美白剤の評価方法
【課題】 紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成することができる美白剤を簡便に選別すること、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうこと等の少なくとも１つを達成することができる、美白剤の評価方法を提供すること。
【解決手段】被験物質の存在により、ＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現が抑制されるか否かを評価する美白剤の評価方法。
【解決手段】被験物質の存在により、ＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現が抑制されるか否かを評価する美白剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽光線は、紫外線、可視光線、赤外線等から構成されている。なかでも、紫外線は、皮膚の表皮メラノサイトにおけるチロシナーゼ活性を上昇させ、それにより、メラニンの合成量が増加させる。そのため、紫外線を浴びた皮膚においては、日焼けが発生し、皮膚の色素沈着、しみ、くすみ等の症状が現れる。
【０００３】
紫外線により皮膚の日焼けが発生した場合、皮膚の美白化のために、チロシナーゼ生合成抑制活性を有するシラン（Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ Ｒｉｅｃｈｂ． ｆｉｌ．）抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤が用いられることが知られている（特許文献１）。しかしながら、前記特許文献１記載の皮膚外用剤は、皮膚の美白化のなかでも、しみ、そばかす、色黒等の予防、症状の緩和又は憎悪の抑制を対象とするものである。
【０００４】
また、紫外線による日焼けから皮膚を保護するため、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤等を含有する紫外線防御用組成物、例えば、日焼け止め化粧料等が用いられている。前記日焼け止め化粧料等の紫外線防御用組成物によれば、皮膚の表面上で、太陽からの紫外線を遮断又は吸収するサンスクリーン効果を得ることができる。したがって、前記紫外線防御用組成物によれば、皮膚細胞への紫外線の到達を抑制し、それにより、日焼けを抑制することができる。しかしながら、日常生活において、前記紫外線防御用組成物は、発汗等により流れ落ち、それにより、前記サンスクリーン効果が弱まることがあるという欠点がある。
【０００５】
そのため、紫外線により引き起こされる日焼け等の皮膚の症状に対して効果を発揮する他の手段が求められている。
【０００６】
一方、細菌等の感染により組織に損傷を受けた場合、局所で、インターロイキン−１、ＴＮＦ−α等が放出され、血管内皮細胞の表面に細胞接着分子のＥ−セレクチンが発現することが知られている。前記Ｅ−セレクチンは、前記Ｅ−セレクチンのリガンドであるシアリルルイスＸを表面に有する白血球の血管表面でのローリングに関与することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−２５２１２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成することができる美白剤を簡便に選別すること、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうこと等の少なくとも１つを達成することができる、美白剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 被験物質の存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記Ｅ−セレクチンの発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法、
〔２〕 前記細胞が、ケラチノサイトである前記〔１〕記載の美白剤の評価方法、
〔３〕 （Ａ）被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、Ｅ−セレクチンを発現する細胞を培養するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む前記〔１〕又は〔２〕記載の美白剤の評価方法、
〔４〕 （ａ）Ｅ−セレクチンを発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む前記〔１〕又は〔２〕記載の美白剤の評価方法、並びに
〔５〕 被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の美白剤の評価方法は、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成することができる美白剤を簡便に選別すること、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうこと等の少なくとも１つを達成することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例２のボタンピ抽出物含有試料を用いた場合の細胞におけるＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現の局在性を調べた結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、被験物質の存在下での細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記ＥＬＡＭ−１の発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法に関する。
【００１３】
本発明の美白剤の評価方法は、細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現が、被験物質の存在により抑制されるか否かが評価されている点に１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の美白剤の評価方法は、日焼け等の紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防できること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成できる美白剤を簡便に選別することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の美白剤の評価方法は、細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現又は前記核酸の発現が被験物質の存在により抑制されるか否かが評価されているため、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうことができるという優れた効果を奏する。
【００１４】
前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物、抗体、抗体断片、ペプチド、核酸等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において、前記「ＥＬＡＭ−１の発現」の用語は、細胞におけるポリペプチドレベルでのＥＬＡＭ−１の発現と、細胞におけるかかるＥＬＡＭ−１が本質的に有する前記生物学的活性及び生物学的機能それぞれの発現とを包含する概念をいう。
【００１６】
本発明の美白剤の評価方法としては、具体的には、例えば、被験物質の存在によるＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量の減少を指標とする方法、前記被験物質の存在による前記ＥＬＡＭ−１の生物学的活性のインビボ又はインビトロでの減少を指標とする方法、前記被験物質の存在による前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量の減少を指標とする方法等が挙げられる。
【００１７】
前記細胞としては、特に限定されないが、例えば、ケラチノサイト、色素細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞等が挙げられる。なかでも、前記細胞は、被験物質のなかから、紫外線によりヒトの皮膚に引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を、より効果的に抑制又は予防できる物質を効率よく選別する観点、及び紫外線により引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防する効果について、美白剤をより適切に評価する観点から、ケラチノサイトが好ましい。前記細胞の供給源となる生物としては、ヒト、マウス、ラット等が挙げられる。前記細胞の供給源となる生物は、被験物質のなかから、紫外線によりヒトの皮膚に引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を、より効果的に抑制又は予防できる物質を効率よく選別する観点、及び紫外線により引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防する効果について、美白剤をより適切に評価する観点から、好ましくは、ヒトであることが望ましい。
【００１８】
本発明の美白剤の評価方法は、１つの実施態様では、（Ａ）被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、ＥＬＡＭ−１を発現する細胞を培養するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む方法（実施態様１の方法）である。
【００１９】
前記実施態様１の方法は、まず、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、ＥＬＡＭ−１を発現する細胞を培養する〔ステップ（Ａ）〕。かかるステップにおいては、細胞を被験物質の存在下に培養する一方で、被験物質を用いない場合の対照として、細胞を、前記被験物質の非存在下に培養することを除いて前記被験物質の存在下に培養された細胞の培養条件と同じ条件下に培養する。
【００２０】
前記細胞は、３次元培養により得られた３次元モデルの細胞であってもよく、通常の培養で得られた細胞であってもよい。紫外線によりヒトの皮膚に引き起こされる皮膚炎症又は皮膚障害の発生を、より効果的に抑制又は予防できる物質を効率よく選別する観点、及び紫外線により引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防する効果について、美白剤を、より適切に評価する観点から、前記細胞は、好ましくは、３次元培養により得られた３次元モデルの細胞であることが望ましい。
【００２１】
前記３次元モデルは、例えば、皮膚モデルの場合、ヒト皮膚構造に類似する重層化された構造を有している。具体的には、前記皮膚モデルは、皮膚と同様に、基底層、有棘層、顆粒層、角質層等が重層化された構造を有する。前記皮膚モデルは、細胞を適切な担体を用いて、適切な培地で重層培養することにより得ることができる。
【００２２】
前記ステップ（Ａ）において、細胞の培養は、前記細胞が生育するに適した培地を用いて、前記細胞が生育するに適した培養条件下に行なうことができる。
【００２３】
例えば、前記細胞がケラチノサイトである場合、前記培地としては、特に限定されないが、例えば、ケラチノサイト生育培地（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ、例えば、「培養細胞実験ハンドブック」、株式会社羊土社、２００４年８月５日発行等を参照）、ＭＣＤＢ１５３基本培地〔ボイス（Ｂｏｙｃｅ Ｓ．Ｔ．）ら、ジャーナル オブ インベスティゲイティブ ダーマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）、第８１巻、第３３頁−第４０頁（１９８３）〕、ＭＣＤＢ１５２基本培地〔タサオ（Ｔｓａｏ Ｍ．Ｃ．）ら、ジャーナル オブ セルラー フィジオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、第１１０巻、第２１９頁−第２２９頁（１９８２）等を参照〕等が挙げられる。また、前記細胞がケラチノサイトである場合、前記培養条件は、目的に応じ、ケラチノサイトの生育に適した範囲の培養温度、ＣＯ2濃度等の条件であればよく、適宜設定することができる。前記培養温度は、例えば、ケラチノサイトを良好に生育させる観点から、好ましくは、３５℃〜３８℃、より好ましくは、３６．５℃〜３７．５℃の範囲の培養温度が選択することができる。また、前記ＣＯ2濃度は、例えば、ケラチノサイトを良好に生育させる観点から、０〜２０体積％、４〜６体積％の範囲のＣＯ2濃度が選択することができる。
【００２４】
前記ステップ（Ａ）において、前記被験物質の存在下での培養の場合、用いられる培地中に含まれる前記被験物質の濃度は、適宜設定することができる。ここで、例えば、被験物質による細胞への効果の度合いも併せて評価する場合、前記ステップ（Ａ）では、種々の濃度で被験物質を含有する複数種の培地を用いればよい。
【００２５】
また、前記ステップ（Ａ）において、細胞の培養時間は、例えば、前記細胞への被験物質の親和性、浸透性等を指標にして、適宜設定することができる。
【００２６】
前記実施態様１の方法では、次に、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射する〔ステップ（Ｂ）〕。
【００２７】
前記ステップ（Ｂ）では、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に対して、紫外線を照射するため、被験物質により、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができるかどうか、又は被験物質としての美白剤が紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生の抑制効果又は予防効果を発揮することができるかどうかを評価することができる。
【００２８】
前記ステップ（Ｂ）において、紫外線照射に先立ち、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞を、リン酸緩衝生理食塩水等で洗浄してもよい。前記ステップ（Ｂ）において、前記洗浄を行なうことは、被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生に対して、サンスクリーン効果とは異なる効果を発揮するかどうかを評価することができる点で有利である。
【００２９】
前記紫外線照射は、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂのいずれか単独での照射であってもよく、ＵＶ−ＡとＵＶ−Ｂとの同時での照射であってもよい。
【００３０】
また、細胞に対する紫外線の照射量は、目的に応じ、適宜設定することができる。
【００３１】
前記実施態様１の方法では、次に、前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価する〔ステップ（Ｃ）〕。
【００３２】
前記ステップ（Ｃ）において、前記ＥＬＡＭ−１の発現量は、例えば、前記ＥＬＡＭ−１に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット解析等の手法により相対的な値として測定することができる。なお、前記実施態様１の方法では、前記ステップ（Ａ）において、細胞として、ＥＬＡＭ−１を適切なタグと融合したタグ融合タンパク質として発現する細胞を用いてもよい。かかる細胞を用いた場合、前記ステップ（Ｃ）において、前記タグを検出する試薬等により、簡便に、細胞内における前記因子の発現量を測定することができる。
【００３３】
また、前記ステップ（Ｃ）において、前記核酸の発現量は、ＥＬＡＭ−１をコードする核酸に特異的な塩基配列からなるプローブ、前記核酸を特異的に増幅することができるプライマー対等を用いたリアルタイムＰＣＲ等に代表される核酸定量法、前記核酸又は前記核酸に相補的な核酸が固定された核酸アレイ（ｃＤＮＡアレイ等）を用いたハイブリダイゼーション法等により測定することができる。
【００３４】
前記ステップ（Ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、日焼け等の紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。
【００３５】
また、前記ステップ（Ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、日焼け等の紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００３６】
また、本発明の美白剤の評価方法は、他の実施態様では、（ａ）ＥＬＡＭ−１を発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む方法である（実施態様２の方法）。
【００３７】
前記実施態様２の方法では、前記ステップ（ａ）は、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下での培養前の細胞に対して、紫外線を照射することを除き、前記実施態様１の方法におけるステップ（Ｂ）と同様に行なうことができる。
【００３８】
また、前記実施態様２の方法において、前記ステップ（ｂ）は、紫外線を照射した後の細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養することを除き、前記実施態様１の方法におけるステップ（Ａ）と同様に行なうことができる。かかるステップにおいては、ステップ（ａ）で得られた細胞を被験物質の存在下に培養する一方で、被験物質を用いない場合の対照として、ステップ（ａ）で得られた細胞を、前記被験物質の非存在下に培養することを除いて前記被験物質の存在下に培養された細胞の培養条件と同じ条件下に培養する。
【００３９】
前記ステップ（ｃ）では、前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価する。前記ＥＬＡＭ−１の発現量及び前記核酸の発現量は、前記実施態様１の方法におけるステップ（Ｃ）の場合と同様に測定することができる。
【００４０】
前記ステップ（ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。
【００４１】
また、前記ステップ（ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００４２】
本発明の美白剤の評価方法は、さらに他の側面では、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価する方法である（実施態様３の方法）。
【００４３】
前記実施態様３の方法では、前記ＥＬＡＭ−１の生物学的活性は、例えば、ＥＬＡＭ−１とシアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡとの結合、ＥＬＡＭ−１と白血球との間の接着等を指標として測定することができる。
【００４４】
前記実施態様３の方法において、前記ＥＬＡＭ−１と、糖鎖リガンドであるシアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴解析等により測定することができる。前記表面プラズモン共鳴解析は、例えば、シアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡを固定化したチップに、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下に、ＥＬＡＭ−１を含有する溶液を一定の流速で送液し、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下の場合のＥＬＡＭ−１と、糖鎖リガンドであるシアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡとの相互作用の有無及びその度合い（結合強度又は結合量）を検出すること等により行なわれる。かかる表面プラズモン共鳴解析では、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、かかる表面プラズモン共鳴解析では、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００４５】
また、前記実施態様３の方法において、例えば、ＥＬＡＭ−１と白血球との間の接着を指標とする場合、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、ＥＬＡＭ−１を表面に提示して発現する細胞を固定化した担体と、検出可能な標識物質で標識された白血球とを接触させ、担体上の細胞と接着した白血球の標識物質を検出して、接着の有無、接着の程度を測定すること等により評価することができる。
【００４６】
なお、本発明の美白剤の評価方法のなかでは、前記実施態様１の方法及び実施態様２の方法における核酸レベルでの発現量に基づく評価は、操作をより簡便に行なうことができる点で有利である。
【００４７】
本発明の美白剤の評価方法は、例えば、美白剤の品質等の評価、新たな美白剤のスクリーニング等を行なう際に利用することができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、ボタンピ抽出物についての「固体成分濃度」は、特に断りのない限り、ボタンピ抽出物から溶媒を留去して得られた乾燥物としての固体成分の量に換算した濃度を示す。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ケラチノサイト）〔商品名：ＮＨＥＫ（Ｆ） 新生児包皮表皮角化細胞、カスケード バイオロジックス（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）製、倉敷紡績株式会社供給〕を、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社製）２ｍｌが入った細胞培養プレートの各ウェルに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養した。
【００５０】
また、最終濃度が０．１体積％（固体成分濃度：０．０００２質量％）となるように、ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（商品名、倉敷紡績株式会社製）に添加し、ボタンピ抽出物含有ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地を得た。得られたボタンピ抽出物含有ＨｕＭｅＤｉａ−ＫＧ２培地２ｍｌを、前記細胞培養プレートの各ウェルに添加し、３７℃、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養することにより、ボタンピ抽出物処理を行なった。培養後、得られた正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により２ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射後、前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（商品名、倉敷紡績株式会社製）で、３７℃、ＣＯ2濃度：５体積％の条件で１０時間培養した。その後、前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を採取した。
【００５１】
商品名：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて、前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞から、全ＲＮＡを抽出した。次に、前記全ＲＮＡを鋳型とし、商品名：Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐ キット〔アギレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕を用いて、ｃＤＮＡを合成した。その後、標識試薬として、Ｃｙａｎｉｎｅ ３−ＣＴＰ、Ｃｙａｎｉｎｅ ５−ＣＴＰ〔パーキンエルマーインコーポレーテッド（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）製〕）を用いて、ｃＲＮＡを合成し、ついで、精製した。
【００５２】
（比較例１）
ボタンピ抽出物の非存在下で培養したこと（ボタンピ抽出物非処理）を除き、前記実施例１と同様に操作を行ない、ｃＲＮＡを得た。
【００５３】
（比較例２）
ボタンピ抽出物の非存在下で培養し（ボタンピ抽出物非処理）、かつ紫外線を照射しなかったこと（紫外線非照射）を除き、前記実施例１と同様に操作を行ない、ｃＲＮＡを得た。
【００５４】
（試験例１）
前記実施例１、比較例１及び比較例２それぞれで得られたｃＲＮＡを、ＤＮＡマイクロアレイ（商品名：Ｈｕｍａｎ １Ａ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に供し、その後、６０℃で１７時間インキュベーションして、それにより、ＤＮＡマイクロアレイ上のＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた。その後、前記ＤＮＡマイクロアレイを洗浄した。
【００５５】
洗浄後のＤＮＡマイクロアレイについて、アレイスキャナー〔商品名：ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ、アジレント テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕を用いて、前記標識に基づく蛍光シグナルを検出した。その後、前記蛍光シグナルの強度を数量化することにより、前記蛍光シグナルに対応する遺伝子の発現量を算出した。その結果の一例を表１に示す。表１におけるＥＬＡＭ−１発現相対値は、比較例２の場合の正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞中におけるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量に対する実施例１及び比較例１それぞれの場合の正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞中におけるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の相対値である。なお、表１におけるＥＬＡＭ−１発現相対値は、比較例２の場合の正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞中におけるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を１として算出した値である。
【００５６】
【表１】
【００５７】
前記表１の結果から、比較例２（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線非照射の条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値に比べ、比較例１（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値が大きくなることがわかる。したがって、紫外線の照射により、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の上昇が引き起こされることが示唆される。
【００５８】
しかしながら、前記表１の結果から、比較例１（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値に比べ、実施例１（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値が小さくなることがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の上昇を抑制することができることが示唆される。
【００５９】
（実施例２）
ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を最終濃度５．０体積％（固体成分濃度：０．１質量％）となるようにリン酸緩衝生理食塩水に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
【００６０】
前記ボタンピ抽出物含有試料を、正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション（ＭａｔＴｅｋ ｃｏｒｐ．）製〕の皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養した。その後、得られた正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。洗浄後の正常ヒト三次元培養皮膚モデルに、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養した。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから表皮角化細胞（ケラチノサイト）を採取した。採取した表皮角化細胞を凍結組織切片作製用包埋剤〔商品名：ティッシュー・テック Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド、サクラファインテック株式会社製〕で包埋し、液体窒素で凍結させた。その後、得られた凍結包埋試料を、クライオスタットで薄切することにより、薄切切片を得た。得られた切片をスライドグラスにのせて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を得た。
【００６１】
（比較例３）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養し（ボタンピ抽出物非処理）、かつ紫外線を照射しなかったこと（紫外線非照射）を除き、前記実施例２と同様に操作を行ない、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を得た。
【００６２】
（比較例４）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養したこと（ボタンピ抽出物非処理）を除き、前記実施例２と同様に操作を行ない、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を得た。
【００６３】
（試験例２）
配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸をｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター〔プロメガ株式会社製〕のクローニングサイトに組み込んで得られた産物を鋳型とし、ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＰ６／Ｔ７）〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）製〕を用いてＰＣＲを行ない、蛍光標識プローブを作製した。
【００６４】
得られた蛍光標識プローブ（１ｍｇ／ｍＬ核酸相当量）を、前記実施例２、比較例３及び比較例４それぞれのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料に添加した。さらに、ハイブリダイゼーション緩衝液〔組成：５０体積％ 脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１ｍｇ／ｍＬ 酵母ｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｎ． ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商品名） Ｘ−１００〕９０μｌを、前記実施例２、比較例３及び比較例４それぞれのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料に添加した。その後、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を、６５℃で１６時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行なった。その後、４×ＳＳＣでパラフィルムを剥がし、２×ＳＳＣ／ホルムアミドで、６５℃で６０分、０．１×ＳＳＣで、６５℃で１２０分、ＭＡＢＴ（ｐＨ７．５）[組成：１００ｍＭマレイン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１体積％ Ｔｒｉｔｏｎ（商品名）Ｘ−１００]中、室温（２５℃）で５分インキュベーションし、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を洗浄した。得られた試料について、対比染色を行ない、光学顕微鏡下に観察した。実施例２のボタンピ抽出物含有試料を用いた場合の細胞におけるＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現の局在性を調べた結果を示す図面代用写真を図１に示す。図１中、パネル（Ａ）は、比較例３（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線非照射の条件）、パネル（Ｂ）は、比較例４（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）、パネル（Ｃ）は、実施例２（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の結果を示す。
【００６５】
図１のパネル（Ａ）の結果から、比較例３（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線非照射の条件）の場合の表皮角化細胞においては、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現が認められないことがわかる。一方、図１のパネル（Ｂ）の結果から、比較例４（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の表皮角化細胞においては、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現部位が全体にわたって多数存在することがわかる。したがって、表皮角化細胞においては、紫外線照射により、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現が全体にわたって引き起こされることが示唆される。
【００６６】
しかしながら、パネル（Ｃ）の結果から、実施例２（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の表皮角化細胞においては、比較例４（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の表皮角化細胞〔パネル（Ｂ）〕に比べ、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現部位の数は少なくなることがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされるＥＬＡＭ−１のｍＲＮＡの発現を抑制することができることが示唆される。また、前記ボタンピ抽出物含有試料は、ＥＬＡＭ−１の発現抑制剤として有用であることが示唆される。
【００６７】
（実施例３）
ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を最終濃度５．０体積％（固体成分濃度：０．１質量％）となるようにリン酸緩衝生理食塩水に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
【００６８】
得られたボタンピ抽出物含有試料を、正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション製〕の皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養した。その後、得られた正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。洗浄後の正常ヒト三次元培養皮膚モデルに、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養した。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから表皮角化細胞を採取した。
【００６９】
商品名：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアジェン社製）を用いて、前記表皮角化細胞から、全ＲＮＡを抽出した。次に、前記全ＲＮＡを鋳型として、商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ〔インビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００７０】
（比較例５）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養したこと（ボタンピ抽出物非処理）を除き、前記実施例３と同様に操作を行ない、ｃＤＮＡを得た。
【００７１】
（比較例６）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養し（ボタンピ抽出物非処理）、かつ紫外線を照射しなかったこと（紫外線非照射）を除き、前記実施例３と同様に操作を行ない、ｃＤＮＡを得た。
【００７２】
（試験例３）
前記実施例３、比較例５及び比較例６それぞれのｃＤＮＡを鋳型として、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現を、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲにより解析した。
【００７３】
なお、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲのために用いるプライマーとして、ＴＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧ（配列番号：１）とＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧ（配列番号：２）とを用いた。また、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲのために用いるプローブとして、商品名：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ（キアジェン社製）を用いた。なお、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、５０℃で２分間でのインキュベーション、９５℃で１５分間のインキュベーション、変性：９４℃で１５秒とアニーリング：Ｔｍ−５℃で３０秒とエクステンション：７２℃３０秒とを１サイクルとする４０サイクルである。ＥＬＡＭ−１の核酸レベルにおける発現相対値を、比較例６のｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量に対する実施例３のｃＤＮＡ又は比較例５のｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における対応するＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の相対値として算出した。なお、前記ＥＬＡＭ−１の発現相対値は、比較例６のｃＤＮＡを用いて算出された表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を１として算出した値である。結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
前記表２の結果から、比較例５（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現相対値に比べ、実施例３（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現相対値が小さくなることがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされるＥＬＡＭ−１のｍＲＮＡの発現量の上昇を抑制することができることが示唆される。
【００７６】
また、ボタンピ抽出物は、漢方薬として用いることができる、個体、組織又は細胞に対して負荷が実質的にかからない植物抽出物である。そのため、前記ボタンピ抽出物含有試料によれば、適用対象となる個体、組織、細胞等に実質的に負荷をかけることなく、個体、組織、細胞等におけるＥＬＡＭ−１により引き起こされる事象を緩和又は前記事象の発現を抑制することができる。
【００７７】
（実施例４）
ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を最終濃度１体積％（固体成分濃度：０．０４質量％）となるように、５０質量％エタノール水溶液に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
【００７８】
（試験例４）
前記実施例４のボタンピ抽出物含有試料を、年齢２４歳〜４０歳の１２名の被験者（実験番号１〜１２）の上腕内側部に、１日３回、１週間にわたって塗布した。また、対照として、５０質量％エタノール水溶液を、前記と同様に、１２名の被験者（実験番号１〜１２）の上腕内側部に、１日３回、１週間にわたって塗布した。その後、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位及び前記対照の塗布部位に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により、１ＭＥＤ相当の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射１週間後、色差計（株式会社村上色彩技術研究所製、ＣＭＳ−１２００）を用いて、紫外線照射部位の皮膚色のＬ*値及び紫外線非照射部位の皮膚色のＬ*値を測定した。次に、式（Ｉ）：
【００７９】
【数１】
【００８０】
に従って、前記Ｌ*値から、ΔＬ*値を算出した。さらに、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位におけるΔＬ*値と前記対照の塗布部位におけるΔＬ*値とから、式（II）：
【００８１】
【数２】
【００８２】
に従って、色素沈着抑制率（％）を求めた。結果を表３に示す。表中、ΔＬ*の値が大きいほど色素沈着の程度が強いことを示す。また、表中、「試料」は、ボタンピ抽出物含有試料を示し、「対照」は、５０質量％エタノール水溶液を示す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
表３の結果から、前記実施例４で得られたボタンピ抽出物含有試料を塗布した場合、対照を塗布した場合に比べ、ほとんどの被験者において、ΔＬ*値が減少することがわかる。したがって、ボタンピ抽出物含有試料によれば、紫外線の照射により引き起こされる色素沈着を抑制することができることが示唆される。
【００８５】
また、本試験例４の結果と、前記試験例１〜３それぞれの結果とから、紫外線の照射により発現量が上昇するＥＬＡＭ−１の発現が抑制されるか否かを調べることによって、美白剤のスクリーニング又は前記美白剤の品質、性質等の評価を行なうことができることが示唆される。
【００８６】
（試験例５）
前記実施例４で得られたボタンピ抽出物含有試料を、１２名の被験者（実験番号１３〜２４）の上腕内側部に、１日３回、１週間にわたって塗布した。その後、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により、１ＭＥＤ相当の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射２４時間後、レーザードップラー血流量計〔商品名：ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭ３、プレイメド（ＰＲＥＩＭＥＤ）社製〕を用いて、レーザードップラー法により、紫外線照射部位における血流量を測定した。なお、対照として、前記実施例４で得られたボタンピ抽出物含有試料に代えて、５０質量％エタノール水溶液を用いて、前記と同様に操作を行ない、血流量を測定した。さらに、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位における血流量と前記対照の塗布部位における血流量とから、式(III)：
【００８７】
【数３】
【００８８】
に従って、血流量増加抑制率（％）を求めた。結果を表４に示す。表中、「試料」は、ボタンピ抽出物含有試料を示し、「対照」は、５０質量％エタノール水溶液を示す。
【００８９】
【表４】
【００９０】
表４の結果から、前記実施例４で得られた試料を塗布した場合、対照を塗布した場合に比べ、ほとんどの被験者において、血流量が減少することがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされる血流量の増加を抑制することができることが示唆される。
【００９１】
また、本試験例５の結果と、前記試験例１〜４それぞれの結果とから、紫外線の照射により発現量が上昇するＥＬＡＭ−１の発現が抑制されるか否かを調べることによって、美白剤のスクリーニング又は前記美白剤の品質、性質等の評価を行なうことができることが示唆される。
【００９２】
（実験例１）
被験物質をリン酸緩衝生理食塩水に添加し、被験物質含有試料を得る。
【００９３】
正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション製〕に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射する。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養する。その後、前記被験物質含有試料を、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルの皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養する。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから被験対象の表皮角化細胞を採取する。次に、得られた表皮角化細胞から、被験対象の無細胞抽出物を調製する。
【００９４】
紫外線を照射せず、被験物質の非存在下で培養することを除き、同様に、対照無細胞抽出物を得る。
【００９５】
前記被験対象の無細胞抽出物及び前記対照の無細胞抽出物について、商品名：ＲａｙＢｉｏ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ〔レイバイオテック インコーポレーション（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ.）製〕を用いて、ＥＬＩＳＡを行なう。
【００９６】
次に、ＥＬＡＭ−１に対応するシグナル強度に基づき、前記ＥＬＡＭ−１の発現相対値を、対照無細胞抽出物を用いて求められた表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量に対する被験対象の無細胞抽出物を用いて求められた表皮角化細胞中における対応するＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量の相対値として算出する。なお、前記ＥＬＡＭ−１の発現相対値は、対照無細胞抽出物を用いて算出された表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量を１として算出した値である。
【００９７】
その結果、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００９８】
（実験例２）
被験物質をリン酸緩衝生理食塩水に添加し、被験物質含有試料を得る。
【００９９】
正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション製〕に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射する。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養する。その後、前記被験物質含有試料を、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルの皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養する。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから表皮角化細胞（ケラチノサイト）を採取する。次に、前記実施例３と同様に、被験対象のｃＤＮＡを得る。
【０１００】
紫外線を照射せず、被験物質含有試料の非存在下で培養することを除き、被験対象のｃＲＮＡの場合と同様に操作を行ない、対照ｃＤＮＡを得る。
【０１０１】
前記被験対象のｃＤＮＡ及び対照ｃＤＮＡを鋳型として、前記試験例３と同様に、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲにより、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を測定する。次に、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルにおける発現相対値を、対照ｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量に対する被験対象のｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における対応するＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の相対値として算出する。なお、前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルにおける発現相対値は、対照ｃＤＮＡを用いて算出された表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を１として算出した値である。
【０１０２】
その結果、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【０１０３】
（実験例３）
紫外線照射と被験物質含有試料の存在下での培養との順番を逆にしたことを除き、前記実験例１と同様に、ＥＬＩＳＡにより、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量（ポリペプチドレベル）と、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量（ポリペプチドレベル）とを比較する。
【０１０４】
その結果、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【０１０５】
（実験例４）
商品名：ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ１００〔ビアコア株式会社製〕を用いて、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下での可溶化Ｅ−セレクチン標品と、シアリルルイスＸとの間の相互作用及びその度合い（結合強度）を解析する。
【０１０６】
その結果、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】
配列番号：１は、ＥＬＡＭ−１用増幅プライマーの配列である。
配列番号：２は、ＥＬＡＭ−１用増幅プライマーの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽光線は、紫外線、可視光線、赤外線等から構成されている。なかでも、紫外線は、皮膚の表皮メラノサイトにおけるチロシナーゼ活性を上昇させ、それにより、メラニンの合成量が増加させる。そのため、紫外線を浴びた皮膚においては、日焼けが発生し、皮膚の色素沈着、しみ、くすみ等の症状が現れる。
【０００３】
紫外線により皮膚の日焼けが発生した場合、皮膚の美白化のために、チロシナーゼ生合成抑制活性を有するシラン（Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ Ｒｉｅｃｈｂ． ｆｉｌ．）抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤が用いられることが知られている（特許文献１）。しかしながら、前記特許文献１記載の皮膚外用剤は、皮膚の美白化のなかでも、しみ、そばかす、色黒等の予防、症状の緩和又は憎悪の抑制を対象とするものである。
【０００４】
また、紫外線による日焼けから皮膚を保護するため、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤等を含有する紫外線防御用組成物、例えば、日焼け止め化粧料等が用いられている。前記日焼け止め化粧料等の紫外線防御用組成物によれば、皮膚の表面上で、太陽からの紫外線を遮断又は吸収するサンスクリーン効果を得ることができる。したがって、前記紫外線防御用組成物によれば、皮膚細胞への紫外線の到達を抑制し、それにより、日焼けを抑制することができる。しかしながら、日常生活において、前記紫外線防御用組成物は、発汗等により流れ落ち、それにより、前記サンスクリーン効果が弱まることがあるという欠点がある。
【０００５】
そのため、紫外線により引き起こされる日焼け等の皮膚の症状に対して効果を発揮する他の手段が求められている。
【０００６】
一方、細菌等の感染により組織に損傷を受けた場合、局所で、インターロイキン−１、ＴＮＦ−α等が放出され、血管内皮細胞の表面に細胞接着分子のＥ−セレクチンが発現することが知られている。前記Ｅ−セレクチンは、前記Ｅ−セレクチンのリガンドであるシアリルルイスＸを表面に有する白血球の血管表面でのローリングに関与することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−２５２１２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成することができる美白剤を簡便に選別すること、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうこと等の少なくとも１つを達成することができる、美白剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 被験物質の存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記Ｅ−セレクチンの発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法、
〔２〕 前記細胞が、ケラチノサイトである前記〔１〕記載の美白剤の評価方法、
〔３〕 （Ａ）被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、Ｅ−セレクチンを発現する細胞を培養するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む前記〔１〕又は〔２〕記載の美白剤の評価方法、
〔４〕 （ａ）Ｅ−セレクチンを発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む前記〔１〕又は〔２〕記載の美白剤の評価方法、並びに
〔５〕 被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の美白剤の評価方法は、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成することができる美白剤を簡便に選別すること、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうこと等の少なくとも１つを達成することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例２のボタンピ抽出物含有試料を用いた場合の細胞におけるＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現の局在性を調べた結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、被験物質の存在下での細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記ＥＬＡＭ−１の発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法に関する。
【００１３】
本発明の美白剤の評価方法は、細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現が、被験物質の存在により抑制されるか否かが評価されている点に１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の美白剤の評価方法は、日焼け等の紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防できること及び皮膚を美白化することの少なくとも１つを達成できる美白剤を簡便に選別することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の美白剤の評価方法は、細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現又は前記核酸の発現が被験物質の存在により抑制されるか否かが評価されているため、美白剤の品質等の評価を簡便に行なうことができるという優れた効果を奏する。
【００１４】
前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物、抗体、抗体断片、ペプチド、核酸等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において、前記「ＥＬＡＭ−１の発現」の用語は、細胞におけるポリペプチドレベルでのＥＬＡＭ−１の発現と、細胞におけるかかるＥＬＡＭ−１が本質的に有する前記生物学的活性及び生物学的機能それぞれの発現とを包含する概念をいう。
【００１６】
本発明の美白剤の評価方法としては、具体的には、例えば、被験物質の存在によるＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量の減少を指標とする方法、前記被験物質の存在による前記ＥＬＡＭ−１の生物学的活性のインビボ又はインビトロでの減少を指標とする方法、前記被験物質の存在による前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量の減少を指標とする方法等が挙げられる。
【００１７】
前記細胞としては、特に限定されないが、例えば、ケラチノサイト、色素細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞等が挙げられる。なかでも、前記細胞は、被験物質のなかから、紫外線によりヒトの皮膚に引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を、より効果的に抑制又は予防できる物質を効率よく選別する観点、及び紫外線により引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防する効果について、美白剤をより適切に評価する観点から、ケラチノサイトが好ましい。前記細胞の供給源となる生物としては、ヒト、マウス、ラット等が挙げられる。前記細胞の供給源となる生物は、被験物質のなかから、紫外線によりヒトの皮膚に引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を、より効果的に抑制又は予防できる物質を効率よく選別する観点、及び紫外線により引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防する効果について、美白剤をより適切に評価する観点から、好ましくは、ヒトであることが望ましい。
【００１８】
本発明の美白剤の評価方法は、１つの実施態様では、（Ａ）被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、ＥＬＡＭ−１を発現する細胞を培養するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む方法（実施態様１の方法）である。
【００１９】
前記実施態様１の方法は、まず、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、ＥＬＡＭ−１を発現する細胞を培養する〔ステップ（Ａ）〕。かかるステップにおいては、細胞を被験物質の存在下に培養する一方で、被験物質を用いない場合の対照として、細胞を、前記被験物質の非存在下に培養することを除いて前記被験物質の存在下に培養された細胞の培養条件と同じ条件下に培養する。
【００２０】
前記細胞は、３次元培養により得られた３次元モデルの細胞であってもよく、通常の培養で得られた細胞であってもよい。紫外線によりヒトの皮膚に引き起こされる皮膚炎症又は皮膚障害の発生を、より効果的に抑制又は予防できる物質を効率よく選別する観点、及び紫外線により引き起こされる皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防する効果について、美白剤を、より適切に評価する観点から、前記細胞は、好ましくは、３次元培養により得られた３次元モデルの細胞であることが望ましい。
【００２１】
前記３次元モデルは、例えば、皮膚モデルの場合、ヒト皮膚構造に類似する重層化された構造を有している。具体的には、前記皮膚モデルは、皮膚と同様に、基底層、有棘層、顆粒層、角質層等が重層化された構造を有する。前記皮膚モデルは、細胞を適切な担体を用いて、適切な培地で重層培養することにより得ることができる。
【００２２】
前記ステップ（Ａ）において、細胞の培養は、前記細胞が生育するに適した培地を用いて、前記細胞が生育するに適した培養条件下に行なうことができる。
【００２３】
例えば、前記細胞がケラチノサイトである場合、前記培地としては、特に限定されないが、例えば、ケラチノサイト生育培地（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ、例えば、「培養細胞実験ハンドブック」、株式会社羊土社、２００４年８月５日発行等を参照）、ＭＣＤＢ１５３基本培地〔ボイス（Ｂｏｙｃｅ Ｓ．Ｔ．）ら、ジャーナル オブ インベスティゲイティブ ダーマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）、第８１巻、第３３頁−第４０頁（１９８３）〕、ＭＣＤＢ１５２基本培地〔タサオ（Ｔｓａｏ Ｍ．Ｃ．）ら、ジャーナル オブ セルラー フィジオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、第１１０巻、第２１９頁−第２２９頁（１９８２）等を参照〕等が挙げられる。また、前記細胞がケラチノサイトである場合、前記培養条件は、目的に応じ、ケラチノサイトの生育に適した範囲の培養温度、ＣＯ2濃度等の条件であればよく、適宜設定することができる。前記培養温度は、例えば、ケラチノサイトを良好に生育させる観点から、好ましくは、３５℃〜３８℃、より好ましくは、３６．５℃〜３７．５℃の範囲の培養温度が選択することができる。また、前記ＣＯ2濃度は、例えば、ケラチノサイトを良好に生育させる観点から、０〜２０体積％、４〜６体積％の範囲のＣＯ2濃度が選択することができる。
【００２４】
前記ステップ（Ａ）において、前記被験物質の存在下での培養の場合、用いられる培地中に含まれる前記被験物質の濃度は、適宜設定することができる。ここで、例えば、被験物質による細胞への効果の度合いも併せて評価する場合、前記ステップ（Ａ）では、種々の濃度で被験物質を含有する複数種の培地を用いればよい。
【００２５】
また、前記ステップ（Ａ）において、細胞の培養時間は、例えば、前記細胞への被験物質の親和性、浸透性等を指標にして、適宜設定することができる。
【００２６】
前記実施態様１の方法では、次に、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射する〔ステップ（Ｂ）〕。
【００２７】
前記ステップ（Ｂ）では、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に対して、紫外線を照射するため、被験物質により、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができるかどうか、又は被験物質としての美白剤が紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生の抑制効果又は予防効果を発揮することができるかどうかを評価することができる。
【００２８】
前記ステップ（Ｂ）において、紫外線照射に先立ち、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞を、リン酸緩衝生理食塩水等で洗浄してもよい。前記ステップ（Ｂ）において、前記洗浄を行なうことは、被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生に対して、サンスクリーン効果とは異なる効果を発揮するかどうかを評価することができる点で有利である。
【００２９】
前記紫外線照射は、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂのいずれか単独での照射であってもよく、ＵＶ−ＡとＵＶ−Ｂとの同時での照射であってもよい。
【００３０】
また、細胞に対する紫外線の照射量は、目的に応じ、適宜設定することができる。
【００３１】
前記実施態様１の方法では、次に、前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価する〔ステップ（Ｃ）〕。
【００３２】
前記ステップ（Ｃ）において、前記ＥＬＡＭ−１の発現量は、例えば、前記ＥＬＡＭ−１に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット解析等の手法により相対的な値として測定することができる。なお、前記実施態様１の方法では、前記ステップ（Ａ）において、細胞として、ＥＬＡＭ−１を適切なタグと融合したタグ融合タンパク質として発現する細胞を用いてもよい。かかる細胞を用いた場合、前記ステップ（Ｃ）において、前記タグを検出する試薬等により、簡便に、細胞内における前記因子の発現量を測定することができる。
【００３３】
また、前記ステップ（Ｃ）において、前記核酸の発現量は、ＥＬＡＭ−１をコードする核酸に特異的な塩基配列からなるプローブ、前記核酸を特異的に増幅することができるプライマー対等を用いたリアルタイムＰＣＲ等に代表される核酸定量法、前記核酸又は前記核酸に相補的な核酸が固定された核酸アレイ（ｃＤＮＡアレイ等）を用いたハイブリダイゼーション法等により測定することができる。
【００３４】
前記ステップ（Ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、日焼け等の紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。
【００３５】
また、前記ステップ（Ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、日焼け等の紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の発生を抑制又は予防することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００３６】
また、本発明の美白剤の評価方法は、他の実施態様では、（ａ）ＥＬＡＭ−１を発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む方法である（実施態様２の方法）。
【００３７】
前記実施態様２の方法では、前記ステップ（ａ）は、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下での培養前の細胞に対して、紫外線を照射することを除き、前記実施態様１の方法におけるステップ（Ｂ）と同様に行なうことができる。
【００３８】
また、前記実施態様２の方法において、前記ステップ（ｂ）は、紫外線を照射した後の細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養することを除き、前記実施態様１の方法におけるステップ（Ａ）と同様に行なうことができる。かかるステップにおいては、ステップ（ａ）で得られた細胞を被験物質の存在下に培養する一方で、被験物質を用いない場合の対照として、ステップ（ａ）で得られた細胞を、前記被験物質の非存在下に培養することを除いて前記被験物質の存在下に培養された細胞の培養条件と同じ条件下に培養する。
【００３９】
前記ステップ（ｃ）では、前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現量又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価する。前記ＥＬＡＭ−１の発現量及び前記核酸の発現量は、前記実施態様１の方法におけるステップ（Ｃ）の場合と同様に測定することができる。
【００４０】
前記ステップ（ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。
【００４１】
また、前記ステップ（ｃ）では、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１又は前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００４２】
本発明の美白剤の評価方法は、さらに他の側面では、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価する方法である（実施態様３の方法）。
【００４３】
前記実施態様３の方法では、前記ＥＬＡＭ−１の生物学的活性は、例えば、ＥＬＡＭ−１とシアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡとの結合、ＥＬＡＭ−１と白血球との間の接着等を指標として測定することができる。
【００４４】
前記実施態様３の方法において、前記ＥＬＡＭ−１と、糖鎖リガンドであるシアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴解析等により測定することができる。前記表面プラズモン共鳴解析は、例えば、シアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡを固定化したチップに、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下に、ＥＬＡＭ−１を含有する溶液を一定の流速で送液し、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下の場合のＥＬＡＭ−１と、糖鎖リガンドであるシアリルルイスＸ又はシアリルルイスＡとの相互作用の有無及びその度合い（結合強度又は結合量）を検出すること等により行なわれる。かかる表面プラズモン共鳴解析では、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、かかる表面プラズモン共鳴解析では、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００４５】
また、前記実施態様３の方法において、例えば、ＥＬＡＭ−１と白血球との間の接着を指標とする場合、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、ＥＬＡＭ−１を表面に提示して発現する細胞を固定化した担体と、検出可能な標識物質で標識された白血球とを接触させ、担体上の細胞と接着した白血球の標識物質を検出して、接着の有無、接着の程度を測定すること等により評価することができる。
【００４６】
なお、本発明の美白剤の評価方法のなかでは、前記実施態様１の方法及び実施態様２の方法における核酸レベルでの発現量に基づく評価は、操作をより簡便に行なうことができる点で有利である。
【００４７】
本発明の美白剤の評価方法は、例えば、美白剤の品質等の評価、新たな美白剤のスクリーニング等を行なう際に利用することができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、ボタンピ抽出物についての「固体成分濃度」は、特に断りのない限り、ボタンピ抽出物から溶媒を留去して得られた乾燥物としての固体成分の量に換算した濃度を示す。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ケラチノサイト）〔商品名：ＮＨＥＫ（Ｆ） 新生児包皮表皮角化細胞、カスケード バイオロジックス（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）製、倉敷紡績株式会社供給〕を、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社製）２ｍｌが入った細胞培養プレートの各ウェルに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養した。
【００５０】
また、最終濃度が０．１体積％（固体成分濃度：０．０００２質量％）となるように、ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（商品名、倉敷紡績株式会社製）に添加し、ボタンピ抽出物含有ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地を得た。得られたボタンピ抽出物含有ＨｕＭｅＤｉａ−ＫＧ２培地２ｍｌを、前記細胞培養プレートの各ウェルに添加し、３７℃、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養することにより、ボタンピ抽出物処理を行なった。培養後、得られた正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により２ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射後、前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（商品名、倉敷紡績株式会社製）で、３７℃、ＣＯ2濃度：５体積％の条件で１０時間培養した。その後、前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を採取した。
【００５１】
商品名：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて、前記正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞から、全ＲＮＡを抽出した。次に、前記全ＲＮＡを鋳型とし、商品名：Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐ キット〔アギレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕を用いて、ｃＤＮＡを合成した。その後、標識試薬として、Ｃｙａｎｉｎｅ ３−ＣＴＰ、Ｃｙａｎｉｎｅ ５−ＣＴＰ〔パーキンエルマーインコーポレーテッド（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）製〕）を用いて、ｃＲＮＡを合成し、ついで、精製した。
【００５２】
（比較例１）
ボタンピ抽出物の非存在下で培養したこと（ボタンピ抽出物非処理）を除き、前記実施例１と同様に操作を行ない、ｃＲＮＡを得た。
【００５３】
（比較例２）
ボタンピ抽出物の非存在下で培養し（ボタンピ抽出物非処理）、かつ紫外線を照射しなかったこと（紫外線非照射）を除き、前記実施例１と同様に操作を行ない、ｃＲＮＡを得た。
【００５４】
（試験例１）
前記実施例１、比較例１及び比較例２それぞれで得られたｃＲＮＡを、ＤＮＡマイクロアレイ（商品名：Ｈｕｍａｎ １Ａ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に供し、その後、６０℃で１７時間インキュベーションして、それにより、ＤＮＡマイクロアレイ上のＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた。その後、前記ＤＮＡマイクロアレイを洗浄した。
【００５５】
洗浄後のＤＮＡマイクロアレイについて、アレイスキャナー〔商品名：ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ、アジレント テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕を用いて、前記標識に基づく蛍光シグナルを検出した。その後、前記蛍光シグナルの強度を数量化することにより、前記蛍光シグナルに対応する遺伝子の発現量を算出した。その結果の一例を表１に示す。表１におけるＥＬＡＭ−１発現相対値は、比較例２の場合の正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞中におけるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量に対する実施例１及び比較例１それぞれの場合の正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞中におけるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の相対値である。なお、表１におけるＥＬＡＭ−１発現相対値は、比較例２の場合の正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞中におけるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を１として算出した値である。
【００５６】
【表１】
【００５７】
前記表１の結果から、比較例２（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線非照射の条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値に比べ、比較例１（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値が大きくなることがわかる。したがって、紫外線の照射により、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の上昇が引き起こされることが示唆される。
【００５８】
しかしながら、前記表１の結果から、比較例１（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値に比べ、実施例１（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１発現相対値が小さくなることがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされるＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の上昇を抑制することができることが示唆される。
【００５９】
（実施例２）
ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を最終濃度５．０体積％（固体成分濃度：０．１質量％）となるようにリン酸緩衝生理食塩水に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
【００６０】
前記ボタンピ抽出物含有試料を、正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション（ＭａｔＴｅｋ ｃｏｒｐ．）製〕の皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養した。その後、得られた正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。洗浄後の正常ヒト三次元培養皮膚モデルに、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養した。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから表皮角化細胞（ケラチノサイト）を採取した。採取した表皮角化細胞を凍結組織切片作製用包埋剤〔商品名：ティッシュー・テック Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド、サクラファインテック株式会社製〕で包埋し、液体窒素で凍結させた。その後、得られた凍結包埋試料を、クライオスタットで薄切することにより、薄切切片を得た。得られた切片をスライドグラスにのせて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を得た。
【００６１】
（比較例３）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養し（ボタンピ抽出物非処理）、かつ紫外線を照射しなかったこと（紫外線非照射）を除き、前記実施例２と同様に操作を行ない、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を得た。
【００６２】
（比較例４）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養したこと（ボタンピ抽出物非処理）を除き、前記実施例２と同様に操作を行ない、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を得た。
【００６３】
（試験例２）
配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸をｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター〔プロメガ株式会社製〕のクローニングサイトに組み込んで得られた産物を鋳型とし、ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＰ６／Ｔ７）〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）製〕を用いてＰＣＲを行ない、蛍光標識プローブを作製した。
【００６４】
得られた蛍光標識プローブ（１ｍｇ／ｍＬ核酸相当量）を、前記実施例２、比較例３及び比較例４それぞれのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料に添加した。さらに、ハイブリダイゼーション緩衝液〔組成：５０体積％ 脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１ｍｇ／ｍＬ 酵母ｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｎ． ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商品名） Ｘ−１００〕９０μｌを、前記実施例２、比較例３及び比較例４それぞれのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料に添加した。その後、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を、６５℃で１６時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行なった。その後、４×ＳＳＣでパラフィルムを剥がし、２×ＳＳＣ／ホルムアミドで、６５℃で６０分、０．１×ＳＳＣで、６５℃で１２０分、ＭＡＢＴ（ｐＨ７．５）[組成：１００ｍＭマレイン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１体積％ Ｔｒｉｔｏｎ（商品名）Ｘ−１００]中、室温（２５℃）で５分インキュベーションし、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試料を洗浄した。得られた試料について、対比染色を行ない、光学顕微鏡下に観察した。実施例２のボタンピ抽出物含有試料を用いた場合の細胞におけるＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現の局在性を調べた結果を示す図面代用写真を図１に示す。図１中、パネル（Ａ）は、比較例３（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線非照射の条件）、パネル（Ｂ）は、比較例４（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）、パネル（Ｃ）は、実施例２（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の結果を示す。
【００６５】
図１のパネル（Ａ）の結果から、比較例３（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線非照射の条件）の場合の表皮角化細胞においては、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現が認められないことがわかる。一方、図１のパネル（Ｂ）の結果から、比較例４（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の表皮角化細胞においては、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現部位が全体にわたって多数存在することがわかる。したがって、表皮角化細胞においては、紫外線照射により、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現が全体にわたって引き起こされることが示唆される。
【００６６】
しかしながら、パネル（Ｃ）の結果から、実施例２（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の表皮角化細胞においては、比較例４（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合の表皮角化細胞〔パネル（Ｂ）〕に比べ、ＥＬＡＭ−１に対応するｍＲＮＡの発現部位の数は少なくなることがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされるＥＬＡＭ−１のｍＲＮＡの発現を抑制することができることが示唆される。また、前記ボタンピ抽出物含有試料は、ＥＬＡＭ−１の発現抑制剤として有用であることが示唆される。
【００６７】
（実施例３）
ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を最終濃度５．０体積％（固体成分濃度：０．１質量％）となるようにリン酸緩衝生理食塩水に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
【００６８】
得られたボタンピ抽出物含有試料を、正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション製〕の皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養した。その後、得られた正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。洗浄後の正常ヒト三次元培養皮膚モデルに、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養した。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから表皮角化細胞を採取した。
【００６９】
商品名：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアジェン社製）を用いて、前記表皮角化細胞から、全ＲＮＡを抽出した。次に、前記全ＲＮＡを鋳型として、商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ〔インビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００７０】
（比較例５）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養したこと（ボタンピ抽出物非処理）を除き、前記実施例３と同様に操作を行ない、ｃＤＮＡを得た。
【００７１】
（比較例６）
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養し（ボタンピ抽出物非処理）、かつ紫外線を照射しなかったこと（紫外線非照射）を除き、前記実施例３と同様に操作を行ない、ｃＤＮＡを得た。
【００７２】
（試験例３）
前記実施例３、比較例５及び比較例６それぞれのｃＤＮＡを鋳型として、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現を、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲにより解析した。
【００７３】
なお、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲのために用いるプライマーとして、ＴＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧ（配列番号：１）とＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧ（配列番号：２）とを用いた。また、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲのために用いるプローブとして、商品名：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ（キアジェン社製）を用いた。なお、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、５０℃で２分間でのインキュベーション、９５℃で１５分間のインキュベーション、変性：９４℃で１５秒とアニーリング：Ｔｍ−５℃で３０秒とエクステンション：７２℃３０秒とを１サイクルとする４０サイクルである。ＥＬＡＭ−１の核酸レベルにおける発現相対値を、比較例６のｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量に対する実施例３のｃＤＮＡ又は比較例５のｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における対応するＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の相対値として算出した。なお、前記ＥＬＡＭ−１の発現相対値は、比較例６のｃＤＮＡを用いて算出された表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を１として算出した値である。結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
前記表２の結果から、比較例５（ボタンピ抽出物非処理で、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現相対値に比べ、実施例３（ボタンピ抽出物処理を行ない、かつ紫外線照射を行なう条件）の場合のＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現相対値が小さくなることがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされるＥＬＡＭ−１のｍＲＮＡの発現量の上昇を抑制することができることが示唆される。
【００７６】
また、ボタンピ抽出物は、漢方薬として用いることができる、個体、組織又は細胞に対して負荷が実質的にかからない植物抽出物である。そのため、前記ボタンピ抽出物含有試料によれば、適用対象となる個体、組織、細胞等に実質的に負荷をかけることなく、個体、組織、細胞等におけるＥＬＡＭ−１により引き起こされる事象を緩和又は前記事象の発現を抑制することができる。
【００７７】
（実施例４）
ボタンピ抽出物（商品名：ボタンピ抽出液、製品番号：５０４５５５１１、丸善製薬株式会社製）を最終濃度１体積％（固体成分濃度：０．０４質量％）となるように、５０質量％エタノール水溶液に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
【００７８】
（試験例４）
前記実施例４のボタンピ抽出物含有試料を、年齢２４歳〜４０歳の１２名の被験者（実験番号１〜１２）の上腕内側部に、１日３回、１週間にわたって塗布した。また、対照として、５０質量％エタノール水溶液を、前記と同様に、１２名の被験者（実験番号１〜１２）の上腕内側部に、１日３回、１週間にわたって塗布した。その後、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位及び前記対照の塗布部位に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により、１ＭＥＤ相当の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射１週間後、色差計（株式会社村上色彩技術研究所製、ＣＭＳ−１２００）を用いて、紫外線照射部位の皮膚色のＬ*値及び紫外線非照射部位の皮膚色のＬ*値を測定した。次に、式（Ｉ）：
【００７９】
【数１】
【００８０】
に従って、前記Ｌ*値から、ΔＬ*値を算出した。さらに、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位におけるΔＬ*値と前記対照の塗布部位におけるΔＬ*値とから、式（II）：
【００８１】
【数２】
【００８２】
に従って、色素沈着抑制率（％）を求めた。結果を表３に示す。表中、ΔＬ*の値が大きいほど色素沈着の程度が強いことを示す。また、表中、「試料」は、ボタンピ抽出物含有試料を示し、「対照」は、５０質量％エタノール水溶液を示す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
表３の結果から、前記実施例４で得られたボタンピ抽出物含有試料を塗布した場合、対照を塗布した場合に比べ、ほとんどの被験者において、ΔＬ*値が減少することがわかる。したがって、ボタンピ抽出物含有試料によれば、紫外線の照射により引き起こされる色素沈着を抑制することができることが示唆される。
【００８５】
また、本試験例４の結果と、前記試験例１〜３それぞれの結果とから、紫外線の照射により発現量が上昇するＥＬＡＭ−１の発現が抑制されるか否かを調べることによって、美白剤のスクリーニング又は前記美白剤の品質、性質等の評価を行なうことができることが示唆される。
【００８６】
（試験例５）
前記実施例４で得られたボタンピ抽出物含有試料を、１２名の被験者（実験番号１３〜２４）の上腕内側部に、１日３回、１週間にわたって塗布した。その後、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により、１ＭＥＤ相当の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射２４時間後、レーザードップラー血流量計〔商品名：ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭ３、プレイメド（ＰＲＥＩＭＥＤ）社製〕を用いて、レーザードップラー法により、紫外線照射部位における血流量を測定した。なお、対照として、前記実施例４で得られたボタンピ抽出物含有試料に代えて、５０質量％エタノール水溶液を用いて、前記と同様に操作を行ない、血流量を測定した。さらに、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位における血流量と前記対照の塗布部位における血流量とから、式(III)：
【００８７】
【数３】
【００８８】
に従って、血流量増加抑制率（％）を求めた。結果を表４に示す。表中、「試料」は、ボタンピ抽出物含有試料を示し、「対照」は、５０質量％エタノール水溶液を示す。
【００８９】
【表４】
【００９０】
表４の結果から、前記実施例４で得られた試料を塗布した場合、対照を塗布した場合に比べ、ほとんどの被験者において、血流量が減少することがわかる。したがって、ボタンピ抽出物によれば、紫外線の照射により引き起こされる血流量の増加を抑制することができることが示唆される。
【００９１】
また、本試験例５の結果と、前記試験例１〜４それぞれの結果とから、紫外線の照射により発現量が上昇するＥＬＡＭ−１の発現が抑制されるか否かを調べることによって、美白剤のスクリーニング又は前記美白剤の品質、性質等の評価を行なうことができることが示唆される。
【００９２】
（実験例１）
被験物質をリン酸緩衝生理食塩水に添加し、被験物質含有試料を得る。
【００９３】
正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション製〕に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射する。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養する。その後、前記被験物質含有試料を、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルの皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養する。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから被験対象の表皮角化細胞を採取する。次に、得られた表皮角化細胞から、被験対象の無細胞抽出物を調製する。
【００９４】
紫外線を照射せず、被験物質の非存在下で培養することを除き、同様に、対照無細胞抽出物を得る。
【００９５】
前記被験対象の無細胞抽出物及び前記対照の無細胞抽出物について、商品名：ＲａｙＢｉｏ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ〔レイバイオテック インコーポレーション（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ.）製〕を用いて、ＥＬＩＳＡを行なう。
【００９６】
次に、ＥＬＡＭ−１に対応するシグナル強度に基づき、前記ＥＬＡＭ−１の発現相対値を、対照無細胞抽出物を用いて求められた表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量に対する被験対象の無細胞抽出物を用いて求められた表皮角化細胞中における対応するＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量の相対値として算出する。なお、前記ＥＬＡＭ−１の発現相対値は、対照無細胞抽出物を用いて算出された表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１のポリペプチドレベルでの発現量を１として算出した値である。
【００９７】
その結果、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【００９８】
（実験例２）
被験物質をリン酸緩衝生理食塩水に添加し、被験物質含有試料を得る。
【００９９】
正常ヒト三次元培養皮膚モデル〔商品名：正常ヒト３次元モデル（製品名：ＭＥＬ−３００Ｂキット）、マテックコーポレーション製〕に、ＵＶ−Ｂランプ（型名：ＧＬ２０ＳＥ、三共電機株式会社製）により１０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線量の紫外線を照射する。紫外線照射後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で１０時間培養する。その後、前記被験物質含有試料を、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルの皮膚モデルカップ内に添加し、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルを、３７℃で、ＣＯ2濃度：５体積％で２４時間培養する。その後、前記正常ヒト三次元培養皮膚モデルから表皮角化細胞（ケラチノサイト）を採取する。次に、前記実施例３と同様に、被験対象のｃＤＮＡを得る。
【０１００】
紫外線を照射せず、被験物質含有試料の非存在下で培養することを除き、被験対象のｃＲＮＡの場合と同様に操作を行ない、対照ｃＤＮＡを得る。
【０１０１】
前記被験対象のｃＤＮＡ及び対照ｃＤＮＡを鋳型として、前記試験例３と同様に、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲにより、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を測定する。次に、ＥＬＡＭ−１の核酸レベルにおける発現相対値を、対照ｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量に対する被験対象のｃＤＮＡを用いて求められた表皮角化細胞中における対応するＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量の相対値として算出する。なお、前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルにおける発現相対値は、対照ｃＤＮＡを用いて算出された表皮角化細胞中における前記ＥＬＡＭ−１の核酸レベルでの発現量を１として算出した値である。
【０１０２】
その結果、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１をコードする核酸の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【０１０３】
（実験例３）
紫外線照射と被験物質含有試料の存在下での培養との順番を逆にしたことを除き、前記実験例１と同様に、ＥＬＩＳＡにより、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量（ポリペプチドレベル）と、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量（ポリペプチドレベル）とを比較する。
【０１０４】
その結果、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量に比べて、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ＥＬＡＭ−１の発現量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和又は治療することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【０１０５】
（実験例４）
商品名：ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ１００〔ビアコア株式会社製〕を用いて、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下での可溶化Ｅ−セレクチン標品と、シアリルルイスＸとの間の相互作用及びその度合い（結合強度）を解析する。
【０１０６】
その結果、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質を、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する美白剤の候補物質として選別することができる。また、被験物質の非存在下の場合の結合強度又は結合量に比べて、前記被験物質の存在下の場合の結合強度又は結合量が減少していることを指標として、当該被験物質が、紫外線による皮膚炎症若しくは皮膚障害の症状を緩和することができ、皮膚を美白化する品質を有する物質であることを評価することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】
配列番号：１は、ＥＬＡＭ−１用増幅プライマーの配列である。
配列番号：２は、ＥＬＡＭ−１用増幅プライマーの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記Ｅ−セレクチンの発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法。
【請求項２】
前記細胞が、ケラチノサイトである請求項１記載の美白剤の評価方法。
【請求項３】
（Ａ）被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、Ｅ−セレクチンを発現する細胞を培養するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む請求項１又は２記載の美白剤の評価方法。
【請求項４】
（ａ）Ｅ−セレクチンを発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む請求項１又は２記載の美白剤の評価方法。
【請求項５】
被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法。
【請求項１】
被験物質の存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるＥ−セレクチンの発現又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記Ｅ−セレクチンの発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法。
【請求項２】
前記細胞が、ケラチノサイトである請求項１記載の美白剤の評価方法。
【請求項３】
（Ａ）被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、Ｅ−セレクチンを発現する細胞を培養するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む請求項１又は２記載の美白剤の評価方法。
【請求項４】
（ａ）Ｅ−セレクチンを発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞におけるＥ−セレクチンの発現量又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記Ｅ−セレクチン又は前記Ｅ−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む請求項１又は２記載の美白剤の評価方法。
【請求項５】
被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、Ｅ−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記Ｅ−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１７７７１０（Ｐ２０１２−１７７７１０Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２５７７５（Ｐ２０１２−１２５７７５）
【出願日】平成２４年６月１日（２０１２．６．１）
【分割の表示】特願２００７−１９９６５６（Ｐ２００７−１９９６５６）の分割
【原出願日】平成１９年７月３１日（２００７．７．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月１日に掲載されたホームページ ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２７／ｐｃ／ｉｐｄｆｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｉ＝３８７３において発表
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月１日（２０１２．６．１）
【分割の表示】特願２００７−１９９６５６（Ｐ２００７−１９９６５６）の分割
【原出願日】平成１９年７月３１日（２００７．７．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月１日に掲載されたホームページ ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２７／ｐｃ／ｉｐｄｆｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｉ＝３８７３において発表
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
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