組織低酸素症の体液マーカー
本発明は、哺乳類対象における組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、もしくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングする、方法及びキットを提供する。前記哺乳類対象由来の体液試料中の酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片のレベルは、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候に関する情報を提供するために測定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類対象における組織低酸素症又は組織低酸素症に起因する臨床症候の１又は複数のマーカーを体液において検出及び測定することに関する。特に、本発明は、哺乳類対象の組織低酸素症又は組織低酸素症に起因する臨床症候の診断及び／又は予後診断における、酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又は該タンパク質に由来するペプチド断片単独での検出又はさらなるマーカーと組み合わせた検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患及び心不全は世界中で重大な健康問題となっているが、これらの症状を効果的に診断し管理する手段は現在のところ乏しいものである。
【０００３】
慢性心不全
慢性心不全（ＣＨＦ）は、高齢化が進んだ産業社会においてますます重大なヘルスケア問題となっている代表的な臨床症候である。心不全の場合の入院率は、過去２０年間にわたり顕著に増加しており、ＣＨＦは予後不良であり、クオリティーオブライフが低い。ＣＨＦの直接費は、ヘルスケア支出のおよそ１〜２％にのぼり、その大半が入院関連である。
【０００４】
慢性心不全は、左室の収縮機能障害（ＬＶＳＤ）の結果起こることが最も多い。Ｇｌａｓｇｏｗ（ＭｃＤｏｎａｐｈ，ら、Ｌａｎｃｅｔ １９９７；３５０：８２９−８３３１）及びＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ（Ｄａｖｉｅｓ，ら、Ｌａｎｃｅｔ ２００１：３５８：４３９−４４４）のスクリーニング研究において、確定的なＬＶＳＤの罹患率はそれぞれ、２．９％及び１．８％であることが示された。両研究において、事例の半分が無症候性であった。ＬＶＳＤを有する患者を同定することにより、個々の患者がクオリティーオブライフを向上させ予後を良好にするための適切な治療を行うことが可能となる。心エコー検査は、ＬＶＳＤ及び心不全の診断の際に現在最も頻繁に用いられる検査である。
【０００５】
ＣＨＦの病態生理学は、カテコールアミン、レニン−アンジオテンシン、エンドセリン、心房及び脳性ナトリウム利尿ペプチド系を含む、多くの神経ホルモン系の活性化を伴う。これらの系には、適応的に活性化されるものも（ナトリウム利尿ペプチド系）あれば、急性状態下では適応的であるが、特に慢性状態において維持される場合には不適応となる（エンドセリン、レニン−アンジオテンシン及びカテコールアミン系）ものもある。ナトリウム利尿ペプチドホルモンの分泌増加は、ＣＨＦを診断する手段として利用されてきた（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５１：９−１３；Ｈｏｂｂｓ，ら、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ ２００２；３２４：１４９８−１５０２）。ＬＶＳＤの検出のためには、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、Ｎ末端プロ心房ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＡＭＰ）より優れた診断ツールである（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５１：９−１３）。さらに、ＢＮＰの前駆体に由来する別のペプチド、すなわちＮ末端プロＢＮＰ（Ｎ−ＢＮＰ）も、ＬＶＳＤ同定のための適切な代替物である（Ｈｏｂｂｓ，ら、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ ２００２；３２４：１４９８−１５０２）。両ケースとも、その試験の陰性的中率は高く、ＣＨＦを除外する際に有用であることが示唆される。多くの場合、ＣＨＦの原因は虚血性心疾患である。さらに、慢性期にわたる心拍出量の減少により、組織循環不全及び相対的組織低酸素症が起こることとなる。
【０００６】
しかし、組織が低酸素であるときに誘導され分泌される血漿中の指標は、心疾患の診断及び予後診断に大いに役立ち、これらの疾患のモニタリングにさらに役立つであろう。
【０００７】
虚血性心疾患
虚血性心疾患は、先進国における重大な健康負担であり、その主要な原因はアテローム性動脈硬化症である。マクロファージ及び他の細胞とともに、脂質、特に酸化又は変性したＬＤＬが蓄積することによって、プラークが成長し不安定となる。
【０００８】
酸素調節タンパク質ＯＲＰ１５０及び小胞体における分子シャペロンとしてのその役割
酸素調節タンパク質ＯＲＰ１５０は、元来、低酸素状態にした星状細胞からクローニングされたシャペロン小胞体関連タンパク質である（Ｋｕｗａｂａｒａ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６；２７１：５０５２−３２）。ラット星状細胞、ヒト大動脈心筋細胞及び単核白血球においてこのタンパク質を誘導したところ、低酸素症に対して特異性を示したが、グルコース欠乏、過酸化水素、ツニカマイシン又は熱ショック等の他のストレス性刺激に対しては特異性を示さなかった（Ｋｕｗａｂａｒａ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６；２７１：５０５２−３２；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。さらに、ヒトアテローム性動脈硬化病巣から調製した組織抽出物において調べたところ、ＯＲＰ１５０のｍＲＮＡ及びタンパク質発現が増加しており、ほとんどのｍＲＮＡがマクロファージで観察された（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。ＯＲＰ１５０は、アテローム性動脈硬化症の血管壁の細胞において分子シャペロンとして機能し、低酸素症が起こっている細胞の小胞体（ＥＲ）に主に存在すると思われる（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。血管疾患の危険因子として知られている酸化又はアセチル化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が存在する場合、その発現がさらに促進され得る（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。アンチセンスオリゴヌクレオチドでその発現を低下させると、低酸素による損傷に対する単核食細胞の感受性が高まることから、その機能には、低酸素症により誘導される損傷に対する保護効果が含まれている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。
【０００９】
最近、ヒトＯＲＰ１５０のクローニングにより、Ｃ末端に小胞体（ＥＲ）残留シグナルを有する９９９残基の推定アミノ酸配列が明らかとなった（Ｉｋｅｄａ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９７；２３０：９４−９）。この配列は、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ１７０）及びヒートショックタンパク質（ＨＳＰ７０）等の他のストレス誘導性タンパク質とある程度のホモロジーを有する。この配列はＥＲに存在することから、特に低酸素状態において、タンパク質の折りたたみ及び成熟のための分子シャペロンとしての役割が示唆される。例えば、腎臓細胞ＯＲＰ１５０アンチセンス形質転換体の場合、糖タンパク質ＧＰ８０の成熟が遅れ、ＧＰ８０がＥＲに蓄積するので、エネルギー欠乏状態にある細胞のＥＲ内でのタンパク質成熟及び輸送におけるＯＲＰ１５０の役割が示された（Ｂａｎｄｏ，ら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０００；２７８：Ｃ１１７２−８２）。
【００１０】
血管疾患におけるＯＲＰ１５０の機能に関する証拠は、マウスの発作モデルに対する観察から得られる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９８；６０：９８−１０６；Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。脳虚血のマウスモデルにおいて、虚血を起こしエネルギーが欠乏している部位においてでさえも、低酸素状態のニューロンでＯＲＰ１５０ ｍＲＮＡ及びタンパク質が急激に誘導された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９８；６０：９８−１０６）。虚血状態のヒトの脳では、ニューロンでのＯＲＰ１５０発現はわずかずつしか誘導されなかったが、星状細胞においてはＯＲＰ１５０が顕著に誘導された（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。ＯＲＰ１５０を過剰発現しているニューロンは、低酸素ストレスに対して抵抗性を有し、ニューロンでＯＲＰ１５０を過剰発現するように遺伝子操作を施したマウスは、虚血ストレス下で起こす発作が小さかった（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。細胞保護作用は、カスパーゼ−３様の活性の抑制及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の促進に関連しており、このことから、低酸素状態での細胞保護作用におけるＯＲＰ１５０に対する役割が示された（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３１０）。さらに、ＯＲＰ１５０アンチセンスＲＮＡを過剰発現するようにトランスフェクションした星状細胞又は細胞株は、低酸素状態のストレスに対して感受性が増加し、アポトーシスが引き起された（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３；Ｏｚａｗａ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：６３９７−４０４）。
【００１１】
血管疾患におけるＯＲＰ１５０に関する役割を示唆する他の証拠は、血管形成に関連するものである（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９８；７８：６９９−７０６；Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３；Ｏｚａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０は腫瘍中に発現され、宿主組織に浸潤した細胞中で高い発現を示す（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。浸潤には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、血管形成因子として知られている）及びＯＲＰ１５０の共発現を伴うことが多く（Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３）、アンチセンスＯＲＰ１５０をトランスフェクションした腫瘍細胞は浸潤を起こしにくく（Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３）、ＶＥＧＦは成熟不全となり、その結果ＥＲへの蓄積が起こる（Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３）。創傷では、血管新生にＶＥＧＦ及びＯＲＰ１５０の両者の発現が伴う（Ｏｚａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０を運ぶアデノウイルスを局所的に投与すると、その部位で、創傷の修復、新しい血管形成及びＶＥＧＦ発現が促進される（Ｏｚａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０発現を低下させるよう操作したマクロファージでは、ＶＥＧＦの成熟に欠陥があり、ＶＥＧＦがＥＲに蓄積するが、ＯＲＰ１５０を過剰発現させると、ＶＥＧＦ産物をうまく搬出し、分泌できるようになる（Ｏｚａｗａ，ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０発現で血管形成が促進されることにより、低酸素ストレス下でのアポトーシス抑制に対するＯＲＰ１５０の別の細胞内効果から示される細胞保護物質としてのその役割がさらに裏付けられるであろう。
【発明の開示】
【００１２】
第一の局面において、本発明は、哺乳類対象由来の体液試料中の第一のマーカーレベルを測定することを含み、前記第一のマーカーが酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片である、前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングする、方法を提供する。
【００１３】
組織低酸素症の状態では、組織中のＯＲＰ１５０発現が上昇し得る。ＯＲＰ１５０タンパク質は、小胞体に付随しており、分泌されないと予想されている。しかし、本発明者らは、予想外にもＯＲＰ１５０又はＯＲＰ１５０由来のペプチド断片を細胞外で（イムノアッセイを用いて、ヒト血漿中に）検出することができることを見出し、ＣＨＦの診断及び予後診断に対するマーカーとしての有用性を示すことができた。さらに、ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片が、心不全及び虚血性心疾患（例えば心筋梗塞）の患者では健常者よりも高いレベルで血漿中に検出された。従って、これらのマーカーの測定は、心不全の存在に関する診断補助及び心不全の重篤度を評価するための診断補助として有用である。
【００１４】
ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片はまた、虚血性心疾患又は急性冠不全症候群の患者の予後の評価に有用であり得るが、特に心筋梗塞後に、心不全による死亡リスク又は再入院リスクが高い患者においてそのペプチドのレベルが上昇する。
【００１５】
本明細書において使用される「組織低酸素症」という用語は、組織又は器官において酸素供給が正常レベル以下に低下することを意味する。酸素供給の低下は、赤血球数減少、肺における酸素化不全（つまり、酸素圧低下、肺機能の異常、気道閉塞又は心臓における右−左シャント）、ヘモグロビンの酸素放出能低下、細動脈閉塞、血管収縮、静脈流出量の減少又は動脈血流入低下の結果起こる、酸素利用、運搬又は流れの減少により生じ得る。「低酸素症の徴候となる臨床症候」という用語は、組織低酸素症の結果として起こる、又は結果として組織低酸素症を引き起こす、あらゆる進行ステージの病態又は状態を意味する。従って、本用語には、虚血；虚血のプロセス；細胞壊死を引き起こす組織損傷；慢性心不全；虚血性心疾患、心筋梗塞及び他の急性冠不全症候群等における急性冠循環閉塞（例えば、非ＳＴ上昇心筋梗塞及び不安定狭心症）；アテローム性動脈硬化症に起因する臨床症候；発作；大動脈瘤；末梢血管性疾患；慢性肺疾患；及び腫瘍などの症状が含まれる。
【００１６】
本発明において、ＯＲＰ１５０の断片は、ＯＲＰ１５０に特有のアミノ酸配列を有するＯＲＰ１５０タンパク質の断片である。ヒトＯＲＰ１５０に対するアミノ酸配列は、図１６に示されており（ＮＣＢＩ ｄｅｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＣ５０９４７，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿００６３８０）、本明細書において使用される「ＯＲＰ１５０」には、その変異体及び対立遺伝子多型が含まれる。前記断片は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸であり得るが、６アミノ酸という短いものであり得る。ある実施形態において、前記断片は、配列ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭを含み、又は該配列から成る。前記断片は、６〜８、６．５〜７．５、６．７〜７．４、１〜４、１．５〜３．５又は１．８〜３．３ｋＤの範囲の分子量を有し得る。分子量は、ゲル電気泳動又はサイズ排除クロマトグラフィー等の当業者に公知の手段によって測定することができる。
【００１７】
本発明において、ＯＲＰ１５０は、血漿、又は間質液、尿、全血、唾液、血清、リンパ液、胃液、胆汁、汗並びに脳及び脊髄液等の哺乳類の体から取得できる他の体液中で、検出することができる。体液には、処理を施してもよく（例えば血清）、又は処理を施さなくてもよい。前記哺乳類対象はヒトであり得る。
【００１８】
ＯＲＰ１５０又はその断片の測定レベルは、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標となるＯＲＰ１５０レベルと比較し得る。このレベルは、組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例又は複数例の哺乳類対象から得たＯＲＰ１５０又はその断片のレベルであるか、又はそのような哺乳類対象中のＯＲＰ１５０又はその断片について予め決定された基準範囲であり得る。このようにして、問題となる状態のない対象の集団的研究から決定された標準レベルと前記レベルとを比較して、診断又は予後診断を行うことができる。このような対象は、年齢及び／又は性別を一致させ得る。ある実施形態において、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標となるＯＲＰ１５０のレベルは、１〜５．７ｆｍｏｌ／ｍｌの範囲であり得る。組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候の指標となるＯＲＰ１５０のレベルは、９５６ｆｍｏｌ／ｍｌ以上の範囲であり得る。本発明が組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に行われた治療の効果のモニタリングに関与する場合には、ＯＲＰ１５０又はその断片の測定レベルを、その対象の基準レベルと比較することができる。基準レベルは、治療開始前に決定することができる。この基準レベルとの差異から、低酸素状態が増加又は減少しているかどうか、つまり、治療が効果的であるかどうかが示される。ＯＲＰ１５０又はその断片のレベルの上昇は、組織低酸素症を示し、逆もまた同様である。
【００１９】
本発明の方法では、哺乳類対象において組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候の指標となる第二のマーカーを測定することができる。組織低酸素症の徴候となる臨床症候は、心不全又は虚血性心疾患であり得る。この例において、本発明の方法は、さらに、心不全又は虚血性心疾患の指標となる第二のマーカーのレベルを測定することを備え得る。第二のマーカーは、天然の心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ−Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９０，７０：６６５参照）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びＣ−タイプナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−Ｓｔｉｎｇｏら、Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２，２６３：Ｈ１３１８参照）、それらの一部、変異体又はキメラを含む、ナトリウム利尿ペプチドであり得る。好ましいナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）である。左室の心筋細胞からのプロＢＮＰ（２種類の循環体、ＢＮＰ（活性ペプチド）及びＮ−ＢＮＰ（不活性ペプチド）に対するインタクトな前駆体）の放出及びＢＮＰの産生の増加は、心筋の引き伸ばし、心筋の伸張及び心筋の損傷が引き金となることによって起こる。ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片は、虚血性心疾患又は急性冠不全症候群の患者の予後を評価する際に、ナトリウム利尿ペプチドと組み合わせて用いることは有用であり（例えば、Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド又はＮ−ＢＮＰ）、心筋梗塞後、ペプチドを組み合わせて使用することは、死亡に関する患者の重症度分類を行うのに有用である。
【００２０】
第一のマーカーであるＯＲＰ１５０又はその断片と同様に、第二のマーカーのレベルを測定して、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことを示す第二のマーカーのレベルと比較し得る。このレベルは、組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例もしくは複数例の哺乳類対象から得た前記第二のマーカーのレベルであるか、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない哺乳類対象における前記第二のマーカーに対して予め決定された基準範囲であり得る。組織低酸素症のリスクが高いことを示すＢＮＰ又はＮ−ＢＮＰレベルは、５．７ｆｍｏｌ／ｍｌ以上であり得る。
【００２１】
マーカーレベルは、濃度、質量、モル数、体積又は存在するマーカーの量を示す他の任意の測定単位で表し得る。第一及び第二のマーカーのそれぞれのレベルは、イムノアッセイ、つまり、マーカーに特異的に結合する抗体を利用したアッセイを用いて測定し得る。このようなアッセイは、競合的又は非競合的イムノアッセイであり得る。同種であれ異種であれ、このようなアッセイは、本分野において周知であり、ラテックス又は金粒子、蛍光部分、酵素、電気化学的に活性な物質等の検出可能物質で標識されている抗体等の特異的な結合パートナーと、検出すべき検体を結合させる。あるいは、上記の検出可能な物質のいずれかで前記検体を標識して、一定量の特異的抗体と競合させることができる。その後、標識の存在又は濃度を検出することにより検体の存在又は存在する検体の量を決定する。ＥＰ２９１１９４に記載されているラテラルフローイムノアッセイ等、実験室用分析装置又は治療場所もしくは家庭用のテスト装置を用いて従来の方法において、このようなアッセイを行うことができる。
【００２２】
ある実施形態では、マーカーが存在する場合に免疫特異的結合が起こりうるような条件下で、試験対象由来の試料を適切な抗体と接触させ、該抗体による何らかの免疫特異的結合の量を検出又は測定することにより、イムノアッセイを行う。最低約１０分間、３０分間、１時間、３時間、５時間、７時間、１０時間、１５時間又は１日、前記抗体を試料に接触させ得る。ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合反応アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイ等の技術を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系を含む、あらゆる適切なイムノアッセイを用いることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
例えば、２段階サンドイッチアッセイ法により、体液試料においてマーカーを検出することができる。第一の段階において、マーカーを捕捉するために、捕捉試薬（例えば、抗−マーカー抗体）を用いる。捕捉試薬は、場合によっては、固体相に固定することができる。第二の段階において、直接又は間接的に標識された検出試薬を使用して、捕捉されたマーカーを検出する。ある実施形態において、検出試薬は抗体である。別の実施形態において、検出試薬はレクチンである。
【００２４】
ある実施形態において、体液試料中に十分なマーカーが存在することにより、ラテラルフローアッセイの捕捉ゾーンにおいて「サンドイッチ」相互作用の形成を引き起こすサンドイッチ方式では、ラテラルフローイムノアッセイ装置を使用することができる。本明細書中において使用される捕捉ゾーンは、ＯＲＰ１５０及び本明細書中に記載されている他のマーカーを捕捉するのに適した、抗体分子、抗原、核酸、レクチン及び酵素等の捕捉試薬が含有し得る。捕捉ゾーンにおける捕捉に適した１つ又は複数の発光標識を本装置に組み込んで、検体の存在により捕捉の程度が決定されるようにすることができる。適切な標識には、ポリスチレンミクロスフィアに固定化された蛍光標識が含まれる。捕捉ゾーンで捕捉することができるようにするために、ミクロスフィアを免疫グロブリンで被覆し得る。
【００２５】
本発明の方法において使用し得る他のアッセイには、フロースルー装置が含まれるが、これに限定されない。
【００２６】
フロースルーアッセイにおいて、ある試薬（通常は抗体）を、膜表面上の所定の領域に固定化する。次に、装置を通して試料体積を送り込むために、リザーバーとして働く吸着層上にこの膜を重ねる。固定化後、非特異的相互作用を最小限に抑えるよう、その膜上のタンパク質結合部位の残余をブロックする。本アッセイを用いる場合、抗体に特異的なマーカーを含有する体液試料を膜に添加し、マトリックスを介して濾過し、固定化された抗体にマーカーが結合できるようにする。必要に応じて実施される第二の段階において（第一の反応物質が抗体である実施形態において）、捕捉したマーカーと反応してサンドイッチを完結させる、タグを付加した第二の抗体（酵素抱合物、着色したラテックス粒子に結合させた抗体、又は着色したコロイドに組み込まれた抗体）を添加又は放出させることができる。あるいは、第二の抗体を試料と混合して、単一のステップで添加することもできる。マーカーが存在すれば、着色されたスポットが膜表面上に生じる。
【００２７】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用する場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明において有用な免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスのものであり得る。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性抗体、ヒト型化抗体及びキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより作製した断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体並びに上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗体が抗原に優先的に結合する場合、例えば、他の分子と約３０％未満、好ましくは２０％、１０％又は１％の交差反応を起こす場合、抗体、又は一般的にあらゆる分子は、その抗原（又は他の分子）に「特異的に結合する」。抗体部分には、Ｆｖ及びＦｖ’部分が含まれる。
【００２８】
ＯＲＰ１５０の検出に有用なある抗体は、配列ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭを認識し得る。他の適切な抗体は、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ，１０９１−１ Ｎａｋａ，Ｆｕｊｉｏｋａ−ｓｈｉ，Ｇｕｎｍａ，３７５−０００５，Ｊａｐａｎ（株式会社免疫生物研究所、郵便番号 ３７５−０００５ 群馬県 藤岡市 中 １０９１−１）から市販されている。
【００２９】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。
【００３０】
哺乳類対象からの体液試料の採取に関する説明書と、
前記試料中の酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片のレベルを測定するための１つ又は複数の試薬と、
を含む、前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングするためのキットも提供される。
【００３１】
前記１つ又は複数の試薬は、上述のような第一のマーカーに特異的に結合する抗体を含み得る。本キットは、特に組織低酸素症の徴候となる臨床症候が上述のように心不全又は虚血性心疾患である場合に、哺乳類対象において組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の指標となる第二のマーカーレベルを測定するための１つ又は複数の試薬がさらに含まれ得る。
【００３２】
哺乳類対象から体液試料を採取するための説明書は、必要に応じて添付される。さらに、本発明のキットは、場合によっては、（１）哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングするためのキットの使用説明書；（２）本キット中に存在するあらゆる抗体に対する標識化結合パートナー；（３）何らかのこのような抗体が固定化された固体相（試薬ストリップ等）；及び（４）診断、予後診断又は治療目的の使用又はそれらの任意の組み合わせに対して規制当局から認可を受けたことを示す表示又は差し込みの注意書き、のうち１又は複数を必要に応じて備えることができる。本抗体又は各抗体に対する標識化結合パートナーが提供されない場合、検出可能なマーカー、例えば化学発光、酵素的、蛍光又は放射性部分等で、本抗体又は各抗体それ自体を標識することができる。
【００３３】
ＯＲＰ１５０は、粥状プラークの血管壁において過剰発現し（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）、主としてマクロファージに存在する。発明者らにより、心不全及び虚血性心疾患（その主原因はアテローム性動脈硬化症）の患者由来の血漿中でＯＲＰ１５０が増加することが明らかとなり、また、アテローム性動脈硬化症が原因となる他の臨床症候、例えば虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患又は他の急性冠不全症候群等の患者において血漿中のＯＲＰ１５０が増加すると思われるので、これらの状態の存在又は重篤度の指標としてこのマーカーを使用することができる。同様に、組織が低酸素状態であり得る慢性肺疾患の患者においても、血漿中のＯＲＰ１５０が上昇していると予想される。現在、肺疾患患者、例えば、家庭での酸素治療を受けている患者のｐＯ２を測定する簡便な方法がないが、ＯＲＰ１５０測定のさらなる用途として、そのような患者の酸素治療のモニタリングにおける使用が挙げられる。浸潤性腫瘍は、血管内皮増殖因子に対するシャペロンとして、ＯＲＰ１５０を過剰発現し得るため（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９８；７８：６９９−７０６；Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３；Ａｓａｈｉら、ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００２；９０：４６２−６）、腫瘍マーカーとして、特に中心領域が相対的に低酸素状態であり得る浸潤性腫瘍のマーカーとして、使用することができる。このような用途は、これらの浸潤性腫瘍の診断、さらに治療のモニタリングにも拡大適用されるであろう。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、哺乳類対象における組織低酸素症のマーカーとしての又は組織低酸素症に起因する臨床症候のマーカーとしての、酸素調節タンパク質ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片の使用を提供する。組織低酸素症に起因する臨床症候は、心不全、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患、肺疾患又は腫瘍増殖の結果であり得る。
【００３５】
別の局面において、本発明は、哺乳類対象での心不全又は虚血性心疾患の存在又は重篤度の決定において診断ツールとして使用するための心臓マーカーとしてのＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片の使用を提供する。ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片は、心不全又は虚血性心疾患の指標となるさらなるマーカーと組み合わせて使用し得る。さらなるマーカーは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）等のナトリウム利尿ペプチドであり得る。
【００３６】
本発明は、哺乳類対象由来の体液試料がＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片の存在について測定される、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候の存在又は重篤度を調べるための方法も提供する。組織低酸素症の徴候となる臨床症候は、心不全又は虚血性心疾患であり得、体液は血漿であり得る。診断又は予後診断は、健康な個体又は個体群から得られた値と比較して得られた結果に基づいて行い得る。測定は、イムノアッセイを用いて行い得る。
【００３７】
本発明は、哺乳類対象から体液試料を取得することと、前記（ＯＲＰ１５０）又はその断片の存在及び／又は量を示すために前記試料に対して測定を行うことと、を含む、酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片の検出方法を提供する。
【００３８】
本発明の各局面についての好ましい特徴は、他の局面の各々に対して準用される。本明細書中で言及する先行技術の文書は、法律が許す範囲内で最大限に組み込まれる。
【００３９】
（実施例）
ここで、次の非限定例において、本発明をより詳しく説明する。以下、添付の図について説明する。
【実施例１】
【００４０】
研究対象
心エコー検査により左心室の収縮機能障害（左室（ＬＶ）駆出分画＜４５％）が認められた１２０名の心不全患者を調べた。さらに３７３名の心筋梗塞の患者も集めた。３種類の標準的基準、即ち適切な症候群、梗塞の急性のＥＣＧ変化（ＳＴ上昇、新しいＬＢＢＢ）及びクレアチンキナーゼ（ＣＫ）が、正常値の上限値の少なくとも２倍である、つまり＞４００ＩＵ／Ｌである、という基準のうち少なくとも２つを伴って現れるものとして、急性心筋梗塞を定義した。心筋梗塞患者１７７名も、心エコー検査により調べ、収縮機能を正常、軽度、中度又は重度として分類した。年齢及び性別構成について適合させた、ＬＶ駆出分画が＞５０％である正常対照を、広告により地域集団から集めた。全対象者からこの研究への参加に対するインフォームドコンセントを得て、地域のＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（倫理委員会）から承認を受けた。
【００４１】
心筋梗塞患者におけるエンドポイント
指標となる入院からの退院後の原因を問わない死亡率及び心臓血管の罹患率（心不全による再入院）としてエンドポイントを定義した。フォローアップ中に死亡した患者の検閲後に死亡以外の全エンドポイントに対する多変量解析を行った。
【００４２】
血液採取及び血漿抽出
健常者及び心不全患者の場合は、１５分間ベッドで休息を取らせた後に、末梢血管血液２０ｍｌを、５００ＩＵ／ｍｌのアプロチニンが入った、予め冷やしておいたＮａ−ＥＤＴＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ 血液）試験管に採取した。心筋梗塞患者の場合は、症候群発症後、７２〜９６時間の間に１回血液試料を採取した。４℃にて３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った後、血漿を分離し、アッセイを行うまで−７０℃に保存した。アッセイ前に、Ｃ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムで血漿を抽出し、遠心エバポレーターで乾燥させた。心不全患者から尿検体もいくつか回収した。これらも上述のようにＣ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムで抽出した。
【００４３】
ＯＲＰ１５０のアッセイ
ＭＲＣ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒにおいて、ヒトＯＲＰ１５０配列のＮ末端ドメインに相当するペプチド（アミノ酸３３−４５）（ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭ）（Ｉｋｅｄａ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９７；２３０：９４−９）を合成した。アミノ酸１−３２は、本タンパク質に対するシグナル配列を表し、成熟ＯＲＰ１５０タンパク質には存在し得ない。本配列のＣ末端に付加させたシステインへのマレイミドカップリングによりキーホールリンペットヘモシアニンと共役させたこのペプチドをウサギに対して、毎月注射した。血清由来のＩｇＧを、プロテインＡセファロースのカラムで精製した。上記ペプチドも、ビオチン−マレイミドを用いて、ＮａＨ２ＰＯ４を１００、ＥＤＴＡを５（単位はｍｍｏｌ／ｌ）含有する、ｐＨ７．０のバッファー中で、２時間、ビオチン化した。過剰なシステインで反応停止させた後、アセトニトリル勾配を用いてＨＰＬＣにより、得られたトレーサーを精製した。あるいは、Ｃ又はＮ末端にビオチン化アミノ酸を取り込んで上記ペプチドを合成し、トレーサーとして使用することが可能であろう。血漿抽出物及び標準は、ＮａＨ２ＰＯ４ １．５、Ｎａ２ＨＰＯ４ ８、ＮａＣｌ １４０、ＥＤＴＡ １（単位はｍｍｏｌ／ｌ）及びウシ血清アルブミン １、アジド ０．１（単位はｇ／ｌ）から成るＩＬＭＡ（免疫発光アッセイ）バッファーを用いて再調製した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１ｍｏｌ／ｌの重炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．６ １００μｌ中の抗−ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）１００ｎｇで被覆した。次に、重炭酸バッファー中の０．５％ウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。このウェル中の標準物質又は試料とともにＩｇＧ ２００ｎｇをプレインキュベーションすることにより、競合的免疫反応アッセイを開始した。一晩インキュベーションを行った後、希釈したビオチン化ＯＲＰペプチドトレーサー ５０μｌ（保存溶液中２μｌ／ｍｌ又は総量１００−５００ｆｍｏｌ）を、このウェルに添加した。４℃にてさらに２４時間インキュベーションを行った後、ウェルを洗浄バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ １．５ｍｍｏｌ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ８ｍｍｏｌ／ｌ、ＮａＣｌ ３４０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ ０．５ｇ／ｌ、アジ化ナトリウム ０．１ｇ／ｌ）で３回洗浄した。メチル−アクリジニウムエステル（ＭＡＥ）で標識したストレプトアビジンを、記載されているように合成した（Ｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１０２：４１１−４１６）。ストレプトアビジン−ＭＡＥ（５００万相対発光ユニット／ウェル）を含有するＩＬＭＡ １００μｌとともにウェルを２時間インキュベーションした。さらに洗浄を行った後、１Ｍ 硝酸（Ｈ２Ｏ２とともに）１００μｌ及び、次に、ＮａＯＨ １００μｌ（臭化セチルアンモニウムと共に）を連続して注入して、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬＸ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒにおいて化学発光を検出した。検出の下限値（ペプチド濃度０における標準偏差の３倍として定義）は、試験管あたり９．８ｆｍｏｌ又は抽出した血漿中９８ｆｍｏｌ／ｍｌであった。アッセイ内の変動係数は、２、３０、５００ｆｍｏｌ／試験管に対してそれぞれ、３．１、４．３及び５．９％であった。ＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｎ末端プロＢＮＰ又はＣＮＰ等の心不全において上昇することが既に明らかとなっているペプチドとの交差反応性はなかった。
【００４４】
アッセイＮ−ＢＮＰ
Ｎ末端プロＢＮＰに対するアッセイは、Ｋａｒｌ，ら、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ Ｓｕｐｐｌ １９９９；２３０：１７７−１８１により記載されている非競合Ｎ末端プロＢＮＰアッセイに基づくものであった。ウサギポリクローナル抗体は、ヒトＮ末端プロＢＮＰのＮ末端（アミノ酸 １−１２）及びＣ末端（アミノ酸 ６５−７６）に対して作製された。血清由来のＩｇＧをプロテインＡセファロースカラムで精製した。Ｃ末端に向けられた抗体（各ＥＬＩＳＡプレートウェルに対して、１００μＬ中０．５μｇ）を、捕捉抗体として用いた。Ｎ末端抗体をアフィニティ精製し、ビオチン化した。分注した試料（２０μｌ）又はＮ−ＢＮＰ標準物質を、Ｃ末端抗体で被覆したウェル中で、４℃にて２４時間、ビオチン化した抗体とともにインキュベーションした。洗浄後、メチル−アクリジニウムエステル（ストレプトアビジン−ＭＡＥ、５ｘ１０６相対発光ユニット／ｍｌ）で標識したストレプトアビジン（Ｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１０２：４１１−４１６）を、各ウェルに添加した。既に述べたようにしてＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬＸ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒでプレートを読み取った（Ｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１０２：４１１−４１６）。検出の下限値は、非抽出血漿で５．７ｆｍｏｌ／ｍｌであった。アッセイ内、及びアッセイ間において、変動係数は、それぞれ２．３％及び４．８％で、許容範囲内であった。ＡＮＰ、ＢＮＰ又はＣＮＰとの交差反応はなかった。
【００４５】
血漿抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー及びゲル電気泳動
３００ｘ７．８ｍｍ Ｂｉｏ−Ｓｅｐ ＳＥＣ Ｓ２０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において、移動相として、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．８）を用いて、流速１ｍｌ／分で、血漿抽出物を定組成サイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。分子量を決定するために使用した標準物質には、ＩｇＧ（１５０ｋＤ）、ＢＳＡ（６８ｋＤ）、オボアルブミン（４４ｋＤ）、ダイズトリプシン阻害剤（２０ｋＤ）、アプロチニン（６．５ｋＤ）及びトリプトファン（２０４Ｄ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫより）が含まれていた。上記のように、ＯＲＰ１５０に対するアッセイを行う前に、２０秒ごとに回収した分画を遠心エバポレーターで乾燥させた。
【００４６】
統計解析
ＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＭＩ）を用いて統計解析を行った。平均値±ＳＥＭ又は非ガウス分布のデータに対する中央値（範囲）としてデータを表し、それを解析前に対数変換した。連続型変数に対して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。複数の独立変数の相関は、一変量の一般線形モデル法（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌ法）を用いて、報告された最小有意差Ｐ値により求めた。ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関分析を行い、中央値、四分位間範囲を表すボックス及び２．５ｔｈから９７．５ｔｈ百分率を表すひげ（ｗｈｉｓｋｅｒ）から成るボックスプロットを構築した。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒの生存時間解析を用いて、ＭＩ後の重症度分類におけるペプチドレベルの有用性について調べた。
【００４７】
結果及び考察
ＯＲＰ１５０アッセイの性能
ＯＲＰ１５０ペプチドに対する典型的な標準曲線を図１で示すが、ここでは、本ペプチドの濃度が増加するに従い化学発光が低下することが示されている。約３００ｆｍｏｌ／試験管において、トレーサー結合変換の半分が起こった。心不全患者の血漿及び尿抽出物の希釈物は、標準曲線との並行性を示した。検出の下限値は９．８ｆｍｏｌ／試験管であった。
【００４８】
さらにヒト血漿抽出物に対して、定組成のサイズ排除クロマトグラフィーを行った（図２）。これは、３つの大きな免疫反応分画、１つは１５０ｋｄ（これはヒトＯＲＰ１５０タンパク質の分子量と予想される。）、６．７ｋＤから７．４ｋＤのそれより小さいピーク及び１．８から３．３ｋＤの最大のピーク、に分けられた。この結果から、血漿から抽出されたＯＲＰ１５０が断片化され、他のエピトープ特異的抗体で検出することができる他の断片があり得ることが示唆される。
【００４９】
ヒトにおけるＯＲＰの検出に対する結論
ＯＲＰに対する特異的なイムノアッセイにより、血漿及び尿中においてこのペプチドの存在が検出された。ＯＲＰ１５０が小胞体関連タンパク質であるため、この発見は予想外のものである。さらに、血漿における免疫反応性が、いくつかの分子量体由来であることから、ＯＲＰ１５０の断片がエピトープ特異的抗体を用いて検出され得ることが示唆される。
【００５０】
健常者、心不全患者及び心筋梗塞患者におけるＯＲＰ１５０
健常者、心不全（ＨＦ）患者及び心筋梗塞（ＭＩ）患者の特徴を表１に示す。これらの群は性別についてよく適合していた。健常者及びＨＦ群は、年齢について適合していたが、ＭＩ群は他の群よりも年齢層が高かった（Ｐ＜０．００１）。解析前に、対数変換によりペプチドレベルを正規化した。図３は、健常者、ＨＦ患者群及びＭＩ患者群におけるＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ−１５０レベルを示す。ＡＮＯＶＡにより、ＬｏｇＮ−ＢＮＰ（Ｐ＜０．０００５）及びＬｏｇＯＲＰ−１５０（Ｐ＜０．０００５）における差が、上記３群の間で明らかとなった。Ｎ−ＢＮＰの場合、ＨＦ患者及びＭＩ患者両方のレベルが健常者よりも高かった（Ｐ＜０．０００５、多重比較のためにＴｕｋｅｙ検定を使用。）が、ＨＦ及びＭＩ群におけるレベルは同程度であった（Ｐは有意ではない）。ＯＲＰ１５０の場合、ＨＦ患者及びＭＩ患者両方のレベルが健常者よりも高かった（Ｐ＜０．０００５、多重比較のためにＴｕｋｅｙ検定を使用。）。ＨＦ群におけるレベルはまた、ＭＩ群におけるレベルよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０００５）。
【００５１】
【表１】
【００５２】
心不全におけるＯＲＰ１５０
正常群中では、Ｎ−ＢＮＰが年齢に依存して変化していた（相関係数 ｒ＝０．４３８、Ｐ＜０．０００５）。しかし、ＯＲＰ１５０は、年齢に対して有意に相関しなかった。正常群とＨＦ群を合わせた場合も、Ｎ−ＢＮＰは、年齢に相関していた（ｒ＝０．３０６、Ｐ＜０．０００５）が、ＯＲＰ１５０の年齢との相関性は小さかった（ｒ＝０．１３８、Ｐ＜０．０２）。
【００５３】
図４は、男女両方の正常及びＨＦにおけるＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルを示す。これらのペプチドレベルは、ＨＦの男女両方で上昇していた（両者に対してＰ＜０．０００５、一変量の一般線形モデル（ＧＬＭ）法を用いた。）。ＨＦにおける両ペプチドは、ＮＹＨＡクラスにより判定した場合のＨＦの重症度に依存して上昇していた。図５は、男女両方において、ＮＹＡＨクラスが上がると両ペプチドが上昇することを示す。Ｎ−ＢＮＰの場合、健常者における値は、ＮＹＡＨクラス、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとは異なっていた（全てに対してＰ＜０．０００５、Ｔｕｋｅｙ検定を使用。）。ＯＲＰ１５０の場合、健常者における値は、ＮＹＡＨクラス、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとは異なっていた（それぞれに対してＰ＜０．００２、０．０００５、０．０００５、０．０００５、Ｔｕｋｅｙ検定を使用。）。
【００５４】
一変量ＧＬＭ法を用いて、共変量として年齢を、性別及びＮＹＨＡクラスを因子として入力して、心不全患者における対数正規化したＮ末端プロＢＮＰレベルの解析を行ったところ、年齢、性別及びＮＹＡＨクラスが有意な予測変数で（全てに対してＰ＜０．０００５）、本モデルに対するｒ２は０．６７５（Ｐ＜０．０００５）となった。性別とＮＹＡＨクラスとの間に有意な相関があったことから、ＮＹＨＡの上昇に伴うＮ−ＢＮＰの上昇は、男性と女性とで異なる可能性があることが示唆された（Ｐ＜０．００７）。対数正規化したＯＲＰ１５０データについて同様の解析を行ったところ、ＮＹＡＨクラスのみが有意な予測変数で（Ｐ＜０．０００５）、本モデルに対するｒ２は０．５１２（Ｐ＜０．０００５）となった。年齢及び性別は有意な予測変数ではなかったが、性別とＮＹＡＨクラスとの間に有意な相関があった（Ｐ＜０．０００５）ことから、ＮＹＨＡクラスの上昇に伴うＯＲＰ１５０上昇は、男性と女性との間で異なることが示唆された。ＨＦ患者の大多数においてその原因は虚血性心疾患であるが、これらのペプチドを用いて原因と関係なくＨＦが検出された。
【００５５】
例えば、９５６ｆｍｏｌ／ｍｌというＯＲＰ１５０のカットオフ値を用いると、上述の血漿抽出物におけるアッセイ技術に基づいて得られたこのようなレベルから、ＨＦ例の９５％が診断され、特異度は３９．４％となろう。従って、この例の場合、ＯＲＰ１５０は、５１．１％の陽性的中率を有し、９２．２％の陰性的中率を有する。このようなカットオフ値を用いることにより、ＨＦ診断で効果的に除外を行うことが可能になると考えられる。
【００５６】
このようなカットオフ値は、アッセイ法により影響を受ける可能性があり、これらが競合的アッセイであれ非競合的アッセイであれ、そしてペプチド又はタンパク質標準物質を用いるかどうかに関わらず、ＯＲＰ１５０に対する新しいアッセイに対して別のカットオフ値を確立する必要がある（下記のアッセイ法に対する注意を参照のこと。）。
【００５７】
下記に挙げたものは、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方に対する、ＨＦの診断のためのカットオフ値（単位はｆｍｏｌ／ｍｌ）であり、様々な敏感度及び特異度も報告している。
【００５８】
【表２】
【００５９】
予測変数をＬｏｇＮ−ＢＮＰ及びＬｏｇＯＲＰ１５０として、逐次的ロジスティック回帰分析により、ＨＦの有無を予測した。正常群とＨＦ群とは年齢及び性別が適合しているので、年齢及び性別は用いなかった。Ｎ−ＢＮＰ（ペプチドレベル５０％上昇に対するオッズ比は１．５６、ペプチドレベル１０倍上昇に対するオッズ比は１２．２９、Ｐ＜０．０００５）及びＯＲＰ１５０（ペプチドレベル５０％上昇に対するオッズ比は２．４６、ペプチドレベル１０倍上昇に対するオッズ比は１６３．９８、Ｐ＜０．０００５）の両方がＨＦの存在の独立予測因子であり、前進法又は後進法のいずれを用いたかということに関係なく、総ｒ２（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｎｅｌｌ）は０．５５であり、Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅのｒ２は０．７４であった。
【００６０】
ロジスティック回帰は、「ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝ａ＋ｂ１χ１＋ｂ２χ２＋ｂ３χ３＋・・・」（式中、ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝ｌｏｇｅ（ｐ／（１−ｐ））であり、ｐはＨＦを有する確率を示し、ａは定数であり、ｂ１及びｂ２は、変数χ１、χ２を乗じる係数を表す。）の方程式にデータを当てはめて行う（この例において、χ１及びχ２は、ｌｏｇ１０（Ｎ−ＢＮＰ）及びｌｏｇ１０（ＯＲＰ１５０）である。）。測定を行いｌｏｇ１０変換したＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルを入れることにより、このモデルを使用して心不全を有する確率を計算することができた。
【００６１】
ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−２１．６４２＋２．５０９＊ｌｏｇ１０（Ｎ−ＢＮＰ）＋５．１＊ｌｏｇ１０（ＯＲＰ１５０）
従って、ｐが０．１０２より大きい場合、ＨＦは、９５％の敏感度及び６８．３％の特異度で検出される。このアルゴリズムにより、本ペプチドのうちいずれか単独の場合よりも高い特異度で心不全が検出できることに留意すること（敏感度９５％で、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０に対する特異度は、それぞれ４０．６％及び３９．４％のみ。）。
【００６２】
上記モデルからの予後診断指標（ＨＦ群の構成員の可能性）を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築した（図６）。ＨＦ同定に対して、本モデルに対するＲＯＣ領域は０．９５であり、Ｎ−ＢＮＰ（０．９１）又はＯＲＰ１５０（０．８４）単独よりも高かった。
【００６３】
下記の表では、上記アルゴリズムにより決定される様々な確率のカットオフ値に対する、ｌｏｇ１０変換Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルを用いた、ロジスティックモデルの敏感度及び特異度を示す。ＨＦ診断の敏感度を最大にしたいか、又はその特異度を最大にしたいかによって、本モデルからの異なる確率のカットオフ値を選ぶことができるであろう。
【００６４】
【表３】
【００６５】
心不全におけるＯＲＰ１５０に対する結論
これらの知見から、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０の両方がＨＦにおいて上昇しているが（そしてＨＦの重症度も上昇している。）、Ｎ−ＢＮＰが対象者の年齢及び性別からより大きな影響を受けていることが示唆される（年齢が高くなり、及び女性である場合、高値を示す。）。一方、ＯＲＰ１５０は、年齢に依存する要素がなく、性別によりわずかに影響を受けた。両ペプチドとも、ＨＦの同定に有用であったが、これら２種類のペプチドを組み合わせると、ＨＦの診断においてさらに可能性が広がる。
【００６６】
心筋梗塞におけるＯＲＰ１５０
心筋梗塞（ＭＩ）群の患者の特徴を表１に示すが、性別は適合していたが年齢層が正常群よりもわずかに高くなった（ｐ＜０．０００５）。Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方とも、心筋梗塞から２−３日後に得た血漿中のレベルが上昇していた（両方に対してＰ＜０．０００５、図３）。Ｎ−ＢＮＰのレベルは、ピークのクレアチンキナーゼレベルと相関していた（ｒ＝０．２４、Ｐ＜０．０００５）ことから、梗塞の大きさとの関係が示唆される。しかし、ＯＲＰ１５０レベルは、ピークのクレアチンキナーゼレベルと有意な相関関係がなかった（ｒ＝０．０５、Ｐは有意でない。）
【００６７】
Ｎ−ＢＮＰは、年齢（ｒ＝０．３９、Ｐ＜０．０００５）及びクレアチニン（ｒ＝０．３８、Ｐ＜０．０００５）の両方と相関しており、性別及び梗塞の影響を考慮に入れた後も偏相関係数は有意であった（年齢に対して（ｒ＝０．３９、Ｐ＜０．０００５）及びクレアチニンに対して（ｒ＝０．３６、Ｐ＜０．０００５））。対照的に、ＯＲＰ１５０は、年齢とは有意な相関がなかったが、クレアチニンとはわずかに相関関係が認められ（ｒ＝０．２０、Ｐ＜０．０００５）、年齢及び梗塞の効果を考慮に入れた場合、偏相関係数はさらに低下した（クレアチニンに対して、（ｒ＝０．１２、Ｐ＜０．００７）。）。
【００６８】
共変数として年齢及びクレアチニンを用い、因子としてＭＩの存在及び性別を用いて、逐次的線形回帰分析により、対数正規化したＯＲＰ１５０の決定要因を求めた。ＭＩの存在（Ｐ＜０．０００５）及びクレアチニン（Ｐ＜０．００４）のみが、ＯＲＰ１５０レベルの有意な独立予測因子として同定され、全分散は１４％であった（Ｐ＜０．０００５）。Ｎ−ＢＮＰレベルについて同様の解析を行ったところ、年齢、性別、クレアチニン及びＭＩの存在が、有意な独立予測因子として同定された（全てに対してＰ＜０．０００５）。従って、これらの知見から、ＨＦ群において、ＯＲＰ１５０レベルは、Ｎ−ＢＮＰレベルよりも、年齢及び性別からの影響を受けにくいということが確認される。
【００６９】
本発明者らは、ロジスティック回帰分析により、独立変数として年齢、性別、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０を用いて、従属変数としてのＭＩの有無を予想した。前進及び後進逐次的回帰分析両方を用いて、４種類全てが、ＭＩの有無に対する独立予測変数として同定され、本モデルにおいてｒ２は０．５６（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｎｅｌｌ）又は０．７９（Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅ）となった。オッズ比は、Ｎ−ＢＮＰの場合（ペプチドレベル５０％上昇に対して１．９４、Ｐ＜０．０００５）；ＯＲＰ１５０の場合（ペプチドレベル５０％上昇に対して１．６１、Ｐ＜０．０００５）であった。
【００７０】
Ｎ−ＢＮＰの血漿レベルは、患者のＫｉｌｌｉｐクラスと関連があった（図７、Ｐ＜０．０００５）。一方で、ＯＲＰ１５０のレベルは、Ｋｉｌｌｉｐクラスに関係なく、全てのＭＩ患者において上昇した（図７）。心エコー検査スキャンを行った１７７名の患者において、Ｎ−ＢＮＰレベルがＬＶ機能不全の程度と関連していることが分かった（図８、Ｐ＜０．０００５）。一方で、ＯＲＰ１５０のレベルは、ＬＶ機能不全の程度に関係なく、全てのＭＩ患者において上昇しており、明らかに「正常な」ＬＶ機能を有する患者でさえも、ＯＲＰ１５０レベルが上昇していた（図８）。
【００７１】
ＭＩ後の転帰
原因を問わない死亡率及びＭＩ後の心不全を伴う再入院率について検討して、これらの転帰の予測におけるＯＲＰ１５０の有用性を調べた。退院後の平均のフォローアップ期間は、４２６日であり、５−７６４日の範囲であった。３６７例のうち、フォローアップ期間中に死亡例が３９例あった。また、心不全による再入院も２２例あった。
【００７２】
死亡した患者は、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルが有意に高かった（それぞれＰ＜０．０００５及びＰ＜０．００１、図９）。さらに、両ペプチドとも、心不全で後日再入院した患者において上昇していた（Ｎ−ＢＮＰに対してＰ＜０．０００５、ＯＲＰ１５０に対してＰ＜０．０２５、図１０）。
【００７３】
ロジスティック回帰分析を用いて、年齢、クレアチニン、梗塞の既往歴、Ｋｉｌｌｉｐ クラス及びＬｏｇＮ−ＢＮＰ又はＬｏｇＯＲＰ１５０について、転帰としての死亡の予測因子を調べた。死亡に対する有意な独立予測因子には、Ｎ−ＢＮＰ（ペプチドレベル１０倍上昇のオッズ比は３．９５、Ｐ＜０．００２）及びＯＲＰ１５０（ペプチドレベル１０倍上昇のオッズ比は４．８５、Ｐ＜０．０５）が含まれ、Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅのｒ２は０．３２であった。後進及び前進回帰分析により、これらの２つの独立予測変数を確認したが、クレアチニンからのさらなる寄与があった（１０倍上昇に対するオッズ比は１９．５６、Ｐ＜０．０５）。これらの知見から、Ｎ−ＢＮＰレベルと独立して、ＯＲＰ１５０がＭＩ後の死亡の予測因子となることが示唆される。
【００７４】
これらの知見を確認するために、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存時間解析を行った。対象者を中央値群の上下で分けたところ、使用したペプチドがＮ−ＢＮＰ（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０００５）であるか又はＯＲＰ−１５０（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．００２）であるかにかかわらず、生存率は、これらの２群間で有意差があった（図１１）。注目すべきことは、Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０単独で定義した中央値以下の群においてでさえ、間違いなく死亡率が０ではないことである（中央値以上の群よりも低いが。）。Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方で順位付けした群における順位付けを利用して、患者を３種類の群に分ける、新規の予後診断指標を生み出した（両ペプチドが中央値以下、いずれかのペプチドが中央値以上、両ペプチドが中央値以上）。図１２において、この新しい予後診断指標を用いた生存時間解析を示すが、ここでは、両ペプチドが中央値以下であった群において観察期間中の死亡例がなく、両ペプチドが中央値以上であった群では死亡率が高く、いずれかのペプチドが中央値以上であった群では死亡率が中間であったことが示されている（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０００５）。
【００７５】
ＭＩにおけるＯＲＰに対する結論
心筋梗塞で見られるように、血漿ＯＲＰ１５０レベルは、虚血性心疾患において上昇する。一方、Ｎ−ＢＮＰもこれらの患者において上昇しているが、年齢、ＬＶ機能不全、症候及び徴候（Ｋｉｌｌｉｐクラスにより判定）並びに腎臓機能に対するＯＲＰ１５０レベルの依存度は、Ｎ−ＢＮＰよりも低い。両ペプチドとも、心筋梗塞による指標となる入院後の死亡又は心不全による再入院等の優れた転帰予測因子である。特に、両ペプチドを組み合わせると、心筋梗塞後の重症度分類にとりわけ有用であり得る（死亡の予測）。
【００７６】
血管疾患におけるＯＲＰに対する総体的結論
上記のデータから、ＯＲＰ１５０がヒト血漿に分泌され、尿中でも検出できることが示される。体液中にＯＲＰ１５０の断片があり得る。ＯＲＰ１５０のレベルは、心不全及び虚血性心疾患の両方において上昇し、その測定値が年齢及び性別により左右されることはより少ないようである。アテローム性動脈硬化症は血管疾患の主原因であるので、例えば、発作、末梢血管性疾患、動脈瘤又は急性冠症候群等、組織低酸素症が存在する他の状態の診断又は予後診断にＯＲＰ１５０を使用することができる。心不全において、それ自身において診断補助となることに加えて、Ｎ−ＢＮＰの測定を補うことができた。心筋梗塞において、それを予後診断の指標として用い、心不全による死亡及び再入院両方を予測できる。単独で、又はＮ−ＢＮＰと組み合わせて、心筋梗塞後のＯＲＰ１５０測定は、患者が非常に低い又は高いリスク群であることを予測することができる重症度分類に対して役立つ。これは、患者に対する治療選択を計画するのに有用であると考えられる。
【実施例２】
【００７７】
さらに１１４名の不安定狭心症患者又は非ＳＴ上昇心筋梗塞（心内膜下の心筋梗塞、クレアチンキナーゼが正常上限値の２倍以下に上昇することにより定義。）について調べた。全患者が休息時の胸痛を有し、治療のために入院していた。平均（範囲）年齢は、６６．８歳（３８〜９３）であり、男性７４名、女性４０名であった。入院から３〜５日後に血液試料を採取し、トロポニンＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と、実施例１で述べたようにしてＯＲＰ１５０タンパク質とＮ−ＢＮＰとを測定した。
【００７８】
実施例１において心筋梗塞患者に対して述べたようにしてエンドポイントに関して患者のフォローアップを行った。
【００７９】
平均フォローアップ期間である４０１日間（２６〜７６４日間の範囲）の間、死亡例が９例あった。トロポニンＴレベルは、生存者（０．１９（０．００５〜０．５５７）μｇ／ｌ）と死亡例（０．１２（０．００５〜１．１４）μｇ／ｌ）とを比較して有意差はなかった。一方、ＯＲＰ１５０及びＮ−ＢＮＰレベルの両方が、生存者と比較して死亡例で有意に高かった（それぞれＰ＜０．００６及びＰ＜０．０５、図１３）。
【００８０】
症例分類に対して、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベル（中央値以下又は以上）の両方を用いて、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存期間解析を行った。対象者を中央値の上下でグループ分けしたところ、使用したペプチドがＮ−ＢＮＰ（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０１６）であるか又はＯＲＰ１５０（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０１５）であるかにかかわらず、これらの２群間で生存率に有意差が認められた（図１４）。両ペプチドを用いて、患者を３群に分類（両ペプチドが中央値以下、いずれかのペプチドが中央値以上、両ペプチドが中央値以上）した場合、生存期間解析から、両ペプチドが中央値以下であった群において観察期間中に死亡例はなく、両ペプチドが中央値以上であった群では死亡率が高いことが示唆された（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．００２、図１５）。従って、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞に対するこの新しい予後診断指標により、ＳＴ上昇心筋梗塞の患者に対して述べたものと同じように（上述のように）、重症度分類が可能となる。
【００８１】
この特定の例に対する中央値ＯＲＰ１５０レベルは、上述のように抽出した試料に対して競合的アッセイにより調べたところ、１６８０ｆｍｏｌ／ｍｌであった。別の標準を用いた他のアッセイ方式に対して、別の中央値カットオフレベルを確立することができる（以下参照、方法の注）。
【００８２】
不安定狭心症／非ＳＴ上昇ＭＩにおける、ＯＲＰに対する結論
不安定狭心症／非ＳＴ上昇ＭＩによって示されるように、血漿ＯＲＰ１５０及びＮ−ＢＮＰレベルは、虚血性心疾患において上昇する。両ペプチドとも、死亡等の転帰の優れた予測因子である。特に、両ペプチドを組み合わせると、不安定狭心症／非ＳＴ上昇ＭＩ後の重症度分類に特に有用であり得る（死亡の予測）。このような予後診断指標を用いることで、死亡リスクの最も高い患者に対して血行再建又は薬剤による治療を行うことが可能となろう。
【００８３】
実施例におけるＯＲＰ１５０カットオフ値の確立法に対する注意
上記で特定したカットオフ値は、ＣＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭ（ここで、ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭは、ＯＲＰ１５０のＮ末端配列由来である。）から成るペプチド標準物質を用いた、血漿由来のＯＲＰ１５０抽出物に基づいている。Ｎ末端にシステインが存在するため（まず第一に、免疫付与のために共役物を産生させるために）、このペプチドは二量体を形成する傾向がある。標準物質の二量体及び単量体の割合が様々であることから、免疫反応性が異なる可能性があり、従って、実際のカットオフ値と異なるということになる。
【００８４】
標準物質として全タンパク質配列を用いた場合（例えば、全長ＯＲＰ１５０）、又は、上記ペプチドＣＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭを、ジチオスレイトールを用いて還元し、Ｎ−エチルマレイミドと反応させ、二量体形成を妨げた場合、このエピトープに対する作製抗体の免疫反応性が異なる可能性があり、従って、カットオフ値が異なる可能性があると思われる。上記カットオフ値の１０〜１００倍までの補正率を、異なる標準物質又は異なるアッセイ方式（例えば、競合方式とは逆に非競合）に対して適用する必要があり得る。しかし、カットオフ値は、１０〜１０，０００ｆｍｏｌ／ｍｌの範囲にあり、実施例において述べた用途にそれを適用するために、新しいそれぞれのアッセイが、それぞれの特定の目的（診断又は予後診断）に対してそのアッセイに与えられた独自のカットオフ値を有し得ると考えられる。これらのカットオフ値は、上記実施例で説明したように、この試験を心不全の診断に用いるか、又は心筋梗塞もしくは不安定狭心症後の予後を予測するために用いるかによっても異なるであろう。
【実施例３】
【００８５】
バルーン血管形成中の冠循環に対する急性閉塞の効果を、アテローム性動脈硬化症の治療のためにこの治療を受けている冠状動脈疾患のある１９名の患者において評価した。この方法を実施する前、及び血管形成後２時間、６時間及び１２時間の時点で血漿を回収した。ＯＲＰ１５０のレベルを上述のようにして測定した。さらに、心筋梗塞等の他の冠動脈閉塞後に上昇することが知られている既知の心室壁張力の心臓マーカー、即ち、Ｂタイプ又は脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を、免疫発光アッセイを用いて、Ｃ１８カラムにおいて測定した。
【００８６】
図１７において、血管形成後の、ＢＮＰと比較した血漿ＯＲＰ１５０レベルの変化について示す。両マーカーとも、時間経過に従い、有意に変化する（繰り返し測定を行い、分散分析を用いて、Ｐ＜０．００１）。さらに、両ペプチドの血漿レベルは、血管形成後２時間でピークとなり、この時間を越えると基底レベルに低下していく。２時間におけるピークのＯＲＰ１５０レベルは、基底値（Ｐ＜０．０２）及び、６時間及び１２時間でのレベル（両方に対してＰ＜０．００１）と有意差が認められる。ＢＮＰの場合、２時間におけるピーク値は、基底値（Ｐ＜０．００１）及び、６時間及び１２時間でのレベル（両方に対してＰ＜０．００５）と有意差が認められる。
【００８７】
バルーン閉塞後にＯＲＰ１５０レベルが急速に上昇することから、心筋梗塞又は他の急性冠症候群（例えば、非ＳＴ上昇心筋梗塞又は不安定狭心症）において見られるような、冠循環の急性閉塞の指標として使用できることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＯＲＰ１５０ペプチド競合的イムノアッセイに対する標準曲線を示す。患者の血漿抽出物（実線でつながれている黒丸）を２倍ずつ段階希釈して用いたところ、それにより標準曲線との平行性が示された。２名の患者の尿抽出物も２倍ずつ段階希釈したが（点線でつながれた白い三角）、これも標準曲線と平行性が示された。
【図２】ＯＲＰ１５０に対する分画の解析に伴う、サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。１５０ｋｄ、２０ｋＤ、６．５ｋＤに対するマーカーの溶出ポイントを矢印で示す。ＯＲＰ１５０に対する免疫反応性の３つのピークが、１５０、約７及び約３ｋＤで明らかとなっている。
【図３ａ】それぞれ健常者、心不全患者及び心筋梗塞患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルのボックスプロットである。
【図３ｂ】それぞれ健常者、心不全患者及び心筋梗塞患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルのボックスプロットである。
【図４ａ】男女両方の健常者及び心不全患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルそれぞれのボックスプロットである。
【図４ｂ】男女両方の健常者及び心不全患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルそれぞれのボックスプロットである。
【図５ａ】男性及び女性の、心不全の重症度（ＮＹＨＡクラスにより判定）と血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０それぞれとの関係を示す。
【図５ｂ】男性及び女性の、心不全の重症度（ＮＹＨＡクラスにより判定）と血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０それぞれとの関係を示す。
【図６】Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０のみを用いた、及びＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０を組み合わせたロジスティックモデルによる予後指標を用いた、心不全の診断に対する受信者動作特性曲線を示す。
【図７】心筋梗塞後の患者におけるＫｉｌｌｉｐクラスに対する血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ−１５０の関係を示す。
【図８】心筋梗塞後の患者における心エコー検査により評価した左心室機能に対する血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ−１５０の関係を示す。心室機能不全は、正常、軽度、中度又は重度に分類される。
【図９】心筋梗塞後の患者における死亡の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルの比較を示す。
【図１０】心筋梗塞後の患者における心不全による再入院の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルの比較を示す。
【図１１ａ】それぞれ、血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１１ｂ】それぞれ、血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１２】血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方の血漿レベルが中央値以下であるか又はそれ以上であるか、及びいずれかのペプチドがそのペプチドの中央値以上である中間群に患者を階層化して行った、心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１３ａ】不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者における死亡の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０のレベルの比較を示す。
【図１３ｂ】不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者における死亡の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０のレベルの比較を示す。
【図１４ａ】血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１４ｂ】血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１５】血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方の血漿レベルが中央値以下であるか又はそれ以上であるか、及びいずれかのペプチドがそのペプチドの中央値以上である中間群に患者を階層化して行った、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞の後の患者の生存時間解析を示す。
【図１６】ヒトＯＲＰ１５０のアミノ酸配列を示す。
【図１７】冠状動脈バルーン血管形成を行った患者における、ＯＲＰ１５０及びＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド３２）の血漿レベルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類対象における組織低酸素症又は組織低酸素症に起因する臨床症候の１又は複数のマーカーを体液において検出及び測定することに関する。特に、本発明は、哺乳類対象の組織低酸素症又は組織低酸素症に起因する臨床症候の診断及び／又は予後診断における、酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又は該タンパク質に由来するペプチド断片単独での検出又はさらなるマーカーと組み合わせた検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患及び心不全は世界中で重大な健康問題となっているが、これらの症状を効果的に診断し管理する手段は現在のところ乏しいものである。
【０００３】
慢性心不全
慢性心不全（ＣＨＦ）は、高齢化が進んだ産業社会においてますます重大なヘルスケア問題となっている代表的な臨床症候である。心不全の場合の入院率は、過去２０年間にわたり顕著に増加しており、ＣＨＦは予後不良であり、クオリティーオブライフが低い。ＣＨＦの直接費は、ヘルスケア支出のおよそ１〜２％にのぼり、その大半が入院関連である。
【０００４】
慢性心不全は、左室の収縮機能障害（ＬＶＳＤ）の結果起こることが最も多い。Ｇｌａｓｇｏｗ（ＭｃＤｏｎａｐｈ，ら、Ｌａｎｃｅｔ １９９７；３５０：８２９−８３３１）及びＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ（Ｄａｖｉｅｓ，ら、Ｌａｎｃｅｔ ２００１：３５８：４３９−４４４）のスクリーニング研究において、確定的なＬＶＳＤの罹患率はそれぞれ、２．９％及び１．８％であることが示された。両研究において、事例の半分が無症候性であった。ＬＶＳＤを有する患者を同定することにより、個々の患者がクオリティーオブライフを向上させ予後を良好にするための適切な治療を行うことが可能となる。心エコー検査は、ＬＶＳＤ及び心不全の診断の際に現在最も頻繁に用いられる検査である。
【０００５】
ＣＨＦの病態生理学は、カテコールアミン、レニン−アンジオテンシン、エンドセリン、心房及び脳性ナトリウム利尿ペプチド系を含む、多くの神経ホルモン系の活性化を伴う。これらの系には、適応的に活性化されるものも（ナトリウム利尿ペプチド系）あれば、急性状態下では適応的であるが、特に慢性状態において維持される場合には不適応となる（エンドセリン、レニン−アンジオテンシン及びカテコールアミン系）ものもある。ナトリウム利尿ペプチドホルモンの分泌増加は、ＣＨＦを診断する手段として利用されてきた（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５１：９−１３；Ｈｏｂｂｓ，ら、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ ２００２；３２４：１４９８−１５０２）。ＬＶＳＤの検出のためには、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、Ｎ末端プロ心房ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＡＭＰ）より優れた診断ツールである（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５１：９−１３）。さらに、ＢＮＰの前駆体に由来する別のペプチド、すなわちＮ末端プロＢＮＰ（Ｎ−ＢＮＰ）も、ＬＶＳＤ同定のための適切な代替物である（Ｈｏｂｂｓ，ら、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ ２００２；３２４：１４９８−１５０２）。両ケースとも、その試験の陰性的中率は高く、ＣＨＦを除外する際に有用であることが示唆される。多くの場合、ＣＨＦの原因は虚血性心疾患である。さらに、慢性期にわたる心拍出量の減少により、組織循環不全及び相対的組織低酸素症が起こることとなる。
【０００６】
しかし、組織が低酸素であるときに誘導され分泌される血漿中の指標は、心疾患の診断及び予後診断に大いに役立ち、これらの疾患のモニタリングにさらに役立つであろう。
【０００７】
虚血性心疾患
虚血性心疾患は、先進国における重大な健康負担であり、その主要な原因はアテローム性動脈硬化症である。マクロファージ及び他の細胞とともに、脂質、特に酸化又は変性したＬＤＬが蓄積することによって、プラークが成長し不安定となる。
【０００８】
酸素調節タンパク質ＯＲＰ１５０及び小胞体における分子シャペロンとしてのその役割
酸素調節タンパク質ＯＲＰ１５０は、元来、低酸素状態にした星状細胞からクローニングされたシャペロン小胞体関連タンパク質である（Ｋｕｗａｂａｒａ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６；２７１：５０５２−３２）。ラット星状細胞、ヒト大動脈心筋細胞及び単核白血球においてこのタンパク質を誘導したところ、低酸素症に対して特異性を示したが、グルコース欠乏、過酸化水素、ツニカマイシン又は熱ショック等の他のストレス性刺激に対しては特異性を示さなかった（Ｋｕｗａｂａｒａ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６；２７１：５０５２−３２；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。さらに、ヒトアテローム性動脈硬化病巣から調製した組織抽出物において調べたところ、ＯＲＰ１５０のｍＲＮＡ及びタンパク質発現が増加しており、ほとんどのｍＲＮＡがマクロファージで観察された（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。ＯＲＰ１５０は、アテローム性動脈硬化症の血管壁の細胞において分子シャペロンとして機能し、低酸素症が起こっている細胞の小胞体（ＥＲ）に主に存在すると思われる（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。血管疾患の危険因子として知られている酸化又はアセチル化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が存在する場合、その発現がさらに促進され得る（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。アンチセンスオリゴヌクレオチドでその発現を低下させると、低酸素による損傷に対する単核食細胞の感受性が高まることから、その機能には、低酸素症により誘導される損傷に対する保護効果が含まれている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）。
【０００９】
最近、ヒトＯＲＰ１５０のクローニングにより、Ｃ末端に小胞体（ＥＲ）残留シグナルを有する９９９残基の推定アミノ酸配列が明らかとなった（Ｉｋｅｄａ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９７；２３０：９４−９）。この配列は、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ１７０）及びヒートショックタンパク質（ＨＳＰ７０）等の他のストレス誘導性タンパク質とある程度のホモロジーを有する。この配列はＥＲに存在することから、特に低酸素状態において、タンパク質の折りたたみ及び成熟のための分子シャペロンとしての役割が示唆される。例えば、腎臓細胞ＯＲＰ１５０アンチセンス形質転換体の場合、糖タンパク質ＧＰ８０の成熟が遅れ、ＧＰ８０がＥＲに蓄積するので、エネルギー欠乏状態にある細胞のＥＲ内でのタンパク質成熟及び輸送におけるＯＲＰ１５０の役割が示された（Ｂａｎｄｏ，ら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０００；２７８：Ｃ１１７２−８２）。
【００１０】
血管疾患におけるＯＲＰ１５０の機能に関する証拠は、マウスの発作モデルに対する観察から得られる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９８；６０：９８−１０６；Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。脳虚血のマウスモデルにおいて、虚血を起こしエネルギーが欠乏している部位においてでさえも、低酸素状態のニューロンでＯＲＰ１５０ ｍＲＮＡ及びタンパク質が急激に誘導された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９８；６０：９８−１０６）。虚血状態のヒトの脳では、ニューロンでのＯＲＰ１５０発現はわずかずつしか誘導されなかったが、星状細胞においてはＯＲＰ１５０が顕著に誘導された（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。ＯＲＰ１５０を過剰発現しているニューロンは、低酸素ストレスに対して抵抗性を有し、ニューロンでＯＲＰ１５０を過剰発現するように遺伝子操作を施したマウスは、虚血ストレス下で起こす発作が小さかった（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。細胞保護作用は、カスパーゼ−３様の活性の抑制及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の促進に関連しており、このことから、低酸素状態での細胞保護作用におけるＯＲＰ１５０に対する役割が示された（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３１０）。さらに、ＯＲＰ１５０アンチセンスＲＮＡを過剰発現するようにトランスフェクションした星状細胞又は細胞株は、低酸素状態のストレスに対して感受性が増加し、アポトーシスが引き起された（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３；Ｏｚａｗａ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：６３９７−４０４）。
【００１１】
血管疾患におけるＯＲＰ１５０に関する役割を示唆する他の証拠は、血管形成に関連するものである（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９８；７８：６９９−７０６；Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３；Ｏｚａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０は腫瘍中に発現され、宿主組織に浸潤した細胞中で高い発現を示す（Ｔａｍａｔａｎｉ，ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：３１７−２３）。浸潤には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、血管形成因子として知られている）及びＯＲＰ１５０の共発現を伴うことが多く（Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３）、アンチセンスＯＲＰ１５０をトランスフェクションした腫瘍細胞は浸潤を起こしにくく（Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３）、ＶＥＧＦは成熟不全となり、その結果ＥＲへの蓄積が起こる（Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３）。創傷では、血管新生にＶＥＧＦ及びＯＲＰ１５０の両者の発現が伴う（Ｏｚａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０を運ぶアデノウイルスを局所的に投与すると、その部位で、創傷の修復、新しい血管形成及びＶＥＧＦ発現が促進される（Ｏｚａｗａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０発現を低下させるよう操作したマクロファージでは、ＶＥＧＦの成熟に欠陥があり、ＶＥＧＦがＥＲに蓄積するが、ＯＲＰ１５０を過剰発現させると、ＶＥＧＦ産物をうまく搬出し、分泌できるようになる（Ｏｚａｗａ，ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０８：４１−５０）。ＯＲＰ１５０発現で血管形成が促進されることにより、低酸素ストレス下でのアポトーシス抑制に対するＯＲＰ１５０の別の細胞内効果から示される細胞保護物質としてのその役割がさらに裏付けられるであろう。
【発明の開示】
【００１２】
第一の局面において、本発明は、哺乳類対象由来の体液試料中の第一のマーカーレベルを測定することを含み、前記第一のマーカーが酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片である、前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングする、方法を提供する。
【００１３】
組織低酸素症の状態では、組織中のＯＲＰ１５０発現が上昇し得る。ＯＲＰ１５０タンパク質は、小胞体に付随しており、分泌されないと予想されている。しかし、本発明者らは、予想外にもＯＲＰ１５０又はＯＲＰ１５０由来のペプチド断片を細胞外で（イムノアッセイを用いて、ヒト血漿中に）検出することができることを見出し、ＣＨＦの診断及び予後診断に対するマーカーとしての有用性を示すことができた。さらに、ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片が、心不全及び虚血性心疾患（例えば心筋梗塞）の患者では健常者よりも高いレベルで血漿中に検出された。従って、これらのマーカーの測定は、心不全の存在に関する診断補助及び心不全の重篤度を評価するための診断補助として有用である。
【００１４】
ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片はまた、虚血性心疾患又は急性冠不全症候群の患者の予後の評価に有用であり得るが、特に心筋梗塞後に、心不全による死亡リスク又は再入院リスクが高い患者においてそのペプチドのレベルが上昇する。
【００１５】
本明細書において使用される「組織低酸素症」という用語は、組織又は器官において酸素供給が正常レベル以下に低下することを意味する。酸素供給の低下は、赤血球数減少、肺における酸素化不全（つまり、酸素圧低下、肺機能の異常、気道閉塞又は心臓における右−左シャント）、ヘモグロビンの酸素放出能低下、細動脈閉塞、血管収縮、静脈流出量の減少又は動脈血流入低下の結果起こる、酸素利用、運搬又は流れの減少により生じ得る。「低酸素症の徴候となる臨床症候」という用語は、組織低酸素症の結果として起こる、又は結果として組織低酸素症を引き起こす、あらゆる進行ステージの病態又は状態を意味する。従って、本用語には、虚血；虚血のプロセス；細胞壊死を引き起こす組織損傷；慢性心不全；虚血性心疾患、心筋梗塞及び他の急性冠不全症候群等における急性冠循環閉塞（例えば、非ＳＴ上昇心筋梗塞及び不安定狭心症）；アテローム性動脈硬化症に起因する臨床症候；発作；大動脈瘤；末梢血管性疾患；慢性肺疾患；及び腫瘍などの症状が含まれる。
【００１６】
本発明において、ＯＲＰ１５０の断片は、ＯＲＰ１５０に特有のアミノ酸配列を有するＯＲＰ１５０タンパク質の断片である。ヒトＯＲＰ１５０に対するアミノ酸配列は、図１６に示されており（ＮＣＢＩ ｄｅｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＣ５０９４７，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿００６３８０）、本明細書において使用される「ＯＲＰ１５０」には、その変異体及び対立遺伝子多型が含まれる。前記断片は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸であり得るが、６アミノ酸という短いものであり得る。ある実施形態において、前記断片は、配列ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭを含み、又は該配列から成る。前記断片は、６〜８、６．５〜７．５、６．７〜７．４、１〜４、１．５〜３．５又は１．８〜３．３ｋＤの範囲の分子量を有し得る。分子量は、ゲル電気泳動又はサイズ排除クロマトグラフィー等の当業者に公知の手段によって測定することができる。
【００１７】
本発明において、ＯＲＰ１５０は、血漿、又は間質液、尿、全血、唾液、血清、リンパ液、胃液、胆汁、汗並びに脳及び脊髄液等の哺乳類の体から取得できる他の体液中で、検出することができる。体液には、処理を施してもよく（例えば血清）、又は処理を施さなくてもよい。前記哺乳類対象はヒトであり得る。
【００１８】
ＯＲＰ１５０又はその断片の測定レベルは、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標となるＯＲＰ１５０レベルと比較し得る。このレベルは、組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例又は複数例の哺乳類対象から得たＯＲＰ１５０又はその断片のレベルであるか、又はそのような哺乳類対象中のＯＲＰ１５０又はその断片について予め決定された基準範囲であり得る。このようにして、問題となる状態のない対象の集団的研究から決定された標準レベルと前記レベルとを比較して、診断又は予後診断を行うことができる。このような対象は、年齢及び／又は性別を一致させ得る。ある実施形態において、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標となるＯＲＰ１５０のレベルは、１〜５．７ｆｍｏｌ／ｍｌの範囲であり得る。組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候の指標となるＯＲＰ１５０のレベルは、９５６ｆｍｏｌ／ｍｌ以上の範囲であり得る。本発明が組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に行われた治療の効果のモニタリングに関与する場合には、ＯＲＰ１５０又はその断片の測定レベルを、その対象の基準レベルと比較することができる。基準レベルは、治療開始前に決定することができる。この基準レベルとの差異から、低酸素状態が増加又は減少しているかどうか、つまり、治療が効果的であるかどうかが示される。ＯＲＰ１５０又はその断片のレベルの上昇は、組織低酸素症を示し、逆もまた同様である。
【００１９】
本発明の方法では、哺乳類対象において組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候の指標となる第二のマーカーを測定することができる。組織低酸素症の徴候となる臨床症候は、心不全又は虚血性心疾患であり得る。この例において、本発明の方法は、さらに、心不全又は虚血性心疾患の指標となる第二のマーカーのレベルを測定することを備え得る。第二のマーカーは、天然の心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ−Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９０，７０：６６５参照）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びＣ−タイプナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−Ｓｔｉｎｇｏら、Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２，２６３：Ｈ１３１８参照）、それらの一部、変異体又はキメラを含む、ナトリウム利尿ペプチドであり得る。好ましいナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）である。左室の心筋細胞からのプロＢＮＰ（２種類の循環体、ＢＮＰ（活性ペプチド）及びＮ−ＢＮＰ（不活性ペプチド）に対するインタクトな前駆体）の放出及びＢＮＰの産生の増加は、心筋の引き伸ばし、心筋の伸張及び心筋の損傷が引き金となることによって起こる。ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片は、虚血性心疾患又は急性冠不全症候群の患者の予後を評価する際に、ナトリウム利尿ペプチドと組み合わせて用いることは有用であり（例えば、Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド又はＮ−ＢＮＰ）、心筋梗塞後、ペプチドを組み合わせて使用することは、死亡に関する患者の重症度分類を行うのに有用である。
【００２０】
第一のマーカーであるＯＲＰ１５０又はその断片と同様に、第二のマーカーのレベルを測定して、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことを示す第二のマーカーのレベルと比較し得る。このレベルは、組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例もしくは複数例の哺乳類対象から得た前記第二のマーカーのレベルであるか、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない哺乳類対象における前記第二のマーカーに対して予め決定された基準範囲であり得る。組織低酸素症のリスクが高いことを示すＢＮＰ又はＮ−ＢＮＰレベルは、５．７ｆｍｏｌ／ｍｌ以上であり得る。
【００２１】
マーカーレベルは、濃度、質量、モル数、体積又は存在するマーカーの量を示す他の任意の測定単位で表し得る。第一及び第二のマーカーのそれぞれのレベルは、イムノアッセイ、つまり、マーカーに特異的に結合する抗体を利用したアッセイを用いて測定し得る。このようなアッセイは、競合的又は非競合的イムノアッセイであり得る。同種であれ異種であれ、このようなアッセイは、本分野において周知であり、ラテックス又は金粒子、蛍光部分、酵素、電気化学的に活性な物質等の検出可能物質で標識されている抗体等の特異的な結合パートナーと、検出すべき検体を結合させる。あるいは、上記の検出可能な物質のいずれかで前記検体を標識して、一定量の特異的抗体と競合させることができる。その後、標識の存在又は濃度を検出することにより検体の存在又は存在する検体の量を決定する。ＥＰ２９１１９４に記載されているラテラルフローイムノアッセイ等、実験室用分析装置又は治療場所もしくは家庭用のテスト装置を用いて従来の方法において、このようなアッセイを行うことができる。
【００２２】
ある実施形態では、マーカーが存在する場合に免疫特異的結合が起こりうるような条件下で、試験対象由来の試料を適切な抗体と接触させ、該抗体による何らかの免疫特異的結合の量を検出又は測定することにより、イムノアッセイを行う。最低約１０分間、３０分間、１時間、３時間、５時間、７時間、１０時間、１５時間又は１日、前記抗体を試料に接触させ得る。ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合反応アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイ等の技術を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系を含む、あらゆる適切なイムノアッセイを用いることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
例えば、２段階サンドイッチアッセイ法により、体液試料においてマーカーを検出することができる。第一の段階において、マーカーを捕捉するために、捕捉試薬（例えば、抗−マーカー抗体）を用いる。捕捉試薬は、場合によっては、固体相に固定することができる。第二の段階において、直接又は間接的に標識された検出試薬を使用して、捕捉されたマーカーを検出する。ある実施形態において、検出試薬は抗体である。別の実施形態において、検出試薬はレクチンである。
【００２４】
ある実施形態において、体液試料中に十分なマーカーが存在することにより、ラテラルフローアッセイの捕捉ゾーンにおいて「サンドイッチ」相互作用の形成を引き起こすサンドイッチ方式では、ラテラルフローイムノアッセイ装置を使用することができる。本明細書中において使用される捕捉ゾーンは、ＯＲＰ１５０及び本明細書中に記載されている他のマーカーを捕捉するのに適した、抗体分子、抗原、核酸、レクチン及び酵素等の捕捉試薬が含有し得る。捕捉ゾーンにおける捕捉に適した１つ又は複数の発光標識を本装置に組み込んで、検体の存在により捕捉の程度が決定されるようにすることができる。適切な標識には、ポリスチレンミクロスフィアに固定化された蛍光標識が含まれる。捕捉ゾーンで捕捉することができるようにするために、ミクロスフィアを免疫グロブリンで被覆し得る。
【００２５】
本発明の方法において使用し得る他のアッセイには、フロースルー装置が含まれるが、これに限定されない。
【００２６】
フロースルーアッセイにおいて、ある試薬（通常は抗体）を、膜表面上の所定の領域に固定化する。次に、装置を通して試料体積を送り込むために、リザーバーとして働く吸着層上にこの膜を重ねる。固定化後、非特異的相互作用を最小限に抑えるよう、その膜上のタンパク質結合部位の残余をブロックする。本アッセイを用いる場合、抗体に特異的なマーカーを含有する体液試料を膜に添加し、マトリックスを介して濾過し、固定化された抗体にマーカーが結合できるようにする。必要に応じて実施される第二の段階において（第一の反応物質が抗体である実施形態において）、捕捉したマーカーと反応してサンドイッチを完結させる、タグを付加した第二の抗体（酵素抱合物、着色したラテックス粒子に結合させた抗体、又は着色したコロイドに組み込まれた抗体）を添加又は放出させることができる。あるいは、第二の抗体を試料と混合して、単一のステップで添加することもできる。マーカーが存在すれば、着色されたスポットが膜表面上に生じる。
【００２７】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用する場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明において有用な免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスのものであり得る。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性抗体、ヒト型化抗体及びキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより作製した断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体並びに上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗体が抗原に優先的に結合する場合、例えば、他の分子と約３０％未満、好ましくは２０％、１０％又は１％の交差反応を起こす場合、抗体、又は一般的にあらゆる分子は、その抗原（又は他の分子）に「特異的に結合する」。抗体部分には、Ｆｖ及びＦｖ’部分が含まれる。
【００２８】
ＯＲＰ１５０の検出に有用なある抗体は、配列ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭを認識し得る。他の適切な抗体は、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ，１０９１−１ Ｎａｋａ，Ｆｕｊｉｏｋａ−ｓｈｉ，Ｇｕｎｍａ，３７５−０００５，Ｊａｐａｎ（株式会社免疫生物研究所、郵便番号 ３７５−０００５ 群馬県 藤岡市 中 １０９１−１）から市販されている。
【００２９】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。
【００３０】
哺乳類対象からの体液試料の採取に関する説明書と、
前記試料中の酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片のレベルを測定するための１つ又は複数の試薬と、
を含む、前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングするためのキットも提供される。
【００３１】
前記１つ又は複数の試薬は、上述のような第一のマーカーに特異的に結合する抗体を含み得る。本キットは、特に組織低酸素症の徴候となる臨床症候が上述のように心不全又は虚血性心疾患である場合に、哺乳類対象において組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の指標となる第二のマーカーレベルを測定するための１つ又は複数の試薬がさらに含まれ得る。
【００３２】
哺乳類対象から体液試料を採取するための説明書は、必要に応じて添付される。さらに、本発明のキットは、場合によっては、（１）哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングするためのキットの使用説明書；（２）本キット中に存在するあらゆる抗体に対する標識化結合パートナー；（３）何らかのこのような抗体が固定化された固体相（試薬ストリップ等）；及び（４）診断、予後診断又は治療目的の使用又はそれらの任意の組み合わせに対して規制当局から認可を受けたことを示す表示又は差し込みの注意書き、のうち１又は複数を必要に応じて備えることができる。本抗体又は各抗体に対する標識化結合パートナーが提供されない場合、検出可能なマーカー、例えば化学発光、酵素的、蛍光又は放射性部分等で、本抗体又は各抗体それ自体を標識することができる。
【００３３】
ＯＲＰ１５０は、粥状プラークの血管壁において過剰発現し（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：１９３０−４１）、主としてマクロファージに存在する。発明者らにより、心不全及び虚血性心疾患（その主原因はアテローム性動脈硬化症）の患者由来の血漿中でＯＲＰ１５０が増加することが明らかとなり、また、アテローム性動脈硬化症が原因となる他の臨床症候、例えば虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患又は他の急性冠不全症候群等の患者において血漿中のＯＲＰ１５０が増加すると思われるので、これらの状態の存在又は重篤度の指標としてこのマーカーを使用することができる。同様に、組織が低酸素状態であり得る慢性肺疾患の患者においても、血漿中のＯＲＰ１５０が上昇していると予想される。現在、肺疾患患者、例えば、家庭での酸素治療を受けている患者のｐＯ２を測定する簡便な方法がないが、ＯＲＰ１５０測定のさらなる用途として、そのような患者の酸素治療のモニタリングにおける使用が挙げられる。浸潤性腫瘍は、血管内皮増殖因子に対するシャペロンとして、ＯＲＰ１５０を過剰発現し得るため（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９８；７８：６９９−７０６；Ｏｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４２０６−１３；Ａｓａｈｉら、ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００２；９０：４６２−６）、腫瘍マーカーとして、特に中心領域が相対的に低酸素状態であり得る浸潤性腫瘍のマーカーとして、使用することができる。このような用途は、これらの浸潤性腫瘍の診断、さらに治療のモニタリングにも拡大適用されるであろう。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、哺乳類対象における組織低酸素症のマーカーとしての又は組織低酸素症に起因する臨床症候のマーカーとしての、酸素調節タンパク質ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片の使用を提供する。組織低酸素症に起因する臨床症候は、心不全、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患、肺疾患又は腫瘍増殖の結果であり得る。
【００３５】
別の局面において、本発明は、哺乳類対象での心不全又は虚血性心疾患の存在又は重篤度の決定において診断ツールとして使用するための心臓マーカーとしてのＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片の使用を提供する。ＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片は、心不全又は虚血性心疾患の指標となるさらなるマーカーと組み合わせて使用し得る。さらなるマーカーは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）等のナトリウム利尿ペプチドであり得る。
【００３６】
本発明は、哺乳類対象由来の体液試料がＯＲＰ１５０又はそのペプチド断片の存在について測定される、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候の存在又は重篤度を調べるための方法も提供する。組織低酸素症の徴候となる臨床症候は、心不全又は虚血性心疾患であり得、体液は血漿であり得る。診断又は予後診断は、健康な個体又は個体群から得られた値と比較して得られた結果に基づいて行い得る。測定は、イムノアッセイを用いて行い得る。
【００３７】
本発明は、哺乳類対象から体液試料を取得することと、前記（ＯＲＰ１５０）又はその断片の存在及び／又は量を示すために前記試料に対して測定を行うことと、を含む、酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片の検出方法を提供する。
【００３８】
本発明の各局面についての好ましい特徴は、他の局面の各々に対して準用される。本明細書中で言及する先行技術の文書は、法律が許す範囲内で最大限に組み込まれる。
【００３９】
（実施例）
ここで、次の非限定例において、本発明をより詳しく説明する。以下、添付の図について説明する。
【実施例１】
【００４０】
研究対象
心エコー検査により左心室の収縮機能障害（左室（ＬＶ）駆出分画＜４５％）が認められた１２０名の心不全患者を調べた。さらに３７３名の心筋梗塞の患者も集めた。３種類の標準的基準、即ち適切な症候群、梗塞の急性のＥＣＧ変化（ＳＴ上昇、新しいＬＢＢＢ）及びクレアチンキナーゼ（ＣＫ）が、正常値の上限値の少なくとも２倍である、つまり＞４００ＩＵ／Ｌである、という基準のうち少なくとも２つを伴って現れるものとして、急性心筋梗塞を定義した。心筋梗塞患者１７７名も、心エコー検査により調べ、収縮機能を正常、軽度、中度又は重度として分類した。年齢及び性別構成について適合させた、ＬＶ駆出分画が＞５０％である正常対照を、広告により地域集団から集めた。全対象者からこの研究への参加に対するインフォームドコンセントを得て、地域のＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（倫理委員会）から承認を受けた。
【００４１】
心筋梗塞患者におけるエンドポイント
指標となる入院からの退院後の原因を問わない死亡率及び心臓血管の罹患率（心不全による再入院）としてエンドポイントを定義した。フォローアップ中に死亡した患者の検閲後に死亡以外の全エンドポイントに対する多変量解析を行った。
【００４２】
血液採取及び血漿抽出
健常者及び心不全患者の場合は、１５分間ベッドで休息を取らせた後に、末梢血管血液２０ｍｌを、５００ＩＵ／ｍｌのアプロチニンが入った、予め冷やしておいたＮａ−ＥＤＴＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ 血液）試験管に採取した。心筋梗塞患者の場合は、症候群発症後、７２〜９６時間の間に１回血液試料を採取した。４℃にて３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った後、血漿を分離し、アッセイを行うまで−７０℃に保存した。アッセイ前に、Ｃ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムで血漿を抽出し、遠心エバポレーターで乾燥させた。心不全患者から尿検体もいくつか回収した。これらも上述のようにＣ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムで抽出した。
【００４３】
ＯＲＰ１５０のアッセイ
ＭＲＣ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒにおいて、ヒトＯＲＰ１５０配列のＮ末端ドメインに相当するペプチド（アミノ酸３３−４５）（ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭ）（Ｉｋｅｄａ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９７；２３０：９４−９）を合成した。アミノ酸１−３２は、本タンパク質に対するシグナル配列を表し、成熟ＯＲＰ１５０タンパク質には存在し得ない。本配列のＣ末端に付加させたシステインへのマレイミドカップリングによりキーホールリンペットヘモシアニンと共役させたこのペプチドをウサギに対して、毎月注射した。血清由来のＩｇＧを、プロテインＡセファロースのカラムで精製した。上記ペプチドも、ビオチン−マレイミドを用いて、ＮａＨ２ＰＯ４を１００、ＥＤＴＡを５（単位はｍｍｏｌ／ｌ）含有する、ｐＨ７．０のバッファー中で、２時間、ビオチン化した。過剰なシステインで反応停止させた後、アセトニトリル勾配を用いてＨＰＬＣにより、得られたトレーサーを精製した。あるいは、Ｃ又はＮ末端にビオチン化アミノ酸を取り込んで上記ペプチドを合成し、トレーサーとして使用することが可能であろう。血漿抽出物及び標準は、ＮａＨ２ＰＯ４ １．５、Ｎａ２ＨＰＯ４ ８、ＮａＣｌ １４０、ＥＤＴＡ １（単位はｍｍｏｌ／ｌ）及びウシ血清アルブミン １、アジド ０．１（単位はｇ／ｌ）から成るＩＬＭＡ（免疫発光アッセイ）バッファーを用いて再調製した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１ｍｏｌ／ｌの重炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．６ １００μｌ中の抗−ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）１００ｎｇで被覆した。次に、重炭酸バッファー中の０．５％ウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。このウェル中の標準物質又は試料とともにＩｇＧ ２００ｎｇをプレインキュベーションすることにより、競合的免疫反応アッセイを開始した。一晩インキュベーションを行った後、希釈したビオチン化ＯＲＰペプチドトレーサー ５０μｌ（保存溶液中２μｌ／ｍｌ又は総量１００−５００ｆｍｏｌ）を、このウェルに添加した。４℃にてさらに２４時間インキュベーションを行った後、ウェルを洗浄バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ １．５ｍｍｏｌ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ８ｍｍｏｌ／ｌ、ＮａＣｌ ３４０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ ０．５ｇ／ｌ、アジ化ナトリウム ０．１ｇ／ｌ）で３回洗浄した。メチル−アクリジニウムエステル（ＭＡＥ）で標識したストレプトアビジンを、記載されているように合成した（Ｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１０２：４１１−４１６）。ストレプトアビジン−ＭＡＥ（５００万相対発光ユニット／ウェル）を含有するＩＬＭＡ １００μｌとともにウェルを２時間インキュベーションした。さらに洗浄を行った後、１Ｍ 硝酸（Ｈ２Ｏ２とともに）１００μｌ及び、次に、ＮａＯＨ １００μｌ（臭化セチルアンモニウムと共に）を連続して注入して、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬＸ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒにおいて化学発光を検出した。検出の下限値（ペプチド濃度０における標準偏差の３倍として定義）は、試験管あたり９．８ｆｍｏｌ又は抽出した血漿中９８ｆｍｏｌ／ｍｌであった。アッセイ内の変動係数は、２、３０、５００ｆｍｏｌ／試験管に対してそれぞれ、３．１、４．３及び５．９％であった。ＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｎ末端プロＢＮＰ又はＣＮＰ等の心不全において上昇することが既に明らかとなっているペプチドとの交差反応性はなかった。
【００４４】
アッセイＮ−ＢＮＰ
Ｎ末端プロＢＮＰに対するアッセイは、Ｋａｒｌ，ら、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ Ｓｕｐｐｌ １９９９；２３０：１７７−１８１により記載されている非競合Ｎ末端プロＢＮＰアッセイに基づくものであった。ウサギポリクローナル抗体は、ヒトＮ末端プロＢＮＰのＮ末端（アミノ酸 １−１２）及びＣ末端（アミノ酸 ６５−７６）に対して作製された。血清由来のＩｇＧをプロテインＡセファロースカラムで精製した。Ｃ末端に向けられた抗体（各ＥＬＩＳＡプレートウェルに対して、１００μＬ中０．５μｇ）を、捕捉抗体として用いた。Ｎ末端抗体をアフィニティ精製し、ビオチン化した。分注した試料（２０μｌ）又はＮ−ＢＮＰ標準物質を、Ｃ末端抗体で被覆したウェル中で、４℃にて２４時間、ビオチン化した抗体とともにインキュベーションした。洗浄後、メチル−アクリジニウムエステル（ストレプトアビジン−ＭＡＥ、５ｘ１０６相対発光ユニット／ｍｌ）で標識したストレプトアビジン（Ｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１０２：４１１−４１６）を、各ウェルに添加した。既に述べたようにしてＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬＸ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒでプレートを読み取った（Ｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１０２：４１１−４１６）。検出の下限値は、非抽出血漿で５．７ｆｍｏｌ／ｍｌであった。アッセイ内、及びアッセイ間において、変動係数は、それぞれ２．３％及び４．８％で、許容範囲内であった。ＡＮＰ、ＢＮＰ又はＣＮＰとの交差反応はなかった。
【００４５】
血漿抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー及びゲル電気泳動
３００ｘ７．８ｍｍ Ｂｉｏ−Ｓｅｐ ＳＥＣ Ｓ２０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において、移動相として、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．８）を用いて、流速１ｍｌ／分で、血漿抽出物を定組成サイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。分子量を決定するために使用した標準物質には、ＩｇＧ（１５０ｋＤ）、ＢＳＡ（６８ｋＤ）、オボアルブミン（４４ｋＤ）、ダイズトリプシン阻害剤（２０ｋＤ）、アプロチニン（６．５ｋＤ）及びトリプトファン（２０４Ｄ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫより）が含まれていた。上記のように、ＯＲＰ１５０に対するアッセイを行う前に、２０秒ごとに回収した分画を遠心エバポレーターで乾燥させた。
【００４６】
統計解析
ＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＭＩ）を用いて統計解析を行った。平均値±ＳＥＭ又は非ガウス分布のデータに対する中央値（範囲）としてデータを表し、それを解析前に対数変換した。連続型変数に対して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。複数の独立変数の相関は、一変量の一般線形モデル法（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌ法）を用いて、報告された最小有意差Ｐ値により求めた。ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関分析を行い、中央値、四分位間範囲を表すボックス及び２．５ｔｈから９７．５ｔｈ百分率を表すひげ（ｗｈｉｓｋｅｒ）から成るボックスプロットを構築した。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒの生存時間解析を用いて、ＭＩ後の重症度分類におけるペプチドレベルの有用性について調べた。
【００４７】
結果及び考察
ＯＲＰ１５０アッセイの性能
ＯＲＰ１５０ペプチドに対する典型的な標準曲線を図１で示すが、ここでは、本ペプチドの濃度が増加するに従い化学発光が低下することが示されている。約３００ｆｍｏｌ／試験管において、トレーサー結合変換の半分が起こった。心不全患者の血漿及び尿抽出物の希釈物は、標準曲線との並行性を示した。検出の下限値は９．８ｆｍｏｌ／試験管であった。
【００４８】
さらにヒト血漿抽出物に対して、定組成のサイズ排除クロマトグラフィーを行った（図２）。これは、３つの大きな免疫反応分画、１つは１５０ｋｄ（これはヒトＯＲＰ１５０タンパク質の分子量と予想される。）、６．７ｋＤから７．４ｋＤのそれより小さいピーク及び１．８から３．３ｋＤの最大のピーク、に分けられた。この結果から、血漿から抽出されたＯＲＰ１５０が断片化され、他のエピトープ特異的抗体で検出することができる他の断片があり得ることが示唆される。
【００４９】
ヒトにおけるＯＲＰの検出に対する結論
ＯＲＰに対する特異的なイムノアッセイにより、血漿及び尿中においてこのペプチドの存在が検出された。ＯＲＰ１５０が小胞体関連タンパク質であるため、この発見は予想外のものである。さらに、血漿における免疫反応性が、いくつかの分子量体由来であることから、ＯＲＰ１５０の断片がエピトープ特異的抗体を用いて検出され得ることが示唆される。
【００５０】
健常者、心不全患者及び心筋梗塞患者におけるＯＲＰ１５０
健常者、心不全（ＨＦ）患者及び心筋梗塞（ＭＩ）患者の特徴を表１に示す。これらの群は性別についてよく適合していた。健常者及びＨＦ群は、年齢について適合していたが、ＭＩ群は他の群よりも年齢層が高かった（Ｐ＜０．００１）。解析前に、対数変換によりペプチドレベルを正規化した。図３は、健常者、ＨＦ患者群及びＭＩ患者群におけるＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ−１５０レベルを示す。ＡＮＯＶＡにより、ＬｏｇＮ−ＢＮＰ（Ｐ＜０．０００５）及びＬｏｇＯＲＰ−１５０（Ｐ＜０．０００５）における差が、上記３群の間で明らかとなった。Ｎ−ＢＮＰの場合、ＨＦ患者及びＭＩ患者両方のレベルが健常者よりも高かった（Ｐ＜０．０００５、多重比較のためにＴｕｋｅｙ検定を使用。）が、ＨＦ及びＭＩ群におけるレベルは同程度であった（Ｐは有意ではない）。ＯＲＰ１５０の場合、ＨＦ患者及びＭＩ患者両方のレベルが健常者よりも高かった（Ｐ＜０．０００５、多重比較のためにＴｕｋｅｙ検定を使用。）。ＨＦ群におけるレベルはまた、ＭＩ群におけるレベルよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０００５）。
【００５１】
【表１】
【００５２】
心不全におけるＯＲＰ１５０
正常群中では、Ｎ−ＢＮＰが年齢に依存して変化していた（相関係数 ｒ＝０．４３８、Ｐ＜０．０００５）。しかし、ＯＲＰ１５０は、年齢に対して有意に相関しなかった。正常群とＨＦ群を合わせた場合も、Ｎ−ＢＮＰは、年齢に相関していた（ｒ＝０．３０６、Ｐ＜０．０００５）が、ＯＲＰ１５０の年齢との相関性は小さかった（ｒ＝０．１３８、Ｐ＜０．０２）。
【００５３】
図４は、男女両方の正常及びＨＦにおけるＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルを示す。これらのペプチドレベルは、ＨＦの男女両方で上昇していた（両者に対してＰ＜０．０００５、一変量の一般線形モデル（ＧＬＭ）法を用いた。）。ＨＦにおける両ペプチドは、ＮＹＨＡクラスにより判定した場合のＨＦの重症度に依存して上昇していた。図５は、男女両方において、ＮＹＡＨクラスが上がると両ペプチドが上昇することを示す。Ｎ−ＢＮＰの場合、健常者における値は、ＮＹＡＨクラス、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとは異なっていた（全てに対してＰ＜０．０００５、Ｔｕｋｅｙ検定を使用。）。ＯＲＰ１５０の場合、健常者における値は、ＮＹＡＨクラス、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとは異なっていた（それぞれに対してＰ＜０．００２、０．０００５、０．０００５、０．０００５、Ｔｕｋｅｙ検定を使用。）。
【００５４】
一変量ＧＬＭ法を用いて、共変量として年齢を、性別及びＮＹＨＡクラスを因子として入力して、心不全患者における対数正規化したＮ末端プロＢＮＰレベルの解析を行ったところ、年齢、性別及びＮＹＡＨクラスが有意な予測変数で（全てに対してＰ＜０．０００５）、本モデルに対するｒ２は０．６７５（Ｐ＜０．０００５）となった。性別とＮＹＡＨクラスとの間に有意な相関があったことから、ＮＹＨＡの上昇に伴うＮ−ＢＮＰの上昇は、男性と女性とで異なる可能性があることが示唆された（Ｐ＜０．００７）。対数正規化したＯＲＰ１５０データについて同様の解析を行ったところ、ＮＹＡＨクラスのみが有意な予測変数で（Ｐ＜０．０００５）、本モデルに対するｒ２は０．５１２（Ｐ＜０．０００５）となった。年齢及び性別は有意な予測変数ではなかったが、性別とＮＹＡＨクラスとの間に有意な相関があった（Ｐ＜０．０００５）ことから、ＮＹＨＡクラスの上昇に伴うＯＲＰ１５０上昇は、男性と女性との間で異なることが示唆された。ＨＦ患者の大多数においてその原因は虚血性心疾患であるが、これらのペプチドを用いて原因と関係なくＨＦが検出された。
【００５５】
例えば、９５６ｆｍｏｌ／ｍｌというＯＲＰ１５０のカットオフ値を用いると、上述の血漿抽出物におけるアッセイ技術に基づいて得られたこのようなレベルから、ＨＦ例の９５％が診断され、特異度は３９．４％となろう。従って、この例の場合、ＯＲＰ１５０は、５１．１％の陽性的中率を有し、９２．２％の陰性的中率を有する。このようなカットオフ値を用いることにより、ＨＦ診断で効果的に除外を行うことが可能になると考えられる。
【００５６】
このようなカットオフ値は、アッセイ法により影響を受ける可能性があり、これらが競合的アッセイであれ非競合的アッセイであれ、そしてペプチド又はタンパク質標準物質を用いるかどうかに関わらず、ＯＲＰ１５０に対する新しいアッセイに対して別のカットオフ値を確立する必要がある（下記のアッセイ法に対する注意を参照のこと。）。
【００５７】
下記に挙げたものは、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方に対する、ＨＦの診断のためのカットオフ値（単位はｆｍｏｌ／ｍｌ）であり、様々な敏感度及び特異度も報告している。
【００５８】
【表２】
【００５９】
予測変数をＬｏｇＮ−ＢＮＰ及びＬｏｇＯＲＰ１５０として、逐次的ロジスティック回帰分析により、ＨＦの有無を予測した。正常群とＨＦ群とは年齢及び性別が適合しているので、年齢及び性別は用いなかった。Ｎ−ＢＮＰ（ペプチドレベル５０％上昇に対するオッズ比は１．５６、ペプチドレベル１０倍上昇に対するオッズ比は１２．２９、Ｐ＜０．０００５）及びＯＲＰ１５０（ペプチドレベル５０％上昇に対するオッズ比は２．４６、ペプチドレベル１０倍上昇に対するオッズ比は１６３．９８、Ｐ＜０．０００５）の両方がＨＦの存在の独立予測因子であり、前進法又は後進法のいずれを用いたかということに関係なく、総ｒ２（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｎｅｌｌ）は０．５５であり、Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅのｒ２は０．７４であった。
【００６０】
ロジスティック回帰は、「ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝ａ＋ｂ１χ１＋ｂ２χ２＋ｂ３χ３＋・・・」（式中、ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝ｌｏｇｅ（ｐ／（１−ｐ））であり、ｐはＨＦを有する確率を示し、ａは定数であり、ｂ１及びｂ２は、変数χ１、χ２を乗じる係数を表す。）の方程式にデータを当てはめて行う（この例において、χ１及びχ２は、ｌｏｇ１０（Ｎ−ＢＮＰ）及びｌｏｇ１０（ＯＲＰ１５０）である。）。測定を行いｌｏｇ１０変換したＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルを入れることにより、このモデルを使用して心不全を有する確率を計算することができた。
【００６１】
ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−２１．６４２＋２．５０９＊ｌｏｇ１０（Ｎ−ＢＮＰ）＋５．１＊ｌｏｇ１０（ＯＲＰ１５０）
従って、ｐが０．１０２より大きい場合、ＨＦは、９５％の敏感度及び６８．３％の特異度で検出される。このアルゴリズムにより、本ペプチドのうちいずれか単独の場合よりも高い特異度で心不全が検出できることに留意すること（敏感度９５％で、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０に対する特異度は、それぞれ４０．６％及び３９．４％のみ。）。
【００６２】
上記モデルからの予後診断指標（ＨＦ群の構成員の可能性）を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築した（図６）。ＨＦ同定に対して、本モデルに対するＲＯＣ領域は０．９５であり、Ｎ−ＢＮＰ（０．９１）又はＯＲＰ１５０（０．８４）単独よりも高かった。
【００６３】
下記の表では、上記アルゴリズムにより決定される様々な確率のカットオフ値に対する、ｌｏｇ１０変換Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルを用いた、ロジスティックモデルの敏感度及び特異度を示す。ＨＦ診断の敏感度を最大にしたいか、又はその特異度を最大にしたいかによって、本モデルからの異なる確率のカットオフ値を選ぶことができるであろう。
【００６４】
【表３】
【００６５】
心不全におけるＯＲＰ１５０に対する結論
これらの知見から、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０の両方がＨＦにおいて上昇しているが（そしてＨＦの重症度も上昇している。）、Ｎ−ＢＮＰが対象者の年齢及び性別からより大きな影響を受けていることが示唆される（年齢が高くなり、及び女性である場合、高値を示す。）。一方、ＯＲＰ１５０は、年齢に依存する要素がなく、性別によりわずかに影響を受けた。両ペプチドとも、ＨＦの同定に有用であったが、これら２種類のペプチドを組み合わせると、ＨＦの診断においてさらに可能性が広がる。
【００６６】
心筋梗塞におけるＯＲＰ１５０
心筋梗塞（ＭＩ）群の患者の特徴を表１に示すが、性別は適合していたが年齢層が正常群よりもわずかに高くなった（ｐ＜０．０００５）。Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方とも、心筋梗塞から２−３日後に得た血漿中のレベルが上昇していた（両方に対してＰ＜０．０００５、図３）。Ｎ−ＢＮＰのレベルは、ピークのクレアチンキナーゼレベルと相関していた（ｒ＝０．２４、Ｐ＜０．０００５）ことから、梗塞の大きさとの関係が示唆される。しかし、ＯＲＰ１５０レベルは、ピークのクレアチンキナーゼレベルと有意な相関関係がなかった（ｒ＝０．０５、Ｐは有意でない。）
【００６７】
Ｎ−ＢＮＰは、年齢（ｒ＝０．３９、Ｐ＜０．０００５）及びクレアチニン（ｒ＝０．３８、Ｐ＜０．０００５）の両方と相関しており、性別及び梗塞の影響を考慮に入れた後も偏相関係数は有意であった（年齢に対して（ｒ＝０．３９、Ｐ＜０．０００５）及びクレアチニンに対して（ｒ＝０．３６、Ｐ＜０．０００５））。対照的に、ＯＲＰ１５０は、年齢とは有意な相関がなかったが、クレアチニンとはわずかに相関関係が認められ（ｒ＝０．２０、Ｐ＜０．０００５）、年齢及び梗塞の効果を考慮に入れた場合、偏相関係数はさらに低下した（クレアチニンに対して、（ｒ＝０．１２、Ｐ＜０．００７）。）。
【００６８】
共変数として年齢及びクレアチニンを用い、因子としてＭＩの存在及び性別を用いて、逐次的線形回帰分析により、対数正規化したＯＲＰ１５０の決定要因を求めた。ＭＩの存在（Ｐ＜０．０００５）及びクレアチニン（Ｐ＜０．００４）のみが、ＯＲＰ１５０レベルの有意な独立予測因子として同定され、全分散は１４％であった（Ｐ＜０．０００５）。Ｎ−ＢＮＰレベルについて同様の解析を行ったところ、年齢、性別、クレアチニン及びＭＩの存在が、有意な独立予測因子として同定された（全てに対してＰ＜０．０００５）。従って、これらの知見から、ＨＦ群において、ＯＲＰ１５０レベルは、Ｎ−ＢＮＰレベルよりも、年齢及び性別からの影響を受けにくいということが確認される。
【００６９】
本発明者らは、ロジスティック回帰分析により、独立変数として年齢、性別、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０を用いて、従属変数としてのＭＩの有無を予想した。前進及び後進逐次的回帰分析両方を用いて、４種類全てが、ＭＩの有無に対する独立予測変数として同定され、本モデルにおいてｒ２は０．５６（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｎｅｌｌ）又は０．７９（Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅ）となった。オッズ比は、Ｎ−ＢＮＰの場合（ペプチドレベル５０％上昇に対して１．９４、Ｐ＜０．０００５）；ＯＲＰ１５０の場合（ペプチドレベル５０％上昇に対して１．６１、Ｐ＜０．０００５）であった。
【００７０】
Ｎ−ＢＮＰの血漿レベルは、患者のＫｉｌｌｉｐクラスと関連があった（図７、Ｐ＜０．０００５）。一方で、ＯＲＰ１５０のレベルは、Ｋｉｌｌｉｐクラスに関係なく、全てのＭＩ患者において上昇した（図７）。心エコー検査スキャンを行った１７７名の患者において、Ｎ−ＢＮＰレベルがＬＶ機能不全の程度と関連していることが分かった（図８、Ｐ＜０．０００５）。一方で、ＯＲＰ１５０のレベルは、ＬＶ機能不全の程度に関係なく、全てのＭＩ患者において上昇しており、明らかに「正常な」ＬＶ機能を有する患者でさえも、ＯＲＰ１５０レベルが上昇していた（図８）。
【００７１】
ＭＩ後の転帰
原因を問わない死亡率及びＭＩ後の心不全を伴う再入院率について検討して、これらの転帰の予測におけるＯＲＰ１５０の有用性を調べた。退院後の平均のフォローアップ期間は、４２６日であり、５−７６４日の範囲であった。３６７例のうち、フォローアップ期間中に死亡例が３９例あった。また、心不全による再入院も２２例あった。
【００７２】
死亡した患者は、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルが有意に高かった（それぞれＰ＜０．０００５及びＰ＜０．００１、図９）。さらに、両ペプチドとも、心不全で後日再入院した患者において上昇していた（Ｎ−ＢＮＰに対してＰ＜０．０００５、ＯＲＰ１５０に対してＰ＜０．０２５、図１０）。
【００７３】
ロジスティック回帰分析を用いて、年齢、クレアチニン、梗塞の既往歴、Ｋｉｌｌｉｐ クラス及びＬｏｇＮ−ＢＮＰ又はＬｏｇＯＲＰ１５０について、転帰としての死亡の予測因子を調べた。死亡に対する有意な独立予測因子には、Ｎ−ＢＮＰ（ペプチドレベル１０倍上昇のオッズ比は３．９５、Ｐ＜０．００２）及びＯＲＰ１５０（ペプチドレベル１０倍上昇のオッズ比は４．８５、Ｐ＜０．０５）が含まれ、Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅのｒ２は０．３２であった。後進及び前進回帰分析により、これらの２つの独立予測変数を確認したが、クレアチニンからのさらなる寄与があった（１０倍上昇に対するオッズ比は１９．５６、Ｐ＜０．０５）。これらの知見から、Ｎ−ＢＮＰレベルと独立して、ＯＲＰ１５０がＭＩ後の死亡の予測因子となることが示唆される。
【００７４】
これらの知見を確認するために、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存時間解析を行った。対象者を中央値群の上下で分けたところ、使用したペプチドがＮ−ＢＮＰ（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０００５）であるか又はＯＲＰ−１５０（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．００２）であるかにかかわらず、生存率は、これらの２群間で有意差があった（図１１）。注目すべきことは、Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０単独で定義した中央値以下の群においてでさえ、間違いなく死亡率が０ではないことである（中央値以上の群よりも低いが。）。Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方で順位付けした群における順位付けを利用して、患者を３種類の群に分ける、新規の予後診断指標を生み出した（両ペプチドが中央値以下、いずれかのペプチドが中央値以上、両ペプチドが中央値以上）。図１２において、この新しい予後診断指標を用いた生存時間解析を示すが、ここでは、両ペプチドが中央値以下であった群において観察期間中の死亡例がなく、両ペプチドが中央値以上であった群では死亡率が高く、いずれかのペプチドが中央値以上であった群では死亡率が中間であったことが示されている（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０００５）。
【００７５】
ＭＩにおけるＯＲＰに対する結論
心筋梗塞で見られるように、血漿ＯＲＰ１５０レベルは、虚血性心疾患において上昇する。一方、Ｎ−ＢＮＰもこれらの患者において上昇しているが、年齢、ＬＶ機能不全、症候及び徴候（Ｋｉｌｌｉｐクラスにより判定）並びに腎臓機能に対するＯＲＰ１５０レベルの依存度は、Ｎ−ＢＮＰよりも低い。両ペプチドとも、心筋梗塞による指標となる入院後の死亡又は心不全による再入院等の優れた転帰予測因子である。特に、両ペプチドを組み合わせると、心筋梗塞後の重症度分類にとりわけ有用であり得る（死亡の予測）。
【００７６】
血管疾患におけるＯＲＰに対する総体的結論
上記のデータから、ＯＲＰ１５０がヒト血漿に分泌され、尿中でも検出できることが示される。体液中にＯＲＰ１５０の断片があり得る。ＯＲＰ１５０のレベルは、心不全及び虚血性心疾患の両方において上昇し、その測定値が年齢及び性別により左右されることはより少ないようである。アテローム性動脈硬化症は血管疾患の主原因であるので、例えば、発作、末梢血管性疾患、動脈瘤又は急性冠症候群等、組織低酸素症が存在する他の状態の診断又は予後診断にＯＲＰ１５０を使用することができる。心不全において、それ自身において診断補助となることに加えて、Ｎ−ＢＮＰの測定を補うことができた。心筋梗塞において、それを予後診断の指標として用い、心不全による死亡及び再入院両方を予測できる。単独で、又はＮ−ＢＮＰと組み合わせて、心筋梗塞後のＯＲＰ１５０測定は、患者が非常に低い又は高いリスク群であることを予測することができる重症度分類に対して役立つ。これは、患者に対する治療選択を計画するのに有用であると考えられる。
【実施例２】
【００７７】
さらに１１４名の不安定狭心症患者又は非ＳＴ上昇心筋梗塞（心内膜下の心筋梗塞、クレアチンキナーゼが正常上限値の２倍以下に上昇することにより定義。）について調べた。全患者が休息時の胸痛を有し、治療のために入院していた。平均（範囲）年齢は、６６．８歳（３８〜９３）であり、男性７４名、女性４０名であった。入院から３〜５日後に血液試料を採取し、トロポニンＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と、実施例１で述べたようにしてＯＲＰ１５０タンパク質とＮ−ＢＮＰとを測定した。
【００７８】
実施例１において心筋梗塞患者に対して述べたようにしてエンドポイントに関して患者のフォローアップを行った。
【００７９】
平均フォローアップ期間である４０１日間（２６〜７６４日間の範囲）の間、死亡例が９例あった。トロポニンＴレベルは、生存者（０．１９（０．００５〜０．５５７）μｇ／ｌ）と死亡例（０．１２（０．００５〜１．１４）μｇ／ｌ）とを比較して有意差はなかった。一方、ＯＲＰ１５０及びＮ−ＢＮＰレベルの両方が、生存者と比較して死亡例で有意に高かった（それぞれＰ＜０．００６及びＰ＜０．０５、図１３）。
【００８０】
症例分類に対して、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベル（中央値以下又は以上）の両方を用いて、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存期間解析を行った。対象者を中央値の上下でグループ分けしたところ、使用したペプチドがＮ−ＢＮＰ（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０１６）であるか又はＯＲＰ１５０（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．０１５）であるかにかかわらず、これらの２群間で生存率に有意差が認められた（図１４）。両ペプチドを用いて、患者を３群に分類（両ペプチドが中央値以下、いずれかのペプチドが中央値以上、両ペプチドが中央値以上）した場合、生存期間解析から、両ペプチドが中央値以下であった群において観察期間中に死亡例はなく、両ペプチドが中央値以上であった群では死亡率が高いことが示唆された（トレンドに対する対数順位検定により、Ｐ＜０．００２、図１５）。従って、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞に対するこの新しい予後診断指標により、ＳＴ上昇心筋梗塞の患者に対して述べたものと同じように（上述のように）、重症度分類が可能となる。
【００８１】
この特定の例に対する中央値ＯＲＰ１５０レベルは、上述のように抽出した試料に対して競合的アッセイにより調べたところ、１６８０ｆｍｏｌ／ｍｌであった。別の標準を用いた他のアッセイ方式に対して、別の中央値カットオフレベルを確立することができる（以下参照、方法の注）。
【００８２】
不安定狭心症／非ＳＴ上昇ＭＩにおける、ＯＲＰに対する結論
不安定狭心症／非ＳＴ上昇ＭＩによって示されるように、血漿ＯＲＰ１５０及びＮ−ＢＮＰレベルは、虚血性心疾患において上昇する。両ペプチドとも、死亡等の転帰の優れた予測因子である。特に、両ペプチドを組み合わせると、不安定狭心症／非ＳＴ上昇ＭＩ後の重症度分類に特に有用であり得る（死亡の予測）。このような予後診断指標を用いることで、死亡リスクの最も高い患者に対して血行再建又は薬剤による治療を行うことが可能となろう。
【００８３】
実施例におけるＯＲＰ１５０カットオフ値の確立法に対する注意
上記で特定したカットオフ値は、ＣＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭ（ここで、ＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭは、ＯＲＰ１５０のＮ末端配列由来である。）から成るペプチド標準物質を用いた、血漿由来のＯＲＰ１５０抽出物に基づいている。Ｎ末端にシステインが存在するため（まず第一に、免疫付与のために共役物を産生させるために）、このペプチドは二量体を形成する傾向がある。標準物質の二量体及び単量体の割合が様々であることから、免疫反応性が異なる可能性があり、従って、実際のカットオフ値と異なるということになる。
【００８４】
標準物質として全タンパク質配列を用いた場合（例えば、全長ＯＲＰ１５０）、又は、上記ペプチドＣＬＡＶＭＳＶＤＬＧＳＥＳＭを、ジチオスレイトールを用いて還元し、Ｎ−エチルマレイミドと反応させ、二量体形成を妨げた場合、このエピトープに対する作製抗体の免疫反応性が異なる可能性があり、従って、カットオフ値が異なる可能性があると思われる。上記カットオフ値の１０〜１００倍までの補正率を、異なる標準物質又は異なるアッセイ方式（例えば、競合方式とは逆に非競合）に対して適用する必要があり得る。しかし、カットオフ値は、１０〜１０，０００ｆｍｏｌ／ｍｌの範囲にあり、実施例において述べた用途にそれを適用するために、新しいそれぞれのアッセイが、それぞれの特定の目的（診断又は予後診断）に対してそのアッセイに与えられた独自のカットオフ値を有し得ると考えられる。これらのカットオフ値は、上記実施例で説明したように、この試験を心不全の診断に用いるか、又は心筋梗塞もしくは不安定狭心症後の予後を予測するために用いるかによっても異なるであろう。
【実施例３】
【００８５】
バルーン血管形成中の冠循環に対する急性閉塞の効果を、アテローム性動脈硬化症の治療のためにこの治療を受けている冠状動脈疾患のある１９名の患者において評価した。この方法を実施する前、及び血管形成後２時間、６時間及び１２時間の時点で血漿を回収した。ＯＲＰ１５０のレベルを上述のようにして測定した。さらに、心筋梗塞等の他の冠動脈閉塞後に上昇することが知られている既知の心室壁張力の心臓マーカー、即ち、Ｂタイプ又は脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を、免疫発光アッセイを用いて、Ｃ１８カラムにおいて測定した。
【００８６】
図１７において、血管形成後の、ＢＮＰと比較した血漿ＯＲＰ１５０レベルの変化について示す。両マーカーとも、時間経過に従い、有意に変化する（繰り返し測定を行い、分散分析を用いて、Ｐ＜０．００１）。さらに、両ペプチドの血漿レベルは、血管形成後２時間でピークとなり、この時間を越えると基底レベルに低下していく。２時間におけるピークのＯＲＰ１５０レベルは、基底値（Ｐ＜０．０２）及び、６時間及び１２時間でのレベル（両方に対してＰ＜０．００１）と有意差が認められる。ＢＮＰの場合、２時間におけるピーク値は、基底値（Ｐ＜０．００１）及び、６時間及び１２時間でのレベル（両方に対してＰ＜０．００５）と有意差が認められる。
【００８７】
バルーン閉塞後にＯＲＰ１５０レベルが急速に上昇することから、心筋梗塞又は他の急性冠症候群（例えば、非ＳＴ上昇心筋梗塞又は不安定狭心症）において見られるような、冠循環の急性閉塞の指標として使用できることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＯＲＰ１５０ペプチド競合的イムノアッセイに対する標準曲線を示す。患者の血漿抽出物（実線でつながれている黒丸）を２倍ずつ段階希釈して用いたところ、それにより標準曲線との平行性が示された。２名の患者の尿抽出物も２倍ずつ段階希釈したが（点線でつながれた白い三角）、これも標準曲線と平行性が示された。
【図２】ＯＲＰ１５０に対する分画の解析に伴う、サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。１５０ｋｄ、２０ｋＤ、６．５ｋＤに対するマーカーの溶出ポイントを矢印で示す。ＯＲＰ１５０に対する免疫反応性の３つのピークが、１５０、約７及び約３ｋＤで明らかとなっている。
【図３ａ】それぞれ健常者、心不全患者及び心筋梗塞患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルのボックスプロットである。
【図３ｂ】それぞれ健常者、心不全患者及び心筋梗塞患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルのボックスプロットである。
【図４ａ】男女両方の健常者及び心不全患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルそれぞれのボックスプロットである。
【図４ｂ】男女両方の健常者及び心不全患者における、対数変換した血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルそれぞれのボックスプロットである。
【図５ａ】男性及び女性の、心不全の重症度（ＮＹＨＡクラスにより判定）と血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０それぞれとの関係を示す。
【図５ｂ】男性及び女性の、心不全の重症度（ＮＹＨＡクラスにより判定）と血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０それぞれとの関係を示す。
【図６】Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０のみを用いた、及びＮ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０を組み合わせたロジスティックモデルによる予後指標を用いた、心不全の診断に対する受信者動作特性曲線を示す。
【図７】心筋梗塞後の患者におけるＫｉｌｌｉｐクラスに対する血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ−１５０の関係を示す。
【図８】心筋梗塞後の患者における心エコー検査により評価した左心室機能に対する血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ−１５０の関係を示す。心室機能不全は、正常、軽度、中度又は重度に分類される。
【図９】心筋梗塞後の患者における死亡の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルの比較を示す。
【図１０】心筋梗塞後の患者における心不全による再入院の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０レベルの比較を示す。
【図１１ａ】それぞれ、血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１１ｂ】それぞれ、血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１２】血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方の血漿レベルが中央値以下であるか又はそれ以上であるか、及びいずれかのペプチドがそのペプチドの中央値以上である中間群に患者を階層化して行った、心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１３ａ】不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者における死亡の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０のレベルの比較を示す。
【図１３ｂ】不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者における死亡の臨床転帰に対する、Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０のレベルの比較を示す。
【図１４ａ】血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１４ｂ】血漿Ｎ−ＢＮＰ又はＯＲＰ１５０の中央値以下又は以上で患者を階層化して行った、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞後の患者の生存時間解析を示す。
【図１５】血漿Ｎ−ＢＮＰ及びＯＲＰ１５０両方の血漿レベルが中央値以下であるか又はそれ以上であるか、及びいずれかのペプチドがそのペプチドの中央値以上である中間群に患者を階層化して行った、不安定狭心症／非ＳＴ上昇心筋梗塞の後の患者の生存時間解析を示す。
【図１６】ヒトＯＲＰ１５０のアミノ酸配列を示す。
【図１７】冠状動脈バルーン血管形成を行った患者における、ＯＲＰ１５０及びＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド３２）の血漿レベルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象由来の体液試料中の第一のマーカーのレベルを測定することを含み、前記第一のマーカーが酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片である、前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングする、方法。
【請求項２】
前記体液が血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のマーカーのレベルが、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である第一のマーカーのレベルと比較される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である前記第一のマーカーの前記レベルが、組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例又は複数例の哺乳類対象から得た前記第一のマーカーのレベルであり、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない哺乳類対象の前記第一のマーカーについて予め決定された基準範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のマーカーに特異的に結合する抗体と前記試料を接触させ、前記抗体と少なくとも１つの種との間で前記試料において生じた何らかの結合を測定することによって、前記第一のマーカーのレベルが測定される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が心不全又は虚血性心疾患である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
心不全又は虚血性心疾患の指標となる第二のマーカーのレベルを測定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第二のマーカーがナトリウム利尿ペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のマーカーのレベルが、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である第二のマーカーのレベルと比較される、請求項８、９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二のマーカーのレベルが、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である前記第二のマーカーのレベルと比較され、該レベルが組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例又は複数例の哺乳類対象から得た前記第二のマーカーのレベルであるか、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない哺乳類対象における前記第二のマーカーに対して予め決定された基準範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二のマーカーに特異的に結合する抗体と前記試料を接触させ、前記抗体と少なくとも１つの種との間で前記試料において生じた何らかの結合を測定することによって、前記第二のマーカーのレベルが測定される、請求項８から請求項１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が、アテローム性動脈硬化症、虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患、肺疾患又は腫瘍増殖である、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
哺乳類対象からの体液試料の採取に関する説明書と、および
前記試料中の酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片のレベルを測定するための１つ又は複数の試薬と、
を備え、
前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングするためのキット。
【請求項１８】
前記体液が血漿である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記１つ又は複数の試薬が、前記第一のマーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項１７又は請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が心不全又は虚血性心疾患である、請求項１７から請求項２０の何れか一項に記載のキット。
【請求項２２】
心不全又は虚血性心疾患の指標となる第二のマーカーのレベルを測定するための１つ又は複数の試薬をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記第二のマーカーがナトリウム利尿ペプチドである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記第二のマーカー測定用の前記１つ又は複数の試薬が、前記第二のマーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項２２、２３又は２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が、アテローム性動脈硬化症、虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患、肺疾患又は腫瘍増殖である、請求項１７から２０の何れか一項に記載のキット。
【請求項１】
哺乳類対象由来の体液試料中の第一のマーカーのレベルを測定することを含み、前記第一のマーカーが酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片である、前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングする、方法。
【請求項２】
前記体液が血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のマーカーのレベルが、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である第一のマーカーのレベルと比較される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である前記第一のマーカーの前記レベルが、組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例又は複数例の哺乳類対象から得た前記第一のマーカーのレベルであり、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない哺乳類対象の前記第一のマーカーについて予め決定された基準範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のマーカーに特異的に結合する抗体と前記試料を接触させ、前記抗体と少なくとも１つの種との間で前記試料において生じた何らかの結合を測定することによって、前記第一のマーカーのレベルが測定される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が心不全又は虚血性心疾患である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
心不全又は虚血性心疾患の指標となる第二のマーカーのレベルを測定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第二のマーカーがナトリウム利尿ペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のマーカーのレベルが、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である第二のマーカーのレベルと比較される、請求項８、９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二のマーカーのレベルが、組織低酸素症又は組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しないことの指標である前記第二のマーカーのレベルと比較され、該レベルが組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない１例又は複数例の哺乳類対象から得た前記第二のマーカーのレベルであるか、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候が存在しない哺乳類対象における前記第二のマーカーに対して予め決定された基準範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二のマーカーに特異的に結合する抗体と前記試料を接触させ、前記抗体と少なくとも１つの種との間で前記試料において生じた何らかの結合を測定することによって、前記第二のマーカーのレベルが測定される、請求項８から請求項１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が、アテローム性動脈硬化症、虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患、肺疾患又は腫瘍増殖である、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
哺乳類対象からの体液試料の採取に関する説明書と、および
前記試料中の酸素調節タンパク質（ＯＲＰ１５０）又はその断片のレベルを測定するための１つ又は複数の試薬と、
を備え、
前記哺乳類対象における組織低酸素症若しくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候をスクリーニングし、診断し、若しくは予後診断し、前記哺乳類対象における組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候の段階もしくは重篤度を決定し、前記哺乳類対象が組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を発症するリスクを同定し、又は組織低酸素症もしくは組織低酸素症の徴候となる臨床症候を有する哺乳類対象に与えた治療の効果をモニタリングするためのキット。
【請求項１８】
前記体液が血漿である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記１つ又は複数の試薬が、前記第一のマーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項１７又は請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が心不全又は虚血性心疾患である、請求項１７から請求項２０の何れか一項に記載のキット。
【請求項２２】
心不全又は虚血性心疾患の指標となる第二のマーカーのレベルを測定するための１つ又は複数の試薬をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記第二のマーカーがナトリウム利尿ペプチドである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）又はＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記第二のマーカー測定用の前記１つ又は複数の試薬が、前記第二のマーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項２２、２３又は２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
組織低酸素症の徴候となる前記臨床症候が、アテローム性動脈硬化症、虚血性発作、大動脈瘤、末梢血管性疾患、肺疾患又は腫瘍増殖である、請求項１７から２０の何れか一項に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００６−５０７５１０（Ｐ２００６−５０７５１０Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７０３１１（Ｐ２００４−５７０３１１）
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５１１３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６７２９
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（３０２０４４５９１）インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング (38)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５１１３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６７２９
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（３０２０４４５９１）インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング (38)
【Ｆターム（参考）】
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