肝星細胞前駆細胞及びその細胞を単離する方法
本発明は、肝星細胞の前駆細胞、その細胞を含む組成物及びその細胞を単離する方法に関する。前駆細胞の表面抗原プロフィールは、ＭＨＣクラスＩａ陰性、ＩＣＡＭ−Ｉ＋、ＶＣＡＭ−Ｉ＋、β３−インテグリン＋である。これらの表面マーカーの発現に加えて、その細胞はまた、細胞内マーカーであるデスミン、ビメンチン、平滑筋αアクチン、ネスチン、肝細胞増殖因子、間質細胞由来因子１α及びＨｌｘホメオボックス転写因子を発現する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年５月２６日出願の米国仮特許出願第６０／８０８，５４８号の便益を主張し、その全ての内容は参照により本開示に含まれるものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、概略的には成熟肝を含む細胞の前駆体に関する。より詳細には、本発明は、肝星細胞の前駆細胞、その細胞を含む組成物及びその細胞を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝星細胞（ＨｐＳｔＣ）は、１９世紀にＫｕｐｆｆｅｒによって初めて記述され、顕微鏡下で見たときのそれらの「星のような（ｓｔｅｌｌａｒ）」輝きのために「Ｓｔｅｒｎｅｌｌｅｎ」と称された。ＨｐＳｔＣは、ディッセ腔（Ｓｐａｃｅ ｏｆ Ｄｉｓｓｅ）において認められる肝特異的間葉細胞であり、かなりの部分が、ビタミンＡを含む細胞質脂質滴からなる。実際に、脂質滴はＨｐＳｔＣの「輝き」の質に寄与する。
【０００４】
現在、ＨｐＳｔＣが、特に視力、生殖及び胚発生のために必要な、ビタミンＡ化合物の取込み、貯蔵及び放出において主要な役割を果たすことは一般的に認められている。哺乳動物では、通常、生体ビタミンＡ総量の約５０％〜８０％がＨｐＳｔＣに貯蔵される。
【０００５】
ＨｐＳｔＣはまた、肝における増殖因子、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）及びマトリックスメタロプロテイナーゼの産生においても中心的な役割を果たす。多くの報告が、ＨｐＳｔＣが肝細胞のためのいくつかのマイトジェン（ＥＧＦ、ＴＧＦα及びＨＧＦなど）を分泌し、肝発生と再生において中心的役割を果たすことを明らかにしている。同様に、多くの研究が、ＥＣＭ調節の失調が肝線維症及び肝硬変における因子であることを示している。更に、ＨｐＳｔＣの収縮特性は、それらが、血管において局所血流を制御する周皮細胞と類似の機能を有することを示唆している。これらを合わせて考慮すると、ＨｐＳｔＣのこれらの多様な機能は、健常肝機能及び肝機能不全におけるそれらの重要な役割を例証する。
【０００６】
ＨｐＳｔＣの重要性についての我々の理解が深まりつつある一方で、ＨｐＳｔＣの起源は不明のままである。初期肝発生において、前腸の内胚葉細胞は肝憩室を生じさせ、肝憩室は、次に、横中隔と呼ばれる周囲の中胚葉内へと発達し、肝細胞索を形成する。一部の研究者は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞が横中隔内の間葉細胞に由来し得ると推測したが、ＨｐＳｔＣはそこからは単離されておらず、免疫選択を可能にするか又は前駆体ＨｐＳｔＣを特徴づけるような表面マーカーはまだ同定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ＨｐＳｔＣに対する前駆体を特異的に同定するマーカーと、そのマーカーでそれらの前駆体を単離する方法と、が求められている。加えて、ＨｐＳｔＣ前駆細胞をインビトロで増殖させる方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様では、肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、（ａ）哺乳動物組織からの細胞の単細胞懸濁液を得ること、を含み、更に、任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｂ）ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞を単細胞懸濁液から除去すること、及び（ｃ）ビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を細胞懸濁液から単離すること、を含む方法を提供する。哺乳動物組織は、肝、膵、腸、肺又は骨髄細胞としてもよく、好ましくは肝である。前記方法は、ＶＣＡＭ及びβ３−インテグリンの少なくとも一方に関して陽性である細胞を細胞懸濁液から単離すること、ＣＤ４５を発現する細胞を細胞懸濁液から除去すること、並びにデスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を細胞懸濁液から単離すること、の少なくとも１つを更に含んでもよい。
【０００９】
幾つかの態様では、単離及び除去する工程は、フローサイトメーターで実施される。ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する細胞の除去は、それらの抗原を発現する細胞に対する種特異的抗体で、たとえばラット肝細胞におけるＲＴ１Ａに対する抗体を利用して実施してもよい。同様に、肝星細胞前駆細胞はヒト肝星細胞前駆細胞であってもよい。
【００１０】
本発明の更にもう１つの態様では、単離肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、（ａ）肝細胞の細胞懸濁液を得ること、及び（ｂ）任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｉ）ＩＣＡＭ−１抗原に関して陽性である細胞を肝細胞の単細胞懸濁液から単離すること、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ抗原に関して陽性である細胞を除去すること、及び（ｉｉｉ）フローサイトメーターでの測定においてビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を単離すること、を含み、前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法を提供する。方法は、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＣＤ４５又はその両方を発現する細胞を細胞懸濁液から除去すること、及びデスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を細胞懸濁液から単離すること、の少なくとも一方を更に含んでもよい。
【００１１】
本発明の他の態様では、ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離肝星細胞前駆細胞を提供する。本発明の更に他の態様では、ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離星細胞前駆細胞を無血清培地で培養することを含む、星細胞前駆細胞のクローン原性増殖の方法を提供する。この培地は、たとえばインスリン、トランスフェリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）若しくは上皮増殖因子（ＥＧＦ）又はそれらの組合せのような、増殖因子を更に含んでもよい。また、単離星細胞前駆細胞を、フィーダー細胞、たとえばＳＴＯ細胞の存在下で更に培養してもよい。
【００１２】
これに関して、本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において以下の説明で述べる又は図面に例示する成分の構成の詳細及び配置に限定されないことが了解されるべきである。本発明は、記述されているものに加えて具体化が可能であり、様々な方法で実行及び実施され得る。また、ここでならびに要約書において使用する成句及び用語は説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきではないことが了解されるべきである。
【００１３】
当業者は、本開示が根拠とする概念が、本発明のいくつかの目的を実施するために他の構造、方法及びシステムを設計するための基礎として容易に利用され得ることを認識する。それゆえ、特許請求の範囲は、そのような均等物を、それらが本発明の精神と範囲から逸脱しない限り包含するとみなされることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、１３ｄｐｃラット胎仔肝及び肺における自己蛍光細胞についてのフローサイトメトリー分析を示す。（Ａ）は、集団全体（ＡＬＬ）の前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）のパターンである。ＳＳＣの値に基づき、Ｒ１及びＲ２ゲートを作製し、それぞれ高（ＳＳＣｈｉ）及び低（ＳＳＣｌｏ）ＳＳＣを表わした。Ｒ１及びＲ２におけるＲＴ１Ａ及びＩＣＡＭ−１の発現パターンも示す。ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉ細胞（Ｒ２、右下）は、ラット胎仔肝における肝芽細胞である（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。数字は各象限のパーセンテージを示す。（Ｂ）集団全体（ＡＬＬ）、Ｒ１及びＲ２の自己蛍光パターンをＵＶレーザー及び４８８ｎｍレーザーで分析した。ＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルは４５０ｎｍフィルターで検出され、一方４８８ｎｍレーザーで励起した非特異的自己蛍光シグナルは５３０／３０バンドパスフィルターで測定した。ＵＶレーザー特異的自己蛍光細胞はＲ１及びＲ２（左上）において検出された。（Ｃ）ＲＴ１Ａ及びＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルの発現を検討した。ＵＶレーザー特異的自己蛍光細胞はＲＴ１Ａ−であった。ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞（矢印）が同定され、ラット肝芽細胞集団に対応した。（Ｄ）ＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルを１３ｄｐｃ胎仔肺細胞において分析した。肺細胞集団にはＵＶ特異的自己蛍光細胞は存在せず、全細胞の大部分がＲＴ１Ａ−である。非特異的自己蛍光細胞（胎仔肝における肝芽細胞集団に匹敵する）は検出されなかった。
【図２】図２は、ｖＡ＋細胞でのＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１発現を示す。（Ａ）１３ｄｐｃ胎仔肝でのＶＣＡＭ−１発現に関するフローサイトメトリーのヒストグラム。細胞の約１５％が細胞表面にＶＣＡＭ−１を発現した。黒いヒストグラムと白いヒストグラムは、それぞれ染色細胞と非染色細胞を示す。ＶＣＡＭ−１＋及びＶＣＡＭ−１−細胞をそれらの自己蛍光シグナルに関してフローサイトメトリーによって分析した。ｖＡ＋細胞及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞のすべてはＶＣＡＭ−１陽性を示している。数字は各象限のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＲＴ１Ａ及びＩＣＡＭ−１についての１３ｄｐｃ胎仔肝細胞の二色分析。Ｒ１細胞集団（ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋）はｖＡ＋細胞及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞のすべてを含む。これらの結果は、ｖＡ＋及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞がＶＣＡＭ−１＋ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋であることを指示する。
【図３】図３は、１３ｄｐｃ胎仔肝におけるｖＡ＋細胞、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞及びａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−細胞の抗原性プロフィールを示す。（Ａ）ＵＶ−自己蛍光及びＲＴ１Ａ発現に関するフローサイトメトリー分析。ＲＴ１Ａ−細胞集団において、４つのゲート（Ｒ１−Ｒ４）を自己蛍光シグナルに基づいて作製した。（Ｂ）各々のゲートされた細胞集団（Ｒ１−Ｒ４）に関するＶＣＡＭ−１対β３−インテグリン、ＰＥＣＡＭ−１又はＴｈｙ−１発現の二色分析。数字は各象限のパーセンテージを示す。主要Ｒ１細胞はＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋であり、一方Ｒ３細胞は均一にＶＣＡＭ−１を発現するが、β３−インテグリン、ＰＥＣＡＭ−１又はＴｈｙ−１は発現しない。
【図４】図４は、両能性肝芽細胞コロニーの免疫細胞化学を示す。ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋細胞をＦＡＣＳによって単離し、クローン細胞密度（１２穴プレートの１つの穴に２５０細胞；６６細胞／ｃｍ２）でＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上に置いた。１５日間の培養後、細胞を固定し、ＡＬＢ（赤色、中央図）及びＣＫ１９（緑色、右図）に対する抗体で染色した。１個の選別細胞から各々のコロニーを生成した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。肝コロニーの９５％以上（９５．７±０．４％；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）が、それぞれ肝細胞及び胆管分化を示す、ＡＬＢ＋ＣＫ１９−及びＡＬＢ−ＣＫ１９＋細胞を含んだ。
【図５】図５は、ＦＡＣＳによって分画した１４ｄｐｃ胎仔肝細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーン１：ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−、レーン２：ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋、レーン３：ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、レーン４：ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１−、レーン５：残りのＶＣＡＭ−１−細胞集団、レーン６：ｃＤＮＡなし。ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞は、ＳＤＦ−１α及びＨＧＦを強力に発現する。ｖＡ＋細胞は、ＨｐＳｔＣマーカー（デスミン、ネスチン、ビメンチン、ＳＭαＡ）に関して陽性であり、肝芽細胞マーカー（アルブミン及びＰｒｏｘ１）に関して陰性である。
【図６】図６は、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞のインビトロ増殖へのＬＩＦ及びＥＧＦの作用を示す。（Ａ）ＦＡＣＳによって単離した５００個のｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を、指示されている濃度のＬＩＦ及びＥＧＦの少なくとも一方を添加したＨＤＭプラスラミニンを含む９６穴プレートの穴に入れた。５日間の培養後、細胞増殖の程度をテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１によって測定した。ＬＩＦは、０．１ｎｇ／ｍｌという低濃度でｖＡ＋細胞の増殖を支持する。ＥＧＦはｖＡ＋細胞の増殖をわずかに改善した。（Ｂ）ＦＡＣＳによって単離した２５０個のＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋ｖＡ＋細胞を、ＥＧＦ及びＬＩＦの少なくとも一方を含むＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞に接種した。１２穴プレートを使用した。２週間の培養期間後、培養物をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（商標）で染色した。ＳＴＯ細胞はＬＩＦを発現するが、産生量は、外因性ＬＩＦ添加がない場合、細胞のクローン性増殖を支持するのに十分ではなかった。外因性ＬＩＦ及びＥＧＦの添加はｖＡ＋細胞のクローン性増殖を劇的に改善した。
【図７】図７は、ＦＡＣＳによって単離したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞に由来するコロニーの免疫細胞化学を示す。細胞を、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加したＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上に置いた。インビトロ培養の１５日後、培養物をデスミン又はネスチンに対する抗体で染色した。コロニー形成細胞はネスチン及びデスミンを発現するが、ＳＴＯ細胞はどちらも発現しない。
【図８】図８は、ＦＡＣＳによって単離し、２ヶ月間培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の免疫細胞化学を示す。選別した細胞を、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加したＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上に置いた。増殖細胞を新鮮ＳＴＯフィーダー細胞上で５回継代培養した。培養した細胞をデスミン又はネスチンに対する抗体で染色した。増殖細胞において、培養期間中ネスチン及びデスミンの発現が維持されることが示されている。
【図９】図９は、２ヶ月間培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の表現型特徴を示す。（Ａ）培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。細胞をＦＡＣＳによって単離し、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加したＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上で培養した。２ヵ月間の培養後、細胞をＦＡＣＳによって分画した。増殖ラット細胞及びマウスＳＴＯフィーダー細胞を、マウスＣＤ９８モノクローナル抗体の抗体染色後、ＦＡＣＳによって分画した。ＣＤ９８はマウスＳＴＯ細胞上で発現され、モノクローナル抗体はマウスＣＤ９８と特異的に反応するが、ラットＣＤ９８とは反応しない。ＲＮＡをｖＡ＋由来ラット細胞及びＳＴＯ細胞から単離した。正常ラットＨｐＳｔＣも使用し、対照のためにＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡをそれらのＲＮＡから合成し、ＨｐＳｔＣにおいて発現される様々な転写産物に特異的なプライマーによるＰＣＲに供した。（Ｂ）培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞についてのフローサイトメトリー。ＲＴ−ＰＣＲのために使用した細胞を抗ＶＣＡＭ−１又はＲＴ１Ａ抗体及びマウスＣＤ９８抗体で染色した。ＣＤ９８陰性画分をＶＣＡＭ−１又はＲＴ１Ａ発現に関して分析した。ラット胎仔肝におけるｖＡ＋細胞に由来する持続的増殖細胞は、検討した培養条件下で均一にＶＣＡＭ−１及びＲＴ１Ａを発現する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＨｐＳｔＣには、「脂肪細胞」、「脂肪摂取細胞」、「伊東細胞」、「類洞周囲細胞」及び「肝周皮細胞」を含む、様々な名称が与えられてきた。しかしながら、明瞭さのために、本明細書ではＨｐＳｔＣという用語だけを使用するが、この用語はありとあらゆる上記の他名称を有する同じ細胞の集団を指すことが了解されるべきである。同様に、ここでの教示は１つの種に限定されない。実際に、ここで提供する例は単に例示であり、限定と解釈されるべきではない。従って、本発明は、肝組織についてのその哺乳動物ソースによって限定されない。ＨｐＳｔＣ及びそれらの前駆体が由来し得る哺乳動物は、ヒト、げっ歯動物（たとえばラット、マウス、ハムスター）、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ及びヒツジを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＨｐＳｔＣ及び前駆体はヒトに由来する。本発明はまた、肝発生の特定段階に限定されない。それゆえ本発明は、死亡後時間の経過していない個体（たとえば死後約３０時間以内）からの肝組織を含む、胎児、新生児、小児及び成体肝組織の少なくとも１つに関して実施され得る。
【００１６】
本発明は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞（ここでは「ＨｐＳｔＣ前駆体」又は「前駆体ＨｐＳｔＣ」とも称される）を単離及び増殖する手法を提供する。ラット胎仔肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体を、細胞質ｖＡリッチ脂質滴による特異的自己蛍光を用いたフローサイトメトリーによって同定した。ｖＡ＋細胞の表面表現型は均一であると考えられ、それらはＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋ＰＥＣＡＭ−１−であった。それらの表面マーカーに加えて、ｖＡ＋細胞は、デスミン、ビメンチン、ＳＭαＡ及びネスチンを含むＨｐＳｔＣに特異的な中間フィラメントを発現する。
【００１７】
ＩＣＡＭ−１発現は胎児肝細胞において広く認められるが、β３−インテグリンはｖＡ＋細胞上で比較的特異的である。β３−インテグリンは、表面発現のためにα−インテグリン、αｖ−インテグリン又はαＩＩ−インテグリンを必要とする。選択は細胞型によって異なる。成体肝におけるＨｐＳｔＣの場合は、αｖ−インテグリンがα鎖のために使用される。それゆえ、ＨｐＳｔＣ前駆体はαｖ−インテグリンを発現する可能性が高い。興味深いことに、成体ＨｐＳｔＣ上で発現されるαｖβ３−インテグリンとＥＣＭリガンドの相互作用は、ＨｐＳｔＣの運命決定、すなわち増殖又はアポトーシスに影響を及ぼすと考えられた。αｖβ３−インテグリンは、成体ＨｐＳｔＣにアポトーシス応答を保護するための刺激シグナルを形質導入した。加えて、もう１つの報告は、αｖβ３−インテグリンがＰＥＣＡＭ−１に結合することを示した。それゆえ、理論に限定されることなく又は理論に縛られることなく、ＨｐＳｔＣ前駆体でのβ３−インテグリン発現は、胎児肝発生の間の増殖のために、周囲のＥＣＭリガンド又は、ＰＥＣＡＭ−１を発現する内皮細胞からの刺激シグナルを受容するために重要であると思われる。
【００１８】
ＦＡＣＳ分析では、胎児肝の肝芽細胞及びＨｐＳｔＣ前駆体においてＶＣＡＭ−１の高発現が検出されることが示されたが、後者は、更にＳＤＦ−１αも発現するので、造血細胞に対してより重要な役割を果たすと考えられる。ＳＤＦ−１αは、ＳＤＦ−１αの受容体であるＣＸＣＲ４を発現する造血幹細胞の強力な化学誘引物質である。このケモカインは、造血幹細胞／前駆細胞の骨髄への移動において中心的役割を果たし、ＶＣＡＭ−１へのＶＬＡ−４依存性接着を上方制御すると思われる。それゆえ、ＨｐＳｔＣ前駆体でのＳＤＦ−１α及びＶＣＡＭ−１の発現は、造血幹細胞／前駆細胞を胎児肝に補充するために極めて重要である可能性がある。
【００１９】
興味深いことに、ＶＣＡＭ−１は肝芽細胞で発現される。表面表現型及びｍＲＮＡ発現に加えて、肝芽細胞についてのインビトロＣＦＡによっても、ＶＣＡＭ−１＋細胞が肝芽細胞であることが明らかにされた。ＶＣＡＭ−１は、内皮細胞、筋原細胞又はＨｐＳｔＣなどの間葉細胞についての表面マーカーとして知られているので、この所見は予想外である。成体肝細胞はＦＡＣＳ分析によってＶＣＡＭ−１−であるので、発現は発生的に制御されると考えられる。
【００２０】
ＨｐＳｔＣ前駆体は胎児肝における主要なＨＧＦ産生細胞であるので、肝発生にとって重要であると思われる。ＨＧＦは肝発生において重要な増殖因子であり、この因子はまた肝再生においても肝実質細胞増殖の役割を担う。加えて、ＨｐＳｔＣは成体肝においてＨＧＦを発現するが、実質細胞、内皮細胞及びクッパー細胞はＨＧＦを発現しない。それゆえ、我々のデータ及びこれまでの試験は、ＨｐＳｔＣが肝における胎児から成体までの主要なＨＧＦ産生細胞であることを示唆する。それゆえＨｐＳｔＣ前駆体は、それ自体がＨＧＦ及びＳＤＦ−１αの主要産生細胞であることから、おそらく胎児肝において肝及び造血発生において重要な役割を果たすと考えられる。
【００２１】
ＶＣＡＭ−１及びＨｌｘの発現及びＨＧＦ及びＳＤＦ−１αの産生を含むＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな表現型及び機能的特徴を考慮すると、前駆体は、肝における造血幹細胞若しくは肝幹細胞又はその両方のための幹細胞ニッチからなると考えられる。無血清培養系はインビトロでＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな特徴的表現型を維持したので、この培養系は、成体肝からＨｐＳｔＣ前駆体を同定するためのインビトロコロニーアッセイ系を開発するために使用できる。加えて、ＨｐＳｔＣ移植系が開発されれば、ＨｐＳｔＣ前駆体を使用した細胞療法が実施可能となる。成体肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体又はＨｐＳｔＣ前駆細胞の同定、エクスビボ増殖及び移植は、線維性肝において活性化ＨｐＳｔＣを置換するための貴重な手段である。明らかに、本試験で述べるＨｐＳｔＣ前駆体についての表現型同定及びインビトロ培養系は、肝疾患に対する新規治療アプローチを開発するための新たな方向を示す。
【００２２】
以下の実施例は本発明の例示であるが、本発明はいかなる意味においてもこれらの特定実施例に限定されない。また、当業者であれば、これらの実施例が本発明を実施するための手段の１つに過ぎないことは明らかである。更に、本実施例は実験上の利便性からラットに関して提示するが、ここで述べる方法及び試薬は、以下で開示する教示から当業者によってヒトへの適用に容易に適合され得るものである。
【００２３】
実験材料及び方法
ラット
妊娠Ｆｉｓｈｅｒ ３４４ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より入手した。栓子が認められた日の午前を０日目と指定した。雄性Ｆｉｓｈｅｒ ３４４ラット（２００ｇ〜２５０ｇ）を成体ＨｐＳｔＣの単離に使用した。動物実験はすべて、施設のガイドラインの下で実施され、ノースカロライナ大学動物管理使用委員会（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）は、国立科学アカデミー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の実験動物の管理と使用のための指針（Ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従ってすべての実験手順を承認した。
【００２４】
細胞の作製
本発明に従ったインビトロ増殖に適する肝前駆細胞は、特定の方法によって単離又は同定されるものに限定されない。一般に、ＨｐＳｔＣ前駆体は肝の切除切片から入手し得る。肝の切除切片を、次に、標準的な手順によって単一分離細胞に解離し得る。そのような手順は酵素的解離及び機械的解離を含む。酵素的解離は、コラゲナーゼなどのプロテアーゼ又はＤＮアーゼなどのヌクレアーゼの存在下で実施し得る。一部の場合には、プロナーゼも使用し得る。肝細胞の酵素的解離の方法は当技術分野において記述され、実施されている。例として、肝前駆細胞の単離と同定の方法は、米国特許第６，０６９，００５号及び米国特許出願第０９／４８７，３１８号、同第１０／１３５，７００号、及び同第１０／３８７，５４７号に述べられている。尚、これらの開示全体は参照により本開示に組み込まれる。実際に、肝細胞の単細胞懸濁液の消化及び単離には、様々な手法が存在する。それゆえ、本発明の範囲は、肝全体を入手する又はその単細胞懸濁液を調製する特定の方法に限定されないことが了解されるべきである。
【００２５】
本実施例では、１３〜１４匹のｄｐｃラットから胎児肝を単離し、８００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で消化して、次にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）で更に消化した。細胞懸濁液を２００Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）で処理した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。
【００２６】
細胞培養
好ましい実施形態では、インビトロ増殖工程には、フィーダー細胞層上でのＨｐＳｔＣ前駆細胞の増殖を支持するために無血清ホルモン添加合成培地（ＨＤＭ）を使用することが含まれる。フィーダー細胞の機能には、養分を供給する接着表面を供給すること、及び前駆体ＨｐＳｔＣの生存、増殖又は分化に必要な特定の増殖因子及び細胞外マトリックス成分を培地に分泌することなどが含まれ、多種多様である。フィーダー細胞は、爬虫類、鳥類、甲殻類、魚類、環形動物、軟体動物、線虫、昆虫又は哺乳動物、好ましくはヒトから得ることができる。より好ましくは、フィーダー細胞は、胚組織、更に好ましくは胚肝組織に由来する。胎児肝細胞を、以前に述べたように（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）ＳＴＯフィーダー細胞上で無血清ホルモン添加合成培地において培養した。
【００２７】
ＨＤＭは、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１０−６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．４×１０−３Ｍニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、７．６μｇ当量／ｌ遊離脂肪酸、２×１０−３Ｍグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１×１０−６ＭのＣｕＳＯ４、３×１０−８ＭのＮａ２ＳｅＯ３及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の１：１混合物からなる。遊離脂肪酸には、１００ｍｇ当量／ｌ保存溶液についてそれぞれ３１．０：２．８：１１．６：１３．４：３５．６：５．６のミリモル比のパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸（すべてＳｉｇｍａ）を含んだ。
【００２８】
ＳＴＯフィーダー細胞を以前に述べたように作製した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。簡単に説明すると、ＳＴＯ細胞のサブクローン、ＳＴＯ５をｐＥＦ−Ｈｌｘ−ＭＣｌｎｅｏでトランスフェクトした。トランスフェクトしたクローン、ＳＴＯ５ＨｌｘをマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で処理し、１２穴プレートにおいて２×１０５細胞／穴の濃度でフィーダー細胞に使用した。選別ｖＡ＋細胞の長期間培養として、その細胞をＳＴＯフィーダー細胞上で、１０ｎｇ／ｍｌヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び１０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を添加したＨＤＭにおいて培養した。培地を１日おきに交換し、細胞を毎週新鮮ＳＴＯフィーダー細胞に継代培養した。
【００２９】
コロニーの免疫細胞化学染色
培養細胞についての染色手順は以前に述べられている（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。簡単に説明すると、培養プレートをメタノール−アセトン（１：１）中に室温で２分間固定し、洗浄して、４℃で２０％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）によってブロックした。アルブミン（ＡＬＢ）及びサイトケラチン（ＣＫ）１９の二重標識のために、培養物を抗ラットＡＬＢ抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）及び抗サイトケラチン１９（ＣＫ１９）モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、次いでテキサスレッド結合抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ）と共にインキュベートした。ネスチン又はデスミン発現に関しては、細胞を抗ネスチン抗体（Ｒａｔ−４０１、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）又は抗デスミン抗体（Ｄ３３、Ｄａｋｏ）、次いでアレクサ４８８結合抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。
【００３０】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
細胞を、デュアルコヒーレントＩ−９０レーザーを備えたＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、選別した。ｖＡ特異的自己蛍光を検出するため、細胞を３５１ｎｍで励起し、蛍光放出を、４５０ＤＦ２０フィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を使用して検出した。蛍光結合抗体を４８８ｎｍで励起し、それらの蛍光放出を標準フィルターによって検出した。
【００３１】
ラット細胞の分析のために使用したモノクローナル抗体は、ＦＩＴＣ結合抗ＲＴ１Ａ（Ｂ５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ラットＩＣＡＭ−１（１Ａ２９；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＶＣＡＭ−１（５Ｆ１０、Ｂａｂｃｏ）、抗ラットα６β１−インテグリン（ｍＡＢ−５Ａ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ラットＣＤ４４（ＯＸ−４９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合抗ラットＶＣＡＭ−１（ＭＲ１０９；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合又はビオチン結合抗ラットβ３−インテグリン（２Ｃ９．Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビオチン結合抗ラットＰＥＣＡＭ−１（ＴＬＤ−３Ａ１２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビオチン結合抗ラットＴｈｙ−１（ＯＸ−７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。非特異的抗体結合をブロックするため、ＦＡＣＳ実験における抗体染色の前に、細胞を２０％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１％硬骨魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）及び抗ラットＣＤ３２（ＦｃγＩＩ受容体）抗体（Ｄ３４−４８５、Ｒａｔ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液と共にインキュベートした。非結合抗ＶＣＡＭ−１抗体（５Ｆ１０）で染色するため、胎児肝細胞を抗ＶＣＡＭ−１抗体と共にインキュベートし、その後ビオチン結合抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（Ｒ１９−１５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ビオチン結合抗体を検出するためにストレプトアビジン−Ｃｙ−クロム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。
【００３２】
選別ｖＡ＋細胞に由来する長期間培養細胞を単離するＦＡＣＳ実験のために、培養物中のすべての細胞を採集し、培養ラット細胞及びＳＴＯフィーダー細胞を分離するためにビオチン結合抗マウスＣＤ９８（Ｈ２０２−１４１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いでストレプトアビジン−Ｃｙ−クロムで染色した。マウスＳＴＯフィーダー細胞は、マウスＣＤ９８に対する抗体で明るく染色された。それゆえ、ＣＤ９８陰性細胞はラット由来細胞であり、先に示したように（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）ＦＡＣＳを用いて容易に識別できる。
【００３３】
肝芽細胞についてのコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）
肝芽細胞に関するＣＦＡの手順は以前に述べられている（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。簡単に説明すると、選別された細胞を、１２穴プレートに５００又は２５００細胞／穴（３．８ｃｍ２）でＳＴＯフィーダー細胞に３組接種し、培地を１日おきに交換して１４〜１５日間ＨＤＭ中で培養した。肝芽細胞の両能性分化活性を検討するため、ＡＬＢ及びＣＫ１９の二重免疫蛍光染色を実施した。各穴当たりのコロニーの数を計数するため、コロニーをＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｂａｘｔｅｒ）によって染色した。
【００３４】
細胞増殖アッセイ
ＦＡＣＳによって単離したｖＡ＋細胞を、最終濃度８μｇ／ｍｌのラミニン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したＨＤＭを含む９６穴プレートにおいて５００細胞／穴で３組接種した。ＥＧＦ及びＬＩＦを指示されている濃度で添加した。接種の５日後、浮遊細胞を除去するために細胞培養物を２回洗浄し、生存接着細胞の数を計数するためにテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む新鮮培地を添加した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。４時間後、製造者のプロトコールに従って吸光度を測定した。
【００３５】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＰＣＲに使用したプライマー配列を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
ＦＡＣＳによって選別した細胞についてのＲＴ−ＰＣＲの手順は以前に述べられている（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。簡単に説明すると、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓセルソーターを用いて細胞を単離し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって抽出して、ｃＤＮＡ合成に供した。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライミング及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ）により、反応容量２０μｌ、４２℃でｔｏｔａｌＲＮＡから合成した（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＰＣＲは、合成されたｃＤＮＡに関して、各々のプライマー１μＭ、各々のｄＮＴＰ ２００μＭ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３及び１．２５Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ）からなる総容量５０μｌで実施した。試料を９４℃に３分間加熱し、次いで９４℃２分間、６２℃２分間及び７２℃３分間の２６〜３５サイクル増幅した。各標的遺伝子についての増幅サイクルの数は異なっており、表１に示している。最後のサイクル後、最終伸長工程を７２℃で６分間実施した。その後、各々のＰＣＲ反応物５μｌを１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。選別細胞のｔｏｔａｌＲＮＡから合成したｃＤＮＡを細胞数で標準化した。
【００３８】
実験結果
胎児肝におけるビタミンＡ＋細胞の同定
単細胞懸濁液の確立後において、ＨｐＳｔＣ前駆体の単離には、肝組織に由来する混合肝細胞集団をフローサイトメトリーに供すること、及び細胞質ビタミンＡ（ｖＡ）に富む脂質滴によって生成される特異的自己蛍光を示す細胞を選択すること、とが含まれる。ビタミンＡは、３３０〜３６０ｎｍ（紫外線、ＵＶ）レーザー光で励起したとき緑青色蛍光を生じる。ＦＡＣＳ分析は、ＵＶレーザーを使用して、肝における成熟ＨｐＳｔＣならびに前駆体ＨｐＳｔＣの両方の細胞質中のビタミンＡ特異的緑青色蛍光（ｖＡ＋）を検出することができる。
【００３９】
図１Ａは、１３ｄｐｃ胎仔肝細胞における自己蛍光のパターンを示す。ｖＡ特異的緑青色自己蛍光シグナルを、ＵＶレーザー（３５１ｎｍ）の励起により４５０ｎｍフィルターで放出光を検出することによって測定した。非ＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルを検出するため、４８８ｎｍレーザー及び５３０／３０ｎｍバンドパスフィルターを使用した。全胎仔肝細胞集団ならびに２つの小集団（図１ＡのＲ１及びＲ２ゲート）の自己蛍光シグナルのパターンを図１Ｂに示す。全細胞集団のＦＡＣＳパターンにおいて（図１Ｂ、ＡＬＬ）、高い自己蛍光特徴を有する２つの異なる小集団が同定された。その１つは、ここではｖＡ＋と称するが、ＵＶ光に特異的な自己蛍光シグナルを有する（図１Ｂ、ＡＬＬ、左上）。一方右上象限において対角線上に位置する細胞は、非特異的自己蛍光を示す。これは、４８８ｎｍレーザー及びＵＶレーザーによってそれぞれ励起したとき、５３０ｎｍフィルター及び４５０ｎｍフィルターで自己蛍光シグナルが検出されたためである。非特異的自己蛍光特徴を有する小集団（ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋と称する）はもっぱらＳＳＣｈｉｇｈゲートに由来したが（図１Ａ、Ｒ２及び図１Ｂ、Ｒ２）、ｖＡ＋細胞（図１Ｂ、左上）はＲ１とＲ２の両方で検出された。
【００４０】
図１Ｃは、ＲＴ１Ａに対するＦＩＴＣ結合抗体によって検出したｖＡ特異的自己蛍光シグナル及びＭＨＣクラスＩａ発現のパターンを示す。ＦＡＣＳ分析では、ｖＡ＋細胞並びにｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞がＲＴ１Ａ発現を有さないことが示された。これは、これら２つの集団が、対照試料（図１Ｂ、Ｒ２）と比較して染色試料（図１Ｃ、Ｒ２）においてシフトしなかったためである。加えて、ＦＡＣＳ分析によればまた、肝芽細胞集団、すなわちＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉｇｈである細胞（図１Ａ、Ｒ２、右下）とＲＴ１Ａ−ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞（図１Ｃ、Ｒ２、矢印）がこのＦＡＣＳ分析による重複集団であることが示された。
【００４１】
これらの自己蛍光シグナルが胎児肝において特異的であるか否かを調べるため、１３ｄｐｃ胎児から胎児肺細胞を単離し、ＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析は、肺細胞にはｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞又はｖＡ＋細胞のいずれも存在しないことを示し（図１Ｄ）、胎児肝における特定小集団の自己蛍光シグナルがユニークな表現型特徴であることを示唆した。
【００４２】
肝前駆細胞（すなわち肝芽細胞）は、ラット胎仔の１３ｄｐｃ肝においてＲＴ１Ａ−ＯＸ１８ｌｏｗＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉｇｈ細胞であることが示唆されたので、これらのマーカーをｖＡ＋細胞において検定した。図１Ａは、１３ｄｐｃでの胎仔肝細胞のＦＡＣＳ分析とそれに続くＲＴ１Ａ、ラットＭＨＣクラスＩ及びＩＣＡＭ−１に対する抗体での染色のパターンを示す。図１Ｃは、ｖＡ−特異的自己蛍光シグナルとＲＴ１Ａに対するＦＩＴＣ結合抗体によって検出したＲＴ１Ａ発現のパターンとを示す。ＦＡＣＳ分析では、ｖＡ＋細胞ならびにｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞がＲＴ１Ａ発現を有さないことが示された。これは、これら２つの集団が、対照試料（図１Ｂ、Ｒ２）と比較して染色試料（図１Ｃ、Ｒ２）においてシフトしなかったためである。加えて、ＦＡＣＳ分析では、肝芽細胞集団、すなわちＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉｇｈである細胞（図１Ａ、Ｒ２、右下）とＲＴ１Ａ−ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞（図１Ｃ、Ｒ２、矢印）とが同一集団であることが示された。これらの結果は、ＦＡＣＳ分析が１３ｄｐｃという早期にラット胎仔肝において特徴的なｖＡ＋細胞を検出できたこと、及びｖＡ＋細胞はＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋であったことを示している。
【００４３】
ビタミンＡ＋細胞におけるＶＣＡＭ−１及びインテグリンβ３の発現
上記で明らかにしたように、ｖＡ陽性及びＭＨＣクラスＩａ陰性はＨｐＳｔＣを同定単離する十分なマーカーである。しかし、一部の場合、特に分子（たとえばＤＮＡ）の完全性が懸念される場合には、ＵＶ光に基づくＵＶ選択は望ましくないと考えられる。それゆえ、本発明は、ＵＶに基づく選択に加えて又はその代わりに使用し得るマーカーを提供する。ＨｐＳｔＣ前駆体は、選択した細胞集団をＶＣＡＭ、より詳細にはＶＣＡＭ−１、に特異的な抗体に曝露することによって更に同定され得る。ＶＣＡＭ−１は、成体肝においてＨｐＳｔＣを筋線維芽細胞と区別するユニークな表面マーカーであることが示されたことから、有効なマーカーである。更に、成体肝細胞はこのマーカーに関して陰性であるので、ＶＣＡＭ−１の発現は発生的に制御されると考えられる。
【００４４】
ｖＡ＋細胞がＶＣＡＭ−１を発現するか否かを検討するために、ＶＣＡＭ−１発現を胎仔肝細胞において分析した。ＦＡＣＳ分析によると、１３ｄｐｃ胎仔肝において細胞の約１５％がＶＣＡＭ−１＋であった（図２Ａ）。次に、ＶＣＡＭ−１＋細胞の自己蛍光及びＲＴ１Ａ発現のパターンを測定した。ＶＣＡＭ−１＋細胞は基本的にすべてのｖＡ＋細胞ならびに全ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞集団を含み（図２Ａ）、ＨｐＳｔＣ及び肝芽細胞がＶＣＡＭ−１を発現することが示された。ラットＶＣＡＭ−１に対する２つのモノクローナル抗体（５Ｆ１０及びＭＲ１０９）のＦＡＣＳ分析では、ＶＣＡＭ−１発現において同一のパターンが示された。加えて、図２ＢのＲ１ゲートはＶＣＡＭ−１＋細胞集団を含んでいたため、胎仔肝ＶＣＡＭ−１＋細胞はＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋細胞であった。これらの結果は、胎仔肝のＶＣＡＭ−１＋ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋細胞がｖＡ＋細胞、肝芽細胞及び多少の非自己蛍光細胞からなることを示唆している。
【００４５】
共にＶＣＡＭ−１＋ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋細胞である２つの自己蛍光集団、ｖＡ＋細胞及び肝芽細胞を識別するためにさらなる表面抗原を検討した。β３−インテグリン（ＣＤ６１）は内皮細胞、血管平滑筋細胞及び成体ＨｐＳｔＣで発現されるので、ＶＣＡＭ−１対インテグリンβ３の二色ＦＡＣＳ分析を実施した。ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞の大部分がβ３−インテグリンを発現したが、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞はβ３−インテグリン−であり、一方ｖＡ−ＲＴ１Ａ−細胞は多少のＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を含んだ（図３Ｂ）。
【００４６】
ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−細胞は、多少のＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を含んだ。残りの主要集団（図３Ｂ、Ｒ４）はＶＣＡＭ−１−であり、図２ＢのＲ２細胞集団に対応すると考えられた。Ｒ４細胞集団は、プラスチック皿で培養すると非接着細胞を含む。これによりそれらが造血細胞であることが示唆された。分画の小集団（〜２０％）はβ３−インテグリン＋であった。内皮細胞マーカーとして知られるＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）の発現も評価した。しかし、ＦＡＣＳ分析では、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞におけるＰＥＣＡＭ−１発現が無視し得る程度であり（図３Ｂ）、一方ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−及び非接着細胞集団においてＰＥＣＡＭ−１＋細胞が検出される（図３Ｂ、Ｒ２及びＲ４）ことが示された。更に、腫瘍形成性損傷後の成体肝において出現する卵形細胞についての表面マーカー、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）の発現を評価した。ＦＡＣＳ分析では、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−がＴｈｙ−１−であることが示された。
【００４７】
これに対し、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞、ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−細胞及び非接着細胞は不均一にＴｈｙ−１を発現する。ＦＡＣＳ分析により、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞がＣＤ４４ｌｏであり、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞がＣＤ４４−であることが示された（データは示さず）。ＣＤ４４（Ｐｇｐ−１）については、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞とｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−において異なった発現を示したが、細胞表面での発現は弱かった。合わせて考慮すると、これらのデータは、検討したすべての抗体の中で、β３−インテグリン抗体染色により、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞とｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞（両集団共に胎児肝においてＶＣＡＭ−１＋ＩＣＡＭ−１＋）の識別が容易になることを示唆している。
【００４８】
ＶＣＡＭ−１＋インテグリンβ３−非特異的自己蛍光細胞集団は肝芽細胞のみ含む。
１４ｄｐｃまでのラットの胎仔肝細胞は、微小環境に依存して肝細胞及び胆管上皮細胞の両方に分化する発生能に関して均質である。これらの両能性前駆細胞は肝芽細胞と呼ばれる。ｖＡ＋細胞が肝細胞系統を生成する潜在能を有するかどうかを検討するため、ＣＦＡ（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）を実施した。４つの細胞集団をＦＡＣＳによって単離し、肝芽細胞についてのＣＦＡに供した。ここで、この４つの細胞集団は、（１）ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−、（２）ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、（３）ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−、及び（４）ＶＣＡＭ−１−非接着細胞とした。選別された細胞分画をＨＤＭ中のＳＴＯ５フィーダー細胞上に置き、１５日間培養して、それぞれ肝及び胆管系統に関してアルブミン及びＣＫ１９に対する抗体で染色した。その後、すべての肝コロニーを計数した。
【００４９】
ＣＦＡは、肝コロニーが第１群のｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−細胞から生成されることを示し（下表２）、ｖＡ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を含む、選別細胞のその他の群が肝前駆細胞ではないことを明らかにした。第１群の選別細胞に由来する肝コロニーの９５％以上が、肝細胞（アルブミン＋ＣＫ１９−）及び胆管上皮細胞（アルブミン−ＣＫ１９＋）の両方を含んだ（図４）。更に、選別されたｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−細胞におけるコロニー形成効率は約３１％であり、既に前記試験（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）により樹立された肝前駆細胞系統（ｒｈｅｌ４３２１）は、４２．５±１．８％のＣＦＡにおけるコロニー効率を有していた。合わせて考慮すると、樹立された細胞系統によるＣＦＡはおそらく新鮮単離細胞よりもはるかに高いので、この実験におけるＣＦＡの結果は、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−細胞集団がほぼ純粋な肝芽細胞集団であることを示している。
【００５０】
表２は、選別されたげっ歯動物胎仔肝細胞からの肝星細胞コロニーの発生率を示す。ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−及びＶＣＡＭ−１−細胞の分画のためのゲートを、それぞれ図３のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４に示すように作製した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
フローサイトメトリー選別細胞を、１２穴プレートにおいて各穴につき表中の細胞数でＳＴＯフィーダー細胞上にて培養した。肝コロニー数は各穴当たりの平均である。コロニー効率は、培養中に接種した細胞と１５日間の培養後にコロニー形成へと進んだ細胞とのパーセンテージで表わされている。数値は平均±ＳＥＭである。選別細胞を接種した穴の総数をカッコ内に示している。
【００５３】
新鮮単離ビタミンＡ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の遺伝子発現
次に、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の遺伝子発現パターンを、それらがＨｐＳｔＣについての様々なマーカーを発現するか否かを調べるために検定した。５つの集団をＦＡＣＳによって単離し、その５つの集団からＲＮＡを単離した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを使用してＨｐＳｔＣマーカーについてのＲＴ−ＰＣＲを実施した。ここで、５つの集団は、（１）ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−、（２）ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋、（３）ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、（４）ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１−、及び（５）ＶＣＡＭ−１−非接着細胞集団とした。成体肝におけるＨｐＳｔＣは、肝の他の細胞型では発現されない中間フィラメント、デスミン及びネスチンを発現する。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、及びａｕｔｏｆｌｕ−ＶＣＡＭ−１−細胞が４つの中間フィラメントすべてを発現することを示した。ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋細胞は、アルブミンならびに肝芽細胞において特異的に発現する転写因子であるＰｒｏｘ１を発現する。この結果は、この集団が肝芽細胞を備えることを明らかにしたＣＦＡアッセイから得られたデータと一致した。肝芽細胞集団では、ネスチン、ＳＭαＡ又はビメンチンの発現は存在しなかった。ＨｐＳｔＣ特異的中間フィラメントの発現は、ｖＡ＋細胞がＨｐＳｔＣ前駆体であることを強く示唆している。
【００５５】
その後、３つの別個の間葉細胞マーカー、ＨＧＦ、間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）及び分岐型ホメオボックス転写因子であるＨｌｘの発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。マウスにおける正常な肝発生、特に肝芽細胞の増殖と分化のためにはＨＧＦが必要であり、成体肝ではＨｐＳｔＣはＨＧＦの主要産生細胞である。ＳＤＦ−１αは、造血前駆細胞のための強力なケモカインであり、胎児肝における造血幹細胞はケモカインに応答して遊走する。Ｈｌｘは、発生中の胎児肝における間葉細胞で発現され、胎児肝造血及び肝発生において必須の役割を果たす。
【００５６】
興味深いことに、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞は、検討したすべての細胞分画の中でＨＧＦ、ＳＤＦ−１α及びＨｌｘ転写産物を最も強く発現した（図５）。集合的に、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞はデスミン＋ネスチン＋ＳＭαＡ＋ビメンチン＋Ｈｌｘ＋であり、胎児肝におけるＨＧＦ及びＳＤＦ−１αの主要産生細胞である。
【００５７】
ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋ｖＡ＋細胞のエクスビボでのクローン性増殖
成体肝から単離したＨｐＳｔＣは、インビトロでは限られた増殖活性しか有さない。ＨｐＳｔＣ前駆体は大きな増殖活性を有すると考えられるので、胎児肝におけるｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞のエクスビボでの増殖能力を検討した。ＬＩＦは、胚性幹細胞又は筋原性細胞を含む多くの異なる細胞型についての多面発現性増殖因子である。ＦＡＣＳによって単離されたｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を、ＬＩＦの存在下で５日間、９６穴プレートにおいて５００細胞／穴の細胞密度でホルモン添加合成無血清培地にて培養すると、細胞は用量依存的に増殖した（図６Ａ）。加えて、神経幹細胞を含む様々な細胞型のための増殖因子であるＥＧＦは、ＬＩＦによって誘導されるＨｐＳｔＣ前駆体の増殖を増強したが、ＥＧＦ単独では増殖を補助しなかった（図６Ａ）。
【００５８】
しかしながら、プラスチック培養プレートだけを使用した条件下では増殖は持続しなかった。それゆえ、ＦＡＣＳ選別ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を、次に、ＳＴＯ５フィーダー細胞上に置いた（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。ＬＩＦはＳＴＯ細胞によって産生されるが、外因性ＬＩＦ及びＥＧＦの添加は、選別ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞からのコロニー形成を更に劇的に補助した（図６Ｂ）。培養中で増殖する細胞はデスミン及びネスチンを発現したが、ＳＴＯ５フィーダー細胞はどちらも発現しなかった（図７）。３つの単一コロニーを採取し、新鮮ＳＴＯ５フィーダー細胞上に置いた。単一コロニー由来細胞は、ＬＩＦ及びＥＧＦを添加したＳＴＯ５フィーダー細胞との共培養において２ヶ月間増殖し続け、それらが大きな増殖潜在能を有することが示された。この増殖細胞において、デスミン及びネスチンの発現は維持された（図８）。
【００５９】
新鮮単離ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞と２ヶ月間培養した細胞との特徴的表現型を更に比較するため、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。２ヶ月間培養下に維持した単一コロニー由来細胞（Ａ４２８−３）をＦＡＣＳによってＳＴＯ５フィーダー細胞から分離し、ＲＴ−ＰＣＲ分析用にＲＮＡを抽出した。対照試料として、同時に選別されたＳＴＯ５フィーダー細胞からＲＮＡを単離した。加えて、成体ＨｐＳｔＣからＲＮＡを単離して、Ａ４２８−３及びＳＴＯ５細胞より得られたＲＮＡと比較した。
【００６０】
結果は、Ａ４２８−３が、デスミン、ネスチン、ＳＭαＡ、ビメンチン、β３−インテグリン、ＳＤＦ−１α、ＨＧＦ及びＨｌｘを発現することを明らかにし、発現パターンが新鮮ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞に類似することを示した（図５及び図９Ａ）。更に、ＶＣＡＭ−１発現がＦＡＣＳ分析によって確認された（図９Ｂ）。ＲＴ１Ａ発現はインビトロ培養において誘導されると考えられた（図９Ｂ）。成体ＨｐＳｔＣのＲＴ−ＰＣＲ結果は、正常成体ＨｐＳｔＣの表現型がデスミン＋、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）＋、ＨＧＦ＋、ＳＭαＡｌｏ／−であるというこれまでの報告と一致した。結果はまた、成体ＨｐＳｔＣがＳＤＦ−１α、β３−インテグリン及びＨｌｘを発現することを示した。Ａ４２８−３細胞において（図９Ａ）又は胎児肝で試験したいかなる分画においても、ＧＦＡＰの発現は見られなかった。
【００６１】
本発明は、しかし、たとえばβ３−インテグリン＋ＰＥＣＡＭ−１−ＶＬＡ−６＋及びＣＤ４４Ｈ−を含む、ＨｐＳｔＣ前駆細胞を同定するために上記マーカーと共に使用し得る付加的なマーカーを提供する。ＩＣＡＭ−１及びβ３−インテグリンも成熟ＨｐＳｔＣで発現される。それらの表面マーカーに加えて、成熟及び前駆体ＨｐＳｔＣは、デスミン、ビメンチン、平滑筋ａアクチン及びネスチンを含むＨｐＳｔＣに特異的な中間フィラメントを発現する。
【００６２】
この試験では、Ａ４２８−３細胞において（図９Ａ）又は胎児肝ＧＦＡＰにおいて試験したいかなる分画においても、ＧＦＡＰの検出可能な発現は存在しなかった。ＧＦＡＰは中枢神経系において星状膠細胞を同定するために使用されるマーカーであるが、このタンパク質は成体肝のＨｐＳｔＣにおいても発現される。しかし、我々は、ＲＴ−ＰＣＲで試験したいかなる細胞画分ならびに全胎児肝試料においても、ＧＦＡＰ ｍＲＮＡを認めなかった。加えて、単離ＨｐＳｔＣ前駆体の培養後でさえも、ＧＦＡＰ発現は誘導されなかったが、デスミン及びネスチンの発現は培養物において維持された。この結果は、胎児肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体が後期発生段階でＧＦＡＰ発現を獲得することを示唆する。我々は、しかし、ＧＦＡＰ＋細胞が１３ｄｐｃ胎児肝においては存在しない異なる前駆体に由来するというもう１つの可能性を排除できない。血流中の循環細胞は選択的細胞起源のソースとなり得る。しかし、成体肝のＨｐＳｔＣの大部分がＧＦＡＰを発現する。従って、血液からの循環細胞の小さな寄与が肝において支配的な集団になる可能性は低い。それゆえ、ＧＦＡＰ発現の獲得はＨｐＳｔＣの成熟の間に起こる可能性がより高いと思われる。
【００６３】
データはまた、ＨｐＳｔＣ前駆体が分岐型ホメオボックスタンパク質であるＨｌｘを比較的強く発現することを示した。Ｈｌｘ発現とＨｐＳｔＣ発生の関係は明らかでないが、Ｈｌｘ発現の喪失は突然変異マウスにおける欠陥に寄与し得る。マウス胎仔肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体は、ＨＧＦ、ＳＤＦ−１α及びＨｌｘも発現する。
【００６４】
ＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな表面表現型に加えて、この試験で樹立された培養系は成体肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体の同定にも使用可能である。これまで、成体肝からのＨｐＳｔＣはウシ胎仔血清を添加した培地で培養されてきた。通常、血清添加培地で培養されたＨｐＳｔＣは筋線維芽細胞を生じさせ、この細胞は線維芽細胞特徴を獲得して、もとのＨｐＳｔＣ表現型を喪失する。それゆえ、血清添加培地条件はＨｐＳｔＣ前駆体を同定するために適切ではない。本試験で述べた無血清培養条件は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞のエクスビボでの維持を助けることができる。
【００６５】
ＨｐＳｔＣ前駆体は、検討した胎児肝細胞画分中のいかなる小集団よりも多くのＨＧＦ転写産物を発現するので、それらは肝発生のために鍵となる役割を果たすと考えられる。ＨＧＦは肝発生のために決定的に重要な増殖因子であり（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、この因子はまた、肝再生においても肝実質細胞増殖の責任を担う（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｅｓ，１９９７）。加えて、ＨｐＳｔＣは成体肝におけるＨＧＦの産生細胞であるが、実質細胞、内皮細胞又はクッパー細胞はＨＧＦの産生細胞ではないことが示された（Ｓｃｈｉｒｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。それゆえ、我々のデータ及びこれまでの試験によるデータは、ＨｐＳｔＣが肝における胎児から成体までの主要なＨＧＦ産生細胞であることを示唆している。
【００６６】
この試験では、１３ｄｐｃ胎仔肝においてＧＦＡＰ発現は存在しなかった。ＧＦＡＰは中枢神経系における星状膠細胞の同定に使用されるマーカーであるが、このタンパク質は成体肝のＨｐＳｔＣにおいても発現する。しかし、我々は、試験したいかなる細胞画分ならびに全胎児肝試料においても、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＦＡＰ ｍＲＮＡを認めなかった。加えて、単離ＨｐＳｔＣ前駆体の培養後でさえも、ＧＦＡＰ発現は誘導されなかったが、デスミン及びネスチンの発現は培養物において維持された。この結果は、胎児肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体が後期発生段階でＧＦＡＰ発現を獲得することを示唆している。我々は、しかし、ＧＦＡＰ＋細胞が１３ｄｐｃ胎児肝においては存在しない異なる前駆体に由来するというもう１つの可能性を排除できない。血流中の循環細胞は選択的細胞起源のソースであり得る。しかし、成体肝のＨｐＳｔＣの大部分がＧＦＡＰを発現する。従って、血液からの循環細胞の小さな寄与が肝において支配的な集団になる可能性は低い。それゆえ、ＧＦＡＰ発現の獲得はＨｐＳｔＣの成熟の間に起こる可能性がより高いと思われる。
【００６７】
分岐型ホメオボックスタンパク質のＨｌｘは、横中隔及び胎児肝における間葉細胞で発現される（Ｌｉｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。Ｈｌｘノックアウトマウスについてのこれまでの試験からは、突然変異マウスが肝発生及び胎仔肝造血障害を有することが明らかにされている（Ｈｅｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【００６８】
移植実験では、造血障害が造血前駆細胞自体によって引き起こされるのではなく、胎児肝微小環境によって引き起こされることが示された。それゆえ、Ｈｌｘ＋細胞は、胎児肝において、肝及び造血発生を助ける重要な細胞集団である。我々のデータによれば、ＨｐＳｔＣ前駆体がＨｌｘを強く発現することが示されている。それゆえ、ＨｌｘノックアウトマウスがＨｐＳｔＣ前駆体を有するかどうかを調べることは興味深い。Ｈｌｘ発現とＨｐＳｔＣ発生の関係は明らかでないが、Ｈｌｘ発現の喪失は突然変異マウスにおける欠陥に寄与し得る。最近、我々は、マウス胎仔肝における類似ＨｐＳｔＣ前駆体がＨＧＦ、ＳＤＦ−１ａ及びＨｌｘも発現することを認めた。更に、本発明人は、ヒト胎児肝において類似マーカー（たとえば平滑筋αアクチン）を有する間葉細胞を同定し、それがヒト肝幹細胞のエクスビボ増殖のために重要であることを明らかにした。
【００６９】
ＦＡＣＳによって精製されたＨｐＳｔＣ前駆体は、ＳＴＯフィーダー細胞上及び脂質、インスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加した無血清培地条件下で増殖した。我々のデータは、ＬＩＦがインビトロ増殖のためにより有用であることを示唆した。ＳＴＯフィーダー細胞の支持により、ＨｐＳｔＣ前駆体は２ヶ月以上にわたって持続的に複製した。培養細胞は、ＶＣＡＭ−１、β３−インテグリン、デスミン、ビメンチン、平滑筋αアクチン、ネスチン、ＨＧＦ及びＳＤＦ−１ａを発現した。新鮮ＨｐＳｔＣ前駆体のこれらの表現型はインビトロ培養の間変化しなかった。
【００７０】
ＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな表面表現型に加えて、本試験で樹立された培養系は成体肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体の同定にも使用可能である。これまで、成体肝からのＨｐＳｔＣはウシ胎仔血清を添加した培地で培養されてきた。通常、血清添加培地で培養されたＨｐＳｔＣは筋線維芽細胞を生じさせ、この細胞は線維芽細胞特徴を獲得して、もとのＨｐＳｔＣ表現型を失う。それゆえ、血清添加培地条件はＨｐＳｔＣ前駆体を同定するために適切ではない。本試験で述べた無血清培養条件は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞のエクスビボでの維持を助ける。成体肝においてＨｐＳｔＣ前駆体が存在すれば、それらは線維性肝において活性化ＨｐＳｔＣを置換するための貴重な手段である。ＨｐＳｔＣ前駆体についての表現型同定及びインビトロ培養系は、肝疾患のための新規治療アプローチの開発を促進する。
【００７１】
本発明をその特定実施形態に関連して説明したが、更なる変更が可能であり、本出願が本発明のいかなる変法、使用又は改変をもカバーするものである。一般に、本発明の原理は、本発明が関連する技術分野において公知又は慣例的なやり方に属し、先に述べた又は特許請求の範囲において述べる本質的特徴に適用され得るような本発明の開示からの逸脱をも包含するものである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年５月２６日出願の米国仮特許出願第６０／８０８，５４８号の便益を主張し、その全ての内容は参照により本開示に含まれるものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、概略的には成熟肝を含む細胞の前駆体に関する。より詳細には、本発明は、肝星細胞の前駆細胞、その細胞を含む組成物及びその細胞を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝星細胞（ＨｐＳｔＣ）は、１９世紀にＫｕｐｆｆｅｒによって初めて記述され、顕微鏡下で見たときのそれらの「星のような（ｓｔｅｌｌａｒ）」輝きのために「Ｓｔｅｒｎｅｌｌｅｎ」と称された。ＨｐＳｔＣは、ディッセ腔（Ｓｐａｃｅ ｏｆ Ｄｉｓｓｅ）において認められる肝特異的間葉細胞であり、かなりの部分が、ビタミンＡを含む細胞質脂質滴からなる。実際に、脂質滴はＨｐＳｔＣの「輝き」の質に寄与する。
【０００４】
現在、ＨｐＳｔＣが、特に視力、生殖及び胚発生のために必要な、ビタミンＡ化合物の取込み、貯蔵及び放出において主要な役割を果たすことは一般的に認められている。哺乳動物では、通常、生体ビタミンＡ総量の約５０％〜８０％がＨｐＳｔＣに貯蔵される。
【０００５】
ＨｐＳｔＣはまた、肝における増殖因子、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）及びマトリックスメタロプロテイナーゼの産生においても中心的な役割を果たす。多くの報告が、ＨｐＳｔＣが肝細胞のためのいくつかのマイトジェン（ＥＧＦ、ＴＧＦα及びＨＧＦなど）を分泌し、肝発生と再生において中心的役割を果たすことを明らかにしている。同様に、多くの研究が、ＥＣＭ調節の失調が肝線維症及び肝硬変における因子であることを示している。更に、ＨｐＳｔＣの収縮特性は、それらが、血管において局所血流を制御する周皮細胞と類似の機能を有することを示唆している。これらを合わせて考慮すると、ＨｐＳｔＣのこれらの多様な機能は、健常肝機能及び肝機能不全におけるそれらの重要な役割を例証する。
【０００６】
ＨｐＳｔＣの重要性についての我々の理解が深まりつつある一方で、ＨｐＳｔＣの起源は不明のままである。初期肝発生において、前腸の内胚葉細胞は肝憩室を生じさせ、肝憩室は、次に、横中隔と呼ばれる周囲の中胚葉内へと発達し、肝細胞索を形成する。一部の研究者は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞が横中隔内の間葉細胞に由来し得ると推測したが、ＨｐＳｔＣはそこからは単離されておらず、免疫選択を可能にするか又は前駆体ＨｐＳｔＣを特徴づけるような表面マーカーはまだ同定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ＨｐＳｔＣに対する前駆体を特異的に同定するマーカーと、そのマーカーでそれらの前駆体を単離する方法と、が求められている。加えて、ＨｐＳｔＣ前駆細胞をインビトロで増殖させる方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様では、肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、（ａ）哺乳動物組織からの細胞の単細胞懸濁液を得ること、を含み、更に、任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｂ）ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞を単細胞懸濁液から除去すること、及び（ｃ）ビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を細胞懸濁液から単離すること、を含む方法を提供する。哺乳動物組織は、肝、膵、腸、肺又は骨髄細胞としてもよく、好ましくは肝である。前記方法は、ＶＣＡＭ及びβ３−インテグリンの少なくとも一方に関して陽性である細胞を細胞懸濁液から単離すること、ＣＤ４５を発現する細胞を細胞懸濁液から除去すること、並びにデスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を細胞懸濁液から単離すること、の少なくとも１つを更に含んでもよい。
【０００９】
幾つかの態様では、単離及び除去する工程は、フローサイトメーターで実施される。ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する細胞の除去は、それらの抗原を発現する細胞に対する種特異的抗体で、たとえばラット肝細胞におけるＲＴ１Ａに対する抗体を利用して実施してもよい。同様に、肝星細胞前駆細胞はヒト肝星細胞前駆細胞であってもよい。
【００１０】
本発明の更にもう１つの態様では、単離肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、（ａ）肝細胞の細胞懸濁液を得ること、及び（ｂ）任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｉ）ＩＣＡＭ−１抗原に関して陽性である細胞を肝細胞の単細胞懸濁液から単離すること、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ抗原に関して陽性である細胞を除去すること、及び（ｉｉｉ）フローサイトメーターでの測定においてビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を単離すること、を含み、前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法を提供する。方法は、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＣＤ４５又はその両方を発現する細胞を細胞懸濁液から除去すること、及びデスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を細胞懸濁液から単離すること、の少なくとも一方を更に含んでもよい。
【００１１】
本発明の他の態様では、ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離肝星細胞前駆細胞を提供する。本発明の更に他の態様では、ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離星細胞前駆細胞を無血清培地で培養することを含む、星細胞前駆細胞のクローン原性増殖の方法を提供する。この培地は、たとえばインスリン、トランスフェリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）若しくは上皮増殖因子（ＥＧＦ）又はそれらの組合せのような、増殖因子を更に含んでもよい。また、単離星細胞前駆細胞を、フィーダー細胞、たとえばＳＴＯ細胞の存在下で更に培養してもよい。
【００１２】
これに関して、本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において以下の説明で述べる又は図面に例示する成分の構成の詳細及び配置に限定されないことが了解されるべきである。本発明は、記述されているものに加えて具体化が可能であり、様々な方法で実行及び実施され得る。また、ここでならびに要約書において使用する成句及び用語は説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきではないことが了解されるべきである。
【００１３】
当業者は、本開示が根拠とする概念が、本発明のいくつかの目的を実施するために他の構造、方法及びシステムを設計するための基礎として容易に利用され得ることを認識する。それゆえ、特許請求の範囲は、そのような均等物を、それらが本発明の精神と範囲から逸脱しない限り包含するとみなされることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、１３ｄｐｃラット胎仔肝及び肺における自己蛍光細胞についてのフローサイトメトリー分析を示す。（Ａ）は、集団全体（ＡＬＬ）の前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）のパターンである。ＳＳＣの値に基づき、Ｒ１及びＲ２ゲートを作製し、それぞれ高（ＳＳＣｈｉ）及び低（ＳＳＣｌｏ）ＳＳＣを表わした。Ｒ１及びＲ２におけるＲＴ１Ａ及びＩＣＡＭ−１の発現パターンも示す。ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉ細胞（Ｒ２、右下）は、ラット胎仔肝における肝芽細胞である（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。数字は各象限のパーセンテージを示す。（Ｂ）集団全体（ＡＬＬ）、Ｒ１及びＲ２の自己蛍光パターンをＵＶレーザー及び４８８ｎｍレーザーで分析した。ＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルは４５０ｎｍフィルターで検出され、一方４８８ｎｍレーザーで励起した非特異的自己蛍光シグナルは５３０／３０バンドパスフィルターで測定した。ＵＶレーザー特異的自己蛍光細胞はＲ１及びＲ２（左上）において検出された。（Ｃ）ＲＴ１Ａ及びＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルの発現を検討した。ＵＶレーザー特異的自己蛍光細胞はＲＴ１Ａ−であった。ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞（矢印）が同定され、ラット肝芽細胞集団に対応した。（Ｄ）ＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルを１３ｄｐｃ胎仔肺細胞において分析した。肺細胞集団にはＵＶ特異的自己蛍光細胞は存在せず、全細胞の大部分がＲＴ１Ａ−である。非特異的自己蛍光細胞（胎仔肝における肝芽細胞集団に匹敵する）は検出されなかった。
【図２】図２は、ｖＡ＋細胞でのＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１発現を示す。（Ａ）１３ｄｐｃ胎仔肝でのＶＣＡＭ−１発現に関するフローサイトメトリーのヒストグラム。細胞の約１５％が細胞表面にＶＣＡＭ−１を発現した。黒いヒストグラムと白いヒストグラムは、それぞれ染色細胞と非染色細胞を示す。ＶＣＡＭ−１＋及びＶＣＡＭ−１−細胞をそれらの自己蛍光シグナルに関してフローサイトメトリーによって分析した。ｖＡ＋細胞及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞のすべてはＶＣＡＭ−１陽性を示している。数字は各象限のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＲＴ１Ａ及びＩＣＡＭ−１についての１３ｄｐｃ胎仔肝細胞の二色分析。Ｒ１細胞集団（ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋）はｖＡ＋細胞及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞のすべてを含む。これらの結果は、ｖＡ＋及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞がＶＣＡＭ−１＋ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋であることを指示する。
【図３】図３は、１３ｄｐｃ胎仔肝におけるｖＡ＋細胞、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞及びａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−細胞の抗原性プロフィールを示す。（Ａ）ＵＶ−自己蛍光及びＲＴ１Ａ発現に関するフローサイトメトリー分析。ＲＴ１Ａ−細胞集団において、４つのゲート（Ｒ１−Ｒ４）を自己蛍光シグナルに基づいて作製した。（Ｂ）各々のゲートされた細胞集団（Ｒ１−Ｒ４）に関するＶＣＡＭ−１対β３−インテグリン、ＰＥＣＡＭ−１又はＴｈｙ−１発現の二色分析。数字は各象限のパーセンテージを示す。主要Ｒ１細胞はＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋であり、一方Ｒ３細胞は均一にＶＣＡＭ−１を発現するが、β３−インテグリン、ＰＥＣＡＭ−１又はＴｈｙ−１は発現しない。
【図４】図４は、両能性肝芽細胞コロニーの免疫細胞化学を示す。ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋細胞をＦＡＣＳによって単離し、クローン細胞密度（１２穴プレートの１つの穴に２５０細胞；６６細胞／ｃｍ２）でＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上に置いた。１５日間の培養後、細胞を固定し、ＡＬＢ（赤色、中央図）及びＣＫ１９（緑色、右図）に対する抗体で染色した。１個の選別細胞から各々のコロニーを生成した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。肝コロニーの９５％以上（９５．７±０．４％；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）が、それぞれ肝細胞及び胆管分化を示す、ＡＬＢ＋ＣＫ１９−及びＡＬＢ−ＣＫ１９＋細胞を含んだ。
【図５】図５は、ＦＡＣＳによって分画した１４ｄｐｃ胎仔肝細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーン１：ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−、レーン２：ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋、レーン３：ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、レーン４：ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１−、レーン５：残りのＶＣＡＭ−１−細胞集団、レーン６：ｃＤＮＡなし。ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞は、ＳＤＦ−１α及びＨＧＦを強力に発現する。ｖＡ＋細胞は、ＨｐＳｔＣマーカー（デスミン、ネスチン、ビメンチン、ＳＭαＡ）に関して陽性であり、肝芽細胞マーカー（アルブミン及びＰｒｏｘ１）に関して陰性である。
【図６】図６は、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞のインビトロ増殖へのＬＩＦ及びＥＧＦの作用を示す。（Ａ）ＦＡＣＳによって単離した５００個のｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を、指示されている濃度のＬＩＦ及びＥＧＦの少なくとも一方を添加したＨＤＭプラスラミニンを含む９６穴プレートの穴に入れた。５日間の培養後、細胞増殖の程度をテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１によって測定した。ＬＩＦは、０．１ｎｇ／ｍｌという低濃度でｖＡ＋細胞の増殖を支持する。ＥＧＦはｖＡ＋細胞の増殖をわずかに改善した。（Ｂ）ＦＡＣＳによって単離した２５０個のＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋ｖＡ＋細胞を、ＥＧＦ及びＬＩＦの少なくとも一方を含むＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞に接種した。１２穴プレートを使用した。２週間の培養期間後、培養物をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（商標）で染色した。ＳＴＯ細胞はＬＩＦを発現するが、産生量は、外因性ＬＩＦ添加がない場合、細胞のクローン性増殖を支持するのに十分ではなかった。外因性ＬＩＦ及びＥＧＦの添加はｖＡ＋細胞のクローン性増殖を劇的に改善した。
【図７】図７は、ＦＡＣＳによって単離したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞に由来するコロニーの免疫細胞化学を示す。細胞を、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加したＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上に置いた。インビトロ培養の１５日後、培養物をデスミン又はネスチンに対する抗体で染色した。コロニー形成細胞はネスチン及びデスミンを発現するが、ＳＴＯ細胞はどちらも発現しない。
【図８】図８は、ＦＡＣＳによって単離し、２ヶ月間培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の免疫細胞化学を示す。選別した細胞を、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加したＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上に置いた。増殖細胞を新鮮ＳＴＯフィーダー細胞上で５回継代培養した。培養した細胞をデスミン又はネスチンに対する抗体で染色した。増殖細胞において、培養期間中ネスチン及びデスミンの発現が維持されることが示されている。
【図９】図９は、２ヶ月間培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の表現型特徴を示す。（Ａ）培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。細胞をＦＡＣＳによって単離し、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加したＨＤＭ中のＳＴＯフィーダー細胞上で培養した。２ヵ月間の培養後、細胞をＦＡＣＳによって分画した。増殖ラット細胞及びマウスＳＴＯフィーダー細胞を、マウスＣＤ９８モノクローナル抗体の抗体染色後、ＦＡＣＳによって分画した。ＣＤ９８はマウスＳＴＯ細胞上で発現され、モノクローナル抗体はマウスＣＤ９８と特異的に反応するが、ラットＣＤ９８とは反応しない。ＲＮＡをｖＡ＋由来ラット細胞及びＳＴＯ細胞から単離した。正常ラットＨｐＳｔＣも使用し、対照のためにＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡをそれらのＲＮＡから合成し、ＨｐＳｔＣにおいて発現される様々な転写産物に特異的なプライマーによるＰＣＲに供した。（Ｂ）培養したｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞についてのフローサイトメトリー。ＲＴ−ＰＣＲのために使用した細胞を抗ＶＣＡＭ−１又はＲＴ１Ａ抗体及びマウスＣＤ９８抗体で染色した。ＣＤ９８陰性画分をＶＣＡＭ−１又はＲＴ１Ａ発現に関して分析した。ラット胎仔肝におけるｖＡ＋細胞に由来する持続的増殖細胞は、検討した培養条件下で均一にＶＣＡＭ−１及びＲＴ１Ａを発現する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＨｐＳｔＣには、「脂肪細胞」、「脂肪摂取細胞」、「伊東細胞」、「類洞周囲細胞」及び「肝周皮細胞」を含む、様々な名称が与えられてきた。しかしながら、明瞭さのために、本明細書ではＨｐＳｔＣという用語だけを使用するが、この用語はありとあらゆる上記の他名称を有する同じ細胞の集団を指すことが了解されるべきである。同様に、ここでの教示は１つの種に限定されない。実際に、ここで提供する例は単に例示であり、限定と解釈されるべきではない。従って、本発明は、肝組織についてのその哺乳動物ソースによって限定されない。ＨｐＳｔＣ及びそれらの前駆体が由来し得る哺乳動物は、ヒト、げっ歯動物（たとえばラット、マウス、ハムスター）、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ及びヒツジを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＨｐＳｔＣ及び前駆体はヒトに由来する。本発明はまた、肝発生の特定段階に限定されない。それゆえ本発明は、死亡後時間の経過していない個体（たとえば死後約３０時間以内）からの肝組織を含む、胎児、新生児、小児及び成体肝組織の少なくとも１つに関して実施され得る。
【００１６】
本発明は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞（ここでは「ＨｐＳｔＣ前駆体」又は「前駆体ＨｐＳｔＣ」とも称される）を単離及び増殖する手法を提供する。ラット胎仔肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体を、細胞質ｖＡリッチ脂質滴による特異的自己蛍光を用いたフローサイトメトリーによって同定した。ｖＡ＋細胞の表面表現型は均一であると考えられ、それらはＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋ＰＥＣＡＭ−１−であった。それらの表面マーカーに加えて、ｖＡ＋細胞は、デスミン、ビメンチン、ＳＭαＡ及びネスチンを含むＨｐＳｔＣに特異的な中間フィラメントを発現する。
【００１７】
ＩＣＡＭ−１発現は胎児肝細胞において広く認められるが、β３−インテグリンはｖＡ＋細胞上で比較的特異的である。β３−インテグリンは、表面発現のためにα−インテグリン、αｖ−インテグリン又はαＩＩ−インテグリンを必要とする。選択は細胞型によって異なる。成体肝におけるＨｐＳｔＣの場合は、αｖ−インテグリンがα鎖のために使用される。それゆえ、ＨｐＳｔＣ前駆体はαｖ−インテグリンを発現する可能性が高い。興味深いことに、成体ＨｐＳｔＣ上で発現されるαｖβ３−インテグリンとＥＣＭリガンドの相互作用は、ＨｐＳｔＣの運命決定、すなわち増殖又はアポトーシスに影響を及ぼすと考えられた。αｖβ３−インテグリンは、成体ＨｐＳｔＣにアポトーシス応答を保護するための刺激シグナルを形質導入した。加えて、もう１つの報告は、αｖβ３−インテグリンがＰＥＣＡＭ−１に結合することを示した。それゆえ、理論に限定されることなく又は理論に縛られることなく、ＨｐＳｔＣ前駆体でのβ３−インテグリン発現は、胎児肝発生の間の増殖のために、周囲のＥＣＭリガンド又は、ＰＥＣＡＭ−１を発現する内皮細胞からの刺激シグナルを受容するために重要であると思われる。
【００１８】
ＦＡＣＳ分析では、胎児肝の肝芽細胞及びＨｐＳｔＣ前駆体においてＶＣＡＭ−１の高発現が検出されることが示されたが、後者は、更にＳＤＦ−１αも発現するので、造血細胞に対してより重要な役割を果たすと考えられる。ＳＤＦ−１αは、ＳＤＦ−１αの受容体であるＣＸＣＲ４を発現する造血幹細胞の強力な化学誘引物質である。このケモカインは、造血幹細胞／前駆細胞の骨髄への移動において中心的役割を果たし、ＶＣＡＭ−１へのＶＬＡ−４依存性接着を上方制御すると思われる。それゆえ、ＨｐＳｔＣ前駆体でのＳＤＦ−１α及びＶＣＡＭ−１の発現は、造血幹細胞／前駆細胞を胎児肝に補充するために極めて重要である可能性がある。
【００１９】
興味深いことに、ＶＣＡＭ−１は肝芽細胞で発現される。表面表現型及びｍＲＮＡ発現に加えて、肝芽細胞についてのインビトロＣＦＡによっても、ＶＣＡＭ−１＋細胞が肝芽細胞であることが明らかにされた。ＶＣＡＭ−１は、内皮細胞、筋原細胞又はＨｐＳｔＣなどの間葉細胞についての表面マーカーとして知られているので、この所見は予想外である。成体肝細胞はＦＡＣＳ分析によってＶＣＡＭ−１−であるので、発現は発生的に制御されると考えられる。
【００２０】
ＨｐＳｔＣ前駆体は胎児肝における主要なＨＧＦ産生細胞であるので、肝発生にとって重要であると思われる。ＨＧＦは肝発生において重要な増殖因子であり、この因子はまた肝再生においても肝実質細胞増殖の役割を担う。加えて、ＨｐＳｔＣは成体肝においてＨＧＦを発現するが、実質細胞、内皮細胞及びクッパー細胞はＨＧＦを発現しない。それゆえ、我々のデータ及びこれまでの試験は、ＨｐＳｔＣが肝における胎児から成体までの主要なＨＧＦ産生細胞であることを示唆する。それゆえＨｐＳｔＣ前駆体は、それ自体がＨＧＦ及びＳＤＦ−１αの主要産生細胞であることから、おそらく胎児肝において肝及び造血発生において重要な役割を果たすと考えられる。
【００２１】
ＶＣＡＭ−１及びＨｌｘの発現及びＨＧＦ及びＳＤＦ−１αの産生を含むＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな表現型及び機能的特徴を考慮すると、前駆体は、肝における造血幹細胞若しくは肝幹細胞又はその両方のための幹細胞ニッチからなると考えられる。無血清培養系はインビトロでＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな特徴的表現型を維持したので、この培養系は、成体肝からＨｐＳｔＣ前駆体を同定するためのインビトロコロニーアッセイ系を開発するために使用できる。加えて、ＨｐＳｔＣ移植系が開発されれば、ＨｐＳｔＣ前駆体を使用した細胞療法が実施可能となる。成体肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体又はＨｐＳｔＣ前駆細胞の同定、エクスビボ増殖及び移植は、線維性肝において活性化ＨｐＳｔＣを置換するための貴重な手段である。明らかに、本試験で述べるＨｐＳｔＣ前駆体についての表現型同定及びインビトロ培養系は、肝疾患に対する新規治療アプローチを開発するための新たな方向を示す。
【００２２】
以下の実施例は本発明の例示であるが、本発明はいかなる意味においてもこれらの特定実施例に限定されない。また、当業者であれば、これらの実施例が本発明を実施するための手段の１つに過ぎないことは明らかである。更に、本実施例は実験上の利便性からラットに関して提示するが、ここで述べる方法及び試薬は、以下で開示する教示から当業者によってヒトへの適用に容易に適合され得るものである。
【００２３】
実験材料及び方法
ラット
妊娠Ｆｉｓｈｅｒ ３４４ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より入手した。栓子が認められた日の午前を０日目と指定した。雄性Ｆｉｓｈｅｒ ３４４ラット（２００ｇ〜２５０ｇ）を成体ＨｐＳｔＣの単離に使用した。動物実験はすべて、施設のガイドラインの下で実施され、ノースカロライナ大学動物管理使用委員会（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）は、国立科学アカデミー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の実験動物の管理と使用のための指針（Ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従ってすべての実験手順を承認した。
【００２４】
細胞の作製
本発明に従ったインビトロ増殖に適する肝前駆細胞は、特定の方法によって単離又は同定されるものに限定されない。一般に、ＨｐＳｔＣ前駆体は肝の切除切片から入手し得る。肝の切除切片を、次に、標準的な手順によって単一分離細胞に解離し得る。そのような手順は酵素的解離及び機械的解離を含む。酵素的解離は、コラゲナーゼなどのプロテアーゼ又はＤＮアーゼなどのヌクレアーゼの存在下で実施し得る。一部の場合には、プロナーゼも使用し得る。肝細胞の酵素的解離の方法は当技術分野において記述され、実施されている。例として、肝前駆細胞の単離と同定の方法は、米国特許第６，０６９，００５号及び米国特許出願第０９／４８７，３１８号、同第１０／１３５，７００号、及び同第１０／３８７，５４７号に述べられている。尚、これらの開示全体は参照により本開示に組み込まれる。実際に、肝細胞の単細胞懸濁液の消化及び単離には、様々な手法が存在する。それゆえ、本発明の範囲は、肝全体を入手する又はその単細胞懸濁液を調製する特定の方法に限定されないことが了解されるべきである。
【００２５】
本実施例では、１３〜１４匹のｄｐｃラットから胎児肝を単離し、８００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で消化して、次にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）で更に消化した。細胞懸濁液を２００Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）で処理した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。
【００２６】
細胞培養
好ましい実施形態では、インビトロ増殖工程には、フィーダー細胞層上でのＨｐＳｔＣ前駆細胞の増殖を支持するために無血清ホルモン添加合成培地（ＨＤＭ）を使用することが含まれる。フィーダー細胞の機能には、養分を供給する接着表面を供給すること、及び前駆体ＨｐＳｔＣの生存、増殖又は分化に必要な特定の増殖因子及び細胞外マトリックス成分を培地に分泌することなどが含まれ、多種多様である。フィーダー細胞は、爬虫類、鳥類、甲殻類、魚類、環形動物、軟体動物、線虫、昆虫又は哺乳動物、好ましくはヒトから得ることができる。より好ましくは、フィーダー細胞は、胚組織、更に好ましくは胚肝組織に由来する。胎児肝細胞を、以前に述べたように（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）ＳＴＯフィーダー細胞上で無血清ホルモン添加合成培地において培養した。
【００２７】
ＨＤＭは、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１０−６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．４×１０−３Ｍニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、７．６μｇ当量／ｌ遊離脂肪酸、２×１０−３Ｍグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１×１０−６ＭのＣｕＳＯ４、３×１０−８ＭのＮａ２ＳｅＯ３及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の１：１混合物からなる。遊離脂肪酸には、１００ｍｇ当量／ｌ保存溶液についてそれぞれ３１．０：２．８：１１．６：１３．４：３５．６：５．６のミリモル比のパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸（すべてＳｉｇｍａ）を含んだ。
【００２８】
ＳＴＯフィーダー細胞を以前に述べたように作製した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。簡単に説明すると、ＳＴＯ細胞のサブクローン、ＳＴＯ５をｐＥＦ−Ｈｌｘ−ＭＣｌｎｅｏでトランスフェクトした。トランスフェクトしたクローン、ＳＴＯ５ＨｌｘをマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で処理し、１２穴プレートにおいて２×１０５細胞／穴の濃度でフィーダー細胞に使用した。選別ｖＡ＋細胞の長期間培養として、その細胞をＳＴＯフィーダー細胞上で、１０ｎｇ／ｍｌヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び１０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を添加したＨＤＭにおいて培養した。培地を１日おきに交換し、細胞を毎週新鮮ＳＴＯフィーダー細胞に継代培養した。
【００２９】
コロニーの免疫細胞化学染色
培養細胞についての染色手順は以前に述べられている（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。簡単に説明すると、培養プレートをメタノール−アセトン（１：１）中に室温で２分間固定し、洗浄して、４℃で２０％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）によってブロックした。アルブミン（ＡＬＢ）及びサイトケラチン（ＣＫ）１９の二重標識のために、培養物を抗ラットＡＬＢ抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）及び抗サイトケラチン１９（ＣＫ１９）モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、次いでテキサスレッド結合抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ）と共にインキュベートした。ネスチン又はデスミン発現に関しては、細胞を抗ネスチン抗体（Ｒａｔ−４０１、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）又は抗デスミン抗体（Ｄ３３、Ｄａｋｏ）、次いでアレクサ４８８結合抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。
【００３０】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
細胞を、デュアルコヒーレントＩ−９０レーザーを備えたＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、選別した。ｖＡ特異的自己蛍光を検出するため、細胞を３５１ｎｍで励起し、蛍光放出を、４５０ＤＦ２０フィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を使用して検出した。蛍光結合抗体を４８８ｎｍで励起し、それらの蛍光放出を標準フィルターによって検出した。
【００３１】
ラット細胞の分析のために使用したモノクローナル抗体は、ＦＩＴＣ結合抗ＲＴ１Ａ（Ｂ５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ラットＩＣＡＭ−１（１Ａ２９；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＶＣＡＭ−１（５Ｆ１０、Ｂａｂｃｏ）、抗ラットα６β１−インテグリン（ｍＡＢ−５Ａ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ラットＣＤ４４（ＯＸ−４９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合抗ラットＶＣＡＭ−１（ＭＲ１０９；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合又はビオチン結合抗ラットβ３−インテグリン（２Ｃ９．Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビオチン結合抗ラットＰＥＣＡＭ−１（ＴＬＤ−３Ａ１２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビオチン結合抗ラットＴｈｙ−１（ＯＸ−７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。非特異的抗体結合をブロックするため、ＦＡＣＳ実験における抗体染色の前に、細胞を２０％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１％硬骨魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）及び抗ラットＣＤ３２（ＦｃγＩＩ受容体）抗体（Ｄ３４−４８５、Ｒａｔ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液と共にインキュベートした。非結合抗ＶＣＡＭ−１抗体（５Ｆ１０）で染色するため、胎児肝細胞を抗ＶＣＡＭ−１抗体と共にインキュベートし、その後ビオチン結合抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（Ｒ１９−１５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ビオチン結合抗体を検出するためにストレプトアビジン−Ｃｙ−クロム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。
【００３２】
選別ｖＡ＋細胞に由来する長期間培養細胞を単離するＦＡＣＳ実験のために、培養物中のすべての細胞を採集し、培養ラット細胞及びＳＴＯフィーダー細胞を分離するためにビオチン結合抗マウスＣＤ９８（Ｈ２０２−１４１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いでストレプトアビジン−Ｃｙ−クロムで染色した。マウスＳＴＯフィーダー細胞は、マウスＣＤ９８に対する抗体で明るく染色された。それゆえ、ＣＤ９８陰性細胞はラット由来細胞であり、先に示したように（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）ＦＡＣＳを用いて容易に識別できる。
【００３３】
肝芽細胞についてのコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）
肝芽細胞に関するＣＦＡの手順は以前に述べられている（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。簡単に説明すると、選別された細胞を、１２穴プレートに５００又は２５００細胞／穴（３．８ｃｍ２）でＳＴＯフィーダー細胞に３組接種し、培地を１日おきに交換して１４〜１５日間ＨＤＭ中で培養した。肝芽細胞の両能性分化活性を検討するため、ＡＬＢ及びＣＫ１９の二重免疫蛍光染色を実施した。各穴当たりのコロニーの数を計数するため、コロニーをＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｂａｘｔｅｒ）によって染色した。
【００３４】
細胞増殖アッセイ
ＦＡＣＳによって単離したｖＡ＋細胞を、最終濃度８μｇ／ｍｌのラミニン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したＨＤＭを含む９６穴プレートにおいて５００細胞／穴で３組接種した。ＥＧＦ及びＬＩＦを指示されている濃度で添加した。接種の５日後、浮遊細胞を除去するために細胞培養物を２回洗浄し、生存接着細胞の数を計数するためにテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む新鮮培地を添加した（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。４時間後、製造者のプロトコールに従って吸光度を測定した。
【００３５】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＰＣＲに使用したプライマー配列を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
ＦＡＣＳによって選別した細胞についてのＲＴ−ＰＣＲの手順は以前に述べられている（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。簡単に説明すると、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓセルソーターを用いて細胞を単離し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって抽出して、ｃＤＮＡ合成に供した。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライミング及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ）により、反応容量２０μｌ、４２℃でｔｏｔａｌＲＮＡから合成した（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＰＣＲは、合成されたｃＤＮＡに関して、各々のプライマー１μＭ、各々のｄＮＴＰ ２００μＭ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３及び１．２５Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ）からなる総容量５０μｌで実施した。試料を９４℃に３分間加熱し、次いで９４℃２分間、６２℃２分間及び７２℃３分間の２６〜３５サイクル増幅した。各標的遺伝子についての増幅サイクルの数は異なっており、表１に示している。最後のサイクル後、最終伸長工程を７２℃で６分間実施した。その後、各々のＰＣＲ反応物５μｌを１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。選別細胞のｔｏｔａｌＲＮＡから合成したｃＤＮＡを細胞数で標準化した。
【００３８】
実験結果
胎児肝におけるビタミンＡ＋細胞の同定
単細胞懸濁液の確立後において、ＨｐＳｔＣ前駆体の単離には、肝組織に由来する混合肝細胞集団をフローサイトメトリーに供すること、及び細胞質ビタミンＡ（ｖＡ）に富む脂質滴によって生成される特異的自己蛍光を示す細胞を選択すること、とが含まれる。ビタミンＡは、３３０〜３６０ｎｍ（紫外線、ＵＶ）レーザー光で励起したとき緑青色蛍光を生じる。ＦＡＣＳ分析は、ＵＶレーザーを使用して、肝における成熟ＨｐＳｔＣならびに前駆体ＨｐＳｔＣの両方の細胞質中のビタミンＡ特異的緑青色蛍光（ｖＡ＋）を検出することができる。
【００３９】
図１Ａは、１３ｄｐｃ胎仔肝細胞における自己蛍光のパターンを示す。ｖＡ特異的緑青色自己蛍光シグナルを、ＵＶレーザー（３５１ｎｍ）の励起により４５０ｎｍフィルターで放出光を検出することによって測定した。非ＵＶレーザー特異的自己蛍光シグナルを検出するため、４８８ｎｍレーザー及び５３０／３０ｎｍバンドパスフィルターを使用した。全胎仔肝細胞集団ならびに２つの小集団（図１ＡのＲ１及びＲ２ゲート）の自己蛍光シグナルのパターンを図１Ｂに示す。全細胞集団のＦＡＣＳパターンにおいて（図１Ｂ、ＡＬＬ）、高い自己蛍光特徴を有する２つの異なる小集団が同定された。その１つは、ここではｖＡ＋と称するが、ＵＶ光に特異的な自己蛍光シグナルを有する（図１Ｂ、ＡＬＬ、左上）。一方右上象限において対角線上に位置する細胞は、非特異的自己蛍光を示す。これは、４８８ｎｍレーザー及びＵＶレーザーによってそれぞれ励起したとき、５３０ｎｍフィルター及び４５０ｎｍフィルターで自己蛍光シグナルが検出されたためである。非特異的自己蛍光特徴を有する小集団（ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋と称する）はもっぱらＳＳＣｈｉｇｈゲートに由来したが（図１Ａ、Ｒ２及び図１Ｂ、Ｒ２）、ｖＡ＋細胞（図１Ｂ、左上）はＲ１とＲ２の両方で検出された。
【００４０】
図１Ｃは、ＲＴ１Ａに対するＦＩＴＣ結合抗体によって検出したｖＡ特異的自己蛍光シグナル及びＭＨＣクラスＩａ発現のパターンを示す。ＦＡＣＳ分析では、ｖＡ＋細胞並びにｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞がＲＴ１Ａ発現を有さないことが示された。これは、これら２つの集団が、対照試料（図１Ｂ、Ｒ２）と比較して染色試料（図１Ｃ、Ｒ２）においてシフトしなかったためである。加えて、ＦＡＣＳ分析によればまた、肝芽細胞集団、すなわちＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉｇｈである細胞（図１Ａ、Ｒ２、右下）とＲＴ１Ａ−ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞（図１Ｃ、Ｒ２、矢印）がこのＦＡＣＳ分析による重複集団であることが示された。
【００４１】
これらの自己蛍光シグナルが胎児肝において特異的であるか否かを調べるため、１３ｄｐｃ胎児から胎児肺細胞を単離し、ＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析は、肺細胞にはｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞又はｖＡ＋細胞のいずれも存在しないことを示し（図１Ｄ）、胎児肝における特定小集団の自己蛍光シグナルがユニークな表現型特徴であることを示唆した。
【００４２】
肝前駆細胞（すなわち肝芽細胞）は、ラット胎仔の１３ｄｐｃ肝においてＲＴ１Ａ−ＯＸ１８ｌｏｗＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉｇｈ細胞であることが示唆されたので、これらのマーカーをｖＡ＋細胞において検定した。図１Ａは、１３ｄｐｃでの胎仔肝細胞のＦＡＣＳ分析とそれに続くＲＴ１Ａ、ラットＭＨＣクラスＩ及びＩＣＡＭ−１に対する抗体での染色のパターンを示す。図１Ｃは、ｖＡ−特異的自己蛍光シグナルとＲＴ１Ａに対するＦＩＴＣ結合抗体によって検出したＲＴ１Ａ発現のパターンとを示す。ＦＡＣＳ分析では、ｖＡ＋細胞ならびにｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞がＲＴ１Ａ発現を有さないことが示された。これは、これら２つの集団が、対照試料（図１Ｂ、Ｒ２）と比較して染色試料（図１Ｃ、Ｒ２）においてシフトしなかったためである。加えて、ＦＡＣＳ分析では、肝芽細胞集団、すなわちＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋ＳＳＣｈｉｇｈである細胞（図１Ａ、Ｒ２、右下）とＲＴ１Ａ−ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞（図１Ｃ、Ｒ２、矢印）とが同一集団であることが示された。これらの結果は、ＦＡＣＳ分析が１３ｄｐｃという早期にラット胎仔肝において特徴的なｖＡ＋細胞を検出できたこと、及びｖＡ＋細胞はＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋であったことを示している。
【００４３】
ビタミンＡ＋細胞におけるＶＣＡＭ−１及びインテグリンβ３の発現
上記で明らかにしたように、ｖＡ陽性及びＭＨＣクラスＩａ陰性はＨｐＳｔＣを同定単離する十分なマーカーである。しかし、一部の場合、特に分子（たとえばＤＮＡ）の完全性が懸念される場合には、ＵＶ光に基づくＵＶ選択は望ましくないと考えられる。それゆえ、本発明は、ＵＶに基づく選択に加えて又はその代わりに使用し得るマーカーを提供する。ＨｐＳｔＣ前駆体は、選択した細胞集団をＶＣＡＭ、より詳細にはＶＣＡＭ−１、に特異的な抗体に曝露することによって更に同定され得る。ＶＣＡＭ−１は、成体肝においてＨｐＳｔＣを筋線維芽細胞と区別するユニークな表面マーカーであることが示されたことから、有効なマーカーである。更に、成体肝細胞はこのマーカーに関して陰性であるので、ＶＣＡＭ−１の発現は発生的に制御されると考えられる。
【００４４】
ｖＡ＋細胞がＶＣＡＭ−１を発現するか否かを検討するために、ＶＣＡＭ−１発現を胎仔肝細胞において分析した。ＦＡＣＳ分析によると、１３ｄｐｃ胎仔肝において細胞の約１５％がＶＣＡＭ−１＋であった（図２Ａ）。次に、ＶＣＡＭ−１＋細胞の自己蛍光及びＲＴ１Ａ発現のパターンを測定した。ＶＣＡＭ−１＋細胞は基本的にすべてのｖＡ＋細胞ならびに全ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋細胞集団を含み（図２Ａ）、ＨｐＳｔＣ及び肝芽細胞がＶＣＡＭ−１を発現することが示された。ラットＶＣＡＭ−１に対する２つのモノクローナル抗体（５Ｆ１０及びＭＲ１０９）のＦＡＣＳ分析では、ＶＣＡＭ−１発現において同一のパターンが示された。加えて、図２ＢのＲ１ゲートはＶＣＡＭ−１＋細胞集団を含んでいたため、胎仔肝ＶＣＡＭ−１＋細胞はＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋細胞であった。これらの結果は、胎仔肝のＶＣＡＭ−１＋ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋細胞がｖＡ＋細胞、肝芽細胞及び多少の非自己蛍光細胞からなることを示唆している。
【００４５】
共にＶＣＡＭ−１＋ＲＴ１Ａ−ＩＣＡＭ−１＋細胞である２つの自己蛍光集団、ｖＡ＋細胞及び肝芽細胞を識別するためにさらなる表面抗原を検討した。β３−インテグリン（ＣＤ６１）は内皮細胞、血管平滑筋細胞及び成体ＨｐＳｔＣで発現されるので、ＶＣＡＭ−１対インテグリンβ３の二色ＦＡＣＳ分析を実施した。ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞の大部分がβ３−インテグリンを発現したが、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞はβ３−インテグリン−であり、一方ｖＡ−ＲＴ１Ａ−細胞は多少のＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を含んだ（図３Ｂ）。
【００４６】
ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−細胞は、多少のＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を含んだ。残りの主要集団（図３Ｂ、Ｒ４）はＶＣＡＭ−１−であり、図２ＢのＲ２細胞集団に対応すると考えられた。Ｒ４細胞集団は、プラスチック皿で培養すると非接着細胞を含む。これによりそれらが造血細胞であることが示唆された。分画の小集団（〜２０％）はβ３−インテグリン＋であった。内皮細胞マーカーとして知られるＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）の発現も評価した。しかし、ＦＡＣＳ分析では、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞及びｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞におけるＰＥＣＡＭ−１発現が無視し得る程度であり（図３Ｂ）、一方ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−及び非接着細胞集団においてＰＥＣＡＭ−１＋細胞が検出される（図３Ｂ、Ｒ２及びＲ４）ことが示された。更に、腫瘍形成性損傷後の成体肝において出現する卵形細胞についての表面マーカー、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）の発現を評価した。ＦＡＣＳ分析では、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−がＴｈｙ−１−であることが示された。
【００４７】
これに対し、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞、ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−細胞及び非接着細胞は不均一にＴｈｙ−１を発現する。ＦＡＣＳ分析により、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞がＣＤ４４ｌｏであり、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞がＣＤ４４−であることが示された（データは示さず）。ＣＤ４４（Ｐｇｐ−１）については、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞とｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−において異なった発現を示したが、細胞表面での発現は弱かった。合わせて考慮すると、これらのデータは、検討したすべての抗体の中で、β３−インテグリン抗体染色により、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−細胞とｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−細胞（両集団共に胎児肝においてＶＣＡＭ−１＋ＩＣＡＭ−１＋）の識別が容易になることを示唆している。
【００４８】
ＶＣＡＭ−１＋インテグリンβ３−非特異的自己蛍光細胞集団は肝芽細胞のみ含む。
１４ｄｐｃまでのラットの胎仔肝細胞は、微小環境に依存して肝細胞及び胆管上皮細胞の両方に分化する発生能に関して均質である。これらの両能性前駆細胞は肝芽細胞と呼ばれる。ｖＡ＋細胞が肝細胞系統を生成する潜在能を有するかどうかを検討するため、ＣＦＡ（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）を実施した。４つの細胞集団をＦＡＣＳによって単離し、肝芽細胞についてのＣＦＡに供した。ここで、この４つの細胞集団は、（１）ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−、（２）ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、（３）ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−、及び（４）ＶＣＡＭ−１−非接着細胞とした。選別された細胞分画をＨＤＭ中のＳＴＯ５フィーダー細胞上に置き、１５日間培養して、それぞれ肝及び胆管系統に関してアルブミン及びＣＫ１９に対する抗体で染色した。その後、すべての肝コロニーを計数した。
【００４９】
ＣＦＡは、肝コロニーが第１群のｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−細胞から生成されることを示し（下表２）、ｖＡ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を含む、選別細胞のその他の群が肝前駆細胞ではないことを明らかにした。第１群の選別細胞に由来する肝コロニーの９５％以上が、肝細胞（アルブミン＋ＣＫ１９−）及び胆管上皮細胞（アルブミン−ＣＫ１９＋）の両方を含んだ（図４）。更に、選別されたｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−細胞におけるコロニー形成効率は約３１％であり、既に前記試験（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）により樹立された肝前駆細胞系統（ｒｈｅｌ４３２１）は、４２．５±１．８％のＣＦＡにおけるコロニー効率を有していた。合わせて考慮すると、樹立された細胞系統によるＣＦＡはおそらく新鮮単離細胞よりもはるかに高いので、この実験におけるＣＦＡの結果は、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−細胞集団がほぼ純粋な肝芽細胞集団であることを示している。
【００５０】
表２は、選別されたげっ歯動物胎仔肝細胞からの肝星細胞コロニーの発生率を示す。ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−及びＶＣＡＭ−１−細胞の分画のためのゲートを、それぞれ図３のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４に示すように作製した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
フローサイトメトリー選別細胞を、１２穴プレートにおいて各穴につき表中の細胞数でＳＴＯフィーダー細胞上にて培養した。肝コロニー数は各穴当たりの平均である。コロニー効率は、培養中に接種した細胞と１５日間の培養後にコロニー形成へと進んだ細胞とのパーセンテージで表わされている。数値は平均±ＳＥＭである。選別細胞を接種した穴の総数をカッコ内に示している。
【００５３】
新鮮単離ビタミンＡ＋ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の遺伝子発現
次に、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞の遺伝子発現パターンを、それらがＨｐＳｔＣについての様々なマーカーを発現するか否かを調べるために検定した。５つの集団をＦＡＣＳによって単離し、その５つの集団からＲＮＡを単離した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを使用してＨｐＳｔＣマーカーについてのＲＴ−ＰＣＲを実施した。ここで、５つの集団は、（１）ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン−、（２）ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋、（３）ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、（４）ａｕｔｏｆｌｕ−ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１−、及び（５）ＶＣＡＭ−１−非接着細胞集団とした。成体肝におけるＨｐＳｔＣは、肝の他の細胞型では発現されない中間フィラメント、デスミン及びネスチンを発現する。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋、ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋、及びａｕｔｏｆｌｕ−ＶＣＡＭ−１−細胞が４つの中間フィラメントすべてを発現することを示した。ｎｓ−ａｕｔｏｆｌｕ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋細胞は、アルブミンならびに肝芽細胞において特異的に発現する転写因子であるＰｒｏｘ１を発現する。この結果は、この集団が肝芽細胞を備えることを明らかにしたＣＦＡアッセイから得られたデータと一致した。肝芽細胞集団では、ネスチン、ＳＭαＡ又はビメンチンの発現は存在しなかった。ＨｐＳｔＣ特異的中間フィラメントの発現は、ｖＡ＋細胞がＨｐＳｔＣ前駆体であることを強く示唆している。
【００５５】
その後、３つの別個の間葉細胞マーカー、ＨＧＦ、間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）及び分岐型ホメオボックス転写因子であるＨｌｘの発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。マウスにおける正常な肝発生、特に肝芽細胞の増殖と分化のためにはＨＧＦが必要であり、成体肝ではＨｐＳｔＣはＨＧＦの主要産生細胞である。ＳＤＦ−１αは、造血前駆細胞のための強力なケモカインであり、胎児肝における造血幹細胞はケモカインに応答して遊走する。Ｈｌｘは、発生中の胎児肝における間葉細胞で発現され、胎児肝造血及び肝発生において必須の役割を果たす。
【００５６】
興味深いことに、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞は、検討したすべての細胞分画の中でＨＧＦ、ＳＤＦ−１α及びＨｌｘ転写産物を最も強く発現した（図５）。集合的に、ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞はデスミン＋ネスチン＋ＳＭαＡ＋ビメンチン＋Ｈｌｘ＋であり、胎児肝におけるＨＧＦ及びＳＤＦ−１αの主要産生細胞である。
【００５７】
ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋ｖＡ＋細胞のエクスビボでのクローン性増殖
成体肝から単離したＨｐＳｔＣは、インビトロでは限られた増殖活性しか有さない。ＨｐＳｔＣ前駆体は大きな増殖活性を有すると考えられるので、胎児肝におけるｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞のエクスビボでの増殖能力を検討した。ＬＩＦは、胚性幹細胞又は筋原性細胞を含む多くの異なる細胞型についての多面発現性増殖因子である。ＦＡＣＳによって単離されたｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を、ＬＩＦの存在下で５日間、９６穴プレートにおいて５００細胞／穴の細胞密度でホルモン添加合成無血清培地にて培養すると、細胞は用量依存的に増殖した（図６Ａ）。加えて、神経幹細胞を含む様々な細胞型のための増殖因子であるＥＧＦは、ＬＩＦによって誘導されるＨｐＳｔＣ前駆体の増殖を増強したが、ＥＧＦ単独では増殖を補助しなかった（図６Ａ）。
【００５８】
しかしながら、プラスチック培養プレートだけを使用した条件下では増殖は持続しなかった。それゆえ、ＦＡＣＳ選別ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞を、次に、ＳＴＯ５フィーダー細胞上に置いた（Ｋｕｂｏｔａ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，２０００）。ＬＩＦはＳＴＯ細胞によって産生されるが、外因性ＬＩＦ及びＥＧＦの添加は、選別ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞からのコロニー形成を更に劇的に補助した（図６Ｂ）。培養中で増殖する細胞はデスミン及びネスチンを発現したが、ＳＴＯ５フィーダー細胞はどちらも発現しなかった（図７）。３つの単一コロニーを採取し、新鮮ＳＴＯ５フィーダー細胞上に置いた。単一コロニー由来細胞は、ＬＩＦ及びＥＧＦを添加したＳＴＯ５フィーダー細胞との共培養において２ヶ月間増殖し続け、それらが大きな増殖潜在能を有することが示された。この増殖細胞において、デスミン及びネスチンの発現は維持された（図８）。
【００５９】
新鮮単離ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞と２ヶ月間培養した細胞との特徴的表現型を更に比較するため、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。２ヶ月間培養下に維持した単一コロニー由来細胞（Ａ４２８−３）をＦＡＣＳによってＳＴＯ５フィーダー細胞から分離し、ＲＴ−ＰＣＲ分析用にＲＮＡを抽出した。対照試料として、同時に選別されたＳＴＯ５フィーダー細胞からＲＮＡを単離した。加えて、成体ＨｐＳｔＣからＲＮＡを単離して、Ａ４２８−３及びＳＴＯ５細胞より得られたＲＮＡと比較した。
【００６０】
結果は、Ａ４２８−３が、デスミン、ネスチン、ＳＭαＡ、ビメンチン、β３−インテグリン、ＳＤＦ−１α、ＨＧＦ及びＨｌｘを発現することを明らかにし、発現パターンが新鮮ｖＡ＋ＲＴ１Ａ−ＶＣＡＭ−１＋β３−インテグリン＋細胞に類似することを示した（図５及び図９Ａ）。更に、ＶＣＡＭ−１発現がＦＡＣＳ分析によって確認された（図９Ｂ）。ＲＴ１Ａ発現はインビトロ培養において誘導されると考えられた（図９Ｂ）。成体ＨｐＳｔＣのＲＴ−ＰＣＲ結果は、正常成体ＨｐＳｔＣの表現型がデスミン＋、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）＋、ＨＧＦ＋、ＳＭαＡｌｏ／−であるというこれまでの報告と一致した。結果はまた、成体ＨｐＳｔＣがＳＤＦ−１α、β３−インテグリン及びＨｌｘを発現することを示した。Ａ４２８−３細胞において（図９Ａ）又は胎児肝で試験したいかなる分画においても、ＧＦＡＰの発現は見られなかった。
【００６１】
本発明は、しかし、たとえばβ３−インテグリン＋ＰＥＣＡＭ−１−ＶＬＡ−６＋及びＣＤ４４Ｈ−を含む、ＨｐＳｔＣ前駆細胞を同定するために上記マーカーと共に使用し得る付加的なマーカーを提供する。ＩＣＡＭ−１及びβ３−インテグリンも成熟ＨｐＳｔＣで発現される。それらの表面マーカーに加えて、成熟及び前駆体ＨｐＳｔＣは、デスミン、ビメンチン、平滑筋ａアクチン及びネスチンを含むＨｐＳｔＣに特異的な中間フィラメントを発現する。
【００６２】
この試験では、Ａ４２８−３細胞において（図９Ａ）又は胎児肝ＧＦＡＰにおいて試験したいかなる分画においても、ＧＦＡＰの検出可能な発現は存在しなかった。ＧＦＡＰは中枢神経系において星状膠細胞を同定するために使用されるマーカーであるが、このタンパク質は成体肝のＨｐＳｔＣにおいても発現される。しかし、我々は、ＲＴ−ＰＣＲで試験したいかなる細胞画分ならびに全胎児肝試料においても、ＧＦＡＰ ｍＲＮＡを認めなかった。加えて、単離ＨｐＳｔＣ前駆体の培養後でさえも、ＧＦＡＰ発現は誘導されなかったが、デスミン及びネスチンの発現は培養物において維持された。この結果は、胎児肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体が後期発生段階でＧＦＡＰ発現を獲得することを示唆する。我々は、しかし、ＧＦＡＰ＋細胞が１３ｄｐｃ胎児肝においては存在しない異なる前駆体に由来するというもう１つの可能性を排除できない。血流中の循環細胞は選択的細胞起源のソースとなり得る。しかし、成体肝のＨｐＳｔＣの大部分がＧＦＡＰを発現する。従って、血液からの循環細胞の小さな寄与が肝において支配的な集団になる可能性は低い。それゆえ、ＧＦＡＰ発現の獲得はＨｐＳｔＣの成熟の間に起こる可能性がより高いと思われる。
【００６３】
データはまた、ＨｐＳｔＣ前駆体が分岐型ホメオボックスタンパク質であるＨｌｘを比較的強く発現することを示した。Ｈｌｘ発現とＨｐＳｔＣ発生の関係は明らかでないが、Ｈｌｘ発現の喪失は突然変異マウスにおける欠陥に寄与し得る。マウス胎仔肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体は、ＨＧＦ、ＳＤＦ−１α及びＨｌｘも発現する。
【００６４】
ＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな表面表現型に加えて、この試験で樹立された培養系は成体肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体の同定にも使用可能である。これまで、成体肝からのＨｐＳｔＣはウシ胎仔血清を添加した培地で培養されてきた。通常、血清添加培地で培養されたＨｐＳｔＣは筋線維芽細胞を生じさせ、この細胞は線維芽細胞特徴を獲得して、もとのＨｐＳｔＣ表現型を喪失する。それゆえ、血清添加培地条件はＨｐＳｔＣ前駆体を同定するために適切ではない。本試験で述べた無血清培養条件は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞のエクスビボでの維持を助けることができる。
【００６５】
ＨｐＳｔＣ前駆体は、検討した胎児肝細胞画分中のいかなる小集団よりも多くのＨＧＦ転写産物を発現するので、それらは肝発生のために鍵となる役割を果たすと考えられる。ＨＧＦは肝発生のために決定的に重要な増殖因子であり（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、この因子はまた、肝再生においても肝実質細胞増殖の責任を担う（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｅｓ，１９９７）。加えて、ＨｐＳｔＣは成体肝におけるＨＧＦの産生細胞であるが、実質細胞、内皮細胞又はクッパー細胞はＨＧＦの産生細胞ではないことが示された（Ｓｃｈｉｒｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。それゆえ、我々のデータ及びこれまでの試験によるデータは、ＨｐＳｔＣが肝における胎児から成体までの主要なＨＧＦ産生細胞であることを示唆している。
【００６６】
この試験では、１３ｄｐｃ胎仔肝においてＧＦＡＰ発現は存在しなかった。ＧＦＡＰは中枢神経系における星状膠細胞の同定に使用されるマーカーであるが、このタンパク質は成体肝のＨｐＳｔＣにおいても発現する。しかし、我々は、試験したいかなる細胞画分ならびに全胎児肝試料においても、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＦＡＰ ｍＲＮＡを認めなかった。加えて、単離ＨｐＳｔＣ前駆体の培養後でさえも、ＧＦＡＰ発現は誘導されなかったが、デスミン及びネスチンの発現は培養物において維持された。この結果は、胎児肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体が後期発生段階でＧＦＡＰ発現を獲得することを示唆している。我々は、しかし、ＧＦＡＰ＋細胞が１３ｄｐｃ胎児肝においては存在しない異なる前駆体に由来するというもう１つの可能性を排除できない。血流中の循環細胞は選択的細胞起源のソースであり得る。しかし、成体肝のＨｐＳｔＣの大部分がＧＦＡＰを発現する。従って、血液からの循環細胞の小さな寄与が肝において支配的な集団になる可能性は低い。それゆえ、ＧＦＡＰ発現の獲得はＨｐＳｔＣの成熟の間に起こる可能性がより高いと思われる。
【００６７】
分岐型ホメオボックスタンパク質のＨｌｘは、横中隔及び胎児肝における間葉細胞で発現される（Ｌｉｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。Ｈｌｘノックアウトマウスについてのこれまでの試験からは、突然変異マウスが肝発生及び胎仔肝造血障害を有することが明らかにされている（Ｈｅｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【００６８】
移植実験では、造血障害が造血前駆細胞自体によって引き起こされるのではなく、胎児肝微小環境によって引き起こされることが示された。それゆえ、Ｈｌｘ＋細胞は、胎児肝において、肝及び造血発生を助ける重要な細胞集団である。我々のデータによれば、ＨｐＳｔＣ前駆体がＨｌｘを強く発現することが示されている。それゆえ、ＨｌｘノックアウトマウスがＨｐＳｔＣ前駆体を有するかどうかを調べることは興味深い。Ｈｌｘ発現とＨｐＳｔＣ発生の関係は明らかでないが、Ｈｌｘ発現の喪失は突然変異マウスにおける欠陥に寄与し得る。最近、我々は、マウス胎仔肝における類似ＨｐＳｔＣ前駆体がＨＧＦ、ＳＤＦ−１ａ及びＨｌｘも発現することを認めた。更に、本発明人は、ヒト胎児肝において類似マーカー（たとえば平滑筋αアクチン）を有する間葉細胞を同定し、それがヒト肝幹細胞のエクスビボ増殖のために重要であることを明らかにした。
【００６９】
ＦＡＣＳによって精製されたＨｐＳｔＣ前駆体は、ＳＴＯフィーダー細胞上及び脂質、インスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ及びＬＩＦを添加した無血清培地条件下で増殖した。我々のデータは、ＬＩＦがインビトロ増殖のためにより有用であることを示唆した。ＳＴＯフィーダー細胞の支持により、ＨｐＳｔＣ前駆体は２ヶ月以上にわたって持続的に複製した。培養細胞は、ＶＣＡＭ−１、β３−インテグリン、デスミン、ビメンチン、平滑筋αアクチン、ネスチン、ＨＧＦ及びＳＤＦ−１ａを発現した。新鮮ＨｐＳｔＣ前駆体のこれらの表現型はインビトロ培養の間変化しなかった。
【００７０】
ＨｐＳｔＣ前駆体のユニークな表面表現型に加えて、本試験で樹立された培養系は成体肝におけるＨｐＳｔＣ前駆体の同定にも使用可能である。これまで、成体肝からのＨｐＳｔＣはウシ胎仔血清を添加した培地で培養されてきた。通常、血清添加培地で培養されたＨｐＳｔＣは筋線維芽細胞を生じさせ、この細胞は線維芽細胞特徴を獲得して、もとのＨｐＳｔＣ表現型を失う。それゆえ、血清添加培地条件はＨｐＳｔＣ前駆体を同定するために適切ではない。本試験で述べた無血清培養条件は、ＨｐＳｔＣ前駆細胞のエクスビボでの維持を助ける。成体肝においてＨｐＳｔＣ前駆体が存在すれば、それらは線維性肝において活性化ＨｐＳｔＣを置換するための貴重な手段である。ＨｐＳｔＣ前駆体についての表現型同定及びインビトロ培養系は、肝疾患のための新規治療アプローチの開発を促進する。
【００７１】
本発明をその特定実施形態に関連して説明したが、更なる変更が可能であり、本出願が本発明のいかなる変法、使用又は改変をもカバーするものである。一般に、本発明の原理は、本発明が関連する技術分野において公知又は慣例的なやり方に属し、先に述べた又は特許請求の範囲において述べる本質的特徴に適用され得るような本発明の開示からの逸脱をも包含するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、
（ａ）哺乳動物組織からの細胞の単細胞懸濁液を得ること、
を含み、前記方法は更に、任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、
（ｂ）ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞を前記単細胞懸濁液から除去すること、及び
（ｃ）ビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を前記単細胞懸濁液から単離すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物組織は、肝、膵、腸、肺又は骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｄ）ＶＣＡＭに関して陽性である細胞を単離すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ４５を発現する細胞を除去すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｄ）ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリンの両方に関して陽性である細胞を単離すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｅ）デスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を前記単細胞懸濁液から単離すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単離及び除去する工程は、フローサイトメトリーを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物組織は、肝組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記肝星細胞前駆細胞は、ヒト肝星細胞前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単離肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、
（ａ）肝細胞の細胞懸濁液を得ること、及び
（ｂ）任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｉ）ＩＣＡＭ抗原に関して陽性である細胞を前記肝細胞の前記単細胞懸濁液から単離すること、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ抗原に関して陽性である細胞を除去すること、及び（ｉｉｉ）フローサイトメーターでの測定においてビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を単離すること、
を含む方法。
【請求項１１】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｃ）デスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を前記細胞懸濁液から単離すること、を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離及び除去する工程は、前記フローサイトメーターにおいて実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する細胞の除去は、抗体によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記肝星細胞前駆細胞は、ヒト肝星細胞前駆細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離肝星細胞前駆細胞。
【請求項１６】
ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離星細胞前駆細胞を無血清培地で培養することを含む、星細胞前駆細胞のクローン原性増殖の方法。
【請求項１７】
前記培地は、増殖因子を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖因子は、インスリン、トランスフェリン、ＬＩＦ若しくはＥＧＦ、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離星細胞前駆細胞は、フィーダー細胞の存在下で更に培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記フィーダー細胞は、ＳＴＯ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、
（ａ）哺乳動物組織からの細胞の単細胞懸濁液を得ること、
を含み、前記方法は更に、任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、
（ｂ）ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞を前記単細胞懸濁液から除去すること、及び
（ｃ）ビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を前記単細胞懸濁液から単離すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物組織は、肝、膵、腸、肺又は骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｄ）ＶＣＡＭに関して陽性である細胞を単離すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ４５を発現する細胞を除去すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｄ）ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリンの両方に関して陽性である細胞を単離すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｅ）デスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を前記単細胞懸濁液から単離すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単離及び除去する工程は、フローサイトメトリーを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物組織は、肝組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記肝星細胞前駆細胞は、ヒト肝星細胞前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単離肝星細胞前駆細胞が富化された細胞の集団を得る方法であって、
（ａ）肝細胞の細胞懸濁液を得ること、及び
（ｂ）任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｉ）ＩＣＡＭ抗原に関して陽性である細胞を前記肝細胞の前記単細胞懸濁液から単離すること、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ抗原に関して陽性である細胞を除去すること、及び（ｉｉｉ）フローサイトメーターでの測定においてビタミンＡ蛍光に関して陽性である細胞を単離すること、
を含む方法。
【請求項１１】
任意の順序で連続的に又は実質的に同時に、（ｃ）デスミン、ネスチン、ビメンチン、平滑筋αアクチン又はそれらの組合せを発現する細胞を前記細胞懸濁液から単離すること、を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離及び除去する工程は、前記フローサイトメーターにおいて実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する細胞の除去は、抗体によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記肝星細胞前駆細胞は、ヒト肝星細胞前駆細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離肝星細胞前駆細胞。
【請求項１６】
ＶＣＡＭ抗原及びβ３−インテグリン抗原の両方を発現する単離星細胞前駆細胞を無血清培地で培養することを含む、星細胞前駆細胞のクローン原性増殖の方法。
【請求項１７】
前記培地は、増殖因子を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖因子は、インスリン、トランスフェリン、ＬＩＦ若しくはＥＧＦ、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離星細胞前駆細胞は、フィーダー細胞の存在下で更に培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記フィーダー細胞は、ＳＴＯ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５３８１５２（Ｐ２００９−５３８１５２Ａ）
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３３９２（Ｐ２００９−５１３３９２）
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０２４３
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５００４５９４１０）ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０２４３
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５００４５９４１０）ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル (16)
【Ｆターム（参考）】
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