経皮免疫感作のためのワクチン
【課題】病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）による感染及び／又はそれによって生じる下痢性疾患の他の症状を治療するための、ワクチン及び経皮免疫感作の提供。
【解決手段】経皮免疫感作により送達されるワクチンは病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）による感染及び／又はそれによって惹起される下痢疾患の症状に対して効果的な処置を提供する。たとえば、ＥＴＥＣから誘導される１，２，３，４，５又はそれ以上の、抗原特異的免疫応答を誘発できる抗原（たとえばトキシン、コロニゼーション又はビルレンス因子）、及び任意の１又は２種以上のアジュバント（たとえば、全細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン、Ｂサブユニット又はそれらのトキソイド、脱毒素突然変異体及びそれらの誘導体）が、ワクチンの製造又は全身性及び／又は粘膜免疫の誘発のために使用される。
【解決手段】経皮免疫感作により送達されるワクチンは病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）による感染及び／又はそれによって惹起される下痢疾患の症状に対して効果的な処置を提供する。たとえば、ＥＴＥＣから誘導される１，２，３，４，５又はそれ以上の、抗原特異的免疫応答を誘発できる抗原（たとえばトキシン、コロニゼーション又はビルレンス因子）、及び任意の１又は２種以上のアジュバント（たとえば、全細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン、Ｂサブユニット又はそれらのトキソイド、脱毒素突然変異体及びそれらの誘導体）が、ワクチンの製造又は全身性及び／又は粘膜免疫の誘発のために使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との引照）
本出願は、２００１年２月１３日出願の米国特許仮出願６０／２６８，０１６；２００１年７月１１日出願の米国特許出願６０／３０４，１１０；２００１年８月８日出願の米国特許出願６０／３１０，４４７及び２００１年８月８日出願の米国特許出願６０／３１０，４８３の利益を請求する。
【０００２】
（合衆国政府の助成に関する陳述）
合衆国政府は、本発明に、ＭＲＭＣ／ＤＡＭＤ１７−０１−００８５及びＮＩＨ／ＡＩ ４５２２７−０１の契約に基づくある種の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）による感染及び／又はそれによって生じる下痢性疾患の他の症状を治療するための、ワクチン及び経皮免疫感作に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトの最大の臓器である皮膚は、感染原による侵入に対する生体の防御に重要な役割を果たし、有害な物質と接触する。しかしながら、この皮膚の障壁機能のため、経皮免疫感作がワクチンの腸内、粘膜及び非経口投与の有効な代替を提供したことの評価は、技術分野において妨げられてきたように思われる。
【０００５】
解剖学的に、皮膚は３つの層から構成される。すなわち、表皮、真皮、及び皮下脂肪である。表皮は基底層、有棘皮層、顆粒層及び角化層から構成される。表皮角質層は角化層及び脂質からなる。皮膚の主要抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞はヒトでは表皮の中間部ないし上部有棘皮層にあると報告されている。真皮は主として結合組織を含有する。血管及びリンパ管は真皮及び皮下脂肪に閉じ込められている。
【０００６】
表皮角質層は、死滅した皮膚細胞と脂質の層であリ、旧来より敵対世界に対する障壁と考えられ、角質層の下の生存細胞から生物及び有害な物質を排除すると考えられてきた。表皮角質層はまた皮膚からの水分の喪失に対する障壁としても働く。比較的乾燥した角質層の水分含量は５〜１５％、一方さらに深い表皮及び真皮の層は比較的良好に水和されていて、水分含量は８５〜９０％と報告されている。ごく最近、抗原提示細胞（たとえば、ランゲルハンス細胞）によって提供される二次防御を有することが認められた。しかも、透過促進の存在又は不存在下に皮膚活性アジュバントを用いる、皮膚を通しての免疫感作能力（すなわち経皮免疫感作）は、ごく最近報告されたのみである。望ましくない皮膚反応たとえばアトピー及び皮膚炎は本技術分野においてよく知られているが、経皮免疫感作（ＴＣＩ）の治療的利点の認識は、皮膚が約５００ダルトンよりも大きい分子の通過に障壁を提供すると信じられていたことから、過去には評価されていなかったものと思われる。
【０００７】
本発明者らは様々なアジュバントがＴＣＩにより有効に投与され、別個の、共投与された抗原に対する全身性及び局所性抗原特異的免疫応答を誘発することを示した。たとえばＷＯ９８／２０７３４，ＷＯ９９／４３３５０，及びＷＯ００／６１１８４；米国特許第５，９１０，３０６号及び第５，９８０，８９８号；及び米国特許出願０９／２５７，１８８；０９／３０９，８８１；０９／３１１，７２０；０９／３１６，０６９；０９／３３７，７４６及び０９／５４５，４１７参照。たとえば、ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンのようなアジュバントは、経皮的に適用した場合に安全かつ有効であり、これに反し腸内、粘膜又は非経口経路で投与された場合には、それらの使用は欠点を伴う。
【０００８】
米国特許４，２２０，５８４号及び４，２８５，９３１号では大腸菌誘発性下痢に対する免疫感作のために、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンを使用している。ウサギに免疫原及びフロインドのアジュバントを筋肉内注射した。トキシンによるチャレンジに対する保護及び回腸ループ活性に対する毒性作用の中和が示された。米国特許５，１８２，１０９号にはワクチンとトキシン（たとえば、大腸菌熱不安定性トキシン）の合剤、及び注射、スプレー又は経口投与用形態での投与が記載されている。中和は免疫感作されたウシの初乳において証明された。エンテロトキシンの突然変異バージョンも免疫原性を保持し、毒性は消失していることが記載されている（たとえば米国特許４，７６１，３７２及び５，３０８，８３５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９８／２０７３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／４３３５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第００／６１１８４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５，９１０，３０６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９８０，８９８号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００９／２５７，１８８号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９／３０９，８８１号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００９／３１１，７２０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００９／３１６，０６９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９／３３７，７４６号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００９／５４５，４１７号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，２２０，５８４号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，２８５，９３１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，１８２，１０９号明細書
【発明の概要】
【００１０】
新規な本発明のワクチン処方、ならびにその製造方法及び使用方法が本明細書に開示されている。とくにＴＣＩ、及び下痢性疾患を治療するためのヒトワクチン接種におけるそれに由来する利点が証明されている。重要な開示は、多価ワクチンにおける様々な抗原間の競合が、経皮免疫感作によって投与された場合には、障害にならなかったことである。本発明の他の利点は以下に論じられるか、本明細書の開示から明らかである。
【００１１】
免疫原は、少なくとも１種のアジュバント及び／又は、病原体、たとえば腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対して免疫応答を誘発できる、１又は２種以上の抗原から構成される。アジュバントは、ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（たとえば大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、コレラトキシン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン）又はアジュバント活性を有するそれらの誘導体であり、抗原は細菌トキシン（たとえば熱不安定性又は熱安定性エンテロトキシン）又はコロニゼーションもしくはビルレンス因子（たとえば、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ３，ＣＳ４，ＣＳ５，ＣＳ６，ＣＳ１７，ＰＣＦ ０１６６）又は免疫原活性を有するペプチドフラグメントもしくはその抱合体から誘導することができる。免疫原及びパッチからなるサブユニット又は全細胞ワクチンも前述の製品の製造方法及び免疫感作のためのそれらの使用に従って提供される。病原体に関連する分子（たとえば、トキシン、膜タンパク質）に特異的な免疫応答は、様々な経路（たとえば腸内、粘膜、経皮）によって誘導される。治療できる他の興味ある旅行者疾患には、キャンピロバクテリア症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、肝炎（Ａ及びＢ型肝炎ウイルス）、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ｖｉｖａｘ，Ｐ．ｏｖａｌｅ及びＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）、細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ，Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｉ）、ウイルス性胃腸炎（ロタウイルス）、及びそれらの合併症が包含される。有効性は臨床的又は実験室的基準により評価することができる。防御は代替マーカーを用いて、又は直接、コントロール試験により評価される。本技術分野の熟練者には、本発明の更なる態様が以下の詳細な説明及び請求の範囲ならびにその普遍化から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アジュバントと混合した抗原（ＬＴ＋ＣＳ６）又は抗原単独（ＣＳ６）で免疫感作したヒトボランティア中、ＬＴ（Ａ及びＢ）及びＣＳ６（Ｃ及びＤ）に対する抗体力価における個々のＩｇＧ及びＩｇＡピークの上昇倍率。横のバーは抗体力価における平均上昇倍率を表す。
【図２】経皮経路を用いて免疫感作及びブースター（矢印）されたボランティア中での抗−ＬＴ（Ａ及びＢ）及び抗−ＣＳ６（Ｃ及びＤ）ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体応答のキネティクス。円は最初の免疫感作後その日までの幾何平均力価を、バーは相当する９５％信頼区間を表示する。ブースター免疫感作間の抗体力価応答を比較する。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，ＮＳ有意差なし、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定。
【図３】アジュバントと混合した抗原を用いた免疫感作に対するレスポンダー間で、ピーク値に達する前の免疫感作による１０６ＰＢＭＣあたり抗−ＬＴ（Ａ及びＢ）及び抗−ＣＳ６（Ｃ及びＤ）ＡＳＣの個々のピーク数。
【図４】ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを使用し又は使用しないで、ＣＳ３及びＣＳ６でのＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。マウスは、尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置し、テープを１０回剥離して角質層を破壊した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の２５μｇ ＣＳ６又は２５μｇ ＣＳ６とＬＴＲ１９２Ｇ１０μｇを負荷した。準備した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。１群のマウスに２５μＬのＣＳ６（２５μｇ）を尾の基部に皮内注射した。すべてのマウスは、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三のワクチン投与後１４日目（日４２）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する力価（Ｃ）を示す。
【図５】２価及び３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンによるＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。尾の基部のワクチン接種部位は図４に記載の操作を用い準備した。接着性バッキングに固着したガーゼパッチに、以下の混合物からなる２５μＬ容量を負荷した：２５μｇ ＣＳ３と１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ；２５μｇ ＣＳ３、２５μｇ ＣＳ６と１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ。準備した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。すべてのマウスは、日０及び１４に経皮的にワクチン接種を受けた。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図６】ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ多価ワクチンを用いたＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。尾の基部のワクチン接種部位は、図４に記載の操作によって準備した。接着性バッキングに固着したガーゼパッチに以下の混合物からなる２５μＬ容量を負荷した：２５μｇ ＣＳ３；２５μｇ ＣＳ６；各２５μｇのＣＳ３とＣＳ６；各２５μｇのＣＳ３とＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ。前処置した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。すべてのマウスは日０及び１４の２回経皮ワクチン接種を受けた。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図７】ＣＳ３とＣＳ６の間における交叉反応性の欠如。尾の基部の部位は図４に記載の操作によって準備した。接着性バッキングに固着したガーゼパッチに以下の混合物からなる２５μＬ容量を負荷した：２５μｇ ＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＡ及びＢ）及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＤ）。パッチは一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０及び１４の２回の経皮ワクチン接種を受けた。第二の免疫後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（パネルＡ及びＣ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ及びＤ）を測定した。
【図８】ＬＴＲ１９２Ｇを使用し又は使用しないで、ＣＳ３での経皮的ワクチン接種によって誘発した血清ＩｇＧサブクラス。マウスは、尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和した皮膚をついで、紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：２５μｇ ＣＳ３又は２５μｇ ＣＳ６をＬＴＲ１９２Ｇ１０μｇと、又はＬＴＲ１９２Ｇを使用しないで負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的ワクチン接種を３回受けた。第三のワクチン投与後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＣＳ３に対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図９】ＬＴＲ１９２Ｇを使用し又は使用しないで、ＣＳ６でのＴＣＩによって誘発した血清ＩｇＧサブクラス。マウスは、尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和した皮膚をついで、紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：２５μｇ ＣＳ６又は２５μｇ ＣＳ３をＬＴＲ１９２Ｇ１０μｇと、又はＬＴＲ１９２Ｇを使用しないで負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的ワクチン接種を３回受けた。第三のワクチン投与後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ６に対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＣＳ６に対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図１０】ＬＴＲ１９２ＧのＴＣＩで誘発された血清ＩｇＧサブクラス。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和した皮膚をついで、紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬのＬＴＲ１９２Ｇ １０μｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的にワクチン接種を３回受けた。第三のワクチン投与後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＬＴＲ１９２Ｇに対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図１１】Ｃ３又はＣＳ６と共投与されたＬＴＲ１９２Ｇにより誘発される血清ＩｇＧサブクラス。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和された皮膚をついで紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的ワクチンを３回受けた。第三のワクチン接種後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルはＬＴＲ１９２Ｇに対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図１２】ＴＣＩ後のＣＳ３特異的糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；２５μｇのＣＳ３（パネルＢ及びＦ）及び２５μｇの ＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。１群のマウスを、２５μｇの ＣＳ３の皮内注射（ＩＤ）によりワクチン接種した（パネルＤ及びＨ）。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に、糞サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＳ３に対する糞便ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（パネルＥ〜Ｈ）を評価した。
【図１３】ＴＣＩ後のＣＳ６特異的糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；２５μｇのＣＳ６（パネルＢ及びＦ）及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。１群のマウスを、２５μｇのＣＳ６の皮内注射（ＩＤ）によりワクチン接種した（パネルＤ及びＨ）。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に、糞便サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＳ６に対する糞中ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（パネルＥ〜Ｈ）を評価した。
【図１４】ＴＣＩ後のＬＴＲ１９２Ｇ特異的糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚で、テープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＢ及びＦ）；２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＤ及びＨ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に糞便サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞便ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（パネルＥ〜Ｈ）を評価した。
【図１５】１価及び２価ＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの脾臓における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（ビヒクル）；２５μｇのＣＳ３；２５μｇのＣＳ６；２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。さらにマウスの群を２５μｇのＣＳ３又はＣＳ６を尾の基部に皮内注射（ＩＤ）してワクチン接種した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に脾臓を収穫した。パネルはＣＳ３−特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ａ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ）；ＣＳ６−特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ｃ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｄ）；ならびにＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ａ及びＣ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ及びＤ）を示す。
【図１６】３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの脾臓における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の処方物：２５μｇＣＳ３／２５μｇＣＳ６／１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。マウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に脾臓を収穫した。パネルはＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ａ）、ならびにＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ）を示す。
【図１７】１価及び２価のＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの鼠径リンパ節における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（ビヒクル）；２５μｇのＣＳ３；２５μｇのＣＳ６；２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。さらに別個のマウス群には、尾の基部に２５μｇのＣＳ３又はＣＳ６を皮内注射（ＩＤ）してワクチン接種した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に鼠径リンパ節を収集した。パネルはＣＳ３−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ａ），ＣＳ６−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ａ及びＢ）を示す。
【図１８】３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの鼠径リンパ節における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＩｇＧ−ＡＳＣ）の検出。マウスは尾、の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６，及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇからなる混合物２５μＬを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に鼠径リンパ節を収集した。
【図１９】ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを使用し又は使用しないでＣＦＡ／ＩでのＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置し、紙やすりで穏やかに５回研摩して角質層を破壊した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の２５μｇのＣＦＡ／Ｉ及び２５μｇのＣＦＡ／Ｉと１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを準備した皮膚に適用し、約１８時間置いた。別個のマウスの群に、２５μＬのＣＦＡ／Ｉ（２５μｇ）を尾の基部に皮内注射した。すべてのマウスは日０及び１４にワクチン接種を受けた。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。パネルはＣＦＡ／Ｉに対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図２０】ＴＣＩ後、ＣＦＡ／Ｉ特異的な糞便ＩｇＡ（上方パネル）及びＩｇＧ（下方パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。ついで、水和した皮膚を紙やすりで穏やかに５回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；２５μｇのＣＦＡ／Ｉ（パネルＢ及びＦ）；及び２５μｇのＣＦＡ／Ｉと１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。１群の別個のマウスには、２５μｇのＣＦＡ／Ｉ（パネルＤ及びＨ）を皮内注射（ＩＤ）によりワクチン接種した。すべてのマウスは、３回、日０，１４及び２８にワクチンを投与された。第三の免疫感作２週後（日４２）に糞便サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＦＡ／Ｉに対する糞便ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（Ｅ〜Ｈ）を評価した。
【図２１】３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンでのＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種する４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚を紙やすりで穏やかに５回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μｇのＣＦＡ／Ｉ，２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇからなる混合物を負荷した。準備した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。すべてのマウスは日０及び１４にワクチンを経皮的に接種された。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清を収集した。
【図２２】４価のＥＴＥＣワクチンによるＴＣＩ後における、コロニゼーション因子抗原に対する糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）抗体の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚を紙やすりで穏やかに研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、４価のワクチン：２５μｇのＣＦＡ／Ｉ，２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から２週後（日４２）に糞サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＦＡ／Ｉ（Ａ），ＣＳ３（Ｂ）及びＣＳ６（Ｃ）に対する糞中ＩｇＡを評価した。処理したサンプルはＣＦＡ／Ｉ（Ｄ），ＣＳ３（Ｅ）及びＣＳ６（Ｆ）に対する糞中ＩｇＧも評価した。
【図２３】４価のＥＴＥＣワクチンによるＴＣＩ後における、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）抗体の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８間前に剃毛した。剃毛した皮膚を水和により前処置し、図１８に記載のように研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、ついで以下のもの：１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（ｍＬＴ）；２５μｇのＣＦＡ／Ｉ及びＬＴＲ１９２Ｇ；又は２５μｇのＣＦＡ／Ｉ，２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に３回ワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に糞サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｃ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＧ（Ｄ〜Ｆ）を評価した。
【図２４】ＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇサブユニットワクチンによる経皮的ワクチン接種はＣＳ３発現ＥＴＥＣ全細胞を認識する血清抗体を誘発する。マウスは尾の基部を標準操作によって剃毛した。パッチの適用直前に、剃毛した皮膚でテープを１０回剥離した。接着性バッキングに固着したガーゼのパッチに、適用直前に２５μｇのＣＳ３及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチは約１８時間適用した。１群１０匹のマウスに２回、日０及び１４にパッチを適用した。第二の免疫感作から１０日後（日２４）に血清サンプルを収集した。血清について、ＣＳ３，ＬＴＲ１９２Ｇ及びＥＴＥＣ全細胞（Ｅ２４３７７８）に対する抗体を評価した。
【図２５】死滅腸毒素原性大腸菌全細胞（ＥＷＣ）による経皮的ワクチン接種。ＥＷＣは細菌培養液中でＥＴＥＣ（株Ｅ２４３７７８）を培養して調製した。細胞を遠心分離によって収穫し、一夜２．５％のホルマリンで固定して（室温）不活性化した。不活性化された、死滅全細胞をリン酸緩衝食塩溶液で洗浄してホルマリンを除去した。免疫感作の前にマウスは尾の基部を剃毛した。パッチの適用直前に剃毛した皮膚でテープを１０回剥離した。接着性バッキングに固着したガーゼのパッチに、１０９ＥＷＣ及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。１群１０匹のマウスを日０及び１４に経皮的にワクチン接種した。第二の免疫感作から１０日後に血清を収集した。血清を、材料と方法の項に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、ＥＷＣ及びＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体について評価した。図２２における結果は、死滅した細菌全細胞による経皮的ワクチン接種が全細胞及びＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを認識する抗体を誘発したことを示している。これらの結果により、死滅ＥＴＥＣ細菌はアジュバントとともに皮膚に適用することが可能で、特異的な免疫を誘発できることが証明される。これは、ＴＣＩがサブユニットワクチンとして、また死滅全細胞ワクチンの送達に適用可能であることを初めて証明するものであり、これらの結果は、この点において有意義である。
【図２６】多重のコロニゼーション因子及び２つのエンテロトキシン、ＬＴ及びＳＴから構成される多価ＥＴＥＣワクチンによる経皮的ワクチン接種。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置し、テープを１０回剥離して角質層を破壊した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６；２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ及び２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ／８μｇ ＳＴａを負荷した。準備した皮膚にパッチを適用し、そこに約１８時間置いた。すべてのマウスは日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第二ワクチンの投与から１４日後（日４２）に血清サンプルを収集した。パネルはＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図２７】湿潤及び乾燥パッチ処方はＴＣＩ用製品の製造に適している。これらの研究においては、様々な液体及びパッチ処方物の調製例としてＬＴを用いた。略述すれば、ＬＴをリン酸緩衝食塩溶液及び５％ラクトース中に製剤化し、ＬＴを接着剤（Ｋｌｕｃｅｌ）とブレンドし、閉塞性のバッキング上に薄いフィルムとして広げ、室温で風乾した。ＬＴ溶液はガーゼパッチに直接適用し、使用前に風乾し、ＬＴ溶液をガーゼパッチに適用して、完全に水和されたパッチとして投与した。液体ＬＴ製剤を受けるマウスの場合は、１０μｇのＬＴを皮膚に直接適用し（被覆するガーゼを使用し、又は使用しないで）、ついで濯いだ。パッチを投与されるマウスについては様々なパッチ処方を約２４時間適用したのち除去した。皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和し、ついで軽石を含む綿棒（ＰＤＩ／ＮｉｃｅＰａｋ）で穏やかに角質層を破壊研摩した。すべてのマウスは日０及び１４に２回１０μｇに相当するワクチン接種を受けた（面積〜１ｃｍ２）。２週後（日２８）に血清サンプルを収集し、血清のＬＴに対する血清抗体を評価した。水性溶液、接着剤中タンパク質を含み、風乾し、完全に水和したパッチ処方がＥＴＥＣ抗原の経皮的送達に適当である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の特異的実施態様の説明
動物及びヒトに免疫応答（たとえば、抗原に特異的な体液性及び／又は細胞性エフェクター）を誘導する、経皮免疫感作（ＴＣＩ）のためのシステムが提供される。この送達システムは、１又は２種以上のアジュバント、抗原、及び／又はポリヌクレオチド（アジュバント及び／又は抗原をコードする）からなる処方の、動物又はヒト対象への簡単な上皮適用を提供する。これにより、化学的及び／又は物理的な浸透増強の補助を使用し、又は使用しないで１又は２種以上の病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対して抗原特異的な免疫応答が誘発される。処方の少なくとも１種の成分（すなわち、抗原又はアジュバント）は、処方の投与に先立ち乾燥形態で及び／又はパッチの部分として提供され得る。このシステムは慣用の腸内、粘膜、又は非経口的免疫技術と組み合わせて使用することもできる。
【００１４】
アジュバント、抗原、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の１又は２以上の活性化が免疫応答の促進を補助し得る。ＡＰＣは抗原を処理して、１又は２種以上のエピトープをリンパ球に提示する。活性化は処方物とＡＰＣ（たとえばランゲルハンス細胞、他の樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球）の間の接触、処方物のＡＰＣによる取り込み、ＡＰＣによる抗原のプロセッシング及び／又はエピトープの提示、ＡＰＣの移動及び／又は分化、ＡＰＣとリンパ球の間の相互作用又はそれらの組み合わせを促進する。アジュバントはそれ自体、ＡＰＣを活性化する。たとえば、ケモカインは抗原提示細胞を所定の部位に補給し、活性化する。とくに抗原提示細胞は皮膚からリンパ節に移動してリンパ球に抗原を提示し、それにより抗原特異的免疫応答を誘発する。さらに処方物は、抗原を認識するリンパ球と直接接触し、抗原特異的免疫応答を誘発する。
【００１５】
抗体及び細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を包含する抗原特異的Ｂ−細胞及び／又はＴ−細胞集団の活性化及び／又は増殖につながる免疫応答の誘発に加えて、本発明は、免疫システムの１又は２以上の成分を、抗原特異的ヘルパー（Ｔｈ１及び／又はＴｈ２）又は遅延型過敏性Ｔ−細胞サブセット（ＴＤＴＨ）に影響する経皮免疫を使用して、陽性に及び／又は陰性に調整することができる。これは、異なるＴ−ヘルパー応答を生じることができるコレラトキシン及び大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの異なる挙動によって例示することができる。本発明によって誘導される望ましい免疫応答は、好ましくは全身性又は局部的（例えば、粘膜の）であるが、通常、望ましくない免疫応答である（たとえば、アトピー、皮膚炎、湿疹、乾癬、又は他のアレルギー性もしくは過敏性反応）。本明細書に記載のように誘発された免疫応答は感染疾患の処置に有用な治療的又は予防的免疫応答を提供する量的及び質的応答である。
【００１６】
ＴＣＩは皮膚透過を用い又は用いないで実施される。たとえば、化学的又は物理的透過増強技術は皮膚層を通して穿孔しない限り使用される。処方の適用前、適用の間、又は適用直後における無傷の皮膚の水和が好ましく、一部又は多くの例でこれが要求される。たとえば、水和は皮膚の最上層（たとえば、透過増強技術により露出された角質層又は表面表皮層）における水分含量を２５％，５０％又は７５％以上に増加させる。
【００１７】
皮膚は、水和物又は化学的透過物質を含有するアプリケーター（たとえば、パッド又はスティック上の吸収物質）で拭うか、あるいはそれらを皮膚に直接適用する。たとえば、水性溶液（たとえば水、食塩水、他の緩衝液）、アセトン、アルコール（たとえば、イソプロピルアルコール）、洗剤（たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム）、脱毛剤又は角質溶解剤（たとえば、水酸化カルシウム、サリチル酸、尿素）、保湿剤（たとえば、グリセロール、他のグルコール）、ポリマー（たとえば、ポリエチレン又はプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン）、又はそれらの組み合わせを使用するか、又は処方中に導入する。同様に、皮膚の研摩（たとえば、やすり板もしくは紙、サンドペーパー、繊維パッド、軽石）、皮膚の表面層の除去（たとえば、接着テープを貼って、剥がす）、エネルギー源（たとえば、熱、光、音、電気、磁気）を用いる皮膚のマイクロポレーション又は障壁破壊デバイス（ガン、微小針）、又はそれらの組み合わせは、物理学的透過エンハンサーとして作用する。皮膚のマイクロポレーションについてはＷＯ９８／２９１３４を、微小針については米国特許６，０９０，７９０、及び経皮ワクチン接種に適用できる経皮ガンについては米国特許ＷＯ６，１６８，５８７を参照されたい。ＴＣＩに化学的又は物理学的透過増強を組み合わせる目的は、真皮の層まで皮膚を穿孔することなく、少なくとも角質層又はさらに深い表皮層を除去することである。これは好ましくは、ヒト又は動物対象に与える不快感はきわめて僅かで、その部位に出血を生じることもなく達成される。たとえば、無傷の皮膚への処方の適用は、角質層又は表皮下の皮膚の層を穿孔する熱、光、音波又は電磁エネルギーを含まない。
【００１８】
ワクチン接種に有用な処方はまた、それらの製造方法とともに提供される。処方は乾燥又は液体型である。乾燥処方の方が慣用のワクチンより保存及び輸送が容易であり、ワクチンの製造場所からワクチン接種が行われる場所まで要求されるコールドチェーンを止めさせることができる。特定の作用機構に限定されることなく、乾燥処方が液体処方に勝る改良となる他の方法は、処方の高濃度の乾燥活性成分（たとえば１又は２種以上のアジュバント及び／又は抗原）の免疫感作部位における直接可溶化によって短いタイムスパンで達成される。皮膚からの湿気（たとえば発汗）及び閉塞性の包帯はこの過程を促進する。この方法で、活性成分の溶解限界に近い濃度がインシチュで達成される。別法として、処方自体の乾燥した活性成分が、抗原提示細胞によって取り込ませ、処理させる固体粒子型を提供することによる改良であってもよい。これらの可能な機構は本発明の範囲又は均等物を制限せずに論じられ、本発明の操作への洞察を提供し、ならびに免疫感作及びワクチン接種におけるこの処方の使用を導く。
【００１９】
処方は液体、クリーム、エマルジョン、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、懸濁液又は他の液体の形態として提供される。乾燥処方は様々な形態で、たとえば微粉末又は顆粒末、均一なフィルム、ペレット及び錠剤として提供される。処方は溶解させ、ついで容器中又は平坦な表面（たとえば皮膚）上で乾燥させるか、又は単純に平坦な表面上に散布する。乾燥は風乾、高温での乾燥、凍結又はスプレー乾燥、固体基板上へのコーティング又はスプレー及びそれにつぐ乾燥、固体基板上への散布、迅速な凍結、ついで真空下における緩徐な乾燥又はそれらの組み合わせで行うことができる。様々な分子が処方の活性成分である場合には、それらを溶液中で混合しついで乾燥してもまた乾燥型のみで混合してもよい。パッチのコンパートメント又はチャンバーは、ただ１種の抗原又はアジュバントが投与前には乾燥状態に保持されるように、活性成分を分離するために使用される。この方法での液体及び固体の分離は、長時間にわたり少なくとも１種の乾燥活性成分の溶解速度をコントロールすることを可能にする。
【００２０】
「パッチ」の語は固体サブストレート（たとえば、閉塞性又は非閉塞性外科用包帯）ならびに少なくとも１種の活性成分を包含する製品を意味する。液体をパッチ中に導入することもできる（すなわち、湿潤パッチ）。処方の１又は２種以上の活性成分は基体上に適用され、パッチの基体又は接着剤に導入されるか、又はそれらの組み合わせである。乾燥パッチには、処方を可溶化するための液体貯蔵部を使用しても、又は使用しなくてもよい。
【００２１】
液体又は固体型の処方は、同一又は分離された場所に１又は２種以上のアジュバント及び／又は抗原の両者が、同時にもしくは多くの場合、反復して適用される。パッチには、コントロールされた放出貯蔵部又は速度調節マトリックスを包含することが可能で、アジュバント及び／又は抗原を段階的に放出することができる。それは、アジュバント及び／又は抗原を単一の貯蔵部に、又は個々の抗原及びアジュバントを別個に多重貯蔵部に含有させる。パッチには、パッチの適用が多重抗原に対する免疫応答を誘発するように、付加的な抗原を含有させてもよい。このような場合、抗原は同じ源から誘導しても異なる源から誘導してもよいが、異なる抗原に特異的な免疫応答を誘発するように異なる化学構造をもたせることになる。多重パッチは同時に適用することができ、単一のパッチが多重の貯蔵部を含有することもできる。効果的な処置のためには多重パッチがある間隔で、又はある期間にわたり一定に適用される。それらは異なる時間に、重複する期間に、又は同時に適用される。少なくとも１種のアジュバント及び／又はアジュバントは投与前には乾燥型に維持される。ついで貯蔵部からの液体の放出又は処方の乾燥成分を含有する貯蔵部への液体の侵入により、少なくとも部分的にその成分が溶解する。
【００２２】
固体（たとえばナノメーター又はマイクロメーターの大きさの粒子）も処方中に導入し得る。固体剤形（ナノ粒子又はマイクロ粒子）は、活性成分の分散又は可溶化を補助し、処方の皮膚表層を通る運搬を助け、アジュバント、抗原又は両者に抗原提示細胞によってオプソニン化され得る基体への付着点を提供する。又はこれらの組み合わせが実行される。シート、ロッド又はビーズとして形成された多孔性固体からの処方の長期放出により、貯蔵としての役割が果たされる。
【００２３】
処方は、生化学的薬剤又はワクチンのための適当な規制機関（たとえば、食品医薬局）に承認された無菌条件下に製造される。所望により、免疫学的には不活性ではあっても、乾燥剤、賦形剤、安定剤、湿潤剤、保存剤、接着剤、パッチ材料、又はそれらの組み合わせが処方中に包含される。しかしながら、それらは他の望ましい性質又は特性を示してもよい。
【００２４】
投与に適当な単一又は単位用量の処方が提供される。単位用量中のアジュバント又は抗原の量は約０．００１〜約１０ｍｇの広い範囲のいずれでもよい。この範囲は約０．１μｇ〜約１ｍｇでもよい。狭い範囲では、約５μｇ〜約５００μｇである。他の適当な範囲は約１μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約２００μｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇである。トキシンについての好ましい用量は約５０μｇ〜約１００μｇ又はそれ未満である（たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ又は１００μｇである）。抗原とアジュバントの比は約１：１（たとえば、抗原及びアジュバントの両者である大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの場合）であるが、さらに高い比も、貧弱な抗原の場合には適当である（たとえば約１：１０又はそれ未満）、又はアジュバントに対して低い抗原の比（たとえば１０：１又はそれ以上）も使用できる。ＬＴ及びＥＴＥＣ抗原の自然の比は全細胞又は溶解物の処方に使用される。
【００２５】
アジュバント及び抗原又はポリヌクレオチドを含む処方は、ヒト又は動物対象に適用され、抗原は免疫細胞に提示され、抗原特異的な免疫応答が誘発される。これは、病原体による感染の前、感染の間又は感染後に行われる。抗原又は抗原をコードするポリヌクレオチドのみが必要であり、処方の免疫原性がアジュバント活性を要求しない程に充分な場合は付加的なアジュバントは加えない。処方の適用が多重抗原に対する免疫応答を誘発するような付加的な抗原を処方に包含させてもよい（即ち、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ））。このような場合、抗原は同じ源から誘導しても、異なる源から誘導してもよいが、異なる抗原に対して特異的な免疫応答を誘発するように、抗原は化学的に異なる構造を有することになる。抗原特異的リンパ球が免疫応答に参加し、Ｂリンパ球による参加の場合、抗原特異的抗体は免疫応答の一部分である。上述の処方は、乾燥剤、賦形剤、保湿剤、安定化剤、保存剤、接着剤、及び本技術分野で周知のパッチ材料を包含する。
【００２６】
本発明は、対象（たとえば、疾患の防止、感染の影響からの保護、現存の疾患又は症候群の治療、又はそれらの組み合わせの処置が必要なヒト又は動物）の処置に使用される。抗原が病原体から誘導される場合、処置により、対象は病原体による感染、又はたとえばトキシン分泌によって惹き起こされる病原性作用に対してワクチン接種される。本発明は、現存の疾患の治療的処置、疾患の保護的予防、疾患の重症度の低減及び／又は持続期間の短縮、疾患の症状の緩和、及びそれらの組み合わせに使用される。
【００２７】
適用部位は抗炎症性コルチコステロイドたとえばヒドロコルチゾン、トリアムシノロン及びモメタゾン又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の保護により、可能性のある局所的皮膚反応を低下又は免疫応答の型を調節する。同様に、抗炎症性ステロイド又はＮＳＡＩＤをパッチ材料、又は液体もしくは固体処方に包含させ、コルチコステロイド又はＮＳＡＩＤを免疫感作後に適用する。ＩＬ−１０，ＴＮＦ−α又は他の免疫モデュレーターを抗炎症剤に代えて使用し得る。さらに、処方の単一又は多重の適用を使用し、２以上の排出リンパ節野上の皮膚に適用される。処方にはその適用が多重抗原に対する免疫応答を誘発するように付加的な抗原を包含させてもよい。このような場合、抗原は同じ源から誘導されても、異なる源から誘導されてもよいが、異なる抗原に特異的な免疫応答を誘発するように、異なる化学構造を有する。多重チャンバーを有するパッチは、各チャンバーが異なる抗原提示細胞をカバーするので、多価ワクチンのより効果的な送達を可能にした。すなわち、抗原提示細胞はただ１個の抗原に遭遇し（アジュバントは使用又は使用しない）、従って抗原の競合はなく、そのため多価ワクチン内のそれぞれの抗原に対する応答は増強される。
【００２８】
処方は、皮膚に免疫応答を始動させ、ブースターするため表皮に、透過技術又は他の免疫感作経路と接合して適用される。単一又は多重適用の経皮的免疫感作（ＴＣＩ）の始動に続いては、同じ又は別の抗原によるブースター免疫感作のため、腸、粘膜、非経口、及び／又は皮内投与技術が行われ得る。単一又は多重適用による腸、粘膜、非経口、及び／又は皮内免疫感作による始動に続いては、同じ又は別の抗原によるブースター免疫感作のための経皮的技術が行われ得る。ＴＣＩは慣用の局所的技術、たとえば粘膜又は皮内免疫感作とは、前者が皮膚には存在しない粘膜（即ち、肺、口腔、鼻、直腸）を必要とし、後者は真皮を通した皮膚の穿孔を必要とする点で著しく異なることを銘記すべきである。処方には、多重抗原に対する免疫応答を誘発するように皮膚に適用される付加的な抗原が包含され得る。
【００２９】
抗原及びアジュバントに加えて、処方はビヒクルを含む。たとえば処方はＡＱＵＡＰＨＯＲ，Ｆｒｅｎｄ，Ｒｉｂｉ又はＳｙｎｔｅｘ乳化液、油中水乳化液（たとえば、水性クリーム，ＩＳＡ−７２０）、水中油乳化液（たとえば、オイルクリーム、ＩＳＡ−５１，ＭＦ５９）、マイクロ乳化液、無水リピド及び水中油型乳化液、他のタイプの乳化液、ゲル、脂肪、ワックス、油脂、シリコン及び保湿剤（たとえばグリセロール）を含み得る。
【００３０】
抗原は、ヒト又は動物対象に感染するいかなる病原体（たとえば、細菌、ウイルス、カビ又は原生動物）から誘導され得る。抗原の化学構造は１又は２以上の炭水化物、脂肪酸及びタンパク質（たとえば、グリコリピド、糖タンパク質、リポタンパク質）である。タンパク質性抗原が好ましい。抗原の分子量は５００ダルトン、８００ダルトン、１０００ダルトン、１０キロダルトン、１００キロダルトン又は１０００キロダルトン以上であり得る。化学又は物理学的透過増強は、細胞、ウイルス粒子及び１メガダルトン以上の巨大分子構造（たとえば、ＣＳ６抗原）に関して好ましいが、水和及び溶媒を含む綿棒による拭き取りなどの技法が皮膚を横切って免疫感作を誘発するのに十分である。抗原は組換え技術、化学合成又は天然の源から少なくとも部分的に精製して得られる。それは化学的又は組換え抱合体たとえば化学的反応基の間の連結又はタンパク質融合体である。抗原は生存細胞又はウイルス、緩和生存細胞又はウイルス、死滅細胞、又は不活性化ウイルスとして提供される。別法として、抗原は少なくとも部分的に精製された細胞フリーの型（たとえば、細胞又はウイルスの溶解物、膜又は他の細胞下フラクション）である。大部分のアジュバントはまた、免疫原性活性を有し、抗原とも考えられるので、アジュバントには抗原の上述の性質及び特性が期待される。
【００３１】
アジュバントの選択は免疫応答の増強及び調節を可能にする。さらに、適当なアジュバントの選択は、体液性又は細胞性免疫応答、特異的抗体アイソタイプ（たとえば、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及び／又はＩｇＧ４）、及び／又は特異的Ｔ−細胞サブセット（たとえばＣＴＬ，Ｔｈ１，Ｔｈ２及び／又はＴＤＴＨ）を優失的に誘発する。アジュバントは好ましくは化学的に活性化（たとえば蛋白分解消化）又は遺伝子的に活性化（たとえば、融合、欠失又は点突然変異）されたＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン又はそのＢサブユニットである。アジュバント、抗原又は両者は、任意によりアジュバント又は抗原を適宜コードするポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ｃＲＮＡ）との処方として提供されてもよい。共有結合によって閉じられた環状ＤＮＡたとえばプラスミドは好ましいポリヌクレオチドの型であるが、線状の型も使用することができる。ポリヌクレオチドは、たとえば複製の起源、セントロメア、テロメア、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写開始又は終結シグナル、スプライスアクセプター又はドナー部位、リボソーム結合部位、翻訳開始又は終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、細胞局在シグナル、プロテアーゼ切断部位、ポリリンカー部位又はそれらの組み合わせが発現ベクター中に見出されている。
【００３２】
「抗原」は、免疫感作又はワクチン接種後に、ヒト又は動物対象の免疫系によって特異的に認識される処方の活性成分である。抗原は、Ｂ−細胞によって認識される単一又は多重の免疫原性エピトープ（すなわち、分泌又は膜結合抗体）又はＴ−細胞受容体を含み得る。Ｔ−細胞受容体によって認識されるタンパク質性エピトープは、それらが抗原提示細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ分子によって結合されているかどうかに依存して、典型的な長さ及び保存されたアミノ酸残基を有する。これに反して、抗体によって認識されるタンパク質性エピトープは、長さが変動する短い、延長されたオリゴペプチドと長いフォールディングされたポリペプチドを含む。エピトープ間の単一アミノ酸の差は区別し得る。抗原は病原体分子に対して免疫応答を誘発できる（たとえば、ＣＳ６抗原はＥＴＥＣのＣＳ６分子に対して特異的免疫応答を誘発することができる）。すなわち、抗原は通常、病原体の特定の分子の化学構造と同一であるか少なくともそれから誘導されるが、このような化学構造に遠縁にすぎない模倣体が、成功裡に使用される。
【００３３】
「アジュバント」は抗原に対する免疫応答の誘発を補助する、処方の活性成分である。アジュバント活性は、処方中にアジュバントそれ自体を包含させることにより、又は処方の他の成分と組み合わせることにより、あるいは特定の免疫感作技術によって、異種抗原（すなわちアジュバントとは別個の化学構造である抗原）に対する免疫応答を上昇させる能力である。上述のように、抗原とアジュバントの化学的抱合又は抗原とアジュバントコード領域の遺伝子的融合により抗原とアジュバントの両者を分子内に含有することができる。すなわち、処方はただ１種のみの活性成分又は成分を含有することもできる。
【００３４】
「有効量」の語は、抗原特異的免疫応答を誘発するアジュバント又は抗原の量を記載する。「サブユニット」免疫原又はワクチンは、病原体の他の細胞性又はウイルス成分から、組換え技術、化学的合成、又は天然の源から少なくとも部分精製により単離された活性成分（たとえばアジュバント、抗原）からなる。
【００３５】
免疫応答の誘発は、たとえば感染疾患の予防的又は治療的ワクチン接種のための処置を提供する。その存在下又は不存在下に免疫応答の大きさ及び／又はキネティクスにおける統計的に有意な変化；免疫系の誘発エレメント（たとえば、体液性対細胞性、Ｔｈ１対Ｔｈ２）における変化；対象の健康及び安寧に対する効果；又はそれらの組み合わせにを生じた場合、製品又は方法は「誘発する」。
【００３６】
本発明において使用される「排出リンパ節野」の語は、その上で収集されたリンパが所定のリンパ節のセット（たとえば、頸部、補助、鼠径部、上顎、腺窩、それらの腹部及び胸郭）を通してろ過される、解剖学的領域を意味する。すなわち、同じ排出リンパ節野が、免疫感作の部位及び時間が、処方の異なる成分を一緒にもたらすように間隔を有する場合（たとえば、単独では有効に使用されない場合でも、アジュバント又は抗原を含む二つの接近配置パッチは有効となり得る）抗原提示細胞がリンパ節に移動するために必要な数日以内の免疫感作（たとえば、腸、粘膜、非経口、経皮、皮内）によって標的化され得る。たとえば、経皮技術によるアジュバンド送達パッチを、従来のワクチンと共に注射するのと同様に、同一の腕上に付して、高齢者、小児又は他の免疫的に、損われた者におけるその有効性をブースターすることができる。それに対し、異なる腕にパッチを貼り付けることにより、アジュバント含有パッチが抗原のみを含むパッチの有効性をブースターすることを防ぐことができる。
【００３７】
本発明の操作においていかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明者らの観察の説明を提供すれば、この経皮的送達システムは、免疫応答が誘発される免疫系の細胞に抗原を運搬する。抗原は皮膚の正常に存在する保護外層（すなわち、角質層）を通過して直接、免疫応答を誘発するか、又は処理した抗原をリンパ球に提示する、上皮の抗原提示細胞集団（たとえば、マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、他の樹状細胞、Ｂリンパ球、又はクッパー細胞）を介して免疫応答が誘発される。すなわち、透過増強技術を用い又は用いないで、皮下注射又は経皮的な技術では真皮は透過されない。所望により、抗原は毛包又は皮膚オルガネラ（たとえば、汗腺、皮下腺）を介して角質層を通過する場合がある。
【００３８】
たとえば、細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（ｂＡＲＥ）による経皮的免疫感作は、とくに最も効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）として知られる上皮ランゲルハンス細胞を標的とする。ＡＰＣの成熟は形態学的に、又は表現型（たとえばＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８３又は共刺激分子の発現）によって評価される。本発明者らは無傷の皮膚の上皮に適用した場合、ｂＡＲＥがランゲルハンス細胞を活性化するように思われることを見出した。アジュバントたとえばトリプシン切断ｂＡＲＥはランゲルハンス細胞の活性化を増強し得る。ランゲルハンス細胞は抗原の貪食によって特異的免疫応答を指示し、ＡＰＣとして抗原をリンパ球に提示するように働くようになるリンパ節に移動し、そこで強力な免疫応答を誘発する。一般に、皮膚は病原体に対する障壁と考えられているが、この障壁の不完全さが、皮膚を通して侵入する生物体に対する免疫応答を編成するように設計された、上皮にわたって分布する多数のランゲルハンス細胞により立証される。
【００３９】
Ｕｄｅｙ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：ｓ６−ｓ８，１９９７によると：
「ランゲルハンス細胞は、哺乳動物の層をなす扁平上皮のすべてに存在する骨髄誘導細胞である。それらは、淡症を生じていない上皮に存する補助細胞の活性のすべてを有し、現時点における規範においては上皮に適用された抗原に向けられた免疫応答の開始及び増強に必須である。ランゲルハンス細胞は強力な補助細胞（樹状細胞）のファミリーであり広く分布するが、上皮及び固体臓器ならびにリンフォイド組織には滅多に現れない。
【００４０】
今回、ランゲルハンス細胞（及び多分、他の樹状細胞）は少なくとも２つの異なるステージを含むライフサイクルを有することが認められた。上皮に存在するランゲルハンス細胞は、抗原捕獲「センチネル（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）」細胞の規則的なネットワークを構築する。上皮のランゲルハンス細胞は微生物を包含する粒子を取り込み、効率的な複合抗原のプロセッサーである。しかしながら、それらは低レベルのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原及び共刺激分子（ＩＣＡＭ−１，Ｂ７−１及びＢ７−２）ならびにプライムされていない貧弱なＴ細胞のスティミュレーターしか発現しなかった。抗原との接触後、一部のランゲルハンス細胞が活性化され、上皮から離れ、局所性リンパ節のＴ−細胞依存性領域に移動し、そこでそれらは成熟樹状細胞として存在する。上皮を離れ、リンパ節に移動する過程で、抗原を有する上皮ランゲルハンス細胞（現時点では「メッセンジャー」）は形態、表面表現型及び機能に劇的な変化を生じる。上皮ランゲルハンス細胞とは対照的に、リンフォイド樹状細胞は本質的に非貪食細胞であり、タンパク質抗原を非効率的にプロセッシングするが、高レベルのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原ならびに様々の共刺激分子を発現し、同定された最も強力なナイーブＴ細胞のスティミュレーターである。」
【００４１】
ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力は経皮的に送達される免疫原及びワクチンの開発を可能にした。皮膚の免疫系を使用する免疫応答は処方を角質層（すなわち、角質化細胞及びリピドから構成される皮膚の最上層）内のランゲルハンス細胞にのみ送達させ、ついで、ランゲルハンス細胞を活性化して抗原を取り込ませ、Ｂ−細胞小胞及び／又はＴ−細胞依存性領域に移動させ、ついで抗原をＢ及び／又はＴリンパ球に提示させることによって達成された。他の抗原ｂＡＲＥ（たとえば、トキシン、コロニゼーション又はビルレンス因子）がランゲルハンス細胞に貪食されると、これらの抗原もリンパ節に輸送され、Ｔリンパ球に提示され、ついでその抗原に特異的な免疫応答が誘発される。すなわち、ＴＣＩの特徴は多分、ｂＡＲＥ又はその誘導体、ケモカイン、サイトカイン、ＰＡＭＰ、又は接触センシタイザー及びアジュバントを誘導する他のランゲルハンス細胞活性化物質によるランゲルハンス細胞の活性化である。ランゲルハンス細胞の皮膚集団のサイズ又はそれらの活性化状態の上昇もまた、免疫応答を増強することが期待される（たとえば、アセトン前処置）。高齢者又は皮膚のランゲルハンス細胞が枯渇した（すなわち、ＵＶ傷害）対象では、ランゲルハンス細胞集団の再補給（たとえば、トレチノイン前処置）が可能である。
【００４２】
アジュバントたとえばｂＡＲＥは、注射又は全身的に投与された場合、高度な毒性を示すことは周知である。しかし、無傷の皮膚の表面（すなわち、表皮上）に置いた場合、全身的な毒性を誘導するとは考えられない。すなわち、経皮的な経路では、全身性の毒性はなく、アジュバント作用の利点の達成が可能である。同様の毒性の不在は、皮膚が角質層のすぐ下で（たとえば、上皮付近又は上皮上で）透過され、真皮を通さない場合に期待される。すなわち、皮膚を通して免疫系の活性化誘発能は、全身性の毒性はなく、強力な免疫応答という予期されなかった利点を付与する。
【００４３】
親和性成熟及び優勢なＩｇＧ抗体へのアイソタイプスイッチングにより誘発される抗体応答の大きさは、一般にＴ−細胞の補助ならびにＴｈ１及びＴｈ２両者の経路の活性化によって達成され、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの産生によって示唆される。また、大きな抗体応答が胸腺独立性の抗原、１型（ＴＩ−１）によって誘発され、これは直接Ｂリンパ球を活性化し、又はＭＨＣクラスＩＩ，Ｂ７，ＣＤ４０，ＣＤ２５及びＩＣＡＭ−１分子の上方調節のようなＢリンパ球に対する類似の活性化作用を示す。
【００４４】
一般的に知られている皮膚免疫応答のスペクトルはアトピー及び接触性皮膚炎によって代表される。ランゲルハンス細胞の活性化の病原性表出である接触性皮膚炎は、抗原を貪食し、リンパ節に移動し、抗原を提示し、皮膚に移動して冒された皮膚部位に強力な破壊的細胞応答を生じるＴリンパ球を感作するランゲルハンス細胞によって指示される。このような応答が抗原特異的なＩｇＧ抗体を伴うことは一般には知られていない。アトピー性皮膚炎はランゲルハンス細胞を類似の方法で使用するが、Ｔｈ２細胞で同定され、一般に高いレベルのＩｇＥを伴う。
【００４５】
一方、ｂＡＲＥによる経皮的免疫感作は有用かつ所望の免疫応答を提供する。通常、誘発された高いＩｇＧレベルを与えるアトピー又は接触性皮膚炎の典型的な所見はない。皮膚の表皮に適用されたコレラトキシン又は大腸菌熱不安定性エンテロトキシンは、免疫感作後２４，４８及び１２０時間後リンパ球浸潤のない免疫感作を達成することができる。前臨床試験で認められたわずかな皮膚反応は容易に処置された。これは経皮免疫感作に従事するランゲルハンス細胞が、「炎症を生じていない上皮に存する補助細胞の活性のすべてを有し、現時点における規範においては上皮面に適用された抗原に向けられた免疫応答の開始及び増強に必須である」（Ｕｄｅｙ，１９９７）ことを示している。経皮的な免疫応答の独特さは、高レベルの抗原特異的ＩｇＧ抗体及び産生される抗体のタイプ（たとえば、ＩｇＭ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３及びＩｇＡ）及び一般に抗原特異的なＩｇＥ抗体の不存在の両者によって指示される。経皮的免疫感作は、もし、抗原提示細胞及びＴリンパ球の十分な活性化がアトピー又は接触性皮膚炎と同時に存する経皮反答において起これば、皮膚の炎症と並んで生ずると想像できる。
【００４６】
ランゲルハンス細胞の経皮的な標的化は、それらの抗原提示機能のすべて又は部分を脱活性化する物質を並んで用いて、免疫感作の修飾又は感作の防止が行われる。ランゲルハンスの活性化又は他の皮膚免疫細胞をモデュレートする技術には、たとえば抗炎症性ステロイド又は非ステロイド性薬剤（ＮＳＡＩＤ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、シクロホスファミド、グルココルチコイド、又は他の免疫抑制剤；インターロイキン−１０、インターロイキン−１モノクローナル抗体（ｍＡＢ）又は可溶性受容体アンタゴニスト（ＲＡ）；インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）インヒビター；又は超抗原を介する枯渇、たとえばＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）により誘発される表皮ランゲルハンス細胞の枯渇の使用が包含される。類似の化合物がランゲルハンス細胞の内部応答の修飾及び異なるＴ−ヘルパー応答（Ｔｈ１又はＴｈ２）の誘発のために使用され、また免疫感作の副作用の可能性を低下させるために皮膚の炎症反応応答をモデュレートさせる。同様に、免疫抑制剤を別個に又は処方を免疫抑制剤と共投与することによって、免疫感作の前、免疫感作の間又はその後に、リンパ球が免疫抑制される。たとえば、通常アレルギー又は刺激性の接触性過敏症を生じる物質を用いて、強力な全身性保護免疫応答を誘発することができが、ＩＣのインヒビターの添加により悪い皮膚反応を緩和し得る。
【００４７】
ＴＣＩは、ＣＴ，ＬＴ又はそれらのサブユニット（たとえば、ＣＴＢ又はＬＴＢ）のガングリオシドＧＭ１結合活性によって達成される。ガングリオシドＧＭ１は哺乳動物細胞に見出される普遍的な細胞膜グリコリピドである。５量体のＣＴＢサブユニットが細胞表面に結合した場合、親水性孔部が形成され、これがＡサブユニットのリピド二重層を横切る挿入を可能にする。ＡＰＣ上の他の結合標的も使用される。ＬＴＢサブユニットはガングリオシドＧＭ１、さらに他のガングリオシドに結合し、その結合活性はＬＴが皮膚上で高い免疫原性を示す事実を説明する。
【００４８】
ｂＡＲＥ又はＢサブユニットを含有するフラグメント又はその抱合体を用いるＴＣＩは、それらのＧＭ１ガングリオシド結合活性を必要とする。マウスをＣＴ，ＣＴＡ及びＣＴＢで経皮的に免疫感作した場合、免疫応答の誘発にはＣＴ及びＣＴＢが必要となった。ＣＴＡはＡＤＰリボシル化エキソトキシン活性を含有するが、結合活性を含有するＣＴ及びＣＴＢのみが免疫応答を誘発可能である。これは、Ｂサブユニットが皮膚を通じての免疫感作に必要かつ十分であることを指示している。本発明者らは、ランゲルハンス細胞又は他のＡＰＣがその細胞表面へのＣＴＢの結合によって活性化され、経皮的免疫応答を生じると結論した。
【００４９】
抗原
経皮免疫感作システムは、物質を免疫応答を生じる分化した細胞（たとえば、抗原提示細胞、リンパ球）に送達する。これらの物質は抗原と呼ばれる。抗原はたとえば、炭水化物、グリコリピド、糖タンパク質、リピド、リポタンパク質、ホスホリピド、ポリペプチド、それらの抱合体、又は免疫応答を誘発することが知られている他の物質等の化学構造から構成される。抗原は全生物体、たとえば細菌又はビリオンとして提供されるか；抗原は抽出物又は溶解物から、全細胞又は膜単独のいずれかから得られるか；あるいは抗原は化学的に合成され、又は組換え技術により製造される。
【００５０】
本発明の抗原は、組換え技術により、好ましくは、親和性又はエピトープタグを付した融合タンパク質として発現され得る；遊離又は担体タンパク質に抱合した化学合成オリゴペプチドが、本発明の抗原を得るために使用され得る。オリゴペプチドはポリペプチドの１タイプと考えられる。オリゴペプチドの長さは６残基〜２０残基であることが好ましい。ポリペプチドも分岐構造として合成されてもよい（たとえば、米国特許５，２２９，４９０及び５，３９０，１１１）。抗原性ポリペプチドにはたとえば、合成又は組換えＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープ、普遍的Ｔ−細胞エピトープ、及び１生物体又は疾患からの混合Ｔ−細胞エピトープ、及び他からのＢ−細胞エピトープが包含される。組換え技術又はペプチド合成によって得られた抗原ならびに天然の源又は抽出液から得られた抗原は、抗原の物理学的又は化学的特徴により、好ましくは分画化又はクロマトグラフィーによって精製することができる。組換え体はｂＡＲＥのＢサブユニット又はキメラと混合する。多重抗原処方は同時に２以上の抗原に対する免疫応答を誘発させるために用いられる。抱合体は多重抗原に対する免疫応答の誘発、免疫応答のブースター又は両者のために使用される。さらに、トキシンはトキソイドの使用によってブースターされ、又はトキソイドはトキシンの使用によりブースターされる。経皮的免疫感作は、初めに他の免疫感作経路、たとえば経口、経鼻、又は非経口経路によって誘発された応答をブースターするために使用される。抗原には、たとえば、トキシン、トキソイド、それらのサブユニット、又はそれらの組み合わせ（たとえば、コレラトキシン、破傷風トキソイド）が包含され、さらにトキシン、トキソイド、それらのサブユニット又はそれらの組み合わせが抗原及びアジュバントの両者として作用する。このような経口／経皮又は経皮／経口免疫感作は、とくに粘膜免疫が保護と相関している疾患における粘膜免疫の増強に重要である。
【００５１】
抗原は、緩衝液又は水もしくは有機溶媒たとえばアルコール又はＤＭＳＯに溶解するか、又はゲル、乳化液、マイクロ乳化液及びクリーム中に導入することができる。適当な緩衝液には、それらに限定されるものではないが、Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋フリーのリン酸緩衝食塩溶液、リン酸緩衝食塩溶液、正規（水中１５０ｍＭ ＮａＣｌ）食塩溶液、及びＨｅｐｅｓ又はＴｒｉｓ緩衝液が包含される。中性緩衝液に不溶の抗原は１０ｍＭの酢酸に溶解し、ついで中性の緩衝液たとえばＰＢＳで所望の容量に希釈する。酸性のｐＨでのみ可溶の抗原の場合には、希釈酢酸中に溶解したのち希釈液として酸性ｐＨにおける酢酸塩−ＰＢＳを使用する。グリセロールは本発明に用いられる非水性緩衝液として適当である。
【００５２】
疎水性抗原、たとえば膜をまたぐドメインを含有するポリペプチドは、界面活性剤又は表面活性剤仲に溶解することができる。さらに、リポソームを含有する処方については、界面活性剤の溶液中の抗原（たとえば、細胞膜抽出液）をリピドと混合し、ついで希釈、透析又はカラムクロマトグラフィーによって界面活性剤を除去してリポソームを形成させることができる。ある種の抗原（たとえば、膜タンパク質）はそれ自体可溶性である必要はないが、直接リピド膜（たとえば、ビロソーム）にビリオン単独の懸濁駅に、もしくはマイクロスフィア懸濁液に又は活性化抗原提示細胞により取り込まれる熱不活性化細菌に挿入することができる（オプソニン化）。抗原は、ＷＯ９９／４３３５０に記載されたように透過増強剤と混合することもできる。
【００５３】
ヒト又は動物対象のワクチン接種に使用可能で、特定の病原体に特異的な免疫応答を誘発する多くの抗原、ならびに抗原の製造方法、適当な抗原用量、免疫応答の誘導についてのアッセイ、病原体（たとえば、細菌、ウイルス、カビ、又は原生動物）による感染の処置については本技術分野において周知である。
【００５４】
哺乳動物の大腸菌による感染による効果は、生物体の特定の株に依存する。腸内には有益な大腸菌が多く存在する。下痢疾患との初期の関連以来、５種の下痢病原性大腸菌が同定されたことによる。すなわち、腸毒素原性（ＥＴＥＣ）、腸病原性（ＥＰＥＣ）、腸出血性（ＥＨＥＣ）、腸集合性（ＥＡｇｇＥＣ）及び腸侵襲性（ＥＩＥＣ）である。それらは特徴的なビルレンス性、たとえばトキシンの同化、及びコロニゼーション因子及び／又は腸内皮細胞との相互作用の特異的なタイプによってグループ分けされている。ＥＴＥＣが最も一般的な下痢原性大腸菌であり、旅行者に最大のリスクを提起する。ヒトから培養された株にはＢ７Ａ（ＣＳ６，ＬＴ，ＳＴａ）、Ｈ１０４０７（ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ，ＳＴａ）及びＥ２４３７７Ａ（ＣＳ３，ＣＳ１，ＬＴ，ＳＴａ）が包含される。それらは単一又は組み合わせで、抗原の全細胞源として使用され、様々な異なるトキシン及びコロニゼーション因子を提供する。
【００５５】
腸毒素原性大腸菌に対して特異的で、より一般的なコロニゼーション及びビルレンス因子に対して交叉反応し、交叉保護する抗体を励起するワクチンの必要性がある。フィンブリエタンパク質のＣＳ４−ＣＦＡ／Ｉファミリーは、ある種のより流行している腸毒素原性大腸菌株に見出され、このファミリーのＥＴＥＣ抗原のメンバーは６種、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ４，ＣＳ１７及びＰＣＦ０１６６である。
【００５６】
ＥＴＥＣのコロニゼーション因子抗原（ＣＦＡ）は、腸上皮に対する細菌のコロニゼーション及び付着の最初の工程において重要である。下痢を有する成人及び小児の疫学的研究では、ＥＴＥＣに帰せられる有病率の大きな百分率にＣＦＡ／Ｉが見出される。ＣＦＡ／Ｉは細菌の表面上にピリ（フィンブリエ）の形で存在する。これは、剛性で、反復するピリンサブユニットから構成される直径７ｎｍのタンパク質繊維である。ＣＦＡ／Ｉ抗原はヒト刷子縁へのマンノース抵抗性付着を明らかなシアル酸感受性によって促進する。したがって、これらのタンパク質に対する免疫を確立させるワクチンは宿主組織への付着、及びそれに次ぐ疾患を防止するものと推定されている。
【００５７】
ＣＳ３，ＣＳ５及びＣＳ６としては、他の抗原が包含される。ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ３及びＣＳ６は単独でも存在し得るが、稀な例外としてＣＳ１はＣＳ３と、ＣＳ２はＣＳ３と、ＣＳ４はＣＳ６と、ＣＳ５はＣＳ６とのみ見出される。血清学的研究では、これらの抗原は、研究部位に依存して、ＥＴＥＣの場合約７５％まで又は少なくとも約２５％に相当する緯度に存在する。
【００５８】
大腸菌ファミリーＣＳ４−ＣＦＡ／Ｉのすべてのメンバーの抗原に対して抗体を励起するコンセンサスペプチドが米国特許５，９１４，１１４に記載されている。このファミリーのメンバーのＮ−末端は高度な同一性を示すが、そのタンパク質配列の残部には、種をまたいだ関連性があまり認められない。コンセンサスペプチドは、既知の線状Ｂ及びＴ細胞エピトープを包含し、進化的に高度の関連性が６つの異なるコロニゼーション因子にみられる。たとえば、コンセンサスペプチドはそのアミノ酸配列（アミノ酸残基は末端又は修飾された内部に付加して反応性結合鎖を提供する）：ＶＥＫＮＩＴＶＴＡＳＶＤＰＴＩＤＬＬＱＡＤＧＳＡＬＰＳＡＶＡＬＴＹＳＰＡ（配列番号：１）及びＶＥＫＮＩＴＶＴＡＳＶＤＰＴＩＤＬＬＱＡＤＧＳＡＬＰＡＳＶＡＬＴＹＳＰＡ（配列番号：２）
を有する。
【００５９】
これらのコンセンサスペプチドは、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ４，ＣＳ１７及びＰＣＦ ０１６６抗原の相同な領域に基づいて構築された。
【表１】
【００６０】
ＣＳ６，コロニゼーション因子ＩＶ（ＣＦＡ／ＩＶ）の成分はまた血清学的検査（たとえば、中東の兵士）において、ＥＴＥＣ株の約２５％より多くに見出されている。ＣＳ３及びＣＳ６抗原のヌクレオチド配列は、それらの製造方法とともに米国特許５，６９８，４１６に記載されている。
【００６１】
使用できる他の抗原は腸疾患を起こすトキシン、たとえばシガトキシン及び大腸菌エンテロトキシンである。熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）については以下に説明する。しかし、疾患症状群を生じる熱安定性エンテロトキシン（たとえば、ＳＴａ，ＳＴｂ）も抗体により中和することができる。ＬＴはペリプラズムトキシンで、ＳＴは細胞外トキシンである。ＳＴａはメタノール可溶性で、ＳＴｂはメタノール不溶性である。２種の異なる前駆体が用いられる。ＳＴａは１８〜１９アミノ酸ペプチド、ＳＴｂは４８アミノ酸ペプチドであり、それらの間には配列の類似性はない。ＬＴとＳＴ又はＳＴ突然変異体との抱合体も使用できる（米国特許４，８８６，６６３）。
【００６２】
広範囲の一般的な旅行者疾患、とくに腸の感染疾患のためのワクチンが開発されれば有利である。たとえば、キャンピロバクテリア症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、肝炎（肝炎ウイルスＡ又はＢ型）、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ，Ｐ．ｖｉｖａｘ，Ｐ．ｏｖａｌｅ及びＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）、細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ，Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｌ）、ウイルス性胃腸炎（ロタウイルス）、ならびにそれらの組み合わせが、応答可能な病原体から誘導される抗原を含ませることによって処置される。毒性を中和し、又は細胞への付着及び侵入をブロックする全身性又は粘膜性抗体が望ましい。病原体に関連する分子（たとえば、トキシン、膜タンパク質）に対し特異的な免疫応答が様々な投与経路（たとえば、腸内、粘膜、非経口、経皮）により誘発される。
【００６３】
アジュバント
処方にはアジュバントが含まれる。ただし、単一分子がアジュバント及び抗原の両性質を有していてもよい（たとえば、熱不安定性エンテロトキシン）。アジュバントは、特異的に又は非特異的に、抗原特異的免疫応答を、多分、抗原提示細胞（たとえば、様々な皮膚層における樹状細胞、とくにランゲルハンス細胞）の活性化によって強化するために使用される物質である。また、Ｅｌｓｏｎら（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）も参照されたい。活性化は初期には表皮又は真皮で起こるが、その効果は樹状細胞がリンパ系及び循環を通して移動する間持続する。アジュバントは抗原とともに、又は抗原なしで処方され適用されるが、アジュバントによる抗原提示細胞の活性化は一般に抗原の提示前に起こる。またそれらは短時間の間隔内で別個に、ただし同じ解剖学的領域（たとえば、同じ排出リンパ節野）に提供されてもよい。
【００６４】
アジュバントにはたとえば、ケモカイン（たとえばデフェンシン、ＨＣＣ−１，ＨＣＣ−４，ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ＭＩＰ−１δ，ＭＩＰ−３α，ＭＩＰ−２，ＲＡＮＴＥＳ）；ケモカイン受容体の他のリガンド（たとえばＣＣＲ１，ＣＣＲ２，ＣＣＲ−５，ＣＣＲ−６，ＣＸＣＲ−１）；サイトカイン（たとえばＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＮＦ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＭ−ＣＳＦ）；それらのサイトカインに対する受容体のリガンド、細菌ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドにおける免疫刺激性ＣｐＧモチーフ；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びその誘導体（たとえばムラブチド、スレオニル−ＭＤＰ，ムラミルトリペプチド）；熱ショックタンパク質及びその誘導体；ｅｌＦ４ａのリーシュマニア相同体及びその誘導体；細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン及びそれらの誘導体（たとえば、遺伝子突然変異体、Ａ及び／又はＢサブユニット含有フラグメント、化学的にトキソイド化されたバージョン）；細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン含有化学的抱合体又は遺伝子組換え体又はそれらの誘導体；Ｃ３ｄタンデムアレイ；リピドＡ及びその誘導体（たとえばモノホスホリル又はジホスホリルリピドＡ、リピドＡアナログ、ＡＧＰ，ＡＳ０２，ＡＳ０４，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，Ｄｅｔｏｘ，ＯＭ−１７４）；ＩＳＣＯＭＳ及びサポニン（たとえばＱｕｉｌ Ａ，ＱＳ−２１）；スクアレン；超抗原；又は塩（たとえば、水酸化又はリン酸アルミニウム、リン酸カルシウム）が包含される。他の有用なアジュバントは、Ｎｏｈｒｉａら（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，７：２６１−２６９、１９９４）及びＲｉｃｈａｒｄｓら（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌら，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）参照。
【００６５】
アジュバントは、好ましくは抗体又は細胞性エフェクター、特異的抗体アイソタイプ（たとえばＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，分泌型ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及び／又はＩｇＧ４）又は特異的Ｔ−細胞サブセット（たとえば、ＣＴＬ，Ｔｈ１，Ｔｈ２及び／又はＴＤＴＨ）を誘導するように選択される。たとえば、抗原提示細胞はクラスＩＩ−限定抗原を前駆体ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示し、Ｔｈ１又はＴｈ２経路に入る。能動的にサイトカインを分泌するＴヘルパー細胞は一次エフェクター細胞であり、それらは静止していれば記憶細胞である。記憶細胞の再活性化は記憶エフェクター細胞を産生する。Ｔｈ１は特徴的に、ＩＮＦ−γを分泌し（ＴＮＦ−β及びＩＬ−２も分泌される）、細胞性免疫の「ヘルプ」を伴う。一方、Ｔｈ２は特徴的に、ＩＬ−４を分泌し（ＩＬ−５及びＩＬ−１３も分泌される）、体液性免疫の「ヘルプ」を伴う。疾患の病原性に依存して、アジュバントはＴｈ１応答（たとえば、抗原特異的細胞溶解細胞）対Ｔｈ２応答（たとえば抗原特異的抗体）に好ましいように選択される。
【００６６】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド又は類似のモチーフはＢリンパ球及びマクロファージを活性化することが知られている（米国特許第６，２１８，３７１）。他の形の細菌性ＤＮＡがアジュバントとして使用できる。細菌性ＤＮＡは、免疫系によるそれらの病原性起源を認識し、先天的免疫応答を刺激して養子免疫応答の招来を可能にするパターンを有する構造クラス中にある。これらの構造は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれ、リポポリサッカライド、テイコイン酸、非メチル化ＣｐＧモチーフ、二重鎖ＲＮＡ及びマンニンス（ｍａｎｎｉｎｓ）を包含する。ＰＡＭＰは炎症応答を仲介できる内因性シグナルを誘導し、Ｔ細胞機能の共刺激物質として作用し、エフェクター機能をコントロールする。ＰＡＭＰがこれらの応答を誘発する能力はアジュバントとしてのそれらの可能性に役割を果たし、それらの標的は抗原提示細胞、たとえば樹状細胞及びマクロファージである。皮膚の抗原提示細胞は同様に、皮膚により伝達されたＰＡＭＰによって刺激されることができた。たとえば、樹状細胞の１タイプのランゲルハンス細胞は、経皮的には貧弱な免疫原性を有する分子と共に存在する、皮膚上の溶液中のＰＡＭＰにより活性化され、この貧弱な免疫原性分子をリンパ節内のＴ−細胞へ移動し、提示するように誘発され、貧弱な免疫原性を有する分子に対する抗体応答を誘発することができた。ＰＡＭＰはまた、他の皮膚アジュバント、例えばコレラトキシンと共に用いて、異なる同時刺激性分子を誘発し、免疫応答を、例えばＴｈ２からＴｈ１応答のように誘導する異なるエフェクター機能を制御することができた。
【００６７】
大部分のＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（ｂＡＲＥ）は、受容体結合活性を含有するＢサブユニット及びＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を含有するＡサブユニットでＡ：Ｂヘテロダイマーとして組織化されている。ｂＡＲＥの例にはコレラトキシン（ＣＴ）大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、ジフテリアトキシン、シュードモナスエキソトキシンＡ（ＥＴＡ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉ−ｎｕｍトキシンＣ２，Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍトキシンＣ３，Ｃ．ｌｉｍｏｓｕｍエキソ酵素、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓエキソ酵素、シュードモナスエキソトキシンＳ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＤＮ、及びＢ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓトキシンが包含される。たとえばトリプシン切断部位の突然変異を含有するｂＡＲＥ（たとえば、Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．６３：１６１７−１６２３，１９９５）又はＡＤＰ−リボシル化に影響する突然変異（たとえばＤｏｕｃｅら，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．６５：２８２２１−２８２２１８，１９９７）を使用することができる。
【００６８】
ＣＴ，ＬＴ，ＥＴＡ及びＰＴは異なる細胞結合部位を有するにもかかわらず、経皮的免疫感作において強力なアジュバントであり、ＩｇＧ抗体を誘発するが、ＩｇＥ抗体は誘発しない。ＣＴなしのＣＴＢもＩｇＧ抗体を誘発することができる。すなわちｂＡＲＥ及びその誘導体はいずれも皮膚に表皮を通して適用された場合、効果的に免疫することができる。しかしながら、アジュバント及び抗原として、ネイティブなＬＴがネイティブなＣＴほど強力ではないことは明らかである。しかし、活性化されたｂＡＲＥは、経皮的免疫系において弱い免疫原性抗原として働くことができる。すなわち、１又は２以上の抗原による免疫感作は別個に、又は抗原提示細胞の免疫刺激と接合させて、予防的又は治療的免疫応答の誘発に使用できる。
【００６９】
一般的に、トキシンは化学的に不活性化して、毒性は低いが免疫原性は維持するトキソイドを形成させることができる。本発明者らは、トキシンベースの免疫原とアジュバントを用いる経皮的免疫感作が、これらの疾患に対する保護に適当なレベルの抗−トキシンを達成することができると想定する。抗−トキシン抗体は、トキシン、又は遺伝子的に脱毒性化したトキソイド自体もしくはトキソイドとアジュバントによる免疫感作により誘発できる。ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン活性又はトリプシン切断部位が変わった、遺伝子的にトキソイド化されたが結合活性は維持されるトキシンは、経皮的免疫感作に用いられる抗原提示細胞の非毒性アクティベーターとしてとくに有用で、トキシンの使用における懸念を減少させる。
【００７０】
ｂＡＲＥは経皮的免疫感作により、抗原特異的ＣＴＬを誘発するアジュバントとして働くこともできる。ｂＡＲＥアジュバントは、他の抗原、たとえば炭水化物、ポリペプチド、グリコリピド及び糖タンパク質抗原に化学的に抱合させることもできる。トキシン、それらのサブユニット又はトキソイドとこれらの抗原との化学的抱合は、表皮から適用した場合、これらの抗原に対する免疫応答の増強が期待される。トキシンの毒性（たとえば、ジフテリアトキシンは毒性がきわめて強いことが知られていて、１分子が１個の細胞を死滅させる）の問題を克服するために、また、破傷風のような強力なトキシンで作業する問題を克服するために、何人かの研究者は遺伝子的に製造されるトキソイドの産生に、組換えによるアプローチを採用している。これは、ＡＤＰ−リボシル化トランスフェラーゼの触媒活性を遺伝子欠失による不活性化に基づいている。これらのトキシンは、結合能力は維持しているが、天然のトキシンの毒性を欠いている。このような遺伝子的にトキソイド化されたエキソトキシンには、経皮的免疫応答の誘発とアジュバントとしての作用が期待される。トキソイドには毒性はないと考えられるので、安全性に対する懸念を生じることがない点で、経皮的免疫系に利点を提供する。しかしながら、トリプシン切断のような技術による活性化は、トリプシン様酵素を欠く皮膚を通じてのＬＴのアジュバント性を増強させることが期待される。さらに、トキシンを化学的に修飾して、上記の問題を解決する幾つかの技術がある。これらの技術は、摂取されたトキシンが有害な反応を生じる可能性がある、ある種の適用たとえば、とくに高齢者への適用に重要である。
【００７１】
アジュバントは、生化学的に、天然のソース（たとえば、ｐＣＴ又はｐＬＴ）から精製するか、又は組換えによって製造してもよい（たとえば、ｒＣＴ又はｒＬＴ）。ＡＤＴ−リボシル化エキソトキシンは蛋白分解（すなわち、活性化）の前又は後に精製することができる。ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンのＢサブユニットも使用できる。蛋白分解後にネイティブな酵素から精製され、又は酵素の全コード領域のフラグメントから製造されて使用される。ＡＤＰリボシル化−エキソトキシンのサブユニットは別個に（たとえばＣＴＢ又はＬＴＢ）又は一緒に（たとえばＣＴＡ−ＬＴＢ，ＬＴＡ−ＣＴＢ）、化学的抱合又は遺伝子融合によって使用できる。
【００７２】
点突然変異（たとえば、単一、二重又は三重アミノ酸置換）、欠失（たとえば、プロテアーゼ認識部位）及びＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンの単離された機能ドメインもアジュバントとして使用することができる。毒性が低いか、又はそれらのＡＤＰ−リボシル化活性は失われているが、それらのアジュバント活性は維持されている誘導体が記載されている。大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの特異的な突然変異体には、ＬＴ−Ｋ６３，ＬＴ−Ｒ７２，ＬＴ（Ｈ４４Ａ），ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ），ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ／Ｌ２１１Ａ）及びＬＴ（Δ１９２−１９４）が包含される。毒性はＹ−１副腎細胞アッセイ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＆ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ，２４：７６０−７６９）でアッセイした。ＡＤＰ−リボシル化はＮＡＤ−アグマチンＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼアッセイ（Ｍｏｓｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６８：６３８３−６３８７，１９９３）によりアッセイした。特定のＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン、それらの誘導体、ならびにそれらの製造及び特徴決定は、米国特許４，６６６，８３７；４，９３５，３６４；５，３０８，８３５；５，７８５，９７１；６，０１９，９８２；６，０３３，６７３及び６，１４９，９１９に記載されている。
【００７３】
ランゲルハンス細胞のアクティベーターはまたアジュバントとして使用できる。このようなアクティベーター例には、熱ショックタンパク質のインデフューサー、接触センシタイザー（たとえば、トリニトロクロロベンゼン、ジニトロフルオロベンゼン、ナイトロジェンマスタード、ペンタデシルカテコール）；トキシン（たとえばシガトキシン、ＳｔａｐｈエンテロトキシンＢ）；リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、リピドＡ又はその誘導体；細菌性ＤＮＡ；サイトカイン（たとえば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）；ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー、溶液中カルシウムイオン、カルシウムイオノフォア、及びケモカイン（たとえば、デフェンシン１又は２，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２，ＩＬ−８）が包含される。
【００７４】
抗原及びアジュバントの両者であるＬＴの場合のように、免疫感作抗原が十分なランゲルハンス細胞活性化能力を有する場合には、別のアジュバントは必要ない。また、このような抗原は十分に免疫原性であるから、アジュバントは必要ないとも考えることができる。生存細胞又はウイルス調製物、弱毒化生存細胞又はウイルス、死滅細胞、不活性化ウイルス及びＤＮＡプラスミドは、経皮的免疫感作に有効に使用することができた。また、低濃度の接触センシタイザー又はランゲルハンス細胞の他のアクティベーターも、皮膚損傷を誘発することなく免疫応答の誘導に使用することができる。
【００７５】
アジュバントの活性を増大させる他の技法には、有効な添加物質たとえば界面活性剤及び／又はホスホリピドを処方に加えて、ＡＤＰ−リボシル化因子によるＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンのアジュバント活性を増強させる。１又は２以上のＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）をｂＡＲＦ（たとえば、ＡＲＦ１，ＡＲＦ２，ＡＲＦ３，ＡＲＦ４，ＡＲＦ５，ＡＲＦ６，ＡＲＤ１）のアジュバント性を増強するために使用することができる。同様に、１又は２以上のＡＲＦがＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンとともにそのアジュバント活性を増強させるために使用される。
【００７６】
望ましくない性質又は有害な副作用（たとえば、アレルギー性又は過敏性反応、アトピー、接触性皮膚炎、又は湿疹；全身性毒性）は、経皮的免疫感作の有効性を破壊することなく、修飾によって低減させることができる。修飾にはたとえば可逆性化学修飾（たとえば蛋白分解）又は免疫系から処方の１又は２以上の成分を可逆的に単離するコーティング中へのカプセル封入が包含される。たとえば、処方の１又は２以上の成分を、送達のための粒子（たとえば、マイクロスフィア、ナノ粒子）中へのカプセル封入できるが、本発明者らはリピド小胞へのカプセル化は経皮的免疫感作には必要なく、マイナスの効果があるように思われることを示した。粒子の貪食作用は独力で、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ分子及び／又は共刺激分子（たとえば、ＣＤ４０，Ｂ７ファミリーメンバーたとえばＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現は上方調節によって、抗原提示細胞の活性化を上昇させる。
【００７７】
処方
医薬的処方の製造方法はよく知られている。処方の成分を医薬的に許容される担体又はビヒクル、ならびに任意の添加物の組み合わせ（たとえば、少なくとも１種の希釈剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、乾燥剤、保存剤、着色剤又はそれらの組み合わせ）を混合する。一般的にＵｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈＥｄ．（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９８年）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ（Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，２ｎｄＥｄ．（編者多数，１９８９−１９９８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）；及びＰｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｓｅｌら，１９９４，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）参照。
【００７８】
グッドマニュファチャリングプラクティス（ＧＭＰ）は医薬品工業において周知であり、政府機関（たとえば食品医薬局）によって規制されている。滅菌された液体処方は、処方の意図された成分を十分な量の溶媒に溶解し、ついでろ過して夾雑する微生物を除去することによって滅菌することによって調製される。一般的には、処方の様々な滅菌成分を、基本の分散メジウム中に含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって分散液を調製する。滅菌が要求される固体剤形の製造には真空乾燥又は凍結乾燥を使用できる。固体剤形（たとえば、散剤、顆粒剤、ペレット、錠剤）又は液体剤形（たとえば、アンプル、カプセル、バイアル中の液体）は、処方の少なくとも１種の活性成分又は成分から調製できる。
【００７９】
様々な投与剤形の製造及びパッチの製造に適当な操作は周知である。処方は、少なくとも１種の活性成分又は成分の固体又は液体剤形をカプセルに封入するか、又はそれらをコンパートメント又はチャンバー中に別個に保持させることにより製造される。パッチは、圧によって破壊され、ついでパッチの乾燥処方を溶解させるビヒクル（たとえば食塩溶液）を含有するコンパートメントを包含できる。各投与用量のサイズ及び対象に投与される間隔は、容器、コンパートメント又はチャンバーの適当なサイズ及び形状を決定するために用いられる。
【００８０】
処方は、活性成分（たとえば、抗原及びアジュバント）の有効量を、ヒト又は動物への投与に適当な医薬的に許容される組成物を提供するために、担体又は適当量のビヒクルとともに含有する。ビヒクルを含有する処方は、クリーム、乳化液、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、溶液、懸濁液、又は本技術分野で既知の他の液体剤形、とくに皮膚の水和を増大させる剤形とする。
【００８１】
投与及び投与スケジュール内での活性成分の相対的な量は、対象（たとえば動物又はヒト）への有効な投与のために適宜調整される。この調整は対象の特定の疾患又は状態、及び治療又は予防が意図されるかに依存する。対象への処方の投与を単純化するために、単一ラウンドの免疫感作のために予め定められた量の活性成分を各単位用量中に含有させる。
【００８２】
タンパク質の不安定性又は変性の多くの原因には加水分解及び変性が包含される。変性の場合は、タンパク質のコンフォメーションが妨害され、タンパク質はその自然の球体構造から脱フォールドされる。その自然のコンフォメーションに再フォールディングされるのではなく、疎水性相互作用が分子を一緒にクランプ（凝集）させるか、自然ではないコンフォメーションへ再フォールディングさせる。いずれの結果も抗原性又はアジュバント活性の低下又は喪失を招く。安定化剤はこのような問題を減少させるか防止するために添加される。
【００８３】
処方又はその製造の任意の中間体は予め保護剤（すなわち、凍結防止剤又は乾燥安定化剤）によって前処理され、ついで氷の結晶の形成を最小にする冷却速度及び最終温度に付すことができる。凍結防止剤の適切な選択及び予め選択された乾燥パラメーターの使用はほとんどすべての処方を、適当な所望の最終的使用のために低温調製することを可能にする。
【００８４】
以下の任意の添加物、たとえば賦形剤、安定化剤、乾燥剤及び保存剤、以下の考察においてそれらの機能によって説明することを理解すべきである。すなわち、特定の化学物質が、賦形剤、安定化剤、乾燥剤及び／又は保存剤のある種の組み合わせとして働く。このような化学物質は、直接免疫応答を誘発しないが、抗原又はアジュバントの免疫学的活性を上昇させることにより、たとえば乾燥及び溶解サイクルにおける抗原又はアジュバントの還元修飾により応答を増強する。
【００８５】
安定化剤には、シクロデキストリン及びその誘導体が包含される（米国特許５，７３０，９６９参照）。適当な保存剤、たとえば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、及びグリセリンは最終処方を安定化するために添加することができる。非イオン界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸の塩、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びそれらの混合物から選択される安定化剤を処方に添加することができる。アルカリ金属塩又は塩化マグネシウムの添加はポリペプチドを安定化し、任意に加えられる血清アルブミン及び凍結乾燥を含めて、安定性をさらに増強する。ポリペプチドはそれを、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、インスリン、デキストリン、及びアルギン酸塩からなる群から選択されるサッカライドと接触させることによっても安定化される。添加できる他の糖には、モノサッカライド、ジサッカライド、糖アルコール及びそれらの混合物（たとえば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）が包含される。ポリオールはポリペプチドを安定化し、水混和性又は水溶性である。適当なポリオールはポリヒドロキシアルコール、モノサッカライド及びジサッカライドであり、たとえばマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース及びそれらのポリマーが包含される。様々な賦形剤、たとえば血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸及びホスホリピド、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン、及び硫酸アンモニウムもポリペプチドを安定化し得る。
【００８６】
単一用量の処方は、適当な賦形剤及び安定化剤の選択により、ポリ（乳酸）及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）の微小球体中に安定化することができる。トレハロースは非還元糖であり、したがってアミノ基を有する物質、たとえばタンパク質、とアミノカルボニル反応を起こさないので、添加物として有利に使用することができる。
【００８７】
対象に、乾燥した非液体型で投与できる処方はコールドチェーンを必要としない条件で保存することができると考えられる。溶液中の抗原（たとえば、ＣＳ６）はアジュバント、たとえばＬＴ、と溶液中で混合して、閉塞性バッキング、たとえばプラスチックラップ、をもつガーゼパッド上に置き、乾燥させる。このパッチをついでガーゼ側を皮膚と直接接触するように皮膚上にある期間置き、単純な閉塞、たとえばプラスチックラップ及び接着テープで覆ってその位置に保持できる。パッチは多くの組成とすることができる。基体は綿のガーゼ、レーヨン−ナイロンの組み合わせ又は他の合成材料であり、閉塞性の固体バッキングたとえばポリ塩化ビニル、レーヨン、他のプラスチック、ゲル、クリーム、乳化液、ワックス、油、パラフィン、ゴム（合成又は天然）、布又は膜を有する。様々な接着剤を用いて、パッチは皮膚上に保持できる、パッチの成分は一緒に保持できる。１又は２以上のアジュバント及び／又は抗原はパッチの基体又は接着剤部分に導入できる。
【００８８】
液体又は準液体処方は直接皮膚に適用され、風乾させれ；皮膚又は頭皮に擦り込まれ；（特に動物の）耳、鼠蹊部、又は皮膚の擦れ合う領域に付され；肛門／直腸組織に付され；包帯、パッチ又は吸収材料でその位置に保持され；浸水させるか、又はほかにストッキング、スリッパー、グローブ又はシャツのようなデバイスによって保持されるか；又は皮膚上にスプレーして、皮膚との最大接触を可能にする。処方は吸収材料包帯又はガーゼに適用してもよい。処方は閉塞性包帯、たとえばＡＱＵＡＰＨＯＲ（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆからの石油乳化液、鉱油、鉱油ワックス、ウールワックス、パンテノール、ビサボール及びグリセリン）、プラスチックフィルム、ＣＯＭＦＥＥＬ（Ｃｏｌｏｐｌａｓｔ）又はバセリン石油ジェリー；又は非閉塞性包帯たとえばＴＥＧＡＤＥＲＭ（３Ｍ）、ＤＵＯＤＥＲＭ（３Ｍ）又はＯＰＳＩＴＥ（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎａｐｈｅｕ）で覆ってもよい。閉塞性包帯は水の通過を排除する。このような処方は単一又は複数の部位、単一又は複数の肢に、又は皮膚の大きな表面積に、完全な含浸により適用することができる。処方は直接、皮膚に適用してもよい。使用できる他の基体は圧感受性接着剤たとえばアクリリックス、ポリイソブチレン、及びシリコーンである。処方は多孔性のパッド（たとえばガーゼ）又は吸水性ストリップ（たとえばろ紙）の代わりに、多分それ自体接着性の基体に、直接導入されてもよい。
【００８９】
パッチを使用するか否かに拘わらず、処方に添加されたポリマーは、活性成分の賦形剤、安定化剤及び／又は保存剤、及び乾燥型活性成分を溶解するために用いた溶液を飽和させる活性成分濃度を低下させるように働く。このような低下はポリマーが「空」のスペースを満たすことにより溶液の有効容量を低下させるので生じる。この方法で、抗原／アジュバントの量は飽和溶液の量を減少させることなく保存することができる。重要な熱力学的考察は、飽和溶液中の活性成分が濃度の低い領域へと皮膚を通って「駆動」されることである。溶液中で、ポリマーはまた、処方の可溶化された成分の抗原／アジュバント活性を安定化及び／又は保存できる。このようなポリマーには、エチレン又はプロピレングリコール、ビニルピロリドン、及びβ−シクロデキストリンポリマー及びコポリマーが包含される。
【００９０】
経皮的送達
処方の経皮的送達はランゲルハンス細胞に標的化され、したがって有効で効率的な免疫感作が達成される。これらの細胞は皮膚に豊富に見出され、Ｔ−細胞の記憶と強力な免疫応答を誘導できる効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。皮膚における多数のランゲルハンス細胞の存在から、経皮的な送達の効率は抗原及びアジュバントに暴露された表面積に関連するのかもしれない。実際、経皮的な免疫感作がきわめて有効な理由は、皮内の免疫感作より、これらの多数の有効な抗原提示細胞が標的化されることであろう。
【００９１】
本発明は、免疫感作への接近を増大させ、一方では強力な免疫応答を誘発させる。経皮的免疫感作は皮下用注射針による注射（すなわち、真皮への透過又は通過）ならびに複雑性及び困難性を要求せず、医学的熟練者、滅菌技術及び滅菌装置の要求を低下させる。さらに、多重部位での免疫感作又は多重免疫への障壁が減少する。処方の単一適用による免疫感作も計画される。
【００９２】
免疫感作は局所的又は表皮への抗原及びアジュバントの単純な処方の適用によって無傷の皮膚に行われ、閉塞性の包帯又は他のパッチ技法を用いて任意に被覆し、化学的又は物理学的な透過を実施し又は実施しない。免疫感作は訓練されていない人でも行うことができ、自分にでも適用できる。免疫感作への容易なアクセスを与え、大規模な領域の免疫感作を可能にした。さらに単純な免疫感作操作は、小児科、老人科及び第三世界集団による免疫感作へのアクセスを改善すると思われる。本発明による経皮的な免疫によれば、抗原及びアジュバントを、免疫系とくに皮下に存する特異的抗原提示細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）へ送達できる方法が提供される。
【００９３】
旧来のワクチンでは、それらの処方が皮膚に針を用いて注射された。針を用いるワクチンの注射には、滅菌した針及びシリンジ、ワクチンの投与のために訓練された医学関係者、注射からの不快感、針に由来する疾患、再使用できる可能性がある針による皮膚の穿孔でもたらされる併発症の可能性を包含する欠点を有する。皮下用針を使用しない経皮免疫感作は、皮下用針を避けることによりワクチン送達に関する進歩を示す。
【００９４】
しかも経皮的免疫感作は、皮膚の大きな表面積を標的する幾つかの位置を用いることにより、より多くの免疫細胞が標的化されることになるので、皮下用針を用いる免疫感作よりも優れている。免疫応答を誘発するのに十分な治療的有効量が単一の皮膚の位置に、あるいは多くの排出リンパ節野を覆う皮膚の領域（たとえば、頸部、腋窩、鼠蹊部、内側上頬、腺窩、腹部及び胸郭のリンパ節）上に、経皮的に送達することができる。このような位置は全身の数多くの異なるリンパ節の位置に近く、少量の抗原が単一の位置に皮内、皮下又は筋肉内注射された場合よりも、より広範囲の刺激を免疫系に提供することになる。
【００９５】
皮膚を通過又は皮膚に侵入した抗原は、抗原提示細胞に遭遇し、それは免疫応答を誘発するように抗原を処理する。多重免疫感作部位に多数の抗原提示細胞が徴集され、徴集された大集団の抗原提示細胞が大きな免疫応答を誘発する。皮膚の使用が抗原を皮膚の貪食細胞たとえば樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、及び他の皮膚抗原提示細胞に送達し；抗原はまた、血流又はリンパ系を通して抗原提示細胞として働くことが既知の肝臓、脾臓、及び骨髄にも送達される、と考えられる。
【００９６】
ランゲルハンス細胞、他の樹状細胞、マクロファージ又はそれらの組み合わせは、それらのアシアログリコタンパク質受容体、マンノース受容体、Ｆｃγ受容体ＣＤ６４、ＩｇＥに対する高親和性受容体又は他の高度に発現される膜タンパク質を用いて特異的に標的化される。それらの受容体のいずれかに特異的なリガンド又は抗体は、アジュバント、抗原又は両者と抱合されるか又はそれらとの融合タンパク質として組換えにより産生させることができる。さらに、アジュバント、抗原又は両者はプロテインＡ又はＧと抱合又はそれらとの融合タンパク質として組換え技術により製造し、Ｂリンパ球の表面免疫グロブリンに標的化することができる。想像された結果は、抗原の抗原提示細胞への広範囲な、稀な程度の、現在の免疫実務では達成されたことのない分布である。
【００９７】
遺伝子免疫感作は米国特許５，５８９，４６６，５，５９３，９７２及び５，７０３，０５５に記載されている。その処方中に含有される核酸（単数又は複数）は抗原、アジュバント又はその両者をコードしてもよい。核酸は複製可能であっても、また複製できなくてもよい。それは非組込み性及び非感染性である。たとえば核酸は、免疫応答をクラスＩ制限応答に向ける抗原及びユビキチンドメインからなる融合ポリペプチドをコードしてもよい。核酸は、抗原又はアジュバントをコードする配列に作用可能に連結された調節領域をさらに含んでいてもよい。核酸にはアジュバントが添加されてもよい。核酸はそのトランスフェクションを促進する物質、たとえば陽イオン性リピド、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン−ＤＭＳＯ又はそれらの混合物と複合されていてもよい。免疫細胞は、ＤＮＡのＦｃ受容体もしくはタンパク質Ａ／Ｇの複合によって、又はそれをα２−マクログロブリンもしくはタンパク質Ａ／Ｇ、又は類似のＡＰＣ標的化材料に連結させる物質にＤＮＡを付着させることによって標的化することができる。
【００９８】
特異的免疫応答は体液性（すなわち、抗原特異的抗体）及び／又は細胞性（すなわち、抗原特異的リンパ球たとえばＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ，Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、及び／又はＴＤＴＨ細胞）エフェクターアームからなる。さらに、免疫応答はＮＫ細胞及び、抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介する他の白血球からなる。
【００９９】
本発明の処方によって誘発される免疫応答には、抗原特異的抗体及び／又はリンパ球の誘発が包含される。抗体はイムノアッセイ法によって検出することができる。様々な抗体アイソタイプ（ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，分泌ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）の検出は、全身性又は局所性免疫応答を指示する。
免疫応答は中和化アッセイによっても検出できる。抗体とはＢリンパ球により産生される保護的タンパク質である。それらは高度に特異的で、一般に抗原の１つのエピトープを標的とする。しばしば、抗体は病原体由来の疾患を生じる抗原との特異的な反応によって、疾患に対する保護において重要な役割を果たす。免疫感作は免疫感作抗原（例えば、細菌トキシン）に特異的な抗体を誘発し得る。
【０１００】
ＣＴＬは、病原体による感染に対して保護するために産生される免疫細胞である。それらはまた、きわめて特異的である。免疫感作は抗原特異的なＣＴＬ、たとえばマラリアタンパク質をベースにした合成オリゴペプチドを、自己主要組織適合性抗原とともに誘導する。経皮的送達システムによる免疫感作によって誘発されるＣＴＬは、病原体感染細胞を殺滅することができる。免疫感作はまた、抗体及びＣＴＬにおけるブースター応答によって示めされるように、記憶応答を生じ、抗原により刺激されたリンパ球の培養によるリンパ球増殖を生じ、また皮膚に抗原単独の皮内チャレンジに対する遅延型過敏症応答を生じる。
【０１０１】
保護の成功は、病原体による感染又はトキシンの投与を使用するチャレンジ研究、又は臨床的基準（たとえば、高い抗体力価、又は粘膜におけるＩｇＡ抗体分泌細胞の産生が指標マーカーとして使用される）の測定によって証明される。
【実施例】
【０１０２】
以下は本発明の例示を意図するものであり、本発明の実施は、以下の実施例によっていかなる意味においても制限又は限定されるものではない。
【０１０３】
動物実施例
ＢＡＢＬ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。マウス（６〜１０週齢）は病原体フリーの状態に維持し、齧歯類用固形飼料と水を自由に与えた。雌のＨａｒｔｌｅｙモルモットは４〜６週齢で、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、病原体フリーの状態に維持し、飼料と水を自由に与えた。
【０１０４】
コレラトキシン（ＣＴ）はＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入し、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）はＳｗｉｓｓ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＶＩ）から購入した。
【０１０５】
組換えＣＳ６（ｒＣＳ６）を調製するためには、カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＵＣ誘導体化プラスミド上、大腸菌株ＨＢ１０（Ｗｏｌｆら，１９９７；Ｗｏｌｆら，１９７７）にＣＳ６の完全な４−遺伝子オペロン（約５ｋｂ）をクローン化した。このクローンを用いてｒＣＳ６をＮｅｗ ＢｒｕｎｓｗｉｃｋＢｉｏＦｌｏ ３０００ファーメンターで産生させた。発酵ブロスを遠心分離によって収穫し、ｒＣＳ６を接線フローろ過によって精製し、ついで硫酸アンモニウムで沈殿させた（Ｗｏｌｆら，１９９７）。ついで、ｒＣＳ６をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で緩衝液交換に付した。精製されたｒＣＳ６を免疫感作まで−２０℃で保存した。ｒＣＳ６の純度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、クーマッシーブルー染色、及び密度測定走査により＞９８％と測定された（Ｃａｓｓｅｌｓら，１９９２；Ｓｃｈｇｇｅｒ ＆ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，１９８７）。
【０１０６】
臨床的なＥＴＥＣ株Ｅ８７７５及びＥ９０３４Ａは、それぞれ、ネイティブなＣＳ６（ｎＣＳ６）及びＣＳ３のソースとして使用した。ＣＦＡアガー（Ｅｖａｎｓら，１９７７）上において増殖させた２種の株の熱及び食塩水抽出液は硫酸アンモニウム、ついで１０％飽和間隔（Ｗｏｌｆら，１９９７）で処理した。６０％及び３０％飽和における沈殿は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡアッセイで測定してそれぞれ最大量及び最高純度のネイティブなＣＳ６及びＣＳ３を含有した。
【０１０７】
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＭＳＰ（ＭＳＰ−１４２、３Ｄ７）をポリヒスチジンタグ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。抗原は３つのクロマトグラフィー工程すなわちニッケル親和性、Ｑ陰イオン交換及びＣＭ陽イオン交換を用いてほぼ均一まで精製した。
【０１０８】
マウスは前述のように経皮的に免疫された（Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｉｎら， ２０００）。略述すれば、動物は、視覚刺激又は皮膚の変化を残さないで背部をＮｏ．４０のクリッパーで剃毛し、４８時間休息させた。マウス及びモルモットはケタミン／キシラジンの混合物の後腿部への筋肉内（ＩＭ）注射又は腹腔内注射（ＩＰ）で麻酔し、免疫感作操作時の自己の身繕いを防止した。露出した皮膚表面を水で濡らしたガーゼによって５〜１０分間水和し、免疫感作前に乾燥したガーゼで軽く吸い取った。２５〜１００μＬの免疫感作溶液を剃毛した皮膚上の２−ｃｍ２の面積に１時間置いた。ついで動物を尾を下にして流水にまかせて約３０秒間徹底的に洗浄し、撫ぜて乾燥させ、再度洗浄した。
【０１０９】
受動免疫感作は、１０，０００ＥＬＩＳＡ単位を越える抗−ＬＴ ＩｇＧ力価を含有するマウスのマッチした株からプールした超免疫血清を尾静脈注射することによって達成された。ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＬＴ又は重炭酸塩緩衝液を経口的にチャレンジする１時間前に、０．５ｍＬの血清を注射した。ナイーブなＣ５７ＢＬ／６マウスも同じ操作を用いてチャレンジの１２時間前に受動免疫感作した。
【０１１０】
外毒素のチャレンジモデルについては記載がある（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，１９８４）。ＢＡＬＢ／ｃマウスには、１０％重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液中に懸濁したＬＴ（５００μＬ中１０μｇ）を与えた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスには体重をベースにＬＴ（５００μＬの１０％ＮａＨＣＯ３中、体重１ｇあたり１００ｐｇ）を給与した。対照動物には５００μＬの１０％ＮａＨＣＯ３単独を投与した。糞食を防止するため、マウスは針金の網の床になっているケージに移した。チャレンジ前１２時間及びチャレンジの間のマウスには１０％のグルコース水を与え、飼料は与えなかった。チャレンジ６時間後に、動物を秤量して屠殺した。ついで小腸（幽門弁から回腸−盲腸接合部まで）を切り離し、液体の喪失を防止するために結紮し、秤量した。液体の蓄積は式ＦＡ＝（Ｇ／（Ｂ−Ｇ））＊１０００（式中、Ｇは消化管重量＋液体のグラム数、Ｂは体重のグラム数）を用いて計算された。この式を用いると、非処置又は重炭酸塩給与動物における液体蓄積のベースライン値は、動物の初期体重に依存して３０〜１５０である。
【０１１１】
組織病理学的な研究は、Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＲｅｓｅａｒｃｈにおけるＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＧａｒｙ Ｍ．Ｚａｕｃｈａ， ＡＶＰ，ＡＢＴ及びＡＣＶＰＭにより実施された。処置群あたり２匹のモルモット及び１匹の対照動物を病理学的研究に準備した。動物は３回のワクチン接種のそれぞれについて暴露して２日後に、麻酔して完全な肉眼的剖検に付した。高用量群の組織病理学的検査には皮膚をもつ組織（毛の生えた皮膚及び背側腰部の暴露部位）の完全な補体の検査を包含させ、残った群で肝臓を評価した。高用量群で収集しホルマリンで固定した組織は、脳、下垂体、舌、肺、気管、食道、甲状腺、胸腺、心臓、膵臓、脾臓、肝臓（付着した胆嚢とともに）、胃、小腸、盲腸、回腸、腸間膜リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、卵巣、子宮、唾液腺、顎下腺リンパ節、骨髄（胸骨）、毛の生えた皮膚、背側腰部の暴露部位、及び肉眼的な損傷であった。個々の動物の組織病理学的所見は１〜５の評点（１＝軽微、２＝軽度、３＝中等度、４＝著明、５＝重度）で分類した。
【０１１２】
ＣＴ，ＬＴ，ネイティブなＣＳ３，ネイティブなＣＳ６，ｒＣＳ６及びＭＳＰ−１４２に対する抗体のレベルはＥＬＩＳＡにて測定した。イムロン−２ポリスチレンプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．１μｇ／ウエルの抗原でコーティングし、室温において一夜インキュベートし、ＰＢＳ中０．５％のカゼイン緩衝液でブロックし、洗浄し、標本の系列希釈を適用し、プレートを室温で２時間インキュベートした。ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体はＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて１時間検出した。抗−ＬＴ特異的ＩｇＡのレベルは上述のように、二次抗体として置換したＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｚｙｍｅｄ）で測定した。分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）抗体のレベルもＥＬＩＳＡによって測定し、この場合、ＬＴコーティングプレートは、順次、ナイーブな又は免疫感作マウスからの糞、肺洗浄液又は膣洗浄液、精製ウサギ抗−分泌鎖（ＳＣ）抗体（１６〜２４時間４℃）（Ｃｒｏｔｔｅｔら，１９９９）及びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）（２時間室温）とインキュベーションした。結合抗体は２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）基体（ＡＢＴＳ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）を用いて明らかにし、反応は３０分後に１％ＳＤＳ溶液を用いて停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。抗体力価の結果は、ＯＤ（４０５ｎｍ）又はＥＬＩＳＡ単位で記録し、これは、光学密度（ＯＤ）１．０を生じる血清の逆希釈として定義される。モルモット抗−ｒＣＳ６ ＥＬＩＳＡは上述のように、検出工程に含まれるペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗−モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により実施された。抗−ＳＣ二次抗体は抗原（ｒＣＳ６）でコーティングされたプレートと反応させ、得られる高いバックグランドは、このアッセイを抗−ｒＣＳ６ＳＣの検出には不適当なものとした。
【０１１３】
１μＬのｒＣＳ６（０．５μｇ）、ネイティブなＣＳ６（１．６μｇ）及びネイティブなＣＳ３（０．５μｇ）をニトロセルロースストリップ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にスポットし、一夜乾燥させた。ストリップをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ）及び１％ウシ血清アルブミンと２時間インキュベートしてブロックした。一次マウス抗体を１：１０００及び１：４０００に希釈し、ストリップと１時間インキュベートし、ついで３回、１，５及び１０分間すべてＰＢＳ−Ｔ中で洗浄した。ついでストリップを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＢＳ−Ｔ中１：５０００）で標識した抗−マウスＩｇＧと３０分インキュベートした。ＰＢＳ中で３回１０分ずつ洗浄したのち、ストリップを３，３’ジアミノベンチジン（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ）、過酸化水素（Ｓｉｇｍａ）及び塩化コバルト（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）で、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のように展開した。すべてのインキュベーション及び洗浄はすべて軌道シェーカー上、室温で行われた。
【０１１４】
最後の免疫感作から７日後に、単核球細胞を脾臓及び表層腹側頸部節から単離し、以前に記述のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｈａｒｔｍａｎら，１９９４；Ｈａｒｔｍａｎら，１９９９）に使用する前に１ｍＬあたり５０ｍｇのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０中で洗浄した。洗浄した脾臓及びリンパ節細胞を計数し、培養メジウム（２ｍＭグルタミン，１ｍＬあたり５０ｍｇのゲンタマイシン及び１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０）中２．５×１０６／ｍＬの密度まで希釈した。１００ｍＬの細胞懸濁液を、予め炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．６中０．１μｇ／ウエルのＣＳ６抗原又はコーティング緩衝液単独でコートしたマイクロウエル中に接種した。各サンプルは四重にアッセイした。３７℃で４時間インキュベートしたのち、プレートを洗浄し、ウサギ抗−モルモットＩｇＧ（１：１２００）、ＩｇＡ（１：７００）又はＩｇＭ（ＩＣＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：８００）を加えた。４℃で一夜インキュベートしたのち、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗−ウサギ抗血清（Ｓｉｇｍａ）を１：２００に希釈して添加した。２時間３７℃に置いたのち、プレートを洗浄し、１ｍＬあたり１００ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートを含む溶解アガロース１００ｍＬの添加により、スポットを可視化した。ついで、スポット形成細胞を立体顕微鏡で計数した。
【０１１５】
新たに収集したマウスの糞、肺洗浄液又は膣洗浄液の肉眼検査では、血液の混入は明らかではなかった。ＨＥＭＡＳＴＩＸストリップ（Ｂａｙｅｒ）によりさらに試験すると、血液の混入は１μＬにつき≦５−２０の無傷の赤血球、又は１ｄＬにつき≦０．０１５−０．０６２ｍｇの遊離ヘモグロビンであった。
【０１１６】
糞のペレットを、自然排便によるチャレンジの前日に収集し、秤量し、１００ｍｇの糞材料あたり１ｍＬのＰＢＳ中にホモジナイズし、遠心分離し、上清を収集し、−２０℃で保存した。
【０１１７】
マウスを放血させ、気管を切開し、２２−ゲージのポリプロピレンチューブを挿入し、ＰＢＳを静かに注入して肺を膨らませた。ついで、注入した材料を放出させ、計３サイクル再注入し、−２０℃で保存した。
【０１１８】
膣腔を、ＰＢＳ（８０μＬ）の膣腔への穏やかな反復挿入及び吸引を計３サイクル行って洗浄した。膣からの材料を１０分間３，０００ｒｐｍで回転させ、上清を清潔な容器に移し、−２０℃で保存した。
【０１１９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＭＳＰ１単独又はＣＴ及びＭＳＰ１により、０，４，８及び１２週に皮膚上で免疫感作した。脾臓及び排出リンパ節（鼠蹊部）組織を一次免疫後２４週の時点で除去した。各群内の個々のマウスからの脾臓組織又はプールしたＬＮから単一細胞懸濁液を調製した。細胞を９６−ウエルプレート中、ウエルあたり４×１０５で５日間３７℃、５％ＣＯ２において、１０μｇ／ｍＬのＭＳＰ１抗原の存在下又は不存在下に培養した。５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を陽性対照として使用した。培養メジウムは、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ），ペニシリン（１０ Ｕ／ｍＬ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ，Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ，Ｓｉｇｍａ）及びＨｅｐｅｓ（１０μＭ，ＢｉｏＲａｄ）を補充したＲＰＭＩ１６４０を含有させた。［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウエル）を、５日間の培養期間における最後の２０時間に添加した。ガラス繊維フィルター上への収穫、ついで液体シンチレーションカウンターによりチミジンの取り込みを評価した。
【０１２０】
ＣＤ４＋細胞は、ＣＴ／ＭＳＰ１免疫群のプールした脾臓細胞からＣＤ４＋細胞選択カラムを用い、製造業者（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の説明書に従ってプールした。カラム（ＣＤ４＋）から溶出した細胞を９６ウエルプレート中、ウエルあたり１×１０５細胞で、ナイーブなマウスからの３×１０５照射（３０００ｒａｄ）フィーダー細胞の存在下又は不存在下に培養した。増殖アッセイは上述のように抗原刺激の存在下又は不存在下に行った。
【０１２１】
他の指示がなければ、示したＥＬＩＳＡデータは個々の動物からの幾何平均値であり、誤差の線は平均からの２標準偏差を表す。抗体力価と液体蓄積（ＦＡ）の群内での比較には、ペアのないＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用い、有意差ｐ値＜０．０５を有意とした。
【０１２２】
細菌性アジュバント及びコロニゼーション因子ＣＳ６による皮膚上への免疫感作は、保護抗体応答を生じる。ＴＣＩが、適当なＥＴＥＣ免疫応答を誘発するのに有効な方法であるかどうかを決定するため、マウスをＣＴ及びｒＣＳ６を用いＴＣＩにより４回免疫感作し、抗−ＣＳ６応答についてアッセイし、ついでＣＴホロトキシンを経口的にチャレンジし、急性の腸腫脹（液体蓄積）の程度を６時間後に定量した。陽性対照群は明礬中５μｇのｒＣＳ６により筋肉内経路（ＩＭ）で免疫した。陰性対照群は皮膚上にｒＣＳ６単独を投与した。ＲＣＳ６抗原と反応する抗体は、低（１０μｇ）又は高（１００μｇ）用量のアジュバントのいずれかを投与した動物における第一の免疫後に明らかであり、第二、第三のブースター免疫後に力価は上昇を続けた。アジュバント（１０又は１００μｇ）の存在下ＣＳ６に対する免疫応答は、抗原単独を１２週にＴＣＩによって送達した場合にみられる応答よりも大きかった（ｐ＜０．０５）。抗−ＣＳ６力価の幾何平均は第三の免疫感作後の高用量群（ＣＴ１００μｇ）最大であり、高い幾可平均抗−ＣＳ６力価は、筋肉内免疫感作に比べて、ＴＣＩを用いて産生されたが、いずれの差も有意ではなかった。抗−ＣＴ力価はＣＴアジュバントした群においてすべての時点で上昇していた。皮膚上ＣＳ６単独で免疫感作された動物は、抗原又はアジュバントに対する一定した抗体応答を発生しなかった。
【０１２３】
皮膚におけるナイーブな、抗原単独、及びＣＴ＋ＣＳ６（１００μｇ／１００μｇ）群を、ＴＣＩを用いた免疫感作後のＣＴによる経口的チャレンジに選択した。ＣＳ６単独及びＣＴ／ＣＳ６群を、第三の免疫感作後１１週にブースターした（研究１９週時点）。２週後、動物に重炭酸塩緩衝液単独（１０％ＮａＨＣＯ３）又は１０μｇのＣＴを含有する重炭酸塩緩衝液のいずれかを給与し、得られた腸の腫脹を測定した。重炭酸塩単独を給与されたナイーブなマウスからの腸は、１０３（範囲７８〜１４６）ベースラインの液体蓄積を示した。ナイーブなマウスにおけるＣＴの経口投与は液体蓄積に２倍の上昇を生じた（平均２０９；範囲１６４〜３５９）。同様に、ｒＣＳ６単独でワクチン接種し、ついでＣＴを給与したマウスも液体の蓄積に約２倍の上昇を示し（平均１９２；範囲１１９〜２９４）を示した。これに反しＴＣＩによりＣＴでワクチン接種されたマウスではチャレンジ後、無視できる腸腫脹を発症した（平均１０５，範囲８４〜１２０）、液体応答は重炭酸塩緩衝液単独を給与されたナイーブ群で観察された場合と区別できなかった（ｐ＜０．５）。
【０１２４】
経皮的に投与されたＣＳ６抗原に対するＣＴ及びＬＴの匹敵するアジュバント作用．ＥＴＥＣワクチンに対するアジュバントとしてのＬＴの使用は、ＬＴがＥＴＥＣ下痢の有意に多くの場合において原因物質であることから（Ｗｏｌｆら，１９９３）、また、そのため抗原及びアジュバントの両方として機能できることから、望ましいと考えられる。ｒＣＳ６のためのＣＴ及びＬＴアジュバントの相対的な強度を試験するために、マウスを１００μｇのｒＣＳ６及びある範囲（１０，２０及び１００μｇ）のＣＴ又はＬＴを用いて４週間隔で３回皮膚上に免疫感作を行った。得られた血清抗−ｒＣＳ６及びアジュバント力価は最終の免疫感作から２週後に評価した。期待されたように抗−アジュバント（ＣＴ又はＬＴ）ＩｇＧ力価はすべてのアジュバント用量で明らかであり、力価は高く、高用量（１００μｇ）の動物内では、最も一定していた。対照的に、ＣＳ６ならびにＬＴ／ＣＴ群のすべてが高い抗−ＣＳ６力価を生じたものの、応答は最低用量で最高であり（１０μｇ対１００μｇ）、一般的にＩＭ経路による前の経験に匹敵した。
【０１２５】
ｒＣＳ６及びＬＴにより免疫されたマウスからの血清抗体はネイティブなＣＳ６を認識する。ｒＣＳ６で免疫されたマウスはＥＬＩＳＡアッセイに使用した組換えタンパク質と反応する高力価の血清ＩｇＧを産生する。これらの結果は、ＴＣＩがＥＴＥＣ感染及び疾患を緩和するのに有効であることを示唆するが、重要なことは、誘発された抗体が大腸菌単離体中に存在するネイティブなＣＳ６（ｎＣＳ６）と反応するか否かであった。抗−ＣＳ６応答の特異性を試験するために、ｒＣＳ６で免疫したマウスからの血清を、ネイティブなＣＳ６タンパク質に対する反応性についてＥＬＩＳＡ及びイムノブロットアッセイで解析した。ＥＬＩＳＡでは、ｒＣＳ６及びＬＴに対して反応性を有する３種のサンプルそれぞれはネイティブなＣＳ６タンパク質に対して特異的であるが、ネイティブなＣＳ３タンパク質には特異的でないことが証明された。同様に、イムノブロットアッセイでは、ｒＣＳ６及びＬＴで免疫されたマウスはいずれも、免疫感作ｒＣＳ６抗原及び部分精製されたネイティブなＣＳ６の両者と反応し、免疫前血清とはほとんど若しくはまったく反応しなかった。ネイティブなＣＳ３対照抗原とは、いずれのマウス血清も反応しなかった。ｒＣＳ６により非経口的に免疫された（ＩＭ注射）マウスからの血清は、経皮的に免疫したマウスからの血清の場合と同様に、ネイティブなＣＳ６及びｒＣＳ６の両者に応答した。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＣ５７ＢＬ／６マウスの場合と同じ様式で応答した。すなわち、ｒＣＳ６を用いるＴＣＩでは、ネイティブな抗原を認識できる血清抗体が誘発された。
【０１２６】
ＬＴに対する抗体は、ＬＴによる経口チャレンジからマウスを能動的及び受動的に保護する。しかしながら、ＬＴはＬＴ仲介ＥＴＥＣ疾患の原因物質であり、ＣＴに酷似し、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）抗体（Ｃｌｅｍｅｎｔら，１９８８）と交叉保護を示すが、ＬＴ抗体を使用するＬＴの経口的チャレンジに対する直接保護はこれまで記載されていなかった。ＬＴ及びｒＣＳ６を用いＴＣＩにより免疫したマウスを記載のように経口的なＬＴによりチャレンジした。高レベルの抗−ＬＴ ＩｇＧが免疫感作マウスの血清中に検出された（ＢＡＬＢ／ｃについての幾何平均＝３６，２４９ＥＬＩＳＡ単位；Ｃ５７ＢＬ／６＝５４，７９２ＥＬＩＳＡ単位）。経口的トキシンのチャレンジには、チャレンジに対する感度の異なる２種のマウス株を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＢＡＬＢ／ｃに比べＬＴトキシンのチャレンジに対して高度に感受性であり、両株における保護は、遺伝的にさらに異なるセッティングで保護的効果が観察されることを示唆するものである。ＬＴチャレンジに対する有意な保護は両株でみられた（ｐ＜０．０５）。
【０１２７】
イヌ及びヒトＥＴＥＣ疾患の研究は、血清抗体が無傷な細菌ならびに単離されたトキシンによる下痢に対する保護に寄与することを示唆している（Ｐｉｅｒｃｅら，１９８０；Ｐｉｅｒｃｅら，１９７２；Ｐｉｅｒｃｅ ＆ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，１９７４）。この前提に呼応し、本発明者ら及び他の研究者は以前に、経皮的に誘発された血清因子が動物をＣＴによる致命的な鼻内チャレンジから保護することを報告している（Ｂｅｉｇｎｏｎら，２００１；Ｇｌｅｎｎら，１９９８ｂ）。すなわち本発明者らは、経皮的に免疫されたマウスにおけるトキシン誘発腸腫脹の防止には多分、抗毒素抗体と考えられる血清因子が寄与するものと仮定した。抗毒素抗体血清による宿主保護の役割を、ＴＣＩによって処置された動物からの血清を投与されたナイーブな受動免疫マウスの経口トキシンチャレンジによって誘発される腸腫脹を定量化することにより評価した。受動免疫の効果はＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス株の両者において評価した。ナイーブなマウスへのＬＴの経口投与は常に、肉眼検査で明らかな液体の蓄積を誘発した。これに対し、受動免疫されたマウスでは、緩衝液単独給与群において観察されたものに匹敵する程度の程度の無視できる液体の蓄積を生じた。すなわち、経皮的に免疫されたマウスからの抗体を与えた受動免疫マウスは、経口的なトキシンチャレンジの続発症から保護された。また、これらの結果は、経皮的に免疫されたマウスは動物をトキシンへの暴露から保護できる血清抗体を産生することが指示される。
【０１２８】
ＴＣＩによるＥＴＥＣ抗原に特異的な粘膜ＩｇＧ，ＩｇＡ及び分泌型ＩｇＡ応答。血清ＩｇＧ応答は、多くの感染物質に対する宿主の保護を伴うが、粘膜免疫応答は粘膜から取得された病原体とくに腸病原体たとえばＥＴＥＣの緩和及び防止に重要であると思われる。ｒＣＳ６を用いるＴＣＩが粘膜で検出可能な抗体応答を誘発するかどうかを決定するため、皮膚上でｒＣＳ６及びアジュバントで免疫したマウスから収穫した糞、肺及び膣標本においてＩｇＧ及びＳ−ＩｇＡ応答を分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＣＳ６単独、ＬＴ／ＣＳ６又はＣＴ／ＣＳ６により３回免疫した。ＣＳ６−特異的ＩｇＧを第三の免疫感作後９週に収集した糞、肺及び膣洗浄標本中で評価した。ｒＣＳ６単独での免疫感作では、高いＣＳ６−特異的ＩｇＧは糞、肺及び膣洗浄標本のいずれにも誘発されなかった。これに反し、ＣＴ／ＣＳ６群の動物では３例中３例が検出可能な抗−ＣＳ６ＩｇＧを肺及び膣洗浄標本中のいずれにも含有した。同様にＣＳ６特異的ＩｇＧ抗体はＬＴアジュバント群からの肺及び膣標本中、及びＣＴとＬＴアジュバント群からの糞標本中に観察した。しかしながら、応答はあまり一定しなかった。糞サンプルの収集方法が糞抗体における一致を起こさせた可能性がある。とくに応答が中等度である場合には、他の収集方法が検討されるべきである。
【０１２９】
局所的に産生されるＩｇＡは、通常分泌型鎖（ＳＣ）と会合したダイマータンパク質であり、上皮の膜を通過する輸送が可能である。ＴＣＩが分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）の産生を誘導できるかどうかを決定するために、動物を皮膚上でＬＴにより２回免疫感作し、抗原特異的ＩｇＧ，ＩｇＡ及びＳ−ＩｇＡ力価を粘膜標本においてＥＬＩＳＡで評価した。ナイーブな動物からの標本と比較して、免疫感作マウスの糞及び膣標本では、１０例中１０例でＬＴを用いる免疫感作により抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが誘発された。さらに重要なことは、試験した１０すべての糞及び膣標本でＳ−ＩｇＡが容易に検出されたことである。
【０１３０】
ＣＴ及びマラリアワクチン抗原の共投与後における保護抗毒素免疫の誘導。多重感染物質に対して標的化されたワクチン接種は期待寿命が比較的短く、２種以上の病原体による個体感染を伴う有病率及び死亡率が高い開発途上国においては望ましい。多重の無関係な感染物質に対する保護の誘発のためにＴＣＩが使用できるかどうかを決定するため、マウスをＣＴ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのタンパク質である、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１４２）のＣ−末端４２ｋＤａフラグメントで同時にワクチン接種した。ＣＴ（０，１０又は１００μｇ）及びＭＳＰ（１００μｇ）タンパク質を０，４，８及び１３週に皮膚に適用した。免疫後の力価が免疫前血清の１：１００希釈で測定されたＯＤの３倍であればマウスはＭＳＰ応答性であるとみなした。この基準に基づいて、ＣＴとＭＳＰで一緒に免疫したマウスからの血清中にＭＳＰを検出したが、対照群（ＭＳＰ単独）から又は免疫前に収穫した（前血液）血清では検出されなかった。二重に免疫したマウスにおける抗−ＣＴ抗体応答の有効性を評価するために、高レベルの抗−ＣＴ抗体を発生したＣＴ（１００μｇ）プラスＭＳＰ（１００μｇ）群からの動物にＣＴを経口的にチャレンジし、腸の腫脹（液体の蓄積）の程度を、ＭＳＰ単独でワクチン接種したマウスにおける誘発と比較した。皮膚上ＣＴ及びＭＳＰを一緒に免疫したすべての動物は、ＭＳＰ単独への暴露群に比べてかなり低い液体蓄積レベル（ｐ＜０．０１）を示した。しかも、免疫マウスからの脾臓及び排出リンパ節細胞は、排出リンパ節細胞及び脾臓中インビトロにおいて強力な抗原特異的増殖性応答を示し、これにはＣＤ４＋Ｔ細胞が寄与した。これらの結果は、アジュバントに対する抗体がＬＴ仲介疾患に対して防御を付与し、一方、他の抗原、たとえばマラリアワクチン抗原候補に対してはアジュバントとして機能することを示唆するものである。
【０１３１】
モルモットにおけるＥＴＥＣ抗原に対する免疫応答。ＴＣＩによる抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の誘導能力を評価するため、確立されたモルモットＡＳＣ動物モデルを選択した。モルモットはアジュバント及び抗原の上皮投与に応答する毒性反応の評価に慣用されるモデルである。モルモットの皮膚をＬＴ（１２〜１００μｇ）及びｒＣＳ６（２５〜２００μｇ）の増加させた用量に、日０，２１及び４２に暴露した。血清を血清学的検討のために日１，２０，４１及び５６に収集し、抗原及びアジュバントに対する抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。マウスによる研究の結果と同様に、ｒＣＳ６及びＬＴワクチンのＴＣＩ投与は、ＣＳ６及びＬＴ濃度に関して用量相関すると思われる、ＣＳ６及びＬＴ抗体応答の誘発を生じた（表２）。ＣＳ６に対する血清抗体の発見は、脾臓及び排出リンパ節組織におけるＣＳ６に特異的なＡＳＣの観察によって確認された。シャムＰＢＳ及びＣＳ６／ＬＴ免疫感作動物から新たに単離された細胞について実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセィでは、抗原に暴露された４匹中４匹で、ｒＣＳ６−特異的ＩｇＡ及びＩｇＭ産生細胞の数において有意な（ｐ＜０．０５）上昇が明らかにされた。抗原特異的ＩｇＡ及びＩｇＭ産生細胞も、現実に検出された細胞数は少なくあまり一致しない（表３）が、上昇したものと思われる。
【表２】
【０１３２】
３回の暴露の各々において、処置群あたり２匹のモルモットを、及び対照群から一匹を、病理学的研究のために準備した（表２）。高用量群の組織の完全な補体を組織病理学的評価に付した。残りの群（対照、低、及び中等度群）から収集した組織は皮膚と肝臓に限られた。高用量群の肉眼的壊死及び組織病理学的検討は、いずれかの暴露における試験製品の投与に帰せられる全身的損傷を証明できなかった。肝臓の壊死はＰＢＳ対照を含めてすべての動物に肉眼的に観察されたが、この所見には処置群との相関はなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパルギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ナトリウム、カリウム及び血中尿素窒素を評価し、すべての処置群で正常であることがわかった。
【０１３３】
ＬＴ／ＣＳ６によるＴＣＩは暴露した局所部位に限定される、最小限から軽度の炎症の変化のみを生じ、２５μｇ ＬＴ／５０μｇ ＣＳ６以上への用量の増加も局所反応の重症度に見るべき影響を与えなかった。典型的な所見は、少ない数の顆粒球及びリンパ球による真皮表層への浸潤（炎症）、ケラチン細胞の過形成による表皮の軽度な肥厚（アカントシス）、及び時に、表皮細胞が凝集力を失い、遊離のケラチン細胞を含む表皮内小胞の形成を生じる小さな病巣（棘細胞離開）である。３時点における最小な変化は、最低の用量群（ＬＴ １２μｇ／ＣＳ６ １２５μｇ）でみられ、ＰＢＳに暴露された対照では皮膚の変化は観察されなかった。マウス及びモルモットの両者では、免疫感作の反復による皮膚所見におけるの重症度には臨床的進行はなく、みられた場合でも、小胞は消散又は圧挫されるか、数日で自然に消散する。
【表３】
【０１３４】
ヒト実施例
年齢１８〜４５歳の健康な男性及び女性ボランティアを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．のメトロポリタン地域から徴集した。除外基準には前年のＥＴＥＣ流行地域への旅行、最近の旅行者下痢歴、妊娠、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染、及び抗生物質に対するアレルギーが包含された。
【０１３５】
ワクチンの成分は、ＬＴと混合したＣＳ６抗原から構成された。ＣＳ６は現在の優れた製造実務（ＧＭＰ）下でＦｏｒｅｓｔ Ｇｌｅｎ Ｐｉｌｏｔ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて産生された。ＣＳ６の産生のために用いた細菌株は大腸菌株ＨＢ１０１から構築され、ＣＳ６の発現に必要な４−遺伝子オペロンを含有するプラスミドを組換え技術によって挿入された。ＣＳ６遺伝子はＥＴＥＣ株Ｅ８８７５（Ｗｏｌｆら，１９９７）からクローン化された。ＣＳ６の産生における主要な工程には、細菌の発酵；接線流ろ過、それに次ぐ硫酸アンモニウムによる沈殿による発酵培養液からのＣＳ６の精製；バルクＣＳ６タンパク質のリン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）溶液中−８０℃での中間的保存；解凍、攪拌及びバイアル中への分配；及び−８０℃での保存が包含される。ＣＳ６はアルミニウムクリンプで封じた灰色のスプリットラバーストッパーを施した２ｍＬの血清バイアル中に精製タンパク質として処方された。各バイアルには、ＰＢＳ中０．９ｍＬ（１．３ｍｇ／ｍＬ）のＣＳ６タンパク質が含有された。大腸菌のネイティブなＬＴは現在のＧＭＰ下Ｓｗｉｓｓ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＶＩ）で製造された。ＬＴは大腸菌株ＨＥ２２ＴＰ２３５Ｋｍから産生された。ＬＴは凍結乾燥粉末として供給された。各バイアルは５００μＬの凍結乾燥したＬＴを含有し、１ｍＬの滅菌蒸留水で再構築された。ワクチン接種グループによるアジュバント（ＬＴ）及び抗原（ＣＳ６）の用量は表４に示す。
【０１３６】
ワクチンは３用量で投与された。最初の用量は日０に投与され、第二及び第三の免疫感作は最初の免疫感作から、それぞれ２８及び８４日目に行われた。ワクチンは、２×２インチの綿のガーゼマトリックス（２層Ｋｅｎｄａｌｌ＃２５５６）から構成される半閉塞性パッチを用いて経皮的に投与された。これは２×２インチのポリエチレン（Ｓａｒａｎ Ｗｒａｐ）のバッキングでカバーされ、さらにこれは４×４インチのＴｅｇａｄｅｒｍ包帯（半閉塞性、３Ｍ ｃａｔ＃１６１６）で覆った。
【０１３７】
ワクチン接種の際には、ワクチンを、５００μＬの滅菌食塩水中で適用し、各上腕に分割用量として投与した。各分割用量は相当する用量のＣＳ６（抗原）単独又は２５０μｇのＬＴ（アジュバント）との組み合わせを含有した。上腕を診察テーブル上に半分伸ばしたように位置させ、イソプロピルアルコール（７０％）の綿棒で５回軽くこすって準備した。綿のガーゼを各上腕に置き、免疫溶液をガーゼにシリンジで適用した。ついで、含浸された綿のガーゼ上にポリエチレンのバッキングを置き、Ｔｅｇａｄｅｒｍ包帯で覆った。パッチの適用後２０分、観察のためにボランティアは研究クリニックに留まらせた。ボランティアは、パッチが装着されている間は、パッチに触れないこと、また激しい肉体的活動には従事しないことを指示された。適用６時間後（範囲：４〜８時間）にパッチを除去させた。ついで免疫部位を５００ｍＬの水で濯ぎ、軽く叩いて乾燥させた。ボランティアには、夜には風呂又はシャワーを使用してもよいが、免疫部位を石鹸でひどく擦ることは避け、皮膚に異常な刺激を与えないように指示された。ボランティアは最初の免疫感作から２８及び８４日後に再度免疫感作された。各ボランティアは各免疫感作で、同じ用量のワクチンを投与された。
【０１３８】
ボランティアは各投与後２０分間、即時性の有害作用の発症について観察した。ボランティアには、ワクチン接種の投与後に観察される兆候及び症状を記録するために日記を与えた。記録された症状は、軽度（気付くことができる）、中等度（日々の活動に影響）又は重度（日々の活動の停止）に分類した。ボランティアは臨床的査定及び副作用の可能性評価のために、２４及び４８時間に評価した。ワクチンの皮膚反応の徴候を認めたボランティアには、さらに７２時間に臨床的査定のためにクリニックに戻るように指示した。ついでボランティアは、副作用が完全に治まるまで必要に応じて追跡した。免疫感作部位に皮膚の発赤を発症した１例のボランティアは皮膚のバイオプシーを実施するか尋ねられた。このバイオプシーは別のインフォームドコンセントの書類に基づき、標準の操作に従って皮膚科医によって行われた。
【０１３９】
ワクチン抗原に対する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の免疫応答は、以前の研究で、ＡＳＣ応答が粘膜腸免疫応答と相関することが示されているので（Ｗｅｎｎｅｒａｓら，１９９２）、この研究の免疫学的終点として選択された。静脈血サンプルはボランティアから、免疫感作前の日０、及び最初の免疫感作後、日７，２８，３５，５６，８４，９１，９８及び１１２に取得した。血液標本はＥＤＴＡ−処置した試験管のＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて収集した。末梢血の単球細胞（ＰＢＭＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）上勾配遠心分離によって単離し、総及びワクチン特異的なＩｇＡ及びＩｇＧ ＡＳＣ数をＥＬＩＳｐｏｔ法（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙら，１９８８；Ｗｅｎｎｅｒａｓら，１９９２）によってアッセイした。ニトロセルロース底９６−ウエルプレート（Ｍｉｌｌｉ−ｔｉｔｅｒ ＨＡ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の個々のウエルを、０．１ｍＬの精製ＣＳ６（２０μｇ／ｍＬ）又はＧＭ１ガングリオシド（０．５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、一夜４℃でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後に、ＧＭ１でコートしたウエルをＬＴ（０．５ｇ／ｍＬ）に３７℃で２時間暴露した。ＰＢＳで洗浄後、プレートを、５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全ＲＰＭＩメジウムでブロックした。完全ＲＰＭＩメジウム中ＰＢＭＣを２×１０７生存細胞／ｍＬに調整した。最終の０．１ｍＬのＰＢＭＣ懸濁液を各ウエルに加え（ウエルあたり１×１０６ＰＢＭＣを加えた）、プレートを、５．０％ＣＯ２中３７℃で４時間インキュベートした。プレートを洗浄し、一方はアルカリホスファターゼ（ＩｇＧ）他方は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩｇＡ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ）と抱合した別のアイソタイプ特異性を有する２つの親和性−精製ヤギ抗−ヒト免疫グロブリン抗体混合物と４℃で一夜インキュベートし、適当なクロモーゲン酵素基質（Ｓｉｇｍａ）に暴露した。個々の細胞により分泌される抗体の地帯に相当するスポットを三重のウエルから倍率４０×下に計数し、データを１０６ ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞数として表した。
【０１４０】
以前に記載されたように（Ａｈｒｅｎら，１９９８；Ｊｅｒｔｂｏｒｎら，１９９８；Ｊｅｒｔｂｏｒｎら，２００１）、本発明者らは陽性なＡＳＣ応答を、ベースラインサンプルにおける１０６ＰＢＭＣあたりのＡＳＣ数が≧０．５である場合、１０６ＰＢＭＣあたりのＡＳＣのベースライン値を越えた≧２倍の上昇として定義した。ＡＳＣ数が１０６ＰＢＭＣあたり免疫感作前に０．５未満であった場合、投与後の値が１０６ＰＢＭＣあたり＞１．０であれば陽性とみなした。
【０１４１】
免疫前及び各免疫感作後日１４及び２８日に、血清抗体力価を測定するために、ボランティアから静脈血液サンプルを取得した。ＬＴに対するＩｇＡ及びＩｇＧ抗体力価をＧＭ１−ＥＬＩＳＡ法（Ｊｅｒｔｂｏｒｎら，１９９８，Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍら，１９８３）により、ＣＳ６に対する力価は前述のＥＬＩＳＡ法（Ｈａｌｌら，２００１；Ｓｔｏｌｌら，１９８６）によって測定した。ＬＴ（ＳＳＶＩにより提供された）及びＣＳ６（ＧＭＰ，ロット０６９５，ＷＲＡＩＲ）を固相抗原として使用した。ＥＬＩＳＡアッセイに用いたＬＴ及びＣＳ６にはワクチン調製物について用いたのと同一ロットを使用した。個々のマイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）をＧＭ１ガングリオシド（０．５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）により室温で一夜コーティングするか、又はＣＳ６の調製物１．０μｇ／ｍＬの０．１ｍＬにより３７℃で一夜コーティングした。ＧＭ１で被覆されたウエルをＰＢＳで洗浄し、０．１ｍＬのＬＴ（０．５μｇ／ｍＬ）３７℃で２時間インキュベートした。０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）でブロックしたのち、血清サンプルを３倍希釈系列（最初は１：５に希釈）で希釈し、ついで室温で９０分間インキュベートした。結合した抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合したウサギ抗−ヒトＩｇＡ又はＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）を添加し、９０分間室温でインキュベートしてついでＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）を加え、証明した。終点力価を、バックグランド（４５０ｎｍにおける吸収）を０．４越える４５０ｎｍのＯＤを与えるサンプルの内挿希釈として指定した。力価を日々の変動を補償した各試験に含まれる対照標本に関連して調整した。両抗原について、同じボランティアからの投与前及び投与後血清サンプルを常に一緒に試験した。各サンプルに帰せられる抗体力価は、異なる日に実施した二重の測定値の幾何平均で表した。互いの終点力価＜５は、計算の目的で２．５に割り当てた。各ＥＬＩＳＡの方法論的誤差の本発明者らの計算に基づいて、本研究の前に、本発明者らは有意な応答（セロコンバージョン）を免疫感作前と処置後の標本の終点力価間の≧２倍の上昇と定義し（Ｊｅｔｂｏｒｎら、１９８６）、免疫感作後の相互力価≧１０の基準を加えることとした。
【０１４２】
３回のスケジュールされたワクチンの投与を受けたボランティアにはすべて、投与後の安全性及び免疫原性分析が行われた。比率はα＝０．０５，検定力＝０．８０で、２×ｎχ２試験を用いて比較した。セルの１つに含まれる数が５未満の場合は２×２表でＦｉｓｈｅｒの直接テストを用いた（Ｓａｈａｉ ＆ Ｋｈｕｒｓｈｉｄ、１９９５）。平均ＡＳＣ数及び平均血漿抗体の力価の上昇倍率は、ワクチン接種の各連続投与のブースター効果を評価するために、別個にＷｉｌｃｏｘｏｎ順位試験を用いた（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ＆ Ｕｒｙ，１９６９）。すべての統計学的試験は両側検定で行った。
【０１４３】
すべてのボランティアからインフォームドコンセントを取得し、この試験の実施に際してはＵ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅのヒト使用ガイドラインに従った。３３例のボランティアが組み込まれ、少なくとも１回、試験ワクチンを投与された。プロトコールはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｕ，Ｓ，Ａｒｍｙによって承認された。ボランティアは年齢２１〜４４歳、女性１７例及び男性１６例；黒人１５例、白人１６例及びアジア人２例であった。３３例のボランティア中、試験に無関係な理由（彼らの仕事のスケジュールにおける都合（４）、Ｄ．Ｃ．メトロポリタン地域からの移動（２）、及び不法薬の使用のために地方の診療所に入院（１））から７例が試験を完了しなかった。２６例のボランティアが３回のスケジュールされたワクチン投与を受け、ワクチン投与後の追跡訪問を完了し、これらのボランティアに関するデータを示した。これらのボランティアは年齢２１〜４４歳、女性１３例及び男性１３例、黒人１２例、白人１２例及びアジア人２例であった。ワクチンの用量によるボランティア数は表４に示す。
【表４】
【０１４４】
ＬＴ／ＣＳ６の組み合わせを投与されたボランティア中７４％（１４／１９）がワクチン接種部位に丘疹状の発赤を発症した。ＣＳ６単独を投与されたボランティアには発赤の発症はなかった。反応は１３例のボランティアで軽度、１例のボランティアで中等度であった。白人のボランティアでの発赤の発症は、黒人のボランティアの場合よりも有意に多かった（１１／１１対３／８，ｐ＜０．００５）。７例の反応は第二投与後に、１４例では第三の投与後に発症した。第二の投与に関連して発赤を生じた７例のボランティアはすべて第三の適用後にも発赤を発症した。臨床的診断は接触性皮膚炎（遅延型過敏症、ＤＴＨ）であった。典型的な発赤を示した１例のボランティアは、ＬＴ／ＣＳ６の第三の投与後に、冒された皮膚のバイオプシーを受けた。バイオプシーでは、限局性の海綿状態を伴う軽度の皮膚慢性炎症（リンパ球）を示した。病理学的診断はＤＴＨの特徴を有する亜急性海綿体皮膚炎であった。発赤は通常、パッチ適用後２４時間以内に始まっていた。第二の投与後における発赤の発症は平均９日間（範囲１〜１４）、第三の投与による発赤は平均６日間（１〜１１）続いた。ボランティアには、ワクチンに関連すると思われる症状の緩和のために０．１％トリアムシノロンクリームが提供された。第一又は第二の免疫感作後にクリームを使用した対象はなかった。第三の投与後に発赤を生じた８例の患者でトリアムシノロンによる処置が行われた。ワクチンの用量により比較した場合、局所症状（掻痒）又は徴候（紅斑、丘疹）の外観及び重症度には明らかな臨床上の差はなかった。トリアムシノロンクリームの使用者と非使用者の間で比較した場合、血清学的免疫応答に統計的有意差はなかった。
【０１４５】
アジュバント及び抗原の両者を投与されたボランティアにのみ免疫応答が検出されたが、ＣＳ６単独を２回投与されただけで１例のボランティアが、単一の時点で、陽性の抗−ＣＳ６ＩｇＡ応答を示した（ただし、ＣＳ６ＩｇＧは陽性ではない）。アジュバント及び抗原の組み合わせを投与された４群の間では、ＬＴ及びＣＳ６に対する血清抗体又はＡＳＣ応答の頻度及び大きさに有意差はなかった。したがって、さらに統計的解析及び提示を行うためにデータをプールした。ＬＴを投与されたすべてのボランティア（１００％）が血清抗−ＬＴ ＩｇＧ応答を示し、９０％が抗−ＬＴ ＩｇＡを産生した。抗−ＣＳ６血清抗体応答率は抗−ＬＴ応答率よりも低く、抗−ＣＳ６ＩｇＧ及びＩｇＡ力価に２倍以上の上昇を示したボランティアはそれぞれ６８％及び５３％であった。ＬＴ及びＣＳに対する血清抗体における個々のピークの上昇倍率は図１に示す。ＬＴ及びＣＳ６の両者に対する強固な応答は、血清抗体とともに観察されたが、応答の大きさには著しい変動があった。ＬＴに対する抗−ＬＴ ＩｇＧの平均は、ほぼログだけ、以前に記載された応答の平均倍率（Ｇｌｅｎｎら，２０００）を超え、ＣＳ６に対する応答よりも大きかった。
【０１４６】
血清抗体応答の速度論を図２に示す。各群についての投与後血清抗体力価を合わせて、幾何平均力価として９５％信頼間隔とともに示す。ＬＴに対する免疫応答の速度論は、ＬＴに対する応答の強力な始動とブースターを示すＣＳ６に対する応答のキネティクススとは著しく異なっている。ＣＳ６に対する応答には、主にブースターが認められた。第二及び第三いずれの免疫感作後の両方にプールした抗−ＣＳ６ＩｇＧ及びＩｇＡ応答には有意差が示唆されるように、ＣＳ６に対する記憶応答があるように思われる。
【０１４７】
ＡＳＣ応答率及び抗原特異的ＡＳＣ×１０６ＰＭＢＣを表５に示す。ＣＳ６及びＬＴに特異的なＡＳＣの両者が検出された。特異的ＡＳＣの型によるそれぞれ個々のレスポンダーに関するピーク数ＡＳＣの時間及び大きさを図３に示す。大部分のレスポンダーにおいては、ピ−クＡＳＣは第二又は第三の免疫感作後に検出された。抗−ＣＳ６ ＩｇＧ ＡＳＣが認められた７人のすべてのボランティアは、第三の免疫感作後にそれらのＡＳＣのピーク数を示した。
【表５】
【０１４８】
腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、開発途上国における小児の下痢の最も一般的な原因の一つである。それはまた、旅行者下痢の主な原因である。疾患の臨床的な表出は、１又は２種のエンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）及び免疫原性は弱い熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）を分泌する細菌によって惹き起こされる。いずれも腸に作用し、疾患の特徴である水性の下痢を生じる。感染に要求されることは、ＥＴＥＣ生物体が腸の上皮に付着する能力を有することである。これは線毛と呼ばれる外膜上の構造を介して行われる。一クラスとしてこれらの構造は抗原的に区別され、コロニゼーション因子抗原（ＣＦＡ）と呼ばれる。今日までに２０の異なるコロニゼーション因子が同定されている。最も広くいきわたり、ヒトに疾患に関連する因子には、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶが包含される。ＣＦＡ／ＩＩは大腸菌表面抗原１（ＣＳ１），ＣＳ２及びＣＳ３と呼ばれる３種の別個の抗原からなる。ＣＦＡ／ＩＶは３種の抗原、ＣＳ４，ＣＳ５及びＣＳ６からなる。
【０１４９】
開発途上国におけるＥＴＥＣ感染の発症率の年齢に関連する低下は、保護免疫の発生に起因するものと考えられてきた。疫学的研究では、感染した小児は同じ化合物株による再感染に対し抵抗性になる（保護される）ことが例証されている。実験的に感染させたボランティアでは同種の株による再チャレンジから保護されることが示されている。異種のＥＴＥＣ株でチャレンジされたヒトボランティアは、臨床的疾患に対して防御されない。
【０１５０】
ＣＦＡは、ＥＴＥＣワクチンの評価のための候補としての可能性が同定されている。しかしながら、この自然の感染に対する広範囲のカバーのためには、ＥＴＥＣワクチンは多重のコロニゼーション因子抗原から構成されなければならない。最も広い範囲をカバーするためには（８０〜９５％）、数種のＣＦＡ（ＣＳ３，ＣＳ６及びＣＦＡ／Ｉ）及びエンテロトキシン（ＬＴ及びＳＴ）から構成される多重ワクチンの開発が要求される。経口投与は可能であるが、これらのタンパク質抗原は、胃内の低いｐＨでの加水分解及び酵素的分解に感受性である。しかも、経口ワクチンには大用量を要し、製品としての実用性がない。エンテロトキシン（ＬＴ及びＳＴ）は他の経路たとえば経口、経鼻、肺内、経直腸又は非経口経路による投与した場合、反応原性（下痢性）及び炎症性であるから、ＥＴＥＣワクチンは他の投与経路に適用できない。
【０１５１】
ＴＣＩの有効性及び安全性は、このワクチン接種の問題にも適用された。以下の実施例において、ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ及びＳＴの多価の組み合わせが、透過の増強下又は増強を行わないで、角質層を通過して効果的送達が可能であり、それらは多価ワクチンの各成分に対する免疫応答を誘発することが証明される。ＴＣＩによるワクチン接種は、低用量の抗原（ＣＳ３，ＣＳ６及びＣＦＡ／）を要求し、免疫応答は同時に共投与されるアジュバントによって有意に増強される。ＴＣＩは、安全にまた重篤な有害副作用を誘発することなく実施することができる。本発明者らは、経皮免疫感作のための抗原及びアジュバントの有効な用量、効果的な投与基準、ワクチンの皮膚内の抗原提示細胞への至適送達、安定な医薬的に許容される処方を記述する。
【０１５２】
材料及び方法
主要な研究は、ＣＦＡ及びＬＴの複合混合物によるＴＣＩのための至適方法を確立するために実施された。以下の研究の目的はＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ及びＳＴａの混合物によるワクチン接種が実行可能であることを証明することであった。これらの研究では、成熟Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢）を使用した。
【０１５３】
マウスは、尾の基部において背腹側表面を、ワクチン接種２４〜４８時間前に剃毛した。すべてのマウスはケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）及びキシラジン（１００ｍｇ／ｍＬ）の混合物２５μＬの腹腔内注射によって麻酔した。剃毛部位を食塩水又は１０％グリセロールと７０％イソプロピルアルコールの混合物による水和で前処置した。まだ完全に水和されている間に、２つの方法の１つで皮膚の最外層、角質層（ＳＣ）を穏やかに処置して破壊した。テープ剥離は３Ｍ又はＤ−ｓｑｕａｍｅ（商標）接着テープを処置表面に適用し、ついでテープを穏やかに除去することを１０回実施した。別法として、水和した皮膚を紙やすり（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は軽石を含む綿棒（ＰＤＩ／ＮｉｃｅＰａｋ）で穏やかに研摩して前処置した。皮膚表面を、上下動を用いて１０回緩衝した。接着性バッキングに固着させたＮｕ−ガーゼパッド（約１ｃｍ２）に、その適用の直前に、ＣＳ３（２５μｇ）、ＣＳ６（２５μｇ）、ＣＦＡ／Ｉ（２５μｇ）、ＳＴａ（８μｇ）及びＬＴＲ１９２Ｇ（２５μｇ）の様々な組み合わせを含有する２５μＬ容量を負荷した。ワクチン負荷パッチは一夜（約１８時間）適用し、除去し、皮膚を水で濯いだ。すべてのマウスは２週の間隔をあけて２又は３回、日０，１４及び２８に投与された。
【０１５４】
末梢血を尾静脈を裂いて得られた。血液は試験管中に回収し、凝血させ、遠心分離し、血清を収集した。サンプルは日０（免疫前）、日１４、日２８及び日４２（第三の投与後２週）に収集した。血清はワクチン接種抗原（ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ及びＳＴａ）及びアジュバント（ＬＴＲ１９２Ｇ）に対する抗体について評価するまで−２０℃で凍結した。後者はＵ．Ｓ．Ｎａｖｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅによって提供された。
【０１５５】
糞サンプルは日３５（第三の免疫感作後７日目）に収集した。新鮮なサンプルを各マウスから収集し、ＰＭＳＦ（食塩水中３μｇ／ｍＬ）で抽出した。サンプルを攪拌（Ｖｏｒｔｅｘミキサー）して懸濁液を形成させ、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）により澄明にした。澄明な上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法による粘膜ＩｇＧ及びＩｇＡの評価まで−２０℃に保存した。
【０１５６】
血清ＩｇＧの評価には、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。９６ウエルプレートをウエルあたり１μｇ抗原／１００μＬで一夜℃においてコートした。リン酸緩衝食塩溶液及びＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、プレートを１００μＬのブロッキング緩衝溶液（０．５％カゼイン及び０．５％ウシ血清アルブミン）により室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、サンプルを、系列希釈（血清サンプルは３倍系列希釈、糞サンプルは２倍系列希釈）で希釈した。プレートを一夜４℃でインキュベートした。プレートをＰＴ緩衝液で洗浄し、ＨＲＰ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）抱合至適希釈（１：２，０００）ヤギ抗−マウスＩｇＧ又は抱合ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｚｙｍｅｄ）１００μＬを各ウエルに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＴ緩衝液で洗浄し、１００μＬの基質ＡＢＴＳ（ＫＰＬ）をウエルに加え、３０分反応させた。１００μＬの１％ＳＤＳ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を加えて反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより４０５ｎｍで光学密度が読み取られ、データはＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ２．４ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解析した。
【０１５７】
ホルマリン不活性化ＥＴＥＣ全細胞に対する血清抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した。腸毒素性大腸菌株Ｅ２４３７７８をアガールプレート上で培養し、細胞を収穫し、２．５％ホルマリン中、室温で一夜不活性化した。ウエルを５×１０５の死滅全細胞（ＥＷＣ）によりコートした。プレートは他の抗原についての記載と同様にして調製した。ＥＷＣに対する血清抗体は上述の方法で測定した。
【０１５８】
マウスを二酸化炭素で窒息させて屠殺し、脾臓と鼠蹊部リンパ節を摘出した。組織を、ＲＰＭＩ１６４０メジウム（Ｇｉｂｃｏ）を含有する試験管中、氷上に維持した。組織を５ｃｃシリンジのバレルで磨砕して単一細胞懸濁液を調製した。組織屑を試験管の底に沈着させ、細胞懸濁液を別の試験管に移した。細胞をＲＰＭＩ１６４０メジウムで２回洗浄し、培養メジウム（ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＦＢＳ，２ｍｍｏｌ Ｌ−グルタミン及び２ｍｍｏｌペン−ストレップ）中に懸濁した。
【０１５９】
９６ウエルろ過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）をＰＢＳ中３μｇ／ｍＬの抗原１００μＬでコートし、一夜４℃でインキュベートした。プレートを３回ＰＢＡで濯ぎ、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で１時間ブロックし、ＢＳＡで濯いだ。細胞を、培養メジウム（ＲＰＭＩ １６４０，１０％ＦＢＳ，２ｍｍｏｌ Ｌ−グルタミン及び２ｍｍｏｌペン−ストレップ）中各ウエルあたり１００μＬで分配し、プレートを加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した。細胞を水による低張ショックにより溶解した。１００μＬのビオチン抱合ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はビオチン抱合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＰＢＳ中２％ＢＳＡでの１：２０００希釈液を加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１００μＬのアルカリホスファターゼ標識アビジンＤ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）１：２０００を各ウエルに加え、さらに２時間室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）をウエルに加えて、プレートを室温で５〜３０分間、青色のスポットが現れるまでインキュベートした。プレートを蒸留水で洗浄して反応を停止させた。抗原特異的ＡＳＣを青色のスポットとして可視化し、解剖顕微鏡で計数し、細胞１０６あたりのＩｇＧ−ＡＳＣ又はＩｇＡ−ＡＳＣとして記録した。
【０１６０】
ＥＴＥＣエンテロトキシンＬＴに対する中和抗体の特性を解析するためのインビトロアッセイ
大腸菌からの熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）はＡ及びＢサブユニットを有する多重サブユニットとして産生される。エンテロトキシンの宿主細胞膜受容体（ＧＭ１ガングリオシド）との初期の相互作用ののち、Ｂサブユニットは細胞膜を貫通して真核動物細胞内へのＡサブユニットの透過を容易にする。化学的還元により、このＡサブユニットは２つの小さいペプチドに解離する。Ａ１は、上皮細胞の基底外側表面上のアデニレートサイクラーゼ酵素複合体における刺激ＧＴＰ−結合タンパク質のＡＤＰ−リボシル化を触媒する。これはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの上昇を生じる。このｃＡＭＰの上昇は水及び電解質の小腸への分泌を惹き起こし、臨床的疾患を生じる。
【０１６１】
細胞培養液中において、ＬＴは高い親和性（ＫＤ＝７．３×１０−１２）でＧＭ１ガングリオシド受容体に結合し、これは多くの真核動物組織及び細胞で発現される。ＬＴは細胞培養中、多くの真核動物細胞（たとえばＣＨＯ及びＹ１）に対して著しい形態学的変化を生じる。この性質を用いて、ＴＣＩによって誘発された抗体がＧＭ１ガングリオシド受容体へのＬＴの結合を阻害（中和）するかどうかを決定するためのインビトロアッセイ方法が開発された。これらの研究では、ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＦ１２メジウム中で培養した。細胞は、３７℃，５％ＣＯ２で対数期の増殖を維持させた。細胞はＴフラスコからトリプシン化し、９６ウエルプレートに、１％ＦＣＳを補充したＦ１２の０．２ｍＬ中５×１０３でプレーティングした。ＬＴで経皮的にワクチン接種し、ＥＬＩＳＡ法でＬＴに対する抗体を持つと決定されたボランティアから、免疫前（日０）及び免疫後（日３２１）の血清を収集した。これらの血清は培養メジウムで１：４希釈し、一連に２倍希釈し、１：８１９２まで希釈した。等容量の希釈血清をＬＴと１時間３７℃で混合した。５０μＬの血清／ＬＴ（６．５ｎｇのＬＴ含有）を、新たにプレーティングしたＣＨＯ細胞培養物（１５μＬのメジウム中５×１０３細胞）の二重サンプルに移した。細胞を３７℃で２４時間培養した。培養期の終了時に、メジウムを除去し、細胞をＦ１２で洗浄し、メタノールで固定し、ギムザ染色で染色した。培養物を倒立光顕微鏡で調べ、培養物を正常な外観又は延長した形態に分類した。結果は、培養物内で９０％を超えて細胞の延長をブロック（中和）した、血清の最低希釈として表した。
【０１６２】
免疫原性及び皮膚を通しての送達を改善するため、熱安定性トキシン（ＳＴａ）のＬＴ又は他の運搬タンパク質に対する抱合
ＳＴａ（ロット１１８４Ａ，Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）のＬＴへの抱合は２工程を含む。第一の工程はＬＴのマレイミド活性化であり、４００μｇのＬＴ（ロット２００ １００，Ｂｅｒｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を４００μＬのリン酸緩衝０．１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した。１６０μＬのスクシンイミジル１−６［（β−マレイミドプロピプロピオンアミドヘキサノエート）］（ＳＭＰＨ，Ｐｉｅｒｃｅ）を約８μＬのＬＲ溶液に添加し、９０分間室温でインキュベートした。反応混合物を脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上でＰＢＳを用いて脱塩し、分画を収集した。活性化ＬＴピークをプールし、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりタンパク質を測定した。第二の工程は抱合であり、８０μｇのＳＴａをマレイミド活性化ＬＴと混合し、一夜４℃でインキュベートした。ＳＴ−ＬＴ抱合体を５００ｍＬのＰＢＳ緩衝液に対して透析した。
【０１６３】
精製したＳＴａ（１００μｇ）を、１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）及び０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含有する反応混合物１ｍＬ中の８００μｇのニワトリ卵オバルブミン（ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ）にカップリングさせた。反応混合物をリン酸緩衝食塩溶液（２０ｎｍ，ｐＨ７．２，ＰＢＳ）に対して４時間透析した。
【０１６４】
抱合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて、オバルブミン及びＬＴ−Ｂの分子量におけるシフトによって確認した。各サンプルは４×サンプル緩衝液（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、１００℃に５分間加熱し、ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）を分析した。電気泳動後、タンパク質のバンドを、銀染色キット（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可視化し、抱合体の分子量を、ゲル上を流した内部対照標準との比較で測定した。
【０１６５】
例１．ＥＴＥＣコロニゼーション因子による経皮的及び皮内ワクチン接種に対する血清ＩｇＧ応答の比較
この研究の目的は、ＣＳ３及びＣＳ６による経皮的ワクチン接種により誘発される免疫応答を、皮内ワクチン接種の場合と比較することを目的とする。グループのマウスを１０回のテープ剥離により前処置し、角質層を除去した。５匹のマウスの群を、１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを使用し又は使用しないで、ＣＳ３（２５μｇ）、ＣＳ６（２５μｇ）で経皮的にワクチン接種した。パッチにはＣＳ３もしくはＣＳ６単独、又はＣＳ３プラスＬＴＲ１９２ＧもしくはＣＳ６プラスＬＴＲ１９２Ｇを含有する容量２５μＬを負荷した。パッチは一夜（約１８時間）適用した。マウスの別の群には２５μｇのＣＳ３又はＣＳ６を皮内注射した。すべてのマウスに３回のワクチン接種（日０，１４及び２８）を行った。第三の免疫感作の２週後に血清を収集し、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体について評価した。
【０１６６】
図４に示す結果は、ＣＳ３及びＣＳ６は経皮的に皮膚に適用した場合、血清抗体を誘発することを証明する。この血清抗体応答は低用量のＬＴＲ１９２Ｇ（１０μｇ）を共投与することによってさらに増強された。図４に示すように、ＣＳ３及びＣＳ６に対する血清力価は、ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントの付加によって、それぞれ２倍及び１２倍に上昇した。ＣＳ３の皮内注射は上皮への適用（１：３０，５８１）に比べて高い力価応答（１：２７３，６９５）を誘発したＣＳ６での経皮的ワクチン接種はきわめて高い力価の抗体を誘発した（１：１８８，９８４）。これはＣＳ６の皮内注射（１：１７，０３６）に比べて１０倍大きかった。さらに、ＬＴＲ１９２Ｇを単独でも、又はＣＳ３もしくはＣＳ６との組み合わせで上皮に適用してもＬＴＲ１９２Ｇに対する高い抗体力価が検出された。これらの結果は、高分子量のＥＴＥＣ抗原（ＣＳ３は約３メガダルトン、ＣＳ６は約１メガダルトン）は、角質層を除去する前処置を施した皮膚にパッチとして投与した場合、免疫原性であることを示している。免疫応答の大きさはアジュバント（ＬＴＲ１９２）の共投与で著しく増強された。変異体ＬＴＲ１９２Ｇも単独で又はＣＳ３もしくはＣＳ６との組み合わせで上皮に適用した場合、それ自身に対する高力価の抗体の産生を誘発した。
【０１６７】
例２．ＥＴＥＣサブユニットワクチンの２価及び３価の組み合わせによる経皮的ワクチン接種
皮膚は例１に記載のように前処置した。マウスは２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ １９２Ｇ；２５μｇ ＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇ；又は２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇのカクテルを含有するパッチで経皮的にワクチン接種した。結果は図５に示す。これらの結果は３価のワクチンの組み合わせ（ＣＳ３／ＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇ）が、２価ワクチン（ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ及びＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇ）に匹敵する血清ＩｇＧ力価を誘発することを証明する。
【０１６８】
これは、多重ＥＴＥＣサブユニットワクチンを単一のパッチ中に組み合わせるにとの実行可能性、及び多重サブユニットワクチンがいずれのサブユニット（すなわち、ＣＳ３又はＣＳ６）に対する免疫応答の大きさにマイナスに影響することなく共投与できることを明瞭に証明するものである。
【０１６９】
例３．ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを共投与又は共投与しない場合のＣＳ３／ＣＳ６を用いたＴＣＩ
次の研究は、上皮投与されたＣＳ３及びＣＳ６の組み合わせに対する免疫応答を、ＬＴＲ１９２Ｇがアジュバントするか否かを決定するために行われた。動物を例１に記載のように前処置し、ワクチンを負荷したパッチを前処置した皮膚（尾の基部）に適用した（一夜）。図６に示した結果は、ＣＳ３及びＣＳ６に対する免疫応答が、３価の混合物に対する１０μｇのＬＴの添加によって、それぞれ５倍及び２４倍に著しく増強されたことを証明する。これは、３種のＥＴＥＣ抗原による経皮的ワクチン接種が実行可能であることを確立する。ＬＴＲ１９２Ｇは重要なアジュバント及び抗原であり、それはＣＳ３に対する免疫応答を５倍まで及びＣＳ６に対する免疫応答を２４倍まで上昇させた。
【０１７０】
例４．ＣＳ３及びＣＳ６分子は抗原的に異なっている
ＣＳ３及びＣＳ６に対する免疫応答の特異性を決定した。マウスをテープの剥離によって前処置し、パッチを２回、一方は日０に他方は日１４に投与した。動物のグループを２５μｇのＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ又は２５μｇＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇでワクチン接種した。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清を収集し、ＣＳ３及びＣＳ６に対する抗体について評価した。図７に示す結果は、ＣＳ３でのワクチン接種がＣＳ６と交叉反応性を示さない特異的抗体を誘発することを証明する。同様に、ＣＳ６に対する抗体はＣＳ３を認識しなかった。これらの結果は、ＣＳ３及びＣＳ６に対する免疫は高度に特異的であり、腸毒素原性大腸菌株に対する広範囲の保護を意図するＥＴＥＣワクチンは多価であることが必要なことを明瞭に示している。
【０１７１】
例５．ＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇを用いるＴＣＩはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラス抗体を誘発する
マウスは、それらの尾の基部において予め剃毛し、皮膚を１０％グルセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和した。それらの水和した皮膚を紙やすりで１０回前処置した。マウスのグループを２５μｇのＣＳ３単独又は２５μｇのＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇの組み合わせでワクチン接種した。マウスは経皮的に３回（日０，１４及び２８）ワクチン接種され、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。図８に示す結果は、この場合に誘発される主要なＩｇＧサブクラスはＩｇＧ１であることを証明するものである。ＩｇＧ１の力価は、ＬＴＲ１９２ＧアジュバントがＣＳ３と共投与された場合より大きかった。さらに、測定可能な抗原特異的ＩｇＧ２ａも検出された。しかしながら、ＩｇＧ２ａサブクラスはアジュバントを共投与した場合にのみ検出された。これらの結果は、ＬＴＲ１９２ＧアジュバントがＣＳ３に対する血清抗体応答を増強することを確認及び拡大するものであり、さらにアジュバントは上皮の経路で送達された抗原に対するＴｈ２及びＴｈ１免疫応答も指示できることを証明するものである。
【０１７２】
例６．ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇを用いるＴＣＩはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラス抗体を誘発する
マウスは剃毛し、例５に記載のように前処置した。マウスのグループに、経皮的に２５μｇのＣＳ６単独又は２５μｇのＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇの組み合わせのワクチンを投与した。マウスは３回（日０，１４及び２８）ワクチンを投与され、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。図９の結果は、ＬＴＲ１９２ＧがＣＳ６に対する血清ＩｇＧ応答をアジュバント（増強）したことを証明する。ＣＳ３と同様に、ＣＳ６に対する抗体はＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラスの両者であった。しかしながら、ＣＳ６−特異的ＩｇＧ２ａの発生はＬＴＲ１９２Ｇアジュバントの使用に依存した。
【０１７３】
例７．ＴＣＩ後、ＬＴＲ１９２Ｇに対して誘発される血清ＩｇＧサブクラス
マウスは例５及び６の記載と同じ操作で前処置した。マウスに、経皮的に３回（日０， １４及び２８）ワクチンを投与し、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。図１０に示す結果は、ＩｇＧ１がＴＣＩによって誘発される主要な血清抗体サブクラスであることを示している。ＣＳ３，ＣＳ６，ＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＧ２ａサブクラスも同様にＴＣＩにより誘発された。
【０１７４】
例８．ＴＣＩにおいてＣＳ３又はＣＳ６を用いて共投与された場合、ＬＴＲ１９２Ｇに対して誘発される血清ＩｇＧサブクラス
マウスは例５〜７記載の操作で前処置した。本研究では１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを２５μｇのＣＳ３又は２５μｇのＣＳ６と混合した。マウスのグループに、経皮的に３回、日０，１４及び２８にワクチンを投与し、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。例７で観察されたように、血清ＩｇＧ１がＬＴＲ１９２Ｇに対して誘発された主要なサブクラス抗体であった（図１１）。測定可能なＩｇＧ２ａも産生された。この研究は、ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ又はＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇの組み合わせを用いたワクチン接種が、アジュバントに対する抗体の産生にネガティブに影響しなかったことをさらに証明するものである。これらの結果は、ＥＴＥＣワクチンの成分としてのＬＴＲ１９２Ｇは、アジュバントとして及びワクチン中の抗原として、二重の目的で働くことを指示するものである。
【０１７５】
ＩｇＧサブクラスの特性決定の重要性は、経皮的なＥＴＥＣワクチンが自然感染に対して保護を示す機構に関係する。これらの結果は、経皮的なワクチン接種が、自然感染に対する宿主の保護に異なる機能を示すことが期待される２つのＩｇＧ抗体サブクラスを誘発することを証明する。これらの機構は「中和」及び「補体仲介細胞毒性」によるものである。ＣＳ３及びＣＳ６に対するＩｇＧ１抗体は、たとえば、病因に必須な工程である小腸でのＣＳ３＋及びＣＳ６＋ＥＴＥＣ株によるコロニー形成能を遮断（中和）することが期待される。ＩｇＧ２ａクラスの抗体には様々な機構による感染から宿主を保護することが期待される。このクラスの抗体は、腸毒素原性大腸菌の表面上でＣＳ３又はＣＳ６抗原と複合体を形成した場合、補体の活性化を仲介し、それが一連の酵素工程を経て細菌細胞の溶解（死滅）をもたらす。いずれの機構も感染からの対象の保護に効果的である。
【０１７６】
例９．ＴＣＩ後のＣＳ３抗原に対する粘膜免疫
ＥＴＥＣサブユニットワクチンを用いるＴＣＩにより誘発される粘膜（胃腸管）免疫応答を特徴づけた。試験はＬＴＲ１９２Ｇを用いた場合、及び用いない場合で、ＣＳ３によるＴＣＩが胃粘膜で抗体の産生を生じるかどうかを決定するために実施された。マウスは尾の基部で剃毛し（４８時間前）、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ワクチンを負荷したパッチを前処置した皮膚の上に置いた。マウスのグループは以下の処方を含有するパッチを受けた。すなわち、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）；２５μｇのＣＳ３単独；及び２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群のマウスには２５μｇ ＣＳ３の皮内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは３回ワクチン接種した（日０，１４及び２８）。第三の免疫感作後７日目（日３５）に糞サンプルを収集した。サンプルを材料と方法の項に記載したように処理した。ＣＳ３単独によるワクチン接種は１匹の動物の例外を除いて抗原特異的抗体を誘発しなかった（図１２Ｂ及びＣ）。ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇでワクチン接種されたマウスは検出可能なＣＳ３に対する糞中ＩｇＧを発生した。ＣＳ３に対する糞ＩｇＡは低レベルであった（図１２Ｃ及びＧ）。ＣＳ３による皮内ワクチン接種は測定可能な、ＣＳ３に対する糞中ＩｇＡ及びＩｇＧを生じた。
【０１７７】
例１０．ＴＣＩ後のＣＳ６抗原に対する粘膜免疫
マウスは例９に記載のように前処置し免疫した。マウスのグループを以下の処方を含有するパッチで経皮的にワクチン接種した。すなわち、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）；２５μｇのＣＳ６；２５μｇ ＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群のマウスには２５μｇ ＣＳ６単独の皮内注射により免疫感作した。すべてのマウスは３回ワクチン接種し（日１４及び２８）、第三の免疫感作後７日目に糞サンプルを収集した。これらの結果は図１３に示す。ＣＳ６単独を投与されたマウスは糞中ＩｇＡ及びＩｇＧをほとんど又は全く発生しなかった（パネルＢ及びＦ）。ＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇで経皮的にワクチン接種されたマウスは力価の低いが測定可能なＣＳ６−特異的ＩｇＡ（パネルＣ）を有した。ＣＳ６−特異的ＩｇＧはすべてのマウスのサンプル中から容易に検出された（パネルＧ）。ＣＳ６を皮内に投与されたマウスは測定可能な抗原特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ（パネルＤ及びＨ）を発生した。
【０１７８】
例１１．ＴＣＩ後のＬＴＲ１９２Ｇ抗原に対する粘膜免疫
マウスは例９に記載のように前処置し免疫した。マウスのグループを以下の処方を含有するパッチで経皮的にワクチン接種した。すなわち、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）；１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ単独；２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群のマウスには２５μｇ ＣＳ６単独の皮内注射により免疫感作した。すべてのマウスは３回ワクチン接種し（日０，１４及び２８）、第三の免疫感作後７日目に糞サンプルを収集した。これらの結果は図１４に示す。ＴＣＩによりＬＴＲ１９２Ｇ単独を投与されたマウスは測定可能な糞中ＩｇＡ及びＩｇＧを発生した（パネルＢ及びＦ）。ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇで経皮的にワクチン接種されたマウスは測定可能なＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＡ（パネルＣ）及び糞中ＩｇＧ（パネルＧ）を発生した。ＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇで経皮的にワクチン接種されたマウスは測定可能なＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＡ及びＩｇＧ（パネルＤ及びＨ）を発生した。これらの結果は、多価ＥＴＥＣワクチンにおけるＬＴＲ１９２Ｇの二重の役割、すなわち、コロニゼーション因子抗原に対する全身性及び粘膜性免疫応答をブースターするための強力なアジュバント及び熱不安定エンテロトキシン、臨床的疾患に関与するトキシンに対するワクチンとしての役割を支持する。
【０１７９】
例１２．２価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩは脾臓内に抗原特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を誘導する
次に、ワクチン接種されたマウスの脾臓内で抗原特異的Ｂ細胞を検出した。マウスは例９に記載のように、前処置し、経皮的にワクチン接種した。
マウスの群を以下の処方のいずれかを用いてワクチン接種した：２５μｇＣＳ３；２５μｇＣＳ３／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇ；２５μｇＣＳ６；又は２５μｇＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇ。パッチを前処理した皮膚に対し一晩適用した。別のマウス群は、尾の基において、２５μｇのＣＳ３及び２５μｇのＣＳ６を用いた皮内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは３回のワクチン接種を受けた（日０、１４及び２８）。方法及び材料の項に記載したように、脾臓を第３の免疫感作（日５８）の３０日後に回収し、単一細胞懸濁液を調製し、抗原特異的ＩｇＧ（ＩｇＧ−ＡＳＣ）及びＩｇＡ（ＩｇＡ−ＡＳＣ）を産生するＢ細胞の同定のために染色した。ＣＳ３単独（図１５、パネルＡ及びＢ）又はＣＳ６単独（図１５、パネルＣ及びＤ）を用いて経皮的に免疫感作したマウスからの脾臓には、ＩｇＡ‐又はＩｇＧ−ＡＳＣは一切検出されなかった。それに対して、ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ又はＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇを用いて経皮的に免疫感作したマウスはＣＳ３−及びＣＳ６−特異的ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣを生じた。これは、脾臓におけるＡＳＣの発生がアジュバントの同時投与に依存することを示している。さらに、ＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣが、二価のワクチン（即ち、ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ及びＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇ）を用いてワクチン接種したマウスの脾臓懸濁液に存在した。これらの結果は、ＴＣＩによる抗原特異的Ｂ細胞免疫の発生がこれらの抗原についてのＬＴＲ１９２Ｇの同時投与に依存することを証明している。
【０１８０】
例１３．３価のＥＴＥＣワクチン（ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ）を用いるＴＣＩは脾臓に抗原特異的抗体分泌細胞を誘導する
この研究の目的は、３価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩ後の脾臓におけるＢ細胞応答を特性づけることであった。マウスを例１２の記載のように前処置し、ワクチン接種した。マウスは、２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇのカクテルを含むパッチでワクチン接種した。パッチを一夜適用し、すべてのマウスは３回（日０，１４及び２８）に経皮的にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に脾臓を収集した。脾臓細胞を、材料と方法の項に記載のように培養し、抗原特異的ＡＳＣを染色し、計数した。結果は図１６に示す。３価のワクチン（ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ）でワクチン接種したマウスはワクチン中の各ＥＴＥＣ抗原に対するＩｇＡ−ＡＳＣ（パネルＡ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（パネルＢ）を発生することが見出された。これらの結果は、ＥＴＥＣサブユニット抗原の混合物による経皮的ワクチン接種が実行可能であり、脾臓内に抗原特異的Ｂ細胞のクローン性増殖を誘導することを証明するものである。
【０１８１】
例１４．１価又は２価のＥＴＥＣサブユニットワクチンを用いるＴＣＩはリンパ節に抗原特異的抗体分泌細胞を誘導する
尾の基部における経皮的なワクチン接種は、尾の背部皮膚表面を排出するリンパ節内のＢ細胞のクローン性増殖を生じると仮説されている。この仮説を試験するため、マウスを、テープを１０回剥離した尾の基部の皮膚で上皮的に免疫感作した。マウスのグループを以下の処方を３回投与した。すなわち、２５μｇ ＣＳ３；２５μｇ ＣＳ６；２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ及び２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群には、２５μｇ ＣＳ３又は ２５μｇ ＣＳ６を皮内に注射した。すべての群は３回（日０，１２及び２８）ワクチン接種し、第三の免疫感作から３０日後に鼠蹊部リンパ節を収集した。単一細胞懸濁液を調製し、抗原とともに培養し、これをマイクロウェル上にプレーティングした。ＩｇＧ−及びＩｇＡ−ＡＳＣを材料と方法の項に記載したように染色して可視化した。図１７に示した結果は、ＣＳ３−又はＣＳ６−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣの発生（それぞれパネルＡ及びＢ）はアジュバントの共投与に依存することを証明する。また、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的なＡＳＣは脾臓よりも鼠蹊部リンパ節に多いことも観察された（図１５）。これは、皮膚免疫感作が同様に、内在性皮膚ランゲルハンス細胞の移動と活性化を包含し、（ＬＴＲ１９２ＧのＧＭ１受容体との相互作用によって活性化されるという仮説と一致する。抗原が負荷され、活性化されたランゲルハンス細胞は上皮から出て、真皮を貫通して排出リンパ管に移動するものと考えられる。リンパ節内のレジデンスに取り込まれた、抗原を有するランゲルハンス細胞はＢ細胞のクローン性増殖を惹き起こし、したがってそれを排出鼠蹊リンパ節内におけるＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇが比較的豊富になる。
【０１８２】
例１５．ＴＣＩによって送達されるＥＴＥＣ抗原の複合混合物に対するＢ−細胞免疫の発生
本発明者らはまた、抗原の複合混合物による免疫感作にＴＣＩが適していることも証明する。マウスは例１４に記載したように前処置し、免疫した。パッチには、次の処方：２５μｇ ＣＳ３，２５μｇ ＣＳ６及び１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇの３種のＥＴＥＣ抗原のカクテル負荷した。３種の上皮免疫感作ののち、鼠蹊部リンパ節を収集し、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＧ−ＡＳＣを測定した。図１８は３価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩが、ワクチン中の各サブユニット抗原に特異的なＡＳＣの発生を刺激しなかったことを示す。
【０１８３】
例１６．ＣＦＡ／Ｉによる経皮的ワクチン接種は全身性免疫を誘発する
高分子量抗原の混合物により皮膚を介して免疫することの可能性が確立されたので、本発明者らは次に、４価のＥＴＥＣワクチンによるＴＣＩの実行可能性を検討した。ＣＦＡ／Ｉは世界中から単離されたＥＴＥＣ株によって広く発現されている。すべてのヒトＥＴＥＣ株の３０％がＣＦＡ／Ｉを発現すると推定されている。最初、本発明者らは、ＣＦＡ／Ｉが皮膚に送達された場合、免疫原性であるかどうかを決定した。これらの研究では、マウスを尾の基部で剃毛し、皮膚を水和し、紙やすりで５回穏やかに研摩して角質層を破壊した。以下の処方のいずれかをパッチに負荷した：２５μｇ ＣＦＡ／Ｉ／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ。パッチは一夜適用した。別個のグループは２５μｇ ＣＦＡ／Ｉを皮内注射して免疫した。すべてのマウスに２回（日０及び１４）投与を行い、第二の免疫感作から１０日後（日２４）、分析のために血清を収集した。図１９に示すように、ＣＦＡ／Ｉで経皮的にワクチン接種されたマウスは、２回の免疫感作後に血清抗体を発生した（パネルＡ）。ＬＴＲ１９２Ｇとの共投与では血清学的応答は約８倍に上昇し、ＬＴＲ１９２Ｇは、皮膚に提示された抗原に対する免疫応答を刺激する一般的なアジュバントであることを指示する。期待されたように、経皮的にワクチン接種されたマウスはＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体も発生した（パネルＢ）。
【０１８４】
例１７．ＣＦＡ／Ｉによる経皮的ワクチン接種は粘膜免疫を誘発する
例１６においてＣＦＡ／Ｉにより経皮的に免疫されたマウスから、新鮮な糞サンプルを収集した。糞サンプルはＣＦＡ／Ｉ特異的なＩｇＡ及びＩｇＧについて試験した。図２０に示すように、ＣＦＡ／Ｉ単独では、検出可能な糞中ＩｇＡ（パネルＢ）及びＩｇＧ（パネルＦ）の発生を誘発しなかった。ＣＦＡ／ＩとＬＴＲ１９２Ｇを投与されたマウスでは、ワクチン接種後に糞中ＩｇＡ（パネルＣ）及びＩｇＧ（パネルＧ）が産生された。興味あることに、ＣＦＡ／Ｉを皮内注射により投与されたマウスでは、抗原に対する糞中の抗体は発生しなかった（パネルＤ及びＨ）。
【０１８５】
例１６及び１７はＣＦＡ／Ｉによる経皮的ワクチン接種が実行可能であること、及び大部分がアジュバントの共投与に依存する全身性及び粘膜応答の産生を証明するものである。
【０１８６】
例１８．４価のＥＴＥＣワクチンによる経皮的ワクチン接種は全身性免疫を誘発する
ＥＴＥＣ感染を防止するためのワクチンによる広いカバーには多価のワクチンの使用が要求される。疫学的研究では広いカバー（ＥＴＥＣ株の８０〜９０％）の、ＥＴＥＣワクチンは、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）と少なくとも３種のコロニゼーション因子抗原の組み合わせが要求されるようであると考えられる。以下の研究は、４価のワクチンによる経皮的ワクチン接種が実行可能であることを証明するために実施された。マウスはＴＣＩの約４８時間前に前処置し、皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和した。ワクチン部位は、紙やすりで５回前処置し、ワクチンを負荷したパッチを皮膚に適用した。ここで用いた処方は、２５μｇ ＣＦＡ／Ｉ，２５μｇ ＣＳ３，２５μｇ ＣＳ６ 及び１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。マウスは日０及び１４の２回にワクチン接種し、第二の免疫感作から１０日後（日２４）に評価のために血清を収集した。図２１に示す結果は、ワクチンの４成分のすべてが、２回の免疫感作後に血清応答を誘発したことを示す。また、ＬＴＲ１９２Ｇ−アジュバントの用量（１０μｇ）は、免疫を達成するためにさらに増量させる必要はなかったことも指摘される。サブユニットワクチンの複合混合物は皮膚を通して送達され、ＬＴＲ１９２Ｇのアジュバント活性はアジュバントの用量の更なる増量を要求しないことが明瞭に指示されるので、この観察は重要である。さらに、ＬＴＲ１９２Ｇの抗原性は多重抗原（ＣＳ３，ＣＳ６又はＣＦＡ／Ｉ）の共投与によって減弱されなかった。
【０１８７】
例１９．４価のＥＴＥＣワクチンを用いる経皮的ワクチン接種はコロニゼーション因子抗原に対する粘膜免疫を誘発する
マウスは例１８の記載のように前処置した。マウスのグループを以下の処方を含有するパッチでワクチン接種した。すなわち、２５μｇ ＣＦＡ／Ｉ，２５ＣＳ３，２５μｇ ＣＳ６及び１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。すべてのマウスは尾の基部で、日０，１４及び２８に経皮的にワクチン接種した。第三の免疫感作から２週後（日４２）に糞サンプルを収集した。サンプルは処理し、ワクチン中の各抗原に対する抗体について評価した。図２２に示す結果は糞中にＣＦＡ／Ｉ（パネルＡ及びＤ）ＣＳ３（パネルＢ及びＥ）及びＣＳ６（パネルＣ及びＦ）に対するＩｇＡ及びＩｇＧが誘発されたことを証明する。
【０１８８】
例２０．４価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩは抗−トキシン（ＬＴ）免疫を誘発する
例１８及び１９に記載のようにワクチン接種したマウスから、糞サンプルを収集した。サンプルを材料及び方法の項に記載のように処理し、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＡ及びＩｇＧについて評価した。図２３に示すように、ＬＴＲ１９２Ｇは抗原特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体の有意な力価を誘発した。この場合、アジュバント単独（パネルＡ及びＤ）、ＣＦＡ／Ｉ抗体と（パネルＢ及びＥ）又は４価のカクテルとして（パネルＣ及びＦ）投与した。
【０１８９】
上記のこれらの例は、多価ワクチンが皮下注射針、ジェットインジェクター又は他の障壁破壊剤を使用しないで、皮膚を通して有効に送達できることを証明する。これらの例はまた、ＬＴアジュバントが、高力価血清抗体の産生の刺激；抗原特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の産生を仲介することによる体液性応答の指示に重要な役割を有し、ある場合には、それはＥＴＥＣコロニゼーション因子抗原に対する粘膜抗体応答の促進が本質的であることも証明する。本発明者らは、抗原のカクテル中で有害な競合を示すことなく、多価ワクチンがＴＣＩにより効果的に送達されることを証明した。これは、ワクチンに、４，５，６，７，８又はそれ以上の抗原を含むことが多分要求されるであろう多くの異なる単離体のカバーを保証するので、様々な抗原特異性を発現する病原体によって惹き起こされる疾患の処置に重要である。トキシンの中和及び感染の防止は、宿主−病原体の相互作用における２つの重要な点での処置（治療及び／又は予防）を提供する。これは予期しなかった先行技術の改良である。
【０１９０】
例２１．ＴＣＩはＬＴに対して長期に持続する中和抗体を誘発する
ヒトボランティアを第Ｉ相臨床試験に組み込んだ。これらのボランティアを、三角筋上の皮膚に経皮免疫した。皮膚はイソプロピルアルコールで前処置し、１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールの混合物で水和した。ガーゼパッチ（４×４インチ）を接着性バッキングに固着させ、ＬＴの水性溶液をパッチに適用した。湿ったパッチ処方はＰＢＳ中５％ラクトースと以下の量のＬＴ：５０μｇ，１００μｇ，２５０μｇ又は５００μｇのいずれかを含有した。ボランティアは２回の用量を投与された（日０及び３０）。血清は免疫感作に先立って（免疫前）及び第一の免疫感作後３１２日（免疫感作後）に採集した。ＥＬＩＳＡによると、血清はそれらの免疫前力価以上のＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体力価を示した（表６）。
【表６】
【０１９１】
インビトロＣＨＯ細胞アッセイを使用して、抗体を含有するこれらの血清がＬＴ受容体結合及びインビトロ毒性を中和するか否かを決定した。すべての血清は、インビトロにおいてＬＴの毒性をブロック（中和）する抗体を有することが見出された。この結果は、ＴＣＩが、細胞上の熱不安定性エンテロトキシンＬＴの毒性作用を中和する機能を有する抗体を誘発しないことを示している。ＴＣＩはＬＴに対して長期に持続する免疫を誘発し、その際誘発される抗体はそのトキシンを中和する。
【０１９２】
例２２．ＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇサブユニットワクチンを用いる経皮的ワクチン接種は、ＣＳ３＋ＥＴＥＣ全細胞上の抗原を認識する血清抗体を誘発する
次に、本発明者らは、経皮的ワクチン接種により誘発された抗体が、腸毒素原性大腸菌生物によって発現されたネイティブなコンフォメーションのエピトープと免疫反応性であることを示す。マウスは予め剃毛し、皮膚を水和した。パッチは２５μｇのＣＳ３及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇの２５μＬから構成される水性溶液を、ガーゼパッチに直接適用することにより調製した。皮膚がまだ水和されている間にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。１群１０匹のマウスにパッチを２回、日０及び１４に投与した。第二の免疫感作から１０日後、日２４に血清を収集した。これらの血清はＥＬＩＳＡ法により、精製ＣＳ３に対する抗体について、ＬＴＲ１９２Ｇ及びＣＳ３を発現する腸毒素原性大腸菌（Ｅ２４３７７８株）に対する抗体について評価した。結果を示す図２４は免疫感作マウスが精製ＣＳ３（１：７０，４６４）及びＬＴＲ１９２Ｇ（１：３２，６５７）に対する有意な血清抗体力価を発生することを証明する。これらの血清はまた、ＥＴＥＣ全細胞（１：１１，２０６）に対して顕著な血清抗体力価を有することが見い出された。これらの結果は、ＥＴＥＣサブユニットワクチン（たとえばＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇ）によるＴＣＩが、ＣＳ３−発現ＥＴＥＣ株上のネイティブなコンフォメーション決定基を認識する抗体の産生を生じることを証明する。
【０１９３】
例２３．死滅ＥＴＥＣを用いたＴＣＩは細菌性病原体に対して免疫を誘発する
皮膚に適用した死滅細菌性病原体による経皮的なワクチン接種が実行可能である。ＥＴＥＣ（株Ｅ２４３７７８）を細菌増殖メジウム上で増殖させた。細菌は遠心分離によって収穫し、リン酸緩衝食塩溶液で洗浄した。２％のホルマリン溶液を細胞ペレットに加え、細胞を単一細胞懸濁液に懸濁した。すべての細菌を死滅させるために、細胞を一夜室温で混合した。死滅細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。マウスは剃毛し、尾の基部の皮膚でテープを１０回剥離して前処置し、角質層を除去した。ガーゼパッチに、１０９死滅ＥＴＥＣ全細胞（ＥＷＣ）を含有する２５μＬの液を負荷し、１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇをこの混合物に加えた。パッチは一夜適用した。１群１０匹の動物を日０及び１４にワクチン接種した。第二の免疫感作から１０日後に血清を収集した。血清を、材料と方法の項に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、ＥＷＣ及びＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体について評価した。図２５に結果を示す。すべてのマウスが血清学的に変換されていること、及び細菌全細胞（１：３２４）ならびにＬＴＲ１９２Ｇ（１：２１，０４４）に対する血清抗体を有することが見出された。これらの結果は、死滅細菌全細胞による経皮的ワクチン接種が実行可能であり、生物特異的な免疫応答が誘発されることを最初に証明するものである。
【０１９４】
例２４．ＥＴＥＣコロニゼーション因子、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）及び熱安定性トキシン（ＳＴ）抗原を用いたＴＣＩ
ある種の腸毒素性大腸菌が、熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）と呼ばれる第二のエンテロトキシンを産生することは周知である。熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）のように、ＳＴはヒトで高度に反応原性で、小児及び成人でひどい下痢を生じる。ＥＴＥＣの株は、ＳＴａ単独、ＬＴ単独、又はＳＴａとＬＴの組み合わせを産生する。ＳＴａは分子量の小さい１９アミノ酸ペプチドであり、６個のシステインを含有する。ＳＴａは注射によって投与された場合、貧弱な免疫原性を示すことが知られている。この研究は、多重コロニゼーション因子（ＣＳ３及びＣＳ６）及び両エンテロトキシン（ＬＴ及びＳＴ）から構成される複合ＥＴＥＣワクチンの経皮送達が可能なことを証明するために実施された。本明細書に記載の方法で、マウスは尾の基部でテープを１０回剥離して前処置した。ここでは以下のパッチ処方を使用した２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６；２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ／ＬＴＲ１９２Ｇ／６８μｇ ＳＴを負荷した。マウスは日０，１４及び２８の３回、ワクチンを経皮的に投与された。第三の免疫感作２週後、血清を収集した。図２６に示す結果は、コロニゼーション因子に対する免疫はＬＴＲ１９２Ｇの添加によって有意に増強されたことを証明する。この研究はまた、多重ＥＴＥＣワクチンへのＳＴの添加が、ＬＴＲ１９２Ｇのアジュバント作用又はこれらのコロニゼーション因子の免疫応答発生に有害な影響を与えることなく可能であることを証明する。ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ及びＳＴａ又は抗原の他の組み合わせから構成される５価のＥＴＥＣワクチンの開発が可能であることが示唆される。これらの抗原は、ＴＣＩにより、毒性又は重篤な有害な副作用もなく、安全に投与することができる。
【０１９５】
例２５．ＥＴＥＣ抗原の送達のための、湿潤、接着剤中タンパク質及び風乾パッチ処方
パッチはＥＴＥＣワクチンのＴＣＩによる送達のための多岐にわたるビヒクルである。ここでは、ＬＴを４つの異なる方法で処方した。第一に、ＬＴ（１０μｇ）を、５％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む中性ｐＨのリン酸緩衝食塩溶液から構成される水性溶液中に処方した。この処方は、１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和した皮膚に直接適用した。この溶液を静かに又はガーゼパッドで覆って１時間放置した。第二に、ＬＴを様々な接着剤（たとえばＫｌｕｃｅｌ）と配合した。この処方をついで閉塞性バッキングの上に薄いコートとして広げた。ＬＴは面積１ｃｍ２あたり１０μｇの有効濃度で、Ｒｏｔｏｇｒａｖｅｕｒプレスを用いて薄いフィルムに広げた。フィルムを室温で風乾し、水分含量を０．２％〜５％未満にした。パッチ（〜１ｃｍ２）をシートから打ち抜いた。パッチは常温及び４℃で保存し、同じ送達特性を示した。第三に、ＬＴはガーゼパッドに直接適用し、表面上に１０μｇ／ｃｍ２の濃度に均一に広げた。これらのパッチは一夜風乾した。第四に、水性処方中ＬＴ（２５μＬのＰＢＳ中１０μｇ及び５％ラクトース）を、接着性バッキングに固着したガーゼパッド（〜１ｃｍ２）に直接滴下した。これらのパッチは一夜常温で風乾した。これらのパッチは使用前１ヶ月４℃に保存した。
【０１９６】
パッチは、材料及び方法の項に記載のマウスモデルを用いてＬＴ抗原の送達について比較した。尾の基部で皮膚を剃毛し、水和し、軽石を含む綿棒で前処置し（１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで処方）、角質層を破壊した。５匹のマウスの群に２つのパッチを、１つは日０に、他は日１４に投与した。適用の前に、風乾したパッチを水２５μＬにより再水和した。２４時間後にパッチを除去した。液体処方については、ＬＴ含有溶液を皮膚上に１時間置き、次いで過剰のＬＴを水で濯いで除去した。第二の免疫感作から２週後（日２８）に、各動物から血清を収集した。結果は図２７に示す。これらの結果は、すべての方法が皮膚を通してのＬＴの経皮送達に適当であることを証明した。この例は、パッチ処方が、パッチに重ねて皮膚に直接適用される水性液体；接着剤（接着剤中のタンパク質）内に抗原を導入し、閉塞性バッキング上に薄いフィルムコーティングとして広げた乾燥パッチ；抗原を適当な表面に直接、溶液で適用し（別個に、又はカクテルとして）、風乾させたパッチ；又は抗原は溶液中に存在し、パッチの適用直前に、パッチ表面に直接適当量の溶液を適用する水和パッチのいずれでもよいことを示す。
【０１９７】
例２６．ＥＴＥＣサブユニットワクチン及びエンテロトキシンの経皮送達のための接着剤中タンパク質処方
接着剤中タンパク質処方は、接着剤処方に１又は２種以上のＥＴＥＣサブユニット抗原の導入を意図するものである。この処方はまた、死滅ＥＴＥＣ全細胞（用量あたり〜１０４〜１０８死滅細菌）のＬＴ−アジュバントとともに又はそれなしでの導入に適している。このブレンドをついで、薄いフィルムとした閉塞性（又は半閉塞性）バッキングシート上に注いで鋳造する。ワクチン／接着剤混合物を、フィルムが乾燥するまで（水分含量は０．５〜５％を変動する。１〜２％が望ましい）硬化させる（室温又は４０℃）。型をとったフィルムをダイカストから所望のサイズ及び形状に切断する。ついで、乾燥パッチを、遮光した防水性プラスチック又はフォイルの袋でシールする。この方法で製造されたパッチは冷蔵庫又は室温で保存する。接着剤中タンパク質は、１又は多重抗原及びアジュバントが様々な量及び比で変動させて導入できる点で柔軟性である。さらに、パッチのサイズは用量を調整するために変動させることができる。個人の年齢に依存して、パッチのサイズ（用量）は小児及び成人で変動させることができる。
【０１９８】
接着剤中タンパク質処方は、柔軟で独特に、ワクチンの層によるコーティングを可能にする。これらのパッチは、各ワクチン成分がパッチバッキング上に別個に層を形成するように製造される。目的は、成分１がバッキング上に層を形成し、成分２のフィルムが１の上に層を形成し、成分３が成分１及び２の上に層を形成し、成分４が最も外の層になるような多重層膜を形成させる。このアプローチの利点は、処方に柔軟性を与えること（すなわちパッチは異なる比の抗原及びアジュバントを用いる同一方法で製造され、又は１又は２種のみの成分を含有する場合も同じ方法でワクチンが製造される）。この多重処方は各抗原及びアジュバントの放出速度をコントロールできる利点を有する。一部の例では、ＬＴ−アジュバントは、皮膚樹状細胞（ランゲルハンス細胞）を他の抗原が放出される前に予め始動させるために、直ちに放出されることが望ましい。このような処方では、ＬＴ−始動ランゲルハンス細胞はトキシン及びコロニゼーション因子抗原をより効率的に捕獲し、処理する。コントロールされた送達は、アジュバント及び抗原のより効果的な使用であり、用量をさらに低下させる。
【０１９９】
表７及び８は、アジュバント及び／又は抗原を接着剤中に安定化するために適当な処方を記載する。以下はこのような処方を例示する意図であり、処方を限定する意図ではない。
【表７】
【０２００】
例２７．ＥＴＥＣサブユニットワクチン（Ｃ３，Ｃ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＳＴ及びＬＴ）及び死滅ＥＴＥＣ全細胞の送達のためのゲル処方
ゲルは完全水和又は湿潤パッチの例である。これらの処方は、ゲルマトリックス内に捕捉された１又は２種以上のＥＴＥＣサブユニット抗原を導入する意図である。この処方はまた、死滅ＥＴＥＣ全細胞（用量あたり約１０４〜１０８死滅細菌）のＬＴとともに又はＬＴなしでの経皮的送達に適している。ワクチンは、カルボマー、プルロニック、又は２つのゲル成分（以下参照）と所望の量及び比で、抗原含有溶液を配合することによって処方される。ゲル含有ワクチンはついで、こぼさないで正しい位置に保持する細片材料上にコーティングする。この材料はワクチン中のタンパク質に対して低い結合能を有することが重要である。細片は、たとえばポリマー、天然及び合成織布、不織布、フォイル、紙、ゴム又はそれらの混合物からなることができる。細片は単一層又は２以上の層のラミネートとする。一般に、細片は実質的に水非透過性であり、皮膚を水和状態に維持することを補助する。この材料は可撓性及びタンパク質に対する低結合性の要求に合致する限り、任意のタイプのポリマーでもよい。適当なポリマーには、それらに限定されるものではないが、ポリエチレン、ビニル酢酸エチル、エチルビニルアルコール、ポリエステル又はテフロン（登録商標）が包含される。ゲルを保持する細片材料の厚さは、１ｍｍ未満、好ましくは０．０５未満、最も好ましくは０．００１〜０．０３ｍｍである。
【０２０１】
ゲルを負荷した細片は様々なサイズ及び形状とすることができる。コーナーは丸くするのが適用に便利である。細片の長さは様々に変動可能であり、使用者（すなわち、小児又は成人）に依存する。それは約２ｃｍ〜約１２ｃｍであり、好ましくは約４ｃｍ〜約９ｃｍである。細片の幅は約０．５ｃｍ〜約４ｃｍである。
【０２０２】
細片は浅いポケット又は窪みを含有することができる。正しい位置に保持させるため、ワクチン含有ゲルを細片上にコーティングする場合には、ゲルの保存部を提供する浅いポケットをゲルで満たす。浅いポケットの横幅は約０．４ｍｍ、深さは約０．１ｍｍとしてもよい。ゲルを負荷したパッチの厚さは約１ｍｍ、好ましくは約０．５ｍｍ又はそれ未満である。
【０２０３】
ゲルと皮膚の間の最大接触を維持しなければならないので、曲げに対する硬直性が重要である。細片はパッチが適用される位置（たとえば、三角筋上の皮膚、掌側の前腕、頸部、耳の後部又は他の位置）の解剖学的位置の外郭に合わせる必要がある。曲げに対する強直性はＨａｎｄｌｅ−Ｏ−Ｍｅｔｅｒ（Ｔｈｗｉｎｇ Ａｌｂｅｒｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定できる。曲げに対する強直性は５ｇｍ／ｃｍ未満、好ましくは３ｇｍ／ｃｍ未満でなければならない。比較的低い曲げ強直性により、細片の材料はほとんど力を要しないで輪郭上にまとわせることが可能である。
【０２０４】
ゲルを負荷した細片は、細片を接着性のバッキングに、細片のゲル表面が接着性バッキングと向かい合わないように正しい位置に固着させる。バッキングの材料は閉塞性又は半閉塞性である（たとえば、Ｔｅｇａｄａｍ）。バッキングはパッチを正しい位置に保持し、皮膚とゲル間の最大接触の維持を助け、装着時にゲルの脱水を防止するように設計される。
【０２０５】
保存時又は取り扱い時の湿潤パッチの脱水を防止するため、かなり剛性な不活性プラスチックの細片上に配置する。ゲル表面はこのプラスチックの細片と直接接触し、ゲル／プラスチックのインターフェースは弱い剥離力を有し、プラスチックの細片からゲル細片の分離を容易にする。プラスチックの細片はポリエチレン又は類似の材料で作成する。ゲルパッチは、光から保護された水の漏らないプラスチック又はフォイルの袋で包装する。袋は冷蔵庫又は室温で保存できる。
【０２０６】
以下の記載は、水和ゲル処方の例示を意図し、限定を意図するものではない。ゲルは、リン酸緩衝食塩溶液；１％Ｃａｒｂｏｍｅｒ１３４２；１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０；１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９３４；１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，２％スクロース，１０％イソプロピルアルコール、１０％グリセロール；５０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ８７；及び３０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８中にゲルを処方する。
【０２０７】
カルボマーポリマーは、高分子量のアクリル酸ベースのポリマーであり、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールによる架橋、及び／又はＣ１０〜Ｃ３０アルキルアクリレートによる修飾を受けていてもよい。これらはパッチに導入されても、導入されなくてもよく、本技術分野で既知の他の手段によって皮膚内に送達されてもよい。
【０２０８】
処方は平均分子量が異なるカルボマーから構成されてもよい。たとえば、ポリマーはＣａｒｂｏｍｅｒ１３４２（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ１３４２，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）；Ｃａｒｂｏｍｅｒ９３４（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９３４，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）；又はＣａｒｂｏｍｅｒ９４０（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）とすることができる。各処方はリン酸緩衝食塩溶液中に調製し、ＬＴを０．６ｍｇ／ｍＬ又はそれ未満の濃度で含有するが、抗原及びアジュバントも約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約０．６ｍｇ／ｍＬ，又は約０．６ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬ処方される。さらに、抗微生物剤たとえばメチルパラベン及びプロピルパラベンも包含させることができる。
【０２０９】
Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０とＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ８７の組み合わせ（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ８７，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）が使用できる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃはエチレンオキシド−プロピレンオキシードエチレンオキシドの反復セグメントを含有する他のクラスのハイドロゲルである。処方中のＬＴ及び抗微生物剤の量は、同一である。
【０２１０】
他の処方では、透過エンハンサー及びカルボマーを用いて送達を増強できる。たとえば、ゲルはＣａｒｂｏｍｅｒ９４０とＰｈａｒｍａｓｏｌｖｅを含む（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，１０％Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖｅ，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）、最終のゲルはＣａｒｂｏｍｅｒ９４０，グリセロール及びイソプロパノールを含有し得る（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，１０％グリセロール、１０％イソプロパノール、０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）。ＬＴ及び抗微生物剤の濃度は前の処方と同じままであるか、又は特定された他の範囲とすることができる。
【０２１１】
例２８．ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＳＴ及びＬＴに対する投与量
用量範囲は変動し、対象の年齢及び医学的状態に依存し得る。１ｍｇ〜５μｇ未満の用量によりヒト及び動物対象の両者で抗原特異的免疫応答を誘発し得る。望ましい成人用量はコロニゼーション因子について、それぞれ約１μｇ〜約１００μｇの範囲（たとえば、ＣＳ３，ＣＳ６及びＣＦＡ／Ｉ）であり；各コロニゼーション因子の好ましい用量は約５μｇ〜約５０μｇである。ＬＴについての望ましい成人用量は約１μｇ〜約１００μｇの範囲であり；ＬＴの好ましい用量は約５μｇ〜約５０μｇである。望ましい成人用量はＳＴ（担体タンパク質に抱合されていない）について約１μｇ〜約１００μｇである。ＳＴは貧弱な免疫原性であるから、成人用量は約２５μｇ〜約１００μｇである。ＳＴがＬＴに化学的にカップリングしている場合（ＬＴ−ＳＴ）、ＳＴの相当用量は約５μｇ〜約５０μｇである。ＳＴを他の担体タンパク質、たとえばアルブミン、ＫＬＨ又は凝集抗体に抱合させることにより、免疫原性を改良することができる。後者の場合、ＳＴの用量は約５μｇ〜約５０μｇである。
【０２１２】
【０２１３】
上に引用された参考文献（たとえば、論文、著書、特許及び特許出願）は、本技術分野の技術レベルを示すものであり、参考として本明細書に導入される。
【０２１４】
特許請求の範囲の意味及びそれらの法的な均等物の範囲内に入る修飾及び置換はそれらの範囲内に包含される。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の移行部を用いる特許請求の範囲は、特許請求の範囲内に他のエレメントを包含させることができる。本発明はまた、移行部の語句「・・・から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｇ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を用いる請求の範囲によっても記載され（すなわちそれらが本発明の操作に実質的に影響しなければ、他のエレメントを請求の範囲内に包含される）、また、「からなる（ｃｏｕｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の移行部の語句（請求の範囲に掲示された、通常は本発明に付随する不純物又は取るに足りない活動以外のエレメントのみを許容する）が「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語句に代わって使用される。請求の範囲に明示された関係がなければ、請求範囲の限定間には特定の関係はない（たとえば、物の請求項における成分の配置又は方法の請求項における工程の順序は、そうであることが例外として述べられていなければ、請求項の限定とならない）。すなわち、本明細書に開示された個々のエレメントの可能なすべての組み合わせ及び順序が、本発明の部分を意図すると考えられる。
【０２１５】
上記記載から、本技術分野における熟練者には、本発明はその精神又は本質的な特性から逸脱することのない他の特異的な形態を包含することができることは明らかである。記載された実施態様は、本発明に与えられる法的な保護範囲は本明細書の記載ではなく、付随する特許請求の範囲によって指示されることから、単に例示的なものであり、限定的なものではないと考えるべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との引照）
本出願は、２００１年２月１３日出願の米国特許仮出願６０／２６８，０１６；２００１年７月１１日出願の米国特許出願６０／３０４，１１０；２００１年８月８日出願の米国特許出願６０／３１０，４４７及び２００１年８月８日出願の米国特許出願６０／３１０，４８３の利益を請求する。
【０００２】
（合衆国政府の助成に関する陳述）
合衆国政府は、本発明に、ＭＲＭＣ／ＤＡＭＤ１７−０１−００８５及びＮＩＨ／ＡＩ ４５２２７−０１の契約に基づくある種の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）による感染及び／又はそれによって生じる下痢性疾患の他の症状を治療するための、ワクチン及び経皮免疫感作に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトの最大の臓器である皮膚は、感染原による侵入に対する生体の防御に重要な役割を果たし、有害な物質と接触する。しかしながら、この皮膚の障壁機能のため、経皮免疫感作がワクチンの腸内、粘膜及び非経口投与の有効な代替を提供したことの評価は、技術分野において妨げられてきたように思われる。
【０００５】
解剖学的に、皮膚は３つの層から構成される。すなわち、表皮、真皮、及び皮下脂肪である。表皮は基底層、有棘皮層、顆粒層及び角化層から構成される。表皮角質層は角化層及び脂質からなる。皮膚の主要抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞はヒトでは表皮の中間部ないし上部有棘皮層にあると報告されている。真皮は主として結合組織を含有する。血管及びリンパ管は真皮及び皮下脂肪に閉じ込められている。
【０００６】
表皮角質層は、死滅した皮膚細胞と脂質の層であリ、旧来より敵対世界に対する障壁と考えられ、角質層の下の生存細胞から生物及び有害な物質を排除すると考えられてきた。表皮角質層はまた皮膚からの水分の喪失に対する障壁としても働く。比較的乾燥した角質層の水分含量は５〜１５％、一方さらに深い表皮及び真皮の層は比較的良好に水和されていて、水分含量は８５〜９０％と報告されている。ごく最近、抗原提示細胞（たとえば、ランゲルハンス細胞）によって提供される二次防御を有することが認められた。しかも、透過促進の存在又は不存在下に皮膚活性アジュバントを用いる、皮膚を通しての免疫感作能力（すなわち経皮免疫感作）は、ごく最近報告されたのみである。望ましくない皮膚反応たとえばアトピー及び皮膚炎は本技術分野においてよく知られているが、経皮免疫感作（ＴＣＩ）の治療的利点の認識は、皮膚が約５００ダルトンよりも大きい分子の通過に障壁を提供すると信じられていたことから、過去には評価されていなかったものと思われる。
【０００７】
本発明者らは様々なアジュバントがＴＣＩにより有効に投与され、別個の、共投与された抗原に対する全身性及び局所性抗原特異的免疫応答を誘発することを示した。たとえばＷＯ９８／２０７３４，ＷＯ９９／４３３５０，及びＷＯ００／６１１８４；米国特許第５，９１０，３０６号及び第５，９８０，８９８号；及び米国特許出願０９／２５７，１８８；０９／３０９，８８１；０９／３１１，７２０；０９／３１６，０６９；０９／３３７，７４６及び０９／５４５，４１７参照。たとえば、ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンのようなアジュバントは、経皮的に適用した場合に安全かつ有効であり、これに反し腸内、粘膜又は非経口経路で投与された場合には、それらの使用は欠点を伴う。
【０００８】
米国特許４，２２０，５８４号及び４，２８５，９３１号では大腸菌誘発性下痢に対する免疫感作のために、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンを使用している。ウサギに免疫原及びフロインドのアジュバントを筋肉内注射した。トキシンによるチャレンジに対する保護及び回腸ループ活性に対する毒性作用の中和が示された。米国特許５，１８２，１０９号にはワクチンとトキシン（たとえば、大腸菌熱不安定性トキシン）の合剤、及び注射、スプレー又は経口投与用形態での投与が記載されている。中和は免疫感作されたウシの初乳において証明された。エンテロトキシンの突然変異バージョンも免疫原性を保持し、毒性は消失していることが記載されている（たとえば米国特許４，７６１，３７２及び５，３０８，８３５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９８／２０７３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／４３３５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第００／６１１８４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５，９１０，３０６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９８０，８９８号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００９／２５７，１８８号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９／３０９，８８１号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００９／３１１，７２０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００９／３１６，０６９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９／３３７，７４６号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００９／５４５，４１７号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，２２０，５８４号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，２８５，９３１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，１８２，１０９号明細書
【発明の概要】
【００１０】
新規な本発明のワクチン処方、ならびにその製造方法及び使用方法が本明細書に開示されている。とくにＴＣＩ、及び下痢性疾患を治療するためのヒトワクチン接種におけるそれに由来する利点が証明されている。重要な開示は、多価ワクチンにおける様々な抗原間の競合が、経皮免疫感作によって投与された場合には、障害にならなかったことである。本発明の他の利点は以下に論じられるか、本明細書の開示から明らかである。
【００１１】
免疫原は、少なくとも１種のアジュバント及び／又は、病原体、たとえば腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対して免疫応答を誘発できる、１又は２種以上の抗原から構成される。アジュバントは、ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（たとえば大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、コレラトキシン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン）又はアジュバント活性を有するそれらの誘導体であり、抗原は細菌トキシン（たとえば熱不安定性又は熱安定性エンテロトキシン）又はコロニゼーションもしくはビルレンス因子（たとえば、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ３，ＣＳ４，ＣＳ５，ＣＳ６，ＣＳ１７，ＰＣＦ ０１６６）又は免疫原活性を有するペプチドフラグメントもしくはその抱合体から誘導することができる。免疫原及びパッチからなるサブユニット又は全細胞ワクチンも前述の製品の製造方法及び免疫感作のためのそれらの使用に従って提供される。病原体に関連する分子（たとえば、トキシン、膜タンパク質）に特異的な免疫応答は、様々な経路（たとえば腸内、粘膜、経皮）によって誘導される。治療できる他の興味ある旅行者疾患には、キャンピロバクテリア症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、肝炎（Ａ及びＢ型肝炎ウイルス）、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ｖｉｖａｘ，Ｐ．ｏｖａｌｅ及びＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）、細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ，Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｉ）、ウイルス性胃腸炎（ロタウイルス）、及びそれらの合併症が包含される。有効性は臨床的又は実験室的基準により評価することができる。防御は代替マーカーを用いて、又は直接、コントロール試験により評価される。本技術分野の熟練者には、本発明の更なる態様が以下の詳細な説明及び請求の範囲ならびにその普遍化から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アジュバントと混合した抗原（ＬＴ＋ＣＳ６）又は抗原単独（ＣＳ６）で免疫感作したヒトボランティア中、ＬＴ（Ａ及びＢ）及びＣＳ６（Ｃ及びＤ）に対する抗体力価における個々のＩｇＧ及びＩｇＡピークの上昇倍率。横のバーは抗体力価における平均上昇倍率を表す。
【図２】経皮経路を用いて免疫感作及びブースター（矢印）されたボランティア中での抗−ＬＴ（Ａ及びＢ）及び抗−ＣＳ６（Ｃ及びＤ）ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体応答のキネティクス。円は最初の免疫感作後その日までの幾何平均力価を、バーは相当する９５％信頼区間を表示する。ブースター免疫感作間の抗体力価応答を比較する。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，ＮＳ有意差なし、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定。
【図３】アジュバントと混合した抗原を用いた免疫感作に対するレスポンダー間で、ピーク値に達する前の免疫感作による１０６ＰＢＭＣあたり抗−ＬＴ（Ａ及びＢ）及び抗−ＣＳ６（Ｃ及びＤ）ＡＳＣの個々のピーク数。
【図４】ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを使用し又は使用しないで、ＣＳ３及びＣＳ６でのＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。マウスは、尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置し、テープを１０回剥離して角質層を破壊した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の２５μｇ ＣＳ６又は２５μｇ ＣＳ６とＬＴＲ１９２Ｇ１０μｇを負荷した。準備した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。１群のマウスに２５μＬのＣＳ６（２５μｇ）を尾の基部に皮内注射した。すべてのマウスは、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三のワクチン投与後１４日目（日４２）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する力価（Ｃ）を示す。
【図５】２価及び３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンによるＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。尾の基部のワクチン接種部位は図４に記載の操作を用い準備した。接着性バッキングに固着したガーゼパッチに、以下の混合物からなる２５μＬ容量を負荷した：２５μｇ ＣＳ３と１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ；２５μｇ ＣＳ３、２５μｇ ＣＳ６と１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ。準備した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。すべてのマウスは、日０及び１４に経皮的にワクチン接種を受けた。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図６】ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ多価ワクチンを用いたＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。尾の基部のワクチン接種部位は、図４に記載の操作によって準備した。接着性バッキングに固着したガーゼパッチに以下の混合物からなる２５μＬ容量を負荷した：２５μｇ ＣＳ３；２５μｇ ＣＳ６；各２５μｇのＣＳ３とＣＳ６；各２５μｇのＣＳ３とＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ。前処置した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。すべてのマウスは日０及び１４の２回経皮ワクチン接種を受けた。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図７】ＣＳ３とＣＳ６の間における交叉反応性の欠如。尾の基部の部位は図４に記載の操作によって準備した。接着性バッキングに固着したガーゼパッチに以下の混合物からなる２５μＬ容量を負荷した：２５μｇ ＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＡ及びＢ）及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＤ）。パッチは一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０及び１４の２回の経皮ワクチン接種を受けた。第二の免疫後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（パネルＡ及びＣ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ及びＤ）を測定した。
【図８】ＬＴＲ１９２Ｇを使用し又は使用しないで、ＣＳ３での経皮的ワクチン接種によって誘発した血清ＩｇＧサブクラス。マウスは、尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和した皮膚をついで、紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：２５μｇ ＣＳ３又は２５μｇ ＣＳ６をＬＴＲ１９２Ｇ１０μｇと、又はＬＴＲ１９２Ｇを使用しないで負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的ワクチン接種を３回受けた。第三のワクチン投与後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ３に対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＣＳ３に対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図９】ＬＴＲ１９２Ｇを使用し又は使用しないで、ＣＳ６でのＴＣＩによって誘発した血清ＩｇＧサブクラス。マウスは、尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和した皮膚をついで、紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：２５μｇ ＣＳ６又は２５μｇ ＣＳ３をＬＴＲ１９２Ｇ１０μｇと、又はＬＴＲ１９２Ｇを使用しないで負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的ワクチン接種を３回受けた。第三のワクチン投与後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＣＳ６に対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＣＳ６に対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図１０】ＬＴＲ１９２ＧのＴＣＩで誘発された血清ＩｇＧサブクラス。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和した皮膚をついで、紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬのＬＴＲ１９２Ｇ １０μｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的にワクチン接種を３回受けた。第三のワクチン投与後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルは、ＬＴＲ１９２Ｇに対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図１１】Ｃ３又はＣＳ６と共投与されたＬＴＲ１９２Ｇにより誘発される血清ＩｇＧサブクラス。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。水和された皮膚をついで紙やすりで穏やかに１０回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に経皮的ワクチンを３回受けた。第三のワクチン接種後３０日目（日５８）に血清サンプルを収集した。パネルはＬＴＲ１９２Ｇに対する総血清ＩｇＧ力価（Ａ）、ＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ１サブクラス（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｃ）を示す。
【図１２】ＴＣＩ後のＣＳ３特異的糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；２５μｇのＣＳ３（パネルＢ及びＦ）及び２５μｇの ＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。１群のマウスを、２５μｇの ＣＳ３の皮内注射（ＩＤ）によりワクチン接種した（パネルＤ及びＨ）。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に、糞サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＳ３に対する糞便ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（パネルＥ〜Ｈ）を評価した。
【図１３】ＴＣＩ後のＣＳ６特異的糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；２５μｇのＣＳ６（パネルＢ及びＦ）及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。１群のマウスを、２５μｇのＣＳ６の皮内注射（ＩＤ）によりワクチン接種した（パネルＤ及びＨ）。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に、糞便サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＳ６に対する糞中ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（パネルＥ〜Ｈ）を評価した。
【図１４】ＴＣＩ後のＬＴＲ１９２Ｇ特異的糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚で、テープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＢ及びＦ）；２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＤ及びＨ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に糞便サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞便ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（パネルＥ〜Ｈ）を評価した。
【図１５】１価及び２価ＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの脾臓における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（ビヒクル）；２５μｇのＣＳ３；２５μｇのＣＳ６；２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。さらにマウスの群を２５μｇのＣＳ３又はＣＳ６を尾の基部に皮内注射（ＩＤ）してワクチン接種した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に脾臓を収穫した。パネルはＣＳ３−特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ａ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ）；ＣＳ６−特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ｃ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｄ）；ならびにＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ａ及びＣ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ及びＤ）を示す。
【図１６】３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの脾臓における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の処方物：２５μｇＣＳ３／２５μｇＣＳ６／１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。マウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に脾臓を収穫した。パネルはＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＡ−ＡＳＣ（Ａ）、ならびにＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ）を示す。
【図１７】１価及び２価のＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの鼠径リンパ節における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬの以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（ビヒクル）；２５μｇのＣＳ３；２５μｇのＣＳ６；２５μｇのＣＳ３と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇのＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。さらに別個のマウス群には、尾の基部に２５μｇのＣＳ３又はＣＳ６を皮内注射（ＩＤ）してワクチン接種した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に鼠径リンパ節を収集した。パネルはＣＳ３−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ａ），ＣＳ６−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ｂ）及びＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣ（Ａ及びＢ）を示す。
【図１８】３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンで経皮的にワクチン接種したマウスの鼠径リンパ節における、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的抗体分泌細胞（ＩｇＧ−ＡＳＣ）の検出。マウスは尾、の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６，及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇからなる混合物２５μＬを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に鼠径リンパ節を収集した。
【図１９】ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを使用し又は使用しないでＣＦＡ／ＩでのＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置し、紙やすりで穏やかに５回研摩して角質層を破壊した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の２５μｇのＣＦＡ／Ｉ及び２５μｇのＣＦＡ／Ｉと１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを準備した皮膚に適用し、約１８時間置いた。別個のマウスの群に、２５μＬのＣＦＡ／Ｉ（２５μｇ）を尾の基部に皮内注射した。すべてのマウスは日０及び１４にワクチン接種を受けた。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清サンプルを収集した。パネルはＣＦＡ／Ｉに対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図２０】ＴＣＩ後、ＣＦＡ／Ｉ特異的な糞便ＩｇＡ（上方パネル）及びＩｇＧ（下方パネル）の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。ついで、水和した皮膚を紙やすりで穏やかに５回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の以下の混合物：リン酸緩衝食塩溶液（パネルＡ及びＥ）；２５μｇのＣＦＡ／Ｉ（パネルＢ及びＦ）；及び２５μｇのＣＦＡ／Ｉと１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（パネルＣ及びＧ）を負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。１群の別個のマウスには、２５μｇのＣＦＡ／Ｉ（パネルＤ及びＨ）を皮内注射（ＩＤ）によりワクチン接種した。すべてのマウスは、３回、日０，１４及び２８にワクチンを投与された。第三の免疫感作２週後（日４２）に糞便サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＦＡ／Ｉに対する糞便ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｄ）及びＩｇＧ（Ｅ〜Ｈ）を評価した。
【図２１】３価のＥＴＥＣサブユニットワクチンでのＴＣＩに対する血清ＩｇＧ応答。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種する４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚を紙やすりで穏やかに５回研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μｇのＣＦＡ／Ｉ，２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇからなる混合物を負荷した。準備した皮膚にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。すべてのマウスは日０及び１４にワクチンを経皮的に接種された。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清を収集した。
【図２２】４価のＥＴＥＣワクチンによるＴＣＩ後における、コロニゼーション因子抗原に対する糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）抗体の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置した。次に、水和した皮膚を紙やすりで穏やかに研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、４価のワクチン：２５μｇのＣＦＡ／Ｉ，２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは３回、日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から２週後（日４２）に糞サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＣＦＡ／Ｉ（Ａ），ＣＳ３（Ｂ）及びＣＳ６（Ｃ）に対する糞中ＩｇＡを評価した。処理したサンプルはＣＦＡ／Ｉ（Ｄ），ＣＳ３（Ｅ）及びＣＳ６（Ｆ）に対する糞中ＩｇＧも評価した。
【図２３】４価のＥＴＥＣワクチンによるＴＣＩ後における、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞便ＩｇＡ（上部パネル）及びＩｇＧ（下部パネル）抗体の検出。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８間前に剃毛した。剃毛した皮膚を水和により前処置し、図１８に記載のように研摩した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、ついで以下のもの：１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ（ｍＬＴ）；２５μｇのＣＦＡ／Ｉ及びＬＴＲ１９２Ｇ；又は２５μｇのＣＦＡ／Ｉ，２５μｇのＣＳ３，２５μｇのＣＳ６及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチを一夜（約１８時間）適用した。すべてのマウスは日０，１４及び２８に３回ワクチン接種を受けた。第三の免疫感作から１週後（日３５）に糞サンプルを収集した。サンプルを処理し、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＡ（パネルＡ〜Ｃ）及びＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＧ（Ｄ〜Ｆ）を評価した。
【図２４】ＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇサブユニットワクチンによる経皮的ワクチン接種はＣＳ３発現ＥＴＥＣ全細胞を認識する血清抗体を誘発する。マウスは尾の基部を標準操作によって剃毛した。パッチの適用直前に、剃毛した皮膚でテープを１０回剥離した。接着性バッキングに固着したガーゼのパッチに、適用直前に２５μｇのＣＳ３及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。パッチは約１８時間適用した。１群１０匹のマウスに２回、日０及び１４にパッチを適用した。第二の免疫感作から１０日後（日２４）に血清サンプルを収集した。血清について、ＣＳ３，ＬＴＲ１９２Ｇ及びＥＴＥＣ全細胞（Ｅ２４３７７８）に対する抗体を評価した。
【図２５】死滅腸毒素原性大腸菌全細胞（ＥＷＣ）による経皮的ワクチン接種。ＥＷＣは細菌培養液中でＥＴＥＣ（株Ｅ２４３７７８）を培養して調製した。細胞を遠心分離によって収穫し、一夜２．５％のホルマリンで固定して（室温）不活性化した。不活性化された、死滅全細胞をリン酸緩衝食塩溶液で洗浄してホルマリンを除去した。免疫感作の前にマウスは尾の基部を剃毛した。パッチの適用直前に剃毛した皮膚でテープを１０回剥離した。接着性バッキングに固着したガーゼのパッチに、１０９ＥＷＣ及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを負荷した。１群１０匹のマウスを日０及び１４に経皮的にワクチン接種した。第二の免疫感作から１０日後に血清を収集した。血清を、材料と方法の項に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、ＥＷＣ及びＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体について評価した。図２２における結果は、死滅した細菌全細胞による経皮的ワクチン接種が全細胞及びＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを認識する抗体を誘発したことを示している。これらの結果により、死滅ＥＴＥＣ細菌はアジュバントとともに皮膚に適用することが可能で、特異的な免疫を誘発できることが証明される。これは、ＴＣＩがサブユニットワクチンとして、また死滅全細胞ワクチンの送達に適用可能であることを初めて証明するものであり、これらの結果は、この点において有意義である。
【図２６】多重のコロニゼーション因子及び２つのエンテロトキシン、ＬＴ及びＳＴから構成される多価ＥＴＥＣワクチンによる経皮的ワクチン接種。マウスは尾の基部の背側表面をワクチン接種の４８時間前に剃毛した。剃毛した皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールでの水和により前処置し、テープを１０回剥離して角質層を破壊した。ガーゼのパッチを接着性バッキングに固着し、２５μＬ容量の２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６；２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ及び２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ／８μｇ ＳＴａを負荷した。準備した皮膚にパッチを適用し、そこに約１８時間置いた。すべてのマウスは日０，１４及び２８にワクチン接種を受けた。第二ワクチンの投与から１４日後（日４２）に血清サンプルを収集した。パネルはＣＳ３に対する血清ＩｇＧ力価（Ａ）及びＣＳ６に対する血清ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。
【図２７】湿潤及び乾燥パッチ処方はＴＣＩ用製品の製造に適している。これらの研究においては、様々な液体及びパッチ処方物の調製例としてＬＴを用いた。略述すれば、ＬＴをリン酸緩衝食塩溶液及び５％ラクトース中に製剤化し、ＬＴを接着剤（Ｋｌｕｃｅｌ）とブレンドし、閉塞性のバッキング上に薄いフィルムとして広げ、室温で風乾した。ＬＴ溶液はガーゼパッチに直接適用し、使用前に風乾し、ＬＴ溶液をガーゼパッチに適用して、完全に水和されたパッチとして投与した。液体ＬＴ製剤を受けるマウスの場合は、１０μｇのＬＴを皮膚に直接適用し（被覆するガーゼを使用し、又は使用しないで）、ついで濯いだ。パッチを投与されるマウスについては様々なパッチ処方を約２４時間適用したのち除去した。皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和し、ついで軽石を含む綿棒（ＰＤＩ／ＮｉｃｅＰａｋ）で穏やかに角質層を破壊研摩した。すべてのマウスは日０及び１４に２回１０μｇに相当するワクチン接種を受けた（面積〜１ｃｍ２）。２週後（日２８）に血清サンプルを収集し、血清のＬＴに対する血清抗体を評価した。水性溶液、接着剤中タンパク質を含み、風乾し、完全に水和したパッチ処方がＥＴＥＣ抗原の経皮的送達に適当である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の特異的実施態様の説明
動物及びヒトに免疫応答（たとえば、抗原に特異的な体液性及び／又は細胞性エフェクター）を誘導する、経皮免疫感作（ＴＣＩ）のためのシステムが提供される。この送達システムは、１又は２種以上のアジュバント、抗原、及び／又はポリヌクレオチド（アジュバント及び／又は抗原をコードする）からなる処方の、動物又はヒト対象への簡単な上皮適用を提供する。これにより、化学的及び／又は物理的な浸透増強の補助を使用し、又は使用しないで１又は２種以上の病原体たとえば毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対して抗原特異的な免疫応答が誘発される。処方の少なくとも１種の成分（すなわち、抗原又はアジュバント）は、処方の投与に先立ち乾燥形態で及び／又はパッチの部分として提供され得る。このシステムは慣用の腸内、粘膜、又は非経口的免疫技術と組み合わせて使用することもできる。
【００１４】
アジュバント、抗原、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の１又は２以上の活性化が免疫応答の促進を補助し得る。ＡＰＣは抗原を処理して、１又は２種以上のエピトープをリンパ球に提示する。活性化は処方物とＡＰＣ（たとえばランゲルハンス細胞、他の樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球）の間の接触、処方物のＡＰＣによる取り込み、ＡＰＣによる抗原のプロセッシング及び／又はエピトープの提示、ＡＰＣの移動及び／又は分化、ＡＰＣとリンパ球の間の相互作用又はそれらの組み合わせを促進する。アジュバントはそれ自体、ＡＰＣを活性化する。たとえば、ケモカインは抗原提示細胞を所定の部位に補給し、活性化する。とくに抗原提示細胞は皮膚からリンパ節に移動してリンパ球に抗原を提示し、それにより抗原特異的免疫応答を誘発する。さらに処方物は、抗原を認識するリンパ球と直接接触し、抗原特異的免疫応答を誘発する。
【００１５】
抗体及び細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を包含する抗原特異的Ｂ−細胞及び／又はＴ−細胞集団の活性化及び／又は増殖につながる免疫応答の誘発に加えて、本発明は、免疫システムの１又は２以上の成分を、抗原特異的ヘルパー（Ｔｈ１及び／又はＴｈ２）又は遅延型過敏性Ｔ−細胞サブセット（ＴＤＴＨ）に影響する経皮免疫を使用して、陽性に及び／又は陰性に調整することができる。これは、異なるＴ−ヘルパー応答を生じることができるコレラトキシン及び大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの異なる挙動によって例示することができる。本発明によって誘導される望ましい免疫応答は、好ましくは全身性又は局部的（例えば、粘膜の）であるが、通常、望ましくない免疫応答である（たとえば、アトピー、皮膚炎、湿疹、乾癬、又は他のアレルギー性もしくは過敏性反応）。本明細書に記載のように誘発された免疫応答は感染疾患の処置に有用な治療的又は予防的免疫応答を提供する量的及び質的応答である。
【００１６】
ＴＣＩは皮膚透過を用い又は用いないで実施される。たとえば、化学的又は物理的透過増強技術は皮膚層を通して穿孔しない限り使用される。処方の適用前、適用の間、又は適用直後における無傷の皮膚の水和が好ましく、一部又は多くの例でこれが要求される。たとえば、水和は皮膚の最上層（たとえば、透過増強技術により露出された角質層又は表面表皮層）における水分含量を２５％，５０％又は７５％以上に増加させる。
【００１７】
皮膚は、水和物又は化学的透過物質を含有するアプリケーター（たとえば、パッド又はスティック上の吸収物質）で拭うか、あるいはそれらを皮膚に直接適用する。たとえば、水性溶液（たとえば水、食塩水、他の緩衝液）、アセトン、アルコール（たとえば、イソプロピルアルコール）、洗剤（たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム）、脱毛剤又は角質溶解剤（たとえば、水酸化カルシウム、サリチル酸、尿素）、保湿剤（たとえば、グリセロール、他のグルコール）、ポリマー（たとえば、ポリエチレン又はプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン）、又はそれらの組み合わせを使用するか、又は処方中に導入する。同様に、皮膚の研摩（たとえば、やすり板もしくは紙、サンドペーパー、繊維パッド、軽石）、皮膚の表面層の除去（たとえば、接着テープを貼って、剥がす）、エネルギー源（たとえば、熱、光、音、電気、磁気）を用いる皮膚のマイクロポレーション又は障壁破壊デバイス（ガン、微小針）、又はそれらの組み合わせは、物理学的透過エンハンサーとして作用する。皮膚のマイクロポレーションについてはＷＯ９８／２９１３４を、微小針については米国特許６，０９０，７９０、及び経皮ワクチン接種に適用できる経皮ガンについては米国特許ＷＯ６，１６８，５８７を参照されたい。ＴＣＩに化学的又は物理学的透過増強を組み合わせる目的は、真皮の層まで皮膚を穿孔することなく、少なくとも角質層又はさらに深い表皮層を除去することである。これは好ましくは、ヒト又は動物対象に与える不快感はきわめて僅かで、その部位に出血を生じることもなく達成される。たとえば、無傷の皮膚への処方の適用は、角質層又は表皮下の皮膚の層を穿孔する熱、光、音波又は電磁エネルギーを含まない。
【００１８】
ワクチン接種に有用な処方はまた、それらの製造方法とともに提供される。処方は乾燥又は液体型である。乾燥処方の方が慣用のワクチンより保存及び輸送が容易であり、ワクチンの製造場所からワクチン接種が行われる場所まで要求されるコールドチェーンを止めさせることができる。特定の作用機構に限定されることなく、乾燥処方が液体処方に勝る改良となる他の方法は、処方の高濃度の乾燥活性成分（たとえば１又は２種以上のアジュバント及び／又は抗原）の免疫感作部位における直接可溶化によって短いタイムスパンで達成される。皮膚からの湿気（たとえば発汗）及び閉塞性の包帯はこの過程を促進する。この方法で、活性成分の溶解限界に近い濃度がインシチュで達成される。別法として、処方自体の乾燥した活性成分が、抗原提示細胞によって取り込ませ、処理させる固体粒子型を提供することによる改良であってもよい。これらの可能な機構は本発明の範囲又は均等物を制限せずに論じられ、本発明の操作への洞察を提供し、ならびに免疫感作及びワクチン接種におけるこの処方の使用を導く。
【００１９】
処方は液体、クリーム、エマルジョン、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、懸濁液又は他の液体の形態として提供される。乾燥処方は様々な形態で、たとえば微粉末又は顆粒末、均一なフィルム、ペレット及び錠剤として提供される。処方は溶解させ、ついで容器中又は平坦な表面（たとえば皮膚）上で乾燥させるか、又は単純に平坦な表面上に散布する。乾燥は風乾、高温での乾燥、凍結又はスプレー乾燥、固体基板上へのコーティング又はスプレー及びそれにつぐ乾燥、固体基板上への散布、迅速な凍結、ついで真空下における緩徐な乾燥又はそれらの組み合わせで行うことができる。様々な分子が処方の活性成分である場合には、それらを溶液中で混合しついで乾燥してもまた乾燥型のみで混合してもよい。パッチのコンパートメント又はチャンバーは、ただ１種の抗原又はアジュバントが投与前には乾燥状態に保持されるように、活性成分を分離するために使用される。この方法での液体及び固体の分離は、長時間にわたり少なくとも１種の乾燥活性成分の溶解速度をコントロールすることを可能にする。
【００２０】
「パッチ」の語は固体サブストレート（たとえば、閉塞性又は非閉塞性外科用包帯）ならびに少なくとも１種の活性成分を包含する製品を意味する。液体をパッチ中に導入することもできる（すなわち、湿潤パッチ）。処方の１又は２種以上の活性成分は基体上に適用され、パッチの基体又は接着剤に導入されるか、又はそれらの組み合わせである。乾燥パッチには、処方を可溶化するための液体貯蔵部を使用しても、又は使用しなくてもよい。
【００２１】
液体又は固体型の処方は、同一又は分離された場所に１又は２種以上のアジュバント及び／又は抗原の両者が、同時にもしくは多くの場合、反復して適用される。パッチには、コントロールされた放出貯蔵部又は速度調節マトリックスを包含することが可能で、アジュバント及び／又は抗原を段階的に放出することができる。それは、アジュバント及び／又は抗原を単一の貯蔵部に、又は個々の抗原及びアジュバントを別個に多重貯蔵部に含有させる。パッチには、パッチの適用が多重抗原に対する免疫応答を誘発するように、付加的な抗原を含有させてもよい。このような場合、抗原は同じ源から誘導しても異なる源から誘導してもよいが、異なる抗原に特異的な免疫応答を誘発するように異なる化学構造をもたせることになる。多重パッチは同時に適用することができ、単一のパッチが多重の貯蔵部を含有することもできる。効果的な処置のためには多重パッチがある間隔で、又はある期間にわたり一定に適用される。それらは異なる時間に、重複する期間に、又は同時に適用される。少なくとも１種のアジュバント及び／又はアジュバントは投与前には乾燥型に維持される。ついで貯蔵部からの液体の放出又は処方の乾燥成分を含有する貯蔵部への液体の侵入により、少なくとも部分的にその成分が溶解する。
【００２２】
固体（たとえばナノメーター又はマイクロメーターの大きさの粒子）も処方中に導入し得る。固体剤形（ナノ粒子又はマイクロ粒子）は、活性成分の分散又は可溶化を補助し、処方の皮膚表層を通る運搬を助け、アジュバント、抗原又は両者に抗原提示細胞によってオプソニン化され得る基体への付着点を提供する。又はこれらの組み合わせが実行される。シート、ロッド又はビーズとして形成された多孔性固体からの処方の長期放出により、貯蔵としての役割が果たされる。
【００２３】
処方は、生化学的薬剤又はワクチンのための適当な規制機関（たとえば、食品医薬局）に承認された無菌条件下に製造される。所望により、免疫学的には不活性ではあっても、乾燥剤、賦形剤、安定剤、湿潤剤、保存剤、接着剤、パッチ材料、又はそれらの組み合わせが処方中に包含される。しかしながら、それらは他の望ましい性質又は特性を示してもよい。
【００２４】
投与に適当な単一又は単位用量の処方が提供される。単位用量中のアジュバント又は抗原の量は約０．００１〜約１０ｍｇの広い範囲のいずれでもよい。この範囲は約０．１μｇ〜約１ｍｇでもよい。狭い範囲では、約５μｇ〜約５００μｇである。他の適当な範囲は約１μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約２００μｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇである。トキシンについての好ましい用量は約５０μｇ〜約１００μｇ又はそれ未満である（たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ又は１００μｇである）。抗原とアジュバントの比は約１：１（たとえば、抗原及びアジュバントの両者である大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの場合）であるが、さらに高い比も、貧弱な抗原の場合には適当である（たとえば約１：１０又はそれ未満）、又はアジュバントに対して低い抗原の比（たとえば１０：１又はそれ以上）も使用できる。ＬＴ及びＥＴＥＣ抗原の自然の比は全細胞又は溶解物の処方に使用される。
【００２５】
アジュバント及び抗原又はポリヌクレオチドを含む処方は、ヒト又は動物対象に適用され、抗原は免疫細胞に提示され、抗原特異的な免疫応答が誘発される。これは、病原体による感染の前、感染の間又は感染後に行われる。抗原又は抗原をコードするポリヌクレオチドのみが必要であり、処方の免疫原性がアジュバント活性を要求しない程に充分な場合は付加的なアジュバントは加えない。処方の適用が多重抗原に対する免疫応答を誘発するような付加的な抗原を処方に包含させてもよい（即ち、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ））。このような場合、抗原は同じ源から誘導しても、異なる源から誘導してもよいが、異なる抗原に対して特異的な免疫応答を誘発するように、抗原は化学的に異なる構造を有することになる。抗原特異的リンパ球が免疫応答に参加し、Ｂリンパ球による参加の場合、抗原特異的抗体は免疫応答の一部分である。上述の処方は、乾燥剤、賦形剤、保湿剤、安定化剤、保存剤、接着剤、及び本技術分野で周知のパッチ材料を包含する。
【００２６】
本発明は、対象（たとえば、疾患の防止、感染の影響からの保護、現存の疾患又は症候群の治療、又はそれらの組み合わせの処置が必要なヒト又は動物）の処置に使用される。抗原が病原体から誘導される場合、処置により、対象は病原体による感染、又はたとえばトキシン分泌によって惹き起こされる病原性作用に対してワクチン接種される。本発明は、現存の疾患の治療的処置、疾患の保護的予防、疾患の重症度の低減及び／又は持続期間の短縮、疾患の症状の緩和、及びそれらの組み合わせに使用される。
【００２７】
適用部位は抗炎症性コルチコステロイドたとえばヒドロコルチゾン、トリアムシノロン及びモメタゾン又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の保護により、可能性のある局所的皮膚反応を低下又は免疫応答の型を調節する。同様に、抗炎症性ステロイド又はＮＳＡＩＤをパッチ材料、又は液体もしくは固体処方に包含させ、コルチコステロイド又はＮＳＡＩＤを免疫感作後に適用する。ＩＬ−１０，ＴＮＦ−α又は他の免疫モデュレーターを抗炎症剤に代えて使用し得る。さらに、処方の単一又は多重の適用を使用し、２以上の排出リンパ節野上の皮膚に適用される。処方にはその適用が多重抗原に対する免疫応答を誘発するように付加的な抗原を包含させてもよい。このような場合、抗原は同じ源から誘導されても、異なる源から誘導されてもよいが、異なる抗原に特異的な免疫応答を誘発するように、異なる化学構造を有する。多重チャンバーを有するパッチは、各チャンバーが異なる抗原提示細胞をカバーするので、多価ワクチンのより効果的な送達を可能にした。すなわち、抗原提示細胞はただ１個の抗原に遭遇し（アジュバントは使用又は使用しない）、従って抗原の競合はなく、そのため多価ワクチン内のそれぞれの抗原に対する応答は増強される。
【００２８】
処方は、皮膚に免疫応答を始動させ、ブースターするため表皮に、透過技術又は他の免疫感作経路と接合して適用される。単一又は多重適用の経皮的免疫感作（ＴＣＩ）の始動に続いては、同じ又は別の抗原によるブースター免疫感作のため、腸、粘膜、非経口、及び／又は皮内投与技術が行われ得る。単一又は多重適用による腸、粘膜、非経口、及び／又は皮内免疫感作による始動に続いては、同じ又は別の抗原によるブースター免疫感作のための経皮的技術が行われ得る。ＴＣＩは慣用の局所的技術、たとえば粘膜又は皮内免疫感作とは、前者が皮膚には存在しない粘膜（即ち、肺、口腔、鼻、直腸）を必要とし、後者は真皮を通した皮膚の穿孔を必要とする点で著しく異なることを銘記すべきである。処方には、多重抗原に対する免疫応答を誘発するように皮膚に適用される付加的な抗原が包含され得る。
【００２９】
抗原及びアジュバントに加えて、処方はビヒクルを含む。たとえば処方はＡＱＵＡＰＨＯＲ，Ｆｒｅｎｄ，Ｒｉｂｉ又はＳｙｎｔｅｘ乳化液、油中水乳化液（たとえば、水性クリーム，ＩＳＡ−７２０）、水中油乳化液（たとえば、オイルクリーム、ＩＳＡ−５１，ＭＦ５９）、マイクロ乳化液、無水リピド及び水中油型乳化液、他のタイプの乳化液、ゲル、脂肪、ワックス、油脂、シリコン及び保湿剤（たとえばグリセロール）を含み得る。
【００３０】
抗原は、ヒト又は動物対象に感染するいかなる病原体（たとえば、細菌、ウイルス、カビ又は原生動物）から誘導され得る。抗原の化学構造は１又は２以上の炭水化物、脂肪酸及びタンパク質（たとえば、グリコリピド、糖タンパク質、リポタンパク質）である。タンパク質性抗原が好ましい。抗原の分子量は５００ダルトン、８００ダルトン、１０００ダルトン、１０キロダルトン、１００キロダルトン又は１０００キロダルトン以上であり得る。化学又は物理学的透過増強は、細胞、ウイルス粒子及び１メガダルトン以上の巨大分子構造（たとえば、ＣＳ６抗原）に関して好ましいが、水和及び溶媒を含む綿棒による拭き取りなどの技法が皮膚を横切って免疫感作を誘発するのに十分である。抗原は組換え技術、化学合成又は天然の源から少なくとも部分的に精製して得られる。それは化学的又は組換え抱合体たとえば化学的反応基の間の連結又はタンパク質融合体である。抗原は生存細胞又はウイルス、緩和生存細胞又はウイルス、死滅細胞、又は不活性化ウイルスとして提供される。別法として、抗原は少なくとも部分的に精製された細胞フリーの型（たとえば、細胞又はウイルスの溶解物、膜又は他の細胞下フラクション）である。大部分のアジュバントはまた、免疫原性活性を有し、抗原とも考えられるので、アジュバントには抗原の上述の性質及び特性が期待される。
【００３１】
アジュバントの選択は免疫応答の増強及び調節を可能にする。さらに、適当なアジュバントの選択は、体液性又は細胞性免疫応答、特異的抗体アイソタイプ（たとえば、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及び／又はＩｇＧ４）、及び／又は特異的Ｔ−細胞サブセット（たとえばＣＴＬ，Ｔｈ１，Ｔｈ２及び／又はＴＤＴＨ）を優失的に誘発する。アジュバントは好ましくは化学的に活性化（たとえば蛋白分解消化）又は遺伝子的に活性化（たとえば、融合、欠失又は点突然変異）されたＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン又はそのＢサブユニットである。アジュバント、抗原又は両者は、任意によりアジュバント又は抗原を適宜コードするポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ｃＲＮＡ）との処方として提供されてもよい。共有結合によって閉じられた環状ＤＮＡたとえばプラスミドは好ましいポリヌクレオチドの型であるが、線状の型も使用することができる。ポリヌクレオチドは、たとえば複製の起源、セントロメア、テロメア、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写開始又は終結シグナル、スプライスアクセプター又はドナー部位、リボソーム結合部位、翻訳開始又は終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、細胞局在シグナル、プロテアーゼ切断部位、ポリリンカー部位又はそれらの組み合わせが発現ベクター中に見出されている。
【００３２】
「抗原」は、免疫感作又はワクチン接種後に、ヒト又は動物対象の免疫系によって特異的に認識される処方の活性成分である。抗原は、Ｂ−細胞によって認識される単一又は多重の免疫原性エピトープ（すなわち、分泌又は膜結合抗体）又はＴ−細胞受容体を含み得る。Ｔ−細胞受容体によって認識されるタンパク質性エピトープは、それらが抗原提示細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ分子によって結合されているかどうかに依存して、典型的な長さ及び保存されたアミノ酸残基を有する。これに反して、抗体によって認識されるタンパク質性エピトープは、長さが変動する短い、延長されたオリゴペプチドと長いフォールディングされたポリペプチドを含む。エピトープ間の単一アミノ酸の差は区別し得る。抗原は病原体分子に対して免疫応答を誘発できる（たとえば、ＣＳ６抗原はＥＴＥＣのＣＳ６分子に対して特異的免疫応答を誘発することができる）。すなわち、抗原は通常、病原体の特定の分子の化学構造と同一であるか少なくともそれから誘導されるが、このような化学構造に遠縁にすぎない模倣体が、成功裡に使用される。
【００３３】
「アジュバント」は抗原に対する免疫応答の誘発を補助する、処方の活性成分である。アジュバント活性は、処方中にアジュバントそれ自体を包含させることにより、又は処方の他の成分と組み合わせることにより、あるいは特定の免疫感作技術によって、異種抗原（すなわちアジュバントとは別個の化学構造である抗原）に対する免疫応答を上昇させる能力である。上述のように、抗原とアジュバントの化学的抱合又は抗原とアジュバントコード領域の遺伝子的融合により抗原とアジュバントの両者を分子内に含有することができる。すなわち、処方はただ１種のみの活性成分又は成分を含有することもできる。
【００３４】
「有効量」の語は、抗原特異的免疫応答を誘発するアジュバント又は抗原の量を記載する。「サブユニット」免疫原又はワクチンは、病原体の他の細胞性又はウイルス成分から、組換え技術、化学的合成、又は天然の源から少なくとも部分精製により単離された活性成分（たとえばアジュバント、抗原）からなる。
【００３５】
免疫応答の誘発は、たとえば感染疾患の予防的又は治療的ワクチン接種のための処置を提供する。その存在下又は不存在下に免疫応答の大きさ及び／又はキネティクスにおける統計的に有意な変化；免疫系の誘発エレメント（たとえば、体液性対細胞性、Ｔｈ１対Ｔｈ２）における変化；対象の健康及び安寧に対する効果；又はそれらの組み合わせにを生じた場合、製品又は方法は「誘発する」。
【００３６】
本発明において使用される「排出リンパ節野」の語は、その上で収集されたリンパが所定のリンパ節のセット（たとえば、頸部、補助、鼠径部、上顎、腺窩、それらの腹部及び胸郭）を通してろ過される、解剖学的領域を意味する。すなわち、同じ排出リンパ節野が、免疫感作の部位及び時間が、処方の異なる成分を一緒にもたらすように間隔を有する場合（たとえば、単独では有効に使用されない場合でも、アジュバント又は抗原を含む二つの接近配置パッチは有効となり得る）抗原提示細胞がリンパ節に移動するために必要な数日以内の免疫感作（たとえば、腸、粘膜、非経口、経皮、皮内）によって標的化され得る。たとえば、経皮技術によるアジュバンド送達パッチを、従来のワクチンと共に注射するのと同様に、同一の腕上に付して、高齢者、小児又は他の免疫的に、損われた者におけるその有効性をブースターすることができる。それに対し、異なる腕にパッチを貼り付けることにより、アジュバント含有パッチが抗原のみを含むパッチの有効性をブースターすることを防ぐことができる。
【００３７】
本発明の操作においていかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明者らの観察の説明を提供すれば、この経皮的送達システムは、免疫応答が誘発される免疫系の細胞に抗原を運搬する。抗原は皮膚の正常に存在する保護外層（すなわち、角質層）を通過して直接、免疫応答を誘発するか、又は処理した抗原をリンパ球に提示する、上皮の抗原提示細胞集団（たとえば、マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、他の樹状細胞、Ｂリンパ球、又はクッパー細胞）を介して免疫応答が誘発される。すなわち、透過増強技術を用い又は用いないで、皮下注射又は経皮的な技術では真皮は透過されない。所望により、抗原は毛包又は皮膚オルガネラ（たとえば、汗腺、皮下腺）を介して角質層を通過する場合がある。
【００３８】
たとえば、細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（ｂＡＲＥ）による経皮的免疫感作は、とくに最も効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）として知られる上皮ランゲルハンス細胞を標的とする。ＡＰＣの成熟は形態学的に、又は表現型（たとえばＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８３又は共刺激分子の発現）によって評価される。本発明者らは無傷の皮膚の上皮に適用した場合、ｂＡＲＥがランゲルハンス細胞を活性化するように思われることを見出した。アジュバントたとえばトリプシン切断ｂＡＲＥはランゲルハンス細胞の活性化を増強し得る。ランゲルハンス細胞は抗原の貪食によって特異的免疫応答を指示し、ＡＰＣとして抗原をリンパ球に提示するように働くようになるリンパ節に移動し、そこで強力な免疫応答を誘発する。一般に、皮膚は病原体に対する障壁と考えられているが、この障壁の不完全さが、皮膚を通して侵入する生物体に対する免疫応答を編成するように設計された、上皮にわたって分布する多数のランゲルハンス細胞により立証される。
【００３９】
Ｕｄｅｙ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：ｓ６−ｓ８，１９９７によると：
「ランゲルハンス細胞は、哺乳動物の層をなす扁平上皮のすべてに存在する骨髄誘導細胞である。それらは、淡症を生じていない上皮に存する補助細胞の活性のすべてを有し、現時点における規範においては上皮に適用された抗原に向けられた免疫応答の開始及び増強に必須である。ランゲルハンス細胞は強力な補助細胞（樹状細胞）のファミリーであり広く分布するが、上皮及び固体臓器ならびにリンフォイド組織には滅多に現れない。
【００４０】
今回、ランゲルハンス細胞（及び多分、他の樹状細胞）は少なくとも２つの異なるステージを含むライフサイクルを有することが認められた。上皮に存在するランゲルハンス細胞は、抗原捕獲「センチネル（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）」細胞の規則的なネットワークを構築する。上皮のランゲルハンス細胞は微生物を包含する粒子を取り込み、効率的な複合抗原のプロセッサーである。しかしながら、それらは低レベルのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原及び共刺激分子（ＩＣＡＭ−１，Ｂ７−１及びＢ７−２）ならびにプライムされていない貧弱なＴ細胞のスティミュレーターしか発現しなかった。抗原との接触後、一部のランゲルハンス細胞が活性化され、上皮から離れ、局所性リンパ節のＴ−細胞依存性領域に移動し、そこでそれらは成熟樹状細胞として存在する。上皮を離れ、リンパ節に移動する過程で、抗原を有する上皮ランゲルハンス細胞（現時点では「メッセンジャー」）は形態、表面表現型及び機能に劇的な変化を生じる。上皮ランゲルハンス細胞とは対照的に、リンフォイド樹状細胞は本質的に非貪食細胞であり、タンパク質抗原を非効率的にプロセッシングするが、高レベルのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原ならびに様々の共刺激分子を発現し、同定された最も強力なナイーブＴ細胞のスティミュレーターである。」
【００４１】
ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力は経皮的に送達される免疫原及びワクチンの開発を可能にした。皮膚の免疫系を使用する免疫応答は処方を角質層（すなわち、角質化細胞及びリピドから構成される皮膚の最上層）内のランゲルハンス細胞にのみ送達させ、ついで、ランゲルハンス細胞を活性化して抗原を取り込ませ、Ｂ−細胞小胞及び／又はＴ−細胞依存性領域に移動させ、ついで抗原をＢ及び／又はＴリンパ球に提示させることによって達成された。他の抗原ｂＡＲＥ（たとえば、トキシン、コロニゼーション又はビルレンス因子）がランゲルハンス細胞に貪食されると、これらの抗原もリンパ節に輸送され、Ｔリンパ球に提示され、ついでその抗原に特異的な免疫応答が誘発される。すなわち、ＴＣＩの特徴は多分、ｂＡＲＥ又はその誘導体、ケモカイン、サイトカイン、ＰＡＭＰ、又は接触センシタイザー及びアジュバントを誘導する他のランゲルハンス細胞活性化物質によるランゲルハンス細胞の活性化である。ランゲルハンス細胞の皮膚集団のサイズ又はそれらの活性化状態の上昇もまた、免疫応答を増強することが期待される（たとえば、アセトン前処置）。高齢者又は皮膚のランゲルハンス細胞が枯渇した（すなわち、ＵＶ傷害）対象では、ランゲルハンス細胞集団の再補給（たとえば、トレチノイン前処置）が可能である。
【００４２】
アジュバントたとえばｂＡＲＥは、注射又は全身的に投与された場合、高度な毒性を示すことは周知である。しかし、無傷の皮膚の表面（すなわち、表皮上）に置いた場合、全身的な毒性を誘導するとは考えられない。すなわち、経皮的な経路では、全身性の毒性はなく、アジュバント作用の利点の達成が可能である。同様の毒性の不在は、皮膚が角質層のすぐ下で（たとえば、上皮付近又は上皮上で）透過され、真皮を通さない場合に期待される。すなわち、皮膚を通して免疫系の活性化誘発能は、全身性の毒性はなく、強力な免疫応答という予期されなかった利点を付与する。
【００４３】
親和性成熟及び優勢なＩｇＧ抗体へのアイソタイプスイッチングにより誘発される抗体応答の大きさは、一般にＴ−細胞の補助ならびにＴｈ１及びＴｈ２両者の経路の活性化によって達成され、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの産生によって示唆される。また、大きな抗体応答が胸腺独立性の抗原、１型（ＴＩ−１）によって誘発され、これは直接Ｂリンパ球を活性化し、又はＭＨＣクラスＩＩ，Ｂ７，ＣＤ４０，ＣＤ２５及びＩＣＡＭ−１分子の上方調節のようなＢリンパ球に対する類似の活性化作用を示す。
【００４４】
一般的に知られている皮膚免疫応答のスペクトルはアトピー及び接触性皮膚炎によって代表される。ランゲルハンス細胞の活性化の病原性表出である接触性皮膚炎は、抗原を貪食し、リンパ節に移動し、抗原を提示し、皮膚に移動して冒された皮膚部位に強力な破壊的細胞応答を生じるＴリンパ球を感作するランゲルハンス細胞によって指示される。このような応答が抗原特異的なＩｇＧ抗体を伴うことは一般には知られていない。アトピー性皮膚炎はランゲルハンス細胞を類似の方法で使用するが、Ｔｈ２細胞で同定され、一般に高いレベルのＩｇＥを伴う。
【００４５】
一方、ｂＡＲＥによる経皮的免疫感作は有用かつ所望の免疫応答を提供する。通常、誘発された高いＩｇＧレベルを与えるアトピー又は接触性皮膚炎の典型的な所見はない。皮膚の表皮に適用されたコレラトキシン又は大腸菌熱不安定性エンテロトキシンは、免疫感作後２４，４８及び１２０時間後リンパ球浸潤のない免疫感作を達成することができる。前臨床試験で認められたわずかな皮膚反応は容易に処置された。これは経皮免疫感作に従事するランゲルハンス細胞が、「炎症を生じていない上皮に存する補助細胞の活性のすべてを有し、現時点における規範においては上皮面に適用された抗原に向けられた免疫応答の開始及び増強に必須である」（Ｕｄｅｙ，１９９７）ことを示している。経皮的な免疫応答の独特さは、高レベルの抗原特異的ＩｇＧ抗体及び産生される抗体のタイプ（たとえば、ＩｇＭ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３及びＩｇＡ）及び一般に抗原特異的なＩｇＥ抗体の不存在の両者によって指示される。経皮的免疫感作は、もし、抗原提示細胞及びＴリンパ球の十分な活性化がアトピー又は接触性皮膚炎と同時に存する経皮反答において起これば、皮膚の炎症と並んで生ずると想像できる。
【００４６】
ランゲルハンス細胞の経皮的な標的化は、それらの抗原提示機能のすべて又は部分を脱活性化する物質を並んで用いて、免疫感作の修飾又は感作の防止が行われる。ランゲルハンスの活性化又は他の皮膚免疫細胞をモデュレートする技術には、たとえば抗炎症性ステロイド又は非ステロイド性薬剤（ＮＳＡＩＤ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、シクロホスファミド、グルココルチコイド、又は他の免疫抑制剤；インターロイキン−１０、インターロイキン−１モノクローナル抗体（ｍＡＢ）又は可溶性受容体アンタゴニスト（ＲＡ）；インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）インヒビター；又は超抗原を介する枯渇、たとえばＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）により誘発される表皮ランゲルハンス細胞の枯渇の使用が包含される。類似の化合物がランゲルハンス細胞の内部応答の修飾及び異なるＴ−ヘルパー応答（Ｔｈ１又はＴｈ２）の誘発のために使用され、また免疫感作の副作用の可能性を低下させるために皮膚の炎症反応応答をモデュレートさせる。同様に、免疫抑制剤を別個に又は処方を免疫抑制剤と共投与することによって、免疫感作の前、免疫感作の間又はその後に、リンパ球が免疫抑制される。たとえば、通常アレルギー又は刺激性の接触性過敏症を生じる物質を用いて、強力な全身性保護免疫応答を誘発することができが、ＩＣのインヒビターの添加により悪い皮膚反応を緩和し得る。
【００４７】
ＴＣＩは、ＣＴ，ＬＴ又はそれらのサブユニット（たとえば、ＣＴＢ又はＬＴＢ）のガングリオシドＧＭ１結合活性によって達成される。ガングリオシドＧＭ１は哺乳動物細胞に見出される普遍的な細胞膜グリコリピドである。５量体のＣＴＢサブユニットが細胞表面に結合した場合、親水性孔部が形成され、これがＡサブユニットのリピド二重層を横切る挿入を可能にする。ＡＰＣ上の他の結合標的も使用される。ＬＴＢサブユニットはガングリオシドＧＭ１、さらに他のガングリオシドに結合し、その結合活性はＬＴが皮膚上で高い免疫原性を示す事実を説明する。
【００４８】
ｂＡＲＥ又はＢサブユニットを含有するフラグメント又はその抱合体を用いるＴＣＩは、それらのＧＭ１ガングリオシド結合活性を必要とする。マウスをＣＴ，ＣＴＡ及びＣＴＢで経皮的に免疫感作した場合、免疫応答の誘発にはＣＴ及びＣＴＢが必要となった。ＣＴＡはＡＤＰリボシル化エキソトキシン活性を含有するが、結合活性を含有するＣＴ及びＣＴＢのみが免疫応答を誘発可能である。これは、Ｂサブユニットが皮膚を通じての免疫感作に必要かつ十分であることを指示している。本発明者らは、ランゲルハンス細胞又は他のＡＰＣがその細胞表面へのＣＴＢの結合によって活性化され、経皮的免疫応答を生じると結論した。
【００４９】
抗原
経皮免疫感作システムは、物質を免疫応答を生じる分化した細胞（たとえば、抗原提示細胞、リンパ球）に送達する。これらの物質は抗原と呼ばれる。抗原はたとえば、炭水化物、グリコリピド、糖タンパク質、リピド、リポタンパク質、ホスホリピド、ポリペプチド、それらの抱合体、又は免疫応答を誘発することが知られている他の物質等の化学構造から構成される。抗原は全生物体、たとえば細菌又はビリオンとして提供されるか；抗原は抽出物又は溶解物から、全細胞又は膜単独のいずれかから得られるか；あるいは抗原は化学的に合成され、又は組換え技術により製造される。
【００５０】
本発明の抗原は、組換え技術により、好ましくは、親和性又はエピトープタグを付した融合タンパク質として発現され得る；遊離又は担体タンパク質に抱合した化学合成オリゴペプチドが、本発明の抗原を得るために使用され得る。オリゴペプチドはポリペプチドの１タイプと考えられる。オリゴペプチドの長さは６残基〜２０残基であることが好ましい。ポリペプチドも分岐構造として合成されてもよい（たとえば、米国特許５，２２９，４９０及び５，３９０，１１１）。抗原性ポリペプチドにはたとえば、合成又は組換えＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープ、普遍的Ｔ−細胞エピトープ、及び１生物体又は疾患からの混合Ｔ−細胞エピトープ、及び他からのＢ−細胞エピトープが包含される。組換え技術又はペプチド合成によって得られた抗原ならびに天然の源又は抽出液から得られた抗原は、抗原の物理学的又は化学的特徴により、好ましくは分画化又はクロマトグラフィーによって精製することができる。組換え体はｂＡＲＥのＢサブユニット又はキメラと混合する。多重抗原処方は同時に２以上の抗原に対する免疫応答を誘発させるために用いられる。抱合体は多重抗原に対する免疫応答の誘発、免疫応答のブースター又は両者のために使用される。さらに、トキシンはトキソイドの使用によってブースターされ、又はトキソイドはトキシンの使用によりブースターされる。経皮的免疫感作は、初めに他の免疫感作経路、たとえば経口、経鼻、又は非経口経路によって誘発された応答をブースターするために使用される。抗原には、たとえば、トキシン、トキソイド、それらのサブユニット、又はそれらの組み合わせ（たとえば、コレラトキシン、破傷風トキソイド）が包含され、さらにトキシン、トキソイド、それらのサブユニット又はそれらの組み合わせが抗原及びアジュバントの両者として作用する。このような経口／経皮又は経皮／経口免疫感作は、とくに粘膜免疫が保護と相関している疾患における粘膜免疫の増強に重要である。
【００５１】
抗原は、緩衝液又は水もしくは有機溶媒たとえばアルコール又はＤＭＳＯに溶解するか、又はゲル、乳化液、マイクロ乳化液及びクリーム中に導入することができる。適当な緩衝液には、それらに限定されるものではないが、Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋フリーのリン酸緩衝食塩溶液、リン酸緩衝食塩溶液、正規（水中１５０ｍＭ ＮａＣｌ）食塩溶液、及びＨｅｐｅｓ又はＴｒｉｓ緩衝液が包含される。中性緩衝液に不溶の抗原は１０ｍＭの酢酸に溶解し、ついで中性の緩衝液たとえばＰＢＳで所望の容量に希釈する。酸性のｐＨでのみ可溶の抗原の場合には、希釈酢酸中に溶解したのち希釈液として酸性ｐＨにおける酢酸塩−ＰＢＳを使用する。グリセロールは本発明に用いられる非水性緩衝液として適当である。
【００５２】
疎水性抗原、たとえば膜をまたぐドメインを含有するポリペプチドは、界面活性剤又は表面活性剤仲に溶解することができる。さらに、リポソームを含有する処方については、界面活性剤の溶液中の抗原（たとえば、細胞膜抽出液）をリピドと混合し、ついで希釈、透析又はカラムクロマトグラフィーによって界面活性剤を除去してリポソームを形成させることができる。ある種の抗原（たとえば、膜タンパク質）はそれ自体可溶性である必要はないが、直接リピド膜（たとえば、ビロソーム）にビリオン単独の懸濁駅に、もしくはマイクロスフィア懸濁液に又は活性化抗原提示細胞により取り込まれる熱不活性化細菌に挿入することができる（オプソニン化）。抗原は、ＷＯ９９／４３３５０に記載されたように透過増強剤と混合することもできる。
【００５３】
ヒト又は動物対象のワクチン接種に使用可能で、特定の病原体に特異的な免疫応答を誘発する多くの抗原、ならびに抗原の製造方法、適当な抗原用量、免疫応答の誘導についてのアッセイ、病原体（たとえば、細菌、ウイルス、カビ、又は原生動物）による感染の処置については本技術分野において周知である。
【００５４】
哺乳動物の大腸菌による感染による効果は、生物体の特定の株に依存する。腸内には有益な大腸菌が多く存在する。下痢疾患との初期の関連以来、５種の下痢病原性大腸菌が同定されたことによる。すなわち、腸毒素原性（ＥＴＥＣ）、腸病原性（ＥＰＥＣ）、腸出血性（ＥＨＥＣ）、腸集合性（ＥＡｇｇＥＣ）及び腸侵襲性（ＥＩＥＣ）である。それらは特徴的なビルレンス性、たとえばトキシンの同化、及びコロニゼーション因子及び／又は腸内皮細胞との相互作用の特異的なタイプによってグループ分けされている。ＥＴＥＣが最も一般的な下痢原性大腸菌であり、旅行者に最大のリスクを提起する。ヒトから培養された株にはＢ７Ａ（ＣＳ６，ＬＴ，ＳＴａ）、Ｈ１０４０７（ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ，ＳＴａ）及びＥ２４３７７Ａ（ＣＳ３，ＣＳ１，ＬＴ，ＳＴａ）が包含される。それらは単一又は組み合わせで、抗原の全細胞源として使用され、様々な異なるトキシン及びコロニゼーション因子を提供する。
【００５５】
腸毒素原性大腸菌に対して特異的で、より一般的なコロニゼーション及びビルレンス因子に対して交叉反応し、交叉保護する抗体を励起するワクチンの必要性がある。フィンブリエタンパク質のＣＳ４−ＣＦＡ／Ｉファミリーは、ある種のより流行している腸毒素原性大腸菌株に見出され、このファミリーのＥＴＥＣ抗原のメンバーは６種、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ４，ＣＳ１７及びＰＣＦ０１６６である。
【００５６】
ＥＴＥＣのコロニゼーション因子抗原（ＣＦＡ）は、腸上皮に対する細菌のコロニゼーション及び付着の最初の工程において重要である。下痢を有する成人及び小児の疫学的研究では、ＥＴＥＣに帰せられる有病率の大きな百分率にＣＦＡ／Ｉが見出される。ＣＦＡ／Ｉは細菌の表面上にピリ（フィンブリエ）の形で存在する。これは、剛性で、反復するピリンサブユニットから構成される直径７ｎｍのタンパク質繊維である。ＣＦＡ／Ｉ抗原はヒト刷子縁へのマンノース抵抗性付着を明らかなシアル酸感受性によって促進する。したがって、これらのタンパク質に対する免疫を確立させるワクチンは宿主組織への付着、及びそれに次ぐ疾患を防止するものと推定されている。
【００５７】
ＣＳ３，ＣＳ５及びＣＳ６としては、他の抗原が包含される。ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ３及びＣＳ６は単独でも存在し得るが、稀な例外としてＣＳ１はＣＳ３と、ＣＳ２はＣＳ３と、ＣＳ４はＣＳ６と、ＣＳ５はＣＳ６とのみ見出される。血清学的研究では、これらの抗原は、研究部位に依存して、ＥＴＥＣの場合約７５％まで又は少なくとも約２５％に相当する緯度に存在する。
【００５８】
大腸菌ファミリーＣＳ４−ＣＦＡ／Ｉのすべてのメンバーの抗原に対して抗体を励起するコンセンサスペプチドが米国特許５，９１４，１１４に記載されている。このファミリーのメンバーのＮ−末端は高度な同一性を示すが、そのタンパク質配列の残部には、種をまたいだ関連性があまり認められない。コンセンサスペプチドは、既知の線状Ｂ及びＴ細胞エピトープを包含し、進化的に高度の関連性が６つの異なるコロニゼーション因子にみられる。たとえば、コンセンサスペプチドはそのアミノ酸配列（アミノ酸残基は末端又は修飾された内部に付加して反応性結合鎖を提供する）：ＶＥＫＮＩＴＶＴＡＳＶＤＰＴＩＤＬＬＱＡＤＧＳＡＬＰＳＡＶＡＬＴＹＳＰＡ（配列番号：１）及びＶＥＫＮＩＴＶＴＡＳＶＤＰＴＩＤＬＬＱＡＤＧＳＡＬＰＡＳＶＡＬＴＹＳＰＡ（配列番号：２）
を有する。
【００５９】
これらのコンセンサスペプチドは、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ４，ＣＳ１７及びＰＣＦ ０１６６抗原の相同な領域に基づいて構築された。
【表１】
【００６０】
ＣＳ６，コロニゼーション因子ＩＶ（ＣＦＡ／ＩＶ）の成分はまた血清学的検査（たとえば、中東の兵士）において、ＥＴＥＣ株の約２５％より多くに見出されている。ＣＳ３及びＣＳ６抗原のヌクレオチド配列は、それらの製造方法とともに米国特許５，６９８，４１６に記載されている。
【００６１】
使用できる他の抗原は腸疾患を起こすトキシン、たとえばシガトキシン及び大腸菌エンテロトキシンである。熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）については以下に説明する。しかし、疾患症状群を生じる熱安定性エンテロトキシン（たとえば、ＳＴａ，ＳＴｂ）も抗体により中和することができる。ＬＴはペリプラズムトキシンで、ＳＴは細胞外トキシンである。ＳＴａはメタノール可溶性で、ＳＴｂはメタノール不溶性である。２種の異なる前駆体が用いられる。ＳＴａは１８〜１９アミノ酸ペプチド、ＳＴｂは４８アミノ酸ペプチドであり、それらの間には配列の類似性はない。ＬＴとＳＴ又はＳＴ突然変異体との抱合体も使用できる（米国特許４，８８６，６６３）。
【００６２】
広範囲の一般的な旅行者疾患、とくに腸の感染疾患のためのワクチンが開発されれば有利である。たとえば、キャンピロバクテリア症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、肝炎（肝炎ウイルスＡ又はＢ型）、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ，Ｐ．ｖｉｖａｘ，Ｐ．ｏｖａｌｅ及びＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）、細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ，Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｌ）、ウイルス性胃腸炎（ロタウイルス）、ならびにそれらの組み合わせが、応答可能な病原体から誘導される抗原を含ませることによって処置される。毒性を中和し、又は細胞への付着及び侵入をブロックする全身性又は粘膜性抗体が望ましい。病原体に関連する分子（たとえば、トキシン、膜タンパク質）に対し特異的な免疫応答が様々な投与経路（たとえば、腸内、粘膜、非経口、経皮）により誘発される。
【００６３】
アジュバント
処方にはアジュバントが含まれる。ただし、単一分子がアジュバント及び抗原の両性質を有していてもよい（たとえば、熱不安定性エンテロトキシン）。アジュバントは、特異的に又は非特異的に、抗原特異的免疫応答を、多分、抗原提示細胞（たとえば、様々な皮膚層における樹状細胞、とくにランゲルハンス細胞）の活性化によって強化するために使用される物質である。また、Ｅｌｓｏｎら（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）も参照されたい。活性化は初期には表皮又は真皮で起こるが、その効果は樹状細胞がリンパ系及び循環を通して移動する間持続する。アジュバントは抗原とともに、又は抗原なしで処方され適用されるが、アジュバントによる抗原提示細胞の活性化は一般に抗原の提示前に起こる。またそれらは短時間の間隔内で別個に、ただし同じ解剖学的領域（たとえば、同じ排出リンパ節野）に提供されてもよい。
【００６４】
アジュバントにはたとえば、ケモカイン（たとえばデフェンシン、ＨＣＣ−１，ＨＣＣ−４，ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ＭＩＰ−１δ，ＭＩＰ−３α，ＭＩＰ−２，ＲＡＮＴＥＳ）；ケモカイン受容体の他のリガンド（たとえばＣＣＲ１，ＣＣＲ２，ＣＣＲ−５，ＣＣＲ−６，ＣＸＣＲ−１）；サイトカイン（たとえばＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＮＦ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＭ−ＣＳＦ）；それらのサイトカインに対する受容体のリガンド、細菌ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドにおける免疫刺激性ＣｐＧモチーフ；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びその誘導体（たとえばムラブチド、スレオニル−ＭＤＰ，ムラミルトリペプチド）；熱ショックタンパク質及びその誘導体；ｅｌＦ４ａのリーシュマニア相同体及びその誘導体；細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン及びそれらの誘導体（たとえば、遺伝子突然変異体、Ａ及び／又はＢサブユニット含有フラグメント、化学的にトキソイド化されたバージョン）；細菌性ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン含有化学的抱合体又は遺伝子組換え体又はそれらの誘導体；Ｃ３ｄタンデムアレイ；リピドＡ及びその誘導体（たとえばモノホスホリル又はジホスホリルリピドＡ、リピドＡアナログ、ＡＧＰ，ＡＳ０２，ＡＳ０４，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，Ｄｅｔｏｘ，ＯＭ−１７４）；ＩＳＣＯＭＳ及びサポニン（たとえばＱｕｉｌ Ａ，ＱＳ−２１）；スクアレン；超抗原；又は塩（たとえば、水酸化又はリン酸アルミニウム、リン酸カルシウム）が包含される。他の有用なアジュバントは、Ｎｏｈｒｉａら（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，７：２６１−２６９、１９９４）及びＲｉｃｈａｒｄｓら（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌら，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）参照。
【００６５】
アジュバントは、好ましくは抗体又は細胞性エフェクター、特異的抗体アイソタイプ（たとえばＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，分泌型ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及び／又はＩｇＧ４）又は特異的Ｔ−細胞サブセット（たとえば、ＣＴＬ，Ｔｈ１，Ｔｈ２及び／又はＴＤＴＨ）を誘導するように選択される。たとえば、抗原提示細胞はクラスＩＩ−限定抗原を前駆体ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示し、Ｔｈ１又はＴｈ２経路に入る。能動的にサイトカインを分泌するＴヘルパー細胞は一次エフェクター細胞であり、それらは静止していれば記憶細胞である。記憶細胞の再活性化は記憶エフェクター細胞を産生する。Ｔｈ１は特徴的に、ＩＮＦ−γを分泌し（ＴＮＦ−β及びＩＬ−２も分泌される）、細胞性免疫の「ヘルプ」を伴う。一方、Ｔｈ２は特徴的に、ＩＬ−４を分泌し（ＩＬ−５及びＩＬ−１３も分泌される）、体液性免疫の「ヘルプ」を伴う。疾患の病原性に依存して、アジュバントはＴｈ１応答（たとえば、抗原特異的細胞溶解細胞）対Ｔｈ２応答（たとえば抗原特異的抗体）に好ましいように選択される。
【００６６】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド又は類似のモチーフはＢリンパ球及びマクロファージを活性化することが知られている（米国特許第６，２１８，３７１）。他の形の細菌性ＤＮＡがアジュバントとして使用できる。細菌性ＤＮＡは、免疫系によるそれらの病原性起源を認識し、先天的免疫応答を刺激して養子免疫応答の招来を可能にするパターンを有する構造クラス中にある。これらの構造は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれ、リポポリサッカライド、テイコイン酸、非メチル化ＣｐＧモチーフ、二重鎖ＲＮＡ及びマンニンス（ｍａｎｎｉｎｓ）を包含する。ＰＡＭＰは炎症応答を仲介できる内因性シグナルを誘導し、Ｔ細胞機能の共刺激物質として作用し、エフェクター機能をコントロールする。ＰＡＭＰがこれらの応答を誘発する能力はアジュバントとしてのそれらの可能性に役割を果たし、それらの標的は抗原提示細胞、たとえば樹状細胞及びマクロファージである。皮膚の抗原提示細胞は同様に、皮膚により伝達されたＰＡＭＰによって刺激されることができた。たとえば、樹状細胞の１タイプのランゲルハンス細胞は、経皮的には貧弱な免疫原性を有する分子と共に存在する、皮膚上の溶液中のＰＡＭＰにより活性化され、この貧弱な免疫原性分子をリンパ節内のＴ−細胞へ移動し、提示するように誘発され、貧弱な免疫原性を有する分子に対する抗体応答を誘発することができた。ＰＡＭＰはまた、他の皮膚アジュバント、例えばコレラトキシンと共に用いて、異なる同時刺激性分子を誘発し、免疫応答を、例えばＴｈ２からＴｈ１応答のように誘導する異なるエフェクター機能を制御することができた。
【００６７】
大部分のＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（ｂＡＲＥ）は、受容体結合活性を含有するＢサブユニット及びＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を含有するＡサブユニットでＡ：Ｂヘテロダイマーとして組織化されている。ｂＡＲＥの例にはコレラトキシン（ＣＴ）大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、ジフテリアトキシン、シュードモナスエキソトキシンＡ（ＥＴＡ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉ−ｎｕｍトキシンＣ２，Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍトキシンＣ３，Ｃ．ｌｉｍｏｓｕｍエキソ酵素、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓエキソ酵素、シュードモナスエキソトキシンＳ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＤＮ、及びＢ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓトキシンが包含される。たとえばトリプシン切断部位の突然変異を含有するｂＡＲＥ（たとえば、Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．６３：１６１７−１６２３，１９９５）又はＡＤＰ−リボシル化に影響する突然変異（たとえばＤｏｕｃｅら，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．６５：２８２２１−２８２２１８，１９９７）を使用することができる。
【００６８】
ＣＴ，ＬＴ，ＥＴＡ及びＰＴは異なる細胞結合部位を有するにもかかわらず、経皮的免疫感作において強力なアジュバントであり、ＩｇＧ抗体を誘発するが、ＩｇＥ抗体は誘発しない。ＣＴなしのＣＴＢもＩｇＧ抗体を誘発することができる。すなわちｂＡＲＥ及びその誘導体はいずれも皮膚に表皮を通して適用された場合、効果的に免疫することができる。しかしながら、アジュバント及び抗原として、ネイティブなＬＴがネイティブなＣＴほど強力ではないことは明らかである。しかし、活性化されたｂＡＲＥは、経皮的免疫系において弱い免疫原性抗原として働くことができる。すなわち、１又は２以上の抗原による免疫感作は別個に、又は抗原提示細胞の免疫刺激と接合させて、予防的又は治療的免疫応答の誘発に使用できる。
【００６９】
一般的に、トキシンは化学的に不活性化して、毒性は低いが免疫原性は維持するトキソイドを形成させることができる。本発明者らは、トキシンベースの免疫原とアジュバントを用いる経皮的免疫感作が、これらの疾患に対する保護に適当なレベルの抗−トキシンを達成することができると想定する。抗−トキシン抗体は、トキシン、又は遺伝子的に脱毒性化したトキソイド自体もしくはトキソイドとアジュバントによる免疫感作により誘発できる。ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン活性又はトリプシン切断部位が変わった、遺伝子的にトキソイド化されたが結合活性は維持されるトキシンは、経皮的免疫感作に用いられる抗原提示細胞の非毒性アクティベーターとしてとくに有用で、トキシンの使用における懸念を減少させる。
【００７０】
ｂＡＲＥは経皮的免疫感作により、抗原特異的ＣＴＬを誘発するアジュバントとして働くこともできる。ｂＡＲＥアジュバントは、他の抗原、たとえば炭水化物、ポリペプチド、グリコリピド及び糖タンパク質抗原に化学的に抱合させることもできる。トキシン、それらのサブユニット又はトキソイドとこれらの抗原との化学的抱合は、表皮から適用した場合、これらの抗原に対する免疫応答の増強が期待される。トキシンの毒性（たとえば、ジフテリアトキシンは毒性がきわめて強いことが知られていて、１分子が１個の細胞を死滅させる）の問題を克服するために、また、破傷風のような強力なトキシンで作業する問題を克服するために、何人かの研究者は遺伝子的に製造されるトキソイドの産生に、組換えによるアプローチを採用している。これは、ＡＤＰ−リボシル化トランスフェラーゼの触媒活性を遺伝子欠失による不活性化に基づいている。これらのトキシンは、結合能力は維持しているが、天然のトキシンの毒性を欠いている。このような遺伝子的にトキソイド化されたエキソトキシンには、経皮的免疫応答の誘発とアジュバントとしての作用が期待される。トキソイドには毒性はないと考えられるので、安全性に対する懸念を生じることがない点で、経皮的免疫系に利点を提供する。しかしながら、トリプシン切断のような技術による活性化は、トリプシン様酵素を欠く皮膚を通じてのＬＴのアジュバント性を増強させることが期待される。さらに、トキシンを化学的に修飾して、上記の問題を解決する幾つかの技術がある。これらの技術は、摂取されたトキシンが有害な反応を生じる可能性がある、ある種の適用たとえば、とくに高齢者への適用に重要である。
【００７１】
アジュバントは、生化学的に、天然のソース（たとえば、ｐＣＴ又はｐＬＴ）から精製するか、又は組換えによって製造してもよい（たとえば、ｒＣＴ又はｒＬＴ）。ＡＤＴ−リボシル化エキソトキシンは蛋白分解（すなわち、活性化）の前又は後に精製することができる。ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンのＢサブユニットも使用できる。蛋白分解後にネイティブな酵素から精製され、又は酵素の全コード領域のフラグメントから製造されて使用される。ＡＤＰリボシル化−エキソトキシンのサブユニットは別個に（たとえばＣＴＢ又はＬＴＢ）又は一緒に（たとえばＣＴＡ−ＬＴＢ，ＬＴＡ−ＣＴＢ）、化学的抱合又は遺伝子融合によって使用できる。
【００７２】
点突然変異（たとえば、単一、二重又は三重アミノ酸置換）、欠失（たとえば、プロテアーゼ認識部位）及びＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンの単離された機能ドメインもアジュバントとして使用することができる。毒性が低いか、又はそれらのＡＤＰ−リボシル化活性は失われているが、それらのアジュバント活性は維持されている誘導体が記載されている。大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの特異的な突然変異体には、ＬＴ−Ｋ６３，ＬＴ−Ｒ７２，ＬＴ（Ｈ４４Ａ），ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ），ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ／Ｌ２１１Ａ）及びＬＴ（Δ１９２−１９４）が包含される。毒性はＹ−１副腎細胞アッセイ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＆ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ，２４：７６０−７６９）でアッセイした。ＡＤＰ−リボシル化はＮＡＤ−アグマチンＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼアッセイ（Ｍｏｓｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６８：６３８３−６３８７，１９９３）によりアッセイした。特定のＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン、それらの誘導体、ならびにそれらの製造及び特徴決定は、米国特許４，６６６，８３７；４，９３５，３６４；５，３０８，８３５；５，７８５，９７１；６，０１９，９８２；６，０３３，６７３及び６，１４９，９１９に記載されている。
【００７３】
ランゲルハンス細胞のアクティベーターはまたアジュバントとして使用できる。このようなアクティベーター例には、熱ショックタンパク質のインデフューサー、接触センシタイザー（たとえば、トリニトロクロロベンゼン、ジニトロフルオロベンゼン、ナイトロジェンマスタード、ペンタデシルカテコール）；トキシン（たとえばシガトキシン、ＳｔａｐｈエンテロトキシンＢ）；リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、リピドＡ又はその誘導体；細菌性ＤＮＡ；サイトカイン（たとえば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）；ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー、溶液中カルシウムイオン、カルシウムイオノフォア、及びケモカイン（たとえば、デフェンシン１又は２，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２，ＩＬ−８）が包含される。
【００７４】
抗原及びアジュバントの両者であるＬＴの場合のように、免疫感作抗原が十分なランゲルハンス細胞活性化能力を有する場合には、別のアジュバントは必要ない。また、このような抗原は十分に免疫原性であるから、アジュバントは必要ないとも考えることができる。生存細胞又はウイルス調製物、弱毒化生存細胞又はウイルス、死滅細胞、不活性化ウイルス及びＤＮＡプラスミドは、経皮的免疫感作に有効に使用することができた。また、低濃度の接触センシタイザー又はランゲルハンス細胞の他のアクティベーターも、皮膚損傷を誘発することなく免疫応答の誘導に使用することができる。
【００７５】
アジュバントの活性を増大させる他の技法には、有効な添加物質たとえば界面活性剤及び／又はホスホリピドを処方に加えて、ＡＤＰ−リボシル化因子によるＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンのアジュバント活性を増強させる。１又は２以上のＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）をｂＡＲＦ（たとえば、ＡＲＦ１，ＡＲＦ２，ＡＲＦ３，ＡＲＦ４，ＡＲＦ５，ＡＲＦ６，ＡＲＤ１）のアジュバント性を増強するために使用することができる。同様に、１又は２以上のＡＲＦがＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンとともにそのアジュバント活性を増強させるために使用される。
【００７６】
望ましくない性質又は有害な副作用（たとえば、アレルギー性又は過敏性反応、アトピー、接触性皮膚炎、又は湿疹；全身性毒性）は、経皮的免疫感作の有効性を破壊することなく、修飾によって低減させることができる。修飾にはたとえば可逆性化学修飾（たとえば蛋白分解）又は免疫系から処方の１又は２以上の成分を可逆的に単離するコーティング中へのカプセル封入が包含される。たとえば、処方の１又は２以上の成分を、送達のための粒子（たとえば、マイクロスフィア、ナノ粒子）中へのカプセル封入できるが、本発明者らはリピド小胞へのカプセル化は経皮的免疫感作には必要なく、マイナスの効果があるように思われることを示した。粒子の貪食作用は独力で、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ分子及び／又は共刺激分子（たとえば、ＣＤ４０，Ｂ７ファミリーメンバーたとえばＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現は上方調節によって、抗原提示細胞の活性化を上昇させる。
【００７７】
処方
医薬的処方の製造方法はよく知られている。処方の成分を医薬的に許容される担体又はビヒクル、ならびに任意の添加物の組み合わせ（たとえば、少なくとも１種の希釈剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、乾燥剤、保存剤、着色剤又はそれらの組み合わせ）を混合する。一般的にＵｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈＥｄ．（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９８年）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ（Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，２ｎｄＥｄ．（編者多数，１９８９−１９９８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）；及びＰｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｓｅｌら，１９９４，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）参照。
【００７８】
グッドマニュファチャリングプラクティス（ＧＭＰ）は医薬品工業において周知であり、政府機関（たとえば食品医薬局）によって規制されている。滅菌された液体処方は、処方の意図された成分を十分な量の溶媒に溶解し、ついでろ過して夾雑する微生物を除去することによって滅菌することによって調製される。一般的には、処方の様々な滅菌成分を、基本の分散メジウム中に含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって分散液を調製する。滅菌が要求される固体剤形の製造には真空乾燥又は凍結乾燥を使用できる。固体剤形（たとえば、散剤、顆粒剤、ペレット、錠剤）又は液体剤形（たとえば、アンプル、カプセル、バイアル中の液体）は、処方の少なくとも１種の活性成分又は成分から調製できる。
【００７９】
様々な投与剤形の製造及びパッチの製造に適当な操作は周知である。処方は、少なくとも１種の活性成分又は成分の固体又は液体剤形をカプセルに封入するか、又はそれらをコンパートメント又はチャンバー中に別個に保持させることにより製造される。パッチは、圧によって破壊され、ついでパッチの乾燥処方を溶解させるビヒクル（たとえば食塩溶液）を含有するコンパートメントを包含できる。各投与用量のサイズ及び対象に投与される間隔は、容器、コンパートメント又はチャンバーの適当なサイズ及び形状を決定するために用いられる。
【００８０】
処方は、活性成分（たとえば、抗原及びアジュバント）の有効量を、ヒト又は動物への投与に適当な医薬的に許容される組成物を提供するために、担体又は適当量のビヒクルとともに含有する。ビヒクルを含有する処方は、クリーム、乳化液、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、溶液、懸濁液、又は本技術分野で既知の他の液体剤形、とくに皮膚の水和を増大させる剤形とする。
【００８１】
投与及び投与スケジュール内での活性成分の相対的な量は、対象（たとえば動物又はヒト）への有効な投与のために適宜調整される。この調整は対象の特定の疾患又は状態、及び治療又は予防が意図されるかに依存する。対象への処方の投与を単純化するために、単一ラウンドの免疫感作のために予め定められた量の活性成分を各単位用量中に含有させる。
【００８２】
タンパク質の不安定性又は変性の多くの原因には加水分解及び変性が包含される。変性の場合は、タンパク質のコンフォメーションが妨害され、タンパク質はその自然の球体構造から脱フォールドされる。その自然のコンフォメーションに再フォールディングされるのではなく、疎水性相互作用が分子を一緒にクランプ（凝集）させるか、自然ではないコンフォメーションへ再フォールディングさせる。いずれの結果も抗原性又はアジュバント活性の低下又は喪失を招く。安定化剤はこのような問題を減少させるか防止するために添加される。
【００８３】
処方又はその製造の任意の中間体は予め保護剤（すなわち、凍結防止剤又は乾燥安定化剤）によって前処理され、ついで氷の結晶の形成を最小にする冷却速度及び最終温度に付すことができる。凍結防止剤の適切な選択及び予め選択された乾燥パラメーターの使用はほとんどすべての処方を、適当な所望の最終的使用のために低温調製することを可能にする。
【００８４】
以下の任意の添加物、たとえば賦形剤、安定化剤、乾燥剤及び保存剤、以下の考察においてそれらの機能によって説明することを理解すべきである。すなわち、特定の化学物質が、賦形剤、安定化剤、乾燥剤及び／又は保存剤のある種の組み合わせとして働く。このような化学物質は、直接免疫応答を誘発しないが、抗原又はアジュバントの免疫学的活性を上昇させることにより、たとえば乾燥及び溶解サイクルにおける抗原又はアジュバントの還元修飾により応答を増強する。
【００８５】
安定化剤には、シクロデキストリン及びその誘導体が包含される（米国特許５，７３０，９６９参照）。適当な保存剤、たとえば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、及びグリセリンは最終処方を安定化するために添加することができる。非イオン界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸の塩、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びそれらの混合物から選択される安定化剤を処方に添加することができる。アルカリ金属塩又は塩化マグネシウムの添加はポリペプチドを安定化し、任意に加えられる血清アルブミン及び凍結乾燥を含めて、安定性をさらに増強する。ポリペプチドはそれを、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、インスリン、デキストリン、及びアルギン酸塩からなる群から選択されるサッカライドと接触させることによっても安定化される。添加できる他の糖には、モノサッカライド、ジサッカライド、糖アルコール及びそれらの混合物（たとえば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）が包含される。ポリオールはポリペプチドを安定化し、水混和性又は水溶性である。適当なポリオールはポリヒドロキシアルコール、モノサッカライド及びジサッカライドであり、たとえばマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース及びそれらのポリマーが包含される。様々な賦形剤、たとえば血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸及びホスホリピド、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン、及び硫酸アンモニウムもポリペプチドを安定化し得る。
【００８６】
単一用量の処方は、適当な賦形剤及び安定化剤の選択により、ポリ（乳酸）及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）の微小球体中に安定化することができる。トレハロースは非還元糖であり、したがってアミノ基を有する物質、たとえばタンパク質、とアミノカルボニル反応を起こさないので、添加物として有利に使用することができる。
【００８７】
対象に、乾燥した非液体型で投与できる処方はコールドチェーンを必要としない条件で保存することができると考えられる。溶液中の抗原（たとえば、ＣＳ６）はアジュバント、たとえばＬＴ、と溶液中で混合して、閉塞性バッキング、たとえばプラスチックラップ、をもつガーゼパッド上に置き、乾燥させる。このパッチをついでガーゼ側を皮膚と直接接触するように皮膚上にある期間置き、単純な閉塞、たとえばプラスチックラップ及び接着テープで覆ってその位置に保持できる。パッチは多くの組成とすることができる。基体は綿のガーゼ、レーヨン−ナイロンの組み合わせ又は他の合成材料であり、閉塞性の固体バッキングたとえばポリ塩化ビニル、レーヨン、他のプラスチック、ゲル、クリーム、乳化液、ワックス、油、パラフィン、ゴム（合成又は天然）、布又は膜を有する。様々な接着剤を用いて、パッチは皮膚上に保持できる、パッチの成分は一緒に保持できる。１又は２以上のアジュバント及び／又は抗原はパッチの基体又は接着剤部分に導入できる。
【００８８】
液体又は準液体処方は直接皮膚に適用され、風乾させれ；皮膚又は頭皮に擦り込まれ；（特に動物の）耳、鼠蹊部、又は皮膚の擦れ合う領域に付され；肛門／直腸組織に付され；包帯、パッチ又は吸収材料でその位置に保持され；浸水させるか、又はほかにストッキング、スリッパー、グローブ又はシャツのようなデバイスによって保持されるか；又は皮膚上にスプレーして、皮膚との最大接触を可能にする。処方は吸収材料包帯又はガーゼに適用してもよい。処方は閉塞性包帯、たとえばＡＱＵＡＰＨＯＲ（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆからの石油乳化液、鉱油、鉱油ワックス、ウールワックス、パンテノール、ビサボール及びグリセリン）、プラスチックフィルム、ＣＯＭＦＥＥＬ（Ｃｏｌｏｐｌａｓｔ）又はバセリン石油ジェリー；又は非閉塞性包帯たとえばＴＥＧＡＤＥＲＭ（３Ｍ）、ＤＵＯＤＥＲＭ（３Ｍ）又はＯＰＳＩＴＥ（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎａｐｈｅｕ）で覆ってもよい。閉塞性包帯は水の通過を排除する。このような処方は単一又は複数の部位、単一又は複数の肢に、又は皮膚の大きな表面積に、完全な含浸により適用することができる。処方は直接、皮膚に適用してもよい。使用できる他の基体は圧感受性接着剤たとえばアクリリックス、ポリイソブチレン、及びシリコーンである。処方は多孔性のパッド（たとえばガーゼ）又は吸水性ストリップ（たとえばろ紙）の代わりに、多分それ自体接着性の基体に、直接導入されてもよい。
【００８９】
パッチを使用するか否かに拘わらず、処方に添加されたポリマーは、活性成分の賦形剤、安定化剤及び／又は保存剤、及び乾燥型活性成分を溶解するために用いた溶液を飽和させる活性成分濃度を低下させるように働く。このような低下はポリマーが「空」のスペースを満たすことにより溶液の有効容量を低下させるので生じる。この方法で、抗原／アジュバントの量は飽和溶液の量を減少させることなく保存することができる。重要な熱力学的考察は、飽和溶液中の活性成分が濃度の低い領域へと皮膚を通って「駆動」されることである。溶液中で、ポリマーはまた、処方の可溶化された成分の抗原／アジュバント活性を安定化及び／又は保存できる。このようなポリマーには、エチレン又はプロピレングリコール、ビニルピロリドン、及びβ−シクロデキストリンポリマー及びコポリマーが包含される。
【００９０】
経皮的送達
処方の経皮的送達はランゲルハンス細胞に標的化され、したがって有効で効率的な免疫感作が達成される。これらの細胞は皮膚に豊富に見出され、Ｔ−細胞の記憶と強力な免疫応答を誘導できる効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。皮膚における多数のランゲルハンス細胞の存在から、経皮的な送達の効率は抗原及びアジュバントに暴露された表面積に関連するのかもしれない。実際、経皮的な免疫感作がきわめて有効な理由は、皮内の免疫感作より、これらの多数の有効な抗原提示細胞が標的化されることであろう。
【００９１】
本発明は、免疫感作への接近を増大させ、一方では強力な免疫応答を誘発させる。経皮的免疫感作は皮下用注射針による注射（すなわち、真皮への透過又は通過）ならびに複雑性及び困難性を要求せず、医学的熟練者、滅菌技術及び滅菌装置の要求を低下させる。さらに、多重部位での免疫感作又は多重免疫への障壁が減少する。処方の単一適用による免疫感作も計画される。
【００９２】
免疫感作は局所的又は表皮への抗原及びアジュバントの単純な処方の適用によって無傷の皮膚に行われ、閉塞性の包帯又は他のパッチ技法を用いて任意に被覆し、化学的又は物理学的な透過を実施し又は実施しない。免疫感作は訓練されていない人でも行うことができ、自分にでも適用できる。免疫感作への容易なアクセスを与え、大規模な領域の免疫感作を可能にした。さらに単純な免疫感作操作は、小児科、老人科及び第三世界集団による免疫感作へのアクセスを改善すると思われる。本発明による経皮的な免疫によれば、抗原及びアジュバントを、免疫系とくに皮下に存する特異的抗原提示細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）へ送達できる方法が提供される。
【００９３】
旧来のワクチンでは、それらの処方が皮膚に針を用いて注射された。針を用いるワクチンの注射には、滅菌した針及びシリンジ、ワクチンの投与のために訓練された医学関係者、注射からの不快感、針に由来する疾患、再使用できる可能性がある針による皮膚の穿孔でもたらされる併発症の可能性を包含する欠点を有する。皮下用針を使用しない経皮免疫感作は、皮下用針を避けることによりワクチン送達に関する進歩を示す。
【００９４】
しかも経皮的免疫感作は、皮膚の大きな表面積を標的する幾つかの位置を用いることにより、より多くの免疫細胞が標的化されることになるので、皮下用針を用いる免疫感作よりも優れている。免疫応答を誘発するのに十分な治療的有効量が単一の皮膚の位置に、あるいは多くの排出リンパ節野を覆う皮膚の領域（たとえば、頸部、腋窩、鼠蹊部、内側上頬、腺窩、腹部及び胸郭のリンパ節）上に、経皮的に送達することができる。このような位置は全身の数多くの異なるリンパ節の位置に近く、少量の抗原が単一の位置に皮内、皮下又は筋肉内注射された場合よりも、より広範囲の刺激を免疫系に提供することになる。
【００９５】
皮膚を通過又は皮膚に侵入した抗原は、抗原提示細胞に遭遇し、それは免疫応答を誘発するように抗原を処理する。多重免疫感作部位に多数の抗原提示細胞が徴集され、徴集された大集団の抗原提示細胞が大きな免疫応答を誘発する。皮膚の使用が抗原を皮膚の貪食細胞たとえば樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、及び他の皮膚抗原提示細胞に送達し；抗原はまた、血流又はリンパ系を通して抗原提示細胞として働くことが既知の肝臓、脾臓、及び骨髄にも送達される、と考えられる。
【００９６】
ランゲルハンス細胞、他の樹状細胞、マクロファージ又はそれらの組み合わせは、それらのアシアログリコタンパク質受容体、マンノース受容体、Ｆｃγ受容体ＣＤ６４、ＩｇＥに対する高親和性受容体又は他の高度に発現される膜タンパク質を用いて特異的に標的化される。それらの受容体のいずれかに特異的なリガンド又は抗体は、アジュバント、抗原又は両者と抱合されるか又はそれらとの融合タンパク質として組換えにより産生させることができる。さらに、アジュバント、抗原又は両者はプロテインＡ又はＧと抱合又はそれらとの融合タンパク質として組換え技術により製造し、Ｂリンパ球の表面免疫グロブリンに標的化することができる。想像された結果は、抗原の抗原提示細胞への広範囲な、稀な程度の、現在の免疫実務では達成されたことのない分布である。
【００９７】
遺伝子免疫感作は米国特許５，５８９，４６６，５，５９３，９７２及び５，７０３，０５５に記載されている。その処方中に含有される核酸（単数又は複数）は抗原、アジュバント又はその両者をコードしてもよい。核酸は複製可能であっても、また複製できなくてもよい。それは非組込み性及び非感染性である。たとえば核酸は、免疫応答をクラスＩ制限応答に向ける抗原及びユビキチンドメインからなる融合ポリペプチドをコードしてもよい。核酸は、抗原又はアジュバントをコードする配列に作用可能に連結された調節領域をさらに含んでいてもよい。核酸にはアジュバントが添加されてもよい。核酸はそのトランスフェクションを促進する物質、たとえば陽イオン性リピド、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン−ＤＭＳＯ又はそれらの混合物と複合されていてもよい。免疫細胞は、ＤＮＡのＦｃ受容体もしくはタンパク質Ａ／Ｇの複合によって、又はそれをα２−マクログロブリンもしくはタンパク質Ａ／Ｇ、又は類似のＡＰＣ標的化材料に連結させる物質にＤＮＡを付着させることによって標的化することができる。
【００９８】
特異的免疫応答は体液性（すなわち、抗原特異的抗体）及び／又は細胞性（すなわち、抗原特異的リンパ球たとえばＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ，Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、及び／又はＴＤＴＨ細胞）エフェクターアームからなる。さらに、免疫応答はＮＫ細胞及び、抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介する他の白血球からなる。
【００９９】
本発明の処方によって誘発される免疫応答には、抗原特異的抗体及び／又はリンパ球の誘発が包含される。抗体はイムノアッセイ法によって検出することができる。様々な抗体アイソタイプ（ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，分泌ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）の検出は、全身性又は局所性免疫応答を指示する。
免疫応答は中和化アッセイによっても検出できる。抗体とはＢリンパ球により産生される保護的タンパク質である。それらは高度に特異的で、一般に抗原の１つのエピトープを標的とする。しばしば、抗体は病原体由来の疾患を生じる抗原との特異的な反応によって、疾患に対する保護において重要な役割を果たす。免疫感作は免疫感作抗原（例えば、細菌トキシン）に特異的な抗体を誘発し得る。
【０１００】
ＣＴＬは、病原体による感染に対して保護するために産生される免疫細胞である。それらはまた、きわめて特異的である。免疫感作は抗原特異的なＣＴＬ、たとえばマラリアタンパク質をベースにした合成オリゴペプチドを、自己主要組織適合性抗原とともに誘導する。経皮的送達システムによる免疫感作によって誘発されるＣＴＬは、病原体感染細胞を殺滅することができる。免疫感作はまた、抗体及びＣＴＬにおけるブースター応答によって示めされるように、記憶応答を生じ、抗原により刺激されたリンパ球の培養によるリンパ球増殖を生じ、また皮膚に抗原単独の皮内チャレンジに対する遅延型過敏症応答を生じる。
【０１０１】
保護の成功は、病原体による感染又はトキシンの投与を使用するチャレンジ研究、又は臨床的基準（たとえば、高い抗体力価、又は粘膜におけるＩｇＡ抗体分泌細胞の産生が指標マーカーとして使用される）の測定によって証明される。
【実施例】
【０１０２】
以下は本発明の例示を意図するものであり、本発明の実施は、以下の実施例によっていかなる意味においても制限又は限定されるものではない。
【０１０３】
動物実施例
ＢＡＢＬ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。マウス（６〜１０週齢）は病原体フリーの状態に維持し、齧歯類用固形飼料と水を自由に与えた。雌のＨａｒｔｌｅｙモルモットは４〜６週齢で、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、病原体フリーの状態に維持し、飼料と水を自由に与えた。
【０１０４】
コレラトキシン（ＣＴ）はＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入し、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）はＳｗｉｓｓ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＶＩ）から購入した。
【０１０５】
組換えＣＳ６（ｒＣＳ６）を調製するためには、カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＵＣ誘導体化プラスミド上、大腸菌株ＨＢ１０（Ｗｏｌｆら，１９９７；Ｗｏｌｆら，１９７７）にＣＳ６の完全な４−遺伝子オペロン（約５ｋｂ）をクローン化した。このクローンを用いてｒＣＳ６をＮｅｗ ＢｒｕｎｓｗｉｃｋＢｉｏＦｌｏ ３０００ファーメンターで産生させた。発酵ブロスを遠心分離によって収穫し、ｒＣＳ６を接線フローろ過によって精製し、ついで硫酸アンモニウムで沈殿させた（Ｗｏｌｆら，１９９７）。ついで、ｒＣＳ６をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で緩衝液交換に付した。精製されたｒＣＳ６を免疫感作まで−２０℃で保存した。ｒＣＳ６の純度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、クーマッシーブルー染色、及び密度測定走査により＞９８％と測定された（Ｃａｓｓｅｌｓら，１９９２；Ｓｃｈｇｇｅｒ ＆ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，１９８７）。
【０１０６】
臨床的なＥＴＥＣ株Ｅ８７７５及びＥ９０３４Ａは、それぞれ、ネイティブなＣＳ６（ｎＣＳ６）及びＣＳ３のソースとして使用した。ＣＦＡアガー（Ｅｖａｎｓら，１９７７）上において増殖させた２種の株の熱及び食塩水抽出液は硫酸アンモニウム、ついで１０％飽和間隔（Ｗｏｌｆら，１９９７）で処理した。６０％及び３０％飽和における沈殿は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡアッセイで測定してそれぞれ最大量及び最高純度のネイティブなＣＳ６及びＣＳ３を含有した。
【０１０７】
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＭＳＰ（ＭＳＰ−１４２、３Ｄ７）をポリヒスチジンタグ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。抗原は３つのクロマトグラフィー工程すなわちニッケル親和性、Ｑ陰イオン交換及びＣＭ陽イオン交換を用いてほぼ均一まで精製した。
【０１０８】
マウスは前述のように経皮的に免疫された（Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｉｎら， ２０００）。略述すれば、動物は、視覚刺激又は皮膚の変化を残さないで背部をＮｏ．４０のクリッパーで剃毛し、４８時間休息させた。マウス及びモルモットはケタミン／キシラジンの混合物の後腿部への筋肉内（ＩＭ）注射又は腹腔内注射（ＩＰ）で麻酔し、免疫感作操作時の自己の身繕いを防止した。露出した皮膚表面を水で濡らしたガーゼによって５〜１０分間水和し、免疫感作前に乾燥したガーゼで軽く吸い取った。２５〜１００μＬの免疫感作溶液を剃毛した皮膚上の２−ｃｍ２の面積に１時間置いた。ついで動物を尾を下にして流水にまかせて約３０秒間徹底的に洗浄し、撫ぜて乾燥させ、再度洗浄した。
【０１０９】
受動免疫感作は、１０，０００ＥＬＩＳＡ単位を越える抗−ＬＴ ＩｇＧ力価を含有するマウスのマッチした株からプールした超免疫血清を尾静脈注射することによって達成された。ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＬＴ又は重炭酸塩緩衝液を経口的にチャレンジする１時間前に、０．５ｍＬの血清を注射した。ナイーブなＣ５７ＢＬ／６マウスも同じ操作を用いてチャレンジの１２時間前に受動免疫感作した。
【０１１０】
外毒素のチャレンジモデルについては記載がある（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，１９８４）。ＢＡＬＢ／ｃマウスには、１０％重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液中に懸濁したＬＴ（５００μＬ中１０μｇ）を与えた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスには体重をベースにＬＴ（５００μＬの１０％ＮａＨＣＯ３中、体重１ｇあたり１００ｐｇ）を給与した。対照動物には５００μＬの１０％ＮａＨＣＯ３単独を投与した。糞食を防止するため、マウスは針金の網の床になっているケージに移した。チャレンジ前１２時間及びチャレンジの間のマウスには１０％のグルコース水を与え、飼料は与えなかった。チャレンジ６時間後に、動物を秤量して屠殺した。ついで小腸（幽門弁から回腸−盲腸接合部まで）を切り離し、液体の喪失を防止するために結紮し、秤量した。液体の蓄積は式ＦＡ＝（Ｇ／（Ｂ−Ｇ））＊１０００（式中、Ｇは消化管重量＋液体のグラム数、Ｂは体重のグラム数）を用いて計算された。この式を用いると、非処置又は重炭酸塩給与動物における液体蓄積のベースライン値は、動物の初期体重に依存して３０〜１５０である。
【０１１１】
組織病理学的な研究は、Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＲｅｓｅａｒｃｈにおけるＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＧａｒｙ Ｍ．Ｚａｕｃｈａ， ＡＶＰ，ＡＢＴ及びＡＣＶＰＭにより実施された。処置群あたり２匹のモルモット及び１匹の対照動物を病理学的研究に準備した。動物は３回のワクチン接種のそれぞれについて暴露して２日後に、麻酔して完全な肉眼的剖検に付した。高用量群の組織病理学的検査には皮膚をもつ組織（毛の生えた皮膚及び背側腰部の暴露部位）の完全な補体の検査を包含させ、残った群で肝臓を評価した。高用量群で収集しホルマリンで固定した組織は、脳、下垂体、舌、肺、気管、食道、甲状腺、胸腺、心臓、膵臓、脾臓、肝臓（付着した胆嚢とともに）、胃、小腸、盲腸、回腸、腸間膜リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、卵巣、子宮、唾液腺、顎下腺リンパ節、骨髄（胸骨）、毛の生えた皮膚、背側腰部の暴露部位、及び肉眼的な損傷であった。個々の動物の組織病理学的所見は１〜５の評点（１＝軽微、２＝軽度、３＝中等度、４＝著明、５＝重度）で分類した。
【０１１２】
ＣＴ，ＬＴ，ネイティブなＣＳ３，ネイティブなＣＳ６，ｒＣＳ６及びＭＳＰ−１４２に対する抗体のレベルはＥＬＩＳＡにて測定した。イムロン−２ポリスチレンプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．１μｇ／ウエルの抗原でコーティングし、室温において一夜インキュベートし、ＰＢＳ中０．５％のカゼイン緩衝液でブロックし、洗浄し、標本の系列希釈を適用し、プレートを室温で２時間インキュベートした。ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体はＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて１時間検出した。抗−ＬＴ特異的ＩｇＡのレベルは上述のように、二次抗体として置換したＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｚｙｍｅｄ）で測定した。分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）抗体のレベルもＥＬＩＳＡによって測定し、この場合、ＬＴコーティングプレートは、順次、ナイーブな又は免疫感作マウスからの糞、肺洗浄液又は膣洗浄液、精製ウサギ抗−分泌鎖（ＳＣ）抗体（１６〜２４時間４℃）（Ｃｒｏｔｔｅｔら，１９９９）及びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）（２時間室温）とインキュベーションした。結合抗体は２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）基体（ＡＢＴＳ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）を用いて明らかにし、反応は３０分後に１％ＳＤＳ溶液を用いて停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。抗体力価の結果は、ＯＤ（４０５ｎｍ）又はＥＬＩＳＡ単位で記録し、これは、光学密度（ＯＤ）１．０を生じる血清の逆希釈として定義される。モルモット抗−ｒＣＳ６ ＥＬＩＳＡは上述のように、検出工程に含まれるペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗−モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により実施された。抗−ＳＣ二次抗体は抗原（ｒＣＳ６）でコーティングされたプレートと反応させ、得られる高いバックグランドは、このアッセイを抗−ｒＣＳ６ＳＣの検出には不適当なものとした。
【０１１３】
１μＬのｒＣＳ６（０．５μｇ）、ネイティブなＣＳ６（１．６μｇ）及びネイティブなＣＳ３（０．５μｇ）をニトロセルロースストリップ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にスポットし、一夜乾燥させた。ストリップをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ）及び１％ウシ血清アルブミンと２時間インキュベートしてブロックした。一次マウス抗体を１：１０００及び１：４０００に希釈し、ストリップと１時間インキュベートし、ついで３回、１，５及び１０分間すべてＰＢＳ−Ｔ中で洗浄した。ついでストリップを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＢＳ−Ｔ中１：５０００）で標識した抗−マウスＩｇＧと３０分インキュベートした。ＰＢＳ中で３回１０分ずつ洗浄したのち、ストリップを３，３’ジアミノベンチジン（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ）、過酸化水素（Ｓｉｇｍａ）及び塩化コバルト（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）で、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のように展開した。すべてのインキュベーション及び洗浄はすべて軌道シェーカー上、室温で行われた。
【０１１４】
最後の免疫感作から７日後に、単核球細胞を脾臓及び表層腹側頸部節から単離し、以前に記述のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｈａｒｔｍａｎら，１９９４；Ｈａｒｔｍａｎら，１９９９）に使用する前に１ｍＬあたり５０ｍｇのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０中で洗浄した。洗浄した脾臓及びリンパ節細胞を計数し、培養メジウム（２ｍＭグルタミン，１ｍＬあたり５０ｍｇのゲンタマイシン及び１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０）中２．５×１０６／ｍＬの密度まで希釈した。１００ｍＬの細胞懸濁液を、予め炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．６中０．１μｇ／ウエルのＣＳ６抗原又はコーティング緩衝液単独でコートしたマイクロウエル中に接種した。各サンプルは四重にアッセイした。３７℃で４時間インキュベートしたのち、プレートを洗浄し、ウサギ抗−モルモットＩｇＧ（１：１２００）、ＩｇＡ（１：７００）又はＩｇＭ（ＩＣＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：８００）を加えた。４℃で一夜インキュベートしたのち、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗−ウサギ抗血清（Ｓｉｇｍａ）を１：２００に希釈して添加した。２時間３７℃に置いたのち、プレートを洗浄し、１ｍＬあたり１００ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートを含む溶解アガロース１００ｍＬの添加により、スポットを可視化した。ついで、スポット形成細胞を立体顕微鏡で計数した。
【０１１５】
新たに収集したマウスの糞、肺洗浄液又は膣洗浄液の肉眼検査では、血液の混入は明らかではなかった。ＨＥＭＡＳＴＩＸストリップ（Ｂａｙｅｒ）によりさらに試験すると、血液の混入は１μＬにつき≦５−２０の無傷の赤血球、又は１ｄＬにつき≦０．０１５−０．０６２ｍｇの遊離ヘモグロビンであった。
【０１１６】
糞のペレットを、自然排便によるチャレンジの前日に収集し、秤量し、１００ｍｇの糞材料あたり１ｍＬのＰＢＳ中にホモジナイズし、遠心分離し、上清を収集し、−２０℃で保存した。
【０１１７】
マウスを放血させ、気管を切開し、２２−ゲージのポリプロピレンチューブを挿入し、ＰＢＳを静かに注入して肺を膨らませた。ついで、注入した材料を放出させ、計３サイクル再注入し、−２０℃で保存した。
【０１１８】
膣腔を、ＰＢＳ（８０μＬ）の膣腔への穏やかな反復挿入及び吸引を計３サイクル行って洗浄した。膣からの材料を１０分間３，０００ｒｐｍで回転させ、上清を清潔な容器に移し、−２０℃で保存した。
【０１１９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＭＳＰ１単独又はＣＴ及びＭＳＰ１により、０，４，８及び１２週に皮膚上で免疫感作した。脾臓及び排出リンパ節（鼠蹊部）組織を一次免疫後２４週の時点で除去した。各群内の個々のマウスからの脾臓組織又はプールしたＬＮから単一細胞懸濁液を調製した。細胞を９６−ウエルプレート中、ウエルあたり４×１０５で５日間３７℃、５％ＣＯ２において、１０μｇ／ｍＬのＭＳＰ１抗原の存在下又は不存在下に培養した。５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を陽性対照として使用した。培養メジウムは、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ），ペニシリン（１０ Ｕ／ｍＬ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ，Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ，Ｓｉｇｍａ）及びＨｅｐｅｓ（１０μＭ，ＢｉｏＲａｄ）を補充したＲＰＭＩ１６４０を含有させた。［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウエル）を、５日間の培養期間における最後の２０時間に添加した。ガラス繊維フィルター上への収穫、ついで液体シンチレーションカウンターによりチミジンの取り込みを評価した。
【０１２０】
ＣＤ４＋細胞は、ＣＴ／ＭＳＰ１免疫群のプールした脾臓細胞からＣＤ４＋細胞選択カラムを用い、製造業者（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の説明書に従ってプールした。カラム（ＣＤ４＋）から溶出した細胞を９６ウエルプレート中、ウエルあたり１×１０５細胞で、ナイーブなマウスからの３×１０５照射（３０００ｒａｄ）フィーダー細胞の存在下又は不存在下に培養した。増殖アッセイは上述のように抗原刺激の存在下又は不存在下に行った。
【０１２１】
他の指示がなければ、示したＥＬＩＳＡデータは個々の動物からの幾何平均値であり、誤差の線は平均からの２標準偏差を表す。抗体力価と液体蓄積（ＦＡ）の群内での比較には、ペアのないＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用い、有意差ｐ値＜０．０５を有意とした。
【０１２２】
細菌性アジュバント及びコロニゼーション因子ＣＳ６による皮膚上への免疫感作は、保護抗体応答を生じる。ＴＣＩが、適当なＥＴＥＣ免疫応答を誘発するのに有効な方法であるかどうかを決定するため、マウスをＣＴ及びｒＣＳ６を用いＴＣＩにより４回免疫感作し、抗−ＣＳ６応答についてアッセイし、ついでＣＴホロトキシンを経口的にチャレンジし、急性の腸腫脹（液体蓄積）の程度を６時間後に定量した。陽性対照群は明礬中５μｇのｒＣＳ６により筋肉内経路（ＩＭ）で免疫した。陰性対照群は皮膚上にｒＣＳ６単独を投与した。ＲＣＳ６抗原と反応する抗体は、低（１０μｇ）又は高（１００μｇ）用量のアジュバントのいずれかを投与した動物における第一の免疫後に明らかであり、第二、第三のブースター免疫後に力価は上昇を続けた。アジュバント（１０又は１００μｇ）の存在下ＣＳ６に対する免疫応答は、抗原単独を１２週にＴＣＩによって送達した場合にみられる応答よりも大きかった（ｐ＜０．０５）。抗−ＣＳ６力価の幾何平均は第三の免疫感作後の高用量群（ＣＴ１００μｇ）最大であり、高い幾可平均抗−ＣＳ６力価は、筋肉内免疫感作に比べて、ＴＣＩを用いて産生されたが、いずれの差も有意ではなかった。抗−ＣＴ力価はＣＴアジュバントした群においてすべての時点で上昇していた。皮膚上ＣＳ６単独で免疫感作された動物は、抗原又はアジュバントに対する一定した抗体応答を発生しなかった。
【０１２３】
皮膚におけるナイーブな、抗原単独、及びＣＴ＋ＣＳ６（１００μｇ／１００μｇ）群を、ＴＣＩを用いた免疫感作後のＣＴによる経口的チャレンジに選択した。ＣＳ６単独及びＣＴ／ＣＳ６群を、第三の免疫感作後１１週にブースターした（研究１９週時点）。２週後、動物に重炭酸塩緩衝液単独（１０％ＮａＨＣＯ３）又は１０μｇのＣＴを含有する重炭酸塩緩衝液のいずれかを給与し、得られた腸の腫脹を測定した。重炭酸塩単独を給与されたナイーブなマウスからの腸は、１０３（範囲７８〜１４６）ベースラインの液体蓄積を示した。ナイーブなマウスにおけるＣＴの経口投与は液体蓄積に２倍の上昇を生じた（平均２０９；範囲１６４〜３５９）。同様に、ｒＣＳ６単独でワクチン接種し、ついでＣＴを給与したマウスも液体の蓄積に約２倍の上昇を示し（平均１９２；範囲１１９〜２９４）を示した。これに反しＴＣＩによりＣＴでワクチン接種されたマウスではチャレンジ後、無視できる腸腫脹を発症した（平均１０５，範囲８４〜１２０）、液体応答は重炭酸塩緩衝液単独を給与されたナイーブ群で観察された場合と区別できなかった（ｐ＜０．５）。
【０１２４】
経皮的に投与されたＣＳ６抗原に対するＣＴ及びＬＴの匹敵するアジュバント作用．ＥＴＥＣワクチンに対するアジュバントとしてのＬＴの使用は、ＬＴがＥＴＥＣ下痢の有意に多くの場合において原因物質であることから（Ｗｏｌｆら，１９９３）、また、そのため抗原及びアジュバントの両方として機能できることから、望ましいと考えられる。ｒＣＳ６のためのＣＴ及びＬＴアジュバントの相対的な強度を試験するために、マウスを１００μｇのｒＣＳ６及びある範囲（１０，２０及び１００μｇ）のＣＴ又はＬＴを用いて４週間隔で３回皮膚上に免疫感作を行った。得られた血清抗−ｒＣＳ６及びアジュバント力価は最終の免疫感作から２週後に評価した。期待されたように抗−アジュバント（ＣＴ又はＬＴ）ＩｇＧ力価はすべてのアジュバント用量で明らかであり、力価は高く、高用量（１００μｇ）の動物内では、最も一定していた。対照的に、ＣＳ６ならびにＬＴ／ＣＴ群のすべてが高い抗−ＣＳ６力価を生じたものの、応答は最低用量で最高であり（１０μｇ対１００μｇ）、一般的にＩＭ経路による前の経験に匹敵した。
【０１２５】
ｒＣＳ６及びＬＴにより免疫されたマウスからの血清抗体はネイティブなＣＳ６を認識する。ｒＣＳ６で免疫されたマウスはＥＬＩＳＡアッセイに使用した組換えタンパク質と反応する高力価の血清ＩｇＧを産生する。これらの結果は、ＴＣＩがＥＴＥＣ感染及び疾患を緩和するのに有効であることを示唆するが、重要なことは、誘発された抗体が大腸菌単離体中に存在するネイティブなＣＳ６（ｎＣＳ６）と反応するか否かであった。抗−ＣＳ６応答の特異性を試験するために、ｒＣＳ６で免疫したマウスからの血清を、ネイティブなＣＳ６タンパク質に対する反応性についてＥＬＩＳＡ及びイムノブロットアッセイで解析した。ＥＬＩＳＡでは、ｒＣＳ６及びＬＴに対して反応性を有する３種のサンプルそれぞれはネイティブなＣＳ６タンパク質に対して特異的であるが、ネイティブなＣＳ３タンパク質には特異的でないことが証明された。同様に、イムノブロットアッセイでは、ｒＣＳ６及びＬＴで免疫されたマウスはいずれも、免疫感作ｒＣＳ６抗原及び部分精製されたネイティブなＣＳ６の両者と反応し、免疫前血清とはほとんど若しくはまったく反応しなかった。ネイティブなＣＳ３対照抗原とは、いずれのマウス血清も反応しなかった。ｒＣＳ６により非経口的に免疫された（ＩＭ注射）マウスからの血清は、経皮的に免疫したマウスからの血清の場合と同様に、ネイティブなＣＳ６及びｒＣＳ６の両者に応答した。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＣ５７ＢＬ／６マウスの場合と同じ様式で応答した。すなわち、ｒＣＳ６を用いるＴＣＩでは、ネイティブな抗原を認識できる血清抗体が誘発された。
【０１２６】
ＬＴに対する抗体は、ＬＴによる経口チャレンジからマウスを能動的及び受動的に保護する。しかしながら、ＬＴはＬＴ仲介ＥＴＥＣ疾患の原因物質であり、ＣＴに酷似し、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）抗体（Ｃｌｅｍｅｎｔら，１９８８）と交叉保護を示すが、ＬＴ抗体を使用するＬＴの経口的チャレンジに対する直接保護はこれまで記載されていなかった。ＬＴ及びｒＣＳ６を用いＴＣＩにより免疫したマウスを記載のように経口的なＬＴによりチャレンジした。高レベルの抗−ＬＴ ＩｇＧが免疫感作マウスの血清中に検出された（ＢＡＬＢ／ｃについての幾何平均＝３６，２４９ＥＬＩＳＡ単位；Ｃ５７ＢＬ／６＝５４，７９２ＥＬＩＳＡ単位）。経口的トキシンのチャレンジには、チャレンジに対する感度の異なる２種のマウス株を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＢＡＬＢ／ｃに比べＬＴトキシンのチャレンジに対して高度に感受性であり、両株における保護は、遺伝的にさらに異なるセッティングで保護的効果が観察されることを示唆するものである。ＬＴチャレンジに対する有意な保護は両株でみられた（ｐ＜０．０５）。
【０１２７】
イヌ及びヒトＥＴＥＣ疾患の研究は、血清抗体が無傷な細菌ならびに単離されたトキシンによる下痢に対する保護に寄与することを示唆している（Ｐｉｅｒｃｅら，１９８０；Ｐｉｅｒｃｅら，１９７２；Ｐｉｅｒｃｅ ＆ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，１９７４）。この前提に呼応し、本発明者ら及び他の研究者は以前に、経皮的に誘発された血清因子が動物をＣＴによる致命的な鼻内チャレンジから保護することを報告している（Ｂｅｉｇｎｏｎら，２００１；Ｇｌｅｎｎら，１９９８ｂ）。すなわち本発明者らは、経皮的に免疫されたマウスにおけるトキシン誘発腸腫脹の防止には多分、抗毒素抗体と考えられる血清因子が寄与するものと仮定した。抗毒素抗体血清による宿主保護の役割を、ＴＣＩによって処置された動物からの血清を投与されたナイーブな受動免疫マウスの経口トキシンチャレンジによって誘発される腸腫脹を定量化することにより評価した。受動免疫の効果はＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス株の両者において評価した。ナイーブなマウスへのＬＴの経口投与は常に、肉眼検査で明らかな液体の蓄積を誘発した。これに対し、受動免疫されたマウスでは、緩衝液単独給与群において観察されたものに匹敵する程度の程度の無視できる液体の蓄積を生じた。すなわち、経皮的に免疫されたマウスからの抗体を与えた受動免疫マウスは、経口的なトキシンチャレンジの続発症から保護された。また、これらの結果は、経皮的に免疫されたマウスは動物をトキシンへの暴露から保護できる血清抗体を産生することが指示される。
【０１２８】
ＴＣＩによるＥＴＥＣ抗原に特異的な粘膜ＩｇＧ，ＩｇＡ及び分泌型ＩｇＡ応答。血清ＩｇＧ応答は、多くの感染物質に対する宿主の保護を伴うが、粘膜免疫応答は粘膜から取得された病原体とくに腸病原体たとえばＥＴＥＣの緩和及び防止に重要であると思われる。ｒＣＳ６を用いるＴＣＩが粘膜で検出可能な抗体応答を誘発するかどうかを決定するため、皮膚上でｒＣＳ６及びアジュバントで免疫したマウスから収穫した糞、肺及び膣標本においてＩｇＧ及びＳ−ＩｇＡ応答を分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＣＳ６単独、ＬＴ／ＣＳ６又はＣＴ／ＣＳ６により３回免疫した。ＣＳ６−特異的ＩｇＧを第三の免疫感作後９週に収集した糞、肺及び膣洗浄標本中で評価した。ｒＣＳ６単独での免疫感作では、高いＣＳ６−特異的ＩｇＧは糞、肺及び膣洗浄標本のいずれにも誘発されなかった。これに反し、ＣＴ／ＣＳ６群の動物では３例中３例が検出可能な抗−ＣＳ６ＩｇＧを肺及び膣洗浄標本中のいずれにも含有した。同様にＣＳ６特異的ＩｇＧ抗体はＬＴアジュバント群からの肺及び膣標本中、及びＣＴとＬＴアジュバント群からの糞標本中に観察した。しかしながら、応答はあまり一定しなかった。糞サンプルの収集方法が糞抗体における一致を起こさせた可能性がある。とくに応答が中等度である場合には、他の収集方法が検討されるべきである。
【０１２９】
局所的に産生されるＩｇＡは、通常分泌型鎖（ＳＣ）と会合したダイマータンパク質であり、上皮の膜を通過する輸送が可能である。ＴＣＩが分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）の産生を誘導できるかどうかを決定するために、動物を皮膚上でＬＴにより２回免疫感作し、抗原特異的ＩｇＧ，ＩｇＡ及びＳ−ＩｇＡ力価を粘膜標本においてＥＬＩＳＡで評価した。ナイーブな動物からの標本と比較して、免疫感作マウスの糞及び膣標本では、１０例中１０例でＬＴを用いる免疫感作により抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが誘発された。さらに重要なことは、試験した１０すべての糞及び膣標本でＳ−ＩｇＡが容易に検出されたことである。
【０１３０】
ＣＴ及びマラリアワクチン抗原の共投与後における保護抗毒素免疫の誘導。多重感染物質に対して標的化されたワクチン接種は期待寿命が比較的短く、２種以上の病原体による個体感染を伴う有病率及び死亡率が高い開発途上国においては望ましい。多重の無関係な感染物質に対する保護の誘発のためにＴＣＩが使用できるかどうかを決定するため、マウスをＣＴ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのタンパク質である、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１４２）のＣ−末端４２ｋＤａフラグメントで同時にワクチン接種した。ＣＴ（０，１０又は１００μｇ）及びＭＳＰ（１００μｇ）タンパク質を０，４，８及び１３週に皮膚に適用した。免疫後の力価が免疫前血清の１：１００希釈で測定されたＯＤの３倍であればマウスはＭＳＰ応答性であるとみなした。この基準に基づいて、ＣＴとＭＳＰで一緒に免疫したマウスからの血清中にＭＳＰを検出したが、対照群（ＭＳＰ単独）から又は免疫前に収穫した（前血液）血清では検出されなかった。二重に免疫したマウスにおける抗−ＣＴ抗体応答の有効性を評価するために、高レベルの抗−ＣＴ抗体を発生したＣＴ（１００μｇ）プラスＭＳＰ（１００μｇ）群からの動物にＣＴを経口的にチャレンジし、腸の腫脹（液体の蓄積）の程度を、ＭＳＰ単独でワクチン接種したマウスにおける誘発と比較した。皮膚上ＣＴ及びＭＳＰを一緒に免疫したすべての動物は、ＭＳＰ単独への暴露群に比べてかなり低い液体蓄積レベル（ｐ＜０．０１）を示した。しかも、免疫マウスからの脾臓及び排出リンパ節細胞は、排出リンパ節細胞及び脾臓中インビトロにおいて強力な抗原特異的増殖性応答を示し、これにはＣＤ４＋Ｔ細胞が寄与した。これらの結果は、アジュバントに対する抗体がＬＴ仲介疾患に対して防御を付与し、一方、他の抗原、たとえばマラリアワクチン抗原候補に対してはアジュバントとして機能することを示唆するものである。
【０１３１】
モルモットにおけるＥＴＥＣ抗原に対する免疫応答。ＴＣＩによる抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の誘導能力を評価するため、確立されたモルモットＡＳＣ動物モデルを選択した。モルモットはアジュバント及び抗原の上皮投与に応答する毒性反応の評価に慣用されるモデルである。モルモットの皮膚をＬＴ（１２〜１００μｇ）及びｒＣＳ６（２５〜２００μｇ）の増加させた用量に、日０，２１及び４２に暴露した。血清を血清学的検討のために日１，２０，４１及び５６に収集し、抗原及びアジュバントに対する抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。マウスによる研究の結果と同様に、ｒＣＳ６及びＬＴワクチンのＴＣＩ投与は、ＣＳ６及びＬＴ濃度に関して用量相関すると思われる、ＣＳ６及びＬＴ抗体応答の誘発を生じた（表２）。ＣＳ６に対する血清抗体の発見は、脾臓及び排出リンパ節組織におけるＣＳ６に特異的なＡＳＣの観察によって確認された。シャムＰＢＳ及びＣＳ６／ＬＴ免疫感作動物から新たに単離された細胞について実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセィでは、抗原に暴露された４匹中４匹で、ｒＣＳ６−特異的ＩｇＡ及びＩｇＭ産生細胞の数において有意な（ｐ＜０．０５）上昇が明らかにされた。抗原特異的ＩｇＡ及びＩｇＭ産生細胞も、現実に検出された細胞数は少なくあまり一致しない（表３）が、上昇したものと思われる。
【表２】
【０１３２】
３回の暴露の各々において、処置群あたり２匹のモルモットを、及び対照群から一匹を、病理学的研究のために準備した（表２）。高用量群の組織の完全な補体を組織病理学的評価に付した。残りの群（対照、低、及び中等度群）から収集した組織は皮膚と肝臓に限られた。高用量群の肉眼的壊死及び組織病理学的検討は、いずれかの暴露における試験製品の投与に帰せられる全身的損傷を証明できなかった。肝臓の壊死はＰＢＳ対照を含めてすべての動物に肉眼的に観察されたが、この所見には処置群との相関はなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパルギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ナトリウム、カリウム及び血中尿素窒素を評価し、すべての処置群で正常であることがわかった。
【０１３３】
ＬＴ／ＣＳ６によるＴＣＩは暴露した局所部位に限定される、最小限から軽度の炎症の変化のみを生じ、２５μｇ ＬＴ／５０μｇ ＣＳ６以上への用量の増加も局所反応の重症度に見るべき影響を与えなかった。典型的な所見は、少ない数の顆粒球及びリンパ球による真皮表層への浸潤（炎症）、ケラチン細胞の過形成による表皮の軽度な肥厚（アカントシス）、及び時に、表皮細胞が凝集力を失い、遊離のケラチン細胞を含む表皮内小胞の形成を生じる小さな病巣（棘細胞離開）である。３時点における最小な変化は、最低の用量群（ＬＴ １２μｇ／ＣＳ６ １２５μｇ）でみられ、ＰＢＳに暴露された対照では皮膚の変化は観察されなかった。マウス及びモルモットの両者では、免疫感作の反復による皮膚所見におけるの重症度には臨床的進行はなく、みられた場合でも、小胞は消散又は圧挫されるか、数日で自然に消散する。
【表３】
【０１３４】
ヒト実施例
年齢１８〜４５歳の健康な男性及び女性ボランティアを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．のメトロポリタン地域から徴集した。除外基準には前年のＥＴＥＣ流行地域への旅行、最近の旅行者下痢歴、妊娠、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染、及び抗生物質に対するアレルギーが包含された。
【０１３５】
ワクチンの成分は、ＬＴと混合したＣＳ６抗原から構成された。ＣＳ６は現在の優れた製造実務（ＧＭＰ）下でＦｏｒｅｓｔ Ｇｌｅｎ Ｐｉｌｏｔ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて産生された。ＣＳ６の産生のために用いた細菌株は大腸菌株ＨＢ１０１から構築され、ＣＳ６の発現に必要な４−遺伝子オペロンを含有するプラスミドを組換え技術によって挿入された。ＣＳ６遺伝子はＥＴＥＣ株Ｅ８８７５（Ｗｏｌｆら，１９９７）からクローン化された。ＣＳ６の産生における主要な工程には、細菌の発酵；接線流ろ過、それに次ぐ硫酸アンモニウムによる沈殿による発酵培養液からのＣＳ６の精製；バルクＣＳ６タンパク質のリン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）溶液中−８０℃での中間的保存；解凍、攪拌及びバイアル中への分配；及び−８０℃での保存が包含される。ＣＳ６はアルミニウムクリンプで封じた灰色のスプリットラバーストッパーを施した２ｍＬの血清バイアル中に精製タンパク質として処方された。各バイアルには、ＰＢＳ中０．９ｍＬ（１．３ｍｇ／ｍＬ）のＣＳ６タンパク質が含有された。大腸菌のネイティブなＬＴは現在のＧＭＰ下Ｓｗｉｓｓ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＶＩ）で製造された。ＬＴは大腸菌株ＨＥ２２ＴＰ２３５Ｋｍから産生された。ＬＴは凍結乾燥粉末として供給された。各バイアルは５００μＬの凍結乾燥したＬＴを含有し、１ｍＬの滅菌蒸留水で再構築された。ワクチン接種グループによるアジュバント（ＬＴ）及び抗原（ＣＳ６）の用量は表４に示す。
【０１３６】
ワクチンは３用量で投与された。最初の用量は日０に投与され、第二及び第三の免疫感作は最初の免疫感作から、それぞれ２８及び８４日目に行われた。ワクチンは、２×２インチの綿のガーゼマトリックス（２層Ｋｅｎｄａｌｌ＃２５５６）から構成される半閉塞性パッチを用いて経皮的に投与された。これは２×２インチのポリエチレン（Ｓａｒａｎ Ｗｒａｐ）のバッキングでカバーされ、さらにこれは４×４インチのＴｅｇａｄｅｒｍ包帯（半閉塞性、３Ｍ ｃａｔ＃１６１６）で覆った。
【０１３７】
ワクチン接種の際には、ワクチンを、５００μＬの滅菌食塩水中で適用し、各上腕に分割用量として投与した。各分割用量は相当する用量のＣＳ６（抗原）単独又は２５０μｇのＬＴ（アジュバント）との組み合わせを含有した。上腕を診察テーブル上に半分伸ばしたように位置させ、イソプロピルアルコール（７０％）の綿棒で５回軽くこすって準備した。綿のガーゼを各上腕に置き、免疫溶液をガーゼにシリンジで適用した。ついで、含浸された綿のガーゼ上にポリエチレンのバッキングを置き、Ｔｅｇａｄｅｒｍ包帯で覆った。パッチの適用後２０分、観察のためにボランティアは研究クリニックに留まらせた。ボランティアは、パッチが装着されている間は、パッチに触れないこと、また激しい肉体的活動には従事しないことを指示された。適用６時間後（範囲：４〜８時間）にパッチを除去させた。ついで免疫部位を５００ｍＬの水で濯ぎ、軽く叩いて乾燥させた。ボランティアには、夜には風呂又はシャワーを使用してもよいが、免疫部位を石鹸でひどく擦ることは避け、皮膚に異常な刺激を与えないように指示された。ボランティアは最初の免疫感作から２８及び８４日後に再度免疫感作された。各ボランティアは各免疫感作で、同じ用量のワクチンを投与された。
【０１３８】
ボランティアは各投与後２０分間、即時性の有害作用の発症について観察した。ボランティアには、ワクチン接種の投与後に観察される兆候及び症状を記録するために日記を与えた。記録された症状は、軽度（気付くことができる）、中等度（日々の活動に影響）又は重度（日々の活動の停止）に分類した。ボランティアは臨床的査定及び副作用の可能性評価のために、２４及び４８時間に評価した。ワクチンの皮膚反応の徴候を認めたボランティアには、さらに７２時間に臨床的査定のためにクリニックに戻るように指示した。ついでボランティアは、副作用が完全に治まるまで必要に応じて追跡した。免疫感作部位に皮膚の発赤を発症した１例のボランティアは皮膚のバイオプシーを実施するか尋ねられた。このバイオプシーは別のインフォームドコンセントの書類に基づき、標準の操作に従って皮膚科医によって行われた。
【０１３９】
ワクチン抗原に対する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の免疫応答は、以前の研究で、ＡＳＣ応答が粘膜腸免疫応答と相関することが示されているので（Ｗｅｎｎｅｒａｓら，１９９２）、この研究の免疫学的終点として選択された。静脈血サンプルはボランティアから、免疫感作前の日０、及び最初の免疫感作後、日７，２８，３５，５６，８４，９１，９８及び１１２に取得した。血液標本はＥＤＴＡ−処置した試験管のＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて収集した。末梢血の単球細胞（ＰＢＭＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）上勾配遠心分離によって単離し、総及びワクチン特異的なＩｇＡ及びＩｇＧ ＡＳＣ数をＥＬＩＳｐｏｔ法（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙら，１９８８；Ｗｅｎｎｅｒａｓら，１９９２）によってアッセイした。ニトロセルロース底９６−ウエルプレート（Ｍｉｌｌｉ−ｔｉｔｅｒ ＨＡ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の個々のウエルを、０．１ｍＬの精製ＣＳ６（２０μｇ／ｍＬ）又はＧＭ１ガングリオシド（０．５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、一夜４℃でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後に、ＧＭ１でコートしたウエルをＬＴ（０．５ｇ／ｍＬ）に３７℃で２時間暴露した。ＰＢＳで洗浄後、プレートを、５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全ＲＰＭＩメジウムでブロックした。完全ＲＰＭＩメジウム中ＰＢＭＣを２×１０７生存細胞／ｍＬに調整した。最終の０．１ｍＬのＰＢＭＣ懸濁液を各ウエルに加え（ウエルあたり１×１０６ＰＢＭＣを加えた）、プレートを、５．０％ＣＯ２中３７℃で４時間インキュベートした。プレートを洗浄し、一方はアルカリホスファターゼ（ＩｇＧ）他方は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩｇＡ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ）と抱合した別のアイソタイプ特異性を有する２つの親和性−精製ヤギ抗−ヒト免疫グロブリン抗体混合物と４℃で一夜インキュベートし、適当なクロモーゲン酵素基質（Ｓｉｇｍａ）に暴露した。個々の細胞により分泌される抗体の地帯に相当するスポットを三重のウエルから倍率４０×下に計数し、データを１０６ ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞数として表した。
【０１４０】
以前に記載されたように（Ａｈｒｅｎら，１９９８；Ｊｅｒｔｂｏｒｎら，１９９８；Ｊｅｒｔｂｏｒｎら，２００１）、本発明者らは陽性なＡＳＣ応答を、ベースラインサンプルにおける１０６ＰＢＭＣあたりのＡＳＣ数が≧０．５である場合、１０６ＰＢＭＣあたりのＡＳＣのベースライン値を越えた≧２倍の上昇として定義した。ＡＳＣ数が１０６ＰＢＭＣあたり免疫感作前に０．５未満であった場合、投与後の値が１０６ＰＢＭＣあたり＞１．０であれば陽性とみなした。
【０１４１】
免疫前及び各免疫感作後日１４及び２８日に、血清抗体力価を測定するために、ボランティアから静脈血液サンプルを取得した。ＬＴに対するＩｇＡ及びＩｇＧ抗体力価をＧＭ１−ＥＬＩＳＡ法（Ｊｅｒｔｂｏｒｎら，１９９８，Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍら，１９８３）により、ＣＳ６に対する力価は前述のＥＬＩＳＡ法（Ｈａｌｌら，２００１；Ｓｔｏｌｌら，１９８６）によって測定した。ＬＴ（ＳＳＶＩにより提供された）及びＣＳ６（ＧＭＰ，ロット０６９５，ＷＲＡＩＲ）を固相抗原として使用した。ＥＬＩＳＡアッセイに用いたＬＴ及びＣＳ６にはワクチン調製物について用いたのと同一ロットを使用した。個々のマイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）をＧＭ１ガングリオシド（０．５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）により室温で一夜コーティングするか、又はＣＳ６の調製物１．０μｇ／ｍＬの０．１ｍＬにより３７℃で一夜コーティングした。ＧＭ１で被覆されたウエルをＰＢＳで洗浄し、０．１ｍＬのＬＴ（０．５μｇ／ｍＬ）３７℃で２時間インキュベートした。０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）でブロックしたのち、血清サンプルを３倍希釈系列（最初は１：５に希釈）で希釈し、ついで室温で９０分間インキュベートした。結合した抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合したウサギ抗−ヒトＩｇＡ又はＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）を添加し、９０分間室温でインキュベートしてついでＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）を加え、証明した。終点力価を、バックグランド（４５０ｎｍにおける吸収）を０．４越える４５０ｎｍのＯＤを与えるサンプルの内挿希釈として指定した。力価を日々の変動を補償した各試験に含まれる対照標本に関連して調整した。両抗原について、同じボランティアからの投与前及び投与後血清サンプルを常に一緒に試験した。各サンプルに帰せられる抗体力価は、異なる日に実施した二重の測定値の幾何平均で表した。互いの終点力価＜５は、計算の目的で２．５に割り当てた。各ＥＬＩＳＡの方法論的誤差の本発明者らの計算に基づいて、本研究の前に、本発明者らは有意な応答（セロコンバージョン）を免疫感作前と処置後の標本の終点力価間の≧２倍の上昇と定義し（Ｊｅｔｂｏｒｎら、１９８６）、免疫感作後の相互力価≧１０の基準を加えることとした。
【０１４２】
３回のスケジュールされたワクチンの投与を受けたボランティアにはすべて、投与後の安全性及び免疫原性分析が行われた。比率はα＝０．０５，検定力＝０．８０で、２×ｎχ２試験を用いて比較した。セルの１つに含まれる数が５未満の場合は２×２表でＦｉｓｈｅｒの直接テストを用いた（Ｓａｈａｉ ＆ Ｋｈｕｒｓｈｉｄ、１９９５）。平均ＡＳＣ数及び平均血漿抗体の力価の上昇倍率は、ワクチン接種の各連続投与のブースター効果を評価するために、別個にＷｉｌｃｏｘｏｎ順位試験を用いた（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ＆ Ｕｒｙ，１９６９）。すべての統計学的試験は両側検定で行った。
【０１４３】
すべてのボランティアからインフォームドコンセントを取得し、この試験の実施に際してはＵ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅのヒト使用ガイドラインに従った。３３例のボランティアが組み込まれ、少なくとも１回、試験ワクチンを投与された。プロトコールはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｕ，Ｓ，Ａｒｍｙによって承認された。ボランティアは年齢２１〜４４歳、女性１７例及び男性１６例；黒人１５例、白人１６例及びアジア人２例であった。３３例のボランティア中、試験に無関係な理由（彼らの仕事のスケジュールにおける都合（４）、Ｄ．Ｃ．メトロポリタン地域からの移動（２）、及び不法薬の使用のために地方の診療所に入院（１））から７例が試験を完了しなかった。２６例のボランティアが３回のスケジュールされたワクチン投与を受け、ワクチン投与後の追跡訪問を完了し、これらのボランティアに関するデータを示した。これらのボランティアは年齢２１〜４４歳、女性１３例及び男性１３例、黒人１２例、白人１２例及びアジア人２例であった。ワクチンの用量によるボランティア数は表４に示す。
【表４】
【０１４４】
ＬＴ／ＣＳ６の組み合わせを投与されたボランティア中７４％（１４／１９）がワクチン接種部位に丘疹状の発赤を発症した。ＣＳ６単独を投与されたボランティアには発赤の発症はなかった。反応は１３例のボランティアで軽度、１例のボランティアで中等度であった。白人のボランティアでの発赤の発症は、黒人のボランティアの場合よりも有意に多かった（１１／１１対３／８，ｐ＜０．００５）。７例の反応は第二投与後に、１４例では第三の投与後に発症した。第二の投与に関連して発赤を生じた７例のボランティアはすべて第三の適用後にも発赤を発症した。臨床的診断は接触性皮膚炎（遅延型過敏症、ＤＴＨ）であった。典型的な発赤を示した１例のボランティアは、ＬＴ／ＣＳ６の第三の投与後に、冒された皮膚のバイオプシーを受けた。バイオプシーでは、限局性の海綿状態を伴う軽度の皮膚慢性炎症（リンパ球）を示した。病理学的診断はＤＴＨの特徴を有する亜急性海綿体皮膚炎であった。発赤は通常、パッチ適用後２４時間以内に始まっていた。第二の投与後における発赤の発症は平均９日間（範囲１〜１４）、第三の投与による発赤は平均６日間（１〜１１）続いた。ボランティアには、ワクチンに関連すると思われる症状の緩和のために０．１％トリアムシノロンクリームが提供された。第一又は第二の免疫感作後にクリームを使用した対象はなかった。第三の投与後に発赤を生じた８例の患者でトリアムシノロンによる処置が行われた。ワクチンの用量により比較した場合、局所症状（掻痒）又は徴候（紅斑、丘疹）の外観及び重症度には明らかな臨床上の差はなかった。トリアムシノロンクリームの使用者と非使用者の間で比較した場合、血清学的免疫応答に統計的有意差はなかった。
【０１４５】
アジュバント及び抗原の両者を投与されたボランティアにのみ免疫応答が検出されたが、ＣＳ６単独を２回投与されただけで１例のボランティアが、単一の時点で、陽性の抗−ＣＳ６ＩｇＡ応答を示した（ただし、ＣＳ６ＩｇＧは陽性ではない）。アジュバント及び抗原の組み合わせを投与された４群の間では、ＬＴ及びＣＳ６に対する血清抗体又はＡＳＣ応答の頻度及び大きさに有意差はなかった。したがって、さらに統計的解析及び提示を行うためにデータをプールした。ＬＴを投与されたすべてのボランティア（１００％）が血清抗−ＬＴ ＩｇＧ応答を示し、９０％が抗−ＬＴ ＩｇＡを産生した。抗−ＣＳ６血清抗体応答率は抗−ＬＴ応答率よりも低く、抗−ＣＳ６ＩｇＧ及びＩｇＡ力価に２倍以上の上昇を示したボランティアはそれぞれ６８％及び５３％であった。ＬＴ及びＣＳに対する血清抗体における個々のピークの上昇倍率は図１に示す。ＬＴ及びＣＳ６の両者に対する強固な応答は、血清抗体とともに観察されたが、応答の大きさには著しい変動があった。ＬＴに対する抗−ＬＴ ＩｇＧの平均は、ほぼログだけ、以前に記載された応答の平均倍率（Ｇｌｅｎｎら，２０００）を超え、ＣＳ６に対する応答よりも大きかった。
【０１４６】
血清抗体応答の速度論を図２に示す。各群についての投与後血清抗体力価を合わせて、幾何平均力価として９５％信頼間隔とともに示す。ＬＴに対する免疫応答の速度論は、ＬＴに対する応答の強力な始動とブースターを示すＣＳ６に対する応答のキネティクススとは著しく異なっている。ＣＳ６に対する応答には、主にブースターが認められた。第二及び第三いずれの免疫感作後の両方にプールした抗−ＣＳ６ＩｇＧ及びＩｇＡ応答には有意差が示唆されるように、ＣＳ６に対する記憶応答があるように思われる。
【０１４７】
ＡＳＣ応答率及び抗原特異的ＡＳＣ×１０６ＰＭＢＣを表５に示す。ＣＳ６及びＬＴに特異的なＡＳＣの両者が検出された。特異的ＡＳＣの型によるそれぞれ個々のレスポンダーに関するピーク数ＡＳＣの時間及び大きさを図３に示す。大部分のレスポンダーにおいては、ピ−クＡＳＣは第二又は第三の免疫感作後に検出された。抗−ＣＳ６ ＩｇＧ ＡＳＣが認められた７人のすべてのボランティアは、第三の免疫感作後にそれらのＡＳＣのピーク数を示した。
【表５】
【０１４８】
腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、開発途上国における小児の下痢の最も一般的な原因の一つである。それはまた、旅行者下痢の主な原因である。疾患の臨床的な表出は、１又は２種のエンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）及び免疫原性は弱い熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）を分泌する細菌によって惹き起こされる。いずれも腸に作用し、疾患の特徴である水性の下痢を生じる。感染に要求されることは、ＥＴＥＣ生物体が腸の上皮に付着する能力を有することである。これは線毛と呼ばれる外膜上の構造を介して行われる。一クラスとしてこれらの構造は抗原的に区別され、コロニゼーション因子抗原（ＣＦＡ）と呼ばれる。今日までに２０の異なるコロニゼーション因子が同定されている。最も広くいきわたり、ヒトに疾患に関連する因子には、ＣＦＡ／Ｉ，ＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶが包含される。ＣＦＡ／ＩＩは大腸菌表面抗原１（ＣＳ１），ＣＳ２及びＣＳ３と呼ばれる３種の別個の抗原からなる。ＣＦＡ／ＩＶは３種の抗原、ＣＳ４，ＣＳ５及びＣＳ６からなる。
【０１４９】
開発途上国におけるＥＴＥＣ感染の発症率の年齢に関連する低下は、保護免疫の発生に起因するものと考えられてきた。疫学的研究では、感染した小児は同じ化合物株による再感染に対し抵抗性になる（保護される）ことが例証されている。実験的に感染させたボランティアでは同種の株による再チャレンジから保護されることが示されている。異種のＥＴＥＣ株でチャレンジされたヒトボランティアは、臨床的疾患に対して防御されない。
【０１５０】
ＣＦＡは、ＥＴＥＣワクチンの評価のための候補としての可能性が同定されている。しかしながら、この自然の感染に対する広範囲のカバーのためには、ＥＴＥＣワクチンは多重のコロニゼーション因子抗原から構成されなければならない。最も広い範囲をカバーするためには（８０〜９５％）、数種のＣＦＡ（ＣＳ３，ＣＳ６及びＣＦＡ／Ｉ）及びエンテロトキシン（ＬＴ及びＳＴ）から構成される多重ワクチンの開発が要求される。経口投与は可能であるが、これらのタンパク質抗原は、胃内の低いｐＨでの加水分解及び酵素的分解に感受性である。しかも、経口ワクチンには大用量を要し、製品としての実用性がない。エンテロトキシン（ＬＴ及びＳＴ）は他の経路たとえば経口、経鼻、肺内、経直腸又は非経口経路による投与した場合、反応原性（下痢性）及び炎症性であるから、ＥＴＥＣワクチンは他の投与経路に適用できない。
【０１５１】
ＴＣＩの有効性及び安全性は、このワクチン接種の問題にも適用された。以下の実施例において、ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ及びＳＴの多価の組み合わせが、透過の増強下又は増強を行わないで、角質層を通過して効果的送達が可能であり、それらは多価ワクチンの各成分に対する免疫応答を誘発することが証明される。ＴＣＩによるワクチン接種は、低用量の抗原（ＣＳ３，ＣＳ６及びＣＦＡ／）を要求し、免疫応答は同時に共投与されるアジュバントによって有意に増強される。ＴＣＩは、安全にまた重篤な有害副作用を誘発することなく実施することができる。本発明者らは、経皮免疫感作のための抗原及びアジュバントの有効な用量、効果的な投与基準、ワクチンの皮膚内の抗原提示細胞への至適送達、安定な医薬的に許容される処方を記述する。
【０１５２】
材料及び方法
主要な研究は、ＣＦＡ及びＬＴの複合混合物によるＴＣＩのための至適方法を確立するために実施された。以下の研究の目的はＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ及びＳＴａの混合物によるワクチン接種が実行可能であることを証明することであった。これらの研究では、成熟Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢）を使用した。
【０１５３】
マウスは、尾の基部において背腹側表面を、ワクチン接種２４〜４８時間前に剃毛した。すべてのマウスはケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）及びキシラジン（１００ｍｇ／ｍＬ）の混合物２５μＬの腹腔内注射によって麻酔した。剃毛部位を食塩水又は１０％グリセロールと７０％イソプロピルアルコールの混合物による水和で前処置した。まだ完全に水和されている間に、２つの方法の１つで皮膚の最外層、角質層（ＳＣ）を穏やかに処置して破壊した。テープ剥離は３Ｍ又はＤ−ｓｑｕａｍｅ（商標）接着テープを処置表面に適用し、ついでテープを穏やかに除去することを１０回実施した。別法として、水和した皮膚を紙やすり（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は軽石を含む綿棒（ＰＤＩ／ＮｉｃｅＰａｋ）で穏やかに研摩して前処置した。皮膚表面を、上下動を用いて１０回緩衝した。接着性バッキングに固着させたＮｕ−ガーゼパッド（約１ｃｍ２）に、その適用の直前に、ＣＳ３（２５μｇ）、ＣＳ６（２５μｇ）、ＣＦＡ／Ｉ（２５μｇ）、ＳＴａ（８μｇ）及びＬＴＲ１９２Ｇ（２５μｇ）の様々な組み合わせを含有する２５μＬ容量を負荷した。ワクチン負荷パッチは一夜（約１８時間）適用し、除去し、皮膚を水で濯いだ。すべてのマウスは２週の間隔をあけて２又は３回、日０，１４及び２８に投与された。
【０１５４】
末梢血を尾静脈を裂いて得られた。血液は試験管中に回収し、凝血させ、遠心分離し、血清を収集した。サンプルは日０（免疫前）、日１４、日２８及び日４２（第三の投与後２週）に収集した。血清はワクチン接種抗原（ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ及びＳＴａ）及びアジュバント（ＬＴＲ１９２Ｇ）に対する抗体について評価するまで−２０℃で凍結した。後者はＵ．Ｓ．Ｎａｖｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅによって提供された。
【０１５５】
糞サンプルは日３５（第三の免疫感作後７日目）に収集した。新鮮なサンプルを各マウスから収集し、ＰＭＳＦ（食塩水中３μｇ／ｍＬ）で抽出した。サンプルを攪拌（Ｖｏｒｔｅｘミキサー）して懸濁液を形成させ、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）により澄明にした。澄明な上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法による粘膜ＩｇＧ及びＩｇＡの評価まで−２０℃に保存した。
【０１５６】
血清ＩｇＧの評価には、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。９６ウエルプレートをウエルあたり１μｇ抗原／１００μＬで一夜℃においてコートした。リン酸緩衝食塩溶液及びＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、プレートを１００μＬのブロッキング緩衝溶液（０．５％カゼイン及び０．５％ウシ血清アルブミン）により室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、サンプルを、系列希釈（血清サンプルは３倍系列希釈、糞サンプルは２倍系列希釈）で希釈した。プレートを一夜４℃でインキュベートした。プレートをＰＴ緩衝液で洗浄し、ＨＲＰ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）抱合至適希釈（１：２，０００）ヤギ抗−マウスＩｇＧ又は抱合ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｚｙｍｅｄ）１００μＬを各ウエルに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＴ緩衝液で洗浄し、１００μＬの基質ＡＢＴＳ（ＫＰＬ）をウエルに加え、３０分反応させた。１００μＬの１％ＳＤＳ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を加えて反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより４０５ｎｍで光学密度が読み取られ、データはＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ２．４ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解析した。
【０１５７】
ホルマリン不活性化ＥＴＥＣ全細胞に対する血清抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した。腸毒素性大腸菌株Ｅ２４３７７８をアガールプレート上で培養し、細胞を収穫し、２．５％ホルマリン中、室温で一夜不活性化した。ウエルを５×１０５の死滅全細胞（ＥＷＣ）によりコートした。プレートは他の抗原についての記載と同様にして調製した。ＥＷＣに対する血清抗体は上述の方法で測定した。
【０１５８】
マウスを二酸化炭素で窒息させて屠殺し、脾臓と鼠蹊部リンパ節を摘出した。組織を、ＲＰＭＩ１６４０メジウム（Ｇｉｂｃｏ）を含有する試験管中、氷上に維持した。組織を５ｃｃシリンジのバレルで磨砕して単一細胞懸濁液を調製した。組織屑を試験管の底に沈着させ、細胞懸濁液を別の試験管に移した。細胞をＲＰＭＩ１６４０メジウムで２回洗浄し、培養メジウム（ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＦＢＳ，２ｍｍｏｌ Ｌ−グルタミン及び２ｍｍｏｌペン−ストレップ）中に懸濁した。
【０１５９】
９６ウエルろ過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）をＰＢＳ中３μｇ／ｍＬの抗原１００μＬでコートし、一夜４℃でインキュベートした。プレートを３回ＰＢＡで濯ぎ、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で１時間ブロックし、ＢＳＡで濯いだ。細胞を、培養メジウム（ＲＰＭＩ １６４０，１０％ＦＢＳ，２ｍｍｏｌ Ｌ−グルタミン及び２ｍｍｏｌペン−ストレップ）中各ウエルあたり１００μＬで分配し、プレートを加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した。細胞を水による低張ショックにより溶解した。１００μＬのビオチン抱合ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はビオチン抱合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＰＢＳ中２％ＢＳＡでの１：２０００希釈液を加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１００μＬのアルカリホスファターゼ標識アビジンＤ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）１：２０００を各ウエルに加え、さらに２時間室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）をウエルに加えて、プレートを室温で５〜３０分間、青色のスポットが現れるまでインキュベートした。プレートを蒸留水で洗浄して反応を停止させた。抗原特異的ＡＳＣを青色のスポットとして可視化し、解剖顕微鏡で計数し、細胞１０６あたりのＩｇＧ−ＡＳＣ又はＩｇＡ−ＡＳＣとして記録した。
【０１６０】
ＥＴＥＣエンテロトキシンＬＴに対する中和抗体の特性を解析するためのインビトロアッセイ
大腸菌からの熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）はＡ及びＢサブユニットを有する多重サブユニットとして産生される。エンテロトキシンの宿主細胞膜受容体（ＧＭ１ガングリオシド）との初期の相互作用ののち、Ｂサブユニットは細胞膜を貫通して真核動物細胞内へのＡサブユニットの透過を容易にする。化学的還元により、このＡサブユニットは２つの小さいペプチドに解離する。Ａ１は、上皮細胞の基底外側表面上のアデニレートサイクラーゼ酵素複合体における刺激ＧＴＰ−結合タンパク質のＡＤＰ−リボシル化を触媒する。これはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの上昇を生じる。このｃＡＭＰの上昇は水及び電解質の小腸への分泌を惹き起こし、臨床的疾患を生じる。
【０１６１】
細胞培養液中において、ＬＴは高い親和性（ＫＤ＝７．３×１０−１２）でＧＭ１ガングリオシド受容体に結合し、これは多くの真核動物組織及び細胞で発現される。ＬＴは細胞培養中、多くの真核動物細胞（たとえばＣＨＯ及びＹ１）に対して著しい形態学的変化を生じる。この性質を用いて、ＴＣＩによって誘発された抗体がＧＭ１ガングリオシド受容体へのＬＴの結合を阻害（中和）するかどうかを決定するためのインビトロアッセイ方法が開発された。これらの研究では、ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＦ１２メジウム中で培養した。細胞は、３７℃，５％ＣＯ２で対数期の増殖を維持させた。細胞はＴフラスコからトリプシン化し、９６ウエルプレートに、１％ＦＣＳを補充したＦ１２の０．２ｍＬ中５×１０３でプレーティングした。ＬＴで経皮的にワクチン接種し、ＥＬＩＳＡ法でＬＴに対する抗体を持つと決定されたボランティアから、免疫前（日０）及び免疫後（日３２１）の血清を収集した。これらの血清は培養メジウムで１：４希釈し、一連に２倍希釈し、１：８１９２まで希釈した。等容量の希釈血清をＬＴと１時間３７℃で混合した。５０μＬの血清／ＬＴ（６．５ｎｇのＬＴ含有）を、新たにプレーティングしたＣＨＯ細胞培養物（１５μＬのメジウム中５×１０３細胞）の二重サンプルに移した。細胞を３７℃で２４時間培養した。培養期の終了時に、メジウムを除去し、細胞をＦ１２で洗浄し、メタノールで固定し、ギムザ染色で染色した。培養物を倒立光顕微鏡で調べ、培養物を正常な外観又は延長した形態に分類した。結果は、培養物内で９０％を超えて細胞の延長をブロック（中和）した、血清の最低希釈として表した。
【０１６２】
免疫原性及び皮膚を通しての送達を改善するため、熱安定性トキシン（ＳＴａ）のＬＴ又は他の運搬タンパク質に対する抱合
ＳＴａ（ロット１１８４Ａ，Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）のＬＴへの抱合は２工程を含む。第一の工程はＬＴのマレイミド活性化であり、４００μｇのＬＴ（ロット２００ １００，Ｂｅｒｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を４００μＬのリン酸緩衝０．１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した。１６０μＬのスクシンイミジル１−６［（β−マレイミドプロピプロピオンアミドヘキサノエート）］（ＳＭＰＨ，Ｐｉｅｒｃｅ）を約８μＬのＬＲ溶液に添加し、９０分間室温でインキュベートした。反応混合物を脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上でＰＢＳを用いて脱塩し、分画を収集した。活性化ＬＴピークをプールし、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりタンパク質を測定した。第二の工程は抱合であり、８０μｇのＳＴａをマレイミド活性化ＬＴと混合し、一夜４℃でインキュベートした。ＳＴ−ＬＴ抱合体を５００ｍＬのＰＢＳ緩衝液に対して透析した。
【０１６３】
精製したＳＴａ（１００μｇ）を、１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）及び０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含有する反応混合物１ｍＬ中の８００μｇのニワトリ卵オバルブミン（ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ）にカップリングさせた。反応混合物をリン酸緩衝食塩溶液（２０ｎｍ，ｐＨ７．２，ＰＢＳ）に対して４時間透析した。
【０１６４】
抱合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて、オバルブミン及びＬＴ−Ｂの分子量におけるシフトによって確認した。各サンプルは４×サンプル緩衝液（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、１００℃に５分間加熱し、ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）を分析した。電気泳動後、タンパク質のバンドを、銀染色キット（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可視化し、抱合体の分子量を、ゲル上を流した内部対照標準との比較で測定した。
【０１６５】
例１．ＥＴＥＣコロニゼーション因子による経皮的及び皮内ワクチン接種に対する血清ＩｇＧ応答の比較
この研究の目的は、ＣＳ３及びＣＳ６による経皮的ワクチン接種により誘発される免疫応答を、皮内ワクチン接種の場合と比較することを目的とする。グループのマウスを１０回のテープ剥離により前処置し、角質層を除去した。５匹のマウスの群を、１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを使用し又は使用しないで、ＣＳ３（２５μｇ）、ＣＳ６（２５μｇ）で経皮的にワクチン接種した。パッチにはＣＳ３もしくはＣＳ６単独、又はＣＳ３プラスＬＴＲ１９２ＧもしくはＣＳ６プラスＬＴＲ１９２Ｇを含有する容量２５μＬを負荷した。パッチは一夜（約１８時間）適用した。マウスの別の群には２５μｇのＣＳ３又はＣＳ６を皮内注射した。すべてのマウスに３回のワクチン接種（日０，１４及び２８）を行った。第三の免疫感作の２週後に血清を収集し、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体について評価した。
【０１６６】
図４に示す結果は、ＣＳ３及びＣＳ６は経皮的に皮膚に適用した場合、血清抗体を誘発することを証明する。この血清抗体応答は低用量のＬＴＲ１９２Ｇ（１０μｇ）を共投与することによってさらに増強された。図４に示すように、ＣＳ３及びＣＳ６に対する血清力価は、ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントの付加によって、それぞれ２倍及び１２倍に上昇した。ＣＳ３の皮内注射は上皮への適用（１：３０，５８１）に比べて高い力価応答（１：２７３，６９５）を誘発したＣＳ６での経皮的ワクチン接種はきわめて高い力価の抗体を誘発した（１：１８８，９８４）。これはＣＳ６の皮内注射（１：１７，０３６）に比べて１０倍大きかった。さらに、ＬＴＲ１９２Ｇを単独でも、又はＣＳ３もしくはＣＳ６との組み合わせで上皮に適用してもＬＴＲ１９２Ｇに対する高い抗体力価が検出された。これらの結果は、高分子量のＥＴＥＣ抗原（ＣＳ３は約３メガダルトン、ＣＳ６は約１メガダルトン）は、角質層を除去する前処置を施した皮膚にパッチとして投与した場合、免疫原性であることを示している。免疫応答の大きさはアジュバント（ＬＴＲ１９２）の共投与で著しく増強された。変異体ＬＴＲ１９２Ｇも単独で又はＣＳ３もしくはＣＳ６との組み合わせで上皮に適用した場合、それ自身に対する高力価の抗体の産生を誘発した。
【０１６７】
例２．ＥＴＥＣサブユニットワクチンの２価及び３価の組み合わせによる経皮的ワクチン接種
皮膚は例１に記載のように前処置した。マウスは２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ １９２Ｇ；２５μｇ ＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇ；又は２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇのカクテルを含有するパッチで経皮的にワクチン接種した。結果は図５に示す。これらの結果は３価のワクチンの組み合わせ（ＣＳ３／ＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇ）が、２価ワクチン（ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ及びＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇ）に匹敵する血清ＩｇＧ力価を誘発することを証明する。
【０１６８】
これは、多重ＥＴＥＣサブユニットワクチンを単一のパッチ中に組み合わせるにとの実行可能性、及び多重サブユニットワクチンがいずれのサブユニット（すなわち、ＣＳ３又はＣＳ６）に対する免疫応答の大きさにマイナスに影響することなく共投与できることを明瞭に証明するものである。
【０１６９】
例３．ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントを共投与又は共投与しない場合のＣＳ３／ＣＳ６を用いたＴＣＩ
次の研究は、上皮投与されたＣＳ３及びＣＳ６の組み合わせに対する免疫応答を、ＬＴＲ１９２Ｇがアジュバントするか否かを決定するために行われた。動物を例１に記載のように前処置し、ワクチンを負荷したパッチを前処置した皮膚（尾の基部）に適用した（一夜）。図６に示した結果は、ＣＳ３及びＣＳ６に対する免疫応答が、３価の混合物に対する１０μｇのＬＴの添加によって、それぞれ５倍及び２４倍に著しく増強されたことを証明する。これは、３種のＥＴＥＣ抗原による経皮的ワクチン接種が実行可能であることを確立する。ＬＴＲ１９２Ｇは重要なアジュバント及び抗原であり、それはＣＳ３に対する免疫応答を５倍まで及びＣＳ６に対する免疫応答を２４倍まで上昇させた。
【０１７０】
例４．ＣＳ３及びＣＳ６分子は抗原的に異なっている
ＣＳ３及びＣＳ６に対する免疫応答の特異性を決定した。マウスをテープの剥離によって前処置し、パッチを２回、一方は日０に他方は日１４に投与した。動物のグループを２５μｇのＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ又は２５μｇＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇでワクチン接種した。第二の免疫感作後１０日目（日２４）に血清を収集し、ＣＳ３及びＣＳ６に対する抗体について評価した。図７に示す結果は、ＣＳ３でのワクチン接種がＣＳ６と交叉反応性を示さない特異的抗体を誘発することを証明する。同様に、ＣＳ６に対する抗体はＣＳ３を認識しなかった。これらの結果は、ＣＳ３及びＣＳ６に対する免疫は高度に特異的であり、腸毒素原性大腸菌株に対する広範囲の保護を意図するＥＴＥＣワクチンは多価であることが必要なことを明瞭に示している。
【０１７１】
例５．ＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇを用いるＴＣＩはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラス抗体を誘発する
マウスは、それらの尾の基部において予め剃毛し、皮膚を１０％グルセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和した。それらの水和した皮膚を紙やすりで１０回前処置した。マウスのグループを２５μｇのＣＳ３単独又は２５μｇのＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇの組み合わせでワクチン接種した。マウスは経皮的に３回（日０，１４及び２８）ワクチン接種され、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。図８に示す結果は、この場合に誘発される主要なＩｇＧサブクラスはＩｇＧ１であることを証明するものである。ＩｇＧ１の力価は、ＬＴＲ１９２ＧアジュバントがＣＳ３と共投与された場合より大きかった。さらに、測定可能な抗原特異的ＩｇＧ２ａも検出された。しかしながら、ＩｇＧ２ａサブクラスはアジュバントを共投与した場合にのみ検出された。これらの結果は、ＬＴＲ１９２ＧアジュバントがＣＳ３に対する血清抗体応答を増強することを確認及び拡大するものであり、さらにアジュバントは上皮の経路で送達された抗原に対するＴｈ２及びＴｈ１免疫応答も指示できることを証明するものである。
【０１７２】
例６．ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇを用いるＴＣＩはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラス抗体を誘発する
マウスは剃毛し、例５に記載のように前処置した。マウスのグループに、経皮的に２５μｇのＣＳ６単独又は２５μｇのＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇの組み合わせのワクチンを投与した。マウスは３回（日０，１４及び２８）ワクチンを投与され、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。図９の結果は、ＬＴＲ１９２ＧがＣＳ６に対する血清ＩｇＧ応答をアジュバント（増強）したことを証明する。ＣＳ３と同様に、ＣＳ６に対する抗体はＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラスの両者であった。しかしながら、ＣＳ６−特異的ＩｇＧ２ａの発生はＬＴＲ１９２Ｇアジュバントの使用に依存した。
【０１７３】
例７．ＴＣＩ後、ＬＴＲ１９２Ｇに対して誘発される血清ＩｇＧサブクラス
マウスは例５及び６の記載と同じ操作で前処置した。マウスに、経皮的に３回（日０， １４及び２８）ワクチンを投与し、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。図１０に示す結果は、ＩｇＧ１がＴＣＩによって誘発される主要な血清抗体サブクラスであることを示している。ＣＳ３，ＣＳ６，ＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＧ２ａサブクラスも同様にＴＣＩにより誘発された。
【０１７４】
例８．ＴＣＩにおいてＣＳ３又はＣＳ６を用いて共投与された場合、ＬＴＲ１９２Ｇに対して誘発される血清ＩｇＧサブクラス
マウスは例５〜７記載の操作で前処置した。本研究では１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇを２５μｇのＣＳ３又は２５μｇのＣＳ６と混合した。マウスのグループに、経皮的に３回、日０，１４及び２８にワクチンを投与し、第三の免疫感作後３０日目（日５８）に血清を収集した。例７で観察されたように、血清ＩｇＧ１がＬＴＲ１９２Ｇに対して誘発された主要なサブクラス抗体であった（図１１）。測定可能なＩｇＧ２ａも産生された。この研究は、ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ又はＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇの組み合わせを用いたワクチン接種が、アジュバントに対する抗体の産生にネガティブに影響しなかったことをさらに証明するものである。これらの結果は、ＥＴＥＣワクチンの成分としてのＬＴＲ１９２Ｇは、アジュバントとして及びワクチン中の抗原として、二重の目的で働くことを指示するものである。
【０１７５】
ＩｇＧサブクラスの特性決定の重要性は、経皮的なＥＴＥＣワクチンが自然感染に対して保護を示す機構に関係する。これらの結果は、経皮的なワクチン接種が、自然感染に対する宿主の保護に異なる機能を示すことが期待される２つのＩｇＧ抗体サブクラスを誘発することを証明する。これらの機構は「中和」及び「補体仲介細胞毒性」によるものである。ＣＳ３及びＣＳ６に対するＩｇＧ１抗体は、たとえば、病因に必須な工程である小腸でのＣＳ３＋及びＣＳ６＋ＥＴＥＣ株によるコロニー形成能を遮断（中和）することが期待される。ＩｇＧ２ａクラスの抗体には様々な機構による感染から宿主を保護することが期待される。このクラスの抗体は、腸毒素原性大腸菌の表面上でＣＳ３又はＣＳ６抗原と複合体を形成した場合、補体の活性化を仲介し、それが一連の酵素工程を経て細菌細胞の溶解（死滅）をもたらす。いずれの機構も感染からの対象の保護に効果的である。
【０１７６】
例９．ＴＣＩ後のＣＳ３抗原に対する粘膜免疫
ＥＴＥＣサブユニットワクチンを用いるＴＣＩにより誘発される粘膜（胃腸管）免疫応答を特徴づけた。試験はＬＴＲ１９２Ｇを用いた場合、及び用いない場合で、ＣＳ３によるＴＣＩが胃粘膜で抗体の産生を生じるかどうかを決定するために実施された。マウスは尾の基部で剃毛し（４８時間前）、水和した皮膚でテープを１０回剥離した。ワクチンを負荷したパッチを前処置した皮膚の上に置いた。マウスのグループは以下の処方を含有するパッチを受けた。すなわち、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）；２５μｇのＣＳ３単独；及び２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群のマウスには２５μｇ ＣＳ３の皮内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは３回ワクチン接種した（日０，１４及び２８）。第三の免疫感作後７日目（日３５）に糞サンプルを収集した。サンプルを材料と方法の項に記載したように処理した。ＣＳ３単独によるワクチン接種は１匹の動物の例外を除いて抗原特異的抗体を誘発しなかった（図１２Ｂ及びＣ）。ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇでワクチン接種されたマウスは検出可能なＣＳ３に対する糞中ＩｇＧを発生した。ＣＳ３に対する糞ＩｇＡは低レベルであった（図１２Ｃ及びＧ）。ＣＳ３による皮内ワクチン接種は測定可能な、ＣＳ３に対する糞中ＩｇＡ及びＩｇＧを生じた。
【０１７７】
例１０．ＴＣＩ後のＣＳ６抗原に対する粘膜免疫
マウスは例９に記載のように前処置し免疫した。マウスのグループを以下の処方を含有するパッチで経皮的にワクチン接種した。すなわち、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）；２５μｇのＣＳ６；２５μｇ ＣＳ６と１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群のマウスには２５μｇ ＣＳ６単独の皮内注射により免疫感作した。すべてのマウスは３回ワクチン接種し（日１４及び２８）、第三の免疫感作後７日目に糞サンプルを収集した。これらの結果は図１３に示す。ＣＳ６単独を投与されたマウスは糞中ＩｇＡ及びＩｇＧをほとんど又は全く発生しなかった（パネルＢ及びＦ）。ＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇで経皮的にワクチン接種されたマウスは力価の低いが測定可能なＣＳ６−特異的ＩｇＡ（パネルＣ）を有した。ＣＳ６−特異的ＩｇＧはすべてのマウスのサンプル中から容易に検出された（パネルＧ）。ＣＳ６を皮内に投与されたマウスは測定可能な抗原特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ（パネルＤ及びＨ）を発生した。
【０１７８】
例１１．ＴＣＩ後のＬＴＲ１９２Ｇ抗原に対する粘膜免疫
マウスは例９に記載のように前処置し免疫した。マウスのグループを以下の処方を含有するパッチで経皮的にワクチン接種した。すなわち、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）；１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇ単独；２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群のマウスには２５μｇ ＣＳ６単独の皮内注射により免疫感作した。すべてのマウスは３回ワクチン接種し（日０，１４及び２８）、第三の免疫感作後７日目に糞サンプルを収集した。これらの結果は図１４に示す。ＴＣＩによりＬＴＲ１９２Ｇ単独を投与されたマウスは測定可能な糞中ＩｇＡ及びＩｇＧを発生した（パネルＢ及びＦ）。ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇで経皮的にワクチン接種されたマウスは測定可能なＬＴＲ１９２Ｇ−特異的ＩｇＡ（パネルＣ）及び糞中ＩｇＧ（パネルＧ）を発生した。ＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇで経皮的にワクチン接種されたマウスは測定可能なＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＡ及びＩｇＧ（パネルＤ及びＨ）を発生した。これらの結果は、多価ＥＴＥＣワクチンにおけるＬＴＲ１９２Ｇの二重の役割、すなわち、コロニゼーション因子抗原に対する全身性及び粘膜性免疫応答をブースターするための強力なアジュバント及び熱不安定エンテロトキシン、臨床的疾患に関与するトキシンに対するワクチンとしての役割を支持する。
【０１７９】
例１２．２価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩは脾臓内に抗原特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を誘導する
次に、ワクチン接種されたマウスの脾臓内で抗原特異的Ｂ細胞を検出した。マウスは例９に記載のように、前処置し、経皮的にワクチン接種した。
マウスの群を以下の処方のいずれかを用いてワクチン接種した：２５μｇＣＳ３；２５μｇＣＳ３／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇ；２５μｇＣＳ６；又は２５μｇＣＳ６／１０μｇＬＴＲ１９２Ｇ。パッチを前処理した皮膚に対し一晩適用した。別のマウス群は、尾の基において、２５μｇのＣＳ３及び２５μｇのＣＳ６を用いた皮内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは３回のワクチン接種を受けた（日０、１４及び２８）。方法及び材料の項に記載したように、脾臓を第３の免疫感作（日５８）の３０日後に回収し、単一細胞懸濁液を調製し、抗原特異的ＩｇＧ（ＩｇＧ−ＡＳＣ）及びＩｇＡ（ＩｇＡ−ＡＳＣ）を産生するＢ細胞の同定のために染色した。ＣＳ３単独（図１５、パネルＡ及びＢ）又はＣＳ６単独（図１５、パネルＣ及びＤ）を用いて経皮的に免疫感作したマウスからの脾臓には、ＩｇＡ‐又はＩｇＧ−ＡＳＣは一切検出されなかった。それに対して、ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ又はＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇを用いて経皮的に免疫感作したマウスはＣＳ３−及びＣＳ６−特異的ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣを生じた。これは、脾臓におけるＡＳＣの発生がアジュバントの同時投与に依存することを示している。さらに、ＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣが、二価のワクチン（即ち、ＣＳ３／ＬＴＲ１９２Ｇ及びＣＳ６／ＬＴＲ１９２Ｇ）を用いてワクチン接種したマウスの脾臓懸濁液に存在した。これらの結果は、ＴＣＩによる抗原特異的Ｂ細胞免疫の発生がこれらの抗原についてのＬＴＲ１９２Ｇの同時投与に依存することを証明している。
【０１８０】
例１３．３価のＥＴＥＣワクチン（ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ）を用いるＴＣＩは脾臓に抗原特異的抗体分泌細胞を誘導する
この研究の目的は、３価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩ後の脾臓におけるＢ細胞応答を特性づけることであった。マウスを例１２の記載のように前処置し、ワクチン接種した。マウスは、２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇのカクテルを含むパッチでワクチン接種した。パッチを一夜適用し、すべてのマウスは３回（日０，１４及び２８）に経皮的にワクチン接種した。第三の免疫感作後３０日目（日５８）に脾臓を収集した。脾臓細胞を、材料と方法の項に記載のように培養し、抗原特異的ＡＳＣを染色し、計数した。結果は図１６に示す。３価のワクチン（ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ）でワクチン接種したマウスはワクチン中の各ＥＴＥＣ抗原に対するＩｇＡ−ＡＳＣ（パネルＡ）及びＩｇＧ−ＡＳＣ（パネルＢ）を発生することが見出された。これらの結果は、ＥＴＥＣサブユニット抗原の混合物による経皮的ワクチン接種が実行可能であり、脾臓内に抗原特異的Ｂ細胞のクローン性増殖を誘導することを証明するものである。
【０１８１】
例１４．１価又は２価のＥＴＥＣサブユニットワクチンを用いるＴＣＩはリンパ節に抗原特異的抗体分泌細胞を誘導する
尾の基部における経皮的なワクチン接種は、尾の背部皮膚表面を排出するリンパ節内のＢ細胞のクローン性増殖を生じると仮説されている。この仮説を試験するため、マウスを、テープを１０回剥離した尾の基部の皮膚で上皮的に免疫感作した。マウスのグループを以下の処方を３回投与した。すなわち、２５μｇ ＣＳ３；２５μｇ ＣＳ６；２５μｇ ＣＳ３／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ及び２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。パッチは一夜適用した。別個の群には、２５μｇ ＣＳ３又は ２５μｇ ＣＳ６を皮内に注射した。すべての群は３回（日０，１２及び２８）ワクチン接種し、第三の免疫感作から３０日後に鼠蹊部リンパ節を収集した。単一細胞懸濁液を調製し、抗原とともに培養し、これをマイクロウェル上にプレーティングした。ＩｇＧ−及びＩｇＡ−ＡＳＣを材料と方法の項に記載したように染色して可視化した。図１７に示した結果は、ＣＳ３−又はＣＳ６−特異的ＩｇＧ−ＡＳＣの発生（それぞれパネルＡ及びＢ）はアジュバントの共投与に依存することを証明する。また、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的なＡＳＣは脾臓よりも鼠蹊部リンパ節に多いことも観察された（図１５）。これは、皮膚免疫感作が同様に、内在性皮膚ランゲルハンス細胞の移動と活性化を包含し、（ＬＴＲ１９２ＧのＧＭ１受容体との相互作用によって活性化されるという仮説と一致する。抗原が負荷され、活性化されたランゲルハンス細胞は上皮から出て、真皮を貫通して排出リンパ管に移動するものと考えられる。リンパ節内のレジデンスに取り込まれた、抗原を有するランゲルハンス細胞はＢ細胞のクローン性増殖を惹き起こし、したがってそれを排出鼠蹊リンパ節内におけるＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇが比較的豊富になる。
【０１８２】
例１５．ＴＣＩによって送達されるＥＴＥＣ抗原の複合混合物に対するＢ−細胞免疫の発生
本発明者らはまた、抗原の複合混合物による免疫感作にＴＣＩが適していることも証明する。マウスは例１４に記載したように前処置し、免疫した。パッチには、次の処方：２５μｇ ＣＳ３，２５μｇ ＣＳ６及び１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇの３種のＥＴＥＣ抗原のカクテル負荷した。３種の上皮免疫感作ののち、鼠蹊部リンパ節を収集し、ＣＳ３，ＣＳ６及びＬＴＲ１９２Ｇ特異的ＩｇＧ−ＡＳＣを測定した。図１８は３価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩが、ワクチン中の各サブユニット抗原に特異的なＡＳＣの発生を刺激しなかったことを示す。
【０１８３】
例１６．ＣＦＡ／Ｉによる経皮的ワクチン接種は全身性免疫を誘発する
高分子量抗原の混合物により皮膚を介して免疫することの可能性が確立されたので、本発明者らは次に、４価のＥＴＥＣワクチンによるＴＣＩの実行可能性を検討した。ＣＦＡ／Ｉは世界中から単離されたＥＴＥＣ株によって広く発現されている。すべてのヒトＥＴＥＣ株の３０％がＣＦＡ／Ｉを発現すると推定されている。最初、本発明者らは、ＣＦＡ／Ｉが皮膚に送達された場合、免疫原性であるかどうかを決定した。これらの研究では、マウスを尾の基部で剃毛し、皮膚を水和し、紙やすりで５回穏やかに研摩して角質層を破壊した。以下の処方のいずれかをパッチに負荷した：２５μｇ ＣＦＡ／Ｉ／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ。パッチは一夜適用した。別個のグループは２５μｇ ＣＦＡ／Ｉを皮内注射して免疫した。すべてのマウスに２回（日０及び１４）投与を行い、第二の免疫感作から１０日後（日２４）、分析のために血清を収集した。図１９に示すように、ＣＦＡ／Ｉで経皮的にワクチン接種されたマウスは、２回の免疫感作後に血清抗体を発生した（パネルＡ）。ＬＴＲ１９２Ｇとの共投与では血清学的応答は約８倍に上昇し、ＬＴＲ１９２Ｇは、皮膚に提示された抗原に対する免疫応答を刺激する一般的なアジュバントであることを指示する。期待されたように、経皮的にワクチン接種されたマウスはＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体も発生した（パネルＢ）。
【０１８４】
例１７．ＣＦＡ／Ｉによる経皮的ワクチン接種は粘膜免疫を誘発する
例１６においてＣＦＡ／Ｉにより経皮的に免疫されたマウスから、新鮮な糞サンプルを収集した。糞サンプルはＣＦＡ／Ｉ特異的なＩｇＡ及びＩｇＧについて試験した。図２０に示すように、ＣＦＡ／Ｉ単独では、検出可能な糞中ＩｇＡ（パネルＢ）及びＩｇＧ（パネルＦ）の発生を誘発しなかった。ＣＦＡ／ＩとＬＴＲ１９２Ｇを投与されたマウスでは、ワクチン接種後に糞中ＩｇＡ（パネルＣ）及びＩｇＧ（パネルＧ）が産生された。興味あることに、ＣＦＡ／Ｉを皮内注射により投与されたマウスでは、抗原に対する糞中の抗体は発生しなかった（パネルＤ及びＨ）。
【０１８５】
例１６及び１７はＣＦＡ／Ｉによる経皮的ワクチン接種が実行可能であること、及び大部分がアジュバントの共投与に依存する全身性及び粘膜応答の産生を証明するものである。
【０１８６】
例１８．４価のＥＴＥＣワクチンによる経皮的ワクチン接種は全身性免疫を誘発する
ＥＴＥＣ感染を防止するためのワクチンによる広いカバーには多価のワクチンの使用が要求される。疫学的研究では広いカバー（ＥＴＥＣ株の８０〜９０％）の、ＥＴＥＣワクチンは、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）と少なくとも３種のコロニゼーション因子抗原の組み合わせが要求されるようであると考えられる。以下の研究は、４価のワクチンによる経皮的ワクチン接種が実行可能であることを証明するために実施された。マウスはＴＣＩの約４８時間前に前処置し、皮膚を１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和した。ワクチン部位は、紙やすりで５回前処置し、ワクチンを負荷したパッチを皮膚に適用した。ここで用いた処方は、２５μｇ ＣＦＡ／Ｉ，２５μｇ ＣＳ３，２５μｇ ＣＳ６ 及び１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。マウスは日０及び１４の２回にワクチン接種し、第二の免疫感作から１０日後（日２４）に評価のために血清を収集した。図２１に示す結果は、ワクチンの４成分のすべてが、２回の免疫感作後に血清応答を誘発したことを示す。また、ＬＴＲ１９２Ｇ−アジュバントの用量（１０μｇ）は、免疫を達成するためにさらに増量させる必要はなかったことも指摘される。サブユニットワクチンの複合混合物は皮膚を通して送達され、ＬＴＲ１９２Ｇのアジュバント活性はアジュバントの用量の更なる増量を要求しないことが明瞭に指示されるので、この観察は重要である。さらに、ＬＴＲ１９２Ｇの抗原性は多重抗原（ＣＳ３，ＣＳ６又はＣＦＡ／Ｉ）の共投与によって減弱されなかった。
【０１８７】
例１９．４価のＥＴＥＣワクチンを用いる経皮的ワクチン接種はコロニゼーション因子抗原に対する粘膜免疫を誘発する
マウスは例１８の記載のように前処置した。マウスのグループを以下の処方を含有するパッチでワクチン接種した。すなわち、２５μｇ ＣＦＡ／Ｉ，２５ＣＳ３，２５μｇ ＣＳ６及び１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇである。すべてのマウスは尾の基部で、日０，１４及び２８に経皮的にワクチン接種した。第三の免疫感作から２週後（日４２）に糞サンプルを収集した。サンプルは処理し、ワクチン中の各抗原に対する抗体について評価した。図２２に示す結果は糞中にＣＦＡ／Ｉ（パネルＡ及びＤ）ＣＳ３（パネルＢ及びＥ）及びＣＳ６（パネルＣ及びＦ）に対するＩｇＡ及びＩｇＧが誘発されたことを証明する。
【０１８８】
例２０．４価のＥＴＥＣワクチンを用いるＴＣＩは抗−トキシン（ＬＴ）免疫を誘発する
例１８及び１９に記載のようにワクチン接種したマウスから、糞サンプルを収集した。サンプルを材料及び方法の項に記載のように処理し、ＬＴＲ１９２Ｇに対する糞中ＩｇＡ及びＩｇＧについて評価した。図２３に示すように、ＬＴＲ１９２Ｇは抗原特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体の有意な力価を誘発した。この場合、アジュバント単独（パネルＡ及びＤ）、ＣＦＡ／Ｉ抗体と（パネルＢ及びＥ）又は４価のカクテルとして（パネルＣ及びＦ）投与した。
【０１８９】
上記のこれらの例は、多価ワクチンが皮下注射針、ジェットインジェクター又は他の障壁破壊剤を使用しないで、皮膚を通して有効に送達できることを証明する。これらの例はまた、ＬＴアジュバントが、高力価血清抗体の産生の刺激；抗原特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の産生を仲介することによる体液性応答の指示に重要な役割を有し、ある場合には、それはＥＴＥＣコロニゼーション因子抗原に対する粘膜抗体応答の促進が本質的であることも証明する。本発明者らは、抗原のカクテル中で有害な競合を示すことなく、多価ワクチンがＴＣＩにより効果的に送達されることを証明した。これは、ワクチンに、４，５，６，７，８又はそれ以上の抗原を含むことが多分要求されるであろう多くの異なる単離体のカバーを保証するので、様々な抗原特異性を発現する病原体によって惹き起こされる疾患の処置に重要である。トキシンの中和及び感染の防止は、宿主−病原体の相互作用における２つの重要な点での処置（治療及び／又は予防）を提供する。これは予期しなかった先行技術の改良である。
【０１９０】
例２１．ＴＣＩはＬＴに対して長期に持続する中和抗体を誘発する
ヒトボランティアを第Ｉ相臨床試験に組み込んだ。これらのボランティアを、三角筋上の皮膚に経皮免疫した。皮膚はイソプロピルアルコールで前処置し、１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールの混合物で水和した。ガーゼパッチ（４×４インチ）を接着性バッキングに固着させ、ＬＴの水性溶液をパッチに適用した。湿ったパッチ処方はＰＢＳ中５％ラクトースと以下の量のＬＴ：５０μｇ，１００μｇ，２５０μｇ又は５００μｇのいずれかを含有した。ボランティアは２回の用量を投与された（日０及び３０）。血清は免疫感作に先立って（免疫前）及び第一の免疫感作後３１２日（免疫感作後）に採集した。ＥＬＩＳＡによると、血清はそれらの免疫前力価以上のＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体力価を示した（表６）。
【表６】
【０１９１】
インビトロＣＨＯ細胞アッセイを使用して、抗体を含有するこれらの血清がＬＴ受容体結合及びインビトロ毒性を中和するか否かを決定した。すべての血清は、インビトロにおいてＬＴの毒性をブロック（中和）する抗体を有することが見出された。この結果は、ＴＣＩが、細胞上の熱不安定性エンテロトキシンＬＴの毒性作用を中和する機能を有する抗体を誘発しないことを示している。ＴＣＩはＬＴに対して長期に持続する免疫を誘発し、その際誘発される抗体はそのトキシンを中和する。
【０１９２】
例２２．ＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇサブユニットワクチンを用いる経皮的ワクチン接種は、ＣＳ３＋ＥＴＥＣ全細胞上の抗原を認識する血清抗体を誘発する
次に、本発明者らは、経皮的ワクチン接種により誘発された抗体が、腸毒素原性大腸菌生物によって発現されたネイティブなコンフォメーションのエピトープと免疫反応性であることを示す。マウスは予め剃毛し、皮膚を水和した。パッチは２５μｇのＣＳ３及び１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇの２５μＬから構成される水性溶液を、ガーゼパッチに直接適用することにより調製した。皮膚がまだ水和されている間にパッチを適用し、その場に約１８時間置いた。１群１０匹のマウスにパッチを２回、日０及び１４に投与した。第二の免疫感作から１０日後、日２４に血清を収集した。これらの血清はＥＬＩＳＡ法により、精製ＣＳ３に対する抗体について、ＬＴＲ１９２Ｇ及びＣＳ３を発現する腸毒素原性大腸菌（Ｅ２４３７７８株）に対する抗体について評価した。結果を示す図２４は免疫感作マウスが精製ＣＳ３（１：７０，４６４）及びＬＴＲ１９２Ｇ（１：３２，６５７）に対する有意な血清抗体力価を発生することを証明する。これらの血清はまた、ＥＴＥＣ全細胞（１：１１，２０６）に対して顕著な血清抗体力価を有することが見い出された。これらの結果は、ＥＴＥＣサブユニットワクチン（たとえばＣＳ３及びＬＴＲ１９２Ｇ）によるＴＣＩが、ＣＳ３−発現ＥＴＥＣ株上のネイティブなコンフォメーション決定基を認識する抗体の産生を生じることを証明する。
【０１９３】
例２３．死滅ＥＴＥＣを用いたＴＣＩは細菌性病原体に対して免疫を誘発する
皮膚に適用した死滅細菌性病原体による経皮的なワクチン接種が実行可能である。ＥＴＥＣ（株Ｅ２４３７７８）を細菌増殖メジウム上で増殖させた。細菌は遠心分離によって収穫し、リン酸緩衝食塩溶液で洗浄した。２％のホルマリン溶液を細胞ペレットに加え、細胞を単一細胞懸濁液に懸濁した。すべての細菌を死滅させるために、細胞を一夜室温で混合した。死滅細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。マウスは剃毛し、尾の基部の皮膚でテープを１０回剥離して前処置し、角質層を除去した。ガーゼパッチに、１０９死滅ＥＴＥＣ全細胞（ＥＷＣ）を含有する２５μＬの液を負荷し、１０μｇのＬＴＲ１９２Ｇをこの混合物に加えた。パッチは一夜適用した。１群１０匹の動物を日０及び１４にワクチン接種した。第二の免疫感作から１０日後に血清を収集した。血清を、材料と方法の項に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、ＥＷＣ及びＬＴＲ１９２Ｇに対する抗体について評価した。図２５に結果を示す。すべてのマウスが血清学的に変換されていること、及び細菌全細胞（１：３２４）ならびにＬＴＲ１９２Ｇ（１：２１，０４４）に対する血清抗体を有することが見出された。これらの結果は、死滅細菌全細胞による経皮的ワクチン接種が実行可能であり、生物特異的な免疫応答が誘発されることを最初に証明するものである。
【０１９４】
例２４．ＥＴＥＣコロニゼーション因子、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）及び熱安定性トキシン（ＳＴ）抗原を用いたＴＣＩ
ある種の腸毒素性大腸菌が、熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）と呼ばれる第二のエンテロトキシンを産生することは周知である。熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）のように、ＳＴはヒトで高度に反応原性で、小児及び成人でひどい下痢を生じる。ＥＴＥＣの株は、ＳＴａ単独、ＬＴ単独、又はＳＴａとＬＴの組み合わせを産生する。ＳＴａは分子量の小さい１９アミノ酸ペプチドであり、６個のシステインを含有する。ＳＴａは注射によって投与された場合、貧弱な免疫原性を示すことが知られている。この研究は、多重コロニゼーション因子（ＣＳ３及びＣＳ６）及び両エンテロトキシン（ＬＴ及びＳＴ）から構成される複合ＥＴＥＣワクチンの経皮送達が可能なことを証明するために実施された。本明細書に記載の方法で、マウスは尾の基部でテープを１０回剥離して前処置した。ここでは以下のパッチ処方を使用した２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６；２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ ＬＴＲ１９２Ｇ；及び２５μｇ ＣＳ３／２５μｇ ＣＳ６／１０μｇ／ＬＴＲ１９２Ｇ／６８μｇ ＳＴを負荷した。マウスは日０，１４及び２８の３回、ワクチンを経皮的に投与された。第三の免疫感作２週後、血清を収集した。図２６に示す結果は、コロニゼーション因子に対する免疫はＬＴＲ１９２Ｇの添加によって有意に増強されたことを証明する。この研究はまた、多重ＥＴＥＣワクチンへのＳＴの添加が、ＬＴＲ１９２Ｇのアジュバント作用又はこれらのコロニゼーション因子の免疫応答発生に有害な影響を与えることなく可能であることを証明する。ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＬＴ及びＳＴａ又は抗原の他の組み合わせから構成される５価のＥＴＥＣワクチンの開発が可能であることが示唆される。これらの抗原は、ＴＣＩにより、毒性又は重篤な有害な副作用もなく、安全に投与することができる。
【０１９５】
例２５．ＥＴＥＣ抗原の送達のための、湿潤、接着剤中タンパク質及び風乾パッチ処方
パッチはＥＴＥＣワクチンのＴＣＩによる送達のための多岐にわたるビヒクルである。ここでは、ＬＴを４つの異なる方法で処方した。第一に、ＬＴ（１０μｇ）を、５％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む中性ｐＨのリン酸緩衝食塩溶液から構成される水性溶液中に処方した。この処方は、１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで水和した皮膚に直接適用した。この溶液を静かに又はガーゼパッドで覆って１時間放置した。第二に、ＬＴを様々な接着剤（たとえばＫｌｕｃｅｌ）と配合した。この処方をついで閉塞性バッキングの上に薄いコートとして広げた。ＬＴは面積１ｃｍ２あたり１０μｇの有効濃度で、Ｒｏｔｏｇｒａｖｅｕｒプレスを用いて薄いフィルムに広げた。フィルムを室温で風乾し、水分含量を０．２％〜５％未満にした。パッチ（〜１ｃｍ２）をシートから打ち抜いた。パッチは常温及び４℃で保存し、同じ送達特性を示した。第三に、ＬＴはガーゼパッドに直接適用し、表面上に１０μｇ／ｃｍ２の濃度に均一に広げた。これらのパッチは一夜風乾した。第四に、水性処方中ＬＴ（２５μＬのＰＢＳ中１０μｇ及び５％ラクトース）を、接着性バッキングに固着したガーゼパッド（〜１ｃｍ２）に直接滴下した。これらのパッチは一夜常温で風乾した。これらのパッチは使用前１ヶ月４℃に保存した。
【０１９６】
パッチは、材料及び方法の項に記載のマウスモデルを用いてＬＴ抗原の送達について比較した。尾の基部で皮膚を剃毛し、水和し、軽石を含む綿棒で前処置し（１０％グリセロール及び７０％イソプロピルアルコールで処方）、角質層を破壊した。５匹のマウスの群に２つのパッチを、１つは日０に、他は日１４に投与した。適用の前に、風乾したパッチを水２５μＬにより再水和した。２４時間後にパッチを除去した。液体処方については、ＬＴ含有溶液を皮膚上に１時間置き、次いで過剰のＬＴを水で濯いで除去した。第二の免疫感作から２週後（日２８）に、各動物から血清を収集した。結果は図２７に示す。これらの結果は、すべての方法が皮膚を通してのＬＴの経皮送達に適当であることを証明した。この例は、パッチ処方が、パッチに重ねて皮膚に直接適用される水性液体；接着剤（接着剤中のタンパク質）内に抗原を導入し、閉塞性バッキング上に薄いフィルムコーティングとして広げた乾燥パッチ；抗原を適当な表面に直接、溶液で適用し（別個に、又はカクテルとして）、風乾させたパッチ；又は抗原は溶液中に存在し、パッチの適用直前に、パッチ表面に直接適当量の溶液を適用する水和パッチのいずれでもよいことを示す。
【０１９７】
例２６．ＥＴＥＣサブユニットワクチン及びエンテロトキシンの経皮送達のための接着剤中タンパク質処方
接着剤中タンパク質処方は、接着剤処方に１又は２種以上のＥＴＥＣサブユニット抗原の導入を意図するものである。この処方はまた、死滅ＥＴＥＣ全細胞（用量あたり〜１０４〜１０８死滅細菌）のＬＴ−アジュバントとともに又はそれなしでの導入に適している。このブレンドをついで、薄いフィルムとした閉塞性（又は半閉塞性）バッキングシート上に注いで鋳造する。ワクチン／接着剤混合物を、フィルムが乾燥するまで（水分含量は０．５〜５％を変動する。１〜２％が望ましい）硬化させる（室温又は４０℃）。型をとったフィルムをダイカストから所望のサイズ及び形状に切断する。ついで、乾燥パッチを、遮光した防水性プラスチック又はフォイルの袋でシールする。この方法で製造されたパッチは冷蔵庫又は室温で保存する。接着剤中タンパク質は、１又は多重抗原及びアジュバントが様々な量及び比で変動させて導入できる点で柔軟性である。さらに、パッチのサイズは用量を調整するために変動させることができる。個人の年齢に依存して、パッチのサイズ（用量）は小児及び成人で変動させることができる。
【０１９８】
接着剤中タンパク質処方は、柔軟で独特に、ワクチンの層によるコーティングを可能にする。これらのパッチは、各ワクチン成分がパッチバッキング上に別個に層を形成するように製造される。目的は、成分１がバッキング上に層を形成し、成分２のフィルムが１の上に層を形成し、成分３が成分１及び２の上に層を形成し、成分４が最も外の層になるような多重層膜を形成させる。このアプローチの利点は、処方に柔軟性を与えること（すなわちパッチは異なる比の抗原及びアジュバントを用いる同一方法で製造され、又は１又は２種のみの成分を含有する場合も同じ方法でワクチンが製造される）。この多重処方は各抗原及びアジュバントの放出速度をコントロールできる利点を有する。一部の例では、ＬＴ−アジュバントは、皮膚樹状細胞（ランゲルハンス細胞）を他の抗原が放出される前に予め始動させるために、直ちに放出されることが望ましい。このような処方では、ＬＴ−始動ランゲルハンス細胞はトキシン及びコロニゼーション因子抗原をより効率的に捕獲し、処理する。コントロールされた送達は、アジュバント及び抗原のより効果的な使用であり、用量をさらに低下させる。
【０１９９】
表７及び８は、アジュバント及び／又は抗原を接着剤中に安定化するために適当な処方を記載する。以下はこのような処方を例示する意図であり、処方を限定する意図ではない。
【表７】
【０２００】
例２７．ＥＴＥＣサブユニットワクチン（Ｃ３，Ｃ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＳＴ及びＬＴ）及び死滅ＥＴＥＣ全細胞の送達のためのゲル処方
ゲルは完全水和又は湿潤パッチの例である。これらの処方は、ゲルマトリックス内に捕捉された１又は２種以上のＥＴＥＣサブユニット抗原を導入する意図である。この処方はまた、死滅ＥＴＥＣ全細胞（用量あたり約１０４〜１０８死滅細菌）のＬＴとともに又はＬＴなしでの経皮的送達に適している。ワクチンは、カルボマー、プルロニック、又は２つのゲル成分（以下参照）と所望の量及び比で、抗原含有溶液を配合することによって処方される。ゲル含有ワクチンはついで、こぼさないで正しい位置に保持する細片材料上にコーティングする。この材料はワクチン中のタンパク質に対して低い結合能を有することが重要である。細片は、たとえばポリマー、天然及び合成織布、不織布、フォイル、紙、ゴム又はそれらの混合物からなることができる。細片は単一層又は２以上の層のラミネートとする。一般に、細片は実質的に水非透過性であり、皮膚を水和状態に維持することを補助する。この材料は可撓性及びタンパク質に対する低結合性の要求に合致する限り、任意のタイプのポリマーでもよい。適当なポリマーには、それらに限定されるものではないが、ポリエチレン、ビニル酢酸エチル、エチルビニルアルコール、ポリエステル又はテフロン（登録商標）が包含される。ゲルを保持する細片材料の厚さは、１ｍｍ未満、好ましくは０．０５未満、最も好ましくは０．００１〜０．０３ｍｍである。
【０２０１】
ゲルを負荷した細片は様々なサイズ及び形状とすることができる。コーナーは丸くするのが適用に便利である。細片の長さは様々に変動可能であり、使用者（すなわち、小児又は成人）に依存する。それは約２ｃｍ〜約１２ｃｍであり、好ましくは約４ｃｍ〜約９ｃｍである。細片の幅は約０．５ｃｍ〜約４ｃｍである。
【０２０２】
細片は浅いポケット又は窪みを含有することができる。正しい位置に保持させるため、ワクチン含有ゲルを細片上にコーティングする場合には、ゲルの保存部を提供する浅いポケットをゲルで満たす。浅いポケットの横幅は約０．４ｍｍ、深さは約０．１ｍｍとしてもよい。ゲルを負荷したパッチの厚さは約１ｍｍ、好ましくは約０．５ｍｍ又はそれ未満である。
【０２０３】
ゲルと皮膚の間の最大接触を維持しなければならないので、曲げに対する硬直性が重要である。細片はパッチが適用される位置（たとえば、三角筋上の皮膚、掌側の前腕、頸部、耳の後部又は他の位置）の解剖学的位置の外郭に合わせる必要がある。曲げに対する強直性はＨａｎｄｌｅ−Ｏ−Ｍｅｔｅｒ（Ｔｈｗｉｎｇ Ａｌｂｅｒｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定できる。曲げに対する強直性は５ｇｍ／ｃｍ未満、好ましくは３ｇｍ／ｃｍ未満でなければならない。比較的低い曲げ強直性により、細片の材料はほとんど力を要しないで輪郭上にまとわせることが可能である。
【０２０４】
ゲルを負荷した細片は、細片を接着性のバッキングに、細片のゲル表面が接着性バッキングと向かい合わないように正しい位置に固着させる。バッキングの材料は閉塞性又は半閉塞性である（たとえば、Ｔｅｇａｄａｍ）。バッキングはパッチを正しい位置に保持し、皮膚とゲル間の最大接触の維持を助け、装着時にゲルの脱水を防止するように設計される。
【０２０５】
保存時又は取り扱い時の湿潤パッチの脱水を防止するため、かなり剛性な不活性プラスチックの細片上に配置する。ゲル表面はこのプラスチックの細片と直接接触し、ゲル／プラスチックのインターフェースは弱い剥離力を有し、プラスチックの細片からゲル細片の分離を容易にする。プラスチックの細片はポリエチレン又は類似の材料で作成する。ゲルパッチは、光から保護された水の漏らないプラスチック又はフォイルの袋で包装する。袋は冷蔵庫又は室温で保存できる。
【０２０６】
以下の記載は、水和ゲル処方の例示を意図し、限定を意図するものではない。ゲルは、リン酸緩衝食塩溶液；１％Ｃａｒｂｏｍｅｒ１３４２；１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０；１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９３４；１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，２％スクロース，１０％イソプロピルアルコール、１０％グリセロール；５０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ８７；及び３０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８中にゲルを処方する。
【０２０７】
カルボマーポリマーは、高分子量のアクリル酸ベースのポリマーであり、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールによる架橋、及び／又はＣ１０〜Ｃ３０アルキルアクリレートによる修飾を受けていてもよい。これらはパッチに導入されても、導入されなくてもよく、本技術分野で既知の他の手段によって皮膚内に送達されてもよい。
【０２０８】
処方は平均分子量が異なるカルボマーから構成されてもよい。たとえば、ポリマーはＣａｒｂｏｍｅｒ１３４２（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ１３４２，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）；Ｃａｒｂｏｍｅｒ９３４（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９３４，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）；又はＣａｒｂｏｍｅｒ９４０（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）とすることができる。各処方はリン酸緩衝食塩溶液中に調製し、ＬＴを０．６ｍｇ／ｍＬ又はそれ未満の濃度で含有するが、抗原及びアジュバントも約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約０．６ｍｇ／ｍＬ，又は約０．６ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬ処方される。さらに、抗微生物剤たとえばメチルパラベン及びプロピルパラベンも包含させることができる。
【０２０９】
Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０とＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ８７の組み合わせ（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ８７，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）が使用できる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃはエチレンオキシド−プロピレンオキシードエチレンオキシドの反復セグメントを含有する他のクラスのハイドロゲルである。処方中のＬＴ及び抗微生物剤の量は、同一である。
【０２１０】
他の処方では、透過エンハンサー及びカルボマーを用いて送達を増強できる。たとえば、ゲルはＣａｒｂｏｍｅｒ９４０とＰｈａｒｍａｓｏｌｖｅを含む（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，１０％Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖｅ，０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）、最終のゲルはＣａｒｂｏｍｅｒ９４０，グリセロール及びイソプロパノールを含有し得る（たとえば１．５％Ｃａｒｂｏｍｅｒ９４０，１０％グリセロール、１０％イソプロパノール、０．６ｍｇ／ｍＬのＬＴ，０．３％のメチルパラベン、０．１％のプロピルパラベン、２．５％のラクトース、１×ＰＢＳ）。ＬＴ及び抗微生物剤の濃度は前の処方と同じままであるか、又は特定された他の範囲とすることができる。
【０２１１】
例２８．ＣＳ３，ＣＳ６，ＣＦＡ／Ｉ，ＳＴ及びＬＴに対する投与量
用量範囲は変動し、対象の年齢及び医学的状態に依存し得る。１ｍｇ〜５μｇ未満の用量によりヒト及び動物対象の両者で抗原特異的免疫応答を誘発し得る。望ましい成人用量はコロニゼーション因子について、それぞれ約１μｇ〜約１００μｇの範囲（たとえば、ＣＳ３，ＣＳ６及びＣＦＡ／Ｉ）であり；各コロニゼーション因子の好ましい用量は約５μｇ〜約５０μｇである。ＬＴについての望ましい成人用量は約１μｇ〜約１００μｇの範囲であり；ＬＴの好ましい用量は約５μｇ〜約５０μｇである。望ましい成人用量はＳＴ（担体タンパク質に抱合されていない）について約１μｇ〜約１００μｇである。ＳＴは貧弱な免疫原性であるから、成人用量は約２５μｇ〜約１００μｇである。ＳＴがＬＴに化学的にカップリングしている場合（ＬＴ−ＳＴ）、ＳＴの相当用量は約５μｇ〜約５０μｇである。ＳＴを他の担体タンパク質、たとえばアルブミン、ＫＬＨ又は凝集抗体に抱合させることにより、免疫原性を改良することができる。後者の場合、ＳＴの用量は約５μｇ〜約５０μｇである。
【０２１２】
【０２１３】
上に引用された参考文献（たとえば、論文、著書、特許及び特許出願）は、本技術分野の技術レベルを示すものであり、参考として本明細書に導入される。
【０２１４】
特許請求の範囲の意味及びそれらの法的な均等物の範囲内に入る修飾及び置換はそれらの範囲内に包含される。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の移行部を用いる特許請求の範囲は、特許請求の範囲内に他のエレメントを包含させることができる。本発明はまた、移行部の語句「・・・から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｇ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を用いる請求の範囲によっても記載され（すなわちそれらが本発明の操作に実質的に影響しなければ、他のエレメントを請求の範囲内に包含される）、また、「からなる（ｃｏｕｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の移行部の語句（請求の範囲に掲示された、通常は本発明に付随する不純物又は取るに足りない活動以外のエレメントのみを許容する）が「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語句に代わって使用される。請求の範囲に明示された関係がなければ、請求範囲の限定間には特定の関係はない（たとえば、物の請求項における成分の配置又は方法の請求項における工程の順序は、そうであることが例外として述べられていなければ、請求項の限定とならない）。すなわち、本明細書に開示された個々のエレメントの可能なすべての組み合わせ及び順序が、本発明の部分を意図すると考えられる。
【０２１５】
上記記載から、本技術分野における熟練者には、本発明はその精神又は本質的な特性から逸脱することのない他の特異的な形態を包含することができることは明らかである。記載された実施態様は、本発明に与えられる法的な保護範囲は本明細書の記載ではなく、付随する特許請求の範囲によって指示されることから、単に例示的なものであり、限定的なものではないと考えるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
経皮免疫感作のための免疫であって、上記免疫原は毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の１又は２種以上の株に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の１又は２種以上の抗原を含む、上記免疫原。
【請求項２】
少なくとも１種のアジュバントをさらに含む「請求項１」記載の免疫原。
【請求項３】
アジュバントはＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン又はアジュバント活性を有するその誘導体である「請求項２」記載の免疫原。
【請求項４】
アジュバントは、コレラトキシン（ＣＴ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）及びアジュバント活性を有するそれらの突然変異体からなる群から選択される「請求項１」記載の免疫原。
【請求項５】
上記抗原の少なくとも１種は、大腸菌コロニゼーション因子抗原（ＣＦＡ）に対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項６】
大腸菌コロニゼーション因子抗原は、ＣＦＡ／１，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ３，ＣＳ４，ＣＳ５，ＣＳ６，ＣＳ１７及びＰＣＦ０１６６からなる群から選択される「請求項５」記載の免疫原。
【請求項７】
上記抗原の少なくとも１種は大腸菌エンテロトキシンＳＴａに対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項８】
１又は２種以上の抗原は少なくともＣＳ３及びＣＳ６；ＣＳ３及びＣＦＡ／１；ＣＳ６及びＣＦＡ／１；ＣＳ３及びＳＴａ；ＣＳ６及びＳＴａ；又はＣＦＡ／１及びＳＴａに対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項９】
１又は２種以上の抗原は少なくともＣＦＡ／１，ＣＳ３及びＣＳ６；ＣＦ３，Ｓ６及びＳＴａ；ＣＥＡ／１，ＣＳ３及びＳＴａ；ＣＦＡ／１，ＣＳ６及びＳＴａ；又はＣＳ３，ＣＳ６及びＳＴａに対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項１０】
経皮免疫感作に適当なワクチンであって、上記ワクチンはパッチ及び「請求項１〜９」のいずれかに記載の免疫原を含む、上記ワクチン。
【請求項１１】
経皮免疫感作に適当なサブユニットワクチンであって、上記ワクチンは化学的合成された、組換え技術によって産生された、少なくとも部分的に精製された、またはそれらの組合せによる、細胞フリーな型にある「請求項１〜９」のいずれかに記載の免疫原を含むワクチン。
【請求項１２】
経皮免疫感作に適当な全細胞ワクチンにおいて、上記ワクチンは全細胞型での「請求項１〜９」のいずれかに記載の免疫原を含む、上記ワクチン。
【請求項１３】
１又は２種以上のＥＴＥＣ株に対して免疫応答を誘発するための「請求項１〜１２」のいずれかに記載の免疫原又はワクチンの使用。
【請求項１４】
旅行者の下痢に伴う１又は２以上の疾患症状の処置及び／又は予防のための「請求項１〜１２」のいずれかに記載の免疫原又はワクチンの使用。
【請求項１５】
化学的及び／又は物理学的浸透増強をさらに含む、「請求項１３又は１４」記載の使用。
【請求項１６】
経皮免疫感作によってＥＴＥＣの１又は２種以上の株に対する免疫応答を誘発する免疫原又はワクチンを製造するための１又は２種以上の抗原の有効量の使用。
【請求項１７】
経皮免疫感作によってＥＴＥＣの１又は２種以上の株に対する免疫応答を誘発する免疫原又はワクチンを製造するための少なくとも１種のアジュバント及び１又は２種以上の抗原の有効量の使用。
【請求項１】
経皮免疫感作のための免疫であって、上記免疫原は毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の１又は２種以上の株に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の１又は２種以上の抗原を含む、上記免疫原。
【請求項２】
少なくとも１種のアジュバントをさらに含む「請求項１」記載の免疫原。
【請求項３】
アジュバントはＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン又はアジュバント活性を有するその誘導体である「請求項２」記載の免疫原。
【請求項４】
アジュバントは、コレラトキシン（ＣＴ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）及びアジュバント活性を有するそれらの突然変異体からなる群から選択される「請求項１」記載の免疫原。
【請求項５】
上記抗原の少なくとも１種は、大腸菌コロニゼーション因子抗原（ＣＦＡ）に対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項６】
大腸菌コロニゼーション因子抗原は、ＣＦＡ／１，ＣＳ１，ＣＳ２，ＣＳ３，ＣＳ４，ＣＳ５，ＣＳ６，ＣＳ１７及びＰＣＦ０１６６からなる群から選択される「請求項５」記載の免疫原。
【請求項７】
上記抗原の少なくとも１種は大腸菌エンテロトキシンＳＴａに対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項８】
１又は２種以上の抗原は少なくともＣＳ３及びＣＳ６；ＣＳ３及びＣＦＡ／１；ＣＳ６及びＣＦＡ／１；ＣＳ３及びＳＴａ；ＣＳ６及びＳＴａ；又はＣＦＡ／１及びＳＴａに対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項９】
１又は２種以上の抗原は少なくともＣＦＡ／１，ＣＳ３及びＣＳ６；ＣＦ３，Ｓ６及びＳＴａ；ＣＥＡ／１，ＣＳ３及びＳＴａ；ＣＦＡ／１，ＣＳ６及びＳＴａ；又はＣＳ３，ＣＳ６及びＳＴａに対する免疫応答を誘発する「請求項１〜４」のいずれかに記載の免疫原。
【請求項１０】
経皮免疫感作に適当なワクチンであって、上記ワクチンはパッチ及び「請求項１〜９」のいずれかに記載の免疫原を含む、上記ワクチン。
【請求項１１】
経皮免疫感作に適当なサブユニットワクチンであって、上記ワクチンは化学的合成された、組換え技術によって産生された、少なくとも部分的に精製された、またはそれらの組合せによる、細胞フリーな型にある「請求項１〜９」のいずれかに記載の免疫原を含むワクチン。
【請求項１２】
経皮免疫感作に適当な全細胞ワクチンにおいて、上記ワクチンは全細胞型での「請求項１〜９」のいずれかに記載の免疫原を含む、上記ワクチン。
【請求項１３】
１又は２種以上のＥＴＥＣ株に対して免疫応答を誘発するための「請求項１〜１２」のいずれかに記載の免疫原又はワクチンの使用。
【請求項１４】
旅行者の下痢に伴う１又は２以上の疾患症状の処置及び／又は予防のための「請求項１〜１２」のいずれかに記載の免疫原又はワクチンの使用。
【請求項１５】
化学的及び／又は物理学的浸透増強をさらに含む、「請求項１３又は１４」記載の使用。
【請求項１６】
経皮免疫感作によってＥＴＥＣの１又は２種以上の株に対する免疫応答を誘発する免疫原又はワクチンを製造するための１又は２種以上の抗原の有効量の使用。
【請求項１７】
経皮免疫感作によってＥＴＥＣの１又は２種以上の株に対する免疫応答を誘発する免疫原又はワクチンを製造するための少なくとも１種のアジュバント及び１又は２種以上の抗原の有効量の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公開番号】特開２０１０−１８０２２８（Ｐ２０１０−１８０２２８Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８５２０８（Ｐ２０１０−８５２０８）
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【分割の表示】特願２００２−５６３９５５（Ｐ２００２−５６３９５５）の分割
【原出願日】平成１４年２月１３日（２００２．２．１３）
【出願人】（５０３２９１３９２）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【分割の表示】特願２００２−５６３９５５（Ｐ２００２−５６３９５５）の分割
【原出願日】平成１４年２月１３日（２００２．２．１３）
【出願人】（５０３２９１３９２）
【Ｆターム（参考）】
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