組換えヒトエリスロポイエチンを発現する宿主細胞
【課題】組換えヒトＥＰＯを生産する組換え宿主細胞を提供する。
【解決手段】ヒトゲノムＤＮＡから得られたヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）をコードする遺伝子をコードするベクターを含む宿主細胞。使用された遺伝子は、ｉ第一の翻訳されたＡＴＧの５’およびｉｉＥＰＯ遺伝子の停止コドンの領域からの配列を含まない。この遺伝子は、ただ１つの発現制御エレメントとしてＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターおよびそのポリアデニル化シグナルを有する真核生物細胞のための発現プラスミドにクローン化された。使用された遺伝的構築物を用いたトランスフェクションから生じた組換え細胞は、一日当たりの１リットルの培養培地当たり５０ｍｇの組換えＥＰＯの予想外に高レベルなタンパク質を発現する。
【解決手段】ヒトゲノムＤＮＡから得られたヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）をコードする遺伝子をコードするベクターを含む宿主細胞。使用された遺伝子は、ｉ第一の翻訳されたＡＴＧの５’およびｉｉＥＰＯ遺伝子の停止コドンの領域からの配列を含まない。この遺伝子は、ただ１つの発現制御エレメントとしてＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターおよびそのポリアデニル化シグナルを有する真核生物細胞のための発現プラスミドにクローン化された。使用された遺伝的構築物を用いたトランスフェクションから生じた組換え細胞は、一日当たりの１リットルの培養培地当たり５０ｍｇの組換えＥＰＯの予想外に高レベルなタンパク質を発現する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、宿主細胞、および組換えヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）コードするヌクレオチド配列を含むベクターに関連する。特に、発現ベクターは、ＥＰＯの発現を制御するプロモーターを１つのみ含む。本発明はまた、ＥＰＯを産生する方法およびそれにしたがって産生されたＥＰＯに関連する。
【背景技術】
【０００２】
（背景情報）
ＥＰＯは骨髄における赤芽球の分化を刺激する糖タンパク質であり、従って、循環赤血球の数を増加させる。ヒトにおける赤血球の平均寿命は１２０日であり、そのためヒトは毎日１／１２０の赤血球を失う。この損失は、適正なレベルの赤血球を維持するために、連続的に回復させなければならない。
【０００３】
ＥＰＯの存在は、世紀の変わり目で初めて仮定され、それは５０年代初期にＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖによって明確に立証された。Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ）１４３：３８４−３８６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ），１４３：４３２−４３５（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：３４４−３４６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔ、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：４６３−４６５（１９０６）；Ｒｅｉｓｓｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ ５：３７２−３８０（１９５０）およびＥｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，８：３４９−３５７（１９５３）を参照のこと。ＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖの実験は、他の研究者によって即座に確認された。Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ，９：２９９−３０９（１９５４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：２５５−２５８（１９５４）；およびＢｏｒｓｏｏｋら、Ｂｌｏｏｄ，９：７３４−７４２（１９５４）を参照のこと。
【０００４】
生物におけるＥＰＯ産生部位の同定は議論の論点であった。連続的な実験によって、腎臓を主要な器官として、そして管周囲の間細胞を合成部位として同定した。Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１７９：６３３−６３４（１９５７）；Ｋｕｒａｔｏｗｓｋａら、Ｂｌｏｏｄ，１８：５２７−５３４（１９６１）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｃｔａ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２６：２２４−３２（１９６１）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２０５：６１１−６１２（１９６５）；Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１４９：２９２−２９３（１９６８）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１３７：３２７−３３０（１９７１）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌ、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），４７：２３８−２４２（１９７２）；Ｅｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，４４：７７−８５（１９７４）；Ｋａｚａｌ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，５：９８−１０９（１９７５）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，９９：５０４−５１０（１９７６）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２８：１０１−１２２（１９８８）；Ｊｅｌｋｍａｎｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：５８１−５８８（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８０：４００８−４０１１（１９８３）；Ｃａｒｏら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０３：９２２−９３１（１９８４）；Ｃａｒｏら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１２：３５７（１９８４）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７０：３１６−３１８（１９８６）；Ｂｏｎｄｕｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２７３１−２７３３（１９８６）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７１：５２４−５２７（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７１：５２４−５２７（１９８８）；Ｌａｃｏｍｂｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：６２０−６２３（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７４：６４５−６５１（１９８９）を参照のこと。
【０００５】
総ＥＰＯの１０％〜１５％の範囲のより小さな割合は、成体の肝臓で産生される。Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：２２７−２４２（１９７９）；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１５：１２１−１３２（１９８０）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１１：３７−４６（１９８１）；Ｄｉｎｋｅｌａａｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，９：７９６−８０３（１９８１）；Ｃａｒｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４４：５（１９８３）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０２：２７４−２８５（１９８３）；Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１３：４３２−４３８（１９８３）；Ｊａｃｏｂｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８０６−８１０（１９８５）；Ｅｒｓｌｅｖら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３：１５９−１６４（１９８６）を参照のこと。その産生されたＥＰＯは、組織の低酸素およびＥＰＯ産生細胞数の増加によって起こるその発現の程度に正比例する。
【０００６】
ＥＰＯは、貧血、特に腎不全に由来する貧血の処置において卓越した有効性を示した。Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３１６：７３−７８（１９８７）；Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１：１７７−１８１（１９８３）を参照のこと。しかし、大量に産生する方法が利用できないために、その治療的な有用性は制限されてきた。公知の抽出システムによって得られるＥＰＯの量および質は不充分であった。最近、組換えＤＮＡ技術の使用によって大量のタンパク質を得る事が可能となった。これらの技術の真核生物細胞への応用は、大規模なＥＰＯの産生を可能にした。米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）、同第５，５４７，９３３号（Ｌｉｎ）、同第５，７５６，３４９号（Ｌｉｎ）、同第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）、および同第４，６７７，１９５（Ｈｅｗｉｃｋら）を参照のこと。
【０００７】
現在では、組換えＤＮＡ技術は広く公知であり、そして使用されている。これらの技術は、ＤＮＡフラグメントおよび酵素のような遺伝的エレメントの、組換えタンパク質の産生のための遺伝構築物を集合および伝達するための使用を含む。また、組換えＤＮＡ技術は生物学的機構の研究を容易にする。Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ、「Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ＤＮＡ」［Ｓａｍａｉａ Ｇｌａｖｎａｉａ Ｍｏｌｅｋｕｌａ］（Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ Ｌｏｎｇｍａｎ Ｉｎｃ．，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，１９９７）；Ｂｒｏｗｎ、「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９５）；Ｗａｔｓｏｎら、「ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ」，第二版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ａｌｂｅｒｔｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｉｎｎｉｓら編、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９０）；Ｅｈｒｌｉｃｈ編、「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ編、「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，１９８７）；Ｄａｖｉｓら、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ、「Ｔｈｅ Ｄｏｕｂｌｅ Ｈｅｌｉｘ」（Ｐｅｎｇｕｉｎ Ｂｏｏｋｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９）を参照のこと。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本願発明は、ヒトＥＰＯをコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いるそのトランスフェクションの手段により得られた、組換えヒトＥＰＯを生産する真核生物細胞株を含む。このベクターは発現制御エレメントとして固有のプロモーターおよびターミネーターをさらに含む。配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１は、使用された遺伝子によって体系化されたＥＰＯアミノ酸配列を同定する。
【０００９】
本発明は、配列番号１におけるアミノ酸配列、ウィルスプロモーターおよびウィルスターミネーター、からなるエリスロポイエチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、ＥＰＯポリペプチドが発現かつ回収されるこのような条件下で、上記宿主細胞を培養する工程を包含する、ＥＰＯポリペプチドを産生するための方法をさらに提供する。
【００１１】
本発明の利点の１つは、利用されたＥＰＯをコードする遺伝子が５’および３’領域の非コードフラグメントを含まないことである。しかし、本願発明の系は、予想外に大量のＥＰＯを産生する。
【００１２】
本発明のさらなる利点は、高いＥＰＯ生産性を示すただ１つのプロモーターを含む発現ベクターの使用である。本願発明の方法を利用することにより、一日当たりの１リットルの細胞培養物当たり５０ｍｇより多くのＥＰＯを得ることが可能であり、すなわち、従来報告された１つのプロモーターを利用する最良の方法よりも、本願発明のＥＰＯ産生レベルは５倍を超える。
【００１３】
本発明において請求されたＥＰＯをコードする遺伝子と、単純なプロモーターとの組み合わせは、驚くべきことに、効果的に動作し、安定なＥＰＯ産生細胞を生じることを示した。遺伝子構築物を操作することはより複雑かつ困難であるが、より適切な理論において使用することが報告されたそれらと匹敵して、またはそれよりもかなり高く、トランスフェクトされた細胞は、大量のＥＰＯを生じた。
【００１４】
本願発明のさらなる利点は、異なる耐性を与える２つのベクターを用いた同時トランスフェクションであり、このように、同時トランスフェクトされたＥＰＯ産生細胞の選択、遺伝的増幅および維持を単純化し、そして促進する。
【００１５】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、以下に記載の方法の精製の後に得られたＥＰＯサンプルの、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を図示する。レーン１、４、および７には、分子量マーカーがロードされた。レーン２、３、５および６には、本願発明の手順に従って得られた、異なる量の純粋なＥＰＯが電気泳動された。得られた生成物の純度および３０ｋＤａを超える見かけの分子量は、はっきりと観測され得るように、尿中のヒトＥＰＯについて報告されたものと同時に起こる。
【図２】図２は、記載された方法に従って得られたＥＰＯサンプルのウエスタンブロット分析を図示する。産生されたＥＰＯの同一性は、ヒトＥＰＯに対するモノクロナール抗体によってそれが認識されたことによって評価された。レーン１および２には、それぞれ標準ヒトＥＰＯおよび分子量マーカーがロードされた。本願発明の方法に従って得られたＥＰＯサンプルは、レーン３〜５にロードされた。
【図３】図３は、記載された方法に従って得られた純粋なＥＰＯサンプルおよび、さらにグリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で処理した純粋なＥＰＯサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分子量マーカーがレーン１、４および８にロードされた。レーン２および７は未処理ＥＰＯに対応する。レーン３には、Ｏ−グリカナーゼ処理されたＥＰＯがロードされ；Ｏ−グリコシル化部位の存在が検証された。レーン５には、部分的にＮ−グリカナーゼで消化されたＥＰＯがロードされた。ＥＰＯと予想された分子量を有する３つのＮ−グリコシル化された分子の存在が検証され得る。レーン６には、Ｎーグリカナーゼで消化されたＥＰＯがロードされ、そして全てが脱グリコシル化されたタンパク質と予想される分子量が観察された。
【図４】図４は、記載された方法に従って産生された純粋なＥＰＯサンプルにおける等電点の調査を図示する。ＥＰＯサンプルはレーン２、３および４で、等電点マーカーはレーン１および５で電気泳動された。ＥＰＯに対応するイソ型の存在が検証され、３．０から４．５の範囲の等電点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
組換えＤＮＡ技術の生物学的基礎は、以下のように要約され得る。
【００１８】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、全ての生細胞およびいくつかのウィルスの遺伝物質である。４つの異なるヌクレオチドのポリマー鎖が、ＤＮＡを形成し、それらの各々はデオキシリボース（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）に結合したプリン、またはピリミジンである。糖部分が、その後リン酸基に結合される。これら４つのヌクレオチドは、以下である：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）。
【００１９】
ＤＮＡ鎖は、ヌクレオチド間のホスホトリエステル結合により形成され、ここで１つのヌクレオチドのデオキシリボースの５’位のリン酸塩は、前のヌクレオチドのデオキシリボースの３’位に結合される。インビボでの合成は、５’から３’に生じ、これはＤＮＡ配列を記載するために採用される従来の方向である。
【００２０】
機能的ＤＮＡは、相補的な塩基の二重らせんとして存在し、ここで鎖は、一方の鎖のＡおよびＣと、相補鎖のＴおよびＧとの、それぞれの間で形成される水素結合により共に保持される。これが、それらが「塩基対」といわれる理由である。
【００２１】
この鎖はまた逆平行でもあり、それは下記のように、各螺旋の５’末端が、他方の３’末端に一致する：
５’−ＴＡＣＧＴＡＣ−３’
３’−ＡＴＧＣＡＴＣ−５’
タンパク質合成が生じるために特定のＤＮＡコード領域が、最初にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される。このｍＲＮＡは、その後、タンパク質に翻訳される。各ＤＮＡコード領域は、遺伝子と呼ばれる。
【００２２】
ＲＮＡ（リボ核酸）鎖の合成は、ＲＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素による特定の遺伝子領域の転写を含む。従って、ＤＮＡテンプレートに相補的な逆平行ＲＮＡ鎖が得られる。ＤＮＡの各ＡはＲＮＡのＵに、各ＣはＧに、各ＧはＣに、および各ＴはＡに対応する。ＲＮＡ分子はまた、ＤＮＡより安定でないという理由で特徴づけられる。さらに、ＤＮＡにあるようなデオキシリボースに代わり、ＲＮＡの糖部分はリボースである。ＲＮＡはさらに、チミン（Ｔ）に代わるウラシル（Ｕ）の置換によってＤＮＡと区別される。
【００２３】
基質ＤＮＡ ５’−−−ＡＣＧＴＡＧ−−−３’
合成されたＲＮＡ ３’−−−ＵＧＣＡＵＧ−−−５’
真核生物細胞において、合成されたｍＲＮＡは、核内でプロセシング（スプライシング）され成熟ｍＲＮＡを生じる。細菌において、このプロセシングは確認されない。
【００２４】
次いで、成熟ｍＲＮＡは、タンパク質に翻訳されるために基質として利用され、このプロセスにおいて、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ、アミノ酸を運び、そしてそれらを特異的に整列し、タンパク質を形成する短いＲＮＡ鎖）およびリボソームが主な関与物である。３つのｍＲＮＡ塩基（トリプレットまたはコドン）は各アミノ酸をコードする。例えば、ｍＲＮＡのＡＵＧ配列は、アミノ酸メチオニンをコードする。従って、ｍＲＮＡ鎖は、特定のペプチド配列に翻訳され、このペプチド配列は最終的に活性なタンパク質に折りたたまれる。タンパク質合成は、「発現」と呼ばれる。
【００２５】
発現されたタンパク質の量は、因子の間でもとりわけ、プロモーターと呼ばれる特定のＤＮＡ領域の存在に依存し、プロモーターは発現プロセスが生じる割合に影響する。さらに、転写の終結を示すＤＮＡ配列（ターミネーター）、および翻訳の終止を示すコドン（停止コドン）が存在する。
【００２６】
ＤＮＡ技術は、天然または合成のいずれかのＤＮＡフラグメントの単離、および細胞（すなわち、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞）にＥＰＯのような異種タンパク質の生成を可能にさせるための、ＤＮＡフラグメントの細胞への挿入を含む。組換えＤＮＡ技術により得られるタンパク質は、組換えタンパク質と呼ばれる。
【００２７】
組換えＤＮＡ技術の適用分野は、培養細胞に限定されない。なぜなら遺伝子は多細胞生物（すなわち植物、昆虫、哺乳動物および魚類）にもまた、取り込まれ得るからである。
【００２８】
異種タンパク質の発現は、以下のエレメントを要求する：
・所望のタンパク質をコードする遺伝子。その遺伝子は以下のような異なる技術を使用して得られ得る；
・ゲノムＤＮＡライブラリーからの単離。
・ＤＮＡ鎖のインビトロ合成。比較的短いＤＮＡ鎖を合成する市販の装置は存在し、これはインビトロでの遺伝子合成を可能にする。
・増幅。遺伝子のようなＤＮＡフラグメントを数倍に複製することを可能にする技術。
・その他、すなわち、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡライブラリーより得られるようなもの。
・目的の細胞においてタンパク質を発現するための活性なプロモーター・転写が正確に終結されるような適切なターミネーター・ベクター。プロモーターおよびターミネーターを有する遺伝子を、染色体中または染色体外のいずれかにこの遺伝子を取り込む目的の細胞の内側領域へ、指向するプラスミドまたはウィルスのような遺伝子構造物。特定の場合において、この取り込まれた遺伝子は、細胞内に無限大に残存し得、そしてその子孫に伝達され得るか、または比較的短期間で消失され得る。プラスミドおよび天然ウィルスまたは改変されたウィルスのような多数のベクター系がある。細胞または核への微量注入のようなＤＮＡ導入の物理的手段を使用することもまた可能である。ウィルスおよびプラスミドは天然より得られ、そして所望する特性を達成するようにインビトロで遺伝子改変される。
・その他。さらに、他の遺伝エレメントが、遺伝子を受け取る細胞の選択を改善するために（すなわち、抗生物質に対する耐性を与える別の遺伝子）、または各細胞における遺伝子のコピー数を増幅（遺伝子増幅）するために必要であり得る。
【００２９】
ベクターおよび遺伝子は、その系の発生のために必要な時間を減少するために可能な限り単純であるべきである。基礎的な考察では、遺伝子の単純性は、生成されるタンパク質産物の生産性または質を軽視すべきでない。
【００３０】
目的のタンパク質の発現を達成するために、適切な対応する遺伝子が、適切なベクターによって宿主細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクトは、利用可能な他の技術の中でもエレクトロポレーション、リン酸カルシウムでの沈殿、およびリポソームの使用のような、異なる技術によってなされ得る。
【００３１】
目的の遺伝子は、例えば、抗生物質（例えば、ジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））に対する、または毒物（例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ））に対する耐性を付与することが既知の他の遺伝子に結合し得る。すなわち、この結合は、安定な様式によりトランスフェクトされた細胞の選択を可能にし、選択された細胞は、目的の遺伝子を子孫へ複製および伝達することが可能である。結合はまた、目的のタンパク質の最も高い発現レベルを示している組換え細胞を選択することを可能にする。
【００３２】
このようにして得られた組換え産物は、他にも適用可能なアッセイはあるが、その分子量、アミノ酸配列および生物学的活性により同定される。
【００３３】
組換えＤＮＡ工学を生み出した、この手段（すなわち、制限酵素）および技術は、７０年代初期に最初に発達し、そして後に、強烈および広範に利用された。さらに詳細には、ＥＰＯ産生のためにここで利用したこの遺伝子工学技術は以下を含む。
１．非コード領域のフラグメントを含むＥＰＯ遺伝子の使用は、最初の翻訳ＡＴＧの５’およびこの遺伝子の終止コドンの３’に位置している。この遺伝子の非コード領域中に位置している発現制御エレメントの存在は、ＥＰＯの高産生を達成するために必要であると従来考えられている。米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）を参照のこと。
２．異種プロモーターを有する発現ベクターの使用は、プロモーターの組み合わせがより高いＥＰＯ産生を誘導するという仮定に基づいた。現在まで、ベクターに含まれる１つのみのプロモーターの使用は、低いレベルのタンパク質の発現を生じてきた。米国特許第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）、米国特許第４，６７７，１９５号（Ｈｅｗｉｃｋら）、および米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）を参照のこと。１つのみのプロモーターを使用するＥＰＯの平均的な産生は、２００μｇ／ｌ／日である。１つのみのプロモーターを使用して報告されたＥＰＯの最大の産生は、１０ｍｇ／ｌ／日である。
３．遺伝子系の潜在的な不安定性は、利用した遺伝子の構築物の複雑性に起因する。
【００３４】
特許請求の範囲に記載されているＥＰＯ産生細胞を得るために、まずゲノムＤＮＡをヒト白血球から抽出する。ＥＰＯコード遺伝子は、単離したゲノムＤＮＡから得られる。これを達成するために、この遺伝子は、ＥＰＯ遺伝子の５’および３’非コード領域の存在を妨げるために適切なプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、さらにクローニングを容易にするために単離した遺伝子の両方の末端に残存する、プライマーの５’末端に制限部位を含む。
【００３５】
次に、増幅した遺伝子は、細菌のベクターにクローン化し、そして配列決定される。一旦、得られた配列が確認されれば、この遺伝子をＳＶ４０初期プロモーターおよびそれのターミネーターのみを保持している真核生物細胞のための発現ベクターのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローン化した。このベクターは、ジェネチシンおよびアンピシリンに対する耐性を付与する。
【００３６】
ＣＨＯ細胞は、その後２つのベクターで同時トランスフェクトされる：１）このＥＰＯ発現ベクターおよび２）メトトレキサートに対する耐性を付与するベクター。安定にトランスフェクトされたＥＰＯ産生細胞は、ジェネチシンに対するそれらの耐性により選択される。ＥＰＯ発現のレベルは、メトトレキサートの増加する濃度に耐性である増幅した細胞の選択によりモニターされる。
【００３７】
最後に、クローンは、ラジオイムノアッセイにより測定したそれらの産生レベルにより選択される。最も産生力を有するクローンの培養上清を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、グリカナーゼ処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法および完全なタンパク質配列分析により産生したＥＰＯの同一性を試験する。産生したＥＰＯのインビボでの生物学的活性は、ＥＰＯ基準のための国際基準を参照して、ｅｘ−ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃマウスアッセイにより決定される。
【００３８】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、ヌクレオチド配列コードＥＰＯを含むベクター、組換えベクターで遺伝的に加工された宿主細胞、および組換え技術によるＥＰＯポリペプチドまたはその一部分の産生に関する。
【００３９】
組換え構築物は、周知の技術（例えば、感染、形質導入、トランスフェクション、伝播媒介、接合、エレクトロポレーションおよび形質転換）を使用して宿主細胞へ導入され得る。例えば、このベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得る。
【００４０】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈降物（例えば、リン酸カルシウム沈降物）の状態、または荷電脂質との複合体の状態で導入される。このベクターがウイルスである場合、それは、インビトロで適当なパッケージング細胞株を使用してパッケージされ得、次いで宿主細胞へ形質導入され得る。
【００４１】
目的のポリヌクレオチドにシス作用性制御領域を含むベクターが、好ましい。適当なトランス作用性因子は、宿主への導入の際に宿主によって供給され得るか、補足しているベクターにより供給され得るか、またはベクターそれ自体により供給され得る。
【００４２】
この点に関して、特定の好ましい実施形態において、このベクターは特定の発現のために提供され、この発現は、誘導可能および／または細胞型特異的であり得る。特に、このようなベクターのうち好ましいのは、操作（例えば、温度および栄養添加剤）することが容易である、環境因子により誘導可能なベクターである。
【００４３】
本発明において有用な発現ベクターとしては以下が挙げられる：染色体誘導ベクター、エピソーム誘導ベクター、およびウイルス誘導ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来ベクター、およびそれらの組み合わせ由来ベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。
【００４４】
このＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（例えば、２〜３例を挙げれば、ファージλＰLプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ，ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）へ作動可能に連結されるはずである。他の安定なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始部位、終止部位および転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。この構築物によって発現された成熟転写物のコード部分は、始めに翻訳開始コドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置付けられた終止コドンを含む。
【００４５】
示されたとおり、この発現ベクターは好ましくは、少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。より好ましくは、２つの発現ベクターは全部で２つのマーカーを含む。このようなマーカーは、メトトレキサート、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性を含む。好ましいベクターは、メトトレキサートおよびネオマイシン誘導抗生物質（例えば、ジェネチシン）に対して耐性を付与する。
【００４６】
特に好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＮａｍａｌｗａおよびＨｅＬａを含む哺乳動物細胞である。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。上記宿主細胞について適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【００４７】
本発明の宿主細胞からＥＰＯを得る好ましい方法は、インスリンを含む培地中で培養することである。詳細には、そのような培養は、本発明の宿主細胞から、ＥＰＯおよびインスリンを含む上清を分離し、その上清を濃縮し、そしてその濃縮した産物を凍結することを含む。好ましくは、培養培地は、培養培地１リットル当たり０．５ｍｇと２０ｍｇとの間のインスリンを含む。
【００４８】
とりわけ、好ましい真核生物細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００４９】
特に好ましいベクターは、ｐＤＨＦＲおよびｐＶｅｘ１である。ｐＤＨＦＲベクターは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを含み、そのＤＮＡの発現は、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター、およびそのポリアデニル化シグナルによって制御される。ｐＶｅｘ１−ＥＰＯベクターは、配列番号１のＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ、ネオマイシン誘導体化抗生物質に対する耐性を付与する因子、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよびＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルを含む。
【００５０】
本発明における使用に適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ即時型初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイスルＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター、およびメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）を含む。特に好ましいプロモーターは、ウイルス性ＳＶ４０初期プロモーターである。
【００５１】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。そのような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８６））に記載されている。
【００５２】
宿主細胞に本発明の構築物を導入するための特に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションによる方法である。
【００５３】
高等真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサーを挿入することにより増加し得る。エンハンサーは、通常、１０から３００ｂｐの範囲の大きさのＤＮＡのシス作用エレメントであり、これは、所定の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増加するために作用する。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００〜２７０で複製開始点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００５４】
小胞体の内腔中、細胞膜周辺腔中、または細胞外環境中への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドの中に組込まれ得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るかまたは、このシグナルは異種シグナルであり得る。
【００５５】
このポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能的領域もまた含み得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加され、精製、または引き続く操作および保存のいずれかの間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善し得る。ペプチド部分はまた、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。
【００５６】
ＥＰＯタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。
【００５７】
本発明の細胞によって生成されるＥＰＯを精製するための好ましい方法は、以下の工程の組合わせによってＥＰＯを含む細胞培養上清を処理することを包含する：（ａ）示差的沈殿、（ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー、（ｃ）ダイアフィルトレーション、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｆ）分子排除クロマトグラフィー。好ましくは、これらの工程は以下の順番で行われる：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）。
【００５８】
本発明の細胞により生成されるＥＰＯを使用する好ましい方法は、疾患の処置のために、ヒトに注射するのに適切な形態への凍結乾燥を含む。詳細には、好ましい凍結乾燥手順は、以下を包含する：薬学的組成物中にＥＰＯを置く工程、第１のＥＰＯ組成物を容器中にロードする工程であって、ここでこの容器は−３０℃またはそれ未満の温度である、工程；大気圧下で４時間またはそれより長い時間、このＥＰＯ組成物を−３０℃またはそれ未満の温度でインキュベートする工程；この組成物を、３０絶対ミクロンかまたはそれ未満の圧力で、一時間かそれより長い時間インキュベートする工程；および、圧力値を５絶対ミクロンかそれ未満に保ちつつ、少なくとも２５℃に達するまで、一時間当たり３℃かそれ未満の温度を上昇させる工程。
【００５９】
凍結乾燥のために好ましい薬学的組成物は、ＥＰＯ、糖、塩およびヒトアルブミンを含む。凍結乾燥のために特に好ましい組成物は、ＥＰＯ、マンニトール、ＮａＣｌ、ＮａＨ2ＰＯ4およびＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを含む。
【００６０】
（核酸分子）
本発明の宿主細胞は、Ｌｉｎ，「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓ」、米国特許第４，７０３，００８号（本明細書中に参考として援用される）からのＥＰＯ核酸分子、およびその改変体を含むベクターを含み得る。改変体は、天然の対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、いくつかの改変形態の１つを意図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ、編。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて産生され得る。
【００６１】
このような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって産生されるものを含む。置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドを含み得る。改変体は、コード化領域または非コード化領域あるいはその両方で変えられ得る。コード化領域内での変更は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）置換、付加および欠失であり、これは、ＥＰＯタンパク質またはその一部の特性および活性を変えない。この点に関して特に好ましいのはまた、保存的置換である。最も非常に好ましいのは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＥＰＯタンパク質をコードする核酸分子である。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号１の完全アミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一性、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％同一性のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【００６３】
もちろん、遺伝的なコードの縮重のために、当業者は、直ちに、ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する多くの核酸分子は、「ＥＰＯタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の全ての各々の改変体およびあらゆる縮重改変体が同一のポリペプチドをコードするので、これは当業者には明らかである。当該分野において、縮重改変体ではないこのような核酸分子について、妥当な数もまたＥＰＯ活性を有するポリペプチドをコードすることがさらに認識され得る。これは、当業者が、タンパク質機能にほとんど有意には影響しそうにないまたは全く有意には影響しそうにないアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪性アミノ酸と第二の脂肪性アミノ酸との置換）に十分気づくからである。
【００６４】
例えば、いかに表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関する指導が、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者は、アミノ酸配列の寛容性を変化する研究に関する２つの主要なアプローチが存在することを示す。第一の方法は、変異が天然の選択によって受け入れられるか拒絶されるかのいずれかである進化のプロセスに依存する。第二のアプローチは、クローン化した遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を導入する遺伝子工学を用い、そして機能性を保存する配列を同定するために選択またはスクリーニングする。著者が述べるには、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に意外にも寛容性であることを明らかにした。著者はさらに、アミノ酸変化がタンパク質の特定の位置において許容性であるようであることを示す。例えば、ほとんどの埋没アミノ酸残基が非極性の側鎖を必要とするのに対して、表面側鎖のわずかな特徴が、一般的に補存される。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．、前出、およびその中に引用される参考文献に記載される。
【００６５】
本願発明は、以下に示す実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
ヒトゲノムＤＮＡの調製 １０ｍｌの血液を、臨床的に健康なヒト成人男性被験体から抽出し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む試験管に加えた。この血液を、５ｍｌのアリコートで、０．３Ｍ サッカロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００を含む４５ｍｌの溶液を加えた２つの５０ｍｌ 試験管へ移した。
【００６７】
次いでこの溶液を、氷上で１０分間インキュベートし、そして４℃で１，０００ ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む０．０７５Ｍ ＮａＣｌ溶液で数回リンスし、続いて４℃で１，０００ ｇで１０分間遠心分離した。
【００６８】
このようにして得られた結果の沈殿を、３ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）溶液中に再懸濁した。次いで、２００μｌの１０％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および５００μｌ Ｋプロテイナーゼ（１％ ＳＤＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８中に１ｍｇ／ｍｌ）を加え、そしてこの溶液を３７℃で一晩インキュベートした。各々の試験管への１ｍｌのＮａＣｌ飽和溶液の添加後、ゲノムＤＮＡを含む溶液を、２，５００ ｇで１５分間遠心分離した。
【００６９】
各々の上清を、１容量のイソプロパノールを加えた１５ｍｌの試験管へ移した。この試験管を転倒混和によって静かに混合し、ＤＮＡ沈殿が形成されるまで室温で保存した。次いでゲノムＤＮＡをカギ端のパスツール（ｈｏｏｋ−ｅｎｄ Ｐａｓｔｅｕｒ）ガラスピペットを用いて回収した。
【００７０】
ＤＮＡを２ｍｌの試験管に置き、１ｍｌの７０％エタノールを加えた。１分後、上清を捨て、そして沈殿を乾燥した。乾燥後、沈殿を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８−１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解した。
【００７１】
ＤＮＡ溶液の濃度を、溶液の１：１０００希釈の２６０ｎｍでの吸収度を測定することによって計算した。５０μｇのゲノムＤＮＡが１ＯＤユニットに等価であると仮定した。１μｌのＴＥ緩衝液あたり５００μｇのゲノムＤＮＡを含む溶液を調製した。
【００７２】
（実施例２ ＥＰＯ構築物の調製）
ＥＰＯ構築物を、実施例１において得られる５００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから調製した。以下のものを、０．５ｍｌの試験管に置かれた、実施例１に由来する１μｌの溶液に添加した：４００ｎｇのＥＰＯ１プライマーおよびＥＰＯ２プライマーの各々、２．５ｍＭの各々のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）水溶液、ならびに、製造業者によって推奨される緩衝液を用いた１００ｌの最終容量における、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。熱サイクラーを用いて、そして、３０サイクル：９３℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間にプログラムした。この反応から、ＥＰＯ遺伝子を含む約２，１７０塩基対のＤＮＡフラグメントを得た。
【００７３】
利用されたプライマーのヌクレオチド配列は、以下の通りであった： ＥＰＯ１：５’ＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号２）。このプライマーは、最初の塩基に対応し、そしてこの塩基は、ＸｈｏＩ酵素の認識部位、および５’末端のＥｃｏＲＩ酵素の別の認識部位とともに、ＥＰＯ遺伝子から翻訳された。これらの部位を、引き続くクローニング工程に用いた。
【００７４】
ＥＰＯ２：５’ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ３’（配列番号３）。このプライマーは、ＥＰＯ遺伝子の最後に翻訳された塩基、および停止コドンに対して相補的である。ＨｉｎｄＩＩＩ酵素の認識部位を、プライマーの３’末端に付加した。この部位を、引き続くクローニング工程に用いた。
【００７５】
得られたヌクレオチド配列は、以下の通りであった（配列番号４）：
【００７６】
【化１】
最初に翻訳されたａｔｇコドン、ならびにｔｇａ「停止」コドンに下線を引く。クローニングに利用した制限部位の配列を、太字のイタリックで示す。１つを超えるコドンが、同一のアミノ酸をコードし得、そして結果として、ＥＰＯタンパク質は、異なるｍＲＮＡ鋳型（異なるヌクレオチド配列を有するが、それにもかかわらず、ＥＰＯをコードする）から翻訳され得たことに注意しなければならない。
【００７７】
（実施例３ ＥＰＯ遺伝子のクローニングおよび配列決定）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを含む、約２，１７０塩基対のフラグメントを精製した。ＤＮＡ末端を、標準的な分子生物学技術に従って、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを用いた処理によって平滑末端化し、そしてＭ１３ｍｐ１８ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングした。得られた組み換えプラスミドを、ＸｈｏＩ酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて切断した。挿入物の存在を、臭化エチジウムを用いて染色した０．８％アガロースゲル中の制限フラグメントの電気泳動により、確認した。陽性のクローン（２つのバンド、一方は約２，２００塩基対を有し、そしてもう一方は、線状化されたベクターに対応する）を、選択した。挿入されたＥＰＯ遺伝子を、Ｔ７配列決定キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒの技術に従って、配列決定した。ＥＰＯ遺伝子のいくつかの領域を、自動３７０Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ配列決定装置を用いて、さらに配列決定した。各々の配列決定システムについては、製造業者に推奨されるプロトコルに従った。
【００７８】
（実施例４ 真核生物細胞に対するベクター）
（１． ｐＶｅｘ１ベクターの構築）
ｐＶｅｘ１ベクターを、以下の標準的な分子生物学技術により形成した。これは、以下から構成される： ａ． Ｅ．ｃｏｌｉにおけるベクターの増幅および選択のために、細菌の複製起点を有し、そして、アンピシリンに対する耐性を与える、細菌性ｐＢＲ３２２ベクターのフラグメント。
【００７９】
ｂ．ａ）からすぐ下流に、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターが続き、これは、このエレメントから３’にクローニングされた遺伝子の発現を可能にした。
【００８０】
ｃ．ｂ）からすぐ下流に、ＸｈｏＩクローニング部位およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位が続き、これは、発現されるべき遺伝子の挿入を可能にした。
【００８１】
ｄ．ｃ）からすぐ下流に、ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルが続き、これは、ｃ）においてクローニングされた遺伝子の特異的な転写物の適切なポリアデニル化を可能にした。
【００８２】
ｅ．ｄ）からすぐ下流に、ＴＫプロモーター、およびそのポリアデニル化シグナルを有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子が続く。これらのエレメントは、ネオマイシンおよびネオマイシンから誘導された抗生物質（例えば、ジェネティシン）の使用を通して、安定にトランスフェクトされた細胞の選択を可能にした。ｅ）の３’末端を、ａ）の５’末端に連結する。
【００８３】
ｐＶｅｘ１ベクターを、１９９９年４月１６日、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ１ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託し、そして登録番号ＤＳＭ１２７７６が与えられた。
【００８４】
（２． ｐＤＨＦＲベクター）
ｐＤＨＦＲベクターは、細菌における選択のために、アンピシリンに対する耐性を与える。このベクターは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするｃＤＮＡを包含し、このＤＨＦＲの発現レベルは、ＳＶ４０ウイルス初期プロモーターおよびそのポリアデニル化シグナルによって制御される。ｐＶｅｘ１−ＥＰＯ（実施例５を参照のこと）ベクターを用いて獲得されたＥＰＯ発現レベルは、増加した濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）を含む培養培地中での、ＤＨＦＲおよびＥＰＯ遺伝子の増幅によって、数倍に増強される。
【００８５】
このｐＤＨＦＲベクターを、１９９９年４月１６日、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ１ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託し、そして登録番号ＤＳＭ１２７７７が与えられた。
【００８６】
（実施例５ 発現ベクターへのＥＰＯコード遺伝子のクローン化）
実施例３に記載の通りにクローン化されたＥＰＯコード遺伝子を含むＭ１３ｍｐ１８クローンを、Ｘｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酵素で切断した。このようにして得られた、約２．２Ｋｂのフラグメントを単離し、そしてｐＶｅｘ Ｉベクターの同じ制限部位を使用して、再びクローン化した。ポジティブなｐＶｅｘ−ＥＰＯクローンを単離し、そして分析して、このＥＰＯコード配列配列番号４はクローン化する手順の間変化しないことが示された。
【００８７】
上記実施例を、従来の分子生物学の技術により、実行した。Ｂｒｏｗｎ、「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９５）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２版」、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）；Ｄａｖｉｓら、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）を参照のこと。
【００８８】
（実施例６ 同時トランスフェクションおよび増幅）
ＤＨＦＲ酵素遺伝子が欠損した（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-）、変異誘発したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株を、ＭＴＸを用いた遺伝子の増幅を促進するために使用した。全プロセスの間、細胞を、３７℃、５％のＣＯ2雰囲気中で、増殖させた。
【００８９】
このＣＨＯ細胞をリン酸カルシウム技術に従って、直径９０ｍｍのペトリ皿を用いて、同時トランスフェクトした。これは以下の通りであった： （１）培養培地（１０％のウシ胎仔血清を伴う、α−ＭＥＭ）をトランスフェクションの４〜８時間前に新しい培地と置換した。
【００９０】
（２）１０ｇ／ｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）溶液の５００μＬ、１６ｇ／ｌのＮａＣｌの５００μＬ、３５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4の１０μｌおよび３５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4溶液の１０μｌを５ｍｌの試験管へ加えた。
【００９１】
（３）別の１．５ｍｌ試験管の中へ、６０μｌの２ＭのＣａＣｌ2および１０μｇの各々のトランスフェクトされるＤＮＡベクター（ｐＶｅｘ−ＥＰＯおよびｐＤＨＦＲ）を有する溶液を加えた。５００μｌの最終の容量に到達するまで、水を加えた。実施例２に記載のｐＤＨＦＲプラスミドは、アンピシリン耐性である、ｐＢＲ３２２プラスミドに基づく。ｐＤＨＦＲプラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で複製され得、そしてＳＶ４０の初期プロモーターとそのターミネーターとの間でクローン化されたＤＨＦＲ遺伝子を有する。ｐＤＨＦＲプラスミドは、ＣＨＯ細胞におけるＤＨＦＲタンパク質の発現を、コードする。このタンパク質は、メトトレキセートに対する抵抗性を与え、それゆえ、高いエリスロポイエチン生産性を示す細胞を選択するように使用され得る。
【００９２】
（４）ＤＮＡおよびＣａＣｌ2を含むこの溶液を、ＨＥＰＥＳを含む試験管へ気泡を泡立てながら一滴ずつ加えて迅速な混合を得、そして局部濃度を最小にした。この方法は、この細胞によってより効果的に組み込まれる、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含む非常に小さな粒子の形成を促進した。
【００９３】
（５）この溶液を３０分間静置し、そして次いでこの細胞を含むペトリ皿へ加えた。
【００９４】
（６）この溶液を穏やかに振ることにより、細胞間で分配した。この細胞を、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下、インキュベーター中で一晩放置した。
【００９５】
（７）細胞をＰＢＳ緩衝液（８ｇのＮａＣｌ；０．２ｇのＫＣｌ；１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇのＮａＨ2ＰＯ4、１リットルになるように水を加え、そしてｐＨをＨＣｌで７．４へ調整した）で２回リンスした。新しい培養培地を次いで加えた。
【００９６】
６００ｇ／ｍｌの濃度でジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）を用いた選択を、トランスフェクションの後、２４時間で始めた。ｐＶｅｘ−ＥＰＯプラスミドを組み込んだ細胞は、この抗生物質に抵抗し得、一方で、他の全ては、２５日後に死亡した。抵抗性コロニーを選択し、そしてそれらの生産性をアッセイした。最も生産的な３つのクローンを、単離されたクローンから選択した。
【００９７】
本発明において使用された遺伝子の構成を利用して、１０-8Ｍ、１０-7Ｍ、１０-6Ｍおよび１０-5Ｍの濃度で、第２の選択試薬としてＭＴＸを使用して、選択を３つのクローンの各々に対して実行した。その目的のために、培養培地をヌクレオチドを伴わない、１０％の透析したウシ胎仔血清を補充したα−ＭＥＭに交換した。以下のプロトコルに従って透析プロセスを実行することが必須である：１００ｍｌの血清を３，０００Ｄａカットオフ（より高いカットオフを用いると、増殖因子が失われ得、そしてこの細胞が増殖および繁殖し得ない）を有する透析バッグ中に入れ、このバッグを密閉して閉じ、５リットルの２回蒸留した水を有する容器中に完全に浸し、そして４℃で、１２時間撹拌しないで放置した。この工程の後、この水を捨て、そして交換し、このバッグを４℃でさらに１２時間放置した。次いでこの透析バッグを取り出し、そしてこの血清を回収した。より短い期間の、より少ない容量を用いるまたは水の交換を伴わない透析は効果的でない。なぜなら、この血清中の任意のわずかなヌクレオチドが、ＭＴＸ選択に悪影響を与えるからである。他方では、より長い期間の透析もまた効果的でない。なぜなら、細胞の増殖に必要ないくつかのタンパク質が沈降して、細胞の成熟を妨げ得るからである。
【００９８】
（実施例７ 高生産性クローンの単離）
１０-7および１０-6ＭのＭＴＸにおいて増殖したクローンを単離し、そしてヌクレオチドを伴わない、１０％の透析したウシ胎仔血清を補充した新しいα−ＭＥＭ中で増殖させた。一旦増殖したら、培養の上清みを、ＥＰＯの生成および分泌についてアッセイした。その目的のために、特異的イノムアッセイを使用した。
【００９９】
上記のプロセスは、１日につき５０，０００μｇのエリスロポイエチン／培養培地のリットルを生成する、組換え宿主細胞のクローンの選択で、終了した。
【０１００】
本実施例で記載された組換え宿主細胞は、１９９９年４月１６日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託され、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７が与えられた。
【０１０１】
この細胞における転写プロセスの有効性を、実施例８に記載される通りに確認した。得られたタンパク質の配列を、実施例９に記載の手順に従って同定した。
【０１０２】
（実施例８ 組換え細胞によって産出された特異的メッセンジャーＲＮＡ配列の検証）
（１．細胞からのＲＮＡの調製）
全ＲＮＡを、以下のプロトコルに従って、ＥＰＯ産出細胞から調製した： コンフルエントの細胞を含む直径９０ｍｍのペトリ皿を、１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２ｍｌのＧＴＣ緩衝液を添加し、そしてこの皿一面に均等に分布させた。このＧＴＣ緩衝液は：５０ｇのグアニジニウムチオシアネート；０．５ｇのＮ−ラウロイルサルコシン、２．５ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．７ｍｌのβ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｌの３０％消泡材（ＳＩＧＭＡ）および１００ｍｌにするに足る水（ｐＨ７．０）、から構成される。
【０１０３】
次いで細胞を溶解した。この溶解物は高粘性の溶液を生じた。この溶液を、１５ｍｌの試験管に移し、そして上記の工程を２ｍｌのＧＴＣ緩衝液を使用してもう１度繰り返した。
【０１０４】
この１５ｍｌの試験管を、ＤＮＡを切断するために１分間激しく攪拌した。次いで塩化セシウム勾配を行った。この目的のために、４ｍｌの、ＣｓＣｌを含む溶液（９５．９７ｇのＣｓＣｌおよび２．５ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム、（ｐＨ５．４）、そして体積が１００ｍｌに達するまで水を加えた）を超遠心分離試験管に加えた。次いでこの溶液の上に、混合することなく、細胞のＧＴＣ懸濁液を加えた。この試験管を次に、ＧＴＣ緩衝液で満たし、そして２０℃で２０時間、３１，０００ｒｐｍで超遠心分離した。
【０１０５】
超遠心分離の間、ＲＮＡは試験管の底に沈殿してペレットを形成し、そして得られたＤＮＡは塩化セシウム勾配の中央にバンドを示した。上清を、ＤＮＡを完全に除去するために廃棄した。ＲＮＡ含有ペレットを５分間乾燥させ、次いで２００μｌの水に溶解し、そして１．５ｍｌの試験管に移した。次いで２００μｌの０．４Ｍ酢酸ナトリウム、（ｐＨ４．８）および２倍の体積のエタノールを加え、この生じた溶液を完全に混合し、そして−８０℃で３０分間静置した。次いでこの溶液を１４，０００ｒｐｍにて１５分間微小遠心分離機で遠心分離し、上清を廃棄し、そして沈殿を１ｍｌの８０％エタノールですすいだ。このペレットを乾燥し、１００μｌの水に再溶解した。このＲＮＡ溶液の１：１００希釈溶液の濃度を、２６０ｎｍで測定した（１ＯＤ単位が約４０μｇのＲＮＡに相当する）。使用された全ての溶液および要素にはＲＮａｓｅが無かった。
【０１０６】
（２．ｃＤＮＡの調製）
特異的ｃＤＮＡを、その目的のために意図されたキットの指示に従って調製した（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｃａｔ．ＲＰＮ１２５６）。ＥＰＯ ２が使用したプライマーであった。
【０１０７】
（３．ＥＰＯをコードするｃＤＮＡのクローニング）
このように得られたｃＤＮＡの５％を、ＥＰＯ ２およびＥＰＯ ３オリゴヌクレオチドをそれぞれ４００ｎｇ、適切な緩衝溶液中のデオキシヌクレオチドをそれぞれ２．５ｍＭ、および２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを、全体積１００μｌで使用して、増幅した。３５回の増幅サイクルを、以下のように行った：９３℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間。
【０１０８】
ＥＰＯ ３を，ＥＰＯ １およびＥＰＯ ２について記載したように合成し、そしてその配列
【０１０９】
【化２】
は、ＥＰＯ ｃＤＮＡをコードする最初の２０塩基に相当し、Ｅｃｏ ＲＩ酵素の認識のための１つの部位である。Ｅｃｏ ＲＩ酵素認識部位を、次のクローニング工程を容易にするために付加した。
【０１１０】
約６００塩基対のフラグメントが得られ、そしてＭ１３ｍｐＩ８およびＭ１３ｍｐＩ９ベクター中にクローニングした。Ｓａｎｇｅｒの配列決定方法を使用して、完全な配列を得るために両方向で、インサートを配列決定した。
【０１１１】
この遺伝子のいくつかの領域の高い自己相補性（これは、放射能写真において多くの非常に不明瞭な圧縮を生じる）のために、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する配列決定キットおよび修飾塩基を使用した。低い品質結果が得られたが、圧縮は分離された。使用したキットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧｅｎｅ ａＴａｑであった。
【０１１２】
ヒトエリスロポイエチンｃＤＮＡの完全配列を単離し、そしてクローニングし、ＥＰＯのコードを示した。結果として、細胞においてクローニングされた遺伝子およびその転写産物は、完全であり、その配列はＥＰＯについて正確であることを見出した。
【０１１３】
（実施例９ ＥＰＯ産物の分析）
前記の実施例に例示されるように、宿主細胞を培養することによって得られたＥＰＯを、種々の品質および同定アッセイを行うためにさらに精製した。
【０１１４】
変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、ＥＰＯについて予想されたように、このＥＰＯは、３０ｋＤａを越える分子量の広いバンドとして同定された。図１を参照のこと。このバンドは、ＥＰＯについて予想されたように、「ウェスタンブロット」アッセイにおいて、ヒトＥＰＯに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体によって認識された。図２を参照のこと。グリカナーゼによる処理は、ＥＰＯについて予想されたように、範囲およびサイズにおいてグリコシド鎖の存在を証明した。図３を参照のこと。産生されたＥＰＯは、ＥＰＯについて予想されたように、３．０から４．５の等電点の範囲の種のシリーズから構成されることが示された。図４を参照のこと。
【０１１５】
トランスフェクトされた細胞株の培養上清から精製された、単離されたタンパク質の完全なアミノ酸配列は、天然ヒトエリスロポイエチンと全くの相同性を示した。天然ヒトエリスロポイエチンの１６５のアミノ酸配列は、以下の通り（配列番号１）である：
【０１１６】
【化３】
この１６５のアミノ酸鎖に沿った４つのグリコシル化部位、および複雑な炭化水素構造、ならびに特に、ＥＰＯに特徴的なシアリン酸末端残基の存在が、証明された。これらの結果は、産生されたタンパク質の生物学的活性アッセイ、国際ＥＰＯ標準と完全な一致を示した低酸素性多血症マウス試験によって、さらに支持された。
【０１１７】
特異的な免疫学的アッセイによって測定された、達成された生産性は、１日あたり培養培地１ｌにつき５０ｍｇＥＰＯであった。
【０１１８】
本明細書中上記の全ての刊行物は、本明細書によりその全体が参考として援用される。
【０１１９】
前述の発明は、明瞭さおよび理解の目的のために、いくらか詳細に記載されたが、本発明および添付の特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細における多様な変化がなされ得るということが、本開示を読むことにより当業者に理解される。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
【表３】
寄託：ＭＣ２ ２０ ２２／１２／９８ 登録番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７ １頁 （オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０１２３】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求する。
【０１２４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１２５】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および登録委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１２６】
（アイスランド）
出願人はここにおいて、出願が（アイスランド特許庁（ｔｈｅ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０１２７】
寄託：ＭＣ２ ２０ ２２／１２／９８ 登録番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７ ２頁 （オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０１２８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１２９】
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１３０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３１】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１３２】
寄託：ｐＤＨＦＲ 登録番号：ＤＳＭ １２７７７ １頁 （オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０１３３】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求する。
【０１３４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３５】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および登録委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３６】
（アイスランド）
出願人はここにおいて、出願が（アイスランド特許庁（ｔｈｅ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０１３７】
寄託：ｐＤＨＦＲ 登録番号：ＤＳＭ １２７７７ ２頁 （オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０１３８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３９】
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１４０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４１】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１４２】
寄託：ｐＶｅｘ１ 登録番号：ＤＳＭ １２７７６ １頁 （オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０１４３】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求する。
【０１４４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４５】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および登録委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４６】
（アイスランド）
出願人はここにおいて、出願が（アイスランド特許庁（ｔｈｅ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０１４７】
寄託：ｐＶｅｘ１ 登録番号：ＤＳＭ １２７７６ ２頁 （オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０１４８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４９】
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１５０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１５１】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、宿主細胞、および組換えヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）コードするヌクレオチド配列を含むベクターに関連する。特に、発現ベクターは、ＥＰＯの発現を制御するプロモーターを１つのみ含む。本発明はまた、ＥＰＯを産生する方法およびそれにしたがって産生されたＥＰＯに関連する。
【背景技術】
【０００２】
（背景情報）
ＥＰＯは骨髄における赤芽球の分化を刺激する糖タンパク質であり、従って、循環赤血球の数を増加させる。ヒトにおける赤血球の平均寿命は１２０日であり、そのためヒトは毎日１／１２０の赤血球を失う。この損失は、適正なレベルの赤血球を維持するために、連続的に回復させなければならない。
【０００３】
ＥＰＯの存在は、世紀の変わり目で初めて仮定され、それは５０年代初期にＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖによって明確に立証された。Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ）１４３：３８４−３８６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ），１４３：４３２−４３５（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：３４４−３４６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔ、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：４６３−４６５（１９０６）；Ｒｅｉｓｓｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ ５：３７２−３８０（１９５０）およびＥｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，８：３４９−３５７（１９５３）を参照のこと。ＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖの実験は、他の研究者によって即座に確認された。Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ，９：２９９−３０９（１９５４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：２５５−２５８（１９５４）；およびＢｏｒｓｏｏｋら、Ｂｌｏｏｄ，９：７３４−７４２（１９５４）を参照のこと。
【０００４】
生物におけるＥＰＯ産生部位の同定は議論の論点であった。連続的な実験によって、腎臓を主要な器官として、そして管周囲の間細胞を合成部位として同定した。Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１７９：６３３−６３４（１９５７）；Ｋｕｒａｔｏｗｓｋａら、Ｂｌｏｏｄ，１８：５２７−５３４（１９６１）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｃｔａ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２６：２２４−３２（１９６１）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２０５：６１１−６１２（１９６５）；Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１４９：２９２−２９３（１９６８）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１３７：３２７−３３０（１９７１）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌ、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），４７：２３８−２４２（１９７２）；Ｅｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，４４：７７−８５（１９７４）；Ｋａｚａｌ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，５：９８−１０９（１９７５）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，９９：５０４−５１０（１９７６）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２８：１０１−１２２（１９８８）；Ｊｅｌｋｍａｎｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：５８１−５８８（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８０：４００８−４０１１（１９８３）；Ｃａｒｏら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０３：９２２−９３１（１９８４）；Ｃａｒｏら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１２：３５７（１９８４）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７０：３１６−３１８（１９８６）；Ｂｏｎｄｕｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２７３１−２７３３（１９８６）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７１：５２４−５２７（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７１：５２４−５２７（１９８８）；Ｌａｃｏｍｂｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：６２０−６２３（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７４：６４５−６５１（１９８９）を参照のこと。
【０００５】
総ＥＰＯの１０％〜１５％の範囲のより小さな割合は、成体の肝臓で産生される。Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：２２７−２４２（１９７９）；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１５：１２１−１３２（１９８０）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１１：３７−４６（１９８１）；Ｄｉｎｋｅｌａａｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，９：７９６−８０３（１９８１）；Ｃａｒｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４４：５（１９８３）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０２：２７４−２８５（１９８３）；Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１３：４３２−４３８（１９８３）；Ｊａｃｏｂｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８０６−８１０（１９８５）；Ｅｒｓｌｅｖら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３：１５９−１６４（１９８６）を参照のこと。その産生されたＥＰＯは、組織の低酸素およびＥＰＯ産生細胞数の増加によって起こるその発現の程度に正比例する。
【０００６】
ＥＰＯは、貧血、特に腎不全に由来する貧血の処置において卓越した有効性を示した。Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３１６：７３−７８（１９８７）；Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１：１７７−１８１（１９８３）を参照のこと。しかし、大量に産生する方法が利用できないために、その治療的な有用性は制限されてきた。公知の抽出システムによって得られるＥＰＯの量および質は不充分であった。最近、組換えＤＮＡ技術の使用によって大量のタンパク質を得る事が可能となった。これらの技術の真核生物細胞への応用は、大規模なＥＰＯの産生を可能にした。米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）、同第５，５４７，９３３号（Ｌｉｎ）、同第５，７５６，３４９号（Ｌｉｎ）、同第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）、および同第４，６７７，１９５（Ｈｅｗｉｃｋら）を参照のこと。
【０００７】
現在では、組換えＤＮＡ技術は広く公知であり、そして使用されている。これらの技術は、ＤＮＡフラグメントおよび酵素のような遺伝的エレメントの、組換えタンパク質の産生のための遺伝構築物を集合および伝達するための使用を含む。また、組換えＤＮＡ技術は生物学的機構の研究を容易にする。Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ、「Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ＤＮＡ」［Ｓａｍａｉａ Ｇｌａｖｎａｉａ Ｍｏｌｅｋｕｌａ］（Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ Ｌｏｎｇｍａｎ Ｉｎｃ．，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，１９９７）；Ｂｒｏｗｎ、「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９５）；Ｗａｔｓｏｎら、「ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ」，第二版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ａｌｂｅｒｔｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｉｎｎｉｓら編、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９０）；Ｅｈｒｌｉｃｈ編、「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ編、「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，１９８７）；Ｄａｖｉｓら、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ、「Ｔｈｅ Ｄｏｕｂｌｅ Ｈｅｌｉｘ」（Ｐｅｎｇｕｉｎ Ｂｏｏｋｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９）を参照のこと。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本願発明は、ヒトＥＰＯをコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いるそのトランスフェクションの手段により得られた、組換えヒトＥＰＯを生産する真核生物細胞株を含む。このベクターは発現制御エレメントとして固有のプロモーターおよびターミネーターをさらに含む。配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１は、使用された遺伝子によって体系化されたＥＰＯアミノ酸配列を同定する。
【０００９】
本発明は、配列番号１におけるアミノ酸配列、ウィルスプロモーターおよびウィルスターミネーター、からなるエリスロポイエチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、ＥＰＯポリペプチドが発現かつ回収されるこのような条件下で、上記宿主細胞を培養する工程を包含する、ＥＰＯポリペプチドを産生するための方法をさらに提供する。
【００１１】
本発明の利点の１つは、利用されたＥＰＯをコードする遺伝子が５’および３’領域の非コードフラグメントを含まないことである。しかし、本願発明の系は、予想外に大量のＥＰＯを産生する。
【００１２】
本発明のさらなる利点は、高いＥＰＯ生産性を示すただ１つのプロモーターを含む発現ベクターの使用である。本願発明の方法を利用することにより、一日当たりの１リットルの細胞培養物当たり５０ｍｇより多くのＥＰＯを得ることが可能であり、すなわち、従来報告された１つのプロモーターを利用する最良の方法よりも、本願発明のＥＰＯ産生レベルは５倍を超える。
【００１３】
本発明において請求されたＥＰＯをコードする遺伝子と、単純なプロモーターとの組み合わせは、驚くべきことに、効果的に動作し、安定なＥＰＯ産生細胞を生じることを示した。遺伝子構築物を操作することはより複雑かつ困難であるが、より適切な理論において使用することが報告されたそれらと匹敵して、またはそれよりもかなり高く、トランスフェクトされた細胞は、大量のＥＰＯを生じた。
【００１４】
本願発明のさらなる利点は、異なる耐性を与える２つのベクターを用いた同時トランスフェクションであり、このように、同時トランスフェクトされたＥＰＯ産生細胞の選択、遺伝的増幅および維持を単純化し、そして促進する。
【００１５】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、以下に記載の方法の精製の後に得られたＥＰＯサンプルの、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を図示する。レーン１、４、および７には、分子量マーカーがロードされた。レーン２、３、５および６には、本願発明の手順に従って得られた、異なる量の純粋なＥＰＯが電気泳動された。得られた生成物の純度および３０ｋＤａを超える見かけの分子量は、はっきりと観測され得るように、尿中のヒトＥＰＯについて報告されたものと同時に起こる。
【図２】図２は、記載された方法に従って得られたＥＰＯサンプルのウエスタンブロット分析を図示する。産生されたＥＰＯの同一性は、ヒトＥＰＯに対するモノクロナール抗体によってそれが認識されたことによって評価された。レーン１および２には、それぞれ標準ヒトＥＰＯおよび分子量マーカーがロードされた。本願発明の方法に従って得られたＥＰＯサンプルは、レーン３〜５にロードされた。
【図３】図３は、記載された方法に従って得られた純粋なＥＰＯサンプルおよび、さらにグリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で処理した純粋なＥＰＯサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分子量マーカーがレーン１、４および８にロードされた。レーン２および７は未処理ＥＰＯに対応する。レーン３には、Ｏ−グリカナーゼ処理されたＥＰＯがロードされ；Ｏ−グリコシル化部位の存在が検証された。レーン５には、部分的にＮ−グリカナーゼで消化されたＥＰＯがロードされた。ＥＰＯと予想された分子量を有する３つのＮ−グリコシル化された分子の存在が検証され得る。レーン６には、Ｎーグリカナーゼで消化されたＥＰＯがロードされ、そして全てが脱グリコシル化されたタンパク質と予想される分子量が観察された。
【図４】図４は、記載された方法に従って産生された純粋なＥＰＯサンプルにおける等電点の調査を図示する。ＥＰＯサンプルはレーン２、３および４で、等電点マーカーはレーン１および５で電気泳動された。ＥＰＯに対応するイソ型の存在が検証され、３．０から４．５の範囲の等電点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
組換えＤＮＡ技術の生物学的基礎は、以下のように要約され得る。
【００１８】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、全ての生細胞およびいくつかのウィルスの遺伝物質である。４つの異なるヌクレオチドのポリマー鎖が、ＤＮＡを形成し、それらの各々はデオキシリボース（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）に結合したプリン、またはピリミジンである。糖部分が、その後リン酸基に結合される。これら４つのヌクレオチドは、以下である：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）。
【００１９】
ＤＮＡ鎖は、ヌクレオチド間のホスホトリエステル結合により形成され、ここで１つのヌクレオチドのデオキシリボースの５’位のリン酸塩は、前のヌクレオチドのデオキシリボースの３’位に結合される。インビボでの合成は、５’から３’に生じ、これはＤＮＡ配列を記載するために採用される従来の方向である。
【００２０】
機能的ＤＮＡは、相補的な塩基の二重らせんとして存在し、ここで鎖は、一方の鎖のＡおよびＣと、相補鎖のＴおよびＧとの、それぞれの間で形成される水素結合により共に保持される。これが、それらが「塩基対」といわれる理由である。
【００２１】
この鎖はまた逆平行でもあり、それは下記のように、各螺旋の５’末端が、他方の３’末端に一致する：
５’−ＴＡＣＧＴＡＣ−３’
３’−ＡＴＧＣＡＴＣ−５’
タンパク質合成が生じるために特定のＤＮＡコード領域が、最初にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される。このｍＲＮＡは、その後、タンパク質に翻訳される。各ＤＮＡコード領域は、遺伝子と呼ばれる。
【００２２】
ＲＮＡ（リボ核酸）鎖の合成は、ＲＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素による特定の遺伝子領域の転写を含む。従って、ＤＮＡテンプレートに相補的な逆平行ＲＮＡ鎖が得られる。ＤＮＡの各ＡはＲＮＡのＵに、各ＣはＧに、各ＧはＣに、および各ＴはＡに対応する。ＲＮＡ分子はまた、ＤＮＡより安定でないという理由で特徴づけられる。さらに、ＤＮＡにあるようなデオキシリボースに代わり、ＲＮＡの糖部分はリボースである。ＲＮＡはさらに、チミン（Ｔ）に代わるウラシル（Ｕ）の置換によってＤＮＡと区別される。
【００２３】
基質ＤＮＡ ５’−−−ＡＣＧＴＡＧ−−−３’
合成されたＲＮＡ ３’−−−ＵＧＣＡＵＧ−−−５’
真核生物細胞において、合成されたｍＲＮＡは、核内でプロセシング（スプライシング）され成熟ｍＲＮＡを生じる。細菌において、このプロセシングは確認されない。
【００２４】
次いで、成熟ｍＲＮＡは、タンパク質に翻訳されるために基質として利用され、このプロセスにおいて、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ、アミノ酸を運び、そしてそれらを特異的に整列し、タンパク質を形成する短いＲＮＡ鎖）およびリボソームが主な関与物である。３つのｍＲＮＡ塩基（トリプレットまたはコドン）は各アミノ酸をコードする。例えば、ｍＲＮＡのＡＵＧ配列は、アミノ酸メチオニンをコードする。従って、ｍＲＮＡ鎖は、特定のペプチド配列に翻訳され、このペプチド配列は最終的に活性なタンパク質に折りたたまれる。タンパク質合成は、「発現」と呼ばれる。
【００２５】
発現されたタンパク質の量は、因子の間でもとりわけ、プロモーターと呼ばれる特定のＤＮＡ領域の存在に依存し、プロモーターは発現プロセスが生じる割合に影響する。さらに、転写の終結を示すＤＮＡ配列（ターミネーター）、および翻訳の終止を示すコドン（停止コドン）が存在する。
【００２６】
ＤＮＡ技術は、天然または合成のいずれかのＤＮＡフラグメントの単離、および細胞（すなわち、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞）にＥＰＯのような異種タンパク質の生成を可能にさせるための、ＤＮＡフラグメントの細胞への挿入を含む。組換えＤＮＡ技術により得られるタンパク質は、組換えタンパク質と呼ばれる。
【００２７】
組換えＤＮＡ技術の適用分野は、培養細胞に限定されない。なぜなら遺伝子は多細胞生物（すなわち植物、昆虫、哺乳動物および魚類）にもまた、取り込まれ得るからである。
【００２８】
異種タンパク質の発現は、以下のエレメントを要求する：
・所望のタンパク質をコードする遺伝子。その遺伝子は以下のような異なる技術を使用して得られ得る；
・ゲノムＤＮＡライブラリーからの単離。
・ＤＮＡ鎖のインビトロ合成。比較的短いＤＮＡ鎖を合成する市販の装置は存在し、これはインビトロでの遺伝子合成を可能にする。
・増幅。遺伝子のようなＤＮＡフラグメントを数倍に複製することを可能にする技術。
・その他、すなわち、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡライブラリーより得られるようなもの。
・目的の細胞においてタンパク質を発現するための活性なプロモーター・転写が正確に終結されるような適切なターミネーター・ベクター。プロモーターおよびターミネーターを有する遺伝子を、染色体中または染色体外のいずれかにこの遺伝子を取り込む目的の細胞の内側領域へ、指向するプラスミドまたはウィルスのような遺伝子構造物。特定の場合において、この取り込まれた遺伝子は、細胞内に無限大に残存し得、そしてその子孫に伝達され得るか、または比較的短期間で消失され得る。プラスミドおよび天然ウィルスまたは改変されたウィルスのような多数のベクター系がある。細胞または核への微量注入のようなＤＮＡ導入の物理的手段を使用することもまた可能である。ウィルスおよびプラスミドは天然より得られ、そして所望する特性を達成するようにインビトロで遺伝子改変される。
・その他。さらに、他の遺伝エレメントが、遺伝子を受け取る細胞の選択を改善するために（すなわち、抗生物質に対する耐性を与える別の遺伝子）、または各細胞における遺伝子のコピー数を増幅（遺伝子増幅）するために必要であり得る。
【００２９】
ベクターおよび遺伝子は、その系の発生のために必要な時間を減少するために可能な限り単純であるべきである。基礎的な考察では、遺伝子の単純性は、生成されるタンパク質産物の生産性または質を軽視すべきでない。
【００３０】
目的のタンパク質の発現を達成するために、適切な対応する遺伝子が、適切なベクターによって宿主細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクトは、利用可能な他の技術の中でもエレクトロポレーション、リン酸カルシウムでの沈殿、およびリポソームの使用のような、異なる技術によってなされ得る。
【００３１】
目的の遺伝子は、例えば、抗生物質（例えば、ジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））に対する、または毒物（例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ））に対する耐性を付与することが既知の他の遺伝子に結合し得る。すなわち、この結合は、安定な様式によりトランスフェクトされた細胞の選択を可能にし、選択された細胞は、目的の遺伝子を子孫へ複製および伝達することが可能である。結合はまた、目的のタンパク質の最も高い発現レベルを示している組換え細胞を選択することを可能にする。
【００３２】
このようにして得られた組換え産物は、他にも適用可能なアッセイはあるが、その分子量、アミノ酸配列および生物学的活性により同定される。
【００３３】
組換えＤＮＡ工学を生み出した、この手段（すなわち、制限酵素）および技術は、７０年代初期に最初に発達し、そして後に、強烈および広範に利用された。さらに詳細には、ＥＰＯ産生のためにここで利用したこの遺伝子工学技術は以下を含む。
１．非コード領域のフラグメントを含むＥＰＯ遺伝子の使用は、最初の翻訳ＡＴＧの５’およびこの遺伝子の終止コドンの３’に位置している。この遺伝子の非コード領域中に位置している発現制御エレメントの存在は、ＥＰＯの高産生を達成するために必要であると従来考えられている。米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）を参照のこと。
２．異種プロモーターを有する発現ベクターの使用は、プロモーターの組み合わせがより高いＥＰＯ産生を誘導するという仮定に基づいた。現在まで、ベクターに含まれる１つのみのプロモーターの使用は、低いレベルのタンパク質の発現を生じてきた。米国特許第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）、米国特許第４，６７７，１９５号（Ｈｅｗｉｃｋら）、および米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）を参照のこと。１つのみのプロモーターを使用するＥＰＯの平均的な産生は、２００μｇ／ｌ／日である。１つのみのプロモーターを使用して報告されたＥＰＯの最大の産生は、１０ｍｇ／ｌ／日である。
３．遺伝子系の潜在的な不安定性は、利用した遺伝子の構築物の複雑性に起因する。
【００３４】
特許請求の範囲に記載されているＥＰＯ産生細胞を得るために、まずゲノムＤＮＡをヒト白血球から抽出する。ＥＰＯコード遺伝子は、単離したゲノムＤＮＡから得られる。これを達成するために、この遺伝子は、ＥＰＯ遺伝子の５’および３’非コード領域の存在を妨げるために適切なプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、さらにクローニングを容易にするために単離した遺伝子の両方の末端に残存する、プライマーの５’末端に制限部位を含む。
【００３５】
次に、増幅した遺伝子は、細菌のベクターにクローン化し、そして配列決定される。一旦、得られた配列が確認されれば、この遺伝子をＳＶ４０初期プロモーターおよびそれのターミネーターのみを保持している真核生物細胞のための発現ベクターのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローン化した。このベクターは、ジェネチシンおよびアンピシリンに対する耐性を付与する。
【００３６】
ＣＨＯ細胞は、その後２つのベクターで同時トランスフェクトされる：１）このＥＰＯ発現ベクターおよび２）メトトレキサートに対する耐性を付与するベクター。安定にトランスフェクトされたＥＰＯ産生細胞は、ジェネチシンに対するそれらの耐性により選択される。ＥＰＯ発現のレベルは、メトトレキサートの増加する濃度に耐性である増幅した細胞の選択によりモニターされる。
【００３７】
最後に、クローンは、ラジオイムノアッセイにより測定したそれらの産生レベルにより選択される。最も産生力を有するクローンの培養上清を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、グリカナーゼ処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法および完全なタンパク質配列分析により産生したＥＰＯの同一性を試験する。産生したＥＰＯのインビボでの生物学的活性は、ＥＰＯ基準のための国際基準を参照して、ｅｘ−ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃマウスアッセイにより決定される。
【００３８】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、ヌクレオチド配列コードＥＰＯを含むベクター、組換えベクターで遺伝的に加工された宿主細胞、および組換え技術によるＥＰＯポリペプチドまたはその一部分の産生に関する。
【００３９】
組換え構築物は、周知の技術（例えば、感染、形質導入、トランスフェクション、伝播媒介、接合、エレクトロポレーションおよび形質転換）を使用して宿主細胞へ導入され得る。例えば、このベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得る。
【００４０】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈降物（例えば、リン酸カルシウム沈降物）の状態、または荷電脂質との複合体の状態で導入される。このベクターがウイルスである場合、それは、インビトロで適当なパッケージング細胞株を使用してパッケージされ得、次いで宿主細胞へ形質導入され得る。
【００４１】
目的のポリヌクレオチドにシス作用性制御領域を含むベクターが、好ましい。適当なトランス作用性因子は、宿主への導入の際に宿主によって供給され得るか、補足しているベクターにより供給され得るか、またはベクターそれ自体により供給され得る。
【００４２】
この点に関して、特定の好ましい実施形態において、このベクターは特定の発現のために提供され、この発現は、誘導可能および／または細胞型特異的であり得る。特に、このようなベクターのうち好ましいのは、操作（例えば、温度および栄養添加剤）することが容易である、環境因子により誘導可能なベクターである。
【００４３】
本発明において有用な発現ベクターとしては以下が挙げられる：染色体誘導ベクター、エピソーム誘導ベクター、およびウイルス誘導ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来ベクター、およびそれらの組み合わせ由来ベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。
【００４４】
このＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（例えば、２〜３例を挙げれば、ファージλＰLプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ，ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）へ作動可能に連結されるはずである。他の安定なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始部位、終止部位および転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。この構築物によって発現された成熟転写物のコード部分は、始めに翻訳開始コドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置付けられた終止コドンを含む。
【００４５】
示されたとおり、この発現ベクターは好ましくは、少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。より好ましくは、２つの発現ベクターは全部で２つのマーカーを含む。このようなマーカーは、メトトレキサート、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性を含む。好ましいベクターは、メトトレキサートおよびネオマイシン誘導抗生物質（例えば、ジェネチシン）に対して耐性を付与する。
【００４６】
特に好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＮａｍａｌｗａおよびＨｅＬａを含む哺乳動物細胞である。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。上記宿主細胞について適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【００４７】
本発明の宿主細胞からＥＰＯを得る好ましい方法は、インスリンを含む培地中で培養することである。詳細には、そのような培養は、本発明の宿主細胞から、ＥＰＯおよびインスリンを含む上清を分離し、その上清を濃縮し、そしてその濃縮した産物を凍結することを含む。好ましくは、培養培地は、培養培地１リットル当たり０．５ｍｇと２０ｍｇとの間のインスリンを含む。
【００４８】
とりわけ、好ましい真核生物細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００４９】
特に好ましいベクターは、ｐＤＨＦＲおよびｐＶｅｘ１である。ｐＤＨＦＲベクターは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを含み、そのＤＮＡの発現は、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター、およびそのポリアデニル化シグナルによって制御される。ｐＶｅｘ１−ＥＰＯベクターは、配列番号１のＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ、ネオマイシン誘導体化抗生物質に対する耐性を付与する因子、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよびＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルを含む。
【００５０】
本発明における使用に適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ即時型初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイスルＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター、およびメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）を含む。特に好ましいプロモーターは、ウイルス性ＳＶ４０初期プロモーターである。
【００５１】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。そのような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８６））に記載されている。
【００５２】
宿主細胞に本発明の構築物を導入するための特に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションによる方法である。
【００５３】
高等真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサーを挿入することにより増加し得る。エンハンサーは、通常、１０から３００ｂｐの範囲の大きさのＤＮＡのシス作用エレメントであり、これは、所定の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増加するために作用する。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００〜２７０で複製開始点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００５４】
小胞体の内腔中、細胞膜周辺腔中、または細胞外環境中への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドの中に組込まれ得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るかまたは、このシグナルは異種シグナルであり得る。
【００５５】
このポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能的領域もまた含み得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加され、精製、または引き続く操作および保存のいずれかの間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善し得る。ペプチド部分はまた、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。
【００５６】
ＥＰＯタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。
【００５７】
本発明の細胞によって生成されるＥＰＯを精製するための好ましい方法は、以下の工程の組合わせによってＥＰＯを含む細胞培養上清を処理することを包含する：（ａ）示差的沈殿、（ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー、（ｃ）ダイアフィルトレーション、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｆ）分子排除クロマトグラフィー。好ましくは、これらの工程は以下の順番で行われる：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）。
【００５８】
本発明の細胞により生成されるＥＰＯを使用する好ましい方法は、疾患の処置のために、ヒトに注射するのに適切な形態への凍結乾燥を含む。詳細には、好ましい凍結乾燥手順は、以下を包含する：薬学的組成物中にＥＰＯを置く工程、第１のＥＰＯ組成物を容器中にロードする工程であって、ここでこの容器は−３０℃またはそれ未満の温度である、工程；大気圧下で４時間またはそれより長い時間、このＥＰＯ組成物を−３０℃またはそれ未満の温度でインキュベートする工程；この組成物を、３０絶対ミクロンかまたはそれ未満の圧力で、一時間かそれより長い時間インキュベートする工程；および、圧力値を５絶対ミクロンかそれ未満に保ちつつ、少なくとも２５℃に達するまで、一時間当たり３℃かそれ未満の温度を上昇させる工程。
【００５９】
凍結乾燥のために好ましい薬学的組成物は、ＥＰＯ、糖、塩およびヒトアルブミンを含む。凍結乾燥のために特に好ましい組成物は、ＥＰＯ、マンニトール、ＮａＣｌ、ＮａＨ2ＰＯ4およびＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを含む。
【００６０】
（核酸分子）
本発明の宿主細胞は、Ｌｉｎ，「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓ」、米国特許第４，７０３，００８号（本明細書中に参考として援用される）からのＥＰＯ核酸分子、およびその改変体を含むベクターを含み得る。改変体は、天然の対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、いくつかの改変形態の１つを意図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ、編。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて産生され得る。
【００６１】
このような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって産生されるものを含む。置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドを含み得る。改変体は、コード化領域または非コード化領域あるいはその両方で変えられ得る。コード化領域内での変更は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）置換、付加および欠失であり、これは、ＥＰＯタンパク質またはその一部の特性および活性を変えない。この点に関して特に好ましいのはまた、保存的置換である。最も非常に好ましいのは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＥＰＯタンパク質をコードする核酸分子である。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号１の完全アミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一性、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％同一性のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【００６３】
もちろん、遺伝的なコードの縮重のために、当業者は、直ちに、ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する多くの核酸分子は、「ＥＰＯタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の全ての各々の改変体およびあらゆる縮重改変体が同一のポリペプチドをコードするので、これは当業者には明らかである。当該分野において、縮重改変体ではないこのような核酸分子について、妥当な数もまたＥＰＯ活性を有するポリペプチドをコードすることがさらに認識され得る。これは、当業者が、タンパク質機能にほとんど有意には影響しそうにないまたは全く有意には影響しそうにないアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪性アミノ酸と第二の脂肪性アミノ酸との置換）に十分気づくからである。
【００６４】
例えば、いかに表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関する指導が、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者は、アミノ酸配列の寛容性を変化する研究に関する２つの主要なアプローチが存在することを示す。第一の方法は、変異が天然の選択によって受け入れられるか拒絶されるかのいずれかである進化のプロセスに依存する。第二のアプローチは、クローン化した遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を導入する遺伝子工学を用い、そして機能性を保存する配列を同定するために選択またはスクリーニングする。著者が述べるには、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に意外にも寛容性であることを明らかにした。著者はさらに、アミノ酸変化がタンパク質の特定の位置において許容性であるようであることを示す。例えば、ほとんどの埋没アミノ酸残基が非極性の側鎖を必要とするのに対して、表面側鎖のわずかな特徴が、一般的に補存される。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．、前出、およびその中に引用される参考文献に記載される。
【００６５】
本願発明は、以下に示す実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
ヒトゲノムＤＮＡの調製 １０ｍｌの血液を、臨床的に健康なヒト成人男性被験体から抽出し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む試験管に加えた。この血液を、５ｍｌのアリコートで、０．３Ｍ サッカロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００を含む４５ｍｌの溶液を加えた２つの５０ｍｌ 試験管へ移した。
【００６７】
次いでこの溶液を、氷上で１０分間インキュベートし、そして４℃で１，０００ ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む０．０７５Ｍ ＮａＣｌ溶液で数回リンスし、続いて４℃で１，０００ ｇで１０分間遠心分離した。
【００６８】
このようにして得られた結果の沈殿を、３ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）溶液中に再懸濁した。次いで、２００μｌの１０％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および５００μｌ Ｋプロテイナーゼ（１％ ＳＤＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８中に１ｍｇ／ｍｌ）を加え、そしてこの溶液を３７℃で一晩インキュベートした。各々の試験管への１ｍｌのＮａＣｌ飽和溶液の添加後、ゲノムＤＮＡを含む溶液を、２，５００ ｇで１５分間遠心分離した。
【００６９】
各々の上清を、１容量のイソプロパノールを加えた１５ｍｌの試験管へ移した。この試験管を転倒混和によって静かに混合し、ＤＮＡ沈殿が形成されるまで室温で保存した。次いでゲノムＤＮＡをカギ端のパスツール（ｈｏｏｋ−ｅｎｄ Ｐａｓｔｅｕｒ）ガラスピペットを用いて回収した。
【００７０】
ＤＮＡを２ｍｌの試験管に置き、１ｍｌの７０％エタノールを加えた。１分後、上清を捨て、そして沈殿を乾燥した。乾燥後、沈殿を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８−１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解した。
【００７１】
ＤＮＡ溶液の濃度を、溶液の１：１０００希釈の２６０ｎｍでの吸収度を測定することによって計算した。５０μｇのゲノムＤＮＡが１ＯＤユニットに等価であると仮定した。１μｌのＴＥ緩衝液あたり５００μｇのゲノムＤＮＡを含む溶液を調製した。
【００７２】
（実施例２ ＥＰＯ構築物の調製）
ＥＰＯ構築物を、実施例１において得られる５００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから調製した。以下のものを、０．５ｍｌの試験管に置かれた、実施例１に由来する１μｌの溶液に添加した：４００ｎｇのＥＰＯ１プライマーおよびＥＰＯ２プライマーの各々、２．５ｍＭの各々のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）水溶液、ならびに、製造業者によって推奨される緩衝液を用いた１００ｌの最終容量における、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。熱サイクラーを用いて、そして、３０サイクル：９３℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間にプログラムした。この反応から、ＥＰＯ遺伝子を含む約２，１７０塩基対のＤＮＡフラグメントを得た。
【００７３】
利用されたプライマーのヌクレオチド配列は、以下の通りであった： ＥＰＯ１：５’ＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号２）。このプライマーは、最初の塩基に対応し、そしてこの塩基は、ＸｈｏＩ酵素の認識部位、および５’末端のＥｃｏＲＩ酵素の別の認識部位とともに、ＥＰＯ遺伝子から翻訳された。これらの部位を、引き続くクローニング工程に用いた。
【００７４】
ＥＰＯ２：５’ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ３’（配列番号３）。このプライマーは、ＥＰＯ遺伝子の最後に翻訳された塩基、および停止コドンに対して相補的である。ＨｉｎｄＩＩＩ酵素の認識部位を、プライマーの３’末端に付加した。この部位を、引き続くクローニング工程に用いた。
【００７５】
得られたヌクレオチド配列は、以下の通りであった（配列番号４）：
【００７６】
【化１】
最初に翻訳されたａｔｇコドン、ならびにｔｇａ「停止」コドンに下線を引く。クローニングに利用した制限部位の配列を、太字のイタリックで示す。１つを超えるコドンが、同一のアミノ酸をコードし得、そして結果として、ＥＰＯタンパク質は、異なるｍＲＮＡ鋳型（異なるヌクレオチド配列を有するが、それにもかかわらず、ＥＰＯをコードする）から翻訳され得たことに注意しなければならない。
【００７７】
（実施例３ ＥＰＯ遺伝子のクローニングおよび配列決定）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを含む、約２，１７０塩基対のフラグメントを精製した。ＤＮＡ末端を、標準的な分子生物学技術に従って、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを用いた処理によって平滑末端化し、そしてＭ１３ｍｐ１８ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングした。得られた組み換えプラスミドを、ＸｈｏＩ酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて切断した。挿入物の存在を、臭化エチジウムを用いて染色した０．８％アガロースゲル中の制限フラグメントの電気泳動により、確認した。陽性のクローン（２つのバンド、一方は約２，２００塩基対を有し、そしてもう一方は、線状化されたベクターに対応する）を、選択した。挿入されたＥＰＯ遺伝子を、Ｔ７配列決定キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒの技術に従って、配列決定した。ＥＰＯ遺伝子のいくつかの領域を、自動３７０Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ配列決定装置を用いて、さらに配列決定した。各々の配列決定システムについては、製造業者に推奨されるプロトコルに従った。
【００７８】
（実施例４ 真核生物細胞に対するベクター）
（１． ｐＶｅｘ１ベクターの構築）
ｐＶｅｘ１ベクターを、以下の標準的な分子生物学技術により形成した。これは、以下から構成される： ａ． Ｅ．ｃｏｌｉにおけるベクターの増幅および選択のために、細菌の複製起点を有し、そして、アンピシリンに対する耐性を与える、細菌性ｐＢＲ３２２ベクターのフラグメント。
【００７９】
ｂ．ａ）からすぐ下流に、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターが続き、これは、このエレメントから３’にクローニングされた遺伝子の発現を可能にした。
【００８０】
ｃ．ｂ）からすぐ下流に、ＸｈｏＩクローニング部位およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位が続き、これは、発現されるべき遺伝子の挿入を可能にした。
【００８１】
ｄ．ｃ）からすぐ下流に、ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルが続き、これは、ｃ）においてクローニングされた遺伝子の特異的な転写物の適切なポリアデニル化を可能にした。
【００８２】
ｅ．ｄ）からすぐ下流に、ＴＫプロモーター、およびそのポリアデニル化シグナルを有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子が続く。これらのエレメントは、ネオマイシンおよびネオマイシンから誘導された抗生物質（例えば、ジェネティシン）の使用を通して、安定にトランスフェクトされた細胞の選択を可能にした。ｅ）の３’末端を、ａ）の５’末端に連結する。
【００８３】
ｐＶｅｘ１ベクターを、１９９９年４月１６日、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ１ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託し、そして登録番号ＤＳＭ１２７７６が与えられた。
【００８４】
（２． ｐＤＨＦＲベクター）
ｐＤＨＦＲベクターは、細菌における選択のために、アンピシリンに対する耐性を与える。このベクターは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするｃＤＮＡを包含し、このＤＨＦＲの発現レベルは、ＳＶ４０ウイルス初期プロモーターおよびそのポリアデニル化シグナルによって制御される。ｐＶｅｘ１−ＥＰＯ（実施例５を参照のこと）ベクターを用いて獲得されたＥＰＯ発現レベルは、増加した濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）を含む培養培地中での、ＤＨＦＲおよびＥＰＯ遺伝子の増幅によって、数倍に増強される。
【００８５】
このｐＤＨＦＲベクターを、１９９９年４月１６日、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ１ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託し、そして登録番号ＤＳＭ１２７７７が与えられた。
【００８６】
（実施例５ 発現ベクターへのＥＰＯコード遺伝子のクローン化）
実施例３に記載の通りにクローン化されたＥＰＯコード遺伝子を含むＭ１３ｍｐ１８クローンを、Ｘｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酵素で切断した。このようにして得られた、約２．２Ｋｂのフラグメントを単離し、そしてｐＶｅｘ Ｉベクターの同じ制限部位を使用して、再びクローン化した。ポジティブなｐＶｅｘ−ＥＰＯクローンを単離し、そして分析して、このＥＰＯコード配列配列番号４はクローン化する手順の間変化しないことが示された。
【００８７】
上記実施例を、従来の分子生物学の技術により、実行した。Ｂｒｏｗｎ、「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９５）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２版」、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）；Ｄａｖｉｓら、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）を参照のこと。
【００８８】
（実施例６ 同時トランスフェクションおよび増幅）
ＤＨＦＲ酵素遺伝子が欠損した（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-）、変異誘発したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株を、ＭＴＸを用いた遺伝子の増幅を促進するために使用した。全プロセスの間、細胞を、３７℃、５％のＣＯ2雰囲気中で、増殖させた。
【００８９】
このＣＨＯ細胞をリン酸カルシウム技術に従って、直径９０ｍｍのペトリ皿を用いて、同時トランスフェクトした。これは以下の通りであった： （１）培養培地（１０％のウシ胎仔血清を伴う、α−ＭＥＭ）をトランスフェクションの４〜８時間前に新しい培地と置換した。
【００９０】
（２）１０ｇ／ｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）溶液の５００μＬ、１６ｇ／ｌのＮａＣｌの５００μＬ、３５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4の１０μｌおよび３５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4溶液の１０μｌを５ｍｌの試験管へ加えた。
【００９１】
（３）別の１．５ｍｌ試験管の中へ、６０μｌの２ＭのＣａＣｌ2および１０μｇの各々のトランスフェクトされるＤＮＡベクター（ｐＶｅｘ−ＥＰＯおよびｐＤＨＦＲ）を有する溶液を加えた。５００μｌの最終の容量に到達するまで、水を加えた。実施例２に記載のｐＤＨＦＲプラスミドは、アンピシリン耐性である、ｐＢＲ３２２プラスミドに基づく。ｐＤＨＦＲプラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で複製され得、そしてＳＶ４０の初期プロモーターとそのターミネーターとの間でクローン化されたＤＨＦＲ遺伝子を有する。ｐＤＨＦＲプラスミドは、ＣＨＯ細胞におけるＤＨＦＲタンパク質の発現を、コードする。このタンパク質は、メトトレキセートに対する抵抗性を与え、それゆえ、高いエリスロポイエチン生産性を示す細胞を選択するように使用され得る。
【００９２】
（４）ＤＮＡおよびＣａＣｌ2を含むこの溶液を、ＨＥＰＥＳを含む試験管へ気泡を泡立てながら一滴ずつ加えて迅速な混合を得、そして局部濃度を最小にした。この方法は、この細胞によってより効果的に組み込まれる、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含む非常に小さな粒子の形成を促進した。
【００９３】
（５）この溶液を３０分間静置し、そして次いでこの細胞を含むペトリ皿へ加えた。
【００９４】
（６）この溶液を穏やかに振ることにより、細胞間で分配した。この細胞を、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下、インキュベーター中で一晩放置した。
【００９５】
（７）細胞をＰＢＳ緩衝液（８ｇのＮａＣｌ；０．２ｇのＫＣｌ；１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇのＮａＨ2ＰＯ4、１リットルになるように水を加え、そしてｐＨをＨＣｌで７．４へ調整した）で２回リンスした。新しい培養培地を次いで加えた。
【００９６】
６００ｇ／ｍｌの濃度でジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）を用いた選択を、トランスフェクションの後、２４時間で始めた。ｐＶｅｘ−ＥＰＯプラスミドを組み込んだ細胞は、この抗生物質に抵抗し得、一方で、他の全ては、２５日後に死亡した。抵抗性コロニーを選択し、そしてそれらの生産性をアッセイした。最も生産的な３つのクローンを、単離されたクローンから選択した。
【００９７】
本発明において使用された遺伝子の構成を利用して、１０-8Ｍ、１０-7Ｍ、１０-6Ｍおよび１０-5Ｍの濃度で、第２の選択試薬としてＭＴＸを使用して、選択を３つのクローンの各々に対して実行した。その目的のために、培養培地をヌクレオチドを伴わない、１０％の透析したウシ胎仔血清を補充したα−ＭＥＭに交換した。以下のプロトコルに従って透析プロセスを実行することが必須である：１００ｍｌの血清を３，０００Ｄａカットオフ（より高いカットオフを用いると、増殖因子が失われ得、そしてこの細胞が増殖および繁殖し得ない）を有する透析バッグ中に入れ、このバッグを密閉して閉じ、５リットルの２回蒸留した水を有する容器中に完全に浸し、そして４℃で、１２時間撹拌しないで放置した。この工程の後、この水を捨て、そして交換し、このバッグを４℃でさらに１２時間放置した。次いでこの透析バッグを取り出し、そしてこの血清を回収した。より短い期間の、より少ない容量を用いるまたは水の交換を伴わない透析は効果的でない。なぜなら、この血清中の任意のわずかなヌクレオチドが、ＭＴＸ選択に悪影響を与えるからである。他方では、より長い期間の透析もまた効果的でない。なぜなら、細胞の増殖に必要ないくつかのタンパク質が沈降して、細胞の成熟を妨げ得るからである。
【００９８】
（実施例７ 高生産性クローンの単離）
１０-7および１０-6ＭのＭＴＸにおいて増殖したクローンを単離し、そしてヌクレオチドを伴わない、１０％の透析したウシ胎仔血清を補充した新しいα−ＭＥＭ中で増殖させた。一旦増殖したら、培養の上清みを、ＥＰＯの生成および分泌についてアッセイした。その目的のために、特異的イノムアッセイを使用した。
【００９９】
上記のプロセスは、１日につき５０，０００μｇのエリスロポイエチン／培養培地のリットルを生成する、組換え宿主細胞のクローンの選択で、終了した。
【０１００】
本実施例で記載された組換え宿主細胞は、１９９９年４月１６日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託され、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７が与えられた。
【０１０１】
この細胞における転写プロセスの有効性を、実施例８に記載される通りに確認した。得られたタンパク質の配列を、実施例９に記載の手順に従って同定した。
【０１０２】
（実施例８ 組換え細胞によって産出された特異的メッセンジャーＲＮＡ配列の検証）
（１．細胞からのＲＮＡの調製）
全ＲＮＡを、以下のプロトコルに従って、ＥＰＯ産出細胞から調製した： コンフルエントの細胞を含む直径９０ｍｍのペトリ皿を、１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２ｍｌのＧＴＣ緩衝液を添加し、そしてこの皿一面に均等に分布させた。このＧＴＣ緩衝液は：５０ｇのグアニジニウムチオシアネート；０．５ｇのＮ−ラウロイルサルコシン、２．５ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．７ｍｌのβ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｌの３０％消泡材（ＳＩＧＭＡ）および１００ｍｌにするに足る水（ｐＨ７．０）、から構成される。
【０１０３】
次いで細胞を溶解した。この溶解物は高粘性の溶液を生じた。この溶液を、１５ｍｌの試験管に移し、そして上記の工程を２ｍｌのＧＴＣ緩衝液を使用してもう１度繰り返した。
【０１０４】
この１５ｍｌの試験管を、ＤＮＡを切断するために１分間激しく攪拌した。次いで塩化セシウム勾配を行った。この目的のために、４ｍｌの、ＣｓＣｌを含む溶液（９５．９７ｇのＣｓＣｌおよび２．５ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム、（ｐＨ５．４）、そして体積が１００ｍｌに達するまで水を加えた）を超遠心分離試験管に加えた。次いでこの溶液の上に、混合することなく、細胞のＧＴＣ懸濁液を加えた。この試験管を次に、ＧＴＣ緩衝液で満たし、そして２０℃で２０時間、３１，０００ｒｐｍで超遠心分離した。
【０１０５】
超遠心分離の間、ＲＮＡは試験管の底に沈殿してペレットを形成し、そして得られたＤＮＡは塩化セシウム勾配の中央にバンドを示した。上清を、ＤＮＡを完全に除去するために廃棄した。ＲＮＡ含有ペレットを５分間乾燥させ、次いで２００μｌの水に溶解し、そして１．５ｍｌの試験管に移した。次いで２００μｌの０．４Ｍ酢酸ナトリウム、（ｐＨ４．８）および２倍の体積のエタノールを加え、この生じた溶液を完全に混合し、そして−８０℃で３０分間静置した。次いでこの溶液を１４，０００ｒｐｍにて１５分間微小遠心分離機で遠心分離し、上清を廃棄し、そして沈殿を１ｍｌの８０％エタノールですすいだ。このペレットを乾燥し、１００μｌの水に再溶解した。このＲＮＡ溶液の１：１００希釈溶液の濃度を、２６０ｎｍで測定した（１ＯＤ単位が約４０μｇのＲＮＡに相当する）。使用された全ての溶液および要素にはＲＮａｓｅが無かった。
【０１０６】
（２．ｃＤＮＡの調製）
特異的ｃＤＮＡを、その目的のために意図されたキットの指示に従って調製した（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｃａｔ．ＲＰＮ１２５６）。ＥＰＯ ２が使用したプライマーであった。
【０１０７】
（３．ＥＰＯをコードするｃＤＮＡのクローニング）
このように得られたｃＤＮＡの５％を、ＥＰＯ ２およびＥＰＯ ３オリゴヌクレオチドをそれぞれ４００ｎｇ、適切な緩衝溶液中のデオキシヌクレオチドをそれぞれ２．５ｍＭ、および２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを、全体積１００μｌで使用して、増幅した。３５回の増幅サイクルを、以下のように行った：９３℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間。
【０１０８】
ＥＰＯ ３を，ＥＰＯ １およびＥＰＯ ２について記載したように合成し、そしてその配列
【０１０９】
【化２】
は、ＥＰＯ ｃＤＮＡをコードする最初の２０塩基に相当し、Ｅｃｏ ＲＩ酵素の認識のための１つの部位である。Ｅｃｏ ＲＩ酵素認識部位を、次のクローニング工程を容易にするために付加した。
【０１１０】
約６００塩基対のフラグメントが得られ、そしてＭ１３ｍｐＩ８およびＭ１３ｍｐＩ９ベクター中にクローニングした。Ｓａｎｇｅｒの配列決定方法を使用して、完全な配列を得るために両方向で、インサートを配列決定した。
【０１１１】
この遺伝子のいくつかの領域の高い自己相補性（これは、放射能写真において多くの非常に不明瞭な圧縮を生じる）のために、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する配列決定キットおよび修飾塩基を使用した。低い品質結果が得られたが、圧縮は分離された。使用したキットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧｅｎｅ ａＴａｑであった。
【０１１２】
ヒトエリスロポイエチンｃＤＮＡの完全配列を単離し、そしてクローニングし、ＥＰＯのコードを示した。結果として、細胞においてクローニングされた遺伝子およびその転写産物は、完全であり、その配列はＥＰＯについて正確であることを見出した。
【０１１３】
（実施例９ ＥＰＯ産物の分析）
前記の実施例に例示されるように、宿主細胞を培養することによって得られたＥＰＯを、種々の品質および同定アッセイを行うためにさらに精製した。
【０１１４】
変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、ＥＰＯについて予想されたように、このＥＰＯは、３０ｋＤａを越える分子量の広いバンドとして同定された。図１を参照のこと。このバンドは、ＥＰＯについて予想されたように、「ウェスタンブロット」アッセイにおいて、ヒトＥＰＯに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体によって認識された。図２を参照のこと。グリカナーゼによる処理は、ＥＰＯについて予想されたように、範囲およびサイズにおいてグリコシド鎖の存在を証明した。図３を参照のこと。産生されたＥＰＯは、ＥＰＯについて予想されたように、３．０から４．５の等電点の範囲の種のシリーズから構成されることが示された。図４を参照のこと。
【０１１５】
トランスフェクトされた細胞株の培養上清から精製された、単離されたタンパク質の完全なアミノ酸配列は、天然ヒトエリスロポイエチンと全くの相同性を示した。天然ヒトエリスロポイエチンの１６５のアミノ酸配列は、以下の通り（配列番号１）である：
【０１１６】
【化３】
この１６５のアミノ酸鎖に沿った４つのグリコシル化部位、および複雑な炭化水素構造、ならびに特に、ＥＰＯに特徴的なシアリン酸末端残基の存在が、証明された。これらの結果は、産生されたタンパク質の生物学的活性アッセイ、国際ＥＰＯ標準と完全な一致を示した低酸素性多血症マウス試験によって、さらに支持された。
【０１１７】
特異的な免疫学的アッセイによって測定された、達成された生産性は、１日あたり培養培地１ｌにつき５０ｍｇＥＰＯであった。
【０１１８】
本明細書中上記の全ての刊行物は、本明細書によりその全体が参考として援用される。
【０１１９】
前述の発明は、明瞭さおよび理解の目的のために、いくらか詳細に記載されたが、本発明および添付の特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細における多様な変化がなされ得るということが、本開示を読むことにより当業者に理解される。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
【表３】
寄託：ＭＣ２ ２０ ２２／１２／９８ 登録番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７ １頁 （オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０１２３】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求する。
【０１２４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１２５】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および登録委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１２６】
（アイスランド）
出願人はここにおいて、出願が（アイスランド特許庁（ｔｈｅ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０１２７】
寄託：ＭＣ２ ２０ ２２／１２／９８ 登録番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７ ２頁 （オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０１２８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１２９】
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１３０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３１】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１３２】
寄託：ｐＤＨＦＲ 登録番号：ＤＳＭ １２７７７ １頁 （オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０１３３】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求する。
【０１３４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３５】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および登録委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３６】
（アイスランド）
出願人はここにおいて、出願が（アイスランド特許庁（ｔｈｅ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０１３７】
寄託：ｐＤＨＦＲ 登録番号：ＤＳＭ １２７７７ ２頁 （オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０１３８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１３９】
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１４０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４１】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１４２】
寄託：ｐＶｅｘ１ 登録番号：ＤＳＭ １２７７６ １頁 （オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０１４３】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求する。
【０１４４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４５】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および登録委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４６】
（アイスランド）
出願人はここにおいて、出願が（アイスランド特許庁（ｔｈｅ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０１４７】
寄託：ｐＶｅｘ１ 登録番号：ＤＳＭ １２７７６ ２頁 （オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０１４８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１４９】
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０１５０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに複製された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０１５１】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供給は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターを含む宿主細胞であって、該ベクターは、以下：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる、エリスロポイエチンポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列（ｂ）ウィルスプロモーター；および（ｃ）ウィルスターミネーターを含む、宿主細胞。
【請求項２】
ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７として寄託される、宿主細胞。
【請求項３】
前記ウィルスプロモーターおよびウィルスターミネーターがＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターおよびターミネーターを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記ベクターがｐＶｅｘ１を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
ｐＤＨＦＲベクターをさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞がネオマイシン誘導抗体およびメトトレキサートに対して耐性である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｏ−Ｇ２または他の哺乳動物細胞を含む群から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞がＣＨＯまたはＣＯＳ細胞を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＥＰＯポリペプチドを生産するための方法であって、該ポリペプチドが発現かつ回収される条件下で請求項１に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する方法。
【請求項１２】
前記条件がメトトレキサートへの曝露を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養が一日当たりの培養培地１リットル当たり５０ｍｇより多くのＥＰＯを生産する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列がヒト白血球から得られる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１】
ベクターを含む宿主細胞であって、該ベクターは、以下：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる、エリスロポイエチンポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列（ｂ）ウィルスプロモーター；および（ｃ）ウィルスターミネーターを含む、宿主細胞。
【請求項２】
ＤＳＭ ＡＣＣ２３９７として寄託される、宿主細胞。
【請求項３】
前記ウィルスプロモーターおよびウィルスターミネーターがＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターおよびターミネーターを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記ベクターがｐＶｅｘ１を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
ｐＤＨＦＲベクターをさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞がネオマイシン誘導抗体およびメトトレキサートに対して耐性である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｏ−Ｇ２または他の哺乳動物細胞を含む群から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞がＣＨＯまたはＣＯＳ細胞を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＥＰＯポリペプチドを生産するための方法であって、該ポリペプチドが発現かつ回収される条件下で請求項１に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する方法。
【請求項１２】
前記条件がメトトレキサートへの曝露を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養が一日当たりの培養培地１リットル当たり５０ｍｇより多くのＥＰＯを生産する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列がヒト白血球から得られる、請求項１に記載の宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２１３６９９（Ｐ２０１０−２１３６９９Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−５９８９６（Ｐ２０１０−５９８９６）
【出願日】平成２２年３月１６日（２０１０．３．１６）
【分割の表示】特願２０００−５８１２３２（Ｐ２０００−５８１２３２）の分割
【原出願日】平成１１年１１月８日（１９９９．１１．８）
【出願人】（５０１１７７３２２）スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５９８９６（Ｐ２０１０−５９８９６）
【出願日】平成２２年３月１６日（２０１０．３．１６）
【分割の表示】特願２０００−５８１２３２（Ｐ２０００−５８１２３２）の分割
【原出願日】平成１１年１１月８日（１９９９．１１．８）
【出願人】（５０１１７７３２２）スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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