細胞懸濁液を送液することにより、該細胞懸濁液を前記第１フィルタ上を通過させる第１工程と、
前記主流路の逆方向に送液することにより、前記第１フィルタ上を再び通過させる第２工程と、を有することを特徴とする細胞配列方法。
【請求項１１】
前記第１工程と前記第２工程とを繰り返すことを特徴とする請求項１０に記載の細胞配列方法。
【請求項１２】
前記副流路の内部の圧力を可変にするポンプが接続されており、
前記ポンプにより前記副流路の内部の圧力を正圧、負圧にし、これを交互に繰り返すことにより、前記第１フィルタに振動を付与させる振動工程を有することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞配列方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−６５（Ｐ２０１２−６５Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３９１３０（Ｐ２０１０−１３９１３０）
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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