結核の予防ワクチン
【課題】 ＭＴＢ−Ｃの毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬を使用し、これによりヒト型結核菌により引き起こされる結核の予防的治療薬を調剤することである。
【解決手段】 結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬の使用において、前記免疫療法薬の製造法は、（Ａ）ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を、３週間以上の培養期間で、培養するステップと、（Ｂ）非イオン性界面活性剤の存在下で、前記細胞の培養菌を均質化するステップと、を有する。
【解決手段】 結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬の使用において、前記免疫療法薬の製造法は、（Ａ）ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を、３週間以上の培養期間で、培養するステップと、（Ｂ）非イオン性界面活性剤の存在下で、前記細胞の培養菌を均質化するステップと、を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、ヒト型結核菌複合体の病原菌により引き起こされる慢性感染症疾患である。ヒト型結核菌複合体は、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）、ウシ型結核菌（M. bovis）、ネズミ由来結核菌（M. microti）、好気性結核菌（M. africanum）の種を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】スペイン特許第２２３１０３７−Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】E. Ribi et al., Nature 1963, 198, pages 1214 to 1215
【非特許文献２】D.P. Pal et al., Indian J. Med. Res. 1977, 65, pages 340 to 345
【非特許文献３】G.K. Khuller et al., Folia Microbiol., 1992, 37, pages 407 to 412
【非特許文献４】E.M. Agger et al., Scand. J. Immunol., 2002, 56, pages 443 to 447
【非特許文献５】I.M. Orme Vaccine, 2006, 24, pages 2 to 19
【非特許文献６】S.H.E. Kaufmann, Nature Rev. Immunol. 2006, 6, 699-704
【０００５】
世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、結核の症状を示す新たな患者が８百万人世界中で毎年記録されており、そのうち約３百万人が死に至る。実際に、世界中で２０億人以上の感染者が存在し、９千万人から１億人が毎年新たに感染している。
【０００６】
結核の予防治療として現在用いられているワクチンは、ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin：カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧワクチンの調製に使うウシ型結核菌の弱毒化された−菌株）と称する菌株のバクテリアとウシ型結核菌の弱毒化した変異体を利用している。
【０００７】
ヒト型結核菌の毒性のあるいは弱毒性の（或いは無毒化した）菌株の細胞壁断片を利用した結核予防の様々なワクチンは、従来文献に記載されている。ワクチンの組成に使用される補助薬（adjuvant）が、ワクチンの有効性に大きな影響を及ぼすと記載されている。
【０００８】
非特許文献１は、無毒化したＢＣＧ菌株の細胞壁断片と鉱油を含む組成物で行った免疫化分析について記載する。この細胞壁断片は、鉱油の中での前記の菌株の培養物の均質化プロセスにより得られる。この組成物は、従来のワクチン（ＢＣＧ）よりも有効である。しかし、非特許文献１は、細胞壁断片は、鉱油が存在しない水で均質化して生成した場合には、如何なる免疫反応（immunological response）も示さないと、記載している。
【０００９】
非特許文献２は、毒性のＨ３７Ｒｖ菌株の細胞壁断片と鉱油で生成したワクチンを開示する。この場合には、細胞壁断片は、水溶相で死細胞を均質化し、その後鉱油をこの組成物に加えて生成している。同文献によれば、水溶相で均質化された細胞壁断片は、免疫原ではなく、また鉱油の存在がワクチンを有効にするために必要であると、記載する。
【００１０】
非特許文献３によれば、フロインドの不完全アジュバンド(Freund's incomplete adjuvant)で形成したヒト型結核菌の弱毒性のＨ３７Ｒａ菌株の様々な細胞壁断片の保護効用について記載するが、この場合も鉱油を含んでいる。
【００１１】
非特許文献４は、毒性のＨ３７Ｒｖ菌株の細胞壁断片を含むワクチンは、それが陽イオン界面活性剤である臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（dimethydioctadecylammonium）を補助薬として含む場合に、有効であると、述べている。同時に、同非特許文献４は、均質化したヒト型結核菌ワクチンによる効力判定は、上記の補助薬を含まない場合には、マウスモデル（murine model）の結核菌に対し一般的なレベルの耐性を示さないとも、述べている。
【００１２】
非特許文献５は、結核の新たな予防ワクチンの最新の研究報告であるが、従来のＢＣＧワクチンは、成人の結核予防に有効でないと、述べている。同時に同文献５は、様々な種類のワクチン（タンパク質とのサブユニット・ワクチン、ＤＮＡとのワクチン、ウィルスと組み合わせたワクチン、遺伝子組み換え型菌株ワクチン）に対する複数の候補を効力検定しており、新たな展開が期待される。
【００１３】
ヒト型結核菌に起因する感染症を防止する予防ワクチンで、弱毒化したＢＣＧ菌株を利用した現在のワクチンよりも有効性の高い予防ワクチンの必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ＭＴＢ−Ｃの毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬を使用することであり、ヒト型結核菌により引き起こされる感染症の予防的治療薬を調剤することである。
【００１５】
特許文献１は、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を含む細胞壁断片を含む免疫療法薬を調剤する方法を開示する。同時に、それを含む組成物と、他の薬剤と組み合わせた結核の混合治療への応用についても開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本明細書は、結核の予防的治療を調剤するために、前記免疫療法薬の使用方法を開示する。
【００１７】
本発明の目的は、結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬の使用を開示することである。前記免疫療法薬の製造法は、（Ａ）ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を、３週間以上の培養期間で、培養するステップと、（Ｂ）非イオン性界面活性剤の存在下で、前記細胞の培養物を均質化するステップとを有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
この毒性菌株は、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の如何なる毒性菌株でもよい。この分野の研究者により最も広く使用されている毒性菌株の一つは、Ｈ３７Ｒｖと称する菌株である。これは、英国のロンドンにある菌株寄託機関（ＮＣＴＣ：National Collection of Type Cultures）に保管（保管番号：ＮＣ００７４１６）されており、そこで入手可能である。
【００１９】
この毒性菌株は、当業者に公知の培養媒体内に植菌することにより培養される。
培養媒体の一例は、ミドルブルック（Middlebrook）７Ｈ１０または７Ｈ１０の寒天培養基、ソートン（Sauton）の培養媒体、プロスカウアー・ベック（Proskauer-Beck）の培養媒体である。
【００２０】
毒性菌株の培養期間は、３週間以上で、好ましくは３−４週間である。その培養温度は、好ましくは３４℃と３８℃の間である。
【００２１】
培養が終了すると、細胞は、特許文献１に開示された方法により、分離される。
【００２２】
活性細胞（live cell）の均質化プロセスは、非イオン性の界面活性剤の存在下で行う。好ましくは、中性ｐＨ（ｐＨ６から８の間）の緩衝媒体中で行う。緩衝媒体の一例は、ＰＢＳ緩衝液（燐酸塩で緩衝した食塩水）である。
【００２３】
この均質化プロセスは、超音波による分解、あるいは機械的均質化装置と組み合わせた他の手段でも行うことができる。この他の手段の一例は、直径が１ｍｍでシリカ製あるいはジルコニア／シリカ製のビーズを用いて行われる。ここで使用される機械的均質化装置は、BioSpec BeadBeater(登録商標）モデル（細胞粉砕装置）である。
【００２４】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）は、均質化プロセスで破砕され、小さな細胞壁断片が得られる。
【００２５】
均質化プロセスで使用される非イオン性の界面活性剤は、エトキシル酸アルキルフェノール類（alkylphenol ethoxylates）、エトキシル酸ソルビタンエステル類（sorbitan ester ethixykates）、又はそれらの混合物からなるグループから選択される。
【００２６】
より好ましくは、非イオン性の界面活性剤は、エトキシル酸オクチルフェノール（octylphenol ethoxylates）のグループから選択される。より好ましくは、エチレン酸化物（etylene oxide）を７−８モル含むエトキシル酸オクチルフェノールが用いられる。この界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（登録商標）の名称で市販されている。
【００２７】
均質化ステップで使用される非イオン性の界面活性剤の均等質（homogenate細胞構造を細かく破壊して得る均一な懸濁液）の全重量に対する割合は、１−１０重量％であり、より好ましくは、３−６重量％である。
【００２８】
細胞壁断片を含む均質化した均等質に、従来の処理を施して、断片化していない細胞と可溶化した組成物を分離し廃棄する。特許文献１に開示された異なる速度での遠心分離と緩衝溶液での洗浄が用いられる。細胞壁断片を含む沈殿物が、上記の純化プロセスの後に、得られる。この沈殿物は、ＰＢＳ緩衝液内に拡散して、従来の処理を施して、ＭＴＢ−Ｃ細胞の完全な不活性化を行う。このＭＴＢ−Ｃ細胞は、断片化プロセスと純化プロセスの後でも依然として見えることもある。上記の処理は、化学的プロセス、物理的プロセスの何れかである。化学的プロセスは、ホルムアルデヒドによる処理であり、物理的プロセスは、オートクレーブ法（高圧蒸気殺菌法）による処理と低温殺菌による処理である。
【００２９】
不活性化処理の後に得られたＰＢＳ緩衝液内で拡散している細胞壁断片を、低温乾燥して貯蔵を容易にする。このために、拡散液をガラス瓶の中に入れて低温乾燥する。この低温乾燥の温度は、−１５℃〜−２５℃で、０．１〜０．５ｍｂａｒの真空中で行う。
【００３０】
低温乾燥プロセスの後に得られたガラス瓶は、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の細胞壁断片を含む免疫療法薬を含み、これを低温（例、−７０℃）で貯蔵する。
【００３１】
上記したように本発明の目的は、結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の使用である。
【００３２】
結核の予防治療薬は、細胞壁断片、選択的事項としては、薬理上許容可能な希釈液、補助薬または賦形剤を利用した免疫療法薬である。この結核の予防治療薬は、燐酸塩を緩衝した食塩水、水様液、乳剤あるいはリポソームの形態で、得られる。
【００３３】
この薬剤は、リポソームの形態が好ましい。
【００３４】
リポソームは、従来の補助脂質と特許文献１に開示された当業者に公知の方法で、得られる。
【００３５】
このリポソームは、ホスファリピド（リン脂質）とステロールを含む。ホスファチドは、中性あるいは負の正味電荷を有する。
【００３６】
使用されるホスファリピドは、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine）とホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）を含む。
【００３７】
リポソームの主要構成分は、通常、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）である。これは、合成物、あるいは天然素材から分離した物である。頻繁に使用される市販品は、大豆由来のレシチンである。このレシチンは、ホスファチジルコリンを主に含むホスファリピドの複合混合物である。
【００３８】
ステロールは、リポソームの調剤の際に使用され、コレステロールと胆汁酸塩である。
【００３９】
リポソームは、好ましくは、大豆由来のレシチンとコール酸ナトリウム（sodium cholate）の混合物から生成される。
【００４０】
リポソームは、選択的事項として、このリポソームの安定性を向上するための添加剤を含む。この添加剤の一例は、脂質酸化防止剤として機能するビタミンＥである。
【００４１】
このリポソームは、１ミクロン以下のものが９９．９％を占める。
【００４２】
このリポソームを、凍結乾燥化処理し、かくして、凍結乾燥されたリポソームの形態の免疫療法薬が得られる。
【００４３】
免疫療法薬を含む薬剤を、１回あるいは複数回（のドーズで）投薬する。複数回（のドーズで）投薬では、ある一定の間隔をあけて、免疫療法薬を投与する。好ましくは、２回の投薬は、２〜５週間の間隔をあけて、好ましくは３〜４週間の間隔をあけて、行う。
【００４４】
この薬剤は、粘膜を通して投薬することができる。例えば、目の粘膜、鼻腔内の粘膜、口内の粘膜、胃の、腸管の粘膜、膣の粘膜、尿路の粘膜を通して投与する。又は非経口で、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射、腹腔内注射で投薬する。非経口の投薬が好ましい。
【００４５】
適切な一回の投薬量（ドーズ）は、いくつかのパラメータに依存する。このパラメータは、治療対象と投薬方法による。好ましくは、ドーズ（一回の投薬量）は、１μｇ〜１０００μｇで、より好ましくは２５μｇ〜７００μｇ、さらに好ましくは５０μｇ〜２００μｇである。
【００４６】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む薬剤は、他の結核予防薬のワクチンと共に投与することもできる。これに関しては、非特許文献６に記載されている。この一例としては、ＢＣＧワクチン、サブユニット・ワクチン、組み換えＢＣＧワクチンである。
【００４７】
ワクチンの組み合わせは、同時に、あるいは接種（投与）間隔を開けた２回の接種で行うこともできる。その接種間隔は、数年にわたる場合もある
【００４８】
接種間隔を開けた場合、最初の接種（投与）は、結核予防のワクチンを投与し、その後、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む薬剤を投与する。後者の薬剤は、最初に接種されたワクチンの再励起剤（追加抗原刺激剤）として、機能する。
【００４９】
意外なことに、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬を含む薬剤の投与は、Ｔｈ１型のインターフェロン・ガンマ（γ）を生成できる。このＴｈ１型のインターフェロンγは、ヒト型結核菌特有の抗原に対し反応を示す。前記抗原は、Ａｇ８５ＢとＡｇ８５Ａとを含む。これらはＡｇ８５複合体の一部である。このＡｇ８５ＢとＡｇ８５Ａは、低分子量（low molecular）のタンパク質の族からなり、バクテリアの培養が対数増殖期（log phase）にある時、かなりの量生成される。この低分子重量のタンパク質は、細胞壁の生合成で重要な役目を担う。
【００５０】
従来のＢＣＧワクチンは、Ａｇ８５複合体の抗原に対し免疫的反応を示さないことが観測されている。これは、低い保護機能を示す結果となる。
【００５１】
前記免疫療法薬でワクチン接種しその後毒性のＨ３７Ｒｖ菌株を感染させたネズミの肺の中に存在する生存能力のある病原菌の数は、制御グループのネズミに存在する生存能力のある病原菌の数（その数は、従来のＢＣＧワクチンでワクチンを施したネズミの病原菌の数と同等である）よりも少ないことが見出された。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の一実施例の詳細を示す。
【実施例１】
【００５３】
ヒト型結核菌により引き起こされた感染症に対する予防ワクチンとしての免疫療法薬の効能。
この実験例で使われた免疫療法薬は、特許文献１の実施例２の方法で製造した。
【００５４】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の有効性を、年齢が６週間から８週間で、特定の病原体のないＣ５７ＢＬ／６型の雌のネズミで、評価した。
【００５５】
ネズミを、それぞれが１２匹からなる３つのグループに分け、各グループに以下のワクチン接種を行った。
（１）ワクチンを投与しない（制御グループ）、
（２）特許文献１の実施例２で得られた免疫療法薬２８５μｇを、２回（実験の３週間目と６週間目）で皮下に接種した。
（３）ＢＣＧのデーニッシュ菌株（Statens Serum Institute, Denmark：デンマーク政府によって、1902年に設立され、ジフテリアの抗毒素・血清などの供給をその起源とする研究所）の２×１０６のコロニーの形成ユニットを、実験のゼロ週間目で皮下に接種した。
【００５６】
ヒト型結核菌複合体の毒性菌株（Ｈ３７Ｒｖパスツール）は、対数増殖期中期（mid-log phase）までプロスカウアー・ベック（Proskauer-Beck）の培養媒体内で培養し、これを感染用として用いた。使用するまで、温度−７０℃で１ｍｌのアリコート内で貯蔵した。
【００５７】
ネズミを、前記の毒性菌株で、実験の９週間目に、ミドルブルック・エアゾール（Middlebrook aerosol）感染装置内に、入れることにより、霧状物質で感染させた。この感染装置は、ネズミの肺の中に、約１０−５０の生存能力のある病原菌の植菌を提供する。
【００５８】
肺の中の生存能力のある病原菌の数は、ネズミの霧状感染の３週間後（即ち、実験の１２週目）に決定した。これにより３７℃で４週間、ミドルブルック７Ｈ１１の寒天培養基内の肺の均質化物の一連の拡散が引き起こされた。この肺は、１ｍｌの２回蒸留水の存在下で、均質化した。
【００５９】
表１の結果は、肺の中で確認された１ｍｌ当たりコロニ形成ユニット（ＣＦＵ：colony forming units）を対数で表示した。
表１
ネズミのグループ ワクチン Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ
１ 何もしない（制御グループ） ６．４２±０．２４
２ リポソームでカプセル化した免疫療法薬 ５．７２±０．３０
３ ＢＣＧ ５．７１±０．５８
【００６０】
ワクチンを投与しないネズミの第１グループと、ワクチンを投与したネズミの第２，３のグループとの間の差異は、統計学上意味のあるものである。
【００６１】
第２グループのネズミの肺の中の生存能力のある病原菌の数は、第１グループのネズミの肺の中の生存能力のある病原菌の数よりも少ない。第２グループのネズミの病原菌の数は、第３グループのネズミの病原菌の数にほぼ等しい。
【００６２】
それゆえに、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を用いた免疫療法薬のワクチン投与は、ヒト型結核菌により引き起こされる感染に対し良好な保護を達成する。
【実施例２】
【００６３】
ヒト型結核菌により引き起こされた感染症に対するＴｈｌ反応の生成器としての免疫療法薬の有効性。
この実験例で使われた免疫療法薬は、特許文献１の実験例２の方法により準備した。
【００６４】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の有効性を、年齢が６週間から８週間で、特定の病原体のないＣ５７ＢＬ／６型の雌のネズミで、生体外実験で、評価した。
【００６５】
ネズミは、それぞれが４匹からなるグループに分け、各グループに以下のワクチン投与を行った。
（１）実験の３週間目と６週間目に塩水を皮下に接種した（制御グループ）。
（２）特許文献１の実施例２で得られた免疫療法薬２８５μｇを、２回（実験の３週間目と６週間目）に、皮下に接種した。
（３）ＢＣＧのデーニッシュ菌株の２×１０６のコロニー形成ユニットを、１回実験のゼロ週間目に皮下に接種し、塩水を３週間目と６週間目に皮下に接種した。
（４）ヒト型結核菌複合体の毒性菌株（Ｈ３７Ｒｖパスツール）の２×１０６のコロニー形成ユニットを、１回実験の３週間目に皮下に接種し、塩水を６週間目に皮下に接種した。
【００６６】
ネズミを第７週で実験用に殺しその脾臓を摘出し、L-glutamine-RPMI（Gibco）を５ｍｌ含むチューブ内に浸した。このチューブを氷の中に実験の終了時まで浸した。この脾臓を、機械的に分解し、縣濁液を直径が７０μｍのナイロンメッシュで濾過した。その後、これを１０分間３００ｇの力で遠心分離した。ペレット剤を、Trisと塩化アンモニウムを２回蒸留水中に溶かした１５ｍｌの溶液で、再形成し、この細胞に対し崩壊を行った。８分後、それらを２０ｍｌのL-glutamine-RPMIで洗浄し、１０分間３００ｇ（重力加速度）の力で遠心分離した。
【００６７】
かくして得られたペレット剤を、５ｍｌのL-glutamine-RPMIで再度縣濁し、この縣濁液を直径７０μｍのナイロンメッシュで濾過した。この細胞を、ノイバウエル・チャンバ（Neubauer chamber）でカウントした。
【００６８】
ネズミの脾臓からの細胞を１×１０５細胞（cell）／井戸（well）の比率で、皿上に植菌し、２００μｌの完全な培養媒体（ＣＣＭ：complete culture medium）で培養した。この完全な培養媒体は、非活性化したウシ胎仔血清と、ペニシリンと、ストレプトマイシンと、ピルビン酸塩ナトリウム（sodium pyruvate）と、２−メルカプトエタノールで補充したL-glutamine-RPMIからなる。あるいはヒト型結核菌抗原で補充した２００μｌの完全な培養媒体からなる。ヒト型結核菌抗原は、１０μｇ／ｍｌの抗原ＰＰＤ（デンマーク、Statens Serum Institut社製）と、５μｇ／ｍｌのＥＳＡＴ−６、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ（ドイツ連邦共和国、Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH社製）である。
【００６９】
この細胞を５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃で培養した。９６時間後、皿を１０分間３００ｇの力で遠心分離し、それらの上澄みを収集した。
【００７０】
この上澄みを凍らせて、この状態で少なくとも２４時間維持した後、インターフェロン−ガンマ（γ）内容物を、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術（double sandwich ELISA technique）を適用し、マウス・インターフェロンγ（Diaclone）用に特定のモノクローナル抗体を用いて、解析した。
【００７１】
表２は、ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌで表した平均インターフェロンγ濃度である。このインターフェロンγは、ヒト型結核抗原に対するネズミの各グループに誘導された。
表２
グループ 接種材料 抗原
制御 ＰＰＤ ＥＳＡＴ−６ Ａｇ８５Ｂ Ａｇ８５Ａ
１ 制御 ０ ０ ０ ０ ０
２ リポソームで ０ ２．５７ ０ ２．６９注１ ２．５３注１
カプセル化した免疫治療法薬剤
３ ＢＣＧ ０ ２．０１注３ ０ ０ ０
４ Ｈ３７Ｒｖ ０ ３．０６注３ ２．８６注２，３ ２．７６注３ ２．５０注３
注１ グループ２と３の間に統計的な有意差がある。
注２ グループ２と４の間に統計的な有意差がある。
注３ グループ３と４の間に統計的な有意差がある。
【００７２】
表２の結果によれば、ヒト型結核菌の毒性の株菌の細胞壁断片を利用するリポソームでカプセル化した免疫療法薬で行った２つの植菌は、ヒト型結核菌特有の抗原に対するインターフェロンγの生成を誘導できることを意味する。これは、それらが、Ｔｈ１型の保護反応を誘導することを意味する。
【００７３】
リポソームでカプセル化した免疫療法薬により、抗原ＰＰＤ、Ａｇ８５ＢとＡｇ８５Ａに対し、誘導された反応は、ヒト型結核菌の毒性のＨ３７Ｒｖ菌株により培養されたネズミのグループに対する反応と大幅な差はない。前記の反応は、従来のワクチンであるＢＣＧ株菌を接種したネズミのグループの反応よりも良好である。その理由は、ＰＰＤのみに対する反応を誘導し、Ａｇ８５ＢとＡｇ８５Ａに対しては反応を誘導しないからである。
【００７４】
毒性菌株で接種したネズミのグループのみが、抗原ＥＳＡＴ−６に対する反応を誘導することができる。
【００７５】
ヒト型結核菌の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬は、ヒト型結核菌に特有な抗原に対しＴｈ１型の保護反応を生成できる。これは、ヒト型結核菌により引き起こされる感染を阻止するのに有効な指標である。
【００７６】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、ヒト型結核菌複合体の病原菌により引き起こされる慢性感染症疾患である。ヒト型結核菌複合体は、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）、ウシ型結核菌（M. bovis）、ネズミ由来結核菌（M. microti）、好気性結核菌（M. africanum）の種を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】スペイン特許第２２３１０３７−Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】E. Ribi et al., Nature 1963, 198, pages 1214 to 1215
【非特許文献２】D.P. Pal et al., Indian J. Med. Res. 1977, 65, pages 340 to 345
【非特許文献３】G.K. Khuller et al., Folia Microbiol., 1992, 37, pages 407 to 412
【非特許文献４】E.M. Agger et al., Scand. J. Immunol., 2002, 56, pages 443 to 447
【非特許文献５】I.M. Orme Vaccine, 2006, 24, pages 2 to 19
【非特許文献６】S.H.E. Kaufmann, Nature Rev. Immunol. 2006, 6, 699-704
【０００５】
世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、結核の症状を示す新たな患者が８百万人世界中で毎年記録されており、そのうち約３百万人が死に至る。実際に、世界中で２０億人以上の感染者が存在し、９千万人から１億人が毎年新たに感染している。
【０００６】
結核の予防治療として現在用いられているワクチンは、ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin：カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧワクチンの調製に使うウシ型結核菌の弱毒化された−菌株）と称する菌株のバクテリアとウシ型結核菌の弱毒化した変異体を利用している。
【０００７】
ヒト型結核菌の毒性のあるいは弱毒性の（或いは無毒化した）菌株の細胞壁断片を利用した結核予防の様々なワクチンは、従来文献に記載されている。ワクチンの組成に使用される補助薬（adjuvant）が、ワクチンの有効性に大きな影響を及ぼすと記載されている。
【０００８】
非特許文献１は、無毒化したＢＣＧ菌株の細胞壁断片と鉱油を含む組成物で行った免疫化分析について記載する。この細胞壁断片は、鉱油の中での前記の菌株の培養物の均質化プロセスにより得られる。この組成物は、従来のワクチン（ＢＣＧ）よりも有効である。しかし、非特許文献１は、細胞壁断片は、鉱油が存在しない水で均質化して生成した場合には、如何なる免疫反応（immunological response）も示さないと、記載している。
【０００９】
非特許文献２は、毒性のＨ３７Ｒｖ菌株の細胞壁断片と鉱油で生成したワクチンを開示する。この場合には、細胞壁断片は、水溶相で死細胞を均質化し、その後鉱油をこの組成物に加えて生成している。同文献によれば、水溶相で均質化された細胞壁断片は、免疫原ではなく、また鉱油の存在がワクチンを有効にするために必要であると、記載する。
【００１０】
非特許文献３によれば、フロインドの不完全アジュバンド(Freund's incomplete adjuvant)で形成したヒト型結核菌の弱毒性のＨ３７Ｒａ菌株の様々な細胞壁断片の保護効用について記載するが、この場合も鉱油を含んでいる。
【００１１】
非特許文献４は、毒性のＨ３７Ｒｖ菌株の細胞壁断片を含むワクチンは、それが陽イオン界面活性剤である臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（dimethydioctadecylammonium）を補助薬として含む場合に、有効であると、述べている。同時に、同非特許文献４は、均質化したヒト型結核菌ワクチンによる効力判定は、上記の補助薬を含まない場合には、マウスモデル（murine model）の結核菌に対し一般的なレベルの耐性を示さないとも、述べている。
【００１２】
非特許文献５は、結核の新たな予防ワクチンの最新の研究報告であるが、従来のＢＣＧワクチンは、成人の結核予防に有効でないと、述べている。同時に同文献５は、様々な種類のワクチン（タンパク質とのサブユニット・ワクチン、ＤＮＡとのワクチン、ウィルスと組み合わせたワクチン、遺伝子組み換え型菌株ワクチン）に対する複数の候補を効力検定しており、新たな展開が期待される。
【００１３】
ヒト型結核菌に起因する感染症を防止する予防ワクチンで、弱毒化したＢＣＧ菌株を利用した現在のワクチンよりも有効性の高い予防ワクチンの必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ＭＴＢ−Ｃの毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬を使用することであり、ヒト型結核菌により引き起こされる感染症の予防的治療薬を調剤することである。
【００１５】
特許文献１は、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を含む細胞壁断片を含む免疫療法薬を調剤する方法を開示する。同時に、それを含む組成物と、他の薬剤と組み合わせた結核の混合治療への応用についても開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本明細書は、結核の予防的治療を調剤するために、前記免疫療法薬の使用方法を開示する。
【００１７】
本発明の目的は、結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬の使用を開示することである。前記免疫療法薬の製造法は、（Ａ）ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を、３週間以上の培養期間で、培養するステップと、（Ｂ）非イオン性界面活性剤の存在下で、前記細胞の培養物を均質化するステップとを有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
この毒性菌株は、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の如何なる毒性菌株でもよい。この分野の研究者により最も広く使用されている毒性菌株の一つは、Ｈ３７Ｒｖと称する菌株である。これは、英国のロンドンにある菌株寄託機関（ＮＣＴＣ：National Collection of Type Cultures）に保管（保管番号：ＮＣ００７４１６）されており、そこで入手可能である。
【００１９】
この毒性菌株は、当業者に公知の培養媒体内に植菌することにより培養される。
培養媒体の一例は、ミドルブルック（Middlebrook）７Ｈ１０または７Ｈ１０の寒天培養基、ソートン（Sauton）の培養媒体、プロスカウアー・ベック（Proskauer-Beck）の培養媒体である。
【００２０】
毒性菌株の培養期間は、３週間以上で、好ましくは３−４週間である。その培養温度は、好ましくは３４℃と３８℃の間である。
【００２１】
培養が終了すると、細胞は、特許文献１に開示された方法により、分離される。
【００２２】
活性細胞（live cell）の均質化プロセスは、非イオン性の界面活性剤の存在下で行う。好ましくは、中性ｐＨ（ｐＨ６から８の間）の緩衝媒体中で行う。緩衝媒体の一例は、ＰＢＳ緩衝液（燐酸塩で緩衝した食塩水）である。
【００２３】
この均質化プロセスは、超音波による分解、あるいは機械的均質化装置と組み合わせた他の手段でも行うことができる。この他の手段の一例は、直径が１ｍｍでシリカ製あるいはジルコニア／シリカ製のビーズを用いて行われる。ここで使用される機械的均質化装置は、BioSpec BeadBeater(登録商標）モデル（細胞粉砕装置）である。
【００２４】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）は、均質化プロセスで破砕され、小さな細胞壁断片が得られる。
【００２５】
均質化プロセスで使用される非イオン性の界面活性剤は、エトキシル酸アルキルフェノール類（alkylphenol ethoxylates）、エトキシル酸ソルビタンエステル類（sorbitan ester ethixykates）、又はそれらの混合物からなるグループから選択される。
【００２６】
より好ましくは、非イオン性の界面活性剤は、エトキシル酸オクチルフェノール（octylphenol ethoxylates）のグループから選択される。より好ましくは、エチレン酸化物（etylene oxide）を７−８モル含むエトキシル酸オクチルフェノールが用いられる。この界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（登録商標）の名称で市販されている。
【００２７】
均質化ステップで使用される非イオン性の界面活性剤の均等質（homogenate細胞構造を細かく破壊して得る均一な懸濁液）の全重量に対する割合は、１−１０重量％であり、より好ましくは、３−６重量％である。
【００２８】
細胞壁断片を含む均質化した均等質に、従来の処理を施して、断片化していない細胞と可溶化した組成物を分離し廃棄する。特許文献１に開示された異なる速度での遠心分離と緩衝溶液での洗浄が用いられる。細胞壁断片を含む沈殿物が、上記の純化プロセスの後に、得られる。この沈殿物は、ＰＢＳ緩衝液内に拡散して、従来の処理を施して、ＭＴＢ−Ｃ細胞の完全な不活性化を行う。このＭＴＢ−Ｃ細胞は、断片化プロセスと純化プロセスの後でも依然として見えることもある。上記の処理は、化学的プロセス、物理的プロセスの何れかである。化学的プロセスは、ホルムアルデヒドによる処理であり、物理的プロセスは、オートクレーブ法（高圧蒸気殺菌法）による処理と低温殺菌による処理である。
【００２９】
不活性化処理の後に得られたＰＢＳ緩衝液内で拡散している細胞壁断片を、低温乾燥して貯蔵を容易にする。このために、拡散液をガラス瓶の中に入れて低温乾燥する。この低温乾燥の温度は、−１５℃〜−２５℃で、０．１〜０．５ｍｂａｒの真空中で行う。
【００３０】
低温乾燥プロセスの後に得られたガラス瓶は、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の細胞壁断片を含む免疫療法薬を含み、これを低温（例、−７０℃）で貯蔵する。
【００３１】
上記したように本発明の目的は、結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の使用である。
【００３２】
結核の予防治療薬は、細胞壁断片、選択的事項としては、薬理上許容可能な希釈液、補助薬または賦形剤を利用した免疫療法薬である。この結核の予防治療薬は、燐酸塩を緩衝した食塩水、水様液、乳剤あるいはリポソームの形態で、得られる。
【００３３】
この薬剤は、リポソームの形態が好ましい。
【００３４】
リポソームは、従来の補助脂質と特許文献１に開示された当業者に公知の方法で、得られる。
【００３５】
このリポソームは、ホスファリピド（リン脂質）とステロールを含む。ホスファチドは、中性あるいは負の正味電荷を有する。
【００３６】
使用されるホスファリピドは、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine）とホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）を含む。
【００３７】
リポソームの主要構成分は、通常、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）である。これは、合成物、あるいは天然素材から分離した物である。頻繁に使用される市販品は、大豆由来のレシチンである。このレシチンは、ホスファチジルコリンを主に含むホスファリピドの複合混合物である。
【００３８】
ステロールは、リポソームの調剤の際に使用され、コレステロールと胆汁酸塩である。
【００３９】
リポソームは、好ましくは、大豆由来のレシチンとコール酸ナトリウム（sodium cholate）の混合物から生成される。
【００４０】
リポソームは、選択的事項として、このリポソームの安定性を向上するための添加剤を含む。この添加剤の一例は、脂質酸化防止剤として機能するビタミンＥである。
【００４１】
このリポソームは、１ミクロン以下のものが９９．９％を占める。
【００４２】
このリポソームを、凍結乾燥化処理し、かくして、凍結乾燥されたリポソームの形態の免疫療法薬が得られる。
【００４３】
免疫療法薬を含む薬剤を、１回あるいは複数回（のドーズで）投薬する。複数回（のドーズで）投薬では、ある一定の間隔をあけて、免疫療法薬を投与する。好ましくは、２回の投薬は、２〜５週間の間隔をあけて、好ましくは３〜４週間の間隔をあけて、行う。
【００４４】
この薬剤は、粘膜を通して投薬することができる。例えば、目の粘膜、鼻腔内の粘膜、口内の粘膜、胃の、腸管の粘膜、膣の粘膜、尿路の粘膜を通して投与する。又は非経口で、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射、腹腔内注射で投薬する。非経口の投薬が好ましい。
【００４５】
適切な一回の投薬量（ドーズ）は、いくつかのパラメータに依存する。このパラメータは、治療対象と投薬方法による。好ましくは、ドーズ（一回の投薬量）は、１μｇ〜１０００μｇで、より好ましくは２５μｇ〜７００μｇ、さらに好ましくは５０μｇ〜２００μｇである。
【００４６】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む薬剤は、他の結核予防薬のワクチンと共に投与することもできる。これに関しては、非特許文献６に記載されている。この一例としては、ＢＣＧワクチン、サブユニット・ワクチン、組み換えＢＣＧワクチンである。
【００４７】
ワクチンの組み合わせは、同時に、あるいは接種（投与）間隔を開けた２回の接種で行うこともできる。その接種間隔は、数年にわたる場合もある
【００４８】
接種間隔を開けた場合、最初の接種（投与）は、結核予防のワクチンを投与し、その後、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む薬剤を投与する。後者の薬剤は、最初に接種されたワクチンの再励起剤（追加抗原刺激剤）として、機能する。
【００４９】
意外なことに、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬を含む薬剤の投与は、Ｔｈ１型のインターフェロン・ガンマ（γ）を生成できる。このＴｈ１型のインターフェロンγは、ヒト型結核菌特有の抗原に対し反応を示す。前記抗原は、Ａｇ８５ＢとＡｇ８５Ａとを含む。これらはＡｇ８５複合体の一部である。このＡｇ８５ＢとＡｇ８５Ａは、低分子量（low molecular）のタンパク質の族からなり、バクテリアの培養が対数増殖期（log phase）にある時、かなりの量生成される。この低分子重量のタンパク質は、細胞壁の生合成で重要な役目を担う。
【００５０】
従来のＢＣＧワクチンは、Ａｇ８５複合体の抗原に対し免疫的反応を示さないことが観測されている。これは、低い保護機能を示す結果となる。
【００５１】
前記免疫療法薬でワクチン接種しその後毒性のＨ３７Ｒｖ菌株を感染させたネズミの肺の中に存在する生存能力のある病原菌の数は、制御グループのネズミに存在する生存能力のある病原菌の数（その数は、従来のＢＣＧワクチンでワクチンを施したネズミの病原菌の数と同等である）よりも少ないことが見出された。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の一実施例の詳細を示す。
【実施例１】
【００５３】
ヒト型結核菌により引き起こされた感染症に対する予防ワクチンとしての免疫療法薬の効能。
この実験例で使われた免疫療法薬は、特許文献１の実施例２の方法で製造した。
【００５４】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の有効性を、年齢が６週間から８週間で、特定の病原体のないＣ５７ＢＬ／６型の雌のネズミで、評価した。
【００５５】
ネズミを、それぞれが１２匹からなる３つのグループに分け、各グループに以下のワクチン接種を行った。
（１）ワクチンを投与しない（制御グループ）、
（２）特許文献１の実施例２で得られた免疫療法薬２８５μｇを、２回（実験の３週間目と６週間目）で皮下に接種した。
（３）ＢＣＧのデーニッシュ菌株（Statens Serum Institute, Denmark：デンマーク政府によって、1902年に設立され、ジフテリアの抗毒素・血清などの供給をその起源とする研究所）の２×１０６のコロニーの形成ユニットを、実験のゼロ週間目で皮下に接種した。
【００５６】
ヒト型結核菌複合体の毒性菌株（Ｈ３７Ｒｖパスツール）は、対数増殖期中期（mid-log phase）までプロスカウアー・ベック（Proskauer-Beck）の培養媒体内で培養し、これを感染用として用いた。使用するまで、温度−７０℃で１ｍｌのアリコート内で貯蔵した。
【００５７】
ネズミを、前記の毒性菌株で、実験の９週間目に、ミドルブルック・エアゾール（Middlebrook aerosol）感染装置内に、入れることにより、霧状物質で感染させた。この感染装置は、ネズミの肺の中に、約１０−５０の生存能力のある病原菌の植菌を提供する。
【００５８】
肺の中の生存能力のある病原菌の数は、ネズミの霧状感染の３週間後（即ち、実験の１２週目）に決定した。これにより３７℃で４週間、ミドルブルック７Ｈ１１の寒天培養基内の肺の均質化物の一連の拡散が引き起こされた。この肺は、１ｍｌの２回蒸留水の存在下で、均質化した。
【００５９】
表１の結果は、肺の中で確認された１ｍｌ当たりコロニ形成ユニット（ＣＦＵ：colony forming units）を対数で表示した。
表１
ネズミのグループ ワクチン Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ
１ 何もしない（制御グループ） ６．４２±０．２４
２ リポソームでカプセル化した免疫療法薬 ５．７２±０．３０
３ ＢＣＧ ５．７１±０．５８
【００６０】
ワクチンを投与しないネズミの第１グループと、ワクチンを投与したネズミの第２，３のグループとの間の差異は、統計学上意味のあるものである。
【００６１】
第２グループのネズミの肺の中の生存能力のある病原菌の数は、第１グループのネズミの肺の中の生存能力のある病原菌の数よりも少ない。第２グループのネズミの病原菌の数は、第３グループのネズミの病原菌の数にほぼ等しい。
【００６２】
それゆえに、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を用いた免疫療法薬のワクチン投与は、ヒト型結核菌により引き起こされる感染に対し良好な保護を達成する。
【実施例２】
【００６３】
ヒト型結核菌により引き起こされた感染症に対するＴｈｌ反応の生成器としての免疫療法薬の有効性。
この実験例で使われた免疫療法薬は、特許文献１の実験例２の方法により準備した。
【００６４】
ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬の有効性を、年齢が６週間から８週間で、特定の病原体のないＣ５７ＢＬ／６型の雌のネズミで、生体外実験で、評価した。
【００６５】
ネズミは、それぞれが４匹からなるグループに分け、各グループに以下のワクチン投与を行った。
（１）実験の３週間目と６週間目に塩水を皮下に接種した（制御グループ）。
（２）特許文献１の実施例２で得られた免疫療法薬２８５μｇを、２回（実験の３週間目と６週間目）に、皮下に接種した。
（３）ＢＣＧのデーニッシュ菌株の２×１０６のコロニー形成ユニットを、１回実験のゼロ週間目に皮下に接種し、塩水を３週間目と６週間目に皮下に接種した。
（４）ヒト型結核菌複合体の毒性菌株（Ｈ３７Ｒｖパスツール）の２×１０６のコロニー形成ユニットを、１回実験の３週間目に皮下に接種し、塩水を６週間目に皮下に接種した。
【００６６】
ネズミを第７週で実験用に殺しその脾臓を摘出し、L-glutamine-RPMI（Gibco）を５ｍｌ含むチューブ内に浸した。このチューブを氷の中に実験の終了時まで浸した。この脾臓を、機械的に分解し、縣濁液を直径が７０μｍのナイロンメッシュで濾過した。その後、これを１０分間３００ｇの力で遠心分離した。ペレット剤を、Trisと塩化アンモニウムを２回蒸留水中に溶かした１５ｍｌの溶液で、再形成し、この細胞に対し崩壊を行った。８分後、それらを２０ｍｌのL-glutamine-RPMIで洗浄し、１０分間３００ｇ（重力加速度）の力で遠心分離した。
【００６７】
かくして得られたペレット剤を、５ｍｌのL-glutamine-RPMIで再度縣濁し、この縣濁液を直径７０μｍのナイロンメッシュで濾過した。この細胞を、ノイバウエル・チャンバ（Neubauer chamber）でカウントした。
【００６８】
ネズミの脾臓からの細胞を１×１０５細胞（cell）／井戸（well）の比率で、皿上に植菌し、２００μｌの完全な培養媒体（ＣＣＭ：complete culture medium）で培養した。この完全な培養媒体は、非活性化したウシ胎仔血清と、ペニシリンと、ストレプトマイシンと、ピルビン酸塩ナトリウム（sodium pyruvate）と、２−メルカプトエタノールで補充したL-glutamine-RPMIからなる。あるいはヒト型結核菌抗原で補充した２００μｌの完全な培養媒体からなる。ヒト型結核菌抗原は、１０μｇ／ｍｌの抗原ＰＰＤ（デンマーク、Statens Serum Institut社製）と、５μｇ／ｍｌのＥＳＡＴ−６、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ（ドイツ連邦共和国、Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH社製）である。
【００６９】
この細胞を５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃で培養した。９６時間後、皿を１０分間３００ｇの力で遠心分離し、それらの上澄みを収集した。
【００７０】
この上澄みを凍らせて、この状態で少なくとも２４時間維持した後、インターフェロン−ガンマ（γ）内容物を、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術（double sandwich ELISA technique）を適用し、マウス・インターフェロンγ（Diaclone）用に特定のモノクローナル抗体を用いて、解析した。
【００７１】
表２は、ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌで表した平均インターフェロンγ濃度である。このインターフェロンγは、ヒト型結核抗原に対するネズミの各グループに誘導された。
表２
グループ 接種材料 抗原
制御 ＰＰＤ ＥＳＡＴ−６ Ａｇ８５Ｂ Ａｇ８５Ａ
１ 制御 ０ ０ ０ ０ ０
２ リポソームで ０ ２．５７ ０ ２．６９注１ ２．５３注１
カプセル化した免疫治療法薬剤
３ ＢＣＧ ０ ２．０１注３ ０ ０ ０
４ Ｈ３７Ｒｖ ０ ３．０６注３ ２．８６注２，３ ２．７６注３ ２．５０注３
注１ グループ２と３の間に統計的な有意差がある。
注２ グループ２と４の間に統計的な有意差がある。
注３ グループ３と４の間に統計的な有意差がある。
【００７２】
表２の結果によれば、ヒト型結核菌の毒性の株菌の細胞壁断片を利用するリポソームでカプセル化した免疫療法薬で行った２つの植菌は、ヒト型結核菌特有の抗原に対するインターフェロンγの生成を誘導できることを意味する。これは、それらが、Ｔｈ１型の保護反応を誘導することを意味する。
【００７３】
リポソームでカプセル化した免疫療法薬により、抗原ＰＰＤ、Ａｇ８５ＢとＡｇ８５Ａに対し、誘導された反応は、ヒト型結核菌の毒性のＨ３７Ｒｖ菌株により培養されたネズミのグループに対する反応と大幅な差はない。前記の反応は、従来のワクチンであるＢＣＧ株菌を接種したネズミのグループの反応よりも良好である。その理由は、ＰＰＤのみに対する反応を誘導し、Ａｇ８５ＢとＡｇ８５Ａに対しては反応を誘導しないからである。
【００７４】
毒性菌株で接種したネズミのグループのみが、抗原ＥＳＡＴ−６に対する反応を誘導することができる。
【００７５】
ヒト型結核菌の毒性菌株の細胞壁断片を利用した免疫療法薬は、ヒト型結核菌に特有な抗原に対しＴｈ１型の保護反応を生成できる。これは、ヒト型結核菌により引き起こされる感染を阻止するのに有効な指標である。
【００７６】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬の使用において、前記免疫療法薬の製造法は、
（Ａ）ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を、３週間以上の培養期間で、培養するステップと、
（Ｂ）非イオン性界面活性剤の存在下で、前記細胞の培養菌を均質化するステップと、
を有する
ことを特徴とする免疫療法薬の使用。
【請求項２】
前記培養期間は、３−４週の間である
ことを特徴とする請求項１記載の免疫療法薬の使用。
【請求項３】
前記非イオン性界面活性剤は、エトキシル酸アルキルフェノールと、エトキシル酸ソルビタン・エステルと、それらの混合物とからなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１又は２記載の免疫療法薬の使用。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤は、エトキシル酸オクチルフェノールからなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項３記載の免疫療法薬の使用。
【請求項５】
前記非イオン性界面活性剤は、エチレンオキシドを７−８モルの間含有するエトキシル酸オクチルフェノールから選択される
ことを特徴とする請求項４記載の免疫療法薬の使用。
【請求項６】
前記（Ｂ）ステップは、中性ｐＨの緩衝媒体内で行われる
ことを特徴とする請求項１−５のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項７】
前記免疫療法薬の製造法は、
（Ｃ）断片化していない細胞と溶融した構成成分を、遠心分離手段で分離するステップと、
（Ｄ）前記細胞壁断片の断片に化学的処理または物理的処理を施して、最終的に含まれる毒性菌株の細胞を非活性化するステップと、
（Ｅ）前記ステップで得られた免疫療法薬を、低温乾燥の手段により乾燥するステップと、
をさらに有する
ことを特徴とする請求項１−６のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項８】
前記免疫療法薬は、リポソームの形態である
ことを特徴とする請求項１−７のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項９】
前記免疫療法薬は、１回または複数回に分けて投与される
ことを特徴とする請求項１−８のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１０】
前記免疫療法薬は、２回に分けて投与される
ことを特徴とする請求項９記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１１】
前記２回の投与は、２−３週の間隔をおいて、行われる
ことを特徴とする請求項１０記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１２】
前記免疫療法薬は、他の結核予防ワクチンと組み合わせて、投与される
ことを特徴とする請求項１−１１のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１３】
前記ワクチンは、時間をあけた２回の接種で、組み合わされる
ことを特徴とする請求項１２記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１４】
最初に結核予防ワクチンを投与し、その後、ＭＴＢ−Ｃの毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬を投与する
ことを特徴とする請求項１３記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１】
結核の予防薬を生成するため、ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬の使用において、前記免疫療法薬の製造法は、
（Ａ）ヒト型結核菌複合体（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性菌株を、３週間以上の培養期間で、培養するステップと、
（Ｂ）非イオン性界面活性剤の存在下で、前記細胞の培養菌を均質化するステップと、
を有する
ことを特徴とする免疫療法薬の使用。
【請求項２】
前記培養期間は、３−４週の間である
ことを特徴とする請求項１記載の免疫療法薬の使用。
【請求項３】
前記非イオン性界面活性剤は、エトキシル酸アルキルフェノールと、エトキシル酸ソルビタン・エステルと、それらの混合物とからなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１又は２記載の免疫療法薬の使用。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤は、エトキシル酸オクチルフェノールからなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項３記載の免疫療法薬の使用。
【請求項５】
前記非イオン性界面活性剤は、エチレンオキシドを７−８モルの間含有するエトキシル酸オクチルフェノールから選択される
ことを特徴とする請求項４記載の免疫療法薬の使用。
【請求項６】
前記（Ｂ）ステップは、中性ｐＨの緩衝媒体内で行われる
ことを特徴とする請求項１−５のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項７】
前記免疫療法薬の製造法は、
（Ｃ）断片化していない細胞と溶融した構成成分を、遠心分離手段で分離するステップと、
（Ｄ）前記細胞壁断片の断片に化学的処理または物理的処理を施して、最終的に含まれる毒性菌株の細胞を非活性化するステップと、
（Ｅ）前記ステップで得られた免疫療法薬を、低温乾燥の手段により乾燥するステップと、
をさらに有する
ことを特徴とする請求項１−６のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項８】
前記免疫療法薬は、リポソームの形態である
ことを特徴とする請求項１−７のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項９】
前記免疫療法薬は、１回または複数回に分けて投与される
ことを特徴とする請求項１−８のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１０】
前記免疫療法薬は、２回に分けて投与される
ことを特徴とする請求項９記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１１】
前記２回の投与は、２−３週の間隔をおいて、行われる
ことを特徴とする請求項１０記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１２】
前記免疫療法薬は、他の結核予防ワクチンと組み合わせて、投与される
ことを特徴とする請求項１−１１のいずれかに記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１３】
前記ワクチンは、時間をあけた２回の接種で、組み合わされる
ことを特徴とする請求項１２記載の免疫療法薬の使用。
【請求項１４】
最初に結核予防ワクチンを投与し、その後、ＭＴＢ−Ｃの毒性菌株の細胞壁断片を含む免疫療法薬を投与する
ことを特徴とする請求項１３記載の免疫療法薬の使用。
【公表番号】特表２０１０−５０８２５４（Ｐ２０１０−５０８２５４Ａ）
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３８８８（Ｐ２００９−５３３８８８）
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００７／０００５８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５３０５５
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（５０９１１６９３４）アーチバル ファルマ、エスエル． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００７／０００５８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５３０５５
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（５０９１１６９３４）アーチバル ファルマ、エスエル． (1)
【Ｆターム（参考）】
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