耐熱性リパーゼ遺伝子、耐熱性リパーゼ、耐熱性リパーゼ発現ベクター、組み換え生物、耐熱性リパーゼの発現方法、耐熱性リパーゼの反応方法、および耐熱性組成物
【課題】耐熱性に優れたリパーゼを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、長時間高温環境下（９０℃において５分以上）で加熱した場合にも、依然として残存活性を有する、アスペルギルス・オリゼ由来の、耐熱性リパーゼとその遺伝子、およびその発現方法。さらに、該リパーゼを用いる、反応方法と、組成物。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、長時間高温環境下（９０℃において５分以上）で加熱した場合にも、依然として残存活性を有する、アスペルギルス・オリゼ由来の、耐熱性リパーゼとその遺伝子、およびその発現方法。さらに、該リパーゼを用いる、反応方法と、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性リパーゼ遺伝子、耐熱性リパーゼ、耐熱性リパーゼ発現ベクター、組み換え生物、耐熱性リパーゼの発現方法、耐熱性リパーゼの反応方法、および耐熱性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、その重要性から主として食品加工関連の酵素として使用されてきた。トリグリセリドからの脂肪酸の製造、化粧品の基材としてのモノグリセリドの製造、水中油型乳化剤としての利用、食品フレーバーの改質、飼料の製造、卵加工品への応用など、リパーゼの用途は様々である。特に、食品加工では、熱をかけて製品を作ることが非常に多く、数多くの耐熱性リパーゼの報告または特許出願がされてきた。リパーゼの供給源としては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの細菌類や、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などの糸状菌が報告されている。
【０００３】
特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ：麹菌、ニホンコウジカビとも呼ばれる。以下Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属は「Ａ．」と略す）は、古来から日本酒や味噌、醤油といった発酵食品の製造に使用されている微生物であり、安全な菌である。そのため、数多くの研究が精力的になされてきた。にもかかわらず、アスペルギルス・オリゼ由来のリパーゼの利用は非常に限られており、麹の製造や発酵エキスの抽出、化粧料などに使用されているだけである。
【０００４】
リパーゼを用いた技術として、たとえば、光合成細菌であるＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＮＡＴのリパーゼを用いて４５〜５５℃の排水を処理する方法が報告されている（特許文献１）。また、リパーゼに金コロイドとＰＥＧ−ポリ（メタクリル酸−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）を加えてナノリパーゼ複合体を形成することにより、リパーゼに耐熱性を付与する方法が報告されている（特許文献２）。
【０００５】
また、糸状菌であるＦｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍのリパーゼをアスペルギルス・オリゼで発現させることにより、バイオディーゼルの生産に応用する技術が報告されている（非特許文献１）。また、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）の耐熱性を有するリパーゼが報告されている（非特許文献２）。また、アスペルギルス・オリゼのリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１７２５４４号公報
【特許文献２】特開２００８−０９２８１６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８年、８１巻、４号、Ｐ．６３７−６４５
【非特許文献２】Ｌｉｐｉｄｓ ２０００年、３５巻、５号、Ｐ．４９５−５０２
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９年、６３巻、５号、８２０−８２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、リパーゼは、加熱による機能の低下が著しい酵素として従来から知られている。具体的には、リパーゼは一般的に、６０℃で１０分間加熱すると完全に失活してしまう酵素として知られている。
【０００９】
たとえば特許文献１のリパーゼでは、５５℃を超える温度で酵素が活性を有するかどうかについては知られていなかった。さらに、特許文献１のリパーゼでは、５５℃を超える温度でインキュべートした場合に、リパーゼが活性を保持できるかどうかについても知られていなかった。また、特許文献２のナノリパーゼ複合体では、複合体を形成するためにコストや手間がかかるのが問題であった。さらに、特許文献２のナノリパーゼ複合体では、６０℃を超える温度に対して耐熱性があるかどうかも知られていなかった。
【００１０】
また、非特許文献１および非特許文献３のリパーゼでは、耐熱性を有するという性質は知られていなかった。また、非特許文献２のリパーゼは、５０℃を超える温度でインキュべートすると、急激に酵素の活性が低下してしまうという問題があった。
【００１１】
このように、従来のリパーゼでは、耐熱性が十分ではなかったため、生成物の収率低下や新しい酵素の再添加の必要性を招き、歩留まりの低さやコスト高の原因となっていた。そこで、長時間高温環境下にさらされても依然として酵素活性を有するような、従来よりも耐熱性に優れたリパーゼを生産する技術が求められている。
【００１２】
本発明はこうした状況に鑑みてなされており、その目的とするところは、耐熱性に優れたリパーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明のある態様の耐熱性リパーゼ遺伝子は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列をコードし、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％を上回るアミノ酸配列。
【００１４】
この態様によると、耐熱性に優れたリパーゼを提供することができる。
【００１５】
なお、本発明で「残存活性を有する」とは、加熱後さらにリパーゼ反応に使用しうる程度に活性が残存していることをいい、通常約１０％以上、好ましくは約１５％以上、さらに好ましくは約２０％以上の活性を有していることをいう。
【００１６】
本発明の別の態様は、耐熱性組成物である。この耐熱性組成物は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有し、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する耐熱性リパーゼを含有する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％以上であるアミノ酸配列。
【００１７】
この態様によると、耐熱性に優れた耐熱性組成物を提供することができる。
【００１８】
なお、上述した各要素を適宜組み合わせたものも、本件特許出願によって特許による保護を求める発明の範囲に含まれうる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、耐熱性に優れたリパーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＯ６０遺伝子群の系統関係を示す分子系統樹を示す図である。
【図２】ＡＯ６０遺伝子群のアラインメントを示す図である。
【図３】薄層クロマトグラフィーによるリパーゼＬｉｐ６０の天然基質に対する反応性を示す図である。
【図４】本発明のリパーゼＬｉｐ６０を、バッファーの種類を変えて相対活性を比較した結果を示すグラフである。
【図５】本発明のリパーゼＬｉｐ６０の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図６】本発明のリパーゼＬｉｐ６０を所定の温度でインキュべートした時間と残存活性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００２２】
ＡＯ６０遺伝子は、アスペルギルス・オリゼの１番染色体上に存在する遺伝子であり、配列番号１に示す８３４塩基のコード領域（２７７アミノ酸）を有する遺伝子である。しかし、ＡＯ６０遺伝子の機能、およびＡＯ６０遺伝子から作られる配列番号２に示すタンパク質の機能は未知であった。本発明では、機能が未知であったＡＯ０９０００９００００６０遺伝子（以下「ＡＯ６０遺伝子」と呼ぶ）から生産されるタンパク質が、リパーゼ活性を有することを明らかにした。そこで、ＡＯ６０遺伝子から生産されるタンパク質を、リパーゼＬｉｐ６０と命名した。
【００２３】
また、本発明では、リパーゼＬｉｐ６０は、従来知られていた耐熱性リパーゼに比べ、はるかに高い耐熱性を有することを明らかにした。アスペルギルス・オリゼが生産するリパーゼは約１９０種類存在すると予想されていたが、本発明では、これまでに報告されていない極めて熱に対する安定性が高いリパーゼを見いだした。本発明では、この性質を利用し、耐熱性の高いリパーゼを非常に多く生産することができるベクターおよび組み換え生物を発明した。また、その組み換え生物から効率的に高純度で耐熱性リパーゼを精製する方法を発明した。また、本発明の耐熱性リパーゼを発現させるための方法および反応方法も発明した。また、本発明の耐熱性リパーゼを含有する耐熱性組成物も発明した。
【００２４】
なお、本発明では、特に明記しない限り、ＡＯ６０遺伝子およびそれと相同性のある遺伝子をまとめて「ＡＯ６０遺伝子群」と総称し、ＡＯ６０遺伝子群がコードするリパーゼをまとめて「リパーゼＬｉｐ６０群」と総称する。以下、ＡＯ６０遺伝子およびリパーゼＬｉｐ６０を中心に説明するが、これらはＡＯ６０遺伝子群の他の遺伝子およびリパーゼＬｉｐ６０群の他のリパーゼ、さらに本発明では記載しないこれらと相同性のある遺伝子およびリパーゼに関しても同様に適用可能である。
【００２５】
（リパーゼＬｉｐ６０発現ベクター）
ＡＯ６０遺伝子群から生産されるリパーゼＬｉｐ６０群は、たとえば野生型のアスペルギルス・オリゼでは、ウェスタンブロッティング法などの手法によって検出することが困難である。つまり、野生型のアスペルギルス・オリゼではＡＯ６０遺伝子の発現量が非常に少ないため、野生型のままではリパーゼＬｉｐ６０をリパーゼ反応に効率的に利用することが非常に困難である。
【００２６】
そこで、本発明では、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）などにより増幅したＡＯ６０遺伝子群のＤＮＡをベクターに組み込み、それを形質転換によって細胞内に導入し、ＡＯ６０遺伝子群の発現量を上昇させることにより、高純度のリパーゼＬｉｐ６０群を容易かつ大量に得るシステムを構築した。
【００２７】
ＡＯ６０遺伝子群のＤＮＡを挿入し、リパーゼＬｉｐ６０群を発現させるためのベクターは、細胞系のベクターであってもよく、また無細胞系のベクターであってもよい。大量にリパーゼＬｉｐ６０群を必要とする場合には、コストの観点から、細胞系を使用してリパーゼＬｉｐ６０群の生産を行うことが好ましい。また、細胞系のベクターの場合、染色体組み込み型であってもよく、染色体に組み込まれないプラスミド型であってもよい。ベクターは、使用する系や生物種によって適宜選択することができる。さらに、ＡＯ６０遺伝子群の発現量を飛躍的に上昇させるために、ベクターは、高発現量のプロモーターを有することが好ましい。本発明では、核組み込み型で高発現量のプロモーターを有する麹菌用小型化高発現ベクターであり、ｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＮＥＮ１４２（大関酒造：特開平９−９９６８参照）を使用した。ｐＮＥＮ１４２は、アスペルギルス・オリゼなどの麹菌だけではなく大腸菌にも使用できるシャトルベクターであるため、特に有利である。
【００２８】
まず、ベクターに組み込むためのＡＯ６０遺伝子群のＤＮＡを調製する必要がある。たとえば、アスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子の場合、ＡＯ６０遺伝子のコード領域のそれぞれわずかに上流と下流にプライミングする５−ＡＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＣ−３および５−ＧＣＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＴＡＣ−３というプライマーセットを使用し、ＰＣＲを行うことができる。ポリメラーゼとして、たとえばＥｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を使用し、９４℃３分→（９８℃１０秒→５１℃４５秒→７２℃２分）×３０サイクル→７２℃４分というサイクルでＰＣＲを行うことができる。また、ＰＣＲには、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法も利用することができる。
【００２９】
次に、得られたＰＣＲ産物およびベクターをライゲーションする。ＰＣＲ産物をそのままＴベクターなどに組み込むこともできるが、ライゲーションに先立ち、得られたＰＣＲ産物およびベクターを制限酵素にて切断し、両末端をベクターに組み込めるような形にするのがより好ましい。制限酵素は、ＰＣＲ産物とベクターの間でライゲーションが行えるように適宜選択することができる。たとえば上述のプライマーセットを使用する場合、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩ（タカラバイオまたはＴＯＹＯＢＯ）という２つの制限酵素を用いて、ＰＣＲ産物を上記プライマー中の認識部位において切断し、ｐＮＥＮ１４２をマルチクローニングサイトにおいて切断することにより、互いに相補的な切断部位を形成することができる。反応条件は、たとえば３７℃で８時間とすることができる。
【００３０】
上述のＰＣＲ後と制限酵素処理後には、ＤＮＡをカラムで精製することが好ましい。このようなカラムとしては、たとえばＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を使用することができる。
【００３１】
また、制限酵素処理後のＤＮＡとベクターとをライゲーションする前に、セルフライゲーションを防止するために脱リン酸化処理を行うのが好ましい。脱リン酸化処理は、たとえばＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ）を用いて３７℃３０分→６５℃１５分という条件で反応を行うことができる。
【００３２】
次に、制限酵素処理後のＰＣＲ産物（ＡＯ６０遺伝子領域のＤＮＡ）と、制限酵素処理後のｐＮＥＮ１４２とをライゲーションする。これにより、耐熱性リパーゼ発現ベクター（以下ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を得ることができる。ライゲーション反応には、たとえばＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を使用することができる。反応条件は、たとえば１６℃で３時間とすることができる。また、ライゲーション反応後の産物に対し、エタノール沈殿を行うことが望ましい。エタノール沈殿は、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．などに記載されている方法を利用することができる。
【００３３】
ライゲーションされなかったｐＮＥＮ１４２やＰＣＲ産物をさらに除去することにより、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２をより高純度で大量に取得することが好ましい。たとえば、ライゲーション反応産物を大腸菌に形質転換し、培養することにより、高純度なＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２を増幅することができる。具体的には、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）を用いて大腸菌ＪＭ１０９ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）へエレクトロポレーション法により形質転換を行うことができる。反応条件は、たとえば２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωとすることができる。
【００３４】
次に、形質転換後の大腸菌を培養し、大腸菌から耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を回収する。たとえば、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓを、ＬＢ液体培地で３７℃において振とう培養した後、アンピシリン入りのＬＢ培地に塗布し、３７℃で２４時間静置培養することができる。その後、大腸菌からＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２を回収する。たとえば、ＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２を回収してもよい。なお、アンピシリン入りのＬＢ培地で培養後にポジティブコロニーの選別をより効率的に行うために、コロニーＰＣＲ法を使用するのが好ましい。
【００３５】
以上の手順により、従来よりもはるかに高い耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０群を大量に発現させるための耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を簡便かつ効率的に得ることができる。
【００３６】
（形質導入）
細胞系の場合、得られた耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を細胞内に形質導入することにより、リパーゼＬｉｐ６０群を大量に発現させることができる。生物種は適宜選択することができるが、生育性や取り扱いやすさの観点から、単細胞である菌類が好ましい。発現量と安全性の観点から、アスペルギルス・オリゼを使用することが特に好ましい。また、形質導入の方法は適宜選択することができるが、たとえばアスペルギルス・オリゼなどの糸状菌の場合には、プロトプラスト−ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）法を用いるのが好ましい。
【００３７】
アスペルギルス・オリゼへの形質導入にプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いる場合、たとえば以下の方法により形質導入をすることができる。つまり、まずアスペルギルス・オリゼに対し、ＹａｔａｌａｓｅＴＭ（タカラバイオ）を用いて細胞壁溶解処理を行う。具体的には、ＹＰＤ液体培地２００ｍｌ中にアスペルギルス・オリゼ（ＲＩＢ４０株：産業技術総合研究所）のｎｉａＤ遺伝子破壊株であるｎｉａＤ４００株（産業技術総合研究所）を植菌し、１００ｒｐｍ、３７℃で２０時間振とう培養する。次に、ガラスフィルター１７Ｇ１（柴田科学）を用いて培養液を濾過する。集まった菌をガラスフィルター１７Ｇ１内で滅菌水とＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を用いて洗浄する。洗浄後の菌を滅菌した薬さじなどで軽く押し、脱水する。次に、菌をチューブへ移し、ＹａｔａｌａｓｅＴＭの反応液３０ｍｌを加え、４０℃で３時間振とうさせ反応させる。
【００３８】
ＹａｔａｌａｓｅＴＭで反応させた後、上述のガラスフィルター１７Ｇ１を用いて培養液を濾過する。この際、ガラスフィルター１７Ｇ１を通過した液体をチューブに回収し、３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てる。次に、沈殿にＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を加えて懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てる。次に、沈殿に溶液１（ＮａＣｌ ４６．７５ｇ、１ＭのＣａＣｌ２ １０ｍｌ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍｌを蒸留水で１０００ｍｌに調整したもの）を１０ｍｌ加えて懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てる、という操作を２度行う。次に、沈殿に溶液１を５ｍｌ加えて懸濁し、懸濁液１を得る。懸濁液１から４０μｌを別のチューブに移す。懸濁液４０μｌ分に対し、ＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を９６０μｌ加えて懸濁し、懸濁液２を得る。
【００３９】
次に、懸濁液２から約１０μｌを分注し、血球検査盤と顕微鏡を用いて菌体量を測定する。その濃度に応じ、懸濁液１に溶液１を加えるか、再度遠心を行って加える溶液の量を前回より少なくするかすることにより、菌濃度が２．５×１０８／ｍｌの懸濁液３を得る。この懸濁液３に、懸濁液３の全量の１／４の溶液２（ＰＥＧ４０００ ４０ｇ、１ＭのＣａＣｌ２ ５ｍｌ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ５ｍｌを蒸留水で１００ｍｌに調整したもの）を加える。形質転換効率をさらに向上させるために、この後に４℃で約２０時間インキュベートするのが好ましい。
【００４０】
次に、懸濁液３から２００μｌずつ別のチューブに分注し、上述の耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）の溶液１０μｌを加えて混合し、氷中で１時間インキュベートする。次に溶液２を１ｍｌ加えて懸濁し、室温で２０分間インキュベートする。その後、懸濁液を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を完全に除去する。次に、沈殿にＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を１０ｍｌ加えて懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を除去する。沈殿にＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を４００μｌ加え、懸濁する。
【００４１】
懸濁液を、ＣＤプレート培地（１０×ＣＤ ５０ｍｌ、グルコース１０ｇ、ＮａＮＯ３ １．５ｇ、ＮａＣｌ ２３．３８ｇ、 Ａｇｅｒ粉末 ７．５ｇを滅菌水で５００ｍｌにメスアップしたもの。ただし、１０×ＣＤは、ＫＣｌ １０ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．５ｇ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇを滅菌水で５００ｍｌにメスアップし、ｐＨを５．５に調整したもの）上に均一に塗布し、３０℃で約９６時間培養する。得られたコロニーに関し、ＣＤプレート培地を用いて４回継代培養を繰り返し、リパーゼＬｉｐ６０生成菌のコロニーを得る。これにより、従来のリパーゼよりもはるかに耐熱性の高いリパーゼＬｉｐ６０を大量に生産するリパーゼＬｉｐ６０生成菌（組み換え生物）を効率的に得ることができる。
【００４２】
なお、得られたリパーゼＬｉｐ６０生成菌のコロニーから、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などを用いてＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲを行うことにより、目的のＤＮＡを有するどうかを確認するのが好ましい。反応には、たとえばＡＯ６０遺伝子の塩基配列上に設計したプライマーを使用してもよい。ＰＣＲは、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法を利用することができる。
【００４３】
また、ｐＮＥＮ１４２のような染色体組み込み型のベクターを使用した場合、ＡＯ６０遺伝子群が染色体に組み込まれているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認してもよい。サザンハイブリダイゼーションには、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．などに記載されている方法を利用することができる。
【００４４】
（タンパク質の精製）
得られたリパーゼＬｉｐ６０生成菌から、リパーゼＬｉｐ６０の回収を行う。まず、リパーゼＬｉｐ６０の酵素抽出液を回収する。具体的には、たとえば得られたリパーゼＬｉｐ６０生成菌を液体のＹＰＤ培地（２００ｍｌ、ｐＨ５．５）を用いて１００ｒｐｍ、３０℃で約７２時間培養し、アスピレーターとガラスフィルター１７Ｇ１を用いて菌体とＹＰＤ培地とを分離する。これにより、菌体を菌体内酵素抽出液として、ＹＰＤ培地を菌体外酵素抽出液として回収する。
【００４５】
リパーゼＬｉｐ６０を後述の汚染物質の分解などの用途に用いる場合には、リパーゼＬｉｐ６０生成菌などの組み換え生物の状態で使用することもできるし、上述の菌体内酵素抽出液または菌体外酵素抽出液の少なくとも一方を使用することもできる。また、タンパク質の全活性を飛躍的に高めるために、リパーゼＬｉｐ６０生成菌を２４時間より長く培養するのが好ましい。また、タンパク質の全活性をさらに高め、かつ全タンパク質量も増大させるために、リパーゼＬｉｐ６０生成菌を４８時間よりも長く培養することがさらに好ましい。
【００４６】
菌体外酵素抽出液からタンパク質を分画するには、硫安分画（塩析）、溶液組成の変化による分離法、ショ糖密度勾配遠心分離法、クロマトグラフィーなどの種々の方法を使用することができる。たとえば硫安分画でタンパク質を分画する場合、まず硫安分画濃度早見表を基準に目的の濃度となる硫酸アンモニウムを計量し、乳鉢で細かくすりつぶす。ＹＰＤ培養液２００ｍｌに２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を３００ｍｌ加え、４℃で撹拌しながらすりつぶした硫酸アンモニウムの粉末を溶け残りが出ないようにゆっくりと加える。その後、４℃で１時間以上インキュべートする。次に、１００００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、タンパク質を回収する。硫酸アンモニウムの濃度をたとえば１〜３０％、３０〜６０％、６０〜８５％と濃度を変えて分画を複数回行う場合には、タンパク質沈殿物を回収後、所望の濃度に達するまで、菌体外酵素抽出液に再び硫酸アンモニウムを加える。回収したタンパク質沈殿物に２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を４０ｍｌ加え、酵素液１として回収する。リパーゼＬｉｐ６０の場合、たとえば、６０％の硫酸アンモニウム濃度において沈殿させることができる。なお、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を使用することもできる。
【００４７】
回収した酵素液１の脱塩処理を行うために、透析を行うことが好ましい。透析は、たとえば以下のように行うことができる。まず２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を約１２Ｌ作成し、最終濃度が約１ｍＭになるように塩化カルシウムを加え、４℃に冷却する。また、透析チューブを切り、蒸留水に約１時間浸すことにより、透析チューブに付着していたグリセロールなど除去する。その後、透析チューブの内部を蒸留水で洗浄し、チューブの一端をストッパーを用いて塞ぐ。次に、ガラス漏斗を使用し、内部に酵素液１を入れ、穏やかに撹拌させながら透析を行う。透析後の酵素液は、酵素液２として回収する。酵素液２をチューブなどに入れ、−８０℃で６時間以上置き、完全に凍結させる。その後、容器に空気の流通ができるようにしてから凍結乾燥瓶に入れ、凍結乾燥機にかけ、乾燥させる。
【００４８】
乾燥後の酵素液２からリパーゼＬｉｐ６０を精製するためには、種々の方法を使用することができる。たとえば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどを使用することができる。高い収率で高純度のリパーゼＬｉｐ６０を精製するためには、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを使用することがより好ましい。また、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を利用することもできる。
【００４９】
リパーゼＬｉｐ６０を精製するために陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する場合、担体としてたとえばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ（東ソー）を使用することが好適である。アスペルギルス・オリゼのリパーゼＬｉｐ６０は等電点が４．７４である。そのため、具体的にはまず、ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍを２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて平衡化する。平衡化されたＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍをカラム（２．５×４０ｃｍ ガラスエコノカラム：ＢｉｏＲａｄ製）に充填させる。充填後、カラムクロマトグラフィー装置（エコノグラジエントカラム：ＢｉｏＲａｄ製）へカラムおよびアダプターをセットし、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を流速５ｍｌ／分で担体であるＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍの３倍量以上流し、担体の洗浄と平衡化を行う。
【００５０】
次に、流速２ｍｌ／分で乾燥後の酵素液２を流し、ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍにタンパク質（リパーゼＬｉｐ６０）を吸着させる。その後、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）をＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍの３〜５倍量流し、カラム内を洗浄する。その後、流速１ｍｌ／分で流出バッファー（５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に１Ｍの硫酸アンモニウムを加えたものを０〜１００％の濃度勾配で使用）を流し、５ｍｌずつ８０本のチューブにフラクションを回収する。なお、流速２．５ｍｌ／分、フラクションは５ｍｌずつ回収、流出バッファーとして、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に０．５Ｍの硫酸アンモニウムを加えたものを０〜１００％の濃度勾配で使用するという条件であれば、より高収率かつ高純度でリパーゼＬｉｐ６０を精製することが可能である。
【００５１】
また、リパーゼＬｉｐ６０を精製するためにゲルろ過クロマトグラフィーを使用する場合、担体としてたとえばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲ（ＧＥヘルスケア）を使用することが好適である。具体的には、まず、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００を５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄し、平衡化を行う。次に、カラム（１．５ｃｍ×１００ｃｍ ガラスエコノカラム：ＢｉｏＲａｄ製）に充填を行う。まず、ブルーデキストランを含む既知タンパク質分子量マーカー（７５０００、４４０００、２９０００、１３７００、６５００（Ｄａ））を分画させ、検量線を作成する。１ｍｌのサンプルが完全に担体内に入ったことを確認してから、流出バッファーを１ｍｌ加える。流出バッファーは、５０ｍＭ酢酸バッファーに０．１５Ｍ塩化ナトリウムを加えたものを使用してもよい。その後、カラムをポンプに接続して流速１ｍｌ／ｍｉｎで流出バッファーを流す。６０ｍｌ程流出させた後、１ｍｌずつ８０本のフラクションを回収する。
【００５２】
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する場合にもゲルろ過クロマトグラフィーを使用する場合にも、回収後の各フラクションについて、吸光度計を用いて２８０ｎｍの波長で吸光度の測定を行い、タンパク質量の測定を行う。また、各フラクションに関してリパーゼ活性の測定も行い、回収後のタンパク質と酵素活性の関係を示すグラフを作成することにより、リパーゼＬｉｐ６０が含まれているフラクションを同定する。以上の手順により、精製されたリパーゼＬｉｐ６０を効率的かつ高純度で回収することができる。具体的には、たとえば表１のような収率で高純度なリパーゼＬｉｐ６０を精製することが可能である。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１は、粗酵素液、６０％の硫安分画後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍで精製後、およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲで精製後のリパーゼＬｉｐ６０の活性や収率をあらわす。ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍでは６０％の硫安分画よりも比活性の高いリパーゼＬｉｐ６０を高い収率で得ることができる。また、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲでは、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍに比べて収率は低いが、比活性が著しく高く、極めて高純度のリパーゼＬｉｐ６０を得ることができる。
【００５５】
（電気泳動）
精製後のリパーゼＬｉｐ６０の電気泳動には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用することができる。たとえば、レディーゲルＪ １２．５％（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定電圧（２００Ｖ）で電気泳動を行うことができる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を利用することができる。
【００５６】
（活性染色）
上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、特定のバンドがリパーゼであるかどうかを確認するためには、活性染色（ザイモグラム）を行うことができる。活性染色の基質には、たとえば４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ（シグマ・アルドリッチ）を使用することができる。まずＭＵＦ−ｂｕｔｙｒａｔｅを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）の存在下でＥｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ（和光純薬）の原液で溶解させ、２５ｍＭの基質溶液を作製する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを蒸留水で洗浄し、ＣＢＢで染色し、タンパク質のバンドを確認後、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）にゲルを浸し、そこに基質溶液を最終濃度が１００μＭとなるように加え、室温で約１時間インキュべートして活性染色を行う。その後、ゲルにＵＶを照射し発光させる。ＣＢＢ染色後のタンパク質のバンドと活性染色のバンドとを比較することにより、特定のバンドがリパーゼであるかどうかを確認することができる。また、リパーゼＬｉｐ６０の検出には、ウェスタンブロッティング法を使用することもできる。
【００５７】
（タンパク質の定量）
精製後のリパーゼＬｉｐ６０のタンパク質の定量には、既知のさまざまな方法を用いることができる。たとえば、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯＲＡＤ）を使用することができる。また、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を利用することもできる。
【００５８】
なお、公知の種々の方法を用いて無細胞系によりリパーゼＬｉｐ６０の発現および精製を行うこともできる。
【００５９】
（活性）
野生型のアスペルギルス・オリゼでは、リパーゼＬｉｐ６０の発現量は非常に低い。一方、本発明に関するＡＯ６０遺伝子を過剰に発現するアスペルギルス・オリゼ（組み換え生物）では、上述の解析で容易に検出可能な程度に、リパーゼＬｉｐ６０の発現量が高くなっている。したがって、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２によって形質導入されたアスペルギルス・オリゼは、耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０を大量に生産しうる点で非常に有用である。また、ＡＯ６０遺伝子が組み込まれたＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２も、アスペルギルス・オリゼに形質転換された場合に、このようにリパーゼＬｉｐ６０を大量に生産しうる点で、同様に非常に有用である。
【００６０】
また、４０℃におけるリパーゼＬｉｐ６０の活性の絶対値は、２．３ Ｕ／ｍｌ（Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。これは、通常のリパーゼに劣らない活性である。また、リパーゼＬｉｐ６０は、脂質の加水分解だけではなく、エステル合成反応も行うことができる。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０は、たとえば１−モノオレインをオレイン酸に加水分解したり、１，３−ジオレインをオレイン酸および１−モノオレインに加水分解したり、トリオレインを１−モノオレイン、１，３−ジオレインおよびオレイン酸に加水分解したりすることができる。それに加えて、たとえば１，３−ジオレインをトリオレインにエステル合成することもできる。また、リパーゼＬｉｐ６０の反応温度は、２５〜７０℃が好ましく、３０〜５５℃がさらに好ましい。また、リパーゼＬｉｐ６０を５０〜７０℃という高温にて反応させることも可能である。また、リパーゼＬｉｐ６０を反応させる際のｐＨは、３．０〜７．０であることが好ましい。
【００６１】
（耐熱性）
ＡＯ６０遺伝子を過剰に発現するアスペルギルス・オリゼから精製したリパーゼＬｉｐ６０は、著しい耐熱性を有する。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０は、５０℃で２０分間インキュべートしても８０％以上の残存活性を有し、１００℃で２０分間インキュべートしても、残存活性がほとんど低下することなく、約６０％の残存活性を有する。また、リパーゼＬｉｐ６０は、インキュべートの時間を延ばした場合、５０℃では１００分を経過しても８０％以上の残存活性を有する。リパーゼＬｉｐ６０は、７０℃でインキュべートした場合にも、１００分を経過しても５０℃と同程度の残存活性を有する。また、リパーゼＬｉｐ６０は、９０℃で１００分間インキュべートした場合にも４０％以上の残存活性を有し、１００℃で１００分間インキュべートした場合にも約３０％の残存活性を有する。
【００６２】
なお、本発明で「残存活性を有する」とは、加熱後さらにリパーゼ反応に使用しうる程度に活性が残存していることをいい、通常約１０％以上、好ましくは約１５％以上、さらに好ましくは約２０％以上の活性を有していることをいう。つまり、リパーゼＬｉｐ６０は、１００℃で１００分間インキュべートした場合にも約３０％の残存活性を有するため、加熱後にリパーゼ反応に使用することが十分可能である。
【００６３】
このように、本発明のリパーゼＬｉｐ６０は、ＰＣＲに使用され、耐熱性を有する酵素として有名な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに匹敵する耐熱性を有する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓなどの高温下で生育する好熱性細菌より取得される。一方、本発明のリパーゼＬｉｐ６０は、驚くべきことに、耐熱性を有さないと考えられている生物であるアスペルギルス・オリゼから取得することができる。
【００６４】
つまり、本発明では、一般的な培養装置を用いて容易かつ大量にリパーゼＬｉｐ６０を生産することができる。また、得られたリパーゼＬｉｐ６０は、著しい耐熱性を有するとともに、通常の温度で反応させた場合に著しい耐久性をも有する。したがって、リパーゼＬｉｐ６０を従来通りの反応に使用する場合にも、長時間反応させることができるようになる。
【００６５】
また、細胞系を用いてリパーゼＬｉｐ６０を生産する場合、ゲノム中にＡＯ６０遺伝子を持たないような菌種も含む、様々な菌種を使用することができる。しかし、アスペルギルス・オリゼを使用することが安全性および生産性の観点から特に好ましい。アスペルギルス・オリゼの株としては、たとえばＲＩＢ４０株（産業技術総合研究所）などが挙げられる。リパーゼＬｉｐ６０の生産菌であるアスペルギルス・オリゼは、食品加工に古くから利用されているので、非常に安全性の高い菌として認められている。このように、菌自体に汎用性が高く、しかもその菌によって生産されるリパーゼＬｉｐ６０が著しい耐熱性を示すことから、様々な食品加工や食品製造の原料、医薬品、化粧品の分野に応用可能と考えられる。
【００６６】
なお、ＡＯ６０遺伝子群およびこれらと相同性のある遺伝子の塩基配列をベクターに組み込み、別の種または無細胞系でリパーゼＬｉｐ６０を発現させることにより、これらの用途に使用してもよい。
【００６７】
（分子系統解析）
まず、アスペルギルス・オリゼ自身のゲノム中において、パラロガス遺伝子（同一ゲノム内で、異なる遺伝子座を占める類似した構造と機能をもつ遺伝子。パラローグともいう）の探索を行った。
【００６８】
アスペルギルス・オリゼのリパーゼＬｉｐ６０のアミノ酸配列を問い合わせ配列とし、ＤＯＧＡＮ（Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｄ ａｔ ＮＩＴＥ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／Ｔｏｐ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、相同性検索を行った。検索にはＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用し、その他はデフォルト設定にて検索を行った。
【００６９】
その結果、スコアが最高の配列（ＡＯ０９０００３０００８６６遺伝子）でさえ、局所的に低い相同性（３８アミノ酸にわたる相同性が３４％）が検出されただけで、しかもリパーゼドメインをもつ遺伝子の配列ではないことが明らかとなった。このことから、ＡＯ６０遺伝子と遺伝子全体にわたり３０％以上の相同性を有し、かつリパーゼ活性を有するようなパラロガス遺伝子は、アスペルギルス・オリゼのゲノム中には存在しないと考えられる。
【００７０】
遺伝子ファミリーに属する遺伝子は、類似する機能を担っていることが多いため、互いにある程度高い相同性を有するのが一般的である。しかし、本発明のリパーゼは、後述するように実際にリパーゼとしての活性を有しているにもかかわらず、アスペルギルス・オリゼの種内に存在する約１９０の遺伝子との間でさえ、遺伝子の大部分の領域においてＴＢＬＡＳＴＮで検出できる程度の相同性を有さないことが明らかとなった。これは、本発明のリパーゼのアミノ酸配列自体が非常に特殊であることを意味する。
【００７１】
次に、アスペルギルス・オリゼとそれ以外の種との間でアミノ酸配列の比較解析を行った。まず、ＡＯ６０遺伝子のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、米国の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用い、相同性検索を行った。検索にはＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用し、その他はデフォルト設定（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ： ３， Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２， Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ： Ｅｘｉｔｅｎｃｅ １１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）にて検索を行った。
【００７２】
その結果、スコアが２００よりも大きく、かつＥ−ｖａｌｕｅ（そのライブラリで偶然に同じスコアでヒットする本数の期待値）がｅ−５０よりも小さな配列として、のべ１６配列がヒットした。これらはいずれも機能が未知である遺伝子のアミノ酸配列である。また、これらの中には、同じ種の同じ遺伝子のものであると考えられる重複する配列も存在した。したがって、そのような重複する配列は以下の解析から除外した。
【００７３】
その結果、アスペルギルス属の配列として、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）のＡＦＬＡ＿０５４０２０遺伝子の配列（アミノ酸の配列番号：ＸＰ＿００２３８３５２７）と、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＡｎ１３ｇ０２８２０遺伝子の配列（ＸＰ＿００１３９６４１７）と、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＡＮ８５００．２遺伝子の配列（ＸＰ＿６８１７６９）とを取得した。
【００７４】
また、アスペルギルス属と同じマユハキタケ科に属するアオカビ属の配列として、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ１６ｇ１１４１０遺伝子の配列（アミノ酸の配列番号：ＸＰ＿００２５６１４４４）と、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）のＰＭＡＡ＿０９８４４０遺伝子の配列（ＸＰ＿００２１４９４２１）を、タラロミセス属の配列として、タラロミセス・スティピタトゥス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）のＴＳＴＡ＿０４２７３０遺伝子の配列（ＸＰ＿００２４８４７５１）を、それぞれ取得した。
【００７５】
また、アスペルギルス・オリゼの属する子嚢菌門とは異なる、放線菌門に属するクリベラ・フラビダ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ）のＫｆｌａ＿１６６３遺伝子の配列（アミノ酸の配列番号：ＣＰ００１７３６）も取得した。また、クリベラ・フラビダ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ）は、上述のようにアスペルギルス・オリゼとは分類学上、門が異なる。にもかかわらず、Ｋｆｌａ＿１６６３遺伝子は、ＡＯ６０遺伝子のコード領域のほぼ全体に相当する、８番目のアミノ酸から２７４番目までの領域において、４８％のアミノ酸レベルの相同性（上述のＴＢＬＡＳＴＮの検出結果に基づく）を有することが明らかとなった。
【００７６】
同様に、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰプログラムを使用し、デフォルト設定（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ： ３， Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２， Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ： Ｅｘｉｔｅｎｃｅ １１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）にて相同性検索を行った。そして、スコアが２００よりも大きく、かつＥ−ｖａｌｕｅがｅ−５０よりも小さな配列として、上記の配列以外に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＡ４）のＬｉｐＡ遺伝子のアミノ酸配列（ＺＰ＿０５４８３２１１）を取得した。
【００７７】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＡ４）は、アスペルギルス・オリゼや上述の他の生物とは異なり、原核生物である。にもかかわらず、このＬｉｐＡ遺伝子は、ＡＯ６０遺伝子のコード領域のほぼ全体に相当する２１番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸までの領域において、５９％のアミノ酸レベルの相同性（上述のＢＬＡＳＴＰの検出結果に基づく）を有することが明らかとなった。原核生物の系統と真核生物の系統は２０億年以上も前に分岐したと考えられている。したがって、そのような非常に遠縁な生物の遺伝子間にこれほど高い相同性があることは驚くべきことである。
【００７８】
図１は、ＡＯ６０遺伝子群の系統関係を示す分子系統樹を示す図である。解析に使用したのは、ＡＯ６０遺伝子および上述の８つの遺伝子のアミノ酸配列である。まず上述のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン２．０１２）を用いてアラインメントし、近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ＮＪ法）を用いて分子系統樹を作成した。分子系統樹の作成には、デフォルトの設定を使用した。アラインメントによって生じた配列のギャップを除去することにより、分子系統樹を作成した。分子系統樹の表示には、Ｎｊｐｌｏｔ（バージョン２．３）を使用した。
【００７９】
上述のように、アスペルギルス・オリゼの種内にはＡＯ６０遺伝子と相同性のあるリパーゼは存在しないことから、これらの８つの遺伝子は、アスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子のオルソロガス遺伝子（複数の種間で保存された遺伝子で、共通の祖先遺伝子から派生した遺伝子。オルソローグともいう）であると考えられる。つまり、ＡＯ６０遺伝子群に属する遺伝子は、それぞれの生物においてアスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子と同一または極めて近似した機能を担っており、したがってＡＯ６０遺伝子と同様に顕著な耐熱性を有すると考えられる。
【００８０】
上述の系統解析では、ＡＯ６０遺伝子と相同性のある遺伝子（いずれも機能は未知）が各種から１遺伝子ずつ見つかった。したがって、菌類から原核生物までを含む幅広い種の多くにおいて、ＡＯ６０遺伝子のオルソロガス遺伝子が原則的に１種に１つずつ存在し、これらの遺伝子から生み出されるリパーゼの多くが、耐熱性を有するものと考えられる。
【００８１】
ここで、ＮＣＢＩのｂｌ２ｓｅｑのＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いてデフォルト設定（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ： ３， Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２， Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ： Ｅｘｉｔｅｎｃｅ １１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）にてアミノ酸配列の全長をアラインメントした場合、アスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子とのアミノ酸配列レベルの相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、アスペルギルス・フラバスで１００％、ペニシリウム・クリソゲナムで７２％、アスペルギルス・ニガーで７０％、アスペルギルス・ニデュランスで６６％、タラロミセス・スティピタトゥスで６２％、ペニシリウム・マルネフェイで６０％、ストレプトマイセスで５９％、クリベラ・フラビダで４８％である。
【００８２】
また、上述のとおり、アスペルギルス・オリゼには、相同性検索で検出できる程度にＡＯ６０遺伝子と相同性を有するようなパラロガス遺伝子は存在しない。したがって、アミノ酸配列レベルでＡＯ６０遺伝子と４８％（アスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダの相同性）を上回る相同性があれば、本発明で生産されるリパーゼＬｉｐ６０と同様にリパーゼ活性および耐熱性を有すると考えられる。また、アミノ酸配列レベルでＡＯ６０遺伝子と５０％以上の相同性を有することが好ましく、６０％以上の相同性を有することがさらに好ましく、７０％以上の相同性を有することが最も好ましい。
【００８３】
また、アスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダとの間のように、４８％程度のアミノ酸配列の相同性を有するリパーゼであれば、同様のリパーゼ活性および耐熱性を有すると考えられる。したがって、ＡＯ６０遺伝子群に属する遺伝子と同程度の相同性を有しさえすれば、生物種は問わない。今後ゲノムの解読が進み、さらに多くの生物種のゲノム配列がデータベースに登録されると考えられるが、本発明で行った相同性検索と同程度の条件で検出されるアミノ酸配列であれば、同様にリパーゼ活性と耐熱性を有すると考えられる。たとえば、アスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダ間には、上述のように４８％の相同性があるが、新たに登録されるＡＯ６０遺伝子群の配列には、クリベラ・フラビダとの相同性が同様に４８％で、アスペルギルス・オリゼとの遺伝子の大部分の領域にわたる相同性が約３０％程度しかないものも予想される。このようなものも、本発明の耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０群をコードするＡＯ６０遺伝子群に含まれる。また、ＡＯ６０遺伝子群の塩基配列に人工的に改変を加えたものを本発明に使用してもよい。
【００８４】
本発明に関するＡＯ６０遺伝子と同様に耐熱性を有するリパーゼは、上述の相同性の基準を満たすことに加えて、またはそれにかえて、リパーゼＬｉｐ６０群のうち少なくともいずれか１つとアミノ酸配列のレベルで約４８％以上の相同性を有するリパーゼをコードするＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であってもよい。
【００８５】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたは配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。
【００８６】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれであってもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件においては、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。
【００８７】
ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８８】
図２は、ＡＯ６０遺伝子群のアラインメントを示す図である。ＡＯ６０遺伝子および上述の８つの遺伝子（それぞれ属名は略して示す）のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン２．０１２）を用いてアラインメントし、開始コドンの位置が揃うように微修正したものである。このように、非常に遠縁な種間で、ＡＯ６０遺伝子群のアミノ酸配列には非常に高い相同性があることが分かる。
【００８９】
また、図２のアラインメントから、本発明によって生産されるリパーゼＬｉｐ６０群は、活性中心付近の網掛けで示した位置（配列番号１のアスペルギルス・オリゼのアミノ酸１０７〜１１６に相当）に「Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｅ−Ｇ」（ただし、Ｘ１はリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）、Ｘ２はバリン（Ｖ）またはイソロイシン（Ｉ）、Ｘ３はロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ））という、種間でほぼ完全に保存された配列を有することが明らかとなった。つまり、リパーゼＬｉｐ６０群と同様のリパーゼ活性を有するためには、これらの配列を活性中心に有していればよい。
【００９０】
なお、活性中心にこのコンセンサス配列を有するリパーゼであれば、仮にリパーゼ全体のアミノ酸配列レベルでの相同性がアスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダとの間の４８％未満であったとしても、耐熱性を有する可能性がある。逆に、このコンセンサス配列の一部に改変が加えられたとしても、耐熱性を保持できる可能性もある。網掛けで示した他の箇所に関しては後述する。
【００９１】
（アミノ酸組成）
ＡＯ６０遺伝子群に含まれる上述の９つの遺伝子から得られるリパーゼのアミノ酸配列のアミノ酸組成（％）を表２に示す。遺伝子名の後には、アミノ酸配列の長さをそれぞれかっこ書きで示した。非特許文献２に記載のアスペルギルス・ニガーの耐熱性を有するとされるリパーゼ遺伝子のアミノ酸組成も示した。また、耐熱性を有することが知られていない非特許文献３に記載のホスホリパーゼＡ１遺伝子（ＮＣＢＩなどにアミノ酸配列がＸＰ＿００１８１８６９４．１の番号で登録されているＡＯ０９０００１０００１４３遺伝子と同一であることが判明した）に関しても、同様の解析を行った。なお、非特許文献２に記載のリパーゼ遺伝子は、塩基配列およびアミノ酸配列が公表されていないため、非特許文献２の表３に記載のアミノ酸組成のデータを使用し、比較を行った（アミノ酸配列の長さは公表されていない）。非特許文献２の列の（８．２７）という記載は、アスパラギン（Ｎ）とアスパラギン酸（Ｄ）の組成の合計が８．２７％であることを表す。同様に（１８．８４）という記載は、グルタミン（Ｑ）とグルタミン酸（Ｅ）の組成の合計が１８．８４％であることを示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
本解析により、耐熱性を有するとされる非特許文献２リパーゼおよび耐熱性を有することが知られていない非特許文献３のリパーゼと比べ、本発明のリパーゼＬｉｐ６０群のアミノ酸組成には、少なくとも以下の特徴がある。つまり、リパーゼＬｉｐ６０群は、通常の耐熱性リパーゼに比べ、（１）バリン（Ｖ）を７．２％以上という高い割合で含む。また、本発明のＬｉｐ６０群は、（２）セリン（Ｓ）を６．５％以下という低い割合でしか含まない。また、本発明のＬｉｐ６０群は、（３）ヒスチジン（Ｈ）を含む割合がやや低い。
【００９４】
また、リパーゼＬｉｐ６０群では、翻訳後、分子内に特殊な構造が形成される可能性がある。たとえば、リパーゼＬｉｐ６０群は、非特許文献２および非特許文献３よりもそれほどシステイン（Ｃ）残基の割合が高いわけではないが、これら従来知られているリパーゼや他の酵素と比較し、２つのシステイン（Ｃ）によって形成されるジスルフィド結合が特殊であると考えられる。図２の網掛けの６か所のシステイン（Ｃ）残基（配列番号２のアミノ酸配列の２７、６４、１７５、１７８、２３５、２６９番目のアミノ酸に相当）は、９種間で完全に保存されている。一方、これら６か所以外には、いずれの種もシステイン（Ｃ）残基を有さない。また、１７５番目と１７８番目のシステイン（Ｃ）は非常に近接しており、これらを中心として略線対称状に、６４番目と２３５番目のシステイン（Ｃ）、および２７番目と２６９番目のシステイン（Ｃ）がそれぞれ存在する。したがって、リパーゼＬｉｐ６０群の耐熱性には、６つのシステイン（Ｃ）が所定の間隔で所定の位置に存在すること、およびシステイン（Ｃ）同士のジスルフィド結合によって形成される立体構造が非常に重要であると考えられる。
【００９５】
（グリコシル化）
リパーゼＬｉｐ６０群に対して、翻訳後に修飾を行うことにより、耐熱性をさらに向上させてもよい。このような翻訳後修飾には、たとえばグリコシル化（糖鎖付加）が考えられる。グリコシル化には、アスパラギン（Ｎ）残基が修飾される場合（Ｎ結合型）と、セリン（Ｓ）残基またはトレオニン（Ｔ）残基が修飾される場合（Ｏ結合型）とが考えられる。
【００９６】
Ｎ結合型によってリパーゼＬｉｐ６０群のアミノ酸残基を修飾する場合には、「アスパラギン（Ｎ）−Ｘ（プロリン以外の任意のアミノ酸）−セリン（Ｓ）」または「アスパラギン（Ｎ）−Ｘ（プロリン以外の任意のアミノ酸）−トレオニン（Ｔ）」のいずれか（シークオン配列）のアスパラギン（Ｎ）残基を、糖鎖によって修飾してもよい。
【００９７】
リパーゼＬｉｐ６０群では、たとえば図２の網掛けで示した配列番号２のアミノ酸の１６０〜１６２番目に相当するアスパラギン（Ｎ）−バリン（Ｖ）−セリン（Ｓ）のうちのアスパラギン（Ｎ）または配列番号２のアミノ酸の２０３〜２０５番目に相当するアスパラギン（Ｎ）−ロイシン（Ｌ）−トレオニン（Ｔ）のうちのアスパラギン（Ｎ）の少なくとも一方を、糖鎖によって修飾してもよい。
【００９８】
リパーゼＬｉｐ６０群のアミノ酸残基を修飾する糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、キシロースなどのうちの１つ以上であってもよい。
【００９９】
なお、ＡＯ６０遺伝子群の塩基に人工的な変異を加え、Ｎ結合型のグリコシル化のためのシークオン配列、またはＯ結合型グリコシル化のためのコンセンサス配列を導入してもよい。このような導入は、突然変異導入法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって 塩基置換、塩基の挿入／欠失などの変異を加えることにより行ってもよい。
【０１００】
（耐熱性リパーゼの用途）
本発明の耐熱性のリパーゼＬｉｐ６０群は、トリグリセリドの脂肪酸の位置を自在に入れ替えたり、特定の脂肪酸を分解して無くしたり、また逆に特定の脂肪酸を付加させたりすることにより、油脂の改質に使用することができる。本反応は、たとえば乳化しやすい油、分解されやすい油、および分解されにくい油のように様々な機能を持った油脂の作製に利用できる。具体的には、食品製造・加工業界、廃棄物処理業界、医薬品業界などにおいて幅広く使用することができる。実用化例としては、米ぬか油、大豆油、ひまわり油、やし油などからリパーゼを用いて植物油を精製する植物水中油型乳化剤としての利用、油の物理的前処理、カカオ油などの脂肪酸鎖長の変換、化粧品の基材としてのモノグリセリドの製造、ジグリセリドの製造、化粧料の製造、生ゴミ処理に使用される微生物酵素製剤への配合、外食産業や食品工業などの施設から排出される油含有廃液の処理、乳加工製品のフレーバー改善、家畜用飼料への添加による栄養価の強化や消化性の改善などが挙げられる。また、特に、高温環境下において、または高温環境下におかれた後に、リパーゼ活性を発揮できるような用途に使用されることが好ましい。たとえば、リパーゼＬｉｐ６０群を用いて、５０〜７０℃において反応を行うことができる。また、たとえばリパーゼＬｉｐ６０群を５０℃以上の温度で通算１００分間以上加熱した後、リパーゼＬｉｐ６０群をリパーゼ反応に使用することができる。より具体的には、たとえば以下の用途が想定される。
【０１０１】
（用途１）
医薬原料（医薬に用途は問わない）を基質として、微小粒子形態又は不溶性表面を有する対象物の形態のナノ酵素複合体の酵素をプロテアーゼとした、ナノリパーゼ複合体を作用させる場合として、例えば、油脂を加水分解して脂肪酸を製造する場合や、エステル合成による界面活性剤の製造を行う場合や、光学分割を行う場合や、油脂・乳化剤等の改質等が挙げられる。
【０１０２】
特に、脂肪酸は、現在油脂を約５０気圧・２５０℃前後で分解するという、典型的な多消費型プロセスによって生産されている。従って、リパーゼＬｉｐ６０群により油脂を分解することに対する需要は非常に高い。しかしながら、通常、リパーゼは熱に弱く、６０℃、１０分で完全に失活し、使用温度は３０℃程度が限界という結果も示されている。そこで、リパーゼＬｉｐ６０群を用いることにより、その優れた耐熱性により、極めて効率的に脂肪酸を製造することが可能となる。なお、リパーゼＬｉｐ６０群自体を内服剤、例えば、消化酵素剤の有効成分として含有させ、耐熱性組成物として用いることも可能である。その場合、含有量は、約０．１〜９９質量％であることが好ましい。それにより、リパーゼＬｉｐ６０群の優れた安定性により、経口投与を行っても、失活しづらく、分散性も良好であり、所望する脂肪分解効果を効率的に得ることができる。
【０１０３】
（用途２）
皮膚の表面物質である基質に対して、リパーゼを作用させる場合に、皮膚外用剤の有効成分として、本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を用いる場合が考えられる。つまり、リパーゼを皮膚外用剤の有効成分として、皮脂等の皮膚表面物質と接触させる場合、美肌効果（化粧品等としての効果）を発揮し得ることが知られているが、このリパーゼの代わりに、リパーゼＬｉｐ６０群を有効成分として含有させ、含有させ、耐熱性組成物として用いることも可能である。その場合、含有量は、約０．１〜９９質量％であることが好ましい。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続され、様々な環境でも安定して機能すると考えられる。そのため、薬効が経時的に安定し、塗布の回数が少なくてすむ皮膚外用剤を提供することができる。
【０１０４】
（用途３：食品の加工）
食品前駆物質、具体的には、リパーゼで処理することによって最終的な食品とする物質をリパーゼの基質とする場合、従来のリパーゼにかえて本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を作用させることができる。食品加工の工程では、熱をかけて製品を作ることが非常に多い。そのため、リパーゼＬｉｐ６０群を使用すれば、高温環境下でもリパーゼの酵素活性をほとんど失わずに、効率的にリパーゼ処理工程を行うことができる。つまり、リパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で含有する耐熱性組成物をリパーゼで処理に使用することにより、加工の途中でリパーゼを追加したりする必要がないため、作業効率がアップし、コストを抑えることもできる。具体的には、麹の製造、発酵エキスの抽出、乳、卵加工品、肉、および日本酒などの酒、味噌、醤油等の発酵食品のフレーバーの改質、保存性の向上、起泡性の改良などのために、これらの食品の前駆物質にナノリパーゼ複合体を作用させることができる。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続し、様々な環境でも安定して機能すると考えられる。そのため、極めて効率的に脂肪の分解を行うことができる。
【０１０５】
（用途４：洗剤への配合）
洗濯物や食器などの被洗浄物に、従来のリパーゼにかえて本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を作用させることにより、油汚れを効率的に分解することができる。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で衣料用洗剤などに含有する耐熱性組成物を製造することができる。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続し、様々な環境でも安定して機能すると考えられる。したがって、効率的に油汚れを落とすことが可能となる。
【０１０６】
（用途５：汚染物質の分解）
環境負荷物質、例えば、富栄養化が進んでいる汚染領域に、本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を作用させることができる。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で含有する耐熱性組成物を使用することができる。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続し、ｐＨや温度が異なる様々な環境（特に酸性条件下）でも安定して機能すると考えられる。したがって、油脂系の汚染物質の分解を、極めて効率的かつ安価に行うことができる。
【０１０７】
（用途６：繊維の処理）
リパーゼによって繊維の表面を処理して肌ざわりや風合いをよくする技術が知られている。従来のリパーゼに代えて、本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で含有する耐熱性組成物を用いることができる。それにより、リパーゼＬｉｐ６０群は活性が長時間持続するため、繊維処理を効率的に行うことができる。
【０１０８】
（用途７：飼料への配合）
本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜２０質量％の割合で含有する耐熱性組成物（配合飼料）を製造することにより、家畜等の生体内でリパーゼＬｉｐ６０群を働かせることができる。リパーゼＬｉｐ６０群は、通常のリパーゼよりも活性が長時間持続することが期待できるため、家畜等の生育をより促進できるようになる。
【０１０９】
（有用性）
本発明は、アスペルギルス・オリゼという極めて安全な微生物が生産し、従来知られていなかった著しい耐熱性を有するリパーゼを、大量かつ簡便に生産する技術を提供することにある。本発明によって生産することができるリパーゼは、常温菌であるアスペルギルス・オリゼが生産する酵素でありながら、極めて高い耐熱性（１００℃、１００分間の加熱処理後にも約３０％の残存活性）を有している。アスペルギルス・オリゼのみならず、常温菌由来の酵素ではこのように著しい耐熱性を有するという報告はない。本発明によって生産することができるリパーゼは、耐熱性を有するとされてきた従来のリパーゼに比べてはるかに高い耐熱性を有している。このように熱に対する安定性が優れていることから、特に熱安定組成物の有効成分として、熱処理を行う食品加工などに幅広く利用することができると考えられる。
【０１１０】
従来のリパーゼでは、熱による酵素機能の低下が、生成物の収率低下や新しい酵素の再添加の必要性を招き、歩留まりの低さやコスト高の原因となっていた。しかしながら、耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０群を提供することで、熱による酵素の機能低下が大幅に改善され、酵素の再添加なども大幅に軽減されることから、エネルギー消費も著しく抑制され、歩留まりも大幅に向上させることができる。その結果、環境への負荷が低減でき、コストも抑えられることから、工業的な利用価値は高い。さらには、バイオリアクターの技術を利用することで、リパーゼＬｉｐ６０群の反応効率をより向上させることもできる。
【０１１１】
また、アスペルギルス・オリゼは、リパーゼ遺伝子を約１９０種類保持していることが予想されているが、本発明では機能が分かっていなかったＡＯ６０遺伝子がリパーゼ活性を有することを明らかにし、さらに耐熱性ポリメラーゼなどの酵素に匹敵する耐熱性という、従来のリパーゼでは予想できなかった性質を明らかにした。本発明のリパーゼＬｉｐ６０群は、遺伝子工学の技術を利用することで、簡単にクローニングやタンパク質の発現および改変を行うことができるため、非常に汎用性が高い。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
リパーゼＬｉｐ６０生成菌の培養時間とリパーゼＬｉｐ６０の産出量との比較を行った。耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を形質導入したリパーゼＬｉｐ６０生成菌（アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のｎｉａＤ遺伝子破壊株であるｎｉａＤ４００株）を、液体のＹＰＤ培地（２００ｍｌ、ｐＨ５．５）で１００ｒｐｍ、３０℃で２４時間、４８時間、７２時間、９６時間培養した。アスピレーターとガラスフィルター１７Ｇ１を用いて培養液から菌体とＹＰＤ培地とを分離し、ＹＰＤ培地の培養液（菌体外酵素抽出液）を回収した。菌体外酵素抽出液のタンパク質量、酵素活性値を各培養時間で比較した。Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質量の測定には、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯＲＡＤ）を使用した。
【０１１３】
まず牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用し、検量線を作成した。濃度がそれぞれ０ｍｇ、０．４７ｍｇ、０．７０５ｍｇ、０．９４ｍｇ、１．４１ｍｇのＢＳＡ溶液に関し、７５０ｎｍの吸光度を測定した。次に、菌体外酵素抽出液の吸光を測定し、検量線を利用して全タンパク質の定量を行った。
【０１１４】
酵素の全活性の測定には、合成基質であるｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅ（シグマ）をイソプロパノールで希釈して０．１５％のｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅ溶液として使用した。反応バッファーは、０．１％のＡｒａｂｉｃ ｇｕｍ（和光純薬）と０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬）を加えた５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を使用した。酵素反応停止薬として、０．１Ｍの炭酸ナトリウムを使用した。
【０１１５】
まず、試験管に反応バッファーを４０５μｌ入れ、そこにｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅ溶液を４５μｌ加え、十分に混合した。次に、混合液の温度を４０℃に保ちつつ、精製したリパーゼＬｉｐ６０を５０μｌ加え、５分間反応させた。その後、０．１Ｍの炭酸ナトリウムを加えて反応を停止させ、分光光度計を用いて４１０ｎｍの吸光度（遊離してくるｐＮＰの濃度）を測定した。ユニット計算のために、ｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅを用いて検量線を作成した。表３に、リパーゼＬｉｐ６０生成菌の培養時間とリパーゼリパーゼＬｉｐ６０の産出量との関係を示す。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
表３の全活性（Ｕ）を２４時間と４８時間で比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０は２４時間まではほとんど生産されず、その後４８時間までの間に急激に生産されることが明らかとなった。この全活性は、９６時間の培養時に最も値を示した。一方、全タンパク質量（ｍｇ）は、７２時間において最も高い値を示した。
【０１１８】
（実施例２）
薄層クロマトグラフィー （Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）を用いて、リパーゼＬｉｐ６０の天然基質（オリーブ油）に対する分解能を調べた。オリーブ油は、オレイン酸を主成分として含むため、オレイン酸と、１−モノオレイン、１，３−ジオレインおよびトリオレインとの間のエステル結合の加水分解能またはその逆の反応であるエステル合成能の指標として有用である。（Ｍ）マーカー（１−モノオレイン、１−３ジオレイン、トリオレイン、オレイン酸）、サンプルとして（１）１−モノオレイン、（２）１−モノオレインにリパーゼＬｉｐ６０を加えたもの、（３）１，３−ジオレイン、（４）１，３−ジオレインにリパーゼＬｉｐ６０を加えたもの、（５）オリーブ油、および（６）オリーブ油にリパーゼＬｉｐ６０を加えたものを使用した。
【０１１９】
展開溶媒としては、へキサン：ジエチルエーテル：酢酸を７０：３０：１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で混合したものを使用した。（Ｍ）、（１）、（３）および（５）では１−モノオレイン（シグマ）、１,３−ジオレイン（シグマ）、トリオレイン（シグマ）、オレイン酸（シグマ）各５ｍｇを加え、（２）、（４）および（６）ではさらに精製したリパーゼを２μｌずつ加えた。さらに乳化剤である１％トリトンＸ−１００を１μｌ加えた後、蒸留水および最終濃度が５０ｍＭとなるように酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加え、全量を１ｍｌに調整した。そして、バイオシェイカーを用いて１８００ｒｐｍ、４０℃にて１時間反応させた。その後、ジエチルエーテルを４００μｌ加えて撹拌した後、１５０００ｒｐｍ、室温にて５分間遠心分離を行った。上層（ジエチルエーテル層）をシリカゲル６０Ｆ２４５プレート（メルク）に乗せ、溶媒により展開（３０分間）した。その後、プレートを乾燥させ、酢酸：希硫酸混合液９５：５（Ｖ／Ｖ）をプレートに噴霧した後、１５０℃で熱しスポットを確認した。
【０１２０】
図３は、薄層クロマトグラフィーによるリパーゼＬｉｐ６０の天然基質に対する反応性を示す図である。
【０１２１】
図３では、左から順に上述の（Ｍ）、（１）、（２）、（３）、（４）、（５）および（６）のスポットをあらわす。上下方向は、上から順にトリオレイン、オレイン酸、１，３−ジオレインおよび１−モノオレインのスポットをあらわす。リパーゼＬｉｐ６０を加えていない（１）と比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０を加えた（２）では、１−モノオレインの一部がリパーゼＬｉｐ６０によってオレイン酸に加水分解されることが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０を加えていない（３）と比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０を加えた（４）では、１，３−ジオレインがオレイン酸および１−モノオレインに加水分解されることも明らかとなった。それに加えて、（４）ではトリオレインのスポットも見られることから、リパーゼＬｉｐ６０は１，３−ジオレインを加水分解するだけではなく、エステル合成反応も行うことが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０を加えていない（５）と比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０を加えた（６）では、トリオレインが１−モノオレイン、１，３−ジオレインおよびオレイン酸に加水分解されることも明らかとなった。
【０１２２】
（実施例３）
図４は、本発明のリパーゼＬｉｐ６０を、バッファーの種類を変えて相対活性を比較した結果を示すグラフである。最もリパーゼ活性が高かったｐＨ６のリン酸バッファーの活性を１００％とし、活性の相対値（％）をあらわした。バッファーとして、それぞれ５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ３．０、 ４．０）、酢酸バッファー（ｐＨ４．０、 ５．０、 ６．０）、リン酸バッファー（ｐＨ６．０、 ７．０、 ８．０）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０、 ９．０）を使用した。これらのバッファー中で、精製後のリパーゼを４０℃で５分間反応させ、リパーゼ活性を測定した。酵素の活性量の測定方法は、これらのバッファーを除き、実施例１と同じである。したがって、実施例１と重複する部分に関しては、適宜省略する。
【０１２３】
リン酸バッファーでは、ｐＨ６．０のときに最もリパーゼ活性が高く、７．０、８．０とｐＨが上がるにつれ、急激に活性が低下した。また、次に高い活性を示した酢酸バッファーでは、ｐＨ４．０において約９３％、ｐＨ５．０において約８９％、ｐＨ６．０において約９８％と、酸性条件の広い範囲で非常に高い安定性を示した。また、クエン酸バッファーでも、ｐＨ３．０でｐＨ６のリン酸バッファーに対して約８０％、ｐＨ４．０で約８８％と、安定して高い活性を示した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーでは、ｐＨ８．０のときに約５５％の活性を示した。
【０１２４】
また、総じて、ｐＨが７．０以下のときにリパーゼが高い活性を示した。特にｐＨ３．０〜７．０の範囲では、リパーゼは高い活性を示した。リン酸バッファーではｐＨ８．０のときに活性が見られなかったことから、少なくともｐＨが７．０よりも大きい場合には、リパーゼの活性はバッファーの種類に依存すると考えられる。
【０１２５】
（実施例４）
図５は、本発明のリパーゼＬｉｐ６０の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。精製したリパーゼＬｉｐ６０を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃および９０℃の８段階で反応させ、至適温度を調べた。図５では、最も高い活性を示した４０℃における活性量を１００％とし、その相対活性に基づいてグラフを作成した。なお、酵素の活性量の測定方法は、反応温度を除き、実施例１と同じである。したがって、実施例１と重複する部分に関しては、適宜省略する。
【０１２６】
４０℃におけるリパーゼＬｉｐ６０の活性の絶対値は、２．３ Ｕｎｉｔｓ／ｍｌであった。このことから、リパーゼＬｉｐ６０は通常のリパーゼに劣らない、高いリパーゼ活性を有することが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０は、４０℃の次に５０℃において高い活性（約９６％）を示した。また、リパーゼＬｉｐ６０は、リパーゼＬｉｐ６０は、３０℃でも高い活性（約８３％）を示し、６０℃でもある程度高い活性（５４％）を示した。また、リパーゼＬｉｐ６０は、７０℃でも約１５％の活性を示した。２０℃の活性（約４５％）と３０℃の活性から、リパーゼＬｉｐ６０は２５℃においても６０℃と同程度の活性（約５５％）を示すと考えられる。
【０１２７】
したがって、本発明のリパーゼＬｉｐ６０は、少なくとも２５〜６０℃の反応条件であれば、比較的高い活性を有することが明らかとなった。また、３０〜５５℃の反応条件であれば、最大活性の約８０％以上の高い活性を示すことも明らかとなった。このように、リパーゼＬｉｐ６０は、広い温度範囲において高い活性を有することが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０は、５０〜７０℃という高温でも反応に使用することができることが明らかとなった。
【０１２８】
（実施例５）
図６は、本発明のリパーゼＬｉｐ６０を所定の温度でインキュべートした時間と残存活性との関係を示すグラフである。具体的には、上述のようにして精製したタンパク質を、５０℃、７０℃、９０℃および１００℃の定温条件下において、それぞれ２０分間、４０分間、６０分間および１００分間インキュべートした。リパーゼＬｉｐ６０の反応温度は、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ）を用い、精製後のリパーゼＬｉｐ６０をチューブに１００μｌずつ入れ、各温度で加熱し、反応後にはサンプルを氷上で冷却した。その後、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）中で、４０℃で１０分間リパーゼ反応を行い、加熱処理をしていないリパーゼＬｉｐ６０の活性を１００％とした場合の残存活性を測定した。ネガティブコントロール（ｎ．ｃ．）として、ＡＯ６０遺伝子を組み込まないｐＮＥＮ１４２を形質転換し、液体培養をしたＹＰＤ培地の上清を用いた。ネガティブコントロールに関しては、９０℃で５分間、１５分間、３０分間および６０分間インキュべートした後、残存活性を測定した。酵素の活性量の測定方法は、実施例１と同じである。したがって、実施例１と重複する部分に関しては、適宜省略する。
【０１２９】
まずネガティブコントロールでは、９０℃で５分間加熱した場合に完全に失活した。一方、本発明のリパーゼＬｉｐ６０では、５０℃で２０分間インキュべートしても８０％以上の残存活性を示した。また、１００℃でインキュべートしても、残存活性がほとんど低下することなく、６０％程度の残存活性を示した。
【０１３０】
また、インキュべートの時間を延ばした場合にも、リパーゼＬｉｐ６０は、５０℃では１００分を経過しても８０％以上の残存活性を示した。リパーゼＬｉｐ６０を７０℃でインキュべートした場合にも、１００分を経過しても５０℃と同程度の残存活性を示した。また、リパーゼＬｉｐ６０を９０℃で１００分間インキュべートした場合にも４０％以上の活性が残存しており、１００℃で１００分間インキュべートした場合にも約３０％の活性が残存していた。
【０１３１】
それぞれの温度で見ると、リパーゼＬｉｐ６０を５０℃で加熱した場合には、初めに少し活性が落ちただけで、２０分後から１００分後まで、ほとんど活性が低下しなかった。具体的には、５０℃で加熱した場合には、２０分後に約８２％、４０分後に約８０％、６０分後に約８２％、１００分後に約８２％の活性を有していた。
【０１３２】
また、７０℃で加熱した場合にも、初めに少し活性が落ちただけで、２０分後から１００分後まで、ほとんど活性が低下しなかった。具体的には、７０℃で加熱した場合には、２０分後に約７５％、４０分後に約７４％、６０分後に約８０％、１００分後に約７２％の活性を有していた。
【０１３３】
また、９０℃で加熱した場合にも、従来の耐熱性リパーゼに比べ、はるかに高い耐熱性を示した。具体的には、９０℃で加熱した場合には、２０分後に約６８％、４０分後に約６２％、６０分後に約５２％、１００分後に約４２％の活性を有していた。
【０１３４】
また、１００℃で加熱した場合にも、従来の耐熱性リパーゼに比べ、はるかに高い耐熱性を示した。具体的には、１００℃で加熱した場合には、２０分後に約５８％、４０分後に約４４％、６０分後に約３６％、１００分後に約２６％の活性を有していた。
【０１３５】
以上、本発明を上述の実施の形態や各実施例を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態や各実施例に限定されるものではなく、実施の形態や各実施例の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態や各実施例における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態や各実施例も本発明の範囲に含まれうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性リパーゼ遺伝子、耐熱性リパーゼ、耐熱性リパーゼ発現ベクター、組み換え生物、耐熱性リパーゼの発現方法、耐熱性リパーゼの反応方法、および耐熱性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、その重要性から主として食品加工関連の酵素として使用されてきた。トリグリセリドからの脂肪酸の製造、化粧品の基材としてのモノグリセリドの製造、水中油型乳化剤としての利用、食品フレーバーの改質、飼料の製造、卵加工品への応用など、リパーゼの用途は様々である。特に、食品加工では、熱をかけて製品を作ることが非常に多く、数多くの耐熱性リパーゼの報告または特許出願がされてきた。リパーゼの供給源としては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの細菌類や、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などの糸状菌が報告されている。
【０００３】
特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ：麹菌、ニホンコウジカビとも呼ばれる。以下Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属は「Ａ．」と略す）は、古来から日本酒や味噌、醤油といった発酵食品の製造に使用されている微生物であり、安全な菌である。そのため、数多くの研究が精力的になされてきた。にもかかわらず、アスペルギルス・オリゼ由来のリパーゼの利用は非常に限られており、麹の製造や発酵エキスの抽出、化粧料などに使用されているだけである。
【０００４】
リパーゼを用いた技術として、たとえば、光合成細菌であるＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＮＡＴのリパーゼを用いて４５〜５５℃の排水を処理する方法が報告されている（特許文献１）。また、リパーゼに金コロイドとＰＥＧ−ポリ（メタクリル酸−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）を加えてナノリパーゼ複合体を形成することにより、リパーゼに耐熱性を付与する方法が報告されている（特許文献２）。
【０００５】
また、糸状菌であるＦｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍのリパーゼをアスペルギルス・オリゼで発現させることにより、バイオディーゼルの生産に応用する技術が報告されている（非特許文献１）。また、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）の耐熱性を有するリパーゼが報告されている（非特許文献２）。また、アスペルギルス・オリゼのリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１７２５４４号公報
【特許文献２】特開２００８−０９２８１６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８年、８１巻、４号、Ｐ．６３７−６４５
【非特許文献２】Ｌｉｐｉｄｓ ２０００年、３５巻、５号、Ｐ．４９５−５０２
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９年、６３巻、５号、８２０−８２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、リパーゼは、加熱による機能の低下が著しい酵素として従来から知られている。具体的には、リパーゼは一般的に、６０℃で１０分間加熱すると完全に失活してしまう酵素として知られている。
【０００９】
たとえば特許文献１のリパーゼでは、５５℃を超える温度で酵素が活性を有するかどうかについては知られていなかった。さらに、特許文献１のリパーゼでは、５５℃を超える温度でインキュべートした場合に、リパーゼが活性を保持できるかどうかについても知られていなかった。また、特許文献２のナノリパーゼ複合体では、複合体を形成するためにコストや手間がかかるのが問題であった。さらに、特許文献２のナノリパーゼ複合体では、６０℃を超える温度に対して耐熱性があるかどうかも知られていなかった。
【００１０】
また、非特許文献１および非特許文献３のリパーゼでは、耐熱性を有するという性質は知られていなかった。また、非特許文献２のリパーゼは、５０℃を超える温度でインキュべートすると、急激に酵素の活性が低下してしまうという問題があった。
【００１１】
このように、従来のリパーゼでは、耐熱性が十分ではなかったため、生成物の収率低下や新しい酵素の再添加の必要性を招き、歩留まりの低さやコスト高の原因となっていた。そこで、長時間高温環境下にさらされても依然として酵素活性を有するような、従来よりも耐熱性に優れたリパーゼを生産する技術が求められている。
【００１２】
本発明はこうした状況に鑑みてなされており、その目的とするところは、耐熱性に優れたリパーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明のある態様の耐熱性リパーゼ遺伝子は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列をコードし、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％を上回るアミノ酸配列。
【００１４】
この態様によると、耐熱性に優れたリパーゼを提供することができる。
【００１５】
なお、本発明で「残存活性を有する」とは、加熱後さらにリパーゼ反応に使用しうる程度に活性が残存していることをいい、通常約１０％以上、好ましくは約１５％以上、さらに好ましくは約２０％以上の活性を有していることをいう。
【００１６】
本発明の別の態様は、耐熱性組成物である。この耐熱性組成物は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有し、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する耐熱性リパーゼを含有する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％以上であるアミノ酸配列。
【００１７】
この態様によると、耐熱性に優れた耐熱性組成物を提供することができる。
【００１８】
なお、上述した各要素を適宜組み合わせたものも、本件特許出願によって特許による保護を求める発明の範囲に含まれうる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、耐熱性に優れたリパーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＯ６０遺伝子群の系統関係を示す分子系統樹を示す図である。
【図２】ＡＯ６０遺伝子群のアラインメントを示す図である。
【図３】薄層クロマトグラフィーによるリパーゼＬｉｐ６０の天然基質に対する反応性を示す図である。
【図４】本発明のリパーゼＬｉｐ６０を、バッファーの種類を変えて相対活性を比較した結果を示すグラフである。
【図５】本発明のリパーゼＬｉｐ６０の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図６】本発明のリパーゼＬｉｐ６０を所定の温度でインキュべートした時間と残存活性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００２２】
ＡＯ６０遺伝子は、アスペルギルス・オリゼの１番染色体上に存在する遺伝子であり、配列番号１に示す８３４塩基のコード領域（２７７アミノ酸）を有する遺伝子である。しかし、ＡＯ６０遺伝子の機能、およびＡＯ６０遺伝子から作られる配列番号２に示すタンパク質の機能は未知であった。本発明では、機能が未知であったＡＯ０９０００９００００６０遺伝子（以下「ＡＯ６０遺伝子」と呼ぶ）から生産されるタンパク質が、リパーゼ活性を有することを明らかにした。そこで、ＡＯ６０遺伝子から生産されるタンパク質を、リパーゼＬｉｐ６０と命名した。
【００２３】
また、本発明では、リパーゼＬｉｐ６０は、従来知られていた耐熱性リパーゼに比べ、はるかに高い耐熱性を有することを明らかにした。アスペルギルス・オリゼが生産するリパーゼは約１９０種類存在すると予想されていたが、本発明では、これまでに報告されていない極めて熱に対する安定性が高いリパーゼを見いだした。本発明では、この性質を利用し、耐熱性の高いリパーゼを非常に多く生産することができるベクターおよび組み換え生物を発明した。また、その組み換え生物から効率的に高純度で耐熱性リパーゼを精製する方法を発明した。また、本発明の耐熱性リパーゼを発現させるための方法および反応方法も発明した。また、本発明の耐熱性リパーゼを含有する耐熱性組成物も発明した。
【００２４】
なお、本発明では、特に明記しない限り、ＡＯ６０遺伝子およびそれと相同性のある遺伝子をまとめて「ＡＯ６０遺伝子群」と総称し、ＡＯ６０遺伝子群がコードするリパーゼをまとめて「リパーゼＬｉｐ６０群」と総称する。以下、ＡＯ６０遺伝子およびリパーゼＬｉｐ６０を中心に説明するが、これらはＡＯ６０遺伝子群の他の遺伝子およびリパーゼＬｉｐ６０群の他のリパーゼ、さらに本発明では記載しないこれらと相同性のある遺伝子およびリパーゼに関しても同様に適用可能である。
【００２５】
（リパーゼＬｉｐ６０発現ベクター）
ＡＯ６０遺伝子群から生産されるリパーゼＬｉｐ６０群は、たとえば野生型のアスペルギルス・オリゼでは、ウェスタンブロッティング法などの手法によって検出することが困難である。つまり、野生型のアスペルギルス・オリゼではＡＯ６０遺伝子の発現量が非常に少ないため、野生型のままではリパーゼＬｉｐ６０をリパーゼ反応に効率的に利用することが非常に困難である。
【００２６】
そこで、本発明では、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）などにより増幅したＡＯ６０遺伝子群のＤＮＡをベクターに組み込み、それを形質転換によって細胞内に導入し、ＡＯ６０遺伝子群の発現量を上昇させることにより、高純度のリパーゼＬｉｐ６０群を容易かつ大量に得るシステムを構築した。
【００２７】
ＡＯ６０遺伝子群のＤＮＡを挿入し、リパーゼＬｉｐ６０群を発現させるためのベクターは、細胞系のベクターであってもよく、また無細胞系のベクターであってもよい。大量にリパーゼＬｉｐ６０群を必要とする場合には、コストの観点から、細胞系を使用してリパーゼＬｉｐ６０群の生産を行うことが好ましい。また、細胞系のベクターの場合、染色体組み込み型であってもよく、染色体に組み込まれないプラスミド型であってもよい。ベクターは、使用する系や生物種によって適宜選択することができる。さらに、ＡＯ６０遺伝子群の発現量を飛躍的に上昇させるために、ベクターは、高発現量のプロモーターを有することが好ましい。本発明では、核組み込み型で高発現量のプロモーターを有する麹菌用小型化高発現ベクターであり、ｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＮＥＮ１４２（大関酒造：特開平９−９９６８参照）を使用した。ｐＮＥＮ１４２は、アスペルギルス・オリゼなどの麹菌だけではなく大腸菌にも使用できるシャトルベクターであるため、特に有利である。
【００２８】
まず、ベクターに組み込むためのＡＯ６０遺伝子群のＤＮＡを調製する必要がある。たとえば、アスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子の場合、ＡＯ６０遺伝子のコード領域のそれぞれわずかに上流と下流にプライミングする５−ＡＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＣ−３および５−ＧＣＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＴＡＣ−３というプライマーセットを使用し、ＰＣＲを行うことができる。ポリメラーゼとして、たとえばＥｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を使用し、９４℃３分→（９８℃１０秒→５１℃４５秒→７２℃２分）×３０サイクル→７２℃４分というサイクルでＰＣＲを行うことができる。また、ＰＣＲには、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法も利用することができる。
【００２９】
次に、得られたＰＣＲ産物およびベクターをライゲーションする。ＰＣＲ産物をそのままＴベクターなどに組み込むこともできるが、ライゲーションに先立ち、得られたＰＣＲ産物およびベクターを制限酵素にて切断し、両末端をベクターに組み込めるような形にするのがより好ましい。制限酵素は、ＰＣＲ産物とベクターの間でライゲーションが行えるように適宜選択することができる。たとえば上述のプライマーセットを使用する場合、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩ（タカラバイオまたはＴＯＹＯＢＯ）という２つの制限酵素を用いて、ＰＣＲ産物を上記プライマー中の認識部位において切断し、ｐＮＥＮ１４２をマルチクローニングサイトにおいて切断することにより、互いに相補的な切断部位を形成することができる。反応条件は、たとえば３７℃で８時間とすることができる。
【００３０】
上述のＰＣＲ後と制限酵素処理後には、ＤＮＡをカラムで精製することが好ましい。このようなカラムとしては、たとえばＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を使用することができる。
【００３１】
また、制限酵素処理後のＤＮＡとベクターとをライゲーションする前に、セルフライゲーションを防止するために脱リン酸化処理を行うのが好ましい。脱リン酸化処理は、たとえばＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ）を用いて３７℃３０分→６５℃１５分という条件で反応を行うことができる。
【００３２】
次に、制限酵素処理後のＰＣＲ産物（ＡＯ６０遺伝子領域のＤＮＡ）と、制限酵素処理後のｐＮＥＮ１４２とをライゲーションする。これにより、耐熱性リパーゼ発現ベクター（以下ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を得ることができる。ライゲーション反応には、たとえばＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を使用することができる。反応条件は、たとえば１６℃で３時間とすることができる。また、ライゲーション反応後の産物に対し、エタノール沈殿を行うことが望ましい。エタノール沈殿は、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．などに記載されている方法を利用することができる。
【００３３】
ライゲーションされなかったｐＮＥＮ１４２やＰＣＲ産物をさらに除去することにより、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２をより高純度で大量に取得することが好ましい。たとえば、ライゲーション反応産物を大腸菌に形質転換し、培養することにより、高純度なＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２を増幅することができる。具体的には、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）を用いて大腸菌ＪＭ１０９ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）へエレクトロポレーション法により形質転換を行うことができる。反応条件は、たとえば２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωとすることができる。
【００３４】
次に、形質転換後の大腸菌を培養し、大腸菌から耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を回収する。たとえば、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓを、ＬＢ液体培地で３７℃において振とう培養した後、アンピシリン入りのＬＢ培地に塗布し、３７℃で２４時間静置培養することができる。その後、大腸菌からＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２を回収する。たとえば、ＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２を回収してもよい。なお、アンピシリン入りのＬＢ培地で培養後にポジティブコロニーの選別をより効率的に行うために、コロニーＰＣＲ法を使用するのが好ましい。
【００３５】
以上の手順により、従来よりもはるかに高い耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０群を大量に発現させるための耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を簡便かつ効率的に得ることができる。
【００３６】
（形質導入）
細胞系の場合、得られた耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を細胞内に形質導入することにより、リパーゼＬｉｐ６０群を大量に発現させることができる。生物種は適宜選択することができるが、生育性や取り扱いやすさの観点から、単細胞である菌類が好ましい。発現量と安全性の観点から、アスペルギルス・オリゼを使用することが特に好ましい。また、形質導入の方法は適宜選択することができるが、たとえばアスペルギルス・オリゼなどの糸状菌の場合には、プロトプラスト−ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）法を用いるのが好ましい。
【００３７】
アスペルギルス・オリゼへの形質導入にプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いる場合、たとえば以下の方法により形質導入をすることができる。つまり、まずアスペルギルス・オリゼに対し、ＹａｔａｌａｓｅＴＭ（タカラバイオ）を用いて細胞壁溶解処理を行う。具体的には、ＹＰＤ液体培地２００ｍｌ中にアスペルギルス・オリゼ（ＲＩＢ４０株：産業技術総合研究所）のｎｉａＤ遺伝子破壊株であるｎｉａＤ４００株（産業技術総合研究所）を植菌し、１００ｒｐｍ、３７℃で２０時間振とう培養する。次に、ガラスフィルター１７Ｇ１（柴田科学）を用いて培養液を濾過する。集まった菌をガラスフィルター１７Ｇ１内で滅菌水とＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を用いて洗浄する。洗浄後の菌を滅菌した薬さじなどで軽く押し、脱水する。次に、菌をチューブへ移し、ＹａｔａｌａｓｅＴＭの反応液３０ｍｌを加え、４０℃で３時間振とうさせ反応させる。
【００３８】
ＹａｔａｌａｓｅＴＭで反応させた後、上述のガラスフィルター１７Ｇ１を用いて培養液を濾過する。この際、ガラスフィルター１７Ｇ１を通過した液体をチューブに回収し、３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てる。次に、沈殿にＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を加えて懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てる。次に、沈殿に溶液１（ＮａＣｌ ４６．７５ｇ、１ＭのＣａＣｌ２ １０ｍｌ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍｌを蒸留水で１０００ｍｌに調整したもの）を１０ｍｌ加えて懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てる、という操作を２度行う。次に、沈殿に溶液１を５ｍｌ加えて懸濁し、懸濁液１を得る。懸濁液１から４０μｌを別のチューブに移す。懸濁液４０μｌ分に対し、ＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を９６０μｌ加えて懸濁し、懸濁液２を得る。
【００３９】
次に、懸濁液２から約１０μｌを分注し、血球検査盤と顕微鏡を用いて菌体量を測定する。その濃度に応じ、懸濁液１に溶液１を加えるか、再度遠心を行って加える溶液の量を前回より少なくするかすることにより、菌濃度が２．５×１０８／ｍｌの懸濁液３を得る。この懸濁液３に、懸濁液３の全量の１／４の溶液２（ＰＥＧ４０００ ４０ｇ、１ＭのＣａＣｌ２ ５ｍｌ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ５ｍｌを蒸留水で１００ｍｌに調整したもの）を加える。形質転換効率をさらに向上させるために、この後に４℃で約２０時間インキュベートするのが好ましい。
【００４０】
次に、懸濁液３から２００μｌずつ別のチューブに分注し、上述の耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）の溶液１０μｌを加えて混合し、氷中で１時間インキュベートする。次に溶液２を１ｍｌ加えて懸濁し、室温で２０分間インキュベートする。その後、懸濁液を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を完全に除去する。次に、沈殿にＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を１０ｍｌ加えて懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を除去する。沈殿にＮａＣｌ溶液（０．８Ｍ）を４００μｌ加え、懸濁する。
【００４１】
懸濁液を、ＣＤプレート培地（１０×ＣＤ ５０ｍｌ、グルコース１０ｇ、ＮａＮＯ３ １．５ｇ、ＮａＣｌ ２３．３８ｇ、 Ａｇｅｒ粉末 ７．５ｇを滅菌水で５００ｍｌにメスアップしたもの。ただし、１０×ＣＤは、ＫＣｌ １０ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．５ｇ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇを滅菌水で５００ｍｌにメスアップし、ｐＨを５．５に調整したもの）上に均一に塗布し、３０℃で約９６時間培養する。得られたコロニーに関し、ＣＤプレート培地を用いて４回継代培養を繰り返し、リパーゼＬｉｐ６０生成菌のコロニーを得る。これにより、従来のリパーゼよりもはるかに耐熱性の高いリパーゼＬｉｐ６０を大量に生産するリパーゼＬｉｐ６０生成菌（組み換え生物）を効率的に得ることができる。
【００４２】
なお、得られたリパーゼＬｉｐ６０生成菌のコロニーから、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などを用いてＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲを行うことにより、目的のＤＮＡを有するどうかを確認するのが好ましい。反応には、たとえばＡＯ６０遺伝子の塩基配列上に設計したプライマーを使用してもよい。ＰＣＲは、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法を利用することができる。
【００４３】
また、ｐＮＥＮ１４２のような染色体組み込み型のベクターを使用した場合、ＡＯ６０遺伝子群が染色体に組み込まれているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認してもよい。サザンハイブリダイゼーションには、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．などに記載されている方法を利用することができる。
【００４４】
（タンパク質の精製）
得られたリパーゼＬｉｐ６０生成菌から、リパーゼＬｉｐ６０の回収を行う。まず、リパーゼＬｉｐ６０の酵素抽出液を回収する。具体的には、たとえば得られたリパーゼＬｉｐ６０生成菌を液体のＹＰＤ培地（２００ｍｌ、ｐＨ５．５）を用いて１００ｒｐｍ、３０℃で約７２時間培養し、アスピレーターとガラスフィルター１７Ｇ１を用いて菌体とＹＰＤ培地とを分離する。これにより、菌体を菌体内酵素抽出液として、ＹＰＤ培地を菌体外酵素抽出液として回収する。
【００４５】
リパーゼＬｉｐ６０を後述の汚染物質の分解などの用途に用いる場合には、リパーゼＬｉｐ６０生成菌などの組み換え生物の状態で使用することもできるし、上述の菌体内酵素抽出液または菌体外酵素抽出液の少なくとも一方を使用することもできる。また、タンパク質の全活性を飛躍的に高めるために、リパーゼＬｉｐ６０生成菌を２４時間より長く培養するのが好ましい。また、タンパク質の全活性をさらに高め、かつ全タンパク質量も増大させるために、リパーゼＬｉｐ６０生成菌を４８時間よりも長く培養することがさらに好ましい。
【００４６】
菌体外酵素抽出液からタンパク質を分画するには、硫安分画（塩析）、溶液組成の変化による分離法、ショ糖密度勾配遠心分離法、クロマトグラフィーなどの種々の方法を使用することができる。たとえば硫安分画でタンパク質を分画する場合、まず硫安分画濃度早見表を基準に目的の濃度となる硫酸アンモニウムを計量し、乳鉢で細かくすりつぶす。ＹＰＤ培養液２００ｍｌに２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を３００ｍｌ加え、４℃で撹拌しながらすりつぶした硫酸アンモニウムの粉末を溶け残りが出ないようにゆっくりと加える。その後、４℃で１時間以上インキュべートする。次に、１００００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、タンパク質を回収する。硫酸アンモニウムの濃度をたとえば１〜３０％、３０〜６０％、６０〜８５％と濃度を変えて分画を複数回行う場合には、タンパク質沈殿物を回収後、所望の濃度に達するまで、菌体外酵素抽出液に再び硫酸アンモニウムを加える。回収したタンパク質沈殿物に２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を４０ｍｌ加え、酵素液１として回収する。リパーゼＬｉｐ６０の場合、たとえば、６０％の硫酸アンモニウム濃度において沈殿させることができる。なお、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を使用することもできる。
【００４７】
回収した酵素液１の脱塩処理を行うために、透析を行うことが好ましい。透析は、たとえば以下のように行うことができる。まず２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を約１２Ｌ作成し、最終濃度が約１ｍＭになるように塩化カルシウムを加え、４℃に冷却する。また、透析チューブを切り、蒸留水に約１時間浸すことにより、透析チューブに付着していたグリセロールなど除去する。その後、透析チューブの内部を蒸留水で洗浄し、チューブの一端をストッパーを用いて塞ぐ。次に、ガラス漏斗を使用し、内部に酵素液１を入れ、穏やかに撹拌させながら透析を行う。透析後の酵素液は、酵素液２として回収する。酵素液２をチューブなどに入れ、−８０℃で６時間以上置き、完全に凍結させる。その後、容器に空気の流通ができるようにしてから凍結乾燥瓶に入れ、凍結乾燥機にかけ、乾燥させる。
【００４８】
乾燥後の酵素液２からリパーゼＬｉｐ６０を精製するためには、種々の方法を使用することができる。たとえば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどを使用することができる。高い収率で高純度のリパーゼＬｉｐ６０を精製するためには、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを使用することがより好ましい。また、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を利用することもできる。
【００４９】
リパーゼＬｉｐ６０を精製するために陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する場合、担体としてたとえばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ（東ソー）を使用することが好適である。アスペルギルス・オリゼのリパーゼＬｉｐ６０は等電点が４．７４である。そのため、具体的にはまず、ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍを２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて平衡化する。平衡化されたＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍをカラム（２．５×４０ｃｍ ガラスエコノカラム：ＢｉｏＲａｄ製）に充填させる。充填後、カラムクロマトグラフィー装置（エコノグラジエントカラム：ＢｉｏＲａｄ製）へカラムおよびアダプターをセットし、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を流速５ｍｌ／分で担体であるＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍの３倍量以上流し、担体の洗浄と平衡化を行う。
【００５０】
次に、流速２ｍｌ／分で乾燥後の酵素液２を流し、ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍにタンパク質（リパーゼＬｉｐ６０）を吸着させる。その後、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）をＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍの３〜５倍量流し、カラム内を洗浄する。その後、流速１ｍｌ／分で流出バッファー（５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に１Ｍの硫酸アンモニウムを加えたものを０〜１００％の濃度勾配で使用）を流し、５ｍｌずつ８０本のチューブにフラクションを回収する。なお、流速２．５ｍｌ／分、フラクションは５ｍｌずつ回収、流出バッファーとして、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に０．５Ｍの硫酸アンモニウムを加えたものを０〜１００％の濃度勾配で使用するという条件であれば、より高収率かつ高純度でリパーゼＬｉｐ６０を精製することが可能である。
【００５１】
また、リパーゼＬｉｐ６０を精製するためにゲルろ過クロマトグラフィーを使用する場合、担体としてたとえばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲ（ＧＥヘルスケア）を使用することが好適である。具体的には、まず、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００を５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄し、平衡化を行う。次に、カラム（１．５ｃｍ×１００ｃｍ ガラスエコノカラム：ＢｉｏＲａｄ製）に充填を行う。まず、ブルーデキストランを含む既知タンパク質分子量マーカー（７５０００、４４０００、２９０００、１３７００、６５００（Ｄａ））を分画させ、検量線を作成する。１ｍｌのサンプルが完全に担体内に入ったことを確認してから、流出バッファーを１ｍｌ加える。流出バッファーは、５０ｍＭ酢酸バッファーに０．１５Ｍ塩化ナトリウムを加えたものを使用してもよい。その後、カラムをポンプに接続して流速１ｍｌ／ｍｉｎで流出バッファーを流す。６０ｍｌ程流出させた後、１ｍｌずつ８０本のフラクションを回収する。
【００５２】
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する場合にもゲルろ過クロマトグラフィーを使用する場合にも、回収後の各フラクションについて、吸光度計を用いて２８０ｎｍの波長で吸光度の測定を行い、タンパク質量の測定を行う。また、各フラクションに関してリパーゼ活性の測定も行い、回収後のタンパク質と酵素活性の関係を示すグラフを作成することにより、リパーゼＬｉｐ６０が含まれているフラクションを同定する。以上の手順により、精製されたリパーゼＬｉｐ６０を効率的かつ高純度で回収することができる。具体的には、たとえば表１のような収率で高純度なリパーゼＬｉｐ６０を精製することが可能である。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１は、粗酵素液、６０％の硫安分画後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍで精製後、およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲで精製後のリパーゼＬｉｐ６０の活性や収率をあらわす。ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍでは６０％の硫安分画よりも比活性の高いリパーゼＬｉｐ６０を高い収率で得ることができる。また、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲでは、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍに比べて収率は低いが、比活性が著しく高く、極めて高純度のリパーゼＬｉｐ６０を得ることができる。
【００５５】
（電気泳動）
精製後のリパーゼＬｉｐ６０の電気泳動には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用することができる。たとえば、レディーゲルＪ １２．５％（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定電圧（２００Ｖ）で電気泳動を行うことができる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を利用することができる。
【００５６】
（活性染色）
上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、特定のバンドがリパーゼであるかどうかを確認するためには、活性染色（ザイモグラム）を行うことができる。活性染色の基質には、たとえば４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ（シグマ・アルドリッチ）を使用することができる。まずＭＵＦ−ｂｕｔｙｒａｔｅを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）の存在下でＥｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ（和光純薬）の原液で溶解させ、２５ｍＭの基質溶液を作製する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを蒸留水で洗浄し、ＣＢＢで染色し、タンパク質のバンドを確認後、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）にゲルを浸し、そこに基質溶液を最終濃度が１００μＭとなるように加え、室温で約１時間インキュべートして活性染色を行う。その後、ゲルにＵＶを照射し発光させる。ＣＢＢ染色後のタンパク質のバンドと活性染色のバンドとを比較することにより、特定のバンドがリパーゼであるかどうかを確認することができる。また、リパーゼＬｉｐ６０の検出には、ウェスタンブロッティング法を使用することもできる。
【００５７】
（タンパク質の定量）
精製後のリパーゼＬｉｐ６０のタンパク質の定量には、既知のさまざまな方法を用いることができる。たとえば、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯＲＡＤ）を使用することができる。また、「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平、編集 南江堂（１９８７年）や、「タンパク質実験ノート」岡田雅人、宮崎香 編集 羊土社（２００５年）などに記載されている方法を利用することもできる。
【００５８】
なお、公知の種々の方法を用いて無細胞系によりリパーゼＬｉｐ６０の発現および精製を行うこともできる。
【００５９】
（活性）
野生型のアスペルギルス・オリゼでは、リパーゼＬｉｐ６０の発現量は非常に低い。一方、本発明に関するＡＯ６０遺伝子を過剰に発現するアスペルギルス・オリゼ（組み換え生物）では、上述の解析で容易に検出可能な程度に、リパーゼＬｉｐ６０の発現量が高くなっている。したがって、ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２によって形質導入されたアスペルギルス・オリゼは、耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０を大量に生産しうる点で非常に有用である。また、ＡＯ６０遺伝子が組み込まれたＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２も、アスペルギルス・オリゼに形質転換された場合に、このようにリパーゼＬｉｐ６０を大量に生産しうる点で、同様に非常に有用である。
【００６０】
また、４０℃におけるリパーゼＬｉｐ６０の活性の絶対値は、２．３ Ｕ／ｍｌ（Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。これは、通常のリパーゼに劣らない活性である。また、リパーゼＬｉｐ６０は、脂質の加水分解だけではなく、エステル合成反応も行うことができる。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０は、たとえば１−モノオレインをオレイン酸に加水分解したり、１，３−ジオレインをオレイン酸および１−モノオレインに加水分解したり、トリオレインを１−モノオレイン、１，３−ジオレインおよびオレイン酸に加水分解したりすることができる。それに加えて、たとえば１，３−ジオレインをトリオレインにエステル合成することもできる。また、リパーゼＬｉｐ６０の反応温度は、２５〜７０℃が好ましく、３０〜５５℃がさらに好ましい。また、リパーゼＬｉｐ６０を５０〜７０℃という高温にて反応させることも可能である。また、リパーゼＬｉｐ６０を反応させる際のｐＨは、３．０〜７．０であることが好ましい。
【００６１】
（耐熱性）
ＡＯ６０遺伝子を過剰に発現するアスペルギルス・オリゼから精製したリパーゼＬｉｐ６０は、著しい耐熱性を有する。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０は、５０℃で２０分間インキュべートしても８０％以上の残存活性を有し、１００℃で２０分間インキュべートしても、残存活性がほとんど低下することなく、約６０％の残存活性を有する。また、リパーゼＬｉｐ６０は、インキュべートの時間を延ばした場合、５０℃では１００分を経過しても８０％以上の残存活性を有する。リパーゼＬｉｐ６０は、７０℃でインキュべートした場合にも、１００分を経過しても５０℃と同程度の残存活性を有する。また、リパーゼＬｉｐ６０は、９０℃で１００分間インキュべートした場合にも４０％以上の残存活性を有し、１００℃で１００分間インキュべートした場合にも約３０％の残存活性を有する。
【００６２】
なお、本発明で「残存活性を有する」とは、加熱後さらにリパーゼ反応に使用しうる程度に活性が残存していることをいい、通常約１０％以上、好ましくは約１５％以上、さらに好ましくは約２０％以上の活性を有していることをいう。つまり、リパーゼＬｉｐ６０は、１００℃で１００分間インキュべートした場合にも約３０％の残存活性を有するため、加熱後にリパーゼ反応に使用することが十分可能である。
【００６３】
このように、本発明のリパーゼＬｉｐ６０は、ＰＣＲに使用され、耐熱性を有する酵素として有名な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに匹敵する耐熱性を有する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓなどの高温下で生育する好熱性細菌より取得される。一方、本発明のリパーゼＬｉｐ６０は、驚くべきことに、耐熱性を有さないと考えられている生物であるアスペルギルス・オリゼから取得することができる。
【００６４】
つまり、本発明では、一般的な培養装置を用いて容易かつ大量にリパーゼＬｉｐ６０を生産することができる。また、得られたリパーゼＬｉｐ６０は、著しい耐熱性を有するとともに、通常の温度で反応させた場合に著しい耐久性をも有する。したがって、リパーゼＬｉｐ６０を従来通りの反応に使用する場合にも、長時間反応させることができるようになる。
【００６５】
また、細胞系を用いてリパーゼＬｉｐ６０を生産する場合、ゲノム中にＡＯ６０遺伝子を持たないような菌種も含む、様々な菌種を使用することができる。しかし、アスペルギルス・オリゼを使用することが安全性および生産性の観点から特に好ましい。アスペルギルス・オリゼの株としては、たとえばＲＩＢ４０株（産業技術総合研究所）などが挙げられる。リパーゼＬｉｐ６０の生産菌であるアスペルギルス・オリゼは、食品加工に古くから利用されているので、非常に安全性の高い菌として認められている。このように、菌自体に汎用性が高く、しかもその菌によって生産されるリパーゼＬｉｐ６０が著しい耐熱性を示すことから、様々な食品加工や食品製造の原料、医薬品、化粧品の分野に応用可能と考えられる。
【００６６】
なお、ＡＯ６０遺伝子群およびこれらと相同性のある遺伝子の塩基配列をベクターに組み込み、別の種または無細胞系でリパーゼＬｉｐ６０を発現させることにより、これらの用途に使用してもよい。
【００６７】
（分子系統解析）
まず、アスペルギルス・オリゼ自身のゲノム中において、パラロガス遺伝子（同一ゲノム内で、異なる遺伝子座を占める類似した構造と機能をもつ遺伝子。パラローグともいう）の探索を行った。
【００６８】
アスペルギルス・オリゼのリパーゼＬｉｐ６０のアミノ酸配列を問い合わせ配列とし、ＤＯＧＡＮ（Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｄ ａｔ ＮＩＴＥ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／Ｔｏｐ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、相同性検索を行った。検索にはＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用し、その他はデフォルト設定にて検索を行った。
【００６９】
その結果、スコアが最高の配列（ＡＯ０９０００３０００８６６遺伝子）でさえ、局所的に低い相同性（３８アミノ酸にわたる相同性が３４％）が検出されただけで、しかもリパーゼドメインをもつ遺伝子の配列ではないことが明らかとなった。このことから、ＡＯ６０遺伝子と遺伝子全体にわたり３０％以上の相同性を有し、かつリパーゼ活性を有するようなパラロガス遺伝子は、アスペルギルス・オリゼのゲノム中には存在しないと考えられる。
【００７０】
遺伝子ファミリーに属する遺伝子は、類似する機能を担っていることが多いため、互いにある程度高い相同性を有するのが一般的である。しかし、本発明のリパーゼは、後述するように実際にリパーゼとしての活性を有しているにもかかわらず、アスペルギルス・オリゼの種内に存在する約１９０の遺伝子との間でさえ、遺伝子の大部分の領域においてＴＢＬＡＳＴＮで検出できる程度の相同性を有さないことが明らかとなった。これは、本発明のリパーゼのアミノ酸配列自体が非常に特殊であることを意味する。
【００７１】
次に、アスペルギルス・オリゼとそれ以外の種との間でアミノ酸配列の比較解析を行った。まず、ＡＯ６０遺伝子のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、米国の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用い、相同性検索を行った。検索にはＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用し、その他はデフォルト設定（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ： ３， Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２， Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ： Ｅｘｉｔｅｎｃｅ １１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）にて検索を行った。
【００７２】
その結果、スコアが２００よりも大きく、かつＥ−ｖａｌｕｅ（そのライブラリで偶然に同じスコアでヒットする本数の期待値）がｅ−５０よりも小さな配列として、のべ１６配列がヒットした。これらはいずれも機能が未知である遺伝子のアミノ酸配列である。また、これらの中には、同じ種の同じ遺伝子のものであると考えられる重複する配列も存在した。したがって、そのような重複する配列は以下の解析から除外した。
【００７３】
その結果、アスペルギルス属の配列として、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）のＡＦＬＡ＿０５４０２０遺伝子の配列（アミノ酸の配列番号：ＸＰ＿００２３８３５２７）と、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＡｎ１３ｇ０２８２０遺伝子の配列（ＸＰ＿００１３９６４１７）と、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＡＮ８５００．２遺伝子の配列（ＸＰ＿６８１７６９）とを取得した。
【００７４】
また、アスペルギルス属と同じマユハキタケ科に属するアオカビ属の配列として、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ１６ｇ１１４１０遺伝子の配列（アミノ酸の配列番号：ＸＰ＿００２５６１４４４）と、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）のＰＭＡＡ＿０９８４４０遺伝子の配列（ＸＰ＿００２１４９４２１）を、タラロミセス属の配列として、タラロミセス・スティピタトゥス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）のＴＳＴＡ＿０４２７３０遺伝子の配列（ＸＰ＿００２４８４７５１）を、それぞれ取得した。
【００７５】
また、アスペルギルス・オリゼの属する子嚢菌門とは異なる、放線菌門に属するクリベラ・フラビダ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ）のＫｆｌａ＿１６６３遺伝子の配列（アミノ酸の配列番号：ＣＰ００１７３６）も取得した。また、クリベラ・フラビダ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ）は、上述のようにアスペルギルス・オリゼとは分類学上、門が異なる。にもかかわらず、Ｋｆｌａ＿１６６３遺伝子は、ＡＯ６０遺伝子のコード領域のほぼ全体に相当する、８番目のアミノ酸から２７４番目までの領域において、４８％のアミノ酸レベルの相同性（上述のＴＢＬＡＳＴＮの検出結果に基づく）を有することが明らかとなった。
【００７６】
同様に、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰプログラムを使用し、デフォルト設定（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ： ３， Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２， Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ： Ｅｘｉｔｅｎｃｅ １１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）にて相同性検索を行った。そして、スコアが２００よりも大きく、かつＥ−ｖａｌｕｅがｅ−５０よりも小さな配列として、上記の配列以外に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＡ４）のＬｉｐＡ遺伝子のアミノ酸配列（ＺＰ＿０５４８３２１１）を取得した。
【００７７】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＡ４）は、アスペルギルス・オリゼや上述の他の生物とは異なり、原核生物である。にもかかわらず、このＬｉｐＡ遺伝子は、ＡＯ６０遺伝子のコード領域のほぼ全体に相当する２１番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸までの領域において、５９％のアミノ酸レベルの相同性（上述のＢＬＡＳＴＰの検出結果に基づく）を有することが明らかとなった。原核生物の系統と真核生物の系統は２０億年以上も前に分岐したと考えられている。したがって、そのような非常に遠縁な生物の遺伝子間にこれほど高い相同性があることは驚くべきことである。
【００７８】
図１は、ＡＯ６０遺伝子群の系統関係を示す分子系統樹を示す図である。解析に使用したのは、ＡＯ６０遺伝子および上述の８つの遺伝子のアミノ酸配列である。まず上述のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン２．０１２）を用いてアラインメントし、近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ＮＪ法）を用いて分子系統樹を作成した。分子系統樹の作成には、デフォルトの設定を使用した。アラインメントによって生じた配列のギャップを除去することにより、分子系統樹を作成した。分子系統樹の表示には、Ｎｊｐｌｏｔ（バージョン２．３）を使用した。
【００７９】
上述のように、アスペルギルス・オリゼの種内にはＡＯ６０遺伝子と相同性のあるリパーゼは存在しないことから、これらの８つの遺伝子は、アスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子のオルソロガス遺伝子（複数の種間で保存された遺伝子で、共通の祖先遺伝子から派生した遺伝子。オルソローグともいう）であると考えられる。つまり、ＡＯ６０遺伝子群に属する遺伝子は、それぞれの生物においてアスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子と同一または極めて近似した機能を担っており、したがってＡＯ６０遺伝子と同様に顕著な耐熱性を有すると考えられる。
【００８０】
上述の系統解析では、ＡＯ６０遺伝子と相同性のある遺伝子（いずれも機能は未知）が各種から１遺伝子ずつ見つかった。したがって、菌類から原核生物までを含む幅広い種の多くにおいて、ＡＯ６０遺伝子のオルソロガス遺伝子が原則的に１種に１つずつ存在し、これらの遺伝子から生み出されるリパーゼの多くが、耐熱性を有するものと考えられる。
【００８１】
ここで、ＮＣＢＩのｂｌ２ｓｅｑのＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いてデフォルト設定（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ： ３， Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２， Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ： Ｅｘｉｔｅｎｃｅ １１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）にてアミノ酸配列の全長をアラインメントした場合、アスペルギルス・オリゼのＡＯ６０遺伝子とのアミノ酸配列レベルの相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、アスペルギルス・フラバスで１００％、ペニシリウム・クリソゲナムで７２％、アスペルギルス・ニガーで７０％、アスペルギルス・ニデュランスで６６％、タラロミセス・スティピタトゥスで６２％、ペニシリウム・マルネフェイで６０％、ストレプトマイセスで５９％、クリベラ・フラビダで４８％である。
【００８２】
また、上述のとおり、アスペルギルス・オリゼには、相同性検索で検出できる程度にＡＯ６０遺伝子と相同性を有するようなパラロガス遺伝子は存在しない。したがって、アミノ酸配列レベルでＡＯ６０遺伝子と４８％（アスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダの相同性）を上回る相同性があれば、本発明で生産されるリパーゼＬｉｐ６０と同様にリパーゼ活性および耐熱性を有すると考えられる。また、アミノ酸配列レベルでＡＯ６０遺伝子と５０％以上の相同性を有することが好ましく、６０％以上の相同性を有することがさらに好ましく、７０％以上の相同性を有することが最も好ましい。
【００８３】
また、アスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダとの間のように、４８％程度のアミノ酸配列の相同性を有するリパーゼであれば、同様のリパーゼ活性および耐熱性を有すると考えられる。したがって、ＡＯ６０遺伝子群に属する遺伝子と同程度の相同性を有しさえすれば、生物種は問わない。今後ゲノムの解読が進み、さらに多くの生物種のゲノム配列がデータベースに登録されると考えられるが、本発明で行った相同性検索と同程度の条件で検出されるアミノ酸配列であれば、同様にリパーゼ活性と耐熱性を有すると考えられる。たとえば、アスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダ間には、上述のように４８％の相同性があるが、新たに登録されるＡＯ６０遺伝子群の配列には、クリベラ・フラビダとの相同性が同様に４８％で、アスペルギルス・オリゼとの遺伝子の大部分の領域にわたる相同性が約３０％程度しかないものも予想される。このようなものも、本発明の耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０群をコードするＡＯ６０遺伝子群に含まれる。また、ＡＯ６０遺伝子群の塩基配列に人工的に改変を加えたものを本発明に使用してもよい。
【００８４】
本発明に関するＡＯ６０遺伝子と同様に耐熱性を有するリパーゼは、上述の相同性の基準を満たすことに加えて、またはそれにかえて、リパーゼＬｉｐ６０群のうち少なくともいずれか１つとアミノ酸配列のレベルで約４８％以上の相同性を有するリパーゼをコードするＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であってもよい。
【００８５】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたは配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。
【００８６】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれであってもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件においては、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。
【００８７】
ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８８】
図２は、ＡＯ６０遺伝子群のアラインメントを示す図である。ＡＯ６０遺伝子および上述の８つの遺伝子（それぞれ属名は略して示す）のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン２．０１２）を用いてアラインメントし、開始コドンの位置が揃うように微修正したものである。このように、非常に遠縁な種間で、ＡＯ６０遺伝子群のアミノ酸配列には非常に高い相同性があることが分かる。
【００８９】
また、図２のアラインメントから、本発明によって生産されるリパーゼＬｉｐ６０群は、活性中心付近の網掛けで示した位置（配列番号１のアスペルギルス・オリゼのアミノ酸１０７〜１１６に相当）に「Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｅ−Ｇ」（ただし、Ｘ１はリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）、Ｘ２はバリン（Ｖ）またはイソロイシン（Ｉ）、Ｘ３はロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ））という、種間でほぼ完全に保存された配列を有することが明らかとなった。つまり、リパーゼＬｉｐ６０群と同様のリパーゼ活性を有するためには、これらの配列を活性中心に有していればよい。
【００９０】
なお、活性中心にこのコンセンサス配列を有するリパーゼであれば、仮にリパーゼ全体のアミノ酸配列レベルでの相同性がアスペルギルス・オリゼとクリベラ・フラビダとの間の４８％未満であったとしても、耐熱性を有する可能性がある。逆に、このコンセンサス配列の一部に改変が加えられたとしても、耐熱性を保持できる可能性もある。網掛けで示した他の箇所に関しては後述する。
【００９１】
（アミノ酸組成）
ＡＯ６０遺伝子群に含まれる上述の９つの遺伝子から得られるリパーゼのアミノ酸配列のアミノ酸組成（％）を表２に示す。遺伝子名の後には、アミノ酸配列の長さをそれぞれかっこ書きで示した。非特許文献２に記載のアスペルギルス・ニガーの耐熱性を有するとされるリパーゼ遺伝子のアミノ酸組成も示した。また、耐熱性を有することが知られていない非特許文献３に記載のホスホリパーゼＡ１遺伝子（ＮＣＢＩなどにアミノ酸配列がＸＰ＿００１８１８６９４．１の番号で登録されているＡＯ０９０００１０００１４３遺伝子と同一であることが判明した）に関しても、同様の解析を行った。なお、非特許文献２に記載のリパーゼ遺伝子は、塩基配列およびアミノ酸配列が公表されていないため、非特許文献２の表３に記載のアミノ酸組成のデータを使用し、比較を行った（アミノ酸配列の長さは公表されていない）。非特許文献２の列の（８．２７）という記載は、アスパラギン（Ｎ）とアスパラギン酸（Ｄ）の組成の合計が８．２７％であることを表す。同様に（１８．８４）という記載は、グルタミン（Ｑ）とグルタミン酸（Ｅ）の組成の合計が１８．８４％であることを示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
本解析により、耐熱性を有するとされる非特許文献２リパーゼおよび耐熱性を有することが知られていない非特許文献３のリパーゼと比べ、本発明のリパーゼＬｉｐ６０群のアミノ酸組成には、少なくとも以下の特徴がある。つまり、リパーゼＬｉｐ６０群は、通常の耐熱性リパーゼに比べ、（１）バリン（Ｖ）を７．２％以上という高い割合で含む。また、本発明のＬｉｐ６０群は、（２）セリン（Ｓ）を６．５％以下という低い割合でしか含まない。また、本発明のＬｉｐ６０群は、（３）ヒスチジン（Ｈ）を含む割合がやや低い。
【００９４】
また、リパーゼＬｉｐ６０群では、翻訳後、分子内に特殊な構造が形成される可能性がある。たとえば、リパーゼＬｉｐ６０群は、非特許文献２および非特許文献３よりもそれほどシステイン（Ｃ）残基の割合が高いわけではないが、これら従来知られているリパーゼや他の酵素と比較し、２つのシステイン（Ｃ）によって形成されるジスルフィド結合が特殊であると考えられる。図２の網掛けの６か所のシステイン（Ｃ）残基（配列番号２のアミノ酸配列の２７、６４、１７５、１７８、２３５、２６９番目のアミノ酸に相当）は、９種間で完全に保存されている。一方、これら６か所以外には、いずれの種もシステイン（Ｃ）残基を有さない。また、１７５番目と１７８番目のシステイン（Ｃ）は非常に近接しており、これらを中心として略線対称状に、６４番目と２３５番目のシステイン（Ｃ）、および２７番目と２６９番目のシステイン（Ｃ）がそれぞれ存在する。したがって、リパーゼＬｉｐ６０群の耐熱性には、６つのシステイン（Ｃ）が所定の間隔で所定の位置に存在すること、およびシステイン（Ｃ）同士のジスルフィド結合によって形成される立体構造が非常に重要であると考えられる。
【００９５】
（グリコシル化）
リパーゼＬｉｐ６０群に対して、翻訳後に修飾を行うことにより、耐熱性をさらに向上させてもよい。このような翻訳後修飾には、たとえばグリコシル化（糖鎖付加）が考えられる。グリコシル化には、アスパラギン（Ｎ）残基が修飾される場合（Ｎ結合型）と、セリン（Ｓ）残基またはトレオニン（Ｔ）残基が修飾される場合（Ｏ結合型）とが考えられる。
【００９６】
Ｎ結合型によってリパーゼＬｉｐ６０群のアミノ酸残基を修飾する場合には、「アスパラギン（Ｎ）−Ｘ（プロリン以外の任意のアミノ酸）−セリン（Ｓ）」または「アスパラギン（Ｎ）−Ｘ（プロリン以外の任意のアミノ酸）−トレオニン（Ｔ）」のいずれか（シークオン配列）のアスパラギン（Ｎ）残基を、糖鎖によって修飾してもよい。
【００９７】
リパーゼＬｉｐ６０群では、たとえば図２の網掛けで示した配列番号２のアミノ酸の１６０〜１６２番目に相当するアスパラギン（Ｎ）−バリン（Ｖ）−セリン（Ｓ）のうちのアスパラギン（Ｎ）または配列番号２のアミノ酸の２０３〜２０５番目に相当するアスパラギン（Ｎ）−ロイシン（Ｌ）−トレオニン（Ｔ）のうちのアスパラギン（Ｎ）の少なくとも一方を、糖鎖によって修飾してもよい。
【００９８】
リパーゼＬｉｐ６０群のアミノ酸残基を修飾する糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、キシロースなどのうちの１つ以上であってもよい。
【００９９】
なお、ＡＯ６０遺伝子群の塩基に人工的な変異を加え、Ｎ結合型のグリコシル化のためのシークオン配列、またはＯ結合型グリコシル化のためのコンセンサス配列を導入してもよい。このような導入は、突然変異導入法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって 塩基置換、塩基の挿入／欠失などの変異を加えることにより行ってもよい。
【０１００】
（耐熱性リパーゼの用途）
本発明の耐熱性のリパーゼＬｉｐ６０群は、トリグリセリドの脂肪酸の位置を自在に入れ替えたり、特定の脂肪酸を分解して無くしたり、また逆に特定の脂肪酸を付加させたりすることにより、油脂の改質に使用することができる。本反応は、たとえば乳化しやすい油、分解されやすい油、および分解されにくい油のように様々な機能を持った油脂の作製に利用できる。具体的には、食品製造・加工業界、廃棄物処理業界、医薬品業界などにおいて幅広く使用することができる。実用化例としては、米ぬか油、大豆油、ひまわり油、やし油などからリパーゼを用いて植物油を精製する植物水中油型乳化剤としての利用、油の物理的前処理、カカオ油などの脂肪酸鎖長の変換、化粧品の基材としてのモノグリセリドの製造、ジグリセリドの製造、化粧料の製造、生ゴミ処理に使用される微生物酵素製剤への配合、外食産業や食品工業などの施設から排出される油含有廃液の処理、乳加工製品のフレーバー改善、家畜用飼料への添加による栄養価の強化や消化性の改善などが挙げられる。また、特に、高温環境下において、または高温環境下におかれた後に、リパーゼ活性を発揮できるような用途に使用されることが好ましい。たとえば、リパーゼＬｉｐ６０群を用いて、５０〜７０℃において反応を行うことができる。また、たとえばリパーゼＬｉｐ６０群を５０℃以上の温度で通算１００分間以上加熱した後、リパーゼＬｉｐ６０群をリパーゼ反応に使用することができる。より具体的には、たとえば以下の用途が想定される。
【０１０１】
（用途１）
医薬原料（医薬に用途は問わない）を基質として、微小粒子形態又は不溶性表面を有する対象物の形態のナノ酵素複合体の酵素をプロテアーゼとした、ナノリパーゼ複合体を作用させる場合として、例えば、油脂を加水分解して脂肪酸を製造する場合や、エステル合成による界面活性剤の製造を行う場合や、光学分割を行う場合や、油脂・乳化剤等の改質等が挙げられる。
【０１０２】
特に、脂肪酸は、現在油脂を約５０気圧・２５０℃前後で分解するという、典型的な多消費型プロセスによって生産されている。従って、リパーゼＬｉｐ６０群により油脂を分解することに対する需要は非常に高い。しかしながら、通常、リパーゼは熱に弱く、６０℃、１０分で完全に失活し、使用温度は３０℃程度が限界という結果も示されている。そこで、リパーゼＬｉｐ６０群を用いることにより、その優れた耐熱性により、極めて効率的に脂肪酸を製造することが可能となる。なお、リパーゼＬｉｐ６０群自体を内服剤、例えば、消化酵素剤の有効成分として含有させ、耐熱性組成物として用いることも可能である。その場合、含有量は、約０．１〜９９質量％であることが好ましい。それにより、リパーゼＬｉｐ６０群の優れた安定性により、経口投与を行っても、失活しづらく、分散性も良好であり、所望する脂肪分解効果を効率的に得ることができる。
【０１０３】
（用途２）
皮膚の表面物質である基質に対して、リパーゼを作用させる場合に、皮膚外用剤の有効成分として、本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を用いる場合が考えられる。つまり、リパーゼを皮膚外用剤の有効成分として、皮脂等の皮膚表面物質と接触させる場合、美肌効果（化粧品等としての効果）を発揮し得ることが知られているが、このリパーゼの代わりに、リパーゼＬｉｐ６０群を有効成分として含有させ、含有させ、耐熱性組成物として用いることも可能である。その場合、含有量は、約０．１〜９９質量％であることが好ましい。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続され、様々な環境でも安定して機能すると考えられる。そのため、薬効が経時的に安定し、塗布の回数が少なくてすむ皮膚外用剤を提供することができる。
【０１０４】
（用途３：食品の加工）
食品前駆物質、具体的には、リパーゼで処理することによって最終的な食品とする物質をリパーゼの基質とする場合、従来のリパーゼにかえて本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を作用させることができる。食品加工の工程では、熱をかけて製品を作ることが非常に多い。そのため、リパーゼＬｉｐ６０群を使用すれば、高温環境下でもリパーゼの酵素活性をほとんど失わずに、効率的にリパーゼ処理工程を行うことができる。つまり、リパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で含有する耐熱性組成物をリパーゼで処理に使用することにより、加工の途中でリパーゼを追加したりする必要がないため、作業効率がアップし、コストを抑えることもできる。具体的には、麹の製造、発酵エキスの抽出、乳、卵加工品、肉、および日本酒などの酒、味噌、醤油等の発酵食品のフレーバーの改質、保存性の向上、起泡性の改良などのために、これらの食品の前駆物質にナノリパーゼ複合体を作用させることができる。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続し、様々な環境でも安定して機能すると考えられる。そのため、極めて効率的に脂肪の分解を行うことができる。
【０１０５】
（用途４：洗剤への配合）
洗濯物や食器などの被洗浄物に、従来のリパーゼにかえて本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を作用させることにより、油汚れを効率的に分解することができる。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で衣料用洗剤などに含有する耐熱性組成物を製造することができる。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続し、様々な環境でも安定して機能すると考えられる。したがって、効率的に油汚れを落とすことが可能となる。
【０１０６】
（用途５：汚染物質の分解）
環境負荷物質、例えば、富栄養化が進んでいる汚染領域に、本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を作用させることができる。具体的には、リパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で含有する耐熱性組成物を使用することができる。リパーゼＬｉｐ６０群は通常のリパーゼよりも活性が長時間持続し、ｐＨや温度が異なる様々な環境（特に酸性条件下）でも安定して機能すると考えられる。したがって、油脂系の汚染物質の分解を、極めて効率的かつ安価に行うことができる。
【０１０７】
（用途６：繊維の処理）
リパーゼによって繊維の表面を処理して肌ざわりや風合いをよくする技術が知られている。従来のリパーゼに代えて、本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜９９質量％の割合で含有する耐熱性組成物を用いることができる。それにより、リパーゼＬｉｐ６０群は活性が長時間持続するため、繊維処理を効率的に行うことができる。
【０１０８】
（用途７：飼料への配合）
本発明により製造されたリパーゼＬｉｐ６０群を約０．１〜２０質量％の割合で含有する耐熱性組成物（配合飼料）を製造することにより、家畜等の生体内でリパーゼＬｉｐ６０群を働かせることができる。リパーゼＬｉｐ６０群は、通常のリパーゼよりも活性が長時間持続することが期待できるため、家畜等の生育をより促進できるようになる。
【０１０９】
（有用性）
本発明は、アスペルギルス・オリゼという極めて安全な微生物が生産し、従来知られていなかった著しい耐熱性を有するリパーゼを、大量かつ簡便に生産する技術を提供することにある。本発明によって生産することができるリパーゼは、常温菌であるアスペルギルス・オリゼが生産する酵素でありながら、極めて高い耐熱性（１００℃、１００分間の加熱処理後にも約３０％の残存活性）を有している。アスペルギルス・オリゼのみならず、常温菌由来の酵素ではこのように著しい耐熱性を有するという報告はない。本発明によって生産することができるリパーゼは、耐熱性を有するとされてきた従来のリパーゼに比べてはるかに高い耐熱性を有している。このように熱に対する安定性が優れていることから、特に熱安定組成物の有効成分として、熱処理を行う食品加工などに幅広く利用することができると考えられる。
【０１１０】
従来のリパーゼでは、熱による酵素機能の低下が、生成物の収率低下や新しい酵素の再添加の必要性を招き、歩留まりの低さやコスト高の原因となっていた。しかしながら、耐熱性を有するリパーゼＬｉｐ６０群を提供することで、熱による酵素の機能低下が大幅に改善され、酵素の再添加なども大幅に軽減されることから、エネルギー消費も著しく抑制され、歩留まりも大幅に向上させることができる。その結果、環境への負荷が低減でき、コストも抑えられることから、工業的な利用価値は高い。さらには、バイオリアクターの技術を利用することで、リパーゼＬｉｐ６０群の反応効率をより向上させることもできる。
【０１１１】
また、アスペルギルス・オリゼは、リパーゼ遺伝子を約１９０種類保持していることが予想されているが、本発明では機能が分かっていなかったＡＯ６０遺伝子がリパーゼ活性を有することを明らかにし、さらに耐熱性ポリメラーゼなどの酵素に匹敵する耐熱性という、従来のリパーゼでは予想できなかった性質を明らかにした。本発明のリパーゼＬｉｐ６０群は、遺伝子工学の技術を利用することで、簡単にクローニングやタンパク質の発現および改変を行うことができるため、非常に汎用性が高い。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
リパーゼＬｉｐ６０生成菌の培養時間とリパーゼＬｉｐ６０の産出量との比較を行った。耐熱性リパーゼ発現ベクター（ＡＯ６０−ｐＮＥＮ１４２）を形質導入したリパーゼＬｉｐ６０生成菌（アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のｎｉａＤ遺伝子破壊株であるｎｉａＤ４００株）を、液体のＹＰＤ培地（２００ｍｌ、ｐＨ５．５）で１００ｒｐｍ、３０℃で２４時間、４８時間、７２時間、９６時間培養した。アスピレーターとガラスフィルター１７Ｇ１を用いて培養液から菌体とＹＰＤ培地とを分離し、ＹＰＤ培地の培養液（菌体外酵素抽出液）を回収した。菌体外酵素抽出液のタンパク質量、酵素活性値を各培養時間で比較した。Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質量の測定には、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯＲＡＤ）を使用した。
【０１１３】
まず牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用し、検量線を作成した。濃度がそれぞれ０ｍｇ、０．４７ｍｇ、０．７０５ｍｇ、０．９４ｍｇ、１．４１ｍｇのＢＳＡ溶液に関し、７５０ｎｍの吸光度を測定した。次に、菌体外酵素抽出液の吸光を測定し、検量線を利用して全タンパク質の定量を行った。
【０１１４】
酵素の全活性の測定には、合成基質であるｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅ（シグマ）をイソプロパノールで希釈して０．１５％のｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅ溶液として使用した。反応バッファーは、０．１％のＡｒａｂｉｃ ｇｕｍ（和光純薬）と０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬）を加えた５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を使用した。酵素反応停止薬として、０．１Ｍの炭酸ナトリウムを使用した。
【０１１５】
まず、試験管に反応バッファーを４０５μｌ入れ、そこにｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅ溶液を４５μｌ加え、十分に混合した。次に、混合液の温度を４０℃に保ちつつ、精製したリパーゼＬｉｐ６０を５０μｌ加え、５分間反応させた。その後、０．１Ｍの炭酸ナトリウムを加えて反応を停止させ、分光光度計を用いて４１０ｎｍの吸光度（遊離してくるｐＮＰの濃度）を測定した。ユニット計算のために、ｐＮＰ−ｐａｌｍｉｔａｔｅを用いて検量線を作成した。表３に、リパーゼＬｉｐ６０生成菌の培養時間とリパーゼリパーゼＬｉｐ６０の産出量との関係を示す。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
表３の全活性（Ｕ）を２４時間と４８時間で比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０は２４時間まではほとんど生産されず、その後４８時間までの間に急激に生産されることが明らかとなった。この全活性は、９６時間の培養時に最も値を示した。一方、全タンパク質量（ｍｇ）は、７２時間において最も高い値を示した。
【０１１８】
（実施例２）
薄層クロマトグラフィー （Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）を用いて、リパーゼＬｉｐ６０の天然基質（オリーブ油）に対する分解能を調べた。オリーブ油は、オレイン酸を主成分として含むため、オレイン酸と、１−モノオレイン、１，３−ジオレインおよびトリオレインとの間のエステル結合の加水分解能またはその逆の反応であるエステル合成能の指標として有用である。（Ｍ）マーカー（１−モノオレイン、１−３ジオレイン、トリオレイン、オレイン酸）、サンプルとして（１）１−モノオレイン、（２）１−モノオレインにリパーゼＬｉｐ６０を加えたもの、（３）１，３−ジオレイン、（４）１，３−ジオレインにリパーゼＬｉｐ６０を加えたもの、（５）オリーブ油、および（６）オリーブ油にリパーゼＬｉｐ６０を加えたものを使用した。
【０１１９】
展開溶媒としては、へキサン：ジエチルエーテル：酢酸を７０：３０：１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で混合したものを使用した。（Ｍ）、（１）、（３）および（５）では１−モノオレイン（シグマ）、１,３−ジオレイン（シグマ）、トリオレイン（シグマ）、オレイン酸（シグマ）各５ｍｇを加え、（２）、（４）および（６）ではさらに精製したリパーゼを２μｌずつ加えた。さらに乳化剤である１％トリトンＸ−１００を１μｌ加えた後、蒸留水および最終濃度が５０ｍＭとなるように酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加え、全量を１ｍｌに調整した。そして、バイオシェイカーを用いて１８００ｒｐｍ、４０℃にて１時間反応させた。その後、ジエチルエーテルを４００μｌ加えて撹拌した後、１５０００ｒｐｍ、室温にて５分間遠心分離を行った。上層（ジエチルエーテル層）をシリカゲル６０Ｆ２４５プレート（メルク）に乗せ、溶媒により展開（３０分間）した。その後、プレートを乾燥させ、酢酸：希硫酸混合液９５：５（Ｖ／Ｖ）をプレートに噴霧した後、１５０℃で熱しスポットを確認した。
【０１２０】
図３は、薄層クロマトグラフィーによるリパーゼＬｉｐ６０の天然基質に対する反応性を示す図である。
【０１２１】
図３では、左から順に上述の（Ｍ）、（１）、（２）、（３）、（４）、（５）および（６）のスポットをあらわす。上下方向は、上から順にトリオレイン、オレイン酸、１，３−ジオレインおよび１−モノオレインのスポットをあらわす。リパーゼＬｉｐ６０を加えていない（１）と比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０を加えた（２）では、１−モノオレインの一部がリパーゼＬｉｐ６０によってオレイン酸に加水分解されることが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０を加えていない（３）と比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０を加えた（４）では、１，３−ジオレインがオレイン酸および１−モノオレインに加水分解されることも明らかとなった。それに加えて、（４）ではトリオレインのスポットも見られることから、リパーゼＬｉｐ６０は１，３−ジオレインを加水分解するだけではなく、エステル合成反応も行うことが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０を加えていない（５）と比較することにより、リパーゼＬｉｐ６０を加えた（６）では、トリオレインが１−モノオレイン、１，３−ジオレインおよびオレイン酸に加水分解されることも明らかとなった。
【０１２２】
（実施例３）
図４は、本発明のリパーゼＬｉｐ６０を、バッファーの種類を変えて相対活性を比較した結果を示すグラフである。最もリパーゼ活性が高かったｐＨ６のリン酸バッファーの活性を１００％とし、活性の相対値（％）をあらわした。バッファーとして、それぞれ５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ３．０、 ４．０）、酢酸バッファー（ｐＨ４．０、 ５．０、 ６．０）、リン酸バッファー（ｐＨ６．０、 ７．０、 ８．０）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０、 ９．０）を使用した。これらのバッファー中で、精製後のリパーゼを４０℃で５分間反応させ、リパーゼ活性を測定した。酵素の活性量の測定方法は、これらのバッファーを除き、実施例１と同じである。したがって、実施例１と重複する部分に関しては、適宜省略する。
【０１２３】
リン酸バッファーでは、ｐＨ６．０のときに最もリパーゼ活性が高く、７．０、８．０とｐＨが上がるにつれ、急激に活性が低下した。また、次に高い活性を示した酢酸バッファーでは、ｐＨ４．０において約９３％、ｐＨ５．０において約８９％、ｐＨ６．０において約９８％と、酸性条件の広い範囲で非常に高い安定性を示した。また、クエン酸バッファーでも、ｐＨ３．０でｐＨ６のリン酸バッファーに対して約８０％、ｐＨ４．０で約８８％と、安定して高い活性を示した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーでは、ｐＨ８．０のときに約５５％の活性を示した。
【０１２４】
また、総じて、ｐＨが７．０以下のときにリパーゼが高い活性を示した。特にｐＨ３．０〜７．０の範囲では、リパーゼは高い活性を示した。リン酸バッファーではｐＨ８．０のときに活性が見られなかったことから、少なくともｐＨが７．０よりも大きい場合には、リパーゼの活性はバッファーの種類に依存すると考えられる。
【０１２５】
（実施例４）
図５は、本発明のリパーゼＬｉｐ６０の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。精製したリパーゼＬｉｐ６０を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃および９０℃の８段階で反応させ、至適温度を調べた。図５では、最も高い活性を示した４０℃における活性量を１００％とし、その相対活性に基づいてグラフを作成した。なお、酵素の活性量の測定方法は、反応温度を除き、実施例１と同じである。したがって、実施例１と重複する部分に関しては、適宜省略する。
【０１２６】
４０℃におけるリパーゼＬｉｐ６０の活性の絶対値は、２．３ Ｕｎｉｔｓ／ｍｌであった。このことから、リパーゼＬｉｐ６０は通常のリパーゼに劣らない、高いリパーゼ活性を有することが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０は、４０℃の次に５０℃において高い活性（約９６％）を示した。また、リパーゼＬｉｐ６０は、リパーゼＬｉｐ６０は、３０℃でも高い活性（約８３％）を示し、６０℃でもある程度高い活性（５４％）を示した。また、リパーゼＬｉｐ６０は、７０℃でも約１５％の活性を示した。２０℃の活性（約４５％）と３０℃の活性から、リパーゼＬｉｐ６０は２５℃においても６０℃と同程度の活性（約５５％）を示すと考えられる。
【０１２７】
したがって、本発明のリパーゼＬｉｐ６０は、少なくとも２５〜６０℃の反応条件であれば、比較的高い活性を有することが明らかとなった。また、３０〜５５℃の反応条件であれば、最大活性の約８０％以上の高い活性を示すことも明らかとなった。このように、リパーゼＬｉｐ６０は、広い温度範囲において高い活性を有することが明らかとなった。また、リパーゼＬｉｐ６０は、５０〜７０℃という高温でも反応に使用することができることが明らかとなった。
【０１２８】
（実施例５）
図６は、本発明のリパーゼＬｉｐ６０を所定の温度でインキュべートした時間と残存活性との関係を示すグラフである。具体的には、上述のようにして精製したタンパク質を、５０℃、７０℃、９０℃および１００℃の定温条件下において、それぞれ２０分間、４０分間、６０分間および１００分間インキュべートした。リパーゼＬｉｐ６０の反応温度は、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ）を用い、精製後のリパーゼＬｉｐ６０をチューブに１００μｌずつ入れ、各温度で加熱し、反応後にはサンプルを氷上で冷却した。その後、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）中で、４０℃で１０分間リパーゼ反応を行い、加熱処理をしていないリパーゼＬｉｐ６０の活性を１００％とした場合の残存活性を測定した。ネガティブコントロール（ｎ．ｃ．）として、ＡＯ６０遺伝子を組み込まないｐＮＥＮ１４２を形質転換し、液体培養をしたＹＰＤ培地の上清を用いた。ネガティブコントロールに関しては、９０℃で５分間、１５分間、３０分間および６０分間インキュべートした後、残存活性を測定した。酵素の活性量の測定方法は、実施例１と同じである。したがって、実施例１と重複する部分に関しては、適宜省略する。
【０１２９】
まずネガティブコントロールでは、９０℃で５分間加熱した場合に完全に失活した。一方、本発明のリパーゼＬｉｐ６０では、５０℃で２０分間インキュべートしても８０％以上の残存活性を示した。また、１００℃でインキュべートしても、残存活性がほとんど低下することなく、６０％程度の残存活性を示した。
【０１３０】
また、インキュべートの時間を延ばした場合にも、リパーゼＬｉｐ６０は、５０℃では１００分を経過しても８０％以上の残存活性を示した。リパーゼＬｉｐ６０を７０℃でインキュべートした場合にも、１００分を経過しても５０℃と同程度の残存活性を示した。また、リパーゼＬｉｐ６０を９０℃で１００分間インキュべートした場合にも４０％以上の活性が残存しており、１００℃で１００分間インキュべートした場合にも約３０％の活性が残存していた。
【０１３１】
それぞれの温度で見ると、リパーゼＬｉｐ６０を５０℃で加熱した場合には、初めに少し活性が落ちただけで、２０分後から１００分後まで、ほとんど活性が低下しなかった。具体的には、５０℃で加熱した場合には、２０分後に約８２％、４０分後に約８０％、６０分後に約８２％、１００分後に約８２％の活性を有していた。
【０１３２】
また、７０℃で加熱した場合にも、初めに少し活性が落ちただけで、２０分後から１００分後まで、ほとんど活性が低下しなかった。具体的には、７０℃で加熱した場合には、２０分後に約７５％、４０分後に約７４％、６０分後に約８０％、１００分後に約７２％の活性を有していた。
【０１３３】
また、９０℃で加熱した場合にも、従来の耐熱性リパーゼに比べ、はるかに高い耐熱性を示した。具体的には、９０℃で加熱した場合には、２０分後に約６８％、４０分後に約６２％、６０分後に約５２％、１００分後に約４２％の活性を有していた。
【０１３４】
また、１００℃で加熱した場合にも、従来の耐熱性リパーゼに比べ、はるかに高い耐熱性を示した。具体的には、１００℃で加熱した場合には、２０分後に約５８％、４０分後に約４４％、６０分後に約３６％、１００分後に約２６％の活性を有していた。
【０１３５】
以上、本発明を上述の実施の形態や各実施例を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態や各実施例に限定されるものではなく、実施の形態や各実施例の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態や各実施例における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態や各実施例も本発明の範囲に含まれうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列をコードし、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する耐熱性リパーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％以上であるアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列を有する耐熱性リパーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する耐熱性リパーゼ発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の耐熱性リパーゼ発現ベクターを有することを特徴とする組み換え生物。
【請求項５】
請求項３に記載の耐熱性リパーゼ発現ベクターを用いて、細胞系または無細胞系にて耐熱性リパーゼを発現させる耐熱性リパーゼの発現方法。
【請求項６】
請求項２に記載の耐熱性リパーゼを用いて、５０〜７０℃において反応を行うことを特徴とする耐熱性リパーゼの反応方法。
【請求項７】
請求項２に記載の耐熱性リパーゼを５０℃以上の温度で通算１００分間以上加熱した後、該耐熱性リパーゼをリパーゼ反応に使用することを特徴とする耐熱性リパーゼの反応方法。
【請求項８】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有し、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する耐熱性リパーゼを含有する耐熱性組成物。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％以上であるアミノ酸配列。
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列をコードし、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する耐熱性リパーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％以上であるアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列を有する耐熱性リパーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する耐熱性リパーゼ発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の耐熱性リパーゼ発現ベクターを有することを特徴とする組み換え生物。
【請求項５】
請求項３に記載の耐熱性リパーゼ発現ベクターを用いて、細胞系または無細胞系にて耐熱性リパーゼを発現させる耐熱性リパーゼの発現方法。
【請求項６】
請求項２に記載の耐熱性リパーゼを用いて、５０〜７０℃において反応を行うことを特徴とする耐熱性リパーゼの反応方法。
【請求項７】
請求項２に記載の耐熱性リパーゼを５０℃以上の温度で通算１００分間以上加熱した後、該耐熱性リパーゼをリパーゼ反応に使用することを特徴とする耐熱性リパーゼの反応方法。
【請求項８】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有し、９０℃において５分以上加熱した場合にも残存活性を有する耐熱性リパーゼを含有する耐熱性組成物。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列との相同性が４８％以上であるアミノ酸配列。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１６７１１７（Ｐ２０１１−１６７１１７Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３３４１１（Ｐ２０１０−３３４１１）
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５９３１６５４８７）学校法人金沢工業大学 (202)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５９３１６５４８７）学校法人金沢工業大学 (202)
【Ｆターム（参考）】
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