組み換えヒトトロンビンの製造方法
本発明は、配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本出願は、組み換えエカリン(ecarin)を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トロンビンは、血液凝固カスケードにおける鍵となる酵素である。フィブリノーゲンからフィブリンモノマーへのトロンビン介在タンパク質消化により、血餅形成に至るカスケード反応が始まる。血餅形成は創傷治癒における第一段階である。加えて、トロンビンは創傷治癒に関与する細胞に対する化学誘引物質であり、そして、形成されたフィブリンネットワークはコラーゲン製造線維芽細胞の足場として働き、食作用を高め、血管形成を促進し、そして増殖因子と結合し、そうして治癒工程をさらに助ける。血餅形成の速度はトロンビンおよびフィブリノーゲンの濃度に依存する。血餅形成における重要な機能のために、トロンビンは、止血用の多くの製品におよび／または組織シーラントまたは“接着剤”として、いずれも単独型製品(すなわちThrombin-JMI)またはフィブリンまたは他の化合物との組み合わせ (すなわちTisseel、Hemaseel、Crosseal) として使用されている。使用の可能性のある領域は広い；皮膚移植、神経系外科、心臓外科、胸部(toracic)外科、血管外科、腫瘍外科、形成外科、眼科外科、整形外科、外傷外科、頭頚部外科、婦人科および泌尿器科外科、消化器外科、口腔外科、薬物送達、組織工学および歯腔止血。
【０００３】
現在まで上市されている承認されたトロンビン含有製品中のトロンビンは、ヒトまたはウシいずれかの血漿由来である。血漿由来タンパク質の使用は、入手量の限界、ならびにウイルスやプリオンの伝播の危険性および自己抗体形成の誘因となる危険性(ウシ製品)のような安全性懸念などの欠点を持つ。ウシトロンビン暴露による抗体形成が顕著な出血障害に至る症例が知られている。
【０００４】
インビボでトロンビンは血液凝固カスケードを介するプロトロンビンの活性化により得られる。血液凝固カスケードを介する活性化は、ガンマ−カルボキシグルタメートに変換される、８−１０個のグルタミン残基を含む機能的ＧＬＡドメインの存在による。インビトロで、不完全ガンマ−カルボキシル化プロトロンビンを、エカリンのようなプロトロンビンアクティベーターの使用によりまたトロンビンに変換できる。ケニアの毒ヘビEchis carinatus由来のヘビ毒であるエカリンは凝血原であり、ヒトプロトロンビンをＡｒｇ３２０−Ｉｌｅ３２１残基間で開裂してメイゾトロンビンを製造するプロテアーゼである。さらなる自己触媒的処理がメイゾトロンビンｄｅｓＦ１、続いてトロンビンの成熟活性形であるアルファ−トロンビンの形成に至る。
【０００５】
理想的な商業的トロンビン製造方法は、動物由来成分の添加無しに高い生産性で製造される組み換えトロンビン前駆体および組み換えプロテアーゼを使用することであろう。さらなる要請は、安定した生産性、容易性および低コストであろう。
【０００６】
効率的組み換えヒトトロンビン(ｒｈ−トロンビン)に対する大きな障壁は、プロトロンビンを高収率で得ることである。多大なる労力が費やされているが、生物製剤の製造に適する条件下で高収率でプロトロンビンを得ることは長い間挑戦課題のままである。Yonemura et al. (J Biochem 135:577-582, 2004)は、組み換えエカリンで消化させた、組み換えＧＬＡドメイン貧化(less)プレトロンビンを使用して組み換えヒトトロンビンを製造している。製造規模でのプレトロンビンの生産性は１５０−２００mg／Ｌであり、これは商業規模製造のためには中程度の生産性である。エカリンの組み換え製造もＷＯ０１／０４１４６に記載されている。その公報において、ｒｈ−トロンビンの製造は、ＣＯＳ細胞中で製造された組み換えプロトロンビンの、ＣＨＯ細胞から製造された組み換えエカリンによる変換により例示されている。しかしながら、この例示された方法は大規模製造に適さず、そして動物由来成分を使用する。
【０００７】
組み換えエカリンは活性化されることが必要なプレプロタンパク質として製造される。ｒ−エカリンを効率的に活性化するための課題は両方の刊行物に記載され、示唆される活性化方法は最適とはほど遠い。
【０００８】
それ故、組み換えヒトトロンビンを得る改善された方法が必要である。ガンマ−カルボキシル化ヒトプロトロンビンの生産性を上げるための我々の努力の間に、我々は驚くべきことに、ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ(ＧＧＣＸ)との共発現が、不完全カルボキシル化プロトロンビンの生産性もまた大きく改善することを発見した(ＷＯ２００５０３８０１９を参照)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＷＯ２００５０３８０１９に記載されたような発現方法により得た組み換えプロトロンビンから、ヒトトロンビンを効率的に製造する方法を記載する。組み換えエカリンと組み合わせた組み換えカルボキシル化または不完全カルボキシル化プロトロンビンは、これより前に組み換えトロンビンの製造には使用されていない。さらに、組み換えエカリンを活性化する方法は新規である。記載の方法は、動物由来成分の添加無く、大規模でｒｈ−トロンビンを製造するのに適する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明の第一の局面によって、配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法が提供される。
【００１１】
他の局面によって、該方法に従う組み換えトロンビンを、薬学的に許容される担体、媒体および／またはアジュバントと共に含む、医薬組成物が提供される。
【００１２】
他の局面によって、配列番号２に従う組み換えエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列が提供される。
【００１３】
さらなる局面によって、配列番号２に従う組み換えエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターが提供される。
【００１４】
なおさらなる局面によって、配列番号２に従う組み換えエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターを含む細胞株が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＦＩＩ＋ＧＧＣＸ構築物
【図２】エカリン構築物
【図３】トロンビン製造を略述する方法の例
【図４】本発明で使用する組み換えエカリンおよび野生型エカリンのヌクレオチド配列アラインメント
【図５】本発明で使用する組み換えエカリンおよび野生型エカリンのアミノ酸アラインメント
【図６】細胞死中の経時的な組み換えエカリンの活性化を示すグラフ
【図７】経時的な細胞培養中の組み換えエカリンの活性化、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでアッセイ
【図８】ｒｈ−トロンビンのＣＩＥＸ精製由来のクロマトグラム
【図９】ＣＩＥＸ精製により得たフラクションの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明は、一部、適当な制御配列と結合したヒトプロトロンビン(ＦＩＩ)および適当な制御配列と結合したヒトガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ(ＧＧＣＸ)をコードするベクター(図１)での安定なトランスフェクトによりもたらされた細胞株から成る。制御配列は、プロトロンビン発現が、ＧＧＣＸ発現の少なくとも１０倍過剰となるように選択すべきである。宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ.６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、ならびにそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｓである。得られたプロトロンビン製造細胞株を、ガンマ−カルボキシル化を無視して、プロトロンビンの高収率のために最適化された培養条件下で増殖させる。ビタミンＫを増殖培地に添加してもしなくてもよい。
【００１７】
本発明は特定のプロトロンビンまたはガンマ−グルタミルカルボキシラーゼまたは、共発現すべきこれらのタンパク質の一方のタンパク質をコードする配列に限定されないことは認識されよう。さらに、そして特に凝血因子に関して、タンパク質の多くの突然変異型が当分野で開示されている。本発明は、野生型配列に適用されるのと同様に、天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、プロトロンビンおよびガンマ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の突然変異型に等しく適用される。一つの態様において、本発明は、全ての野生型タンパク質またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％配列同一性を有するタンパク質で行うことができる。他の態様において、表１に記載する配列を使用できる。
【００１８】
【表１】
【００１９】
これらのタンパク質いずれも、その核酸およびアミノ酸配列を含み、既知である。表２は、本発明において使用できる種々のタンパク質の野生型および突然変異型の代表的配列を同定する。
【００２０】
本明細書で使用する用語“ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ”または“ＧＧＣＸ”は、グルタミン酸残基のカルボキシル化を触媒するビタミンＫ依存性酵素を意味する。
【００２１】
ＧＧＣＸ酵素は広く分布し、シロイルカ(Delphinapterus leucas)、ガマアンコウ(Opsanus tau)、鶏(Gallus gallus)、メクラウナギ(Myxine glutinosa)、カブトガニ(Limulus polyphemus)、およびイモガイ(Conus textile)のような多様な生物種からクローン化されている(Begley et al., 2000, ibid;Bandyopadhyay et al. 2002, ibid)。イモガイからのカルボキシラーゼはウシカルボキシラーゼに類似し、ＣＯＳ細胞で発現されている(Czerwiec et al. 2002, ibid)。ＧＧＣＸに類似するさらなるタンパク質を、昆虫および原核生物、例えばガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)およびレプトスピラ属(Leptospira)において見ることができ、それぞれＮＣＢＩ受託番号：gi 31217234、gi 21298685、gi 24216281およびgi 24197548(Bandyopadhyay et al., 2002, ibid)である。カルボキシラーゼ酵素は、顕著な進化的保存を示す。非ヒト酵素の数種が、我々が使用しているヒトＧＧＣＸと類似の活性を示し、または示すことが予測でき、それ故、ヒト酵素の代替として使用してよい。
【００２２】
表２は、本発明に使用できるヒトＧＧＸＣに相当な推定タンパク質の代表的配列を同定する(起源の生物種に従い分類)。
【表２】
【表３】
【００２３】
上記ＧＧＣＸタンパク質および他の生物種由来のＧＧＣＸタンパク質の各々を、本発明におけるカルボキシラーゼ酵素として使用できる。
【００２４】
本発明の第二部分は、エカリンおよび関連制御要素をコードするポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトした細胞株である(図２)。エカリンコード配列は、哺乳動物細胞における発現に関して最適化してよいが、かかる配列に限定されない。本発明の一つの態様において、配列番号２に従う配列またはその相同体を使用してエカリンを発現する。エカリンをコードする配列番号２の相同体は、配列番号２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有し得る。宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ.６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、およびそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｓである。
【００２５】
一つの態様において、プロトロンビンおよびエカリンは、同一親細胞株に由来する細胞から製造する。この細胞株起源は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)(その派生物を含む)およびＮＳ０(骨髄腫ＢＡＬＢ／ｃマウス)(その派生物を含む)であってよく、そしてこれらに限定されない。同じ細胞株バックグラウンドを使用する目的は、トロンビン産物の精製および純度の評価を容易にするためである。
【００２６】
他の態様において、エカリンおよびプロトロンビンを異なる宿主細胞株；すなわち各々ＣＨＯおよびＮＳ０から製造する。
【００２７】
本発明の一つの局面において、組み換えエカリンの使用が、これが、トロンビン製造工程中および最終トロンビン産物における非トロンビン産物由来成分の検出を容易にするために、好ましい。第二の局面において、組み換えエカリンが、ヘビ毒由来のエカリンに存在し得るアレルゲン性または毒性成分への暴露の危険性を減らすために、好ましい。第三の局面において、ヘビ毒からのエカリンは、エカリン調製物のバッチ間変化および限られたバッチサイズのために好ましくない。
【００２８】
粗プロトロンビンおよび粗エカリンを混合し、実施例３に記載のようなトロンビン形成を可能にする条件下でインキュベートする。次いで、製造されたトロンビンを実施例４に記載の方法、または当業者に既知の他の方法により精製する。あるいは、プロトロンビンおよび／またはエカリンを、最初に当分野で既知の方法により精製し、続いて混合してトロンビンを得ることができる。次いで、トロンビンを非産物成分から精製する。
適当なトロンビン製造方法の例を図３に概説する。
【００２９】
配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用する、組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法が提供される。組み換えエカリンは、ＣＨＯ−Ｓ細胞中配列番号２のヌクレオチド配列またはその相同体を含む遺伝子を含む細胞で発現され、かつ分泌され得るが、この場合のエカリンは、野生型エカリンと同じアミノ酸配列を有する。
【００３０】
上記方法において、組み換えプロトロンビンを組み換えエカリンに付し、その組み換えエカリンは、ＣＨＯ−Ｓ細胞による細胞外発現後活性形で単離でき、該細胞を、該エカリンの活性化に十分な時間アポトーシス／壊死を起こさせ、そうしてヒト組み換えトロンビンを単離する。
【００３１】
組み換えプロトロンビンは、配列番号１の配列またはその相同体を含むヌクレオチド配列を有するプロトロンビン発現遺伝子を含む細胞株により製造できる。プロトロンビンをコードする配列番号１の相同体は、配列番号１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有し得る。組み換えプロトロンビンは、完全カルボキシル化プロトロンビンと不完全カルボキシル化プロトロンビンの混合物であり得る。一つの態様において、組み換えプロトロンビンは完全カルボキシル化プロトロンビンであり、そして他の態様において、組み換えプロトロンビンは不完全カルボキシル化プロトロンビンである。
【００３２】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法により得られる組み換えトロンビンに関する。本発明の方法により得られる組み換えトロンビンを薬学的に許容される担体、媒体および／またはアジュバントと共に含む医薬組成物を設計できる。本医薬組成物は、適用可能な形態であり得る。
【００３３】
一つの態様において、記載の方法により製造したトロンビンを、他のタンパク質、すなわち組み換え細胞、トランスジェニック動物またはヒト血漿由来のフィブリンと組み合わせて組織シーラント(“接着剤”)の製造に使用できる。他の態様において、記載の方法により製造したトロンビンを、一活性成分としてまたは非タンパク質マトリックスと組み合わせて凍結乾燥した独立型製品として、または、一活性成分としてまたは他の活性成分と組み合わせた溶液として使用できる。
【００３４】
適当な混ぜ入れられる成分は、コラーゲン、キチン、分解性ポリマー、セルロース、組み換え凝血因子および、トランスジェニックまたは組み換え源からのフィブリノーゲンであろうが、これらに限定されない。
【００３５】
組織シーラント(“接着剤”)の可能性のある領域は非常に多い；皮膚移植、神経系外科、心臓外科、胸部外科、血管外科、腫瘍外科、形成外科、眼科外科、整形外科、外傷外科、頭頚部外科、婦人科および泌尿器科外科、消化器外科、口腔外科、薬物送達、組織工学および歯腔止血。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、治療的有効量の本発明の方法を使用して得られる組み換えヒトトロンビンを患者に投与することにより、凝血を誘発する方法に関する。
【００３７】
本発明の他の局面は、配列番号２または組み換えエカリンをコードするその相同体に従う単離ＤＮＡ配列である。エカリンをコードする配列番号２の相同体は、配列番号２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。配列番号２は、最適発現のために最適化されている設計された配列である。本配列は、哺乳動物細胞系での発現に特に適する。
【００３８】
さらなる局面によって、配列番号２またはその相同体を含むベクターが提供される。該ベクターは配列番号２またはその相同体を過剰発現し、そして、配列番号２またはその相同体によりコードされるエカリンの発現を可能にする発現制御配列に操作可能に結合するように設計できる。第三の局面によって、配列番号２またはその相同体によりコードされるエカリンを発現できる、該ベクターを含む宿主細胞が提供される。この宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ.６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、およびそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｓである。
【００３９】
本発明の他の態様に従って、配列番号２またはその相同体によりコードされるアミノ酸配列を含み、そして実施例２に記載の方法により得る、ポリペプチドが提供される。
【００４０】
２個の配列間の配列同一性は、BestFit、PILEUP、GapまたはFrameAlignのようなプログラムを使用する、対方式(pair-wise)コンピューターアラインメント分析により決定できる。好ましいアラインメントツールはBestFitである。実施に際し、配列データベース内で、クエリー配列に対する類似／同一配列を検索する時、適当なアルゴリズム、例えばBlast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA、またはFasta3およびスコアリングマトリックス、例えばBlosum 62を使用した類似配列の最初の同定を実施することが一般に必要である。かかるアルゴリズムは、Smith-Watermanの“ゴールド・スタンダード”アラインメントアルゴリズムに厳密に近づける努力をする。それ故、類似性、すなわち、いかに２種の一次ポリペプチド配列が整列するかの評価に使用するための好ましいソフトウエア／検索エンジンは、Smith-Watermanである。同一性は直接の適合を意味し、類似性は保存的置換が可能である。
【００４１】
実験の部
本発明をさらに以下の実施例の手段により記載し、それは添付の特許請求の範囲の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００４２】
実施例１
ＣＨＯ細胞における組み換えヒトプロトロンビンの高収率製造
図１に示す、配列番号１のヌクレオチド配列を有する構築物ＰＮ３２を含むＰ１Ｅ２細胞株を、トロンビン製造に使用するためのプロトロンビンを製造するために、タンパク質および動物成分を含まない増殖培地を使用して、ＷＯ２００５０３８０１９に記載の方法に従い醗酵機中で増殖させた。細胞培養バッチ法または灌流培養法(表１)のいずれかで増殖させ、製造されたプロトロンビンの量をエカリンアッセイにより測定した。このエカリンアッセイは、本質的にChromogenixアッセイ(Moelndal, Sweden)の通りに、標準として精製血漿由来ヒトプロトロンビン(Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA)を使用して行った。
【００４３】
【表４】
醗酵機実験は、バッチ培養法および灌流培養法の両方が、組み換えトロンビンの製造に適するプロトロンビンの製造に使用できることを示した(表１)。これらの醗酵機実験により得られた完全カルボキシル化プロトロンビンの割合は約５５−８７％であり、残りは不完全カルボキシル化プロトロンビンであった。
【００４４】
実施例２
ＣＨＯ細胞における組み換えエカリンの製造
哺乳動物細胞における発現のために最適化した配列番号２のヌクレオチド配列を有するエカリンコード配列を合成し、InvitrogenベクターｐＣＤＮＡ ３．１＋にクローン化した(図２)。本発明で使用する組み換えエカリンのヌクレオチド配列と野生型エカリンの配列(ＧＩ：７１７０９０)のアラインメントを図４に示す。図５から明らかな通り、この組み換えエカリンは、野生型エカリンのアミノ酸配列と１００％相同である。ＡＺエカリン(配列番号３)であるこの構築物を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen)を安定にトランスフェクトした。エカリンは宿主細胞により細胞外空間に分泌され、エカリン製造クローンについてスクリーニングするために、培養上清サンプルを採り、アッセイ緩衝液(０.１％ＢＳＡ含有５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４)中、組み換えヒトプロトロンビン(ｒｈＦＩＩ)と最終濃度１mg ｒｈＦＩＩ／Ｌまで混合した。この混合物を２０−４０分間、３７℃でインキュベートした。サンプル中に存在するエカリンの作用により製造されたトロンビンを、次いで、色素生産性トロンビン基質Ｓ−２２３８(Chromogenix, Moelndal)の１−２mM溶液の添加により検出した。発色をモニターし、適当なときに２０％酢酸を使用して停止させた。製造された組み換えエカリンの活性を概算するために、活性が証明されているヘビ毒由来エカリンをSigmaから購入し、標準として仕様した。得られた最良の製造細胞株は、動物成分を含まない培地で増殖させて、実験室規模シェーカー培養の培養液１リットル当たり最大７０００Ｕエカリンを製造した。
【００４５】
組み換えエカリンの活性化
上記方法は組み換えエカリンをプロタンパク質として製造した。それ故、最適活性のためにプロ部分の除去による活性化が必要である。驚くべきことに、我々は、活性化が、エカリン製造細胞の死亡後、培養物のインキュベーションを少なくとも７日間継続することにより最も好都合に得られることを発見した(図６)。使用した培養培地は、ＨＴサプリメント、非必須アミノ酸およびGlutamax Iを補ったＣＤ−ＣＨＯ(ＣＨＯ−Ｓに関してInvitrogenが推奨する通り)であり、増殖条件は、３７℃で、５％二酸化炭素含有雰囲気下のシェーカーボトルであった。培養サンプルを、上記の通り活性についてアッセイした。図６から明らかな通り、組み換えエカリンの活性はこの期間に増加した。
【００４６】
培養上清からのサンプルをまたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜にブロットした。膜の標識を、大腸菌中に封入体として発現されるエカリンの成熟部分に対するポリクローナルウサギ血清で行った。“Ｍ”は分子量マーカーを意味し、数字はサンプル回収日を意味する。図７から明らかな通り、本組み換えエカリンは細胞死後１週間を超えて安定なままである。エカリンの活性化をまた低温で、例えば室温ほど低い温度で行ってよいが、そうすれば活性化により長い時間が必要である。エカリンは、死亡した宿主細胞の存在下で室温で数ヶ月間安定なままである。活性は、それが安定するまで徐々に増加する。細菌感染があるか高温下以外で、活性の減少は観察されていない。エカリンの活性化のためにトリプシンの使用を試みたが、失敗した。
【００４７】
実施例３
エカリンによるプロトロンビンからトロンビンへの変換
エカリンプロテアーゼは、プロトロンビンを、トロンビン触媒活性を有するトロンビンの中間体形態であるメイゾトロンビンに変換する。トロンビンへのさらなる処理が、自己触媒により達成される。プロトロンビンからトロンビンへの変換に必要なエカリン培養の量を概算するために、我々は一連の試験消化を行った。種々の量の実施例２で得たエカリン含有培養上清を、ＰＢＳ緩衝液(Cambrex)中１mg／mlプロトロンビン(実施例１の通りに得た)とイオン号した。混合物のインキュベーションを３７℃で１−３時間行った。次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、プロトロンビンからトロンビンへの完全な変換に必要な組み換えエカリンの量を同定した。この方法により、我々は、組み換えエカリンが非常に強力であることを発見した；７０００Ｕ／Ｌで１リットルのエカリン培養上清が、３７℃で３時間以内に６４グラムのプロトロンビンをトロンビンに変換することができた。通常組み換えにより製造したプロトロンビンは完全カルボキシル化プロトロンビンを不完全カルボキシル化プロトロンビンから分離するために精製しなければならない。しかしながら、本組み換えエカリンが完全カルボキシル化および不完全カルボキシル化プロトロンビンの両方を効率的に活性化できるため、本発明ではこれは必要ない。
【００４８】
実施例４
トロンビンの精製
実施例３に記載の方法により得たトロンビンを、AEKTA-FPLC(GE Healthcare)および２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５で平衡化したＳＰ−セファロースＨＰカラム(GE Healthcare)を使用するカチオン交換クロマトグラフィー(ＣＩＥＸ)により精製した。実施例３の通りに製造したエカリン消化プロトロンビンをｐＨ６.２および約８mS／cmの伝導性に調節した。トロンビンを、カラム平衡緩衝液中、２０カラム容積にわたる１Ｍ塩化ナトリウム勾配で溶出した(図８)。選択フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した(図９)。トロンビン活性を色素生産性トロンビン基質Ｓ−２２３８とのインキュベーションにより確認した(Chromogenix, Moelndal)。
【００４９】
実施例５
得られたｒｈ−トロンビンの分析
得られたトロンビンをさらに分析するために、色素生産性トロンビン基質Ｓ−２３６６(Chromogenix)を使用して動的パラメータを測定した。活性をヒルジンでの力価測定により概算した。全パラメータについてｒｈ−トロンビンは次の通りであった；Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA)からの血漿由来ヒトα−トロンビンに類似する活性、ＫｋａｔおよびＶｍａｘ。
精製トロンビンをまたＮ末端配列決定に付した：還元トロンビン重および軽ポリペプチド鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Immobilon P膜(Millipor)にブロットした。摘出したバンドをEdman分解法により配列決定した。予想通り重鎖Ｎ末端の最初の５個のアミノ酸はＩＶＥＧＳであると確認され、軽鎖の５個のＮ末端アミノ酸はＴＦＧＳであった。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本出願は、組み換えエカリン(ecarin)を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トロンビンは、血液凝固カスケードにおける鍵となる酵素である。フィブリノーゲンからフィブリンモノマーへのトロンビン介在タンパク質消化により、血餅形成に至るカスケード反応が始まる。血餅形成は創傷治癒における第一段階である。加えて、トロンビンは創傷治癒に関与する細胞に対する化学誘引物質であり、そして、形成されたフィブリンネットワークはコラーゲン製造線維芽細胞の足場として働き、食作用を高め、血管形成を促進し、そして増殖因子と結合し、そうして治癒工程をさらに助ける。血餅形成の速度はトロンビンおよびフィブリノーゲンの濃度に依存する。血餅形成における重要な機能のために、トロンビンは、止血用の多くの製品におよび／または組織シーラントまたは“接着剤”として、いずれも単独型製品(すなわちThrombin-JMI)またはフィブリンまたは他の化合物との組み合わせ (すなわちTisseel、Hemaseel、Crosseal) として使用されている。使用の可能性のある領域は広い；皮膚移植、神経系外科、心臓外科、胸部(toracic)外科、血管外科、腫瘍外科、形成外科、眼科外科、整形外科、外傷外科、頭頚部外科、婦人科および泌尿器科外科、消化器外科、口腔外科、薬物送達、組織工学および歯腔止血。
【０００３】
現在まで上市されている承認されたトロンビン含有製品中のトロンビンは、ヒトまたはウシいずれかの血漿由来である。血漿由来タンパク質の使用は、入手量の限界、ならびにウイルスやプリオンの伝播の危険性および自己抗体形成の誘因となる危険性(ウシ製品)のような安全性懸念などの欠点を持つ。ウシトロンビン暴露による抗体形成が顕著な出血障害に至る症例が知られている。
【０００４】
インビボでトロンビンは血液凝固カスケードを介するプロトロンビンの活性化により得られる。血液凝固カスケードを介する活性化は、ガンマ−カルボキシグルタメートに変換される、８−１０個のグルタミン残基を含む機能的ＧＬＡドメインの存在による。インビトロで、不完全ガンマ−カルボキシル化プロトロンビンを、エカリンのようなプロトロンビンアクティベーターの使用によりまたトロンビンに変換できる。ケニアの毒ヘビEchis carinatus由来のヘビ毒であるエカリンは凝血原であり、ヒトプロトロンビンをＡｒｇ３２０−Ｉｌｅ３２１残基間で開裂してメイゾトロンビンを製造するプロテアーゼである。さらなる自己触媒的処理がメイゾトロンビンｄｅｓＦ１、続いてトロンビンの成熟活性形であるアルファ−トロンビンの形成に至る。
【０００５】
理想的な商業的トロンビン製造方法は、動物由来成分の添加無しに高い生産性で製造される組み換えトロンビン前駆体および組み換えプロテアーゼを使用することであろう。さらなる要請は、安定した生産性、容易性および低コストであろう。
【０００６】
効率的組み換えヒトトロンビン(ｒｈ−トロンビン)に対する大きな障壁は、プロトロンビンを高収率で得ることである。多大なる労力が費やされているが、生物製剤の製造に適する条件下で高収率でプロトロンビンを得ることは長い間挑戦課題のままである。Yonemura et al. (J Biochem 135:577-582, 2004)は、組み換えエカリンで消化させた、組み換えＧＬＡドメイン貧化(less)プレトロンビンを使用して組み換えヒトトロンビンを製造している。製造規模でのプレトロンビンの生産性は１５０−２００mg／Ｌであり、これは商業規模製造のためには中程度の生産性である。エカリンの組み換え製造もＷＯ０１／０４１４６に記載されている。その公報において、ｒｈ−トロンビンの製造は、ＣＯＳ細胞中で製造された組み換えプロトロンビンの、ＣＨＯ細胞から製造された組み換えエカリンによる変換により例示されている。しかしながら、この例示された方法は大規模製造に適さず、そして動物由来成分を使用する。
【０００７】
組み換えエカリンは活性化されることが必要なプレプロタンパク質として製造される。ｒ−エカリンを効率的に活性化するための課題は両方の刊行物に記載され、示唆される活性化方法は最適とはほど遠い。
【０００８】
それ故、組み換えヒトトロンビンを得る改善された方法が必要である。ガンマ−カルボキシル化ヒトプロトロンビンの生産性を上げるための我々の努力の間に、我々は驚くべきことに、ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ(ＧＧＣＸ)との共発現が、不完全カルボキシル化プロトロンビンの生産性もまた大きく改善することを発見した(ＷＯ２００５０３８０１９を参照)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＷＯ２００５０３８０１９に記載されたような発現方法により得た組み換えプロトロンビンから、ヒトトロンビンを効率的に製造する方法を記載する。組み換えエカリンと組み合わせた組み換えカルボキシル化または不完全カルボキシル化プロトロンビンは、これより前に組み換えトロンビンの製造には使用されていない。さらに、組み換えエカリンを活性化する方法は新規である。記載の方法は、動物由来成分の添加無く、大規模でｒｈ−トロンビンを製造するのに適する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明の第一の局面によって、配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法が提供される。
【００１１】
他の局面によって、該方法に従う組み換えトロンビンを、薬学的に許容される担体、媒体および／またはアジュバントと共に含む、医薬組成物が提供される。
【００１２】
他の局面によって、配列番号２に従う組み換えエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列が提供される。
【００１３】
さらなる局面によって、配列番号２に従う組み換えエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターが提供される。
【００１４】
なおさらなる局面によって、配列番号２に従う組み換えエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターを含む細胞株が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＦＩＩ＋ＧＧＣＸ構築物
【図２】エカリン構築物
【図３】トロンビン製造を略述する方法の例
【図４】本発明で使用する組み換えエカリンおよび野生型エカリンのヌクレオチド配列アラインメント
【図５】本発明で使用する組み換えエカリンおよび野生型エカリンのアミノ酸アラインメント
【図６】細胞死中の経時的な組み換えエカリンの活性化を示すグラフ
【図７】経時的な細胞培養中の組み換えエカリンの活性化、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでアッセイ
【図８】ｒｈ−トロンビンのＣＩＥＸ精製由来のクロマトグラム
【図９】ＣＩＥＸ精製により得たフラクションの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明は、一部、適当な制御配列と結合したヒトプロトロンビン(ＦＩＩ)および適当な制御配列と結合したヒトガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ(ＧＧＣＸ)をコードするベクター(図１)での安定なトランスフェクトによりもたらされた細胞株から成る。制御配列は、プロトロンビン発現が、ＧＧＣＸ発現の少なくとも１０倍過剰となるように選択すべきである。宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ.６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、ならびにそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｓである。得られたプロトロンビン製造細胞株を、ガンマ−カルボキシル化を無視して、プロトロンビンの高収率のために最適化された培養条件下で増殖させる。ビタミンＫを増殖培地に添加してもしなくてもよい。
【００１７】
本発明は特定のプロトロンビンまたはガンマ−グルタミルカルボキシラーゼまたは、共発現すべきこれらのタンパク質の一方のタンパク質をコードする配列に限定されないことは認識されよう。さらに、そして特に凝血因子に関して、タンパク質の多くの突然変異型が当分野で開示されている。本発明は、野生型配列に適用されるのと同様に、天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、プロトロンビンおよびガンマ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の突然変異型に等しく適用される。一つの態様において、本発明は、全ての野生型タンパク質またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％配列同一性を有するタンパク質で行うことができる。他の態様において、表１に記載する配列を使用できる。
【００１８】
【表１】
【００１９】
これらのタンパク質いずれも、その核酸およびアミノ酸配列を含み、既知である。表２は、本発明において使用できる種々のタンパク質の野生型および突然変異型の代表的配列を同定する。
【００２０】
本明細書で使用する用語“ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ”または“ＧＧＣＸ”は、グルタミン酸残基のカルボキシル化を触媒するビタミンＫ依存性酵素を意味する。
【００２１】
ＧＧＣＸ酵素は広く分布し、シロイルカ(Delphinapterus leucas)、ガマアンコウ(Opsanus tau)、鶏(Gallus gallus)、メクラウナギ(Myxine glutinosa)、カブトガニ(Limulus polyphemus)、およびイモガイ(Conus textile)のような多様な生物種からクローン化されている(Begley et al., 2000, ibid;Bandyopadhyay et al. 2002, ibid)。イモガイからのカルボキシラーゼはウシカルボキシラーゼに類似し、ＣＯＳ細胞で発現されている(Czerwiec et al. 2002, ibid)。ＧＧＣＸに類似するさらなるタンパク質を、昆虫および原核生物、例えばガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)およびレプトスピラ属(Leptospira)において見ることができ、それぞれＮＣＢＩ受託番号：gi 31217234、gi 21298685、gi 24216281およびgi 24197548(Bandyopadhyay et al., 2002, ibid)である。カルボキシラーゼ酵素は、顕著な進化的保存を示す。非ヒト酵素の数種が、我々が使用しているヒトＧＧＣＸと類似の活性を示し、または示すことが予測でき、それ故、ヒト酵素の代替として使用してよい。
【００２２】
表２は、本発明に使用できるヒトＧＧＸＣに相当な推定タンパク質の代表的配列を同定する(起源の生物種に従い分類)。
【表２】
【表３】
【００２３】
上記ＧＧＣＸタンパク質および他の生物種由来のＧＧＣＸタンパク質の各々を、本発明におけるカルボキシラーゼ酵素として使用できる。
【００２４】
本発明の第二部分は、エカリンおよび関連制御要素をコードするポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトした細胞株である(図２)。エカリンコード配列は、哺乳動物細胞における発現に関して最適化してよいが、かかる配列に限定されない。本発明の一つの態様において、配列番号２に従う配列またはその相同体を使用してエカリンを発現する。エカリンをコードする配列番号２の相同体は、配列番号２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有し得る。宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ.６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、およびそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｓである。
【００２５】
一つの態様において、プロトロンビンおよびエカリンは、同一親細胞株に由来する細胞から製造する。この細胞株起源は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)(その派生物を含む)およびＮＳ０(骨髄腫ＢＡＬＢ／ｃマウス)(その派生物を含む)であってよく、そしてこれらに限定されない。同じ細胞株バックグラウンドを使用する目的は、トロンビン産物の精製および純度の評価を容易にするためである。
【００２６】
他の態様において、エカリンおよびプロトロンビンを異なる宿主細胞株；すなわち各々ＣＨＯおよびＮＳ０から製造する。
【００２７】
本発明の一つの局面において、組み換えエカリンの使用が、これが、トロンビン製造工程中および最終トロンビン産物における非トロンビン産物由来成分の検出を容易にするために、好ましい。第二の局面において、組み換えエカリンが、ヘビ毒由来のエカリンに存在し得るアレルゲン性または毒性成分への暴露の危険性を減らすために、好ましい。第三の局面において、ヘビ毒からのエカリンは、エカリン調製物のバッチ間変化および限られたバッチサイズのために好ましくない。
【００２８】
粗プロトロンビンおよび粗エカリンを混合し、実施例３に記載のようなトロンビン形成を可能にする条件下でインキュベートする。次いで、製造されたトロンビンを実施例４に記載の方法、または当業者に既知の他の方法により精製する。あるいは、プロトロンビンおよび／またはエカリンを、最初に当分野で既知の方法により精製し、続いて混合してトロンビンを得ることができる。次いで、トロンビンを非産物成分から精製する。
適当なトロンビン製造方法の例を図３に概説する。
【００２９】
配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用する、組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法が提供される。組み換えエカリンは、ＣＨＯ−Ｓ細胞中配列番号２のヌクレオチド配列またはその相同体を含む遺伝子を含む細胞で発現され、かつ分泌され得るが、この場合のエカリンは、野生型エカリンと同じアミノ酸配列を有する。
【００３０】
上記方法において、組み換えプロトロンビンを組み換えエカリンに付し、その組み換えエカリンは、ＣＨＯ−Ｓ細胞による細胞外発現後活性形で単離でき、該細胞を、該エカリンの活性化に十分な時間アポトーシス／壊死を起こさせ、そうしてヒト組み換えトロンビンを単離する。
【００３１】
組み換えプロトロンビンは、配列番号１の配列またはその相同体を含むヌクレオチド配列を有するプロトロンビン発現遺伝子を含む細胞株により製造できる。プロトロンビンをコードする配列番号１の相同体は、配列番号１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有し得る。組み換えプロトロンビンは、完全カルボキシル化プロトロンビンと不完全カルボキシル化プロトロンビンの混合物であり得る。一つの態様において、組み換えプロトロンビンは完全カルボキシル化プロトロンビンであり、そして他の態様において、組み換えプロトロンビンは不完全カルボキシル化プロトロンビンである。
【００３２】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法により得られる組み換えトロンビンに関する。本発明の方法により得られる組み換えトロンビンを薬学的に許容される担体、媒体および／またはアジュバントと共に含む医薬組成物を設計できる。本医薬組成物は、適用可能な形態であり得る。
【００３３】
一つの態様において、記載の方法により製造したトロンビンを、他のタンパク質、すなわち組み換え細胞、トランスジェニック動物またはヒト血漿由来のフィブリンと組み合わせて組織シーラント(“接着剤”)の製造に使用できる。他の態様において、記載の方法により製造したトロンビンを、一活性成分としてまたは非タンパク質マトリックスと組み合わせて凍結乾燥した独立型製品として、または、一活性成分としてまたは他の活性成分と組み合わせた溶液として使用できる。
【００３４】
適当な混ぜ入れられる成分は、コラーゲン、キチン、分解性ポリマー、セルロース、組み換え凝血因子および、トランスジェニックまたは組み換え源からのフィブリノーゲンであろうが、これらに限定されない。
【００３５】
組織シーラント(“接着剤”)の可能性のある領域は非常に多い；皮膚移植、神経系外科、心臓外科、胸部外科、血管外科、腫瘍外科、形成外科、眼科外科、整形外科、外傷外科、頭頚部外科、婦人科および泌尿器科外科、消化器外科、口腔外科、薬物送達、組織工学および歯腔止血。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、治療的有効量の本発明の方法を使用して得られる組み換えヒトトロンビンを患者に投与することにより、凝血を誘発する方法に関する。
【００３７】
本発明の他の局面は、配列番号２または組み換えエカリンをコードするその相同体に従う単離ＤＮＡ配列である。エカリンをコードする配列番号２の相同体は、配列番号２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。配列番号２は、最適発現のために最適化されている設計された配列である。本配列は、哺乳動物細胞系での発現に特に適する。
【００３８】
さらなる局面によって、配列番号２またはその相同体を含むベクターが提供される。該ベクターは配列番号２またはその相同体を過剰発現し、そして、配列番号２またはその相同体によりコードされるエカリンの発現を可能にする発現制御配列に操作可能に結合するように設計できる。第三の局面によって、配列番号２またはその相同体によりコードされるエカリンを発現できる、該ベクターを含む宿主細胞が提供される。この宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ.６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、およびそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｓである。
【００３９】
本発明の他の態様に従って、配列番号２またはその相同体によりコードされるアミノ酸配列を含み、そして実施例２に記載の方法により得る、ポリペプチドが提供される。
【００４０】
２個の配列間の配列同一性は、BestFit、PILEUP、GapまたはFrameAlignのようなプログラムを使用する、対方式(pair-wise)コンピューターアラインメント分析により決定できる。好ましいアラインメントツールはBestFitである。実施に際し、配列データベース内で、クエリー配列に対する類似／同一配列を検索する時、適当なアルゴリズム、例えばBlast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA、またはFasta3およびスコアリングマトリックス、例えばBlosum 62を使用した類似配列の最初の同定を実施することが一般に必要である。かかるアルゴリズムは、Smith-Watermanの“ゴールド・スタンダード”アラインメントアルゴリズムに厳密に近づける努力をする。それ故、類似性、すなわち、いかに２種の一次ポリペプチド配列が整列するかの評価に使用するための好ましいソフトウエア／検索エンジンは、Smith-Watermanである。同一性は直接の適合を意味し、類似性は保存的置換が可能である。
【００４１】
実験の部
本発明をさらに以下の実施例の手段により記載し、それは添付の特許請求の範囲の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００４２】
実施例１
ＣＨＯ細胞における組み換えヒトプロトロンビンの高収率製造
図１に示す、配列番号１のヌクレオチド配列を有する構築物ＰＮ３２を含むＰ１Ｅ２細胞株を、トロンビン製造に使用するためのプロトロンビンを製造するために、タンパク質および動物成分を含まない増殖培地を使用して、ＷＯ２００５０３８０１９に記載の方法に従い醗酵機中で増殖させた。細胞培養バッチ法または灌流培養法(表１)のいずれかで増殖させ、製造されたプロトロンビンの量をエカリンアッセイにより測定した。このエカリンアッセイは、本質的にChromogenixアッセイ(Moelndal, Sweden)の通りに、標準として精製血漿由来ヒトプロトロンビン(Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA)を使用して行った。
【００４３】
【表４】
醗酵機実験は、バッチ培養法および灌流培養法の両方が、組み換えトロンビンの製造に適するプロトロンビンの製造に使用できることを示した(表１)。これらの醗酵機実験により得られた完全カルボキシル化プロトロンビンの割合は約５５−８７％であり、残りは不完全カルボキシル化プロトロンビンであった。
【００４４】
実施例２
ＣＨＯ細胞における組み換えエカリンの製造
哺乳動物細胞における発現のために最適化した配列番号２のヌクレオチド配列を有するエカリンコード配列を合成し、InvitrogenベクターｐＣＤＮＡ ３．１＋にクローン化した(図２)。本発明で使用する組み換えエカリンのヌクレオチド配列と野生型エカリンの配列(ＧＩ：７１７０９０)のアラインメントを図４に示す。図５から明らかな通り、この組み換えエカリンは、野生型エカリンのアミノ酸配列と１００％相同である。ＡＺエカリン(配列番号３)であるこの構築物を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen)を安定にトランスフェクトした。エカリンは宿主細胞により細胞外空間に分泌され、エカリン製造クローンについてスクリーニングするために、培養上清サンプルを採り、アッセイ緩衝液(０.１％ＢＳＡ含有５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４)中、組み換えヒトプロトロンビン(ｒｈＦＩＩ)と最終濃度１mg ｒｈＦＩＩ／Ｌまで混合した。この混合物を２０−４０分間、３７℃でインキュベートした。サンプル中に存在するエカリンの作用により製造されたトロンビンを、次いで、色素生産性トロンビン基質Ｓ−２２３８(Chromogenix, Moelndal)の１−２mM溶液の添加により検出した。発色をモニターし、適当なときに２０％酢酸を使用して停止させた。製造された組み換えエカリンの活性を概算するために、活性が証明されているヘビ毒由来エカリンをSigmaから購入し、標準として仕様した。得られた最良の製造細胞株は、動物成分を含まない培地で増殖させて、実験室規模シェーカー培養の培養液１リットル当たり最大７０００Ｕエカリンを製造した。
【００４５】
組み換えエカリンの活性化
上記方法は組み換えエカリンをプロタンパク質として製造した。それ故、最適活性のためにプロ部分の除去による活性化が必要である。驚くべきことに、我々は、活性化が、エカリン製造細胞の死亡後、培養物のインキュベーションを少なくとも７日間継続することにより最も好都合に得られることを発見した(図６)。使用した培養培地は、ＨＴサプリメント、非必須アミノ酸およびGlutamax Iを補ったＣＤ−ＣＨＯ(ＣＨＯ−Ｓに関してInvitrogenが推奨する通り)であり、増殖条件は、３７℃で、５％二酸化炭素含有雰囲気下のシェーカーボトルであった。培養サンプルを、上記の通り活性についてアッセイした。図６から明らかな通り、組み換えエカリンの活性はこの期間に増加した。
【００４６】
培養上清からのサンプルをまたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜にブロットした。膜の標識を、大腸菌中に封入体として発現されるエカリンの成熟部分に対するポリクローナルウサギ血清で行った。“Ｍ”は分子量マーカーを意味し、数字はサンプル回収日を意味する。図７から明らかな通り、本組み換えエカリンは細胞死後１週間を超えて安定なままである。エカリンの活性化をまた低温で、例えば室温ほど低い温度で行ってよいが、そうすれば活性化により長い時間が必要である。エカリンは、死亡した宿主細胞の存在下で室温で数ヶ月間安定なままである。活性は、それが安定するまで徐々に増加する。細菌感染があるか高温下以外で、活性の減少は観察されていない。エカリンの活性化のためにトリプシンの使用を試みたが、失敗した。
【００４７】
実施例３
エカリンによるプロトロンビンからトロンビンへの変換
エカリンプロテアーゼは、プロトロンビンを、トロンビン触媒活性を有するトロンビンの中間体形態であるメイゾトロンビンに変換する。トロンビンへのさらなる処理が、自己触媒により達成される。プロトロンビンからトロンビンへの変換に必要なエカリン培養の量を概算するために、我々は一連の試験消化を行った。種々の量の実施例２で得たエカリン含有培養上清を、ＰＢＳ緩衝液(Cambrex)中１mg／mlプロトロンビン(実施例１の通りに得た)とイオン号した。混合物のインキュベーションを３７℃で１−３時間行った。次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、プロトロンビンからトロンビンへの完全な変換に必要な組み換えエカリンの量を同定した。この方法により、我々は、組み換えエカリンが非常に強力であることを発見した；７０００Ｕ／Ｌで１リットルのエカリン培養上清が、３７℃で３時間以内に６４グラムのプロトロンビンをトロンビンに変換することができた。通常組み換えにより製造したプロトロンビンは完全カルボキシル化プロトロンビンを不完全カルボキシル化プロトロンビンから分離するために精製しなければならない。しかしながら、本組み換えエカリンが完全カルボキシル化および不完全カルボキシル化プロトロンビンの両方を効率的に活性化できるため、本発明ではこれは必要ない。
【００４８】
実施例４
トロンビンの精製
実施例３に記載の方法により得たトロンビンを、AEKTA-FPLC(GE Healthcare)および２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５で平衡化したＳＰ−セファロースＨＰカラム(GE Healthcare)を使用するカチオン交換クロマトグラフィー(ＣＩＥＸ)により精製した。実施例３の通りに製造したエカリン消化プロトロンビンをｐＨ６.２および約８mS／cmの伝導性に調節した。トロンビンを、カラム平衡緩衝液中、２０カラム容積にわたる１Ｍ塩化ナトリウム勾配で溶出した(図８)。選択フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した(図９)。トロンビン活性を色素生産性トロンビン基質Ｓ−２２３８とのインキュベーションにより確認した(Chromogenix, Moelndal)。
【００４９】
実施例５
得られたｒｈ−トロンビンの分析
得られたトロンビンをさらに分析するために、色素生産性トロンビン基質Ｓ−２３６６(Chromogenix)を使用して動的パラメータを測定した。活性をヒルジンでの力価測定により概算した。全パラメータについてｒｈ−トロンビンは次の通りであった；Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA)からの血漿由来ヒトα−トロンビンに類似する活性、ＫｋａｔおよびＶｍａｘ。
精製トロンビンをまたＮ末端配列決定に付した：還元トロンビン重および軽ポリペプチド鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Immobilon P膜(Millipor)にブロットした。摘出したバンドをEdman分解法により配列決定した。予想通り重鎖Ｎ末端の最初の５個のアミノ酸はＩＶＥＧＳであると確認され、軽鎖の５個のＮ末端アミノ酸はＴＦＧＳであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法。
【請求項２】
組み換えエカリンがＣＨＯ−Ｓ細胞中の配列番号２のヌクレオチド配列またはその相同体を含む遺伝子を含む細胞によって発現され、かつ分泌され、該エカリンが、野生型エカリンと同じアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組み換えプロトロンビンを組み換えエカリンに付し、その組み換えエカリンは、ＣＨＯ−Ｓ細胞による細胞外発現後活性形で単離され、該細胞を、該エカリンの活性化に十分な時間アポトーシス／壊死を起こさせ、そうして組み換えヒトトロンビンを単離する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組み換えプロトロンビンが配列番号１の配列を含むヌクレオチド配列を有するプロトロンビン発現遺伝子を含む細胞株により製造される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
組み換えプロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンと不完全カルボキシル化プロトロンビンの混合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
組み換えプロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
組み換えプロトロンビンが不完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の方法により得られる組み換えトロンビン。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換えトロンビンを薬学的に許容される担体、媒体および／またはアジュバントと共に含む、医薬組成物。
【請求項１０】
適用可能な形態である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号２によるエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項１２】
相同体が配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１１に記載の単離ＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の単離ＤＮＡ配列を含む、ベクター。
【請求項１４】
配列番号２によりコードされるアミノ酸配列またはその相同体。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１】
配列番号２の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法。
【請求項２】
組み換えエカリンがＣＨＯ−Ｓ細胞中の配列番号２のヌクレオチド配列またはその相同体を含む遺伝子を含む細胞によって発現され、かつ分泌され、該エカリンが、野生型エカリンと同じアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組み換えプロトロンビンを組み換えエカリンに付し、その組み換えエカリンは、ＣＨＯ−Ｓ細胞による細胞外発現後活性形で単離され、該細胞を、該エカリンの活性化に十分な時間アポトーシス／壊死を起こさせ、そうして組み換えヒトトロンビンを単離する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組み換えプロトロンビンが配列番号１の配列を含むヌクレオチド配列を有するプロトロンビン発現遺伝子を含む細胞株により製造される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
組み換えプロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンと不完全カルボキシル化プロトロンビンの混合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
組み換えプロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
組み換えプロトロンビンが不完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の方法により得られる組み換えトロンビン。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換えトロンビンを薬学的に許容される担体、媒体および／またはアジュバントと共に含む、医薬組成物。
【請求項１０】
適用可能な形態である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号２によるエカリンまたは配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するその相同体をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項１２】
相同体が配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１１に記載の単離ＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の単離ＤＮＡ配列を含む、ベクター。
【請求項１４】
配列番号２によりコードされるアミノ酸配列またはその相同体。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図８】
【図７】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図８】
【図７】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５３２６６１（Ｐ２０１０−５３２６６１Ａ）
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４７０２（Ｐ２０１０−５１４７０２）
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０８３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００８８２１
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（３９１００８９５１）アストラゼネカ・アクチエボラーグ (625)
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０８３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００８８２１
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（３９１００８９５１）アストラゼネカ・アクチエボラーグ (625)
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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