線維芽細胞の増殖の弱毒化
【課題】プロテオグリカンの改変を通じて、線維性細胞の異常な形成に関連する状態の処置のための方法および組成物を提供すること。コラーゲン合成を調節するため、ＴＧＦβの産生を減少させるため、線維芽細胞の増殖もしくは遊走を減少させるため、細胞由来のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを放出させるため、および線維芽細胞状上で増殖因子結合部位を減少させるための方法および組成物を提供すること。強皮症、乾癬、ケロイド、肺線維症および外科的癒着のような線維芽細胞の過剰増殖に関する障害を処置するための方法および組成物を提供すること。
【解決手段】高度に精製された、特定のグリコサミノグリカン分解酵素（コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣ）を使用する。
【解決手段】高度に精製された、特定のグリコサミノグリカン分解酵素（コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣ）を使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、線維性組織の形成を阻害するための、コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣ、グリコサミドグリカン分解酵素を使用する方法および組成物である。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上および細胞外基質中のプロテオグリカンは、可変性のグリコサミノグリカン鎖を含み、これは、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣを含む。いくつかのプロテオグリカンは、１つのタイプのグリコサミノグリカンのみを含むが、他は、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の混合物を含む（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７１：４８１−５３０、１９９１）。細胞外プロテオグリカンは、細胞および組織のための骨格構造を形成し、そして細胞関連プロテオグリカンと共に、細胞接着、細胞遊走、および細胞増殖を制御する際の主な機能を有する。プロテオグリカンおよびそれらの成分の一部の機能は、細胞代謝におけるヘパリン硫酸およびヘパラン硫酸の役割にかなりの重点を置いて、総括的に研究されている（Ｋｊｅｌｌｅｎ，Ｌ．およびＬｉｎｄａｈｌ，Ｕ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：４４３−４７５；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら（１９９５）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７４：５３４−５４０；Ｙａｙｏｎｒａ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：８４１−８４８）。コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを含む、プロテオグリカンの生物学的活性、および特に、細胞増殖でのそれらの効果について、ほとんど知られていない。
【０００３】
グリコサミノグリカン合成の２種のインヒビター（クロレートおよびβ−キシロシド（β−ｘｙｌｏｓｉｄｅ））を、細胞周期の制御に対するヘパランとコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとの相対的な寄与を試験するために使用した（Ｋｅｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：８１００−８１０７；Ｍｉａｏら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：７１３−１８４；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｎ．Ｂ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６３１６−６３２１）。しかし、これらの化合物の両方は、硫酸化グリコサミノグリカンの全タイプの発現を阻害する。現在、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣの合成または発現を選択的に遮断し得るインヒビターは存在しない。しかし、細胞由来のヘパリン硫酸またはコンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣのいずれかを除去し得る、特定のグリコサミノグリカンリアーゼが、利用可能である。コンドロイチナーゼは、以下の種々の細菌種から単離された：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｕｒｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ（Ｌｉｎｈａｒｄｔら（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１３５−１７５；Ｌｉｎｎら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：８５９−８６６；Ｍｉｃｈｅｌｌａｃｃｉら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９２３：２９１−３０１；ならびにＳａｔｏら（１９８６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：１０５７−１０５９）。
【０００４】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性を試験したほとんどの研究（Ｌｙｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７１−２７８；Ｍａｅｄａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１４４６−２１４５２；Ｍｉｌｅｖら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１４３９−２１４４２；Ｒａｐｒａｅｇｅｒ、１９８９、およびＳｃｈｍｉｄｔら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９２４２−１９２４７）は、このような酵素の一つである、のコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来、Ｙａｍａｇａｔａら（１９６８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：１５２３−１５３５）を利用した。このコンドロイチナーゼＡＢＣは、全てのコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃおよびコンドロイチン硫酸Ｂ）を分解する。コンドロイチナーゼＡＢＣは、１以上のタイプのコンンドロイチン硫酸で作用するので、この酵素を利用する、個々のタイプのコンドロイチン硫酸の生物学的な活性を決定することは、可能ではない。
【０００５】
細胞増殖における、コンドロイチン硫酸Ａプロテオグリカンまたはコンドロイチン硫酸Ｂプロテオグリカンまたはコンドロイチン硫酸Ｃプロテオグリカンの役割についての証拠としては、創傷治癒において生じるような迅速な細胞増殖の間のアップレギュレーション（ＰｅｎｃおよびＧａｌｌｏ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８１１６−２８１２１；Ｙｅｏら（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１４３７−１４５０）ならびに休止細胞でのダウンレギュレーション（Ｔａｏら（１９９７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１３５：１７１−１７９）を示すデータが挙げられる。このような研究により、細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分泌および発現と細胞増殖との間に関係が存在し得ることが示唆される。
【０００６】
創傷治癒における最近の研究により、コンドロイチン硫酸Ｂプロテオグリカンが創傷治癒の体液中に高濃度で存在し、そして創傷領域にこれらのプロテオグリカンを付加することにより、治癒を促進し得ることを見出した（ＰｅｎｃおよびＧａｌｌｏ，１９９８）。創傷治癒におけるコンドロイチン硫酸Ｂの作用機構は未知であるが、これらのプロテオグリカンが、細胞増殖に直接的または間接的に影響を与える得る可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、プロテオグリカンの改変を通じて、線維性細胞の異常な形成に関連する状態の処置のための方法および組成物を提供することは、本発明の目的である。
【０００８】
コラーゲン合成を調節するため、ＴＧＦβの産生を減少させるため、線維芽細胞の増殖もしくは遊走を減少させるため、細胞由来のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを放出させるため、および線維芽細胞状上で増殖因子結合部位を減少させるための方法および組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【０００９】
強皮症、乾癬、ケロイド、肺線維症および外科的癒着のような線維芽細胞の過剰増殖に関する障害を処置するための方法および組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
高度に精製された、特定のグリコサミノグリカン分解酵素（コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣ）は、線維増殖性疾患を処置するために使用される。コンドロイチン硫酸Ｂ、およびより重要でない範囲で、コンドロイチン硫酸ＡもしくはＣの細胞表面からの酵素学的な除去により、細胞上の増殖因子レセプターを効果的に減少させ、これにより、このような増殖因子に対して細胞増殖応答を減少させる。さらに、コンドロイチン硫酸を除去することにより、主な細胞外基質成分のひとつであるコラーゲンの分泌を減少させる。線維芽細胞の増殖阻害とコラーゲン合成阻害との組合せを介して、コンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣでの処理により、乾癬、強皮症、ケロイドおよび外科的癒着において見出された線維芽組織のサイズを減少させる。
・本発明はまた、以下を提供する：
・（項目１） 線維性組織形成を調節するための方法であって、
上記方法は、その処置の必要がある個体に対して、有効量のデルマタン硫酸分解酵素またはコンドロイチン硫酸分解酵素を投与する工程；
を包含する、方法。
・（項目２） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、細菌性のデルマタン硫酸分解酵素またはコンドロイチン硫酸分解酵素からなる群から選択され得、そしてＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ｍｉｃｒｏｃｏｓｓｕｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ｖｉｂｒｉｏ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素哺乳動物細胞由来のアリールスルファターゼＢ、哺乳動物細胞由来のＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、および哺乳動物細胞由来の+イズロネートスルファターゼからなる群より選択され得、これらの酵素は、細菌における組換えヌクレオチド配列およびそれらの組み合わせから発現され得る、方法。
・（項目３） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、哺乳動物酵素であり得る、方法。
・（項目４） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、細菌酵素であり得る、方法。
・（項目５） 項目４に記載の方法であって、上記コンドロイチナーゼは、コンドロイチナーゼBであり得る、方法。
・（項目６） 項目１に記載の方法であって、上記個体は、皮膚障害を有し得る、方法。
・（項目７） 項目１に記載の方法であって、上記皮膚障害は、強皮症または乾癬であり得る、方法。
・（項目８） 項目１に記載の方法であって、上記個体は、ケロイド瘢痕を有し得るか、またはケロイド瘢痕の危険性があり得るか、あるいは肺線維症を有し得る、方法。
・（項目９） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、全身投与され得る、方法。
・（項目１０） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、処置の必要な部位にかまたはその部位付近に、局所的または局在的に投与され得る、方法。
・（項目１１） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、制御された放出処方物および／または持続性放出処方物の形態で投与され得る、方法。
・（項目１２） 器官線維症を含む障害の処置を必要とする個体に投与するための処方物であって、上記処方物は、線維症を阻害するために有効な量のデルマタン硫酸分解酵素またはコンドロイチン硫酸分解酵素と、薬学的に受容可能なキャリアとを含み得、上記投与量は、創傷治癒のために有効な量とは異なり得る、処方物。
・（項目１３） 項目１２に記載の処方物であって、上記酵素は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｍｉｃｒｏｃｏｓｓｕｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｖｉｂｒｉｏ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素からなる群より選択され得、これらの酵素は、細菌における組換えヌクレオチド配列およびそれらの組み合わせから発現され得る、処方物。
・（項目１４） 上記酵素が、哺乳動物酵素であり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１５） 上記酵素が、細菌性コンドロイチナーゼであり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１６） 上記コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＢであり得る、項目１５に記載の処方物。
・（項目１７） 上記酵素が、制御された持続性放出処方物であり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１８） コラーゲン合成を阻害するのに有効な投与量であり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１９） 肺への送達のために有効なエアロゾル処方物の形態であり得る、項目１２に記載の処方物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣ、およびヘパラン硫酸を含むグリコサミノグリカンは、細胞表面（これらはサイトカインおよび増殖因子のためのコレセプターとして作用する）上および細胞外間隙（これらは細胞外物質の構造を形成し、組織および器官の支持および組織化構造として役立つ）に位置するプロテオグリカンの硫酸化ポリサッカリド成分である。
【００１２】
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の超精製した２つの酵素、コンドロイチナーゼＢ（この唯一の基質は、コンドロイチン硫酸Ｂである）およびコンドロイチナーゼＡＣ（この基質は、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣである）は、異なるコンドロイチン硫酸の活性間の区別、およびこれらのヒト皮膚線維芽細胞増殖への影響を直接評価することを可能にさせる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、細胞増殖を促進するという前提から始まり、今度は、コンドロイチンＢ、およびより少ない程度でコンドロイチンＡまたはＣを除去することが、細胞増殖を阻害することが実証された。
【００１３】
高度に精製されたグリコサミノグリカン分解酵素（好ましくは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来）の使用によって線維症プロセスにおける事象を阻害する方法が、実施例において実証される。
【００１４】
（酵素処方物）
（酵素）
実施例に記載されるコンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のグリコサミノグリカン分解酵素である。両方の酵素は、ｉ）細胞からのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの放出；ｉｉ）細胞上の増殖因子結合部位の減少；ｉｉｉ）線維芽細胞増殖の減少；ｉｖ）ＴＧＦβ産生の減少、およびｖ）コラーゲン合成の減少およびそれによる線維性組織形成の減少によって細胞増殖および細胞外基質合成に関連する相互作用を調節する。
【００１５】
グリコサミノグリカンは、異なる位置に硫酸基を保有する、交互にヘキソサミン残基およびヘキスロン残基からなる分枝していないポリサッカリドである。このクラスの分子は、二糖骨格の組成により３つのファミリーに分けられ得る。これらは：ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨｅｘＡ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＯ4））；コンドロイチン硫酸（ＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ）；およびケラタン硫酸（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）である。
【００１６】
代表的なグリコサミノグリカン分解酵素として、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ１、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ２、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ３、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣ、およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のヘパリナーゼ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｈｐ２０６由来のヘパリナーゼ、Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ種由来のヘパリナーゼ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｍｉｃｒｏｃｏｓｓｕｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｖｉｂｒｉｏ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、細菌中で組換えヌクレオチド配列から発現されるこれらの酵素およびこれらの組み合わせが挙げられる。グリコサミノグリカンを分解する他の酵素は、哺乳動物細胞中に存在し、へパラナーゼ、アリールスルファターゼＢ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、およびイズロネートスルファターゼを含む。
【００１７】
コンドロイチン硫酸のファミリーは、硫酸化されていないコンドロイチン硫酸、過硫酸化されたコンドロイチン硫酸、および硫酸官能基の数および位置の異なるコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅと命名された７つのサブタイプを含む。さらに、コンドロイチンＢはまた、デルマタン硫酸と言われ、代替のヘキスロン酸位置においてイズロン酸が主な残基であることが異なる。
【００１８】
コンドロイチン硫酸Ａ，ＢおよびＣは、哺乳動物に見出される主な形態であり、細胞分化、接着、酵素的経路およびホルモン相互作用を含む種々の生物学的活性の調節に関与し得る。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在は、以下により報告されるような組織損傷および血管損傷への応答における細胞増殖後期で上昇する。Ｙｅｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１４３７〜１４５０、１９９１、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＨａｔｔｏｎ、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５８：７７〜９５、１９９３、およびＦｏｒｒｅｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１７：７５８〜７６９、１９９１。コンドロイチン硫酸はまた、Ｔａｂａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８（２７）：２０４１９〜２０４３２、１９９３により記載されるように血管の疾患およびリポタンパク質取り込みの進行に関与する事象に関連付けられている。
【００１９】
コンドロイチナーゼは、以下いくつかの細菌種から単離されてきた：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ、Ａｅｒｏｍｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｕｒｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ（Ｌｉｎｈａｒｄｔら、１９８６；Ｌｉｎｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：８５９〜８６６、１９８３；Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９２３：２９１〜２０１、１９８７；およびＳａｔｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：１０５７〜１０５９、１９８６）。Ｉｂｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｒ ａｎｄ Ｄ、Ｉｎｃ．らによるＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５６０「Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｌｙａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ」は、天然に産生されるコンドロイチナーゼの精製、特にコンドロイチンＢからのコンドロイチンＡＣの分離方法、ならびに組換えコンドロイチナーゼの発現および精製方法を記載する。コンドロイチン硫酸を分解する哺乳動物の酵素として、アリールスルファターゼＢ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、およびイズロネートスルファターゼが挙げられる。
【００２０】
本明細書中で記載される方法および組成物において有用なこれらの酵素は、細胞、特に線維芽細胞表面上のプロテオグリカン、最も好ましくは、細胞増殖および／または遊走および／または遺伝子（特にコラーゲン）発現に関与するレセプターとして貢献するプロテオグリカンを切断する。
【００２１】
（処方物）
局所的な適用のために、グリコサミノグリカン分解酵素は、キャリアと合わされ、その結果、適用部位での所望の活性に基づく有効投与量が送達される。局所的な適用のために、現在は、いくつかの軟膏およびクリームが他の治療剤のために使用される；これらの任意の１つがコンドロイチナーゼＢまたはＡＣの適用のために使用され得る。局所的組成物は、例えば、乾癬のような疾患の治療のために皮膚に適用され得る。キャリアは、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、泡、エアロゾル、坐剤、パッド、またはゲル状スティックであり得る。局所的な適用のために、現在、いくつかの軟膏およびクリームが使用される；これらの任意の１つがコンドロイチナーゼＢまたはＡＣの適用のために使用され得る。局所的な組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、緩衝化生理食塩水、鉱油、植物油（例えば、コーン油またはラッカセイ油）、石油ゼリー、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）１８２、アルコール溶液、もしくはリポソームまたはリポソーム様産物）中の有効量のグリコサミノグリカン分解酵素からなる。
【００２２】
局所投与または全身投与のための組成物は、一般的に不活性の希釈物を含む。例えば、注射剤のために、コンドロイチナーゼＢまたはＡＣは、生理学的に平衡化緩衝溶液中に調製され得る。非経口、皮内、皮下、または局所適用のために使用さる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈物（例えば、注射用水、生理食塩液溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨て可能なシリンジ、ガラスまたはプラスチック製の多回用量バイアル中に封入され得る。
【００２３】
指向される内服局所適用のために、この組成物は、錠剤またはカプセル剤の形態である得、これは以下の任意の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；またはグリダント（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）。投薬単位形態がカプセルである場合、上記型の材料に加えて、脂肪油のような液体キャリアを含み得る。さらに、投薬単位形態は、投薬単位の物理的形態を改変する種々のその他の材料（例えば、糖衣、セラック、腸溶剤）を含み得る。任意のこれらの処方物はまた、グリコサミノグリカン分解酵素にも細胞にも有害な影響を与えない、保存剤、抗酸化剤、抗生物質、免疫抑制剤、および他の生物学的に有効な薬剤、または薬学的に有効な薬剤を含み得る。
【００２４】
グリコサミノグリカン分解酵素はまた、選択された部位で制御された期間にわたってグリコサミノグリカン分解酵素を放出する生体適合性の高分子移植物との組み合わせで投与され得る。好ましい生分解性の高分子の材料の例として、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸）、ポリグリコール酸、ポリエチレン酢酸ビニル、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。好ましい非生分解性高分子材料の例として、エチレン酢酸ビニルコポリマーが挙げられる。
【００２５】
（組み合わせで投与され得る他の治療剤）
グリコサミノグリカン分解酵素は、単独または他の治療剤との組み合わせで投与され得る。例えば、この酵素は、抗菌剤、サイトカインおよびケモカイン（例えば、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、Ｉ１−１、Ｉ１−６）に対する抗体、および抗炎症剤（例えば、コルチゾン）とともに投与され得る。
【００２６】
他の組み合わせは、当業者に明らかである。
【００２７】
（処置方法）
細胞の過剰増殖は、慢性疾患（例えば、乾癬、水腫性硬化症および肺性線維症）の特徴である。これらの疾患のそれぞれが、関連する器官を構成する個々の細胞型の複雑な相互作用を示す。一般論として、これらの疾患は制御されていない細胞増殖およびコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの過剰な沈着により特徴付けられる（ＬｉｕおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９９８）、Ｓｅｍ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｄ．ａｎｄ Ｓｕｒｇ．１７：３〜１１；およびＰｈａｎ，Ｓ．Ｈ．Ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｐ．Ａ．Ｗａｒｄ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３、１２１〜１６２頁）。コラーゲンは、線維性瘢痕組織の主な成分であると考えられるが、最近の研究は、硫酸化グリコサミノグリカンがこのような疾患を生じるコラーゲンの沈着および組織再構築にとって非常に重要であり得ることが示された（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎら（１９９６）、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５４：１８１９〜１８２８）。このような疾患の全てにおいてキーとなる細胞は、線維芽細胞である。線維芽細胞増殖およびマトリックスの分泌は、組織の厚さおよび密度の非常な増加の原因である。線維芽細胞は、外科手術後の接着および熱傷のような傷害後に形成するケロイドにおける過剰な瘢痕組織に主に寄与する。線維芽細胞増殖ならびにコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの分泌を制御するメカニズムは複雑である。線維芽細胞を活性化する物質として、他の細胞および線維芽細胞自体により産生されるサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子が挙げられる。このようなサイトカインの１つは、コラーゲン合成のキーとなるコントローラー、ＴＧＦβである。ＴＧＦβは線維芽細胞により分泌され、それ自身の分泌を高めるためにフィードバックされ得、線維芽細胞マトリックス産生および線維芽細胞増殖の両方を増加する。ＴＧＦβ活性は、特定のレセプターの相互作用を介して媒介され、硫酸化グリコサミノグリカンは、それらおよび他のマトリックスタンパク質と会合する（Ｓｅｇａｒｉｎｉら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３：２６１〜２７２）。
【００２８】
実施例に示されるように、グリコサミノグリカン分解酵素は、特定の適用に適切であるようにコラーゲン合成、線維芽細胞増殖または線維芽細胞遊走を調節するために効果的な投薬量で処置されるべき部位に投与され、細胞からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを放出し；細胞状の増殖因子結合部位を減少し、そしてこれにより線維性組織形成を減少する。局所、局在、皮内、または全身適用のいずれかである。
【００２９】
コンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣは、例えば、強皮症、乾癬およびケロイドの損傷に局所的に適用され得；または、例えば、ケロイドおよび外科手術の融合部へ皮下（局在的に）注射され得る。これらのコンドロイチナーゼはまた、全身的に使用され、静脈内注射または直接的な肺へのエアロゾル投与を介して肺線維症を処置し得る。
【実施例】
【００３０】
（実施例）
本発明は、以下の制限ではない実施例を参照することによりさらに理解される。
【００３１】
（実施例１：酵素基質特異性）
コンドロイチナーゼＢ（ＥＣ番号なし）およびコンドロイチナーゼＡＣ（ＥＣ４．２．２．５）は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍで発現される組換えタンパク質である（ＰＣＴ／ＵＳ／９５／０８５６０「Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｌｙａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ」）。速度論的な分光光度的アッセイ（基本的にはＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５６に記載されるように実施した）を使用して比活性および基質特異性を各酵素について決定した。これらのアッセイにおいて、酵素の濃度は、０．２５ＩＵ／ｍｌであり、基質濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ（コンドロイチン硫酸Ｂおよびコンドロイチン硫酸ＡＣ）または０．７５ｍｇ／ｍｌ（ヘパラン硫酸）であった。酵素の特異的活性は：コンドロイチナーゼＢについて９７ＩＵ／ｍｇおよびコンドロイチナーゼＡＣについて２２１ＩＵ／ｍｇであった。
【００３２】
超精製コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣの基質特異性を酵素のコンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、およびヘパラン硫酸を分解する能力を試験することにより決定した。表１に示すように、両酵素は、対応する硫酸化グリコサミノグリカンに対して活性であった（他のグリコサミノグリカンのいずれかに対しては０．２％以下の活性を有する）。これらの結果は、本願で使用される精製されたコンドロイチナーゼＢおよび精製されたコンドロイチナーゼＡＣの基質特異性を確認する。
（表１：グリコサミノグリカンに対する酵素活性の比較）
【００３３】
【表１】
【００３４】
酵素活性を各基質でのＩＵ／ｍｌとして、および各基質に対する相対的な活性として示す。相対的な活性を、好ましい基質（コンドロイチナーゼＢに対してＣＳＢ、コンドロイチナーゼＡＣ対してＣＳＡ。ＣＳＢ＝コンドロイチン硫酸Ｂ；ＣＳＡ＝コンドロイチン硫酸Ａ；ＣＳＣ＝コンドロイチン硫酸Ｃ；ＨＳ＝ヘパラン硫酸）について１００％とした後に決定した。基質濃度は５００ｍｃｇ／ｍｌ（ＣＳＢ、ＣＳＡ、ＣＳＣ）または７５０ｍｃｇ／ｍｌ（ＨＳ）であった。
【００３５】
（実施例２：グリコサミノグリカンの細胞からの除去）
細胞からの硫酸化グリコサミノグリカン除去におけるコンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣの有効性を35Ｓとともにインキュベーションすることにより標識されたグリコサミノグリカンを含有する細胞を使用して調べた。線維芽細胞を２４ウェルのプレートに６×１０4細胞／ウェルの密度で１０％血清を含有するＤＭＥＭ中にプレートした。２４時間後、培地を１０％血清および２５μＣｉ／ｍｌのＮａ235ＳＯ4を含むフィッシャー培地に替え、２．５日間インキュベーションを続けた。培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで２回リンスし、次に示されたようにコンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣで処置した。培地を除去し、放射性活性を決定した。酵素による硫酸化グリコサミノグリカンの細胞からの放出をコンドロイチナーゼ処置細胞のｃｐｍ／ウェルから非処置細胞のｃｐｍ／ウェルを差し引いて表した。
【００３６】
細胞を１．０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢに３７℃で種々の時間曝露した。図１Ａに示されるように、コンドロイチナーゼＢによる硫酸化ＧＡＧの最大放出は、１時間の酵素への曝露後に達成された。コンドロイチナーゼＢの濃度を変えて線維芽細胞を１時間処理したさらなる実験を行った。図１Ｂは、硫酸化グリコサミノグリカンの線維芽細胞からの放出はまた、使用されるコンドロイチナーゼＢの濃度に依存することを示す。
【００３７】
コンドロイチナーゼＡＣによる硫酸化ＧＡＧの放出を０．１および１．０ＩＵ／ｍｌの酵素で線維芽細胞を１または２時間処置することにより調べた。図２に示されるように、硫酸化ＧＡＧのコンドロイチナーゼＡＣによる放出は、時間および用量の両方に依存した。最大放出は、１．０ＩＵ／ｍｌの酵素で２時間処置した後に達成された。
【００３８】
（実施例３：ｂＦＧＦ結合への影響）
ヨウ素化された（ｉｏｄｉｎａｔｅｄ）ｂＦＢＦをＤｕｐｏｎｔ ＮＥＮ（比活性が１２００Ｃｉ／ｍｍｍｏｌより大きい）から得た。線維芽細胞を４８ウェルの培養皿にプレートし、コンフルーエンスまで増殖させた。結合アッセイの前に、細胞を培地または酵素で増殖アッセイについて記載したように処理した。酵素処置の次に、細胞を冷却し、結合アッセイを４℃で行った。結合緩衝液（ＤＭＥＭ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ゼラチン）中２５ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−ｂＦＧＦのみ、または結合緩衝液中に加えた２５μｇ／ｍｌの標識していないｂＦＧＦとともに細胞を１時間インキュベートした。ｂＦＧＦとのインキュベーション後、細胞を氷冷結合緩衝液で２回洗浄した。グリコサミノグリカンに結合した125Ｉ−ｂＦＧＦを洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の２Ｍ ＮａＣｌ）を使用して２回のリンスで除去した。レセプターに結合した125Ｉ−ｂＦＧＦを洗浄緩衝液（ｐＨ４．０）（ＦａｎｎｏｎおよびＮｕｇｅｎｔ（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７９４９〜１７９５６）を使用して２回洗浄することにより除去した。
【００３９】
多数の増殖因子が、細胞表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することが示されてきた。しかし、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに結合する増殖因子に関する情報はほとんどない。従って、コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣの線維芽細胞に結合するような増殖因子（ｂＦＧＦ）への効果を調べた。コンドロイチンＢ処理した細胞では、細胞表面のグリコサミノグリカンおよびレセプターの両方に結合するｂＦＧＦの量が酵素濃度の増加とともに減少した（図３）。グリコサミノグリカンに特異的な結合は、使用された最高の酵素濃度（１０ＩＵ／ｍｌ）で５１±６％（ｎ＝３）まで有意に減少した。レセプターの結合は、１．０および１０ＩＵ／ｍｌでそれぞれ３２±９％（ｎ＝３）および３１±８％（ｎ＝３）まで有意に減少した。
【００４０】
ｂＦＧＦ結合データのスキャッチャードプロット分析により、コンドロイチナーゼＢ処理した細胞上のレセプターの数が、コントロールと比較して減少することが見出され、ここで結合親和性変化はなかった（図４）。コンドロイチナーゼＢ処置した線維芽細胞は、１．８（±０．６）×１０5のレセプターを有したが、一方、処置していない線維芽細胞は、３．０（±０．８）×１０5のレセプターを有した。コンドロイチナーゼ処理した線維芽細胞における結合親和性は、コントロールにおける１６．７±２．９ｎＭと比較して１５．３±３．６ｎＭであった（ｎ＝５）。
【００４１】
コンドロイチナーゼＡＣは、線維芽細胞に結合するｂＦＧＦを阻害する効果がより少なかった。ｂＦＧＦの結合は、０．０１〜１．０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣによっては影響されなかったが、１０ＩＵ／ｍｌで有意な阻害が見出された。１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣで、ＧＡＧおよびレセプターとの特異的な結合は、それぞれ４６±２％、および５４±３％まで阻害された。
【００４２】
（実施例４：増殖に対する効果）
ヒト皮膚線維芽細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手した。細胞をＤＭＥＭ（１％抗生物質、および１０％血清を含む）中で培養した。増殖アッセイを以前に記載されたように行った（ＤｅｎｈｏｌｍおよびＰｈａｎ（１９８９）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３４：３５５−３６３）。簡潔には、細胞を１０％血清含有ＤＭＥＭ中にプレーティングし；２４時間後、培地を無血清培地と置き換え、そしてインキュベーションをさらに２４時間続けた。次いで、細胞を、無血清のＤＭＥＭ単独か、または指定された濃度の酵素を含む無血清のＤＭＥＭのいずれかを用いて、３７℃で１時間処理した。酵素処理の後、細胞をＤＭＥＭを用いて１回リンスし、次いで１０％血清含有ＤＭＥＭを加え、そして４８時間インキュベートした。ｂＦＧＦを使用する実験において、１００ｐｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含むか、または含まないＤＭＥＭ（２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む）を使用した。各々の実験についてのコントロールは：（ネガティブ）無血清培地中でインキュベートした未処理の細胞、および（ポジティブ）１０％血清含有ＤＭＥＭ中でインキュベートした未処理の細胞であった。ウェル当たりの細胞数をＣｙＱｕａｎｔアッセイ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて定量した。蛍光／ウェルを、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００ 蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定し、そして細胞数を標準曲線から計算した。ネガティブコントロールにおける細胞／ウェルの平均数は、３．０±０．３×１０4であり、ポジティブコントロールに関しては９．０±０．８×１０4であった（平均±標準誤差；ｎ＝１０）。各々の実験についてのコントロールに基づいて、データを％阻害として表し、ここで％阻害＝１−［（細胞数／ウェル 酵素処理）／（細胞数／ウェル 未処理）］×１００％である。
【００４３】
コンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣを用いた線維芽細胞の処理が、これらの細胞の増殖に対して効果を有するかどうかを決定するために、実験を行った。細胞を、０．０１〜１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで１時間予め処理した場合（図５Ａ、黒丸）、１０％胎仔ウシ血清（血清）に応答した線維芽細胞の増殖が、用量依存型で阻害された。コンドロイチナーゼＢ処理線維芽細胞についての増殖の最大阻害は、０．３〜１０ＩＵ／ｍｌで、４７〜６３％であった。線維芽細胞のコンドロイチナーゼＡＣ処理もまた、血清に対する増殖応答を、用量依存型で阻害した（図５Ｂ、黒丸）。１．０〜１０ＩＵ／ｍｌ用量のコンドロイチナーゼＡＣで、１９〜４４％の阻害がみられた。
【００４４】
結合実験により、コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣでの処理が線維芽細胞に対するｂＦＧＦ結合を減少させたことが明らかになったので、線維芽細胞増殖実験を、血清の代わりに、ｂＦＧＦを使用して、繰り返した。コンドロイチナーゼＢを用いたコンドロイチン硫酸Ｂの除去は、ｂＦＧＦに対する増殖応答を、用量依存型で阻害した（図５Ａ、白ヌキ丸）。しかしながら、ｂＦＧＦに応答する増殖の阻害は、血清に対する応答の阻害に必要であった濃度より、高濃度の酵素を必要とした。１．０ＩＵ／ｍｌより低いコンドロイチナーゼＢ濃度では、阻害は観察されず；最大阻害は、１０ＩＵ／ｍｌの濃度で、２６±４％であった。レセプターへのｂＦＧＦ結合に対するコンドロイチナーゼＢの効果と、細胞増殖に対する効果との間には、有意な相関があった（ｒ2＝０．９８７、ｐ＜０．００３）。
【００４５】
線維芽細胞のコンドロイチナーゼＡＣ処理は、ｂＦＧＦに応答する線維芽細胞の増殖に対する効果を、ほとんど有さなかった（図５Ｂ，白ヌキ丸）。ｂＦＧＦ結合と同様に、増殖の阻害を検出するためには、１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣが必要であった。
【００４６】
（実施例５：線維芽細胞におけるコラーゲン合成の阻害）
コラーゲンの合成および分泌に対するコンドロイチナーゼＢの効果を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。ヒト皮膚線維芽細胞を、９６ウェルプレートに、１×１０4細胞／ウェルの密度で、１０％血清を含む培地中にプレーティングした。３日後、培地を、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含む無血清培地に交換し、インキュベーションを２４時間以上続けた。細胞を、０〜１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで１時間処理し、次いで、無血清培地を用いて１回洗浄し、そして２５ ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−βを含むか、または含まない新しい培地（アスコルビン酸を含む）を加えた。次いで、線維芽細胞を、３７℃で７２時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、そして細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中０．０２Ｍ ＮＨ4ＯＨおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎの溶液を５分間加えることによって溶解した。残った細胞外マトリックスをＰＢＳを用いて２回洗浄した。細胞外マトリックスのコラーゲン含量を、直接ＥＬＩＳＡを使用（一次抗体として抗ヒトＩ型コラーゲンマウスモノクローナル抗体を、そして二次抗体としてホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体を用いる）してアッセイした。４５０ｎｍの吸光度をマルチウェル分光光度計で読み取ることによって、コラーゲンを定量した。ウェル当たりのコラーゲンの量は、種々の濃度のヒトＩ型コラーゲンの標準曲線より計算された。
【００４７】
図６に示したように、コンドロイチナーゼＢは、コラーゲンの分泌および細胞外マトリックスへ取りこみを阻害した。１ＩＵ／ｍｌおよび１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで処理した線維芽細胞のマトリックス中のコラーゲンの量は、未処理細胞のコラーゲン量より、有意に少なかった。この効果は、コラーゲン合成がＴＧＦβで刺激された細胞でより顕著であった。
【００４８】
（実施例６：マウス皮膚器官の培養物における線維芽細胞増殖の阻害）
Ｆｌａｋｙ ｓｋｉｎマウス（ｆｓｎ／ｆｓｎ）由来の皮膚を、これらの実験に使用した。Ｆｌａｋｙ ｓｋｉｎマウスは、ヒトの乾癬にみられる病変に良く似た皮膚病変を発症する自然突然変異体である（Ｓｕｎｄｅｒｂｅｒｇら（１９９７）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ６５：２７１−２８６）。これらのマウスの皮膚は、７週齢までに、顕著に肥厚し、そして鱗状になる。組織学的検査によって、表皮層および真皮の広範囲な肥厚が示される。真皮の増加は、線維芽細胞の異常増殖およびこれらの細胞によるコラーゲン合成の増加に起因する。真皮の肥厚を減少させる任意の薬理学的な物質は、乾癬および強皮症のような病気の処置において有用性を有し得る。
【００４９】
Ｆｌａｋｙ ｓｋｉｎの器官培養物を利用し、線維芽細胞増殖および真皮の肥厚に対するコンドロイチナーゼＢの効果を評価した。ヒト皮膚培養物に関して以前に記載されたように、培養を開始し、そして維持した（Ｖａｒａｎｉら（１９９４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：５６１−５７３）。皮膚を７〜９週齢のマウスから入手した。細菌による培養物の汚染を防ぐために、皮膚をＤＭＥＭ（５培濃度のペニシリン／ストレプトマイシンを含む）を用いて２回洗浄した。無菌条件下で皮膚を２ｍｍ2切片に切り取り、そして１切片を、１．５ｍＭカルシウムを含むケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中の０、０．１、１．０、または１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢと共に、９６ウェルディッシュの各ウェル中に置いた。これらの培養物を、１、４および６日目に培地の交換を行って、８日間維持した。
【００５０】
０、３、および７日目に、いくつかの培養物に１μＣｉの3Ｈ−チミジンを加え、そして２４時間後（１、４、および８日目）に回収した。チミジン標識した切片を使用し、チミジンの取り込みによって測定される線維芽細胞の増殖を評価した。これらの培養物を回収し、そして以下のように定量した：培地を除去し、そして皮膚切片を、氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した。氷冷５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、そして培養物を室温で３０分間インキュベートした。ＴＣＡを除去し、切片を氷冷脱イオン水中で２回洗浄し、そして氷冷９５％エタノール中で２回洗浄した。切片を室温で３時間乾燥し、次いで、ｍｇ／皮膚断片を得るために、個別に重量測定を行った。１切片当たりに取り込まれたチミジンのｃｐｍおよび各切片の重量から計算された、ｃｐｍ／ｍｇ組織を定量するために、切片をシンチレーション流体中に置き、そしてカウントした。４匹のマウスの各々について、１時点当たり最低１２切片値を使用した。各々のマウスについて、未処理皮膚（培地単独）によって取り込まれた、ｃｐｍ／ｍｇ組織をコントロールとした。酵素処理した皮膚の％阻害は、各々のマウスに対するコントロール値を使用して計算した。
【００５１】
１日目または４日目には、線維芽細胞増殖の阻害はなかった。しかしながら、皮膚切片を１および１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢを用いて８日間処理した後には、増殖の減少が観察された。図７において示されるように、細胞増殖は、１．０および１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで処理した皮膚において、それぞれ３５％および４８％阻害された。１０ＩＵ／ｍｌで処理した皮膚における効果は有意（ｐ＝０．００２のレベル）であった（ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔの群比較によって決定）。
【００５２】
皮膚に対するコンドロイチナーゼＢの効果を、染色切片においても評価した。培養を開始した日（０日目）ならびに４および８日目に、未処理の切片または酵素処理された切片を、１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、そして組織学検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。切片化された皮膚の評価は３切片／処置／マウス／時点に基づいた。各々の切片について、較正された接眼マイクロメータを使用して、角質層、表皮および真皮の厚さを測定した。同じ切片の異なる領域内で、各層の測定を３回行った。
【００５３】
組織学的評価に基づいて、角質層にも表皮にも厚さに有意な変化はなかった。しかしながら、真皮（コンドロイチナーゼＢで処理した培養物中の真皮線維芽細胞を含む皮膚層）の厚さに有意な変化があった。図８に示されるように、１．０および１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで処理した皮膚切片中の真皮の厚さは、コントロールの厚さより３６％および４０％少なかった。真皮層の厚さの減少は、線維芽細胞の数の減少を反映し、そしてトリチウム化したチミジンの取り込みによって測定されたように、細胞増殖の減少と一致している。
【００５４】
（実施例７：肺線維症のマウスモデルにおけるプロコラーゲンおよびＴＧＦβの発現の阻害）
Ｉ型コラーゲンの合成、およびコラーゲン促進サイトカイン（ＴＧＦβ）に対するコンドロイチナーゼＢの効果を、肺線維症のマウスモデルにおいて検査した。このモデルにおいて、線維症は、抗腫瘍薬物（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）（硫酸ブレオマイシン）の気管内注入によって、マウスの肺において誘導される。ブレオマイシン誘導線維症は、この疾患を有するマウスおよびヒトの両方における形態学、生化学およびｍＲＮＡの変化に関する研究によって立証されるように、ヒトの特発性肺線維症に非常に良く似ている。（Ｐｈａｎ，Ｓ．Ｈ．Ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ． 「Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」Ｐ．Ａ．Ｗａｒｄ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８３，ｐｐ１２１−１６２；Ｚｈａｎｇら、（１９９４）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１９２−２０２；ＰｈａｎおよびＫｕｎｋｅｌ（１９９２）Ｅｘｐｅｒ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．１８：２９−４３）。
【００５５】
これらの実験において使用したマウスは８週齢で約２５ｇのＣＢＡ／Ｊであった。マウスを各群当たり６匹の３処理群に分けた。各群のマウスを以下のように処理した：
【００５６】
【表２】
【００５７】
２１日目に、全てのマウスをペントバルビタールナトリウムの致死量注射によって屠殺した。肺に生理食塩水をフラッシュして血液を取り除き、そしてｍＲＮＡを抽出し、およびプロコラーゲンＩおよびＴＧＦβの発現を評価した（ＰｈａｎおよびＫｕｎｋｅｌ（１９９２；Ｅｘｐｅｒ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．１８：２９−４３）によって記載のように）。異なる処理群からのマウスの肺に含まれるｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット分析の後のフィルムからのデンシトメトリーの読み取りから定量した。ブレオマイシンに続いてコンドロイチナーゼＢで処理したマウスの肺は、プロコラーゲンＩ型およびコラーゲン合成促進サイトカイン（ＴＧＦβ）の両方について、顕著により少ないｍＲＮＡを含んでいた。これらの結果は、コンドロイチナーゼＢが、線維症の肺において大きく増加されることが示されている２つの主要なタンパク質についてのｍＲＮＡの発現の阻害において、効果的であったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来コンドロイチナーゼＢで処置した後の、線維芽細胞由来の硫酸化グリコサミノグリカンの放出の時間（図１Ａ）または用量（図１Ｂ）を関数としたグラフである。図１Ａは、示された時間（分）で、１．０ ＩＵ／ｍｌで処置した後の、35Ｓ−グリコサミノグリカンの放出を示す。図１Ｂは、１時間、示された酵素の濃度で処理した後の、35Ｓ−グリコサミノグリカンの放出を示す。データは、３連で実施した２つのこのような実験の各々から、酵素処理によって放出された35Ｓ−グリコサミノグリカンのｃｐｍ／ウェルである（酵素で処理されたｃｐｍ細胞−培地のみで処理されたｃｐｍ細胞）。培地のみで放出された平均ｃｐｍは、８，１６０±５９９であった。
【図２】図２は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣで処理した後の、線維芽細胞由来の硫酸化グリコサミノグリカンの用量依存性放出と時間のグラフである。中実バーは、１時間処理後の放出を示し、そして中空バーは、２時間処理後の放出である。データは、３連で実施した２つのこのような実験の各々から、酵素処理によって放出された35Ｓ−グリコサミノグリカンのｃｐｍ／ウェルである酵素で処理されたｃｐｍ細胞−培地のみで処理されたｃｐｍ細胞）。培地のみで放出された平均ｃｐｍは、４，０２８±５４であった。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで処理した後の、線維芽細胞グリコサミノグリカン（ＧＡＧ、図３Ａ）およびｂＧＦＧレセプター（図３Ｂ）に対する125Ｉ−ｂＦＧＦの結合のグラフである。全結合（△）、非特異的結合（○）および特異的結合（●）が示される。データは、２連で実施した５つのこのような実験の各々由来である。
【図４】図４は、培地（コントロール、●）または１．０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ（○）で処置した線維芽細胞のレセプターに結合したｂＦＧＦのスキャッチャード分析のグラフである。データは、２連で実施した５つのこのような実験の各々由来である。
【図５】図５Ａよび５Ｂは、１０％のウシ胎児血清（血清）（●）または１００ｐｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（○）に応答する、線維芽細胞増殖での、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ（図５Ａ）およびコンドロイチナーゼＡＣ（図５Ｂ）の用量依存効果のグラフである。データは、コンドロイチナーゼＢで処理した細胞を培地のみで処置した細胞と比較した増殖の阻害％である。各点は、３連で実施した４つの実験の平均±ｓｅｍである。
【図６】図６は、２５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの非存在（クロスハッチ）または存在（黒）における、０〜１０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで処理した線維芽細胞の細胞外基質のコラーゲン含有量のグラフである。
【図７】図７は、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで８日処理した、マウス皮膚培地中での細胞増殖の阻害のグラフである。増殖を、２４時間の曝露後に、皮膚部分に３Ｈ−チミジンを取り込みによって評価した。データは、コントロール（酵素なし）と比較した場合、阻害％として表現される。各バーは、３匹のマウスから採取された、３６の皮膚部分の平均±ｓｅｍを示す。この＊は、阻害は、ｐ＜０．０５で実質的に有意であったことを示す。
【図８】図８は、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで８日間処置したマウスの皮膚培地中での、皮膚厚の減少のグラフである。データは、コントロール（酵素なし）と比較した減少％として表現される。各バーは、３匹のマウスの１８皮膚部分から取った測定値の平均±ｓｅｍを表す。この＊は、阻害（厚さの減少）は、ｐ＜０．０５で実質的に有意であったことを示す。
【図９】図９ａおよび９ｂは、コンドロイチナーゼＢで処理したマウスの肺における、プロコラーゲンＩ（図９ａ）およびＴＧＦβ（図９ｂ）に対する、ｍＲＮＡの発現の阻害のグラフである。処置グラフは、気管および／または腹腔それぞれに注射された経路および物質を示す。ＣｈＢは、１回注射当たり２５ＩＵの酵素であり；ＢＬＭは、ブレオマイシン硫酸の０．０２５ユニットの１回注射であり；そしてＳＡＬは、等しい体積の生理食塩水の注射を示す。データは、ノーザンブロットフィルムの濃度測定の読み取りによって決定されるような、一体化ユニット（×１０3）として表現される。各バーは、６匹のマウスの平均±ｓｅｍを示す。この＊は、ｍＲＮＡ発現の減少は、マウスに与えられたＢＬＭ／ＳＡＬにおいて見出される減少よりも有意に少ないことを示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、線維性組織の形成を阻害するための、コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣ、グリコサミドグリカン分解酵素を使用する方法および組成物である。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上および細胞外基質中のプロテオグリカンは、可変性のグリコサミノグリカン鎖を含み、これは、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣを含む。いくつかのプロテオグリカンは、１つのタイプのグリコサミノグリカンのみを含むが、他は、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の混合物を含む（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７１：４８１−５３０、１９９１）。細胞外プロテオグリカンは、細胞および組織のための骨格構造を形成し、そして細胞関連プロテオグリカンと共に、細胞接着、細胞遊走、および細胞増殖を制御する際の主な機能を有する。プロテオグリカンおよびそれらの成分の一部の機能は、細胞代謝におけるヘパリン硫酸およびヘパラン硫酸の役割にかなりの重点を置いて、総括的に研究されている（Ｋｊｅｌｌｅｎ，Ｌ．およびＬｉｎｄａｈｌ，Ｕ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：４４３−４７５；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら（１９９５）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７４：５３４−５４０；Ｙａｙｏｎｒａ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：８４１−８４８）。コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを含む、プロテオグリカンの生物学的活性、および特に、細胞増殖でのそれらの効果について、ほとんど知られていない。
【０００３】
グリコサミノグリカン合成の２種のインヒビター（クロレートおよびβ−キシロシド（β−ｘｙｌｏｓｉｄｅ））を、細胞周期の制御に対するヘパランとコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとの相対的な寄与を試験するために使用した（Ｋｅｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：８１００−８１０７；Ｍｉａｏら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：７１３−１８４；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｎ．Ｂ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６３１６−６３２１）。しかし、これらの化合物の両方は、硫酸化グリコサミノグリカンの全タイプの発現を阻害する。現在、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣの合成または発現を選択的に遮断し得るインヒビターは存在しない。しかし、細胞由来のヘパリン硫酸またはコンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣのいずれかを除去し得る、特定のグリコサミノグリカンリアーゼが、利用可能である。コンドロイチナーゼは、以下の種々の細菌種から単離された：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｕｒｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ（Ｌｉｎｈａｒｄｔら（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１３５−１７５；Ｌｉｎｎら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：８５９−８６６；Ｍｉｃｈｅｌｌａｃｃｉら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９２３：２９１−３０１；ならびにＳａｔｏら（１９８６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：１０５７−１０５９）。
【０００４】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性を試験したほとんどの研究（Ｌｙｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７１−２７８；Ｍａｅｄａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１４４６−２１４５２；Ｍｉｌｅｖら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１４３９−２１４４２；Ｒａｐｒａｅｇｅｒ、１９８９、およびＳｃｈｍｉｄｔら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９２４２−１９２４７）は、このような酵素の一つである、のコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来、Ｙａｍａｇａｔａら（１９６８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：１５２３−１５３５）を利用した。このコンドロイチナーゼＡＢＣは、全てのコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃおよびコンドロイチン硫酸Ｂ）を分解する。コンドロイチナーゼＡＢＣは、１以上のタイプのコンンドロイチン硫酸で作用するので、この酵素を利用する、個々のタイプのコンドロイチン硫酸の生物学的な活性を決定することは、可能ではない。
【０００５】
細胞増殖における、コンドロイチン硫酸Ａプロテオグリカンまたはコンドロイチン硫酸Ｂプロテオグリカンまたはコンドロイチン硫酸Ｃプロテオグリカンの役割についての証拠としては、創傷治癒において生じるような迅速な細胞増殖の間のアップレギュレーション（ＰｅｎｃおよびＧａｌｌｏ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８１１６−２８１２１；Ｙｅｏら（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１４３７−１４５０）ならびに休止細胞でのダウンレギュレーション（Ｔａｏら（１９９７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１３５：１７１−１７９）を示すデータが挙げられる。このような研究により、細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分泌および発現と細胞増殖との間に関係が存在し得ることが示唆される。
【０００６】
創傷治癒における最近の研究により、コンドロイチン硫酸Ｂプロテオグリカンが創傷治癒の体液中に高濃度で存在し、そして創傷領域にこれらのプロテオグリカンを付加することにより、治癒を促進し得ることを見出した（ＰｅｎｃおよびＧａｌｌｏ，１９９８）。創傷治癒におけるコンドロイチン硫酸Ｂの作用機構は未知であるが、これらのプロテオグリカンが、細胞増殖に直接的または間接的に影響を与える得る可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、プロテオグリカンの改変を通じて、線維性細胞の異常な形成に関連する状態の処置のための方法および組成物を提供することは、本発明の目的である。
【０００８】
コラーゲン合成を調節するため、ＴＧＦβの産生を減少させるため、線維芽細胞の増殖もしくは遊走を減少させるため、細胞由来のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを放出させるため、および線維芽細胞状上で増殖因子結合部位を減少させるための方法および組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【０００９】
強皮症、乾癬、ケロイド、肺線維症および外科的癒着のような線維芽細胞の過剰増殖に関する障害を処置するための方法および組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
高度に精製された、特定のグリコサミノグリカン分解酵素（コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣ）は、線維増殖性疾患を処置するために使用される。コンドロイチン硫酸Ｂ、およびより重要でない範囲で、コンドロイチン硫酸ＡもしくはＣの細胞表面からの酵素学的な除去により、細胞上の増殖因子レセプターを効果的に減少させ、これにより、このような増殖因子に対して細胞増殖応答を減少させる。さらに、コンドロイチン硫酸を除去することにより、主な細胞外基質成分のひとつであるコラーゲンの分泌を減少させる。線維芽細胞の増殖阻害とコラーゲン合成阻害との組合せを介して、コンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣでの処理により、乾癬、強皮症、ケロイドおよび外科的癒着において見出された線維芽組織のサイズを減少させる。
・本発明はまた、以下を提供する：
・（項目１） 線維性組織形成を調節するための方法であって、
上記方法は、その処置の必要がある個体に対して、有効量のデルマタン硫酸分解酵素またはコンドロイチン硫酸分解酵素を投与する工程；
を包含する、方法。
・（項目２） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、細菌性のデルマタン硫酸分解酵素またはコンドロイチン硫酸分解酵素からなる群から選択され得、そしてＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ｍｉｃｒｏｃｏｓｓｕｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ｖｉｂｒｉｏ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素哺乳動物細胞由来のアリールスルファターゼＢ、哺乳動物細胞由来のＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、および哺乳動物細胞由来の+イズロネートスルファターゼからなる群より選択され得、これらの酵素は、細菌における組換えヌクレオチド配列およびそれらの組み合わせから発現され得る、方法。
・（項目３） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、哺乳動物酵素であり得る、方法。
・（項目４） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、細菌酵素であり得る、方法。
・（項目５） 項目４に記載の方法であって、上記コンドロイチナーゼは、コンドロイチナーゼBであり得る、方法。
・（項目６） 項目１に記載の方法であって、上記個体は、皮膚障害を有し得る、方法。
・（項目７） 項目１に記載の方法であって、上記皮膚障害は、強皮症または乾癬であり得る、方法。
・（項目８） 項目１に記載の方法であって、上記個体は、ケロイド瘢痕を有し得るか、またはケロイド瘢痕の危険性があり得るか、あるいは肺線維症を有し得る、方法。
・（項目９） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、全身投与され得る、方法。
・（項目１０） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、処置の必要な部位にかまたはその部位付近に、局所的または局在的に投与され得る、方法。
・（項目１１） 項目１に記載の方法であって、上記酵素は、制御された放出処方物および／または持続性放出処方物の形態で投与され得る、方法。
・（項目１２） 器官線維症を含む障害の処置を必要とする個体に投与するための処方物であって、上記処方物は、線維症を阻害するために有効な量のデルマタン硫酸分解酵素またはコンドロイチン硫酸分解酵素と、薬学的に受容可能なキャリアとを含み得、上記投与量は、創傷治癒のために有効な量とは異なり得る、処方物。
・（項目１３） 項目１２に記載の処方物であって、上記酵素は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｍｉｃｒｏｃｏｓｓｕｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｖｉｂｒｉｏ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素からなる群より選択され得、これらの酵素は、細菌における組換えヌクレオチド配列およびそれらの組み合わせから発現され得る、処方物。
・（項目１４） 上記酵素が、哺乳動物酵素であり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１５） 上記酵素が、細菌性コンドロイチナーゼであり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１６） 上記コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＢであり得る、項目１５に記載の処方物。
・（項目１７） 上記酵素が、制御された持続性放出処方物であり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１８） コラーゲン合成を阻害するのに有効な投与量であり得る、項目１２に記載の処方物。
・（項目１９） 肺への送達のために有効なエアロゾル処方物の形態であり得る、項目１２に記載の処方物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣ、およびヘパラン硫酸を含むグリコサミノグリカンは、細胞表面（これらはサイトカインおよび増殖因子のためのコレセプターとして作用する）上および細胞外間隙（これらは細胞外物質の構造を形成し、組織および器官の支持および組織化構造として役立つ）に位置するプロテオグリカンの硫酸化ポリサッカリド成分である。
【００１２】
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の超精製した２つの酵素、コンドロイチナーゼＢ（この唯一の基質は、コンドロイチン硫酸Ｂである）およびコンドロイチナーゼＡＣ（この基質は、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣである）は、異なるコンドロイチン硫酸の活性間の区別、およびこれらのヒト皮膚線維芽細胞増殖への影響を直接評価することを可能にさせる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、細胞増殖を促進するという前提から始まり、今度は、コンドロイチンＢ、およびより少ない程度でコンドロイチンＡまたはＣを除去することが、細胞増殖を阻害することが実証された。
【００１３】
高度に精製されたグリコサミノグリカン分解酵素（好ましくは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来）の使用によって線維症プロセスにおける事象を阻害する方法が、実施例において実証される。
【００１４】
（酵素処方物）
（酵素）
実施例に記載されるコンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のグリコサミノグリカン分解酵素である。両方の酵素は、ｉ）細胞からのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの放出；ｉｉ）細胞上の増殖因子結合部位の減少；ｉｉｉ）線維芽細胞増殖の減少；ｉｖ）ＴＧＦβ産生の減少、およびｖ）コラーゲン合成の減少およびそれによる線維性組織形成の減少によって細胞増殖および細胞外基質合成に関連する相互作用を調節する。
【００１５】
グリコサミノグリカンは、異なる位置に硫酸基を保有する、交互にヘキソサミン残基およびヘキスロン残基からなる分枝していないポリサッカリドである。このクラスの分子は、二糖骨格の組成により３つのファミリーに分けられ得る。これらは：ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨｅｘＡ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＯ4））；コンドロイチン硫酸（ＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ）；およびケラタン硫酸（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）である。
【００１６】
代表的なグリコサミノグリカン分解酵素として、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ１、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ２、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ３、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣ、およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のヘパリナーゼ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｈｐ２０６由来のヘパリナーゼ、Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ種由来のヘパリナーゼ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｍｉｃｒｏｃｏｓｓｕｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ｖｉｂｒｉｏ種由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチン硫酸分解酵素、細菌中で組換えヌクレオチド配列から発現されるこれらの酵素およびこれらの組み合わせが挙げられる。グリコサミノグリカンを分解する他の酵素は、哺乳動物細胞中に存在し、へパラナーゼ、アリールスルファターゼＢ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、およびイズロネートスルファターゼを含む。
【００１７】
コンドロイチン硫酸のファミリーは、硫酸化されていないコンドロイチン硫酸、過硫酸化されたコンドロイチン硫酸、および硫酸官能基の数および位置の異なるコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅと命名された７つのサブタイプを含む。さらに、コンドロイチンＢはまた、デルマタン硫酸と言われ、代替のヘキスロン酸位置においてイズロン酸が主な残基であることが異なる。
【００１８】
コンドロイチン硫酸Ａ，ＢおよびＣは、哺乳動物に見出される主な形態であり、細胞分化、接着、酵素的経路およびホルモン相互作用を含む種々の生物学的活性の調節に関与し得る。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在は、以下により報告されるような組織損傷および血管損傷への応答における細胞増殖後期で上昇する。Ｙｅｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１４３７〜１４５０、１９９１、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＨａｔｔｏｎ、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５８：７７〜９５、１９９３、およびＦｏｒｒｅｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１７：７５８〜７６９、１９９１。コンドロイチン硫酸はまた、Ｔａｂａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８（２７）：２０４１９〜２０４３２、１９９３により記載されるように血管の疾患およびリポタンパク質取り込みの進行に関与する事象に関連付けられている。
【００１９】
コンドロイチナーゼは、以下いくつかの細菌種から単離されてきた：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ、Ａｅｒｏｍｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｕｒｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ（Ｌｉｎｈａｒｄｔら、１９８６；Ｌｉｎｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：８５９〜８６６、１９８３；Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９２３：２９１〜２０１、１９８７；およびＳａｔｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：１０５７〜１０５９、１９８６）。Ｉｂｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｒ ａｎｄ Ｄ、Ｉｎｃ．らによるＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５６０「Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｌｙａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ」は、天然に産生されるコンドロイチナーゼの精製、特にコンドロイチンＢからのコンドロイチンＡＣの分離方法、ならびに組換えコンドロイチナーゼの発現および精製方法を記載する。コンドロイチン硫酸を分解する哺乳動物の酵素として、アリールスルファターゼＢ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、およびイズロネートスルファターゼが挙げられる。
【００２０】
本明細書中で記載される方法および組成物において有用なこれらの酵素は、細胞、特に線維芽細胞表面上のプロテオグリカン、最も好ましくは、細胞増殖および／または遊走および／または遺伝子（特にコラーゲン）発現に関与するレセプターとして貢献するプロテオグリカンを切断する。
【００２１】
（処方物）
局所的な適用のために、グリコサミノグリカン分解酵素は、キャリアと合わされ、その結果、適用部位での所望の活性に基づく有効投与量が送達される。局所的な適用のために、現在は、いくつかの軟膏およびクリームが他の治療剤のために使用される；これらの任意の１つがコンドロイチナーゼＢまたはＡＣの適用のために使用され得る。局所的組成物は、例えば、乾癬のような疾患の治療のために皮膚に適用され得る。キャリアは、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、泡、エアロゾル、坐剤、パッド、またはゲル状スティックであり得る。局所的な適用のために、現在、いくつかの軟膏およびクリームが使用される；これらの任意の１つがコンドロイチナーゼＢまたはＡＣの適用のために使用され得る。局所的な組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、緩衝化生理食塩水、鉱油、植物油（例えば、コーン油またはラッカセイ油）、石油ゼリー、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）１８２、アルコール溶液、もしくはリポソームまたはリポソーム様産物）中の有効量のグリコサミノグリカン分解酵素からなる。
【００２２】
局所投与または全身投与のための組成物は、一般的に不活性の希釈物を含む。例えば、注射剤のために、コンドロイチナーゼＢまたはＡＣは、生理学的に平衡化緩衝溶液中に調製され得る。非経口、皮内、皮下、または局所適用のために使用さる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈物（例えば、注射用水、生理食塩液溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨て可能なシリンジ、ガラスまたはプラスチック製の多回用量バイアル中に封入され得る。
【００２３】
指向される内服局所適用のために、この組成物は、錠剤またはカプセル剤の形態である得、これは以下の任意の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；またはグリダント（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）。投薬単位形態がカプセルである場合、上記型の材料に加えて、脂肪油のような液体キャリアを含み得る。さらに、投薬単位形態は、投薬単位の物理的形態を改変する種々のその他の材料（例えば、糖衣、セラック、腸溶剤）を含み得る。任意のこれらの処方物はまた、グリコサミノグリカン分解酵素にも細胞にも有害な影響を与えない、保存剤、抗酸化剤、抗生物質、免疫抑制剤、および他の生物学的に有効な薬剤、または薬学的に有効な薬剤を含み得る。
【００２４】
グリコサミノグリカン分解酵素はまた、選択された部位で制御された期間にわたってグリコサミノグリカン分解酵素を放出する生体適合性の高分子移植物との組み合わせで投与され得る。好ましい生分解性の高分子の材料の例として、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸）、ポリグリコール酸、ポリエチレン酢酸ビニル、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。好ましい非生分解性高分子材料の例として、エチレン酢酸ビニルコポリマーが挙げられる。
【００２５】
（組み合わせで投与され得る他の治療剤）
グリコサミノグリカン分解酵素は、単独または他の治療剤との組み合わせで投与され得る。例えば、この酵素は、抗菌剤、サイトカインおよびケモカイン（例えば、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、Ｉ１−１、Ｉ１−６）に対する抗体、および抗炎症剤（例えば、コルチゾン）とともに投与され得る。
【００２６】
他の組み合わせは、当業者に明らかである。
【００２７】
（処置方法）
細胞の過剰増殖は、慢性疾患（例えば、乾癬、水腫性硬化症および肺性線維症）の特徴である。これらの疾患のそれぞれが、関連する器官を構成する個々の細胞型の複雑な相互作用を示す。一般論として、これらの疾患は制御されていない細胞増殖およびコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの過剰な沈着により特徴付けられる（ＬｉｕおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９９８）、Ｓｅｍ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｄ．ａｎｄ Ｓｕｒｇ．１７：３〜１１；およびＰｈａｎ，Ｓ．Ｈ．Ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｐ．Ａ．Ｗａｒｄ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３、１２１〜１６２頁）。コラーゲンは、線維性瘢痕組織の主な成分であると考えられるが、最近の研究は、硫酸化グリコサミノグリカンがこのような疾患を生じるコラーゲンの沈着および組織再構築にとって非常に重要であり得ることが示された（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎら（１９９６）、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５４：１８１９〜１８２８）。このような疾患の全てにおいてキーとなる細胞は、線維芽細胞である。線維芽細胞増殖およびマトリックスの分泌は、組織の厚さおよび密度の非常な増加の原因である。線維芽細胞は、外科手術後の接着および熱傷のような傷害後に形成するケロイドにおける過剰な瘢痕組織に主に寄与する。線維芽細胞増殖ならびにコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの分泌を制御するメカニズムは複雑である。線維芽細胞を活性化する物質として、他の細胞および線維芽細胞自体により産生されるサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子が挙げられる。このようなサイトカインの１つは、コラーゲン合成のキーとなるコントローラー、ＴＧＦβである。ＴＧＦβは線維芽細胞により分泌され、それ自身の分泌を高めるためにフィードバックされ得、線維芽細胞マトリックス産生および線維芽細胞増殖の両方を増加する。ＴＧＦβ活性は、特定のレセプターの相互作用を介して媒介され、硫酸化グリコサミノグリカンは、それらおよび他のマトリックスタンパク質と会合する（Ｓｅｇａｒｉｎｉら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３：２６１〜２７２）。
【００２８】
実施例に示されるように、グリコサミノグリカン分解酵素は、特定の適用に適切であるようにコラーゲン合成、線維芽細胞増殖または線維芽細胞遊走を調節するために効果的な投薬量で処置されるべき部位に投与され、細胞からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを放出し；細胞状の増殖因子結合部位を減少し、そしてこれにより線維性組織形成を減少する。局所、局在、皮内、または全身適用のいずれかである。
【００２９】
コンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣは、例えば、強皮症、乾癬およびケロイドの損傷に局所的に適用され得；または、例えば、ケロイドおよび外科手術の融合部へ皮下（局在的に）注射され得る。これらのコンドロイチナーゼはまた、全身的に使用され、静脈内注射または直接的な肺へのエアロゾル投与を介して肺線維症を処置し得る。
【実施例】
【００３０】
（実施例）
本発明は、以下の制限ではない実施例を参照することによりさらに理解される。
【００３１】
（実施例１：酵素基質特異性）
コンドロイチナーゼＢ（ＥＣ番号なし）およびコンドロイチナーゼＡＣ（ＥＣ４．２．２．５）は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍで発現される組換えタンパク質である（ＰＣＴ／ＵＳ／９５／０８５６０「Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｌｙａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ」）。速度論的な分光光度的アッセイ（基本的にはＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５６に記載されるように実施した）を使用して比活性および基質特異性を各酵素について決定した。これらのアッセイにおいて、酵素の濃度は、０．２５ＩＵ／ｍｌであり、基質濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ（コンドロイチン硫酸Ｂおよびコンドロイチン硫酸ＡＣ）または０．７５ｍｇ／ｍｌ（ヘパラン硫酸）であった。酵素の特異的活性は：コンドロイチナーゼＢについて９７ＩＵ／ｍｇおよびコンドロイチナーゼＡＣについて２２１ＩＵ／ｍｇであった。
【００３２】
超精製コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣの基質特異性を酵素のコンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、およびヘパラン硫酸を分解する能力を試験することにより決定した。表１に示すように、両酵素は、対応する硫酸化グリコサミノグリカンに対して活性であった（他のグリコサミノグリカンのいずれかに対しては０．２％以下の活性を有する）。これらの結果は、本願で使用される精製されたコンドロイチナーゼＢおよび精製されたコンドロイチナーゼＡＣの基質特異性を確認する。
（表１：グリコサミノグリカンに対する酵素活性の比較）
【００３３】
【表１】
【００３４】
酵素活性を各基質でのＩＵ／ｍｌとして、および各基質に対する相対的な活性として示す。相対的な活性を、好ましい基質（コンドロイチナーゼＢに対してＣＳＢ、コンドロイチナーゼＡＣ対してＣＳＡ。ＣＳＢ＝コンドロイチン硫酸Ｂ；ＣＳＡ＝コンドロイチン硫酸Ａ；ＣＳＣ＝コンドロイチン硫酸Ｃ；ＨＳ＝ヘパラン硫酸）について１００％とした後に決定した。基質濃度は５００ｍｃｇ／ｍｌ（ＣＳＢ、ＣＳＡ、ＣＳＣ）または７５０ｍｃｇ／ｍｌ（ＨＳ）であった。
【００３５】
（実施例２：グリコサミノグリカンの細胞からの除去）
細胞からの硫酸化グリコサミノグリカン除去におけるコンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣの有効性を35Ｓとともにインキュベーションすることにより標識されたグリコサミノグリカンを含有する細胞を使用して調べた。線維芽細胞を２４ウェルのプレートに６×１０4細胞／ウェルの密度で１０％血清を含有するＤＭＥＭ中にプレートした。２４時間後、培地を１０％血清および２５μＣｉ／ｍｌのＮａ235ＳＯ4を含むフィッシャー培地に替え、２．５日間インキュベーションを続けた。培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで２回リンスし、次に示されたようにコンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣで処置した。培地を除去し、放射性活性を決定した。酵素による硫酸化グリコサミノグリカンの細胞からの放出をコンドロイチナーゼ処置細胞のｃｐｍ／ウェルから非処置細胞のｃｐｍ／ウェルを差し引いて表した。
【００３６】
細胞を１．０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢに３７℃で種々の時間曝露した。図１Ａに示されるように、コンドロイチナーゼＢによる硫酸化ＧＡＧの最大放出は、１時間の酵素への曝露後に達成された。コンドロイチナーゼＢの濃度を変えて線維芽細胞を１時間処理したさらなる実験を行った。図１Ｂは、硫酸化グリコサミノグリカンの線維芽細胞からの放出はまた、使用されるコンドロイチナーゼＢの濃度に依存することを示す。
【００３７】
コンドロイチナーゼＡＣによる硫酸化ＧＡＧの放出を０．１および１．０ＩＵ／ｍｌの酵素で線維芽細胞を１または２時間処置することにより調べた。図２に示されるように、硫酸化ＧＡＧのコンドロイチナーゼＡＣによる放出は、時間および用量の両方に依存した。最大放出は、１．０ＩＵ／ｍｌの酵素で２時間処置した後に達成された。
【００３８】
（実施例３：ｂＦＧＦ結合への影響）
ヨウ素化された（ｉｏｄｉｎａｔｅｄ）ｂＦＢＦをＤｕｐｏｎｔ ＮＥＮ（比活性が１２００Ｃｉ／ｍｍｍｏｌより大きい）から得た。線維芽細胞を４８ウェルの培養皿にプレートし、コンフルーエンスまで増殖させた。結合アッセイの前に、細胞を培地または酵素で増殖アッセイについて記載したように処理した。酵素処置の次に、細胞を冷却し、結合アッセイを４℃で行った。結合緩衝液（ＤＭＥＭ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ゼラチン）中２５ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−ｂＦＧＦのみ、または結合緩衝液中に加えた２５μｇ／ｍｌの標識していないｂＦＧＦとともに細胞を１時間インキュベートした。ｂＦＧＦとのインキュベーション後、細胞を氷冷結合緩衝液で２回洗浄した。グリコサミノグリカンに結合した125Ｉ−ｂＦＧＦを洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の２Ｍ ＮａＣｌ）を使用して２回のリンスで除去した。レセプターに結合した125Ｉ−ｂＦＧＦを洗浄緩衝液（ｐＨ４．０）（ＦａｎｎｏｎおよびＮｕｇｅｎｔ（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７９４９〜１７９５６）を使用して２回洗浄することにより除去した。
【００３９】
多数の増殖因子が、細胞表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することが示されてきた。しかし、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに結合する増殖因子に関する情報はほとんどない。従って、コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣの線維芽細胞に結合するような増殖因子（ｂＦＧＦ）への効果を調べた。コンドロイチンＢ処理した細胞では、細胞表面のグリコサミノグリカンおよびレセプターの両方に結合するｂＦＧＦの量が酵素濃度の増加とともに減少した（図３）。グリコサミノグリカンに特異的な結合は、使用された最高の酵素濃度（１０ＩＵ／ｍｌ）で５１±６％（ｎ＝３）まで有意に減少した。レセプターの結合は、１．０および１０ＩＵ／ｍｌでそれぞれ３２±９％（ｎ＝３）および３１±８％（ｎ＝３）まで有意に減少した。
【００４０】
ｂＦＧＦ結合データのスキャッチャードプロット分析により、コンドロイチナーゼＢ処理した細胞上のレセプターの数が、コントロールと比較して減少することが見出され、ここで結合親和性変化はなかった（図４）。コンドロイチナーゼＢ処置した線維芽細胞は、１．８（±０．６）×１０5のレセプターを有したが、一方、処置していない線維芽細胞は、３．０（±０．８）×１０5のレセプターを有した。コンドロイチナーゼ処理した線維芽細胞における結合親和性は、コントロールにおける１６．７±２．９ｎＭと比較して１５．３±３．６ｎＭであった（ｎ＝５）。
【００４１】
コンドロイチナーゼＡＣは、線維芽細胞に結合するｂＦＧＦを阻害する効果がより少なかった。ｂＦＧＦの結合は、０．０１〜１．０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣによっては影響されなかったが、１０ＩＵ／ｍｌで有意な阻害が見出された。１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣで、ＧＡＧおよびレセプターとの特異的な結合は、それぞれ４６±２％、および５４±３％まで阻害された。
【００４２】
（実施例４：増殖に対する効果）
ヒト皮膚線維芽細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手した。細胞をＤＭＥＭ（１％抗生物質、および１０％血清を含む）中で培養した。増殖アッセイを以前に記載されたように行った（ＤｅｎｈｏｌｍおよびＰｈａｎ（１９８９）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３４：３５５−３６３）。簡潔には、細胞を１０％血清含有ＤＭＥＭ中にプレーティングし；２４時間後、培地を無血清培地と置き換え、そしてインキュベーションをさらに２４時間続けた。次いで、細胞を、無血清のＤＭＥＭ単独か、または指定された濃度の酵素を含む無血清のＤＭＥＭのいずれかを用いて、３７℃で１時間処理した。酵素処理の後、細胞をＤＭＥＭを用いて１回リンスし、次いで１０％血清含有ＤＭＥＭを加え、そして４８時間インキュベートした。ｂＦＧＦを使用する実験において、１００ｐｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含むか、または含まないＤＭＥＭ（２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む）を使用した。各々の実験についてのコントロールは：（ネガティブ）無血清培地中でインキュベートした未処理の細胞、および（ポジティブ）１０％血清含有ＤＭＥＭ中でインキュベートした未処理の細胞であった。ウェル当たりの細胞数をＣｙＱｕａｎｔアッセイ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて定量した。蛍光／ウェルを、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００ 蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定し、そして細胞数を標準曲線から計算した。ネガティブコントロールにおける細胞／ウェルの平均数は、３．０±０．３×１０4であり、ポジティブコントロールに関しては９．０±０．８×１０4であった（平均±標準誤差；ｎ＝１０）。各々の実験についてのコントロールに基づいて、データを％阻害として表し、ここで％阻害＝１−［（細胞数／ウェル 酵素処理）／（細胞数／ウェル 未処理）］×１００％である。
【００４３】
コンドロイチナーゼＢまたはコンドロイチナーゼＡＣを用いた線維芽細胞の処理が、これらの細胞の増殖に対して効果を有するかどうかを決定するために、実験を行った。細胞を、０．０１〜１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで１時間予め処理した場合（図５Ａ、黒丸）、１０％胎仔ウシ血清（血清）に応答した線維芽細胞の増殖が、用量依存型で阻害された。コンドロイチナーゼＢ処理線維芽細胞についての増殖の最大阻害は、０．３〜１０ＩＵ／ｍｌで、４７〜６３％であった。線維芽細胞のコンドロイチナーゼＡＣ処理もまた、血清に対する増殖応答を、用量依存型で阻害した（図５Ｂ、黒丸）。１．０〜１０ＩＵ／ｍｌ用量のコンドロイチナーゼＡＣで、１９〜４４％の阻害がみられた。
【００４４】
結合実験により、コンドロイチナーゼＢおよびコンドロイチナーゼＡＣでの処理が線維芽細胞に対するｂＦＧＦ結合を減少させたことが明らかになったので、線維芽細胞増殖実験を、血清の代わりに、ｂＦＧＦを使用して、繰り返した。コンドロイチナーゼＢを用いたコンドロイチン硫酸Ｂの除去は、ｂＦＧＦに対する増殖応答を、用量依存型で阻害した（図５Ａ、白ヌキ丸）。しかしながら、ｂＦＧＦに応答する増殖の阻害は、血清に対する応答の阻害に必要であった濃度より、高濃度の酵素を必要とした。１．０ＩＵ／ｍｌより低いコンドロイチナーゼＢ濃度では、阻害は観察されず；最大阻害は、１０ＩＵ／ｍｌの濃度で、２６±４％であった。レセプターへのｂＦＧＦ結合に対するコンドロイチナーゼＢの効果と、細胞増殖に対する効果との間には、有意な相関があった（ｒ2＝０．９８７、ｐ＜０．００３）。
【００４５】
線維芽細胞のコンドロイチナーゼＡＣ処理は、ｂＦＧＦに応答する線維芽細胞の増殖に対する効果を、ほとんど有さなかった（図５Ｂ，白ヌキ丸）。ｂＦＧＦ結合と同様に、増殖の阻害を検出するためには、１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣが必要であった。
【００４６】
（実施例５：線維芽細胞におけるコラーゲン合成の阻害）
コラーゲンの合成および分泌に対するコンドロイチナーゼＢの効果を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。ヒト皮膚線維芽細胞を、９６ウェルプレートに、１×１０4細胞／ウェルの密度で、１０％血清を含む培地中にプレーティングした。３日後、培地を、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含む無血清培地に交換し、インキュベーションを２４時間以上続けた。細胞を、０〜１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで１時間処理し、次いで、無血清培地を用いて１回洗浄し、そして２５ ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−βを含むか、または含まない新しい培地（アスコルビン酸を含む）を加えた。次いで、線維芽細胞を、３７℃で７２時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、そして細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中０．０２Ｍ ＮＨ4ＯＨおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎの溶液を５分間加えることによって溶解した。残った細胞外マトリックスをＰＢＳを用いて２回洗浄した。細胞外マトリックスのコラーゲン含量を、直接ＥＬＩＳＡを使用（一次抗体として抗ヒトＩ型コラーゲンマウスモノクローナル抗体を、そして二次抗体としてホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体を用いる）してアッセイした。４５０ｎｍの吸光度をマルチウェル分光光度計で読み取ることによって、コラーゲンを定量した。ウェル当たりのコラーゲンの量は、種々の濃度のヒトＩ型コラーゲンの標準曲線より計算された。
【００４７】
図６に示したように、コンドロイチナーゼＢは、コラーゲンの分泌および細胞外マトリックスへ取りこみを阻害した。１ＩＵ／ｍｌおよび１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで処理した線維芽細胞のマトリックス中のコラーゲンの量は、未処理細胞のコラーゲン量より、有意に少なかった。この効果は、コラーゲン合成がＴＧＦβで刺激された細胞でより顕著であった。
【００４８】
（実施例６：マウス皮膚器官の培養物における線維芽細胞増殖の阻害）
Ｆｌａｋｙ ｓｋｉｎマウス（ｆｓｎ／ｆｓｎ）由来の皮膚を、これらの実験に使用した。Ｆｌａｋｙ ｓｋｉｎマウスは、ヒトの乾癬にみられる病変に良く似た皮膚病変を発症する自然突然変異体である（Ｓｕｎｄｅｒｂｅｒｇら（１９９７）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ６５：２７１−２８６）。これらのマウスの皮膚は、７週齢までに、顕著に肥厚し、そして鱗状になる。組織学的検査によって、表皮層および真皮の広範囲な肥厚が示される。真皮の増加は、線維芽細胞の異常増殖およびこれらの細胞によるコラーゲン合成の増加に起因する。真皮の肥厚を減少させる任意の薬理学的な物質は、乾癬および強皮症のような病気の処置において有用性を有し得る。
【００４９】
Ｆｌａｋｙ ｓｋｉｎの器官培養物を利用し、線維芽細胞増殖および真皮の肥厚に対するコンドロイチナーゼＢの効果を評価した。ヒト皮膚培養物に関して以前に記載されたように、培養を開始し、そして維持した（Ｖａｒａｎｉら（１９９４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：５６１−５７３）。皮膚を７〜９週齢のマウスから入手した。細菌による培養物の汚染を防ぐために、皮膚をＤＭＥＭ（５培濃度のペニシリン／ストレプトマイシンを含む）を用いて２回洗浄した。無菌条件下で皮膚を２ｍｍ2切片に切り取り、そして１切片を、１．５ｍＭカルシウムを含むケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中の０、０．１、１．０、または１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢと共に、９６ウェルディッシュの各ウェル中に置いた。これらの培養物を、１、４および６日目に培地の交換を行って、８日間維持した。
【００５０】
０、３、および７日目に、いくつかの培養物に１μＣｉの3Ｈ−チミジンを加え、そして２４時間後（１、４、および８日目）に回収した。チミジン標識した切片を使用し、チミジンの取り込みによって測定される線維芽細胞の増殖を評価した。これらの培養物を回収し、そして以下のように定量した：培地を除去し、そして皮膚切片を、氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した。氷冷５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、そして培養物を室温で３０分間インキュベートした。ＴＣＡを除去し、切片を氷冷脱イオン水中で２回洗浄し、そして氷冷９５％エタノール中で２回洗浄した。切片を室温で３時間乾燥し、次いで、ｍｇ／皮膚断片を得るために、個別に重量測定を行った。１切片当たりに取り込まれたチミジンのｃｐｍおよび各切片の重量から計算された、ｃｐｍ／ｍｇ組織を定量するために、切片をシンチレーション流体中に置き、そしてカウントした。４匹のマウスの各々について、１時点当たり最低１２切片値を使用した。各々のマウスについて、未処理皮膚（培地単独）によって取り込まれた、ｃｐｍ／ｍｇ組織をコントロールとした。酵素処理した皮膚の％阻害は、各々のマウスに対するコントロール値を使用して計算した。
【００５１】
１日目または４日目には、線維芽細胞増殖の阻害はなかった。しかしながら、皮膚切片を１および１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢを用いて８日間処理した後には、増殖の減少が観察された。図７において示されるように、細胞増殖は、１．０および１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで処理した皮膚において、それぞれ３５％および４８％阻害された。１０ＩＵ／ｍｌで処理した皮膚における効果は有意（ｐ＝０．００２のレベル）であった（ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔの群比較によって決定）。
【００５２】
皮膚に対するコンドロイチナーゼＢの効果を、染色切片においても評価した。培養を開始した日（０日目）ならびに４および８日目に、未処理の切片または酵素処理された切片を、１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、そして組織学検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。切片化された皮膚の評価は３切片／処置／マウス／時点に基づいた。各々の切片について、較正された接眼マイクロメータを使用して、角質層、表皮および真皮の厚さを測定した。同じ切片の異なる領域内で、各層の測定を３回行った。
【００５３】
組織学的評価に基づいて、角質層にも表皮にも厚さに有意な変化はなかった。しかしながら、真皮（コンドロイチナーゼＢで処理した培養物中の真皮線維芽細胞を含む皮膚層）の厚さに有意な変化があった。図８に示されるように、１．０および１０ＩＵ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢで処理した皮膚切片中の真皮の厚さは、コントロールの厚さより３６％および４０％少なかった。真皮層の厚さの減少は、線維芽細胞の数の減少を反映し、そしてトリチウム化したチミジンの取り込みによって測定されたように、細胞増殖の減少と一致している。
【００５４】
（実施例７：肺線維症のマウスモデルにおけるプロコラーゲンおよびＴＧＦβの発現の阻害）
Ｉ型コラーゲンの合成、およびコラーゲン促進サイトカイン（ＴＧＦβ）に対するコンドロイチナーゼＢの効果を、肺線維症のマウスモデルにおいて検査した。このモデルにおいて、線維症は、抗腫瘍薬物（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）（硫酸ブレオマイシン）の気管内注入によって、マウスの肺において誘導される。ブレオマイシン誘導線維症は、この疾患を有するマウスおよびヒトの両方における形態学、生化学およびｍＲＮＡの変化に関する研究によって立証されるように、ヒトの特発性肺線維症に非常に良く似ている。（Ｐｈａｎ，Ｓ．Ｈ．Ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ． 「Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」Ｐ．Ａ．Ｗａｒｄ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８３，ｐｐ１２１−１６２；Ｚｈａｎｇら、（１９９４）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１９２−２０２；ＰｈａｎおよびＫｕｎｋｅｌ（１９９２）Ｅｘｐｅｒ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．１８：２９−４３）。
【００５５】
これらの実験において使用したマウスは８週齢で約２５ｇのＣＢＡ／Ｊであった。マウスを各群当たり６匹の３処理群に分けた。各群のマウスを以下のように処理した：
【００５６】
【表２】
【００５７】
２１日目に、全てのマウスをペントバルビタールナトリウムの致死量注射によって屠殺した。肺に生理食塩水をフラッシュして血液を取り除き、そしてｍＲＮＡを抽出し、およびプロコラーゲンＩおよびＴＧＦβの発現を評価した（ＰｈａｎおよびＫｕｎｋｅｌ（１９９２；Ｅｘｐｅｒ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．１８：２９−４３）によって記載のように）。異なる処理群からのマウスの肺に含まれるｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット分析の後のフィルムからのデンシトメトリーの読み取りから定量した。ブレオマイシンに続いてコンドロイチナーゼＢで処理したマウスの肺は、プロコラーゲンＩ型およびコラーゲン合成促進サイトカイン（ＴＧＦβ）の両方について、顕著により少ないｍＲＮＡを含んでいた。これらの結果は、コンドロイチナーゼＢが、線維症の肺において大きく増加されることが示されている２つの主要なタンパク質についてのｍＲＮＡの発現の阻害において、効果的であったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来コンドロイチナーゼＢで処置した後の、線維芽細胞由来の硫酸化グリコサミノグリカンの放出の時間（図１Ａ）または用量（図１Ｂ）を関数としたグラフである。図１Ａは、示された時間（分）で、１．０ ＩＵ／ｍｌで処置した後の、35Ｓ−グリコサミノグリカンの放出を示す。図１Ｂは、１時間、示された酵素の濃度で処理した後の、35Ｓ−グリコサミノグリカンの放出を示す。データは、３連で実施した２つのこのような実験の各々から、酵素処理によって放出された35Ｓ−グリコサミノグリカンのｃｐｍ／ウェルである（酵素で処理されたｃｐｍ細胞−培地のみで処理されたｃｐｍ細胞）。培地のみで放出された平均ｃｐｍは、８，１６０±５９９であった。
【図２】図２は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣで処理した後の、線維芽細胞由来の硫酸化グリコサミノグリカンの用量依存性放出と時間のグラフである。中実バーは、１時間処理後の放出を示し、そして中空バーは、２時間処理後の放出である。データは、３連で実施した２つのこのような実験の各々から、酵素処理によって放出された35Ｓ−グリコサミノグリカンのｃｐｍ／ウェルである酵素で処理されたｃｐｍ細胞−培地のみで処理されたｃｐｍ細胞）。培地のみで放出された平均ｃｐｍは、４，０２８±５４であった。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで処理した後の、線維芽細胞グリコサミノグリカン（ＧＡＧ、図３Ａ）およびｂＧＦＧレセプター（図３Ｂ）に対する125Ｉ−ｂＦＧＦの結合のグラフである。全結合（△）、非特異的結合（○）および特異的結合（●）が示される。データは、２連で実施した５つのこのような実験の各々由来である。
【図４】図４は、培地（コントロール、●）または１．０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ（○）で処置した線維芽細胞のレセプターに結合したｂＦＧＦのスキャッチャード分析のグラフである。データは、２連で実施した５つのこのような実験の各々由来である。
【図５】図５Ａよび５Ｂは、１０％のウシ胎児血清（血清）（●）または１００ｐｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（○）に応答する、線維芽細胞増殖での、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ（図５Ａ）およびコンドロイチナーゼＡＣ（図５Ｂ）の用量依存効果のグラフである。データは、コンドロイチナーゼＢで処理した細胞を培地のみで処置した細胞と比較した増殖の阻害％である。各点は、３連で実施した４つの実験の平均±ｓｅｍである。
【図６】図６は、２５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの非存在（クロスハッチ）または存在（黒）における、０〜１０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで処理した線維芽細胞の細胞外基質のコラーゲン含有量のグラフである。
【図７】図７は、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで８日処理した、マウス皮膚培地中での細胞増殖の阻害のグラフである。増殖を、２４時間の曝露後に、皮膚部分に３Ｈ−チミジンを取り込みによって評価した。データは、コントロール（酵素なし）と比較した場合、阻害％として表現される。各バーは、３匹のマウスから採取された、３６の皮膚部分の平均±ｓｅｍを示す。この＊は、阻害は、ｐ＜０．０５で実質的に有意であったことを示す。
【図８】図８は、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢで８日間処置したマウスの皮膚培地中での、皮膚厚の減少のグラフである。データは、コントロール（酵素なし）と比較した減少％として表現される。各バーは、３匹のマウスの１８皮膚部分から取った測定値の平均±ｓｅｍを表す。この＊は、阻害（厚さの減少）は、ｐ＜０．０５で実質的に有意であったことを示す。
【図９】図９ａおよび９ｂは、コンドロイチナーゼＢで処理したマウスの肺における、プロコラーゲンＩ（図９ａ）およびＴＧＦβ（図９ｂ）に対する、ｍＲＮＡの発現の阻害のグラフである。処置グラフは、気管および／または腹腔それぞれに注射された経路および物質を示す。ＣｈＢは、１回注射当たり２５ＩＵの酵素であり；ＢＬＭは、ブレオマイシン硫酸の０．０２５ユニットの１回注射であり；そしてＳＡＬは、等しい体積の生理食塩水の注射を示す。データは、ノーザンブロットフィルムの濃度測定の読み取りによって決定されるような、一体化ユニット（×１０3）として表現される。各バーは、６匹のマウスの平均±ｓｅｍを示す。この＊は、ｍＲＮＡ発現の減少は、マウスに与えられたＢＬＭ／ＳＡＬにおいて見出される減少よりも有意に少ないことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるような、線維性組織の形成を阻害するための方法。
【請求項１】
本明細書に記載されるような、線維性組織の形成を阻害するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−９４８５０（Ｐ２００８−９４８５０Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９４９４６（Ｐ２００７−２９４９４６）
【出願日】平成１９年１１月１３日（２００７．１１．１３）
【分割の表示】特願２００１−５４１５２７（Ｐ２００１−５４１５２７）の分割
【原出願日】平成１２年１１月２８日（２０００．１１．２８）
【出願人】（５０６１３６４８３）バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１３日（２００７．１１．１３）
【分割の表示】特願２００１−５４１５２７（Ｐ２００１−５４１５２７）の分割
【原出願日】平成１２年１１月２８日（２０００．１１．２８）
【出願人】（５０６１３６４８３）バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]