結核菌検出法
【課題】検査期間が短く、感度が高く、定量性を有し、しかも安全性が高い結核菌検出法およびそのためのキットを提供する。
【解決手段】被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法。
【解決手段】被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌検出法に関し、さらに詳細には、たとえば、喀痰のような被検体中のヒト型結核菌またはウシ型結核菌の存否を検査するための検出方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
結核菌は分類学的には抗酸性菌に属する菌群である。結核菌には、ヒト型結核菌（ミコバクテリウム ツベルクローシス Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（ミコバクテリウム ボビス Mycobacterium bovis）、ネズミ型結核菌（ミコバクテリウム ミクロチ Mycobacterium microti）、トリ型結核菌（ミコバクテリウム アビウム Mycobacterium avium）および冷血動物結核菌などが知られている。しかして、これらの中でヒトの結核症に関与するのは、ほとんど全てヒト型結核菌であるが、稀には、ウシ型結核菌による感染がある。また、ヒト型結核菌およびウシ型結核菌以外のミコバクテリウム属に属する微生物は、非定型抗酸菌と呼ばれている。
【０００３】
一方、ヒトの結核症の従来の診断法としては、所謂、「ナイアシン産生試験」が広く行なわれている。
このナイアシン産生試験は、結核症疑罹患患者の、たとえば、喀痰、暖めた１重量％滅菌食塩水をエアロゾルとしてネプライザーで深く吸入させて咳とともに喀出される痰、胃洗浄液、糞便および尿などのそれぞれの被検体を培地に培養して増殖せしめた結核菌から沸騰蒸留水で抽出し、抽出液中のナイアシンの存否を知ることによって、被検体中の結核菌の存否を知る方法である。
【０００４】
しかしながら、ナイアシン産生試験においては、９３％以上の結核菌が陽性を示すが、他の抗酸菌の或る菌種、または、稀に、非定型抗酸菌でも陽性を示すため、仮令、ナイアシン産生試験が陽性であったとしても、必ずしもその菌種を結核菌であると断定することはできない。よって、一般的には、ナイアシン産生試験の他に、菌の生育速度、色素発生およびコロニーの性状などを同時に調べて、結核菌とそれ以外の抗酸菌との鑑別がなされている。
【０００５】
被検体の培養によって増殖した結核菌のナイアシンは定性的化学分析手段で検知されるが、この定性的化学分析は感度が低く、正確な検査結果を得るためには、多量のナイアシンが必要とされる。また、この定性的化学分析においては数工程にわたる分析学操作が行なわれるが、このような分析操作は菌体の飛散などによる結核菌感染の危険性が高い。したがってこれらの分析操作は、極めて安全性の高い環境で、かつ、極めて安全性の高い装置を使用し、しかも、細心の注意を払って行なわなければならないとされている。しかして、ナイアシン産生試験を実施するためには、定性的化学分析自体に多少の時間を要するだけでなく、被検体の培養を必要としこの培養には長時間かかるので、結果的には分析に長時間が費やされることになる。
【０００６】
一方、このナイアシン産生試験は、被検体を液体培養で行なう場合と固体培養で行なう場合とがある。
前者は、たとえば、米国などで行なわれており、被検体の培養期間は短縮されるが、作業時における結核菌感染の危険性が大きく、高度に安全な施設および装置が必要とされる。
本邦では、後者が行なわれており、結核菌感染の危険性は軽減されるが、分析結果が判明するまでに２ヵ月間程度の長期間が必要とされている。
しかして、後者においては、作業時における結核菌感染の危険性は軽減されはするが、依然として、安全性の高い環境で、かつ、安全性の高い装置を使用し、しかも、細心の注意を払われなければならないとされている。
【０００７】
蛋白質ＭＰＴ６４（以下、ＭＰＴ６４蛋白 と記す）はヒト型結核菌（ミコバクテリム ツベルクローシス Mycobacterium tuberculosis）が特異的に産生し、菌体外へ分泌するミコバクテリアル プロテイン（Mycobacterial protein）であり、また、蛋白質ＭＰＢ６４（以下、ＭＰＢ６４蛋白 と記す）と同一の物質であることが知られている。
他方、ＭＰＢ６４蛋白は、ＢＣＧ菌株のウシ型結核菌（ミコバクテリウム ボビス ＢＣＧ（Mycobacterium bovis ＢＣＧ）（以下、ＢＣＧ菌 と記す）によって産生され菌体外に分泌されるミコバクテリアル プロテインである。
エム．ハーボー（M.Harboe）は、このＭＰＢ６４蛋白をＢＣＧ菌から分離、精製して、その性質などについて研究して報告している（Infection and Inmmunity 1986, Vol.52, No.1, 293〜302）。
【０００８】
また、特開平１−２４７０９４号公報においても、ＭＰＢ６４蛋白は、ヒトに感染して結核症と酷似した症状を呈する非定型抗酸菌によっては産生されないが、ウシ型結核菌のＢＣＧ菌によって産生され、かつＭＰＴ６４蛋白と同一物質であるというＢＣＧ菌およびヒト型結核菌のそれぞれに特異な蛋白質であるとしている。
【０００９】
従って、このことは抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は抗原をＭＰＢ６４蛋白とする抗体であるが、同時にＭＰＴ６４蛋白の抗体でもあることを意味する。
従って、病原性的には無害なＢＣＧ菌を培養し、その培養液からＢＣＧによって産生されたＭＰＢ６４蛋白を抽出、精製し、該ＭＰＢ６４蛋白を抗原として抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を作成し、その抗体を用いた抗原抗体反応（免疫反応）によって被検体中の結核菌を検出することにより、ヒトの結核症を明確、かつ迅速に判別することができる結核症の簡便な診断法を確立することが可能となる。
【００１０】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を使用した結核菌の検査薬および検出方法として、たとえば、特開平７−１１０３３２号公報記載の方法が知られている。この方法における免疫学的方法として、逆受身血球凝集反応（ＲＰＨＡ）、逆受身ラテックス凝集反応（ＲＰＬＡ）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが記載されている。
前二者においては凝集時間が、たとえば、３時間程度と長く、感度が低く、かつ定量性は全くないなどの不都合な問題がある。
後者においては、前二者に比較して試験操作が煩雑で、かつ通常は特殊な機械を使用する関係上、安全キャビネット中での実施が容易ではないなどの欠点がある。
【特許文献１】特開平７−１１０３３２号公報
【非特許文献１】Infection and Immunity 1986, Vol.52, No.1, 293〜302
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、上記のような従来技術における欠点を解決し、被検体の採取から検査結果判明までの期間が短く、感度が高く、半定量性を有し、しかも、安全性が高い結核菌の検出法を開発すべく、鋭意、研鑚を重ねた結果、たとえば、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子のような呈色標識物質を結合せしめた呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を調製し、これを使用することにより上記の従来技術における欠点を解決することができるとの新知見を得、この知見に基づいて、本発明に到達した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも、試料添加用部材、呈色標識抗体含浸部材、クロマト展開用膜担体および吸収用部材を有し、上記呈色標識抗体含浸部材および上記クロマト展開用膜担体には前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体および第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体がそれぞれ含浸されており、上記試料添加用部材は上記呈色標識抗体含浸部材に積層され、上記クロマト展開用膜担体はその上流側端部が上記呈色標識抗体含浸部材に被覆されるとともに該呈色標識抗体含浸部材に連接され、上記吸収用部材はその上流側端部が上記クロマト展開用膜担体に積層されるとともに該クロマト展開用膜担体と連接してなるクロマト法テストストリップを用い、前記液体培養して得られた培養液を前記試料添加用部材に灌注することによって行われる。
【００１４】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質は、コロイド状金属または着色ラテックスであることが好ましい。
前記第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものであることが好ましい。
前記クロマト法テストストリップはケースに収容されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
被検体は、主として結核症疑罹患患者および被検患者のそれぞれの喀痰などであるが、たとえば、滅菌食塩水のエアロゾルを吸入させて咳とともに喀出される痰、胃洗浄液、糞便および尿などのそれぞれをも使用することができる。
被検体は、常法により、固体培養または液体培養がなされる。
【００１６】
固体培養の場合には、たとえば、試験管工藤ＰＤ固形斜面培地（協和薬品工業株式会社の商品）を使用して、３７℃で培養される。この斜面に培養された結核菌に蒸留水を添加して培養期間中に菌体外に分泌された培養物を抽出し、この結核菌混在溶液を試料として検査に供する。
液体培養の場合には、たとえば、被検体液と水酸化ナトリウム水溶液とを混合して、この混合液から菌体を遠心分離によって分離し、分離された菌体を、たとえば、デュボス液体培地（ベクトン・デッキンソン社の商品）で３７℃で培養した培養液を試料として検査に供する。
【００１７】
ＭＰＢ６４蛋白は、たとえば、上記の、エム．ハーボーの分離、精製法のようなそれ自体公知の方法で調製される。
すなわち、ミコバクテリウム ボビスに属するＢＣＧ菌東京株のようなＭＰＢ６４蛋白産生能力を有する菌株を、たとえば、ソートン培地のような液体培地で培養して得られた培養液から、塩析、透析、カラムクロマトグラフィおよび電気泳動などによる蛋白質の同定を逐次経由して精製ＭＰＢ６４蛋白が得られる。
【００１８】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は、このようにして得られた精製ＭＰＢ６４蛋白を抗原として、常法によって得られた単クローン抗体および多クローン抗体のいずれであってもよい。
単クローン抗体は、たとえば、ケラーミルシュタインの方法によって得られる。また、多クローン抗体は、好ましくは、ヤギを免疫して得られる。
【００１９】
このようにして得られた抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は、呈色標識物質と結合せしめられて呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とされる。
呈色標識物質には、たとえば、コロイド状金属および着色ラテックスなどがある。
コロイド状金属の代表例として、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。
【００２０】
コロイド状金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０nm程度とされる。
また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラテックスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数拾nm乃至数百nm程度から選択することができる。
これらの呈色標識物質は、市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
【００２１】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と呈色標識物質との結合は常法によって行なわれる。すなわち、たとえば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と金ゾルとを室温乃至常温下で数分間、長くても１０分間、混合することによって両者を物理的に結合せしめることが可能である。
【００２２】
抗原であるＭＰＢ６４蛋白または該蛋白質と同一物質であるＭＰＴ６４蛋白（以下、ＭＰＴ６４蛋白をＭＰＢ６４蛋白と同様に抗原と記す）と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とは、通常の抗原抗体反応によって結合せしめられる。すなわち、たとえば、結核菌が産生する抗原であるＭＰＢ６４蛋白またはＭＰＴ６４蛋白を含有するかもしれない検査試料と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との両者が混合せしめられた緩衝液中で常温乃至室温で静置することによって抗原抗体反応が行なわれ、抗原であるＭＰＢ６４蛋白またはＭＰＴ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物（以下、単に呈色結合物と記す）が得られる。この呈色結合物は、たとえば、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体が固定化された帯状固相担体にチャージされてクロマト展開され、そのことごとくを該第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に捕捉せしめて、使用された呈色標識物質固有の色を呈せしめ、これにより被検体中の結核菌が検出される。
【００２３】
上記の第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は抗原であるＭＰＢ６４蛋白またはＭＰＴ６４蛋白に対する抗原抗体反応の結合部位が、標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に使用された抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の該抗原に対する抗原抗体反応の結合部位とは異なるものでなければならない。
【００２４】
なお、結核菌の既知の菌数と第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体で捕捉される呈色結合物の呈色濃度との関係から導いた判定基準を使用することにより、被検体中に含有されている結核菌の大凡の菌数を知ることが出来る。この場合に、被検体の検査条件のすべては、判定基準を作成する際のそれらと実質的に同一とされなければならない。
【００２５】
呈色結合物の第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体による捕捉は、クロマト法テストストリップによることが好ましい。
クロマト法テストストリップとは、ケースの蓋体の試料注入口から、帯状の固相担体テストストリップの一端に検査試料を灌注することによりクロマト展開が開始されて浸潤して該テストストリップの呈色標識抗体含浸部材に到達し、該部材の呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と免疫反応して呈色結合物が形成され、さらに、該呈色結合物が捕捉部位まで浸潤して捕捉部位の第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との免疫反応により捕捉されて、捕捉部位が呈色せしめられる方法である。
【００２６】
クロマト法テストストリップの調製に、たとえば、特公平７−１３６４０号記載の方法が好適に適用される。
クロマト法テストストリップによる本発明の結核菌検出法において、被検体または被検体から得られた検査試料と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを予め混合した混合液をクロマト法テストストリップによりクロマト展開せしめてもよいし、また、クロマト法テストストリップに予め試料添加用部材および呈色標識抗体含浸部材をそれぞれ設け、該試料添加用部材に所定量の被検体または被検体から得られた検査試料を灌注してクロマト展開を行なう上記の方法によってもよい。
【００２７】
上記のクロマト法テストストリップによって本発明の結核菌検出法を行なうために、少なくとも、ケースに収納されたクロマト法テストストリップまたは呈色標識抗体含浸部材が欠如したクロマト法テストストリップと容器に収納された呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を１組みとしてキットとすることができる。
【００２８】
このキットには、さらに上記の判定基準として予め作成された蛋白濃度と呈色度との関係表を包含せしめることができる。
本発明の結核菌検出方法において、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との間の免疫反応ならびにこの免疫反応で生成せしめられた呈色結合物と第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との間の免疫反応はいずれも数分で完結せしめられるので、検査自体は長くても１５分程度で終了する。
【００２９】
本発明の結核菌検出法では、他の結核菌検出方法におけると同様に、被検体の処理に際して結核菌感染を防止するように充分な注意が必要とされる。しかしながら、本発明の検出法では、結核菌が含有されているかも知れない被検体または被検体から得られた検査試料は、その少量がクロマト法テストストリップに添加されるだけであり、かつ、検査自体に要する時間は長くとも１５分程度であるため、結核菌に感染する危険性は、検査の操作が煩雑で検査に長時間を有する従来の結核菌検出方法に比して少ない。
【実施例】
【００３０】
本発明を実施例によって、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
１．ＭＰＢ６４蛋白の分離
(1) ＢＣＧ菌東京株の培養
ＢＣＧ菌東京株は結核予防会結核研究所から入手し、それを下記の組成を有するソートン培地５００ml×２０本に接種し、３７℃で５週間培養して、培養液１０lを得た。
【００３２】
ソートン培地の組成
アスパラギン ０.４ ％
くえん酸 ０.２ ％
くえん酸ナトリウム ０.２８ ％
りん酸カリウム ０.０５ ％
硫酸マグネシウム ０.０５ ％
くえん酸第１鉄アンモニウム ０.００５％
グリセリン ６ ％
（「％」は「重量／容量％」を示す。以下同様）
【００３３】
(2) ＭＰＢ６４蛋白の分離・精製
1)上記(1)で得られた培養液に硫酸アンモニウム（以下、硫安 と記す）を加えて８０％飽和溶液として、沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得られたこの蛋白質画分を３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に溶解せしめ、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して蛋白質約９gを含有する透析液約３０mlを得た。
2)この蛋白質約９gを含有する上記の溶液約３０mlをＤＥＡＥ・セファデックスＡ・５０（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（５７cm×５.５cm）にチャージして、３０mMトリス塩酸溶緩衝液（ｐＨ８.７）１００mlを用いて上記のカラムを洗浄して溶出液を得た。
【００３４】
次いで、３０mMトリス塩酸緩衝・２００mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）でクロマト展開した。このクロマト展開の溶出液に硫安を加えて７０％飽和溶液として、沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得た。この蛋白質画分を３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に溶解せしめ、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して蛋白質約３.５gを含有する透析液約３５mlを得た。
【００３５】
3)この蛋白質約３.５gを含有する上記の溶液約３５mlをＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（６４cm×３.６cm）にチャージして、３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）約７００mlを用いて上記のカラムを洗浄した。
次いで、３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）および３０mMトリス塩酸緩衝・２００mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）を用いて塩化ナトリウム濃度０から２００mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液を２０mlずつのフラクションとして採取した。フラクション番号１０５番から１２１番までの展開液を集めた。この展開液に硫安を加えて７０％飽和溶液として沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得た。この蛋白質画分を３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に溶解せしめて、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）に対して透析して蛋白質約０.７gを含有する透析液約７mlを得た。
【００３６】
この展開液約３６０mlを、分画分子量が１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約６mlになるまで濃縮し、次いで、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）に対して透析して透析液約７mlを得た。この溶液約７mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約０.７gを含有する凍結乾燥品を得た。
【００３７】
4)この蛋白質０.７gを含有する凍結乾燥品を精製水７mlに溶解せしめ、その全量をＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（４５cm×３.０cm）にチャージして、３０mMトリス塩酸緩衝・３M尿素・４０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ ７.５）と３０mMトリス塩酸緩衝・３M尿素・９０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.５）を用いて塩化ナトリウム濃度４０mMから９０mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液５mlずつをフラクションとして採取した。
【００３８】
それぞれのフラクションの少量をポリアクリルアミドゲルの固相担体にスポッティングして電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルー染色によって得られた電気泳動像において分子量約２３,０００の蛋白質のバンドが認められた各フラクションを集めた。この溶液を分画分子量１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約２mlになるまで濃縮し、次いで１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）に対して透析して透析液約２.５mlを得た。この溶液約２.５mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約６０mgを含有する凍結乾燥品を得た。
【００３９】
5)この蛋白質約６０mgを含有する凍結乾燥品を精製水２mlに溶解せしめ、その全量をＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（３４cm×２.７cm）にチャージし、次いで、３０mMトリス塩酸緩衝・６０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）を用いてカラムを洗浄した。
【００４０】
次に、３０mMトリス塩酸緩衝・６０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）と３０mMトリス塩酸緩衝・１１０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ ８.７）を用いて塩化ナトリウム濃度６０mMから１１０mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液１mlずつをフラクションとして採取した。それぞれのフラクションの少量をポリアクリルアミドゲルの固相担体にスポッティングして電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルー染色によって得られた電気泳動像において分子量約２３,０００の蛋白質のバンドが認められた各フラクションを集めた。
【００４１】
この溶液を、分画分子量１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約１mlになるまで濃縮した。次いで、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して透析液約１.３mlを得た。この溶液約１.３mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約６mgを含有する凍結乾燥品を得た。
【００４２】
6)最後に、この蛋白質約６mgを含有する凍結乾燥品を精製水１mlに溶解せしめ、その全量をセファクリルＳ−２００（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（３０cm×２cm）にチャージし、次いで、３０mMトリス塩酸緩衝・０.５mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.５）を用いてクロマト展開し、この展開液を０.５mlずつのフラクションとして採取した。それぞれのフラクションの少量をポリアクリルアミドゲルの固相担体にスポッティングして電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルー染色によって得られた電気泳動像において分子量約２,３０００の蛋白質のバンドが認められた各フラクションを集めた。この溶液を分画分子量１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約１mlになるまで濃縮し、次いで、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して透析液約１.３mlを得た。この溶液約１.３mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約５mgを含有する凍結乾燥品を得た。 このようにして得られた分子量約２３,０００のこの蛋白質のデスク電気泳動（７.７％アクリルアミドゲル）では単一ピークの泳動像を示したので、このＭＰＢ６４蛋白は純度が高いものと判断された。
【００４３】
２．抗ＭＰＢ６４蛋白単クローン抗体（マウス）の作成
(1) ＭＰＢ６４蛋白投与マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系）の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合
1)上記１．で得られた精製ＭＰＢ６４蛋白を用いて、ケラー−ミルシュタインの方法（G.Kohker and C.Milstein；Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976）にしたがって細胞融合を行ないハイブリドーマを調製した。
【００４４】
すなわち、上記１．で得られた精製ＭＰＢ６４蛋白溶液（２００μg／ml）５００μlとフロイント不完全アジュバント５００μlとを常法により乳化するまで混合し、この混合乳化液５００μlをＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（雌、４週齢）の腹腔内に投与して免疫を行なった。前回投与の２週間後に、上記と同様にして調製された混合乳化液４０μlを上記のマウス腹腔内に、再度、投与した。
さらに、その２週間後に精製ＭＰＢ６４蛋白の生理食塩水溶液（２００μg／ml）を上記のマウス腹腔内に投与して最終免疫を行なった。
【００４５】
2)最終免疫から３日後にマウスを屠殺して、直ちにその脾臓を無菌的に取り出した。この脾臓を約１０mlの無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地が入れてある直径６０mmのシャーレに入れ、脾臓の長軸に沿って鋏で切れ目を入れ、手早く脾臓をピンセットで圧迫しつつ細胞を遊離せしめた。この細胞をナイロンメッシュを通過せしめられて、新たな無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊せしめて脾臓細胞浮遊液を得た。
【００４６】
3)上記の脾臓細胞浮遊液をＲＰＭＩ−１６４０培地と混合し、フィコールペイクを用いる比重遠心法によって赤血球を除去して得られた脾臓細胞を、無菌ＲＰＭＩ−１６４０無血清培地中に浮遊せしめた。
【００４７】
4)他方、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（以下、Ｐ３Ｕ１細胞 と記す）をウシ胎児血清１０容量％を含有されてなる無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養増殖させた後に、遠心分離（２５０×Ｇ）してＰ３Ｕ１細胞を分離し、この細胞を無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄して、無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊せしめＰ３Ｕ１細胞浮遊液を得た。
【００４８】
5)上記2)の脾臓細胞浮遊液と上記4)のＰ３Ｕ１細胞浮遊液とを混合し、遠心分離（２５０×Ｇ）によってこの混合液から両者の細胞を分離した。分離されたこの両者の細胞を分子量４,０００のポリエチレングリコールが４０％含有されてなる無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７.４）１mlに懸濁して３７℃で６分間静置して、脾臓細胞とＰ３Ｕ１細胞とを融合せしめてハイブリドーマとした。
【００４９】
次いで、これらの細胞に無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて全量１０mlとし、この細胞浮遊液を遠心分離（２５０×Ｇ）してこれらの細胞を分離した。これらの細胞にウシ胎児血清が１０容量％含有されてなる無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地１０mlを加えて、これらの細胞を浮遊せしめた。この細胞浮遊液を遠心分離（２５０×Ｇ）して液分を除去し、細胞を得た。
【００５０】
6)この細胞にＨＡＴ培地を加えて１×１０6個／mlの細胞浮遊液とし、この細胞浮遊液の１００μlずつを９６穴（ウエル）プラスチック マイクロタイタープレート（住友ベークライト株式会社の商品）の各ウエルに分注し、インキュベーター中で炭酸ガスが５容量％含有されてなる空気の存在下３７℃で培養した。
【００５１】
7)培養開始後１日目に、さらに、ＨＡＴ培地を各ウエルに１００μlずつ加え、以後 ２日目、３日目、８日目および１１日目のそれぞれには、培養液の半分である１００μlを取り除き、その替りにＨＡＴ培地１００μlを補充しつつ培養を続行した。培養後１４日目には、ハイブリドーマが存在するウエルには１ウエルあたり平均２〜３個のハイブリドーマのコロニーが認められた。このウエルでは、培養開始から約２週間後にはハイブリドーマが充分増殖したので、この時点で培養上澄液の抗体力価を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて検定した。
【００５２】
8)固相酵素免疫測定法は、予め抗原であるＭＰＢ６４蛋白が固相化せしめられたＥＬＩＳＡ用プラスチック マイクロタイタープレートのウエルに、これらのハイブリドーマが培養された５０μlの培養液を加えて３７℃で１時間静置し、この培養液を除去した後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で洗浄する。次いで５０μlのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン溶液を加えて、３７℃で１時間静置して免疫反応せしめて、該ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン溶液を除去し、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で洗浄する。さらに、このウエルに４−アミノアンチピリン、過酸化水素およびフェノールからなる通常のペルオキシダーゼ発色系の試薬を加えて発色せしめて常法にしたがって抗体の力価を求めた。
一方、抗体を産生しているウエル中のハイブリドーマについては、限界希釈法によるクローニング操作を３回繰り返し行なった。
その結果、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を安定に産生するクローン化細胞５株を得た。
【００５３】
(2) 単クローン抗体の精製
１週間前に１匹あたり2,6,10,14−テトラメチルペンタンデカン０.５mlを腹腔内に注射されたＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に上記のクローン化細胞株のうち抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の生産量が特に多いクローン化細胞懸濁液（１０7個／ml）０.５mlを注射し、その１週間後に抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含む腹水を該マウス１匹あたり５〜１０ml得た。
【００５４】
この腹水を、５０mMトリス塩酸緩衝・１５０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.５）で平衡化されたプロテインＡ（ファルマシア バイオテック株式会社の商品）カラムにチャージした。次いで、５０mMトリス塩酸緩衝・１５０mM塩化ナトリウム液（ｐＨ８.５）でカラムを洗浄した後、１００mMくえん酸塩緩衝・１５０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ５.０）で上記の抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を溶出せしめた。
【００５５】
上記の抗ＭＰＢ６４蛋白抗体溶出液を１０℃で２０mMりん酸塩緩衝・１５０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.４）に対して透析した後、防腐剤として最終濃度が０.１％溶液となるようにアジ化ナトリウム（ＮａＮ3）を添加した。
【００５６】
３．金コロイド標識抗体および青色ラテックス標識抗体の作成
(1) 金ゾルの調製
９９mlの超純水を沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸（片山化学工業株式会社の商品）溶液（塩化金酸濃度１％）１mlを加え、さらにその１分後に、くえん酸ナトリウム溶液（くえん酸ナトリウム濃度１％）１.５mlを加えて５分間沸騰させて後に、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液を２００mM炭酸カリウム溶液でｐＨ９.０に調製し、これに超純水を加えて全量を１００mlとして金ゾルを得た。
【００５７】
(2) 金コロイド標識抗体の調製
上記２．で得られた抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体の蛋白換算重量１μg（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単にその重量の数値のみを示す ）と上記の金ゾル１mlとを混合し、室温で２分間静置して、この抗体のことごとくを金ゾルの分散粒子であるコロイド粒子と結合させた。これに最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ と記す）水溶液を加えて上記の抗体に結合せしめられた金コロイド粒子の表面をブロックした。この溶液を遠心分離（５,６００×Ｇ、３０分間）して抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体を結合したコロイド粒子の表面がＢＳＡでブロックされた金コロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。
この金コロイド標識抗体を、１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０.５％トリトン（Triton）−Ｘ１００を含有する５０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７.４）に再懸濁して精製金コロイド標識抗体溶液を得た。
【００５８】
(3) 青色ラテックス標識抗体の調製
上記２．で得られた抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体０.２５mgと１０％青色ラテックス（粒径０.２μm、日本ペイント株式会社の商品）溶液を精製水で希釈して得られた１％青色ラテックス溶液１mlとを混合し、室温で３０分間静置して抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体を青色ラテックスに結合させた後、遠心分離（５,０００×Ｇ、３０分間）して青色ラテックスに結合せしめられた抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体である粗青色ラテックス標識抗体を沈殿せしめて集めた。この粗青色ラテックス標識抗体を１％ＢＳＡ溶液および０.８５％塩化ナトリウム溶液を含有する１０mMりん酸塩緩衝液（ｐＨ７.４）１mlに再分散し、遠心分離（５,０００×Ｇ、３０分間）するという操作を３回繰り返した。このように処理された青色ラテックス標識抗体を１％ＢＳＡおよび０.８５％塩化ナトリウム溶液が含有されてなる１０mMりん酸塩緩衝液（ｐＨ７.４ ）２０mlに分散せしめて、固形分約０.０５％の精製青色ラテックス標識抗体溶液を得た。
【００５９】
４．クロマト法テストストリップの作成
(1) 特公平７−１３６４０号公報の記載に準拠してクロマト法テストストリップを作成した。
すなわち、幅５mm,長さ３６mmの細長い帯状のニトロセルロース膜（メンブレンフィルター）をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体とし、このクロマト展開始点とは逆方向末端から７.５mmの位置に、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体３.０mg／mlが含有されてなる抗体溶液０.５μlをスポット状に塗布して、これを室温で乾燥して補足部位とした。なお、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とは免疫反応において、抗原であるＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白に対する結合部位が、上記３．の金コロイド標識抗体または青色ラテックス標識抗体の調製に使用された抗体とは異なる結合特異性を有する抗体をいう。
【００６０】
(2) また、５mm×１５mmの帯状のガラス繊維不織布に上記の金コロイド標識抗体液３７.５μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材とした。
(3) また、５mm×１５mmの帯状のガラス繊維不織布に上記の青色金ラテックス標識抗体溶液３７.５μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて青色ラテックス標識抗体含浸部材とした。
【００６１】
(4) 次に、試料添加用部材である綿布、上記の金コロイド標識抗体含浸部材または青色ラテックス標識抗体含浸部材、クロマト展開用膜担体であるニトロセルロース膜および吸収用部材である濾紙を、それぞれ粘着シートの粘着面の所定位置に貼着してクロマト法テストストリップを作成した。すなわち、粘着シートの粘着面上にクロマト展開用膜担体を貼着し、このクロマト展開用膜担体のクロマト展開の始点とは逆方向末端に、上記の金コロイド標識抗体溶液または青色ラテックス標識抗体溶液を含浸せしめて乾燥せしめられた標識抗体含浸部材のクロマト展開の始点とは逆方向末端を重ね合わせて配列せしめ、さらに、この金コロイド標識抗体含浸部または青色ラテックス標識抗体含浸部の重複部分からその全体を覆って試料添加部材を配列せしめた。
さらに、ニトロセルロース膜の他方の端には、吸収用部材の一部を重ねて配列せしめてクロマト法ストリップとした。
【００６２】
５．被検体からの結核菌の検出
(1) 判定基準の作成
1)精製ＭＰＢ６４蛋白を生理食塩水で希釈し、ＭＰＢ６４蛋白の濃度がそれぞれ０.２５ng／ml，０.５ng／ml，１.０ng／ml，２.０ng／ml，４.０ng／ml，８.０ng／mlおよび１６.０ng／mlからなる溶液とし、これらのＭＰＢ６４蛋白溶液を標準試料とした。これらの標準試料を用いて、上記のクロマト法テストストリップによる検定およびＲＰＨＡ法による検定を行ない、得られた両者の結果からＭＰＢ６４蛋白濃度に対する両者の方法の検出感度について比較した。
【００６３】
2)抗体感作血球を特開平７−１１０３３２号公報記載の方法に準拠して調製した。
すなわち、グルタールアルデヒド固定ヒツジ赤血球の０.５％１０mMりん酸塩緩衝懸濁液１容量部と、１mgのタンニン（米国ＮＢＣ社）を生理食塩水１００mlに溶解せしめた溶液１容量部とを混合し、室温で１５分間放置した後、タンニン処理赤血球を遠心分離し、タンニン処理赤血球を生理食塩水で３回洗浄した後に、１容量部になるように生理食塩水に懸濁せしめて０.５％タンニン赤血球生理食塩水溶液を得た。
【００６４】
常法にしたがってヤギを免疫して得られた抗体をアフィニティーカラムクロマト法により精製した精製抗ＭＰＢ６４蛋白多クローン抗体溶液（２μg／ml）１容量部と上記の０.５％タンニン赤血球生理食塩水溶液１容量部とを混合し、３７℃で３０分間放置した後、この液を遠心分離（１,５００×Ｇ、１０分間）して抗体感作赤血球を分離した。この抗体感作赤血球１０mMりん酸塩緩衝液で３回洗浄した後、０.１％ＢＳＡを含有する１０mMりん酸塩緩衝液に懸濁せしめて０.５％抗体感作赤血球生理食塩水溶液を調製した。
【００６５】
3)金コロイド標識抗体含浸部材を用いたクロマト法テストストリップにおいて、各濃度の標準試料１００μlをクロマト展開せしめ、１５分後の該テストストリップにおける補足部位での赤紫色の着色の有無を肉眼で判定し、無着色を−とし、着色をその濃淡により±（疑陽性）から＋＋＋（濃厚着色）までの間を、±，＋，＋＋，＋＋＋の４段階に区分して判定基準とした。クロマト法テストストリップにおける肉眼による判定基準と標準試料の蛋白濃度との関係を表１に示した。
なお、捕捉部位における赤紫色の着色の有無および着色の濃淡は、被検体中の結核菌の有無および結核菌の大凡の菌数を表わしていることはいうまでもない。
【００６６】
4)青色ラテックス標識抗体含浸部を用いて、上記同様の操作を行なったとき、上記と同様の結果が得られた。
【００６７】
5)他方、ＲＰＨＡ法において、９６ウエル プラスチック マイクロタイタープレート（住友ベークライト株式会社の製品）の各ウエルに、各濃度の標準試料５μlずつを入れ、次いで、各ウエルに上記の抗体感作赤血球生理食塩水溶液２５μlを滴下し、室温で３０分間静置して免疫反応を生ぜしめ、この反応後の各ウエルのおける赤血球凝集の程度を肉眼で判定して、−（無凝集）から＋＋＋（極めてよい凝集）までの間の−，±，＋，＋＋，＋＋＋の５段階に区分した。このＲＰＨＡ法における肉眼判定の結果を、上記のクロマト法テストストリップでの標準試料の精製ＭＰＢ６４蛋白濃度に基づく判定基準と比較し、それを表１に示す。
表１に示されるように、本発明の結核菌検出法はＲＰＨＡ法に比して感度が高く、しかも半定量性があることが判る。
【００６８】
【表１】
【００６９】
(2) 被検体からの結核菌検出例１
1)ヒトの喀痰を結核症被検体（８例）とし、該被検体からの結核菌の検出を検討した。
すなわち、被検体５mlと、５mlの２％水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で３０分間静置した後、遠心分離（１,５００×Ｇ、３０分間）して生じた沈渣を回収し、この沈渣と生理食塩水とを混合し、この混合液を遠心分離（１,５００×Ｇ、３０分間）して生じた沈渣を再び回収し、この沈渣と生理食塩水２００μlとを混合して、これを検査試料とした。
【００７０】
2)この検査試料１００μlを滅菌試験管にとり、この試験管にデュボス液体培地（ベクトン・デッキンソン株式会社の商品）５mlを加え、３７℃で培養し、培養開始３日目の培養液について上記の本発明のクロマト法テストストリップによる結核菌の検出法およびＲＰＨＡ法による結核菌の検出を行なった。
なお、培養開始７日目の培養液については、ＲＰＨＡ法のみによる結核菌の検出を行なった。
【００７１】
対照として、上記の被検体８例の喀痰各５mlと、５mlの２％水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で３０分間静置した後、この溶液１００μlを、試験管工藤ＰＤ固形斜面培地（協和薬品工業株式会社の商品）の表面に均一に接種して、３７℃で５６日間培養し、増殖した結核菌についてナイアシン産生試験を行なった。
【００７２】
すなわち、上記の試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面に１ml沸騰蒸留水を加え、該表面をほぼ水平にし５分間静置して結核菌体からナイアシンを抽出した。
この抽出液から２００μlを採取し、これと４容量％アニリン・エタノール溶液１００μlおよび１０容量％ブロムシアン溶液とを混合した。混合してから５分後に、この混合液に結核菌に由来したナイアシンが存在すれば、混合液は黄色に発色するので、肉眼で判定して黄色に発色すれば、その被検体を陽性（＋）とした。
表２にこれらの検査結果を示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
表２から、ナイアシン産生試験では試験管工藤ＰＤ固形斜面培地での培養に５６日間という長期間を要するが、他方、本発明の検出法では、デュボス液体培地での培養で３日間という短期間ですみ、また、本発明の検出法ではその感度もＲＰＨＡ法に比して格段と高い。
【００７５】
(3) 被検体からの結核菌検出例２
1) レントゲン診断による結核症疑罹患患者８名のそれぞれの喀痰における結核菌についての検査を行なった。
すなわち、上記の各喀痰と、これと等量の２％水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で３０分間静置し、これを培養試料とした。
【００７６】
2)上記培養試料１００μｌを試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面に均一に接種して、３７℃で培養し、培養開始７日目、１４日目、２１日目、２８日目および５６日目に、各試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面に蒸留水５００μｌをそれぞれ加えて振盪し、該試験管中の液を菌体抽出試料とした。この菌体抽出試料１００μlをクロマト法テストストリップにチャージしてクロマト展開せしめ、１５分後の捕捉部位における赤紫色の呈色の有無および呈色の濃淡を肉眼で観察し、上記の判定基準に従って判定した。
なお、比較のために上記の各試料について、培養期間を５６日間とした以外は上記と同様に培養して増殖せしめた結核菌に関して上記と同様にしてナイアシン産生試験を行なった。
これらの結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
なお、表３において（−）および（＋）のそれぞれは、上記の試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面においてコロニーが「形成されていない」および「形成された」をそれぞれ示す。
【００７９】
表３では、試料の培養に試験管工藤ＰＤ固形斜面培地を使用した場合には、ナイアシン産生試験では検査結果が判明するまでに５６日の長期間を要するに対して、本発明の検出方法ではナイアシン産生試験の半分の日数である培養開始２８目で被検体における結核菌の存在が判定でき、しかも、極めて高感度であることを示している。
【００８０】
次に、本発明の結核菌検出法において好適に使用されるクロマト法テストストリップの代表例を図面を使用してさらに具体的に説明する。
すなわち、図１はクロマト法テストストリップを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたクロマト法テストストリップの縦断部端面図である。
しかして、図２は図１で示されたクロマト法テストストリップを収納するためのケースを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたケースの縦断部端面図である。
なお、図面は原理を示すためのものであり、寸法などは正確には示されていない。
【００８１】
このクロマト法テストストリップは、粘着シート 1の粘着面に、上流側（以下、図面の向かって左側を上流側、また、図面の向かって右側を下流側と記す）から順次、試料添加用部材 5、呈色標識抗体含浸部材 2、クロマト展開用膜担体 3および吸収用部材 4が貼着されている。しかして、呈色標識抗体含浸部材 2にはその全面に呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体液が、また、クロマト展開用膜担体 3には第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体液がスポット状に含浸せしめられている（クロマト展開用膜担体 3においてスポット状に第二抗ＭＰＢ６４蛋白が含浸せしめられた箇所を以下、捕捉部31 と記す）。なお、試料添加用部材 5は該呈色標識抗体含浸部材 2に積層せしめられている。該クロマト展開用膜担体 3はその上流側端部が上記の呈色標識抗体含浸部材 2によって被覆され、かつ該呈色標識抗体含浸部材 2に連接せしめられている。
【００８２】
該吸収用部材 4はその上流側端部が該クロマト展開用膜担体 3の下流側端部に積層せしめられている。
これらの粘着シート 1、呈色標識抗体含浸部材 2、クロマト展開用膜担体 3、吸収用部材 4および試料添加用部材5はいずれも細長い長方形で帯状とされている。クロマト展開用膜担体 3はクロマト展開に際してそれ自体の毛細管作用により、試料添加用部材 5にスポット状にチャージされた被検体およびその他の各種試料をクロマト展開方向である下流側に自動的に移動せしめ得る材質を有するものであればよい。
【００８３】
しかして、呈色標識抗体含浸部材 2としてガラス繊維不織布が、クロマト展開用膜担体 3としてニトロセルロース膜が、吸収用部材 4として濾紙が、試料添加用部材 5として、その材質は問わないが、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布が最適である。
【００８４】
捕捉部31を有するクロマト展開用膜担体 3は、捕捉部31に補足される呈色結合物の色が明確に目視できるものを使用することが好ましい。たとえば、呈色標識物質が金コロイド粒子である場合には、この金コロイド粒子は赤紫色を呈するため、その呈色結合物も赤紫色を呈するので、クロマト展開用膜担体 3の色は淡色が好ましく、白が特に好ましい。
【００８５】
上記のクロマト法テストストリップは、ケース 6に収納されている。ケース 6は、通常は、合成樹脂製である。
ケース 6は、容器本体61と蓋体62とからなっている。
蓋体62の上面には上記のクロマト法テストストリップの試料添加用部材 5およびクロマト展開用膜担体 3の捕捉部31のそれぞれに対応する位置に、それぞれ、試料注入口621および判定孔622が穿設されている。
【００８６】
蓋体62の試料注入口621から被検体、被検体の培養物、これらからの各種抽出液などの試料が試料添加用部材 5に灌注される。灌注された該試料は試料添加用部材 5を下流側に向かって浸潤すると同時に下方の呈色標識抗体含浸部材 2へ移行せしめられるとともに呈色標識抗体含浸部材 2の下流側方向に向かって展開せしめられる。各種の試料中に結核菌から産出されたＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白が含有されていた場合には、この間にＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との免疫反応によってＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との呈色結合物が生成せしめられる。
【００８７】
試料はさらにクロマト展開用膜担体 3を下流側に向かって展開せしめられる。この呈色結合物は展開の途次に該クロマト展開用膜担体 3の捕捉部31で捕捉されて集積せしめられ呈色する。この呈色は判定孔622から肉眼で観察される。
【００８８】
［発明の効果］
本発明は簡便な方法で、かつ、短時間で、しかも、安全に、高い精度で結核菌の存否を判定することができ、さらに、試料中に存在する結核菌の菌数をも半定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】クロマト法テストストリップを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたクロマト法テストストリップの縦断部端面図である。
【図２】図１で示されたクロマト法テストストリップを収納するためのケースを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたケースの縦断部端面図である。
【符号の説明】
【００９０】
1 粘着シート
2 呈色標識抗体含浸部材
3 クロマト展開用膜担体
31 捕捉部
4 吸収用部材
5 試料添加用部材
6 ケース
61 容器本体
62 蓋体
621 試料注入口
622 判定孔
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌検出法に関し、さらに詳細には、たとえば、喀痰のような被検体中のヒト型結核菌またはウシ型結核菌の存否を検査するための検出方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
結核菌は分類学的には抗酸性菌に属する菌群である。結核菌には、ヒト型結核菌（ミコバクテリウム ツベルクローシス Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（ミコバクテリウム ボビス Mycobacterium bovis）、ネズミ型結核菌（ミコバクテリウム ミクロチ Mycobacterium microti）、トリ型結核菌（ミコバクテリウム アビウム Mycobacterium avium）および冷血動物結核菌などが知られている。しかして、これらの中でヒトの結核症に関与するのは、ほとんど全てヒト型結核菌であるが、稀には、ウシ型結核菌による感染がある。また、ヒト型結核菌およびウシ型結核菌以外のミコバクテリウム属に属する微生物は、非定型抗酸菌と呼ばれている。
【０００３】
一方、ヒトの結核症の従来の診断法としては、所謂、「ナイアシン産生試験」が広く行なわれている。
このナイアシン産生試験は、結核症疑罹患患者の、たとえば、喀痰、暖めた１重量％滅菌食塩水をエアロゾルとしてネプライザーで深く吸入させて咳とともに喀出される痰、胃洗浄液、糞便および尿などのそれぞれの被検体を培地に培養して増殖せしめた結核菌から沸騰蒸留水で抽出し、抽出液中のナイアシンの存否を知ることによって、被検体中の結核菌の存否を知る方法である。
【０００４】
しかしながら、ナイアシン産生試験においては、９３％以上の結核菌が陽性を示すが、他の抗酸菌の或る菌種、または、稀に、非定型抗酸菌でも陽性を示すため、仮令、ナイアシン産生試験が陽性であったとしても、必ずしもその菌種を結核菌であると断定することはできない。よって、一般的には、ナイアシン産生試験の他に、菌の生育速度、色素発生およびコロニーの性状などを同時に調べて、結核菌とそれ以外の抗酸菌との鑑別がなされている。
【０００５】
被検体の培養によって増殖した結核菌のナイアシンは定性的化学分析手段で検知されるが、この定性的化学分析は感度が低く、正確な検査結果を得るためには、多量のナイアシンが必要とされる。また、この定性的化学分析においては数工程にわたる分析学操作が行なわれるが、このような分析操作は菌体の飛散などによる結核菌感染の危険性が高い。したがってこれらの分析操作は、極めて安全性の高い環境で、かつ、極めて安全性の高い装置を使用し、しかも、細心の注意を払って行なわなければならないとされている。しかして、ナイアシン産生試験を実施するためには、定性的化学分析自体に多少の時間を要するだけでなく、被検体の培養を必要としこの培養には長時間かかるので、結果的には分析に長時間が費やされることになる。
【０００６】
一方、このナイアシン産生試験は、被検体を液体培養で行なう場合と固体培養で行なう場合とがある。
前者は、たとえば、米国などで行なわれており、被検体の培養期間は短縮されるが、作業時における結核菌感染の危険性が大きく、高度に安全な施設および装置が必要とされる。
本邦では、後者が行なわれており、結核菌感染の危険性は軽減されるが、分析結果が判明するまでに２ヵ月間程度の長期間が必要とされている。
しかして、後者においては、作業時における結核菌感染の危険性は軽減されはするが、依然として、安全性の高い環境で、かつ、安全性の高い装置を使用し、しかも、細心の注意を払われなければならないとされている。
【０００７】
蛋白質ＭＰＴ６４（以下、ＭＰＴ６４蛋白 と記す）はヒト型結核菌（ミコバクテリム ツベルクローシス Mycobacterium tuberculosis）が特異的に産生し、菌体外へ分泌するミコバクテリアル プロテイン（Mycobacterial protein）であり、また、蛋白質ＭＰＢ６４（以下、ＭＰＢ６４蛋白 と記す）と同一の物質であることが知られている。
他方、ＭＰＢ６４蛋白は、ＢＣＧ菌株のウシ型結核菌（ミコバクテリウム ボビス ＢＣＧ（Mycobacterium bovis ＢＣＧ）（以下、ＢＣＧ菌 と記す）によって産生され菌体外に分泌されるミコバクテリアル プロテインである。
エム．ハーボー（M.Harboe）は、このＭＰＢ６４蛋白をＢＣＧ菌から分離、精製して、その性質などについて研究して報告している（Infection and Inmmunity 1986, Vol.52, No.1, 293〜302）。
【０００８】
また、特開平１−２４７０９４号公報においても、ＭＰＢ６４蛋白は、ヒトに感染して結核症と酷似した症状を呈する非定型抗酸菌によっては産生されないが、ウシ型結核菌のＢＣＧ菌によって産生され、かつＭＰＴ６４蛋白と同一物質であるというＢＣＧ菌およびヒト型結核菌のそれぞれに特異な蛋白質であるとしている。
【０００９】
従って、このことは抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は抗原をＭＰＢ６４蛋白とする抗体であるが、同時にＭＰＴ６４蛋白の抗体でもあることを意味する。
従って、病原性的には無害なＢＣＧ菌を培養し、その培養液からＢＣＧによって産生されたＭＰＢ６４蛋白を抽出、精製し、該ＭＰＢ６４蛋白を抗原として抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を作成し、その抗体を用いた抗原抗体反応（免疫反応）によって被検体中の結核菌を検出することにより、ヒトの結核症を明確、かつ迅速に判別することができる結核症の簡便な診断法を確立することが可能となる。
【００１０】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を使用した結核菌の検査薬および検出方法として、たとえば、特開平７−１１０３３２号公報記載の方法が知られている。この方法における免疫学的方法として、逆受身血球凝集反応（ＲＰＨＡ）、逆受身ラテックス凝集反応（ＲＰＬＡ）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが記載されている。
前二者においては凝集時間が、たとえば、３時間程度と長く、感度が低く、かつ定量性は全くないなどの不都合な問題がある。
後者においては、前二者に比較して試験操作が煩雑で、かつ通常は特殊な機械を使用する関係上、安全キャビネット中での実施が容易ではないなどの欠点がある。
【特許文献１】特開平７−１１０３３２号公報
【非特許文献１】Infection and Immunity 1986, Vol.52, No.1, 293〜302
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、上記のような従来技術における欠点を解決し、被検体の採取から検査結果判明までの期間が短く、感度が高く、半定量性を有し、しかも、安全性が高い結核菌の検出法を開発すべく、鋭意、研鑚を重ねた結果、たとえば、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子のような呈色標識物質を結合せしめた呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を調製し、これを使用することにより上記の従来技術における欠点を解決することができるとの新知見を得、この知見に基づいて、本発明に到達した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも、試料添加用部材、呈色標識抗体含浸部材、クロマト展開用膜担体および吸収用部材を有し、上記呈色標識抗体含浸部材および上記クロマト展開用膜担体には前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体および第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体がそれぞれ含浸されており、上記試料添加用部材は上記呈色標識抗体含浸部材に積層され、上記クロマト展開用膜担体はその上流側端部が上記呈色標識抗体含浸部材に被覆されるとともに該呈色標識抗体含浸部材に連接され、上記吸収用部材はその上流側端部が上記クロマト展開用膜担体に積層されるとともに該クロマト展開用膜担体と連接してなるクロマト法テストストリップを用い、前記液体培養して得られた培養液を前記試料添加用部材に灌注することによって行われる。
【００１４】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質は、コロイド状金属または着色ラテックスであることが好ましい。
前記第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものであることが好ましい。
前記クロマト法テストストリップはケースに収容されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
被検体は、主として結核症疑罹患患者および被検患者のそれぞれの喀痰などであるが、たとえば、滅菌食塩水のエアロゾルを吸入させて咳とともに喀出される痰、胃洗浄液、糞便および尿などのそれぞれをも使用することができる。
被検体は、常法により、固体培養または液体培養がなされる。
【００１６】
固体培養の場合には、たとえば、試験管工藤ＰＤ固形斜面培地（協和薬品工業株式会社の商品）を使用して、３７℃で培養される。この斜面に培養された結核菌に蒸留水を添加して培養期間中に菌体外に分泌された培養物を抽出し、この結核菌混在溶液を試料として検査に供する。
液体培養の場合には、たとえば、被検体液と水酸化ナトリウム水溶液とを混合して、この混合液から菌体を遠心分離によって分離し、分離された菌体を、たとえば、デュボス液体培地（ベクトン・デッキンソン社の商品）で３７℃で培養した培養液を試料として検査に供する。
【００１７】
ＭＰＢ６４蛋白は、たとえば、上記の、エム．ハーボーの分離、精製法のようなそれ自体公知の方法で調製される。
すなわち、ミコバクテリウム ボビスに属するＢＣＧ菌東京株のようなＭＰＢ６４蛋白産生能力を有する菌株を、たとえば、ソートン培地のような液体培地で培養して得られた培養液から、塩析、透析、カラムクロマトグラフィおよび電気泳動などによる蛋白質の同定を逐次経由して精製ＭＰＢ６４蛋白が得られる。
【００１８】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は、このようにして得られた精製ＭＰＢ６４蛋白を抗原として、常法によって得られた単クローン抗体および多クローン抗体のいずれであってもよい。
単クローン抗体は、たとえば、ケラーミルシュタインの方法によって得られる。また、多クローン抗体は、好ましくは、ヤギを免疫して得られる。
【００１９】
このようにして得られた抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は、呈色標識物質と結合せしめられて呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とされる。
呈色標識物質には、たとえば、コロイド状金属および着色ラテックスなどがある。
コロイド状金属の代表例として、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。
【００２０】
コロイド状金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０nm程度とされる。
また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラテックスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数拾nm乃至数百nm程度から選択することができる。
これらの呈色標識物質は、市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
【００２１】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と呈色標識物質との結合は常法によって行なわれる。すなわち、たとえば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と金ゾルとを室温乃至常温下で数分間、長くても１０分間、混合することによって両者を物理的に結合せしめることが可能である。
【００２２】
抗原であるＭＰＢ６４蛋白または該蛋白質と同一物質であるＭＰＴ６４蛋白（以下、ＭＰＴ６４蛋白をＭＰＢ６４蛋白と同様に抗原と記す）と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とは、通常の抗原抗体反応によって結合せしめられる。すなわち、たとえば、結核菌が産生する抗原であるＭＰＢ６４蛋白またはＭＰＴ６４蛋白を含有するかもしれない検査試料と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との両者が混合せしめられた緩衝液中で常温乃至室温で静置することによって抗原抗体反応が行なわれ、抗原であるＭＰＢ６４蛋白またはＭＰＴ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物（以下、単に呈色結合物と記す）が得られる。この呈色結合物は、たとえば、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体が固定化された帯状固相担体にチャージされてクロマト展開され、そのことごとくを該第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に捕捉せしめて、使用された呈色標識物質固有の色を呈せしめ、これにより被検体中の結核菌が検出される。
【００２３】
上記の第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は抗原であるＭＰＢ６４蛋白またはＭＰＴ６４蛋白に対する抗原抗体反応の結合部位が、標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に使用された抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の該抗原に対する抗原抗体反応の結合部位とは異なるものでなければならない。
【００２４】
なお、結核菌の既知の菌数と第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体で捕捉される呈色結合物の呈色濃度との関係から導いた判定基準を使用することにより、被検体中に含有されている結核菌の大凡の菌数を知ることが出来る。この場合に、被検体の検査条件のすべては、判定基準を作成する際のそれらと実質的に同一とされなければならない。
【００２５】
呈色結合物の第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体による捕捉は、クロマト法テストストリップによることが好ましい。
クロマト法テストストリップとは、ケースの蓋体の試料注入口から、帯状の固相担体テストストリップの一端に検査試料を灌注することによりクロマト展開が開始されて浸潤して該テストストリップの呈色標識抗体含浸部材に到達し、該部材の呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と免疫反応して呈色結合物が形成され、さらに、該呈色結合物が捕捉部位まで浸潤して捕捉部位の第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との免疫反応により捕捉されて、捕捉部位が呈色せしめられる方法である。
【００２６】
クロマト法テストストリップの調製に、たとえば、特公平７−１３６４０号記載の方法が好適に適用される。
クロマト法テストストリップによる本発明の結核菌検出法において、被検体または被検体から得られた検査試料と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを予め混合した混合液をクロマト法テストストリップによりクロマト展開せしめてもよいし、また、クロマト法テストストリップに予め試料添加用部材および呈色標識抗体含浸部材をそれぞれ設け、該試料添加用部材に所定量の被検体または被検体から得られた検査試料を灌注してクロマト展開を行なう上記の方法によってもよい。
【００２７】
上記のクロマト法テストストリップによって本発明の結核菌検出法を行なうために、少なくとも、ケースに収納されたクロマト法テストストリップまたは呈色標識抗体含浸部材が欠如したクロマト法テストストリップと容器に収納された呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を１組みとしてキットとすることができる。
【００２８】
このキットには、さらに上記の判定基準として予め作成された蛋白濃度と呈色度との関係表を包含せしめることができる。
本発明の結核菌検出方法において、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との間の免疫反応ならびにこの免疫反応で生成せしめられた呈色結合物と第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との間の免疫反応はいずれも数分で完結せしめられるので、検査自体は長くても１５分程度で終了する。
【００２９】
本発明の結核菌検出法では、他の結核菌検出方法におけると同様に、被検体の処理に際して結核菌感染を防止するように充分な注意が必要とされる。しかしながら、本発明の検出法では、結核菌が含有されているかも知れない被検体または被検体から得られた検査試料は、その少量がクロマト法テストストリップに添加されるだけであり、かつ、検査自体に要する時間は長くとも１５分程度であるため、結核菌に感染する危険性は、検査の操作が煩雑で検査に長時間を有する従来の結核菌検出方法に比して少ない。
【実施例】
【００３０】
本発明を実施例によって、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
１．ＭＰＢ６４蛋白の分離
(1) ＢＣＧ菌東京株の培養
ＢＣＧ菌東京株は結核予防会結核研究所から入手し、それを下記の組成を有するソートン培地５００ml×２０本に接種し、３７℃で５週間培養して、培養液１０lを得た。
【００３２】
ソートン培地の組成
アスパラギン ０.４ ％
くえん酸 ０.２ ％
くえん酸ナトリウム ０.２８ ％
りん酸カリウム ０.０５ ％
硫酸マグネシウム ０.０５ ％
くえん酸第１鉄アンモニウム ０.００５％
グリセリン ６ ％
（「％」は「重量／容量％」を示す。以下同様）
【００３３】
(2) ＭＰＢ６４蛋白の分離・精製
1)上記(1)で得られた培養液に硫酸アンモニウム（以下、硫安 と記す）を加えて８０％飽和溶液として、沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得られたこの蛋白質画分を３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に溶解せしめ、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して蛋白質約９gを含有する透析液約３０mlを得た。
2)この蛋白質約９gを含有する上記の溶液約３０mlをＤＥＡＥ・セファデックスＡ・５０（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（５７cm×５.５cm）にチャージして、３０mMトリス塩酸溶緩衝液（ｐＨ８.７）１００mlを用いて上記のカラムを洗浄して溶出液を得た。
【００３４】
次いで、３０mMトリス塩酸緩衝・２００mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）でクロマト展開した。このクロマト展開の溶出液に硫安を加えて７０％飽和溶液として、沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得た。この蛋白質画分を３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に溶解せしめ、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して蛋白質約３.５gを含有する透析液約３５mlを得た。
【００３５】
3)この蛋白質約３.５gを含有する上記の溶液約３５mlをＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（６４cm×３.６cm）にチャージして、３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）約７００mlを用いて上記のカラムを洗浄した。
次いで、３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）および３０mMトリス塩酸緩衝・２００mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）を用いて塩化ナトリウム濃度０から２００mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液を２０mlずつのフラクションとして採取した。フラクション番号１０５番から１２１番までの展開液を集めた。この展開液に硫安を加えて７０％飽和溶液として沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得た。この蛋白質画分を３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に溶解せしめて、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）に対して透析して蛋白質約０.７gを含有する透析液約７mlを得た。
【００３６】
この展開液約３６０mlを、分画分子量が１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約６mlになるまで濃縮し、次いで、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）に対して透析して透析液約７mlを得た。この溶液約７mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約０.７gを含有する凍結乾燥品を得た。
【００３７】
4)この蛋白質０.７gを含有する凍結乾燥品を精製水７mlに溶解せしめ、その全量をＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（４５cm×３.０cm）にチャージして、３０mMトリス塩酸緩衝・３M尿素・４０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ ７.５）と３０mMトリス塩酸緩衝・３M尿素・９０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.５）を用いて塩化ナトリウム濃度４０mMから９０mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液５mlずつをフラクションとして採取した。
【００３８】
それぞれのフラクションの少量をポリアクリルアミドゲルの固相担体にスポッティングして電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルー染色によって得られた電気泳動像において分子量約２３,０００の蛋白質のバンドが認められた各フラクションを集めた。この溶液を分画分子量１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約２mlになるまで濃縮し、次いで１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８.７）に対して透析して透析液約２.５mlを得た。この溶液約２.５mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約６０mgを含有する凍結乾燥品を得た。
【００３９】
5)この蛋白質約６０mgを含有する凍結乾燥品を精製水２mlに溶解せしめ、その全量をＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（３４cm×２.７cm）にチャージし、次いで、３０mMトリス塩酸緩衝・６０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）を用いてカラムを洗浄した。
【００４０】
次に、３０mMトリス塩酸緩衝・６０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.７）と３０mMトリス塩酸緩衝・１１０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ ８.７）を用いて塩化ナトリウム濃度６０mMから１１０mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液１mlずつをフラクションとして採取した。それぞれのフラクションの少量をポリアクリルアミドゲルの固相担体にスポッティングして電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルー染色によって得られた電気泳動像において分子量約２３,０００の蛋白質のバンドが認められた各フラクションを集めた。
【００４１】
この溶液を、分画分子量１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約１mlになるまで濃縮した。次いで、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して透析液約１.３mlを得た。この溶液約１.３mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約６mgを含有する凍結乾燥品を得た。
【００４２】
6)最後に、この蛋白質約６mgを含有する凍結乾燥品を精製水１mlに溶解せしめ、その全量をセファクリルＳ−２００（ファルマシア バイオテク株式会社の商品）カラム（３０cm×２cm）にチャージし、次いで、３０mMトリス塩酸緩衝・０.５mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.５）を用いてクロマト展開し、この展開液を０.５mlずつのフラクションとして採取した。それぞれのフラクションの少量をポリアクリルアミドゲルの固相担体にスポッティングして電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルー染色によって得られた電気泳動像において分子量約２,３０００の蛋白質のバンドが認められた各フラクションを集めた。この溶液を分画分子量１０,０００のポアサイズを有する限外濾過膜を使用した吸引式限外濾過により、５℃で約１mlになるまで濃縮し、次いで、１０℃で３０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.７）に対して透析して透析液約１.３mlを得た。この溶液約１.３mlを常法により凍結乾燥を行ない、蛋白質約５mgを含有する凍結乾燥品を得た。 このようにして得られた分子量約２３,０００のこの蛋白質のデスク電気泳動（７.７％アクリルアミドゲル）では単一ピークの泳動像を示したので、このＭＰＢ６４蛋白は純度が高いものと判断された。
【００４３】
２．抗ＭＰＢ６４蛋白単クローン抗体（マウス）の作成
(1) ＭＰＢ６４蛋白投与マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系）の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合
1)上記１．で得られた精製ＭＰＢ６４蛋白を用いて、ケラー−ミルシュタインの方法（G.Kohker and C.Milstein；Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976）にしたがって細胞融合を行ないハイブリドーマを調製した。
【００４４】
すなわち、上記１．で得られた精製ＭＰＢ６４蛋白溶液（２００μg／ml）５００μlとフロイント不完全アジュバント５００μlとを常法により乳化するまで混合し、この混合乳化液５００μlをＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（雌、４週齢）の腹腔内に投与して免疫を行なった。前回投与の２週間後に、上記と同様にして調製された混合乳化液４０μlを上記のマウス腹腔内に、再度、投与した。
さらに、その２週間後に精製ＭＰＢ６４蛋白の生理食塩水溶液（２００μg／ml）を上記のマウス腹腔内に投与して最終免疫を行なった。
【００４５】
2)最終免疫から３日後にマウスを屠殺して、直ちにその脾臓を無菌的に取り出した。この脾臓を約１０mlの無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地が入れてある直径６０mmのシャーレに入れ、脾臓の長軸に沿って鋏で切れ目を入れ、手早く脾臓をピンセットで圧迫しつつ細胞を遊離せしめた。この細胞をナイロンメッシュを通過せしめられて、新たな無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊せしめて脾臓細胞浮遊液を得た。
【００４６】
3)上記の脾臓細胞浮遊液をＲＰＭＩ−１６４０培地と混合し、フィコールペイクを用いる比重遠心法によって赤血球を除去して得られた脾臓細胞を、無菌ＲＰＭＩ−１６４０無血清培地中に浮遊せしめた。
【００４７】
4)他方、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（以下、Ｐ３Ｕ１細胞 と記す）をウシ胎児血清１０容量％を含有されてなる無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養増殖させた後に、遠心分離（２５０×Ｇ）してＰ３Ｕ１細胞を分離し、この細胞を無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄して、無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊せしめＰ３Ｕ１細胞浮遊液を得た。
【００４８】
5)上記2)の脾臓細胞浮遊液と上記4)のＰ３Ｕ１細胞浮遊液とを混合し、遠心分離（２５０×Ｇ）によってこの混合液から両者の細胞を分離した。分離されたこの両者の細胞を分子量４,０００のポリエチレングリコールが４０％含有されてなる無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７.４）１mlに懸濁して３７℃で６分間静置して、脾臓細胞とＰ３Ｕ１細胞とを融合せしめてハイブリドーマとした。
【００４９】
次いで、これらの細胞に無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて全量１０mlとし、この細胞浮遊液を遠心分離（２５０×Ｇ）してこれらの細胞を分離した。これらの細胞にウシ胎児血清が１０容量％含有されてなる無菌ＲＰＭＩ−１６４０培地１０mlを加えて、これらの細胞を浮遊せしめた。この細胞浮遊液を遠心分離（２５０×Ｇ）して液分を除去し、細胞を得た。
【００５０】
6)この細胞にＨＡＴ培地を加えて１×１０6個／mlの細胞浮遊液とし、この細胞浮遊液の１００μlずつを９６穴（ウエル）プラスチック マイクロタイタープレート（住友ベークライト株式会社の商品）の各ウエルに分注し、インキュベーター中で炭酸ガスが５容量％含有されてなる空気の存在下３７℃で培養した。
【００５１】
7)培養開始後１日目に、さらに、ＨＡＴ培地を各ウエルに１００μlずつ加え、以後 ２日目、３日目、８日目および１１日目のそれぞれには、培養液の半分である１００μlを取り除き、その替りにＨＡＴ培地１００μlを補充しつつ培養を続行した。培養後１４日目には、ハイブリドーマが存在するウエルには１ウエルあたり平均２〜３個のハイブリドーマのコロニーが認められた。このウエルでは、培養開始から約２週間後にはハイブリドーマが充分増殖したので、この時点で培養上澄液の抗体力価を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて検定した。
【００５２】
8)固相酵素免疫測定法は、予め抗原であるＭＰＢ６４蛋白が固相化せしめられたＥＬＩＳＡ用プラスチック マイクロタイタープレートのウエルに、これらのハイブリドーマが培養された５０μlの培養液を加えて３７℃で１時間静置し、この培養液を除去した後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で洗浄する。次いで５０μlのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン溶液を加えて、３７℃で１時間静置して免疫反応せしめて、該ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン溶液を除去し、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で洗浄する。さらに、このウエルに４−アミノアンチピリン、過酸化水素およびフェノールからなる通常のペルオキシダーゼ発色系の試薬を加えて発色せしめて常法にしたがって抗体の力価を求めた。
一方、抗体を産生しているウエル中のハイブリドーマについては、限界希釈法によるクローニング操作を３回繰り返し行なった。
その結果、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を安定に産生するクローン化細胞５株を得た。
【００５３】
(2) 単クローン抗体の精製
１週間前に１匹あたり2,6,10,14−テトラメチルペンタンデカン０.５mlを腹腔内に注射されたＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に上記のクローン化細胞株のうち抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の生産量が特に多いクローン化細胞懸濁液（１０7個／ml）０.５mlを注射し、その１週間後に抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含む腹水を該マウス１匹あたり５〜１０ml得た。
【００５４】
この腹水を、５０mMトリス塩酸緩衝・１５０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８.５）で平衡化されたプロテインＡ（ファルマシア バイオテック株式会社の商品）カラムにチャージした。次いで、５０mMトリス塩酸緩衝・１５０mM塩化ナトリウム液（ｐＨ８.５）でカラムを洗浄した後、１００mMくえん酸塩緩衝・１５０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ５.０）で上記の抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を溶出せしめた。
【００５５】
上記の抗ＭＰＢ６４蛋白抗体溶出液を１０℃で２０mMりん酸塩緩衝・１５０mM塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.４）に対して透析した後、防腐剤として最終濃度が０.１％溶液となるようにアジ化ナトリウム（ＮａＮ3）を添加した。
【００５６】
３．金コロイド標識抗体および青色ラテックス標識抗体の作成
(1) 金ゾルの調製
９９mlの超純水を沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸（片山化学工業株式会社の商品）溶液（塩化金酸濃度１％）１mlを加え、さらにその１分後に、くえん酸ナトリウム溶液（くえん酸ナトリウム濃度１％）１.５mlを加えて５分間沸騰させて後に、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液を２００mM炭酸カリウム溶液でｐＨ９.０に調製し、これに超純水を加えて全量を１００mlとして金ゾルを得た。
【００５７】
(2) 金コロイド標識抗体の調製
上記２．で得られた抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体の蛋白換算重量１μg（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単にその重量の数値のみを示す ）と上記の金ゾル１mlとを混合し、室温で２分間静置して、この抗体のことごとくを金ゾルの分散粒子であるコロイド粒子と結合させた。これに最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ と記す）水溶液を加えて上記の抗体に結合せしめられた金コロイド粒子の表面をブロックした。この溶液を遠心分離（５,６００×Ｇ、３０分間）して抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体を結合したコロイド粒子の表面がＢＳＡでブロックされた金コロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。
この金コロイド標識抗体を、１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０.５％トリトン（Triton）−Ｘ１００を含有する５０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７.４）に再懸濁して精製金コロイド標識抗体溶液を得た。
【００５８】
(3) 青色ラテックス標識抗体の調製
上記２．で得られた抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体０.２５mgと１０％青色ラテックス（粒径０.２μm、日本ペイント株式会社の商品）溶液を精製水で希釈して得られた１％青色ラテックス溶液１mlとを混合し、室温で３０分間静置して抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体を青色ラテックスに結合させた後、遠心分離（５,０００×Ｇ、３０分間）して青色ラテックスに結合せしめられた抗ＭＰＢ６４蛋白マウス単クローン抗体である粗青色ラテックス標識抗体を沈殿せしめて集めた。この粗青色ラテックス標識抗体を１％ＢＳＡ溶液および０.８５％塩化ナトリウム溶液を含有する１０mMりん酸塩緩衝液（ｐＨ７.４）１mlに再分散し、遠心分離（５,０００×Ｇ、３０分間）するという操作を３回繰り返した。このように処理された青色ラテックス標識抗体を１％ＢＳＡおよび０.８５％塩化ナトリウム溶液が含有されてなる１０mMりん酸塩緩衝液（ｐＨ７.４ ）２０mlに分散せしめて、固形分約０.０５％の精製青色ラテックス標識抗体溶液を得た。
【００５９】
４．クロマト法テストストリップの作成
(1) 特公平７−１３６４０号公報の記載に準拠してクロマト法テストストリップを作成した。
すなわち、幅５mm,長さ３６mmの細長い帯状のニトロセルロース膜（メンブレンフィルター）をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体とし、このクロマト展開始点とは逆方向末端から７.５mmの位置に、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体３.０mg／mlが含有されてなる抗体溶液０.５μlをスポット状に塗布して、これを室温で乾燥して補足部位とした。なお、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とは免疫反応において、抗原であるＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白に対する結合部位が、上記３．の金コロイド標識抗体または青色ラテックス標識抗体の調製に使用された抗体とは異なる結合特異性を有する抗体をいう。
【００６０】
(2) また、５mm×１５mmの帯状のガラス繊維不織布に上記の金コロイド標識抗体液３７.５μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材とした。
(3) また、５mm×１５mmの帯状のガラス繊維不織布に上記の青色金ラテックス標識抗体溶液３７.５μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて青色ラテックス標識抗体含浸部材とした。
【００６１】
(4) 次に、試料添加用部材である綿布、上記の金コロイド標識抗体含浸部材または青色ラテックス標識抗体含浸部材、クロマト展開用膜担体であるニトロセルロース膜および吸収用部材である濾紙を、それぞれ粘着シートの粘着面の所定位置に貼着してクロマト法テストストリップを作成した。すなわち、粘着シートの粘着面上にクロマト展開用膜担体を貼着し、このクロマト展開用膜担体のクロマト展開の始点とは逆方向末端に、上記の金コロイド標識抗体溶液または青色ラテックス標識抗体溶液を含浸せしめて乾燥せしめられた標識抗体含浸部材のクロマト展開の始点とは逆方向末端を重ね合わせて配列せしめ、さらに、この金コロイド標識抗体含浸部または青色ラテックス標識抗体含浸部の重複部分からその全体を覆って試料添加部材を配列せしめた。
さらに、ニトロセルロース膜の他方の端には、吸収用部材の一部を重ねて配列せしめてクロマト法ストリップとした。
【００６２】
５．被検体からの結核菌の検出
(1) 判定基準の作成
1)精製ＭＰＢ６４蛋白を生理食塩水で希釈し、ＭＰＢ６４蛋白の濃度がそれぞれ０.２５ng／ml，０.５ng／ml，１.０ng／ml，２.０ng／ml，４.０ng／ml，８.０ng／mlおよび１６.０ng／mlからなる溶液とし、これらのＭＰＢ６４蛋白溶液を標準試料とした。これらの標準試料を用いて、上記のクロマト法テストストリップによる検定およびＲＰＨＡ法による検定を行ない、得られた両者の結果からＭＰＢ６４蛋白濃度に対する両者の方法の検出感度について比較した。
【００６３】
2)抗体感作血球を特開平７−１１０３３２号公報記載の方法に準拠して調製した。
すなわち、グルタールアルデヒド固定ヒツジ赤血球の０.５％１０mMりん酸塩緩衝懸濁液１容量部と、１mgのタンニン（米国ＮＢＣ社）を生理食塩水１００mlに溶解せしめた溶液１容量部とを混合し、室温で１５分間放置した後、タンニン処理赤血球を遠心分離し、タンニン処理赤血球を生理食塩水で３回洗浄した後に、１容量部になるように生理食塩水に懸濁せしめて０.５％タンニン赤血球生理食塩水溶液を得た。
【００６４】
常法にしたがってヤギを免疫して得られた抗体をアフィニティーカラムクロマト法により精製した精製抗ＭＰＢ６４蛋白多クローン抗体溶液（２μg／ml）１容量部と上記の０.５％タンニン赤血球生理食塩水溶液１容量部とを混合し、３７℃で３０分間放置した後、この液を遠心分離（１,５００×Ｇ、１０分間）して抗体感作赤血球を分離した。この抗体感作赤血球１０mMりん酸塩緩衝液で３回洗浄した後、０.１％ＢＳＡを含有する１０mMりん酸塩緩衝液に懸濁せしめて０.５％抗体感作赤血球生理食塩水溶液を調製した。
【００６５】
3)金コロイド標識抗体含浸部材を用いたクロマト法テストストリップにおいて、各濃度の標準試料１００μlをクロマト展開せしめ、１５分後の該テストストリップにおける補足部位での赤紫色の着色の有無を肉眼で判定し、無着色を−とし、着色をその濃淡により±（疑陽性）から＋＋＋（濃厚着色）までの間を、±，＋，＋＋，＋＋＋の４段階に区分して判定基準とした。クロマト法テストストリップにおける肉眼による判定基準と標準試料の蛋白濃度との関係を表１に示した。
なお、捕捉部位における赤紫色の着色の有無および着色の濃淡は、被検体中の結核菌の有無および結核菌の大凡の菌数を表わしていることはいうまでもない。
【００６６】
4)青色ラテックス標識抗体含浸部を用いて、上記同様の操作を行なったとき、上記と同様の結果が得られた。
【００６７】
5)他方、ＲＰＨＡ法において、９６ウエル プラスチック マイクロタイタープレート（住友ベークライト株式会社の製品）の各ウエルに、各濃度の標準試料５μlずつを入れ、次いで、各ウエルに上記の抗体感作赤血球生理食塩水溶液２５μlを滴下し、室温で３０分間静置して免疫反応を生ぜしめ、この反応後の各ウエルのおける赤血球凝集の程度を肉眼で判定して、−（無凝集）から＋＋＋（極めてよい凝集）までの間の−，±，＋，＋＋，＋＋＋の５段階に区分した。このＲＰＨＡ法における肉眼判定の結果を、上記のクロマト法テストストリップでの標準試料の精製ＭＰＢ６４蛋白濃度に基づく判定基準と比較し、それを表１に示す。
表１に示されるように、本発明の結核菌検出法はＲＰＨＡ法に比して感度が高く、しかも半定量性があることが判る。
【００６８】
【表１】
【００６９】
(2) 被検体からの結核菌検出例１
1)ヒトの喀痰を結核症被検体（８例）とし、該被検体からの結核菌の検出を検討した。
すなわち、被検体５mlと、５mlの２％水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で３０分間静置した後、遠心分離（１,５００×Ｇ、３０分間）して生じた沈渣を回収し、この沈渣と生理食塩水とを混合し、この混合液を遠心分離（１,５００×Ｇ、３０分間）して生じた沈渣を再び回収し、この沈渣と生理食塩水２００μlとを混合して、これを検査試料とした。
【００７０】
2)この検査試料１００μlを滅菌試験管にとり、この試験管にデュボス液体培地（ベクトン・デッキンソン株式会社の商品）５mlを加え、３７℃で培養し、培養開始３日目の培養液について上記の本発明のクロマト法テストストリップによる結核菌の検出法およびＲＰＨＡ法による結核菌の検出を行なった。
なお、培養開始７日目の培養液については、ＲＰＨＡ法のみによる結核菌の検出を行なった。
【００７１】
対照として、上記の被検体８例の喀痰各５mlと、５mlの２％水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で３０分間静置した後、この溶液１００μlを、試験管工藤ＰＤ固形斜面培地（協和薬品工業株式会社の商品）の表面に均一に接種して、３７℃で５６日間培養し、増殖した結核菌についてナイアシン産生試験を行なった。
【００７２】
すなわち、上記の試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面に１ml沸騰蒸留水を加え、該表面をほぼ水平にし５分間静置して結核菌体からナイアシンを抽出した。
この抽出液から２００μlを採取し、これと４容量％アニリン・エタノール溶液１００μlおよび１０容量％ブロムシアン溶液とを混合した。混合してから５分後に、この混合液に結核菌に由来したナイアシンが存在すれば、混合液は黄色に発色するので、肉眼で判定して黄色に発色すれば、その被検体を陽性（＋）とした。
表２にこれらの検査結果を示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
表２から、ナイアシン産生試験では試験管工藤ＰＤ固形斜面培地での培養に５６日間という長期間を要するが、他方、本発明の検出法では、デュボス液体培地での培養で３日間という短期間ですみ、また、本発明の検出法ではその感度もＲＰＨＡ法に比して格段と高い。
【００７５】
(3) 被検体からの結核菌検出例２
1) レントゲン診断による結核症疑罹患患者８名のそれぞれの喀痰における結核菌についての検査を行なった。
すなわち、上記の各喀痰と、これと等量の２％水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で３０分間静置し、これを培養試料とした。
【００７６】
2)上記培養試料１００μｌを試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面に均一に接種して、３７℃で培養し、培養開始７日目、１４日目、２１日目、２８日目および５６日目に、各試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面に蒸留水５００μｌをそれぞれ加えて振盪し、該試験管中の液を菌体抽出試料とした。この菌体抽出試料１００μlをクロマト法テストストリップにチャージしてクロマト展開せしめ、１５分後の捕捉部位における赤紫色の呈色の有無および呈色の濃淡を肉眼で観察し、上記の判定基準に従って判定した。
なお、比較のために上記の各試料について、培養期間を５６日間とした以外は上記と同様に培養して増殖せしめた結核菌に関して上記と同様にしてナイアシン産生試験を行なった。
これらの結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
なお、表３において（−）および（＋）のそれぞれは、上記の試験管工藤ＰＤ固形斜面培地の表面においてコロニーが「形成されていない」および「形成された」をそれぞれ示す。
【００７９】
表３では、試料の培養に試験管工藤ＰＤ固形斜面培地を使用した場合には、ナイアシン産生試験では検査結果が判明するまでに５６日の長期間を要するに対して、本発明の検出方法ではナイアシン産生試験の半分の日数である培養開始２８目で被検体における結核菌の存在が判定でき、しかも、極めて高感度であることを示している。
【００８０】
次に、本発明の結核菌検出法において好適に使用されるクロマト法テストストリップの代表例を図面を使用してさらに具体的に説明する。
すなわち、図１はクロマト法テストストリップを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたクロマト法テストストリップの縦断部端面図である。
しかして、図２は図１で示されたクロマト法テストストリップを収納するためのケースを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたケースの縦断部端面図である。
なお、図面は原理を示すためのものであり、寸法などは正確には示されていない。
【００８１】
このクロマト法テストストリップは、粘着シート 1の粘着面に、上流側（以下、図面の向かって左側を上流側、また、図面の向かって右側を下流側と記す）から順次、試料添加用部材 5、呈色標識抗体含浸部材 2、クロマト展開用膜担体 3および吸収用部材 4が貼着されている。しかして、呈色標識抗体含浸部材 2にはその全面に呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体液が、また、クロマト展開用膜担体 3には第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体液がスポット状に含浸せしめられている（クロマト展開用膜担体 3においてスポット状に第二抗ＭＰＢ６４蛋白が含浸せしめられた箇所を以下、捕捉部31 と記す）。なお、試料添加用部材 5は該呈色標識抗体含浸部材 2に積層せしめられている。該クロマト展開用膜担体 3はその上流側端部が上記の呈色標識抗体含浸部材 2によって被覆され、かつ該呈色標識抗体含浸部材 2に連接せしめられている。
【００８２】
該吸収用部材 4はその上流側端部が該クロマト展開用膜担体 3の下流側端部に積層せしめられている。
これらの粘着シート 1、呈色標識抗体含浸部材 2、クロマト展開用膜担体 3、吸収用部材 4および試料添加用部材5はいずれも細長い長方形で帯状とされている。クロマト展開用膜担体 3はクロマト展開に際してそれ自体の毛細管作用により、試料添加用部材 5にスポット状にチャージされた被検体およびその他の各種試料をクロマト展開方向である下流側に自動的に移動せしめ得る材質を有するものであればよい。
【００８３】
しかして、呈色標識抗体含浸部材 2としてガラス繊維不織布が、クロマト展開用膜担体 3としてニトロセルロース膜が、吸収用部材 4として濾紙が、試料添加用部材 5として、その材質は問わないが、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布が最適である。
【００８４】
捕捉部31を有するクロマト展開用膜担体 3は、捕捉部31に補足される呈色結合物の色が明確に目視できるものを使用することが好ましい。たとえば、呈色標識物質が金コロイド粒子である場合には、この金コロイド粒子は赤紫色を呈するため、その呈色結合物も赤紫色を呈するので、クロマト展開用膜担体 3の色は淡色が好ましく、白が特に好ましい。
【００８５】
上記のクロマト法テストストリップは、ケース 6に収納されている。ケース 6は、通常は、合成樹脂製である。
ケース 6は、容器本体61と蓋体62とからなっている。
蓋体62の上面には上記のクロマト法テストストリップの試料添加用部材 5およびクロマト展開用膜担体 3の捕捉部31のそれぞれに対応する位置に、それぞれ、試料注入口621および判定孔622が穿設されている。
【００８６】
蓋体62の試料注入口621から被検体、被検体の培養物、これらからの各種抽出液などの試料が試料添加用部材 5に灌注される。灌注された該試料は試料添加用部材 5を下流側に向かって浸潤すると同時に下方の呈色標識抗体含浸部材 2へ移行せしめられるとともに呈色標識抗体含浸部材 2の下流側方向に向かって展開せしめられる。各種の試料中に結核菌から産出されたＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白が含有されていた場合には、この間にＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との免疫反応によってＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との呈色結合物が生成せしめられる。
【００８７】
試料はさらにクロマト展開用膜担体 3を下流側に向かって展開せしめられる。この呈色結合物は展開の途次に該クロマト展開用膜担体 3の捕捉部31で捕捉されて集積せしめられ呈色する。この呈色は判定孔622から肉眼で観察される。
【００８８】
［発明の効果］
本発明は簡便な方法で、かつ、短時間で、しかも、安全に、高い精度で結核菌の存否を判定することができ、さらに、試料中に存在する結核菌の菌数をも半定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】クロマト法テストストリップを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたクロマト法テストストリップの縦断部端面図である。
【図２】図１で示されたクロマト法テストストリップを収納するためのケースを示し、ａは平面図、ｂはａで示されたケースの縦断部端面図である。
【符号の説明】
【００９０】
1 粘着シート
2 呈色標識抗体含浸部材
3 クロマト展開用膜担体
31 捕捉部
4 吸収用部材
5 試料添加用部材
6 ケース
61 容器本体
62 蓋体
621 試料注入口
622 判定孔
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法。
【請求項２】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質がコロイド状金属である請求項１記載の結核菌検出法。
【請求項３】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質が着色ラテックスである請求項１記載の結核菌検出法。
【請求項４】
前記第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものである請求項１〜３の何れか１項に記載の結核菌検出法。
【請求項５】
少なくとも、試料添加用部材５、呈色標識抗体含浸部材２、クロマト展開用膜担体３および吸収用部材４を有し、上記部材２および担体３には前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体および第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体がそれぞれ含浸されており、上記部材５は部材２に積層され、上記担体３はその上流側端部が上記部材２に被覆されるとともに該部材２に連接され、上記部材４はその上流側端部が上記担体３に積層されるとともに該担体３と連接してなるクロマト法テストストリップを用い、前記液体培養して得られた培養液を前記試料添加用部材に灌注することによって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質がコロイド状金属である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質が着色ラテックスである請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものである請求項５〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマト法テストストリップがケースに収容されてなる請求項５〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１】
被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白と呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法。
【請求項２】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質がコロイド状金属である請求項１記載の結核菌検出法。
【請求項３】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質が着色ラテックスである請求項１記載の結核菌検出法。
【請求項４】
前記第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものである請求項１〜３の何れか１項に記載の結核菌検出法。
【請求項５】
少なくとも、試料添加用部材５、呈色標識抗体含浸部材２、クロマト展開用膜担体３および吸収用部材４を有し、上記部材２および担体３には前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体および第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体がそれぞれ含浸されており、上記部材５は部材２に積層され、上記担体３はその上流側端部が上記部材２に被覆されるとともに該部材２に連接され、上記部材４はその上流側端部が上記担体３に積層されるとともに該担体３と連接してなるクロマト法テストストリップを用い、前記液体培養して得られた培養液を前記試料添加用部材に灌注することによって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質がコロイド状金属である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体において、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質が着色ラテックスである請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は前記呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものである請求項５〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマト法テストストリップがケースに収容されてなる請求項５〜８の何れか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−３１６０７８（Ｐ２００７−３１６０７８Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８４１６２（Ｐ２００７−１８４１６２）
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【分割の表示】特願平９−２８２６０４の分割
【原出願日】平成９年９月３０日（１９９７．９．３０）
【出願人】（５９１０１１２８１）株式会社タウンズ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【分割の表示】特願平９−２８２６０４の分割
【原出願日】平成９年９月３０日（１９９７．９．３０）
【出願人】（５９１０１１２８１）株式会社タウンズ (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]