肥満症のマーカーとその使用の方法
肥満症、特に小児肥満症のマーカーが、その使用の方法とともに提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６１／３０７，２０５号（２０１０年２月２３日提出）および米国の仮出願第６１／３９２，６７９号（２０１０年１０月１３日提出）について３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。前記出願は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により与えられたグラント番号Ｒ０１ ＨＤ０５６４６５−０１Ａ１のもと政府の支援によりなされた。政府は、本発明について特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は肥満症の分野に関する。具体的には、本発明は、肥満症、特に小児肥満症に関するマーカーおよびその使用の方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
いくつかの刊行物および特許文献が、本発明が属する分野の技術水準を説明するために本明細書を通じて引用される。これらの引用文献はそれぞれ出典明示により完全に記載されたように本明細書の一部とされる。
【０００５】
肥満症は現代の社会の大きな健康問題であり、西側社会で、特に小児において有病率が上昇している（Troiano et al. (1998) Pediatrics, 101:497-504）。肥満症およびその付随する表現形であるインスリン抵抗性（Reaven, G.M. (1988) Diabetes, 37:1595-607; DeFronzo et al. (1991) Diabetes Care, 14:173-94）は、米国における主な死因の一因とも考えられており、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧と他の慢性疾患に関する重要な危険因子でもある（National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement (1985) Ann. Intern. Med., 103:147-51）。約７０％の肥満症の若者は成長して肥満症の成人となる（Nicklas et al. (2001) J. Am. Coll. Nutr., 20:599-608; Whitaker et al. (1997) N. Engl. J. Med., 337:869-73; Parsons et al. (1999) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 23(Suppl 8): S1-107）。実際、青年期の肥満が、成人における増加した総死亡率と関係していることが示された（Must, A. (2003) Nutr. Rev., 61:139-42）。
【０００６】
ここ３０年ににわたる環境の変化、特に座りっぱなしの生活様式と共に便利な非常に高カロリー食品の無制限の供給にもかかわらず、肥満症のリスクに対する遺伝的要素に関する強力な証拠もある（Friedman, J.M. (2004) Nat. Med., 10:563-9; Lyon et al. (2005) Am. J. Clin. Nutr., 82:215S-217S）。これは人種集団間の有病率の差に反映される（Knowler et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:1-27; Zimmet et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:91-124）。加えて、肥満症の家族性発症は、一卵性（ＭＺ）双生児の間で体脂肪量７０〜９０％の一致であると報告され、二卵性（ＤＺ）双生児における３５〜４５％の一致より高いことが長い注目されていた（Stunkard et al. (1986) JAMA 256:51-4; Borjeson et al. (1976) Acta Paediatr. Scand., 65:279-87）。したがって、ＢＭＩの推定遺伝率は３０〜７０％の範囲にある（Hebebrand et al. (2003) Obes. Rev., 4:139-46; Farooqi et al. (2005) Int. J. Obes. (Lond), 29:1149-52; Bell et al. (2005) Nat. Rev. Genet., 6:221-34; Schousboe et al. (2003) Twin Res., 6:409-21）。
【０００７】
過去３年で、１３の遺伝子座が、主に成人のゲノムワイド関連（ＧＷＡ）研究の結果からＢＭＩに関連づけられた。インスリン誘発遺伝子２（ＩＮＳＩＧ２）は、この方法によって肥満症における役割が報告された最初の遺伝子座であったが(Herbert et al. (2006) Science 312:279-83)、再現試行では一致しない結果が得られた（Loos et al. (2007) Science 315:187; Dina et al. (2007) Science 315:187; Rosskopf et al. (2007) Science 315:187; Lyon et al. (2007) PLoS Genet., 3:e61; Hotta et al. (2008) J. Hum. Genet., 53:857-62）。二番目に報告された遺伝子座、体脂肪および肥満症関連の遺伝子（fat mass- and obesity-associated gene）（FTO; Frayling et al. (2007) Science 316:889-94）は、他の方法によりより強固に観察された（Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746; Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361; Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6; Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115）。後のより大規模な研究により、１１個のさらなる遺伝子座が明らかにされた（Loos et al. (2008) Nat. Genet., 40:768-75; Thorleifsson et al. (2009) Nat. Genet., 41:18-24; Willer et al. (2009) Nat. Genet., 41:25-34）。加えて、発育遅延のある小児における極度の症候性肥満症に関するコピー数バリエーション（copy number variation）の研究では、形質に寄与する少数のまれなバリアントが報告された（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Troiano et al. (1998) Pediatrics, 101:497-504
【非特許文献２】Reaven, G.M. (1988) Diabetes, 37:1595-607
【非特許文献３】DeFronzo et al. (1991) Diabetes Care, 14:173-94
【非特許文献４】National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement (1985) Ann. Intern. Med., 103:147-51
【非特許文献５】Nicklas et al. (2001) J. Am. Coll. Nutr., 20:599-608
【非特許文献６】Whitaker et al. (1997) N. Engl. J. Med., 337:869-73
【非特許文献７】Parsons et al. (1999) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 23(Suppl 8): S1-107
【非特許文献８】Must, A. (2003) Nutr. Rev., 61:139-42
【非特許文献９】Friedman, J.M. (2004) Nat. Med., 10:563-9
【非特許文献１０】Lyon et al. (2005) Am. J. Clin. Nutr., 82:215S-217S
【非特許文献１１】Knowler et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:1-27
【非特許文献１２】Zimmet et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:91-124
【非特許文献１３】Stunkard et al. (1986) JAMA 256:51-4
【非特許文献１４】Borjeson et al. (1976) Acta Paediatr. Scand., 65:279-87
【非特許文献１５】Hebebrand et al. (2003) Obes. Rev., 4:139-46
【非特許文献１６】Farooqi et al. (2005) Int. J. Obes. (Lond), 29:1149-52
【非特許文献１７】Bell et al. (2005) Nat. Rev. Genet., 6:221-34
【非特許文献１８】Schousboe et al. (2003) Twin Res., 6:409-21
【非特許文献１９】Herbert et al. (2006) Science 312:279-83
【非特許文献２０】Loos et al. (2007) Science 315:187
【非特許文献２１】Dina et al. (2007) Science 315:187
【非特許文献２２】Rosskopf et al. (2007) Science 315:187
【非特許文献２３】Lyon et al. (2007) PLoS Genet., 3:e61
【非特許文献２４】Hotta et al. (2008) J. Hum. Genet., 53:857-62
【非特許文献２５】FTO; Frayling et al. (2007) Science 316:889-94
【非特許文献２６】Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746
【非特許文献２７】Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361
【非特許文献２８】Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6
【非特許文献２９】Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115
【非特許文献３０】Loos et al. (2008) Nat. Genet., 40:768-75
【非特許文献３１】Thorleifsson et al. (2009) Nat. Genet., 41:18-24
【非特許文献３２】Willer et al. (2009) Nat. Genet., 41:25-34
【非特許文献３３】Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明によれば、患者における肥満症に関する増大したリスクを診断する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記方法は、患者由来の生体試料における少なくとも１つのコピー数バリエーションの存在を評価することを含む。１つの実施形態において、コピー数バリエーションは、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＤＮＡＪＣ１５からなる群より選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、コピー数バリエーションは、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＥＰＨＡ６からなる群より選択される遺伝子におけるものである。コピー数バリエーションは、欠失または重複であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図１Ｂ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図１Ｃ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図１Ｄ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図２】Ｂ−アレル頻度（ＢＡＦ）およびログＲ比（ＬＲＲ）に基づくＣＮＶ観察の例。ＣＮＶ数の分布は、各集団の個人ごとにコールした。ＬＲＲは規格化した強度であり、ＢＡＦは規格化したジェノタイプ・データである。ＢＡＦ値およびＬＲＲ値は、クラスター中心から各ＳＮＰに対する各試料の偏差に基づく。ＬＲＲは、予想される２倍体の強度信号を意味する０付近にある傾向がある。ＬＲＲが上昇する場合、より多くのＤＮＡは結合されて、重複があることを示す。反対に、ＬＲＲの減少した信号は、より少ない程度でしかＤＮＡが結合していないことを示し、欠失と一致する。前後して、ＢＡＦは３つの正常な２倍体モード０＝ＡＡ、０．５＝ＡＢおよび１＝ＢＢを有する。０．５値がＳＮＰの隣接する領域で観察されない場合、欠失があるおそれがある。０．５値が観察されず、０．３３値および０．６６値が観察される場合、重複はＡＡＢおよびＡＢＢジェノタイプを裏付け得る。ＲＯＨ：ホモ接合性のコピー数ニュートラルラン（copy number neutral run）。ホモ接合性はＢＡＦでは明らかであるが、ＬＲＲはゼロから実質的に乖離せず、結果的に、欠失コールではなく、むしろＲＯＨコールとなる。
【図３】ヒトゲノムのBuild ３６（２００６年３月）を供えたＵＣＳＣゲノム・ブラウザを用いて、欠失または重複により直接影響を受ける遺伝子座を示す。図３Ａ〜Ｃは、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５およびＦＯＸＰ２それぞれに直接影響を与える欠失を示す。図３Ｄ〜Ｆは、ＫＩＦ２Ｂ、ＤＮＡＪＣ１５とＡＲＬ１５それぞれに影響を与える重複を示す。
【図４】表示の遺伝子座でのＣＮＶｓの定量ＰＣＲ検証のグラフ。エラーバーは４重試行の標準偏差を示す。
【図５】ＰｅｎｎＣＮＶ（Illumina（登録商標）アレイに対して用いた５３２，８９８のＳＮＰｓ）からのＣＮＶコールの統計情報に関する分析フローダイアグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳しい説明）
米国の小児と成人における肥満症の有病率は、過去１０年で劇的に増加し、米国の成人集団の３０％が３０超のＢＭＩを有し、５％が４０超のＢＭＩを有する。成人肥満症の多くの遺伝的決定基が、ゲノムワイドな関連解析研究および小児期における症候性肥満症の研究を通じてすでに確立されている。通常の小児肥満症（regular childhood obesity）（ＢＭＩの≧９５パーセンタイル）に対して罹病性を与えるＣＮＶｓを包括的に同定しようとする試みにおいて、全ゲノムＣＮＶ検査を、５５０,０００のＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型をジェノタイプしたヨーロッパ系の１，０８０の小児肥満症の事例と２,５００の痩せの対照（ＢＭＩの＜５０パーセンタイル）に対して実施した。陽性所見が、アフリカ系の１，４７９の小児肥満症の事例および１，５７５の痩せの対照群で評価された。ヨーロッパ系アメリカ人の事例で独特であった３５のＣＮＶ遺伝子座が同定され、そのうち１５（４２．９％）がアフリカ系アメリカ人の事例でも独占的に再現された（７つの重複および８つの欠失）。少なくとも３のＥＡの事例で独特であった１７のＣＮＶ遺伝子座が同定され、その両方が既に公に報告されたものではなく、定量ＰＣＲを用いて確認された。それらの遺伝子座のうち８つ（４７．１％）もまたＡＡの事例で独占的に再現された（６つの欠失および２つの重複）。再現された欠失した遺伝子座は、ＥＤＩＬ３（EGF-like repeats- and discoidin I-like domains-containing protein 3）、Ｓ１ＰＲ５（endothelial differentiation, sphingolipid）、ＦＯＸＰ２（forkhead box P2）、ＴＢＣＡ（tubulin folding cofactor A）、ＡＢＣＢ５（ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 5）、およびＺＰＬＤ１（zona pellucida-like domain containing 1）を含んだが、一方で、再現された重複の遺伝子座では、ＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）、ＡＧＲ３（breast cancer membrane protein 11 precursor）、ＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）、およびＤＮＡＪＣ１５（DnaJ homolog, subfamily C, member 15）、特にＫＩＦ２ＢおよびＡＲＬ１５を含んだ。ＥＰＨＡ６−ＵＮＱ６１１４遺伝子座における欠失についての証拠も、ＡＡ集団をディスカバリー・セット（discovery set）として調査した場合に観察された。すべてのバリアントは、定量ＰＣＲを用いて実験的に検証された。これらのバリアントは、肥満症の病因の重要なメディエーターである神経機能に関係する遺伝子を標的とする。これらの結果は、ＣＮＶｓが複数の民族で肥満症に関する遺伝的罹病性に寄与することを示す。
【００１２】
定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００１３】
本明細書中で用いられる用語「肥満症」は被検体における過剰の体脂肪がある状態を一般に意味する。「肥満症」は、被検体が３０．０ｋｇ／ｍ２以上のボディーマスインデックス（ＢＭＩ；身長の平方メートルあたりの体重（ｋｇ／ｍ２））を有することによる状態を意味し得る。「肥満症の被検体」は、３０．０ｋｇ／ｍ２以上のボディーマスインデックス（ＢＭＩ）を有する被検体である。「体重超過の被検体」は２５．０ｋｇ／ｍ２超から３０．０ｋｇ／ｍ２までのＢＭＩを有する被検体である。
【００１４】
用語「コピー数」は、本明細書で用いられるように、試料のゲノムＤＮＡにおける特定領域のコピーの数を意味する。あるゲノム領域が「コピー数バリエーション」を有する場合、そのゲノム領域は、ゲノムのその他の平均コピー数のそれ（例えばヒトでは２コピー）と異なるコピー数を有する。
【００１５】
本明細書で用いられる「生体試料」は、被検体、好ましくはヒト被検体、例えば組織、組織標本、細胞試料、腫瘍サンプルおよび生体液（例えば血液、尿または羊水）から得られる生体物質試料を意味する。特定の実施例において、生体試料は血液である。
【００１６】
本明細書で用いられる「診断」は、被検体における疾患または障害を検出および同定することを意味する。本用語は、疾患または障害を有することが知られている患者において、該疾患または障害の状態（進行、退行、安定化、処置に対する応答など）を評価または判断することも包含し得る。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「予後」は、被検体の将来の健康（例えば予想される病的状態または死亡率、糖尿病に罹る可能性および心血管疾患のリスク）に関する疾患または障害の存在による影響に関する情報を提供すること（例えば、本発明の診断法で決定されるように）を意味する。換言すれば、用語「予後」は、疾患/障害から見込みのある経過および結果の予測、または疾患/障害からの回復の可能性を提供することを意味する。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「処置」は、疾患または障害に苦しむ患者に利益をもたらす処置、例えば、患者の状態（例えば１以上の症状）における改善、状態の進行における遅延などをもたらす種類の処置を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「プローブ」は、プローブに対して相補的な配列を有する核酸にアニーリングまたは特異的にハイブリダイズすることができる、純粋な制限酵素消化で天然に生じた又は人工的に生成されたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸、ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかを意味する。プローブは一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの正確な長さは、多くの因子、例えば温度、プローブの供給源および方法の使用に依存し得る。例えば、診断適用に関しては、目標配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは概して約１０−１００、約１０−５０、約１５−３０、約１５−２５、約２０−５０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より短いヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書中のプローブは、特定の目標核酸配列の異なるストランドに相補的となるように選択されてもよい。これは、プローブが所定の条件セット下で各々の標的ストランドと「特異的にハイブリダイズする」またはアニールすることができるように、十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プローブ配列は標的の正確な相補的配列を反映する必要はないが、反映していてもよい。例えば、プローブ配列の残りの部分が標的ストランドと相補的であれば、相補的でないヌクレオチド断片がそのプローブの５’または３’端に付着されてもよい。あるいは、プローブ配列が標的核酸配列と十分に相補的であり、標的核酸と特異的にアニールするのであれば、相補的でない塩基または長い配列がそのプローブ中に挿入されていてもよい。
【００２０】
本明細書中で用いられる用語「プライマー」は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの、一本鎖または二本鎖のいずれかの、生物系に由来するか、制限酵素消化により生成するか若しくは合成的に製造される、オリゴヌクレオチドであって、適当な環境に置いた場合に、テンプレート依存的な核酸合成の開始物質として機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。適当な核酸テンプレート、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適当な補因子および適当な温度やｐＨなどの条件にプライマーを置いた場合に、ポリメラーゼまたは同様の活性の作用によるヌクレオチドの付加によりその３’末端で伸長し、プライマー伸長産物を得ることができる。プライマーは、特定の条件およびアプリケーションの要求に応じて長さを変更することができる。例えば、診断適用では、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に約１０〜２５以上のヌクレオチド長である。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始するために、即ち、ポリメラーゼもしくは類似の酵素による合成の開始に使用する適当に並置されたプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な様式で所望のテンプレート鎖とアニールを可能とするために、該所望のテンプレートと十分に相補的でなければならない。プライマー配列が所望のテンプレートの正確な相補鎖である必要はない。例えば、相補的でないヌクレオチド配列が、それ以外は相補的なプライマーの５’端に付着されてよい。あるいは、そのオリゴヌクレオチドプライマー配列が所望のテンプレート鎖の配列と十分に相補的であり、伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を機能的に提供できる場合、相補的でない塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に挿入されていてもよい。
【００２１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は米国特許４，６８３，１９５、４，８００，１９５および４，９６５，１８８に記載され、それらの全開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００２２】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関し、用語「特異的にハイブリダイズする」は、当分野で一般に用いられる所定の条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列からなる２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の会合を意味する（場合により、「実質的に相補的」と称される）。特に、前記用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを意味し、一本鎖核酸の相補的でない配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除することを意味する。種々の相補性を有する一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適当な条件は、当該分野では周知である。
【００２３】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを実施するために要求されるストリンジェントな条件は、以下に記載される（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press):
Tm = 81.5 ℃ + 16.6Log [Na+] + 0.41(%G+C) - 0.63(％ホルムアミド) - 600/二本鎖の#bp
【００２４】
上記式の例証として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミド、ＧＣ含有率４２％および平均プローブサイズ２００塩基対を用いた場合、Ｔｍは５７℃である。二本鎖ＤＮＡのＴｍはホモロジーが１％低下するごとに１〜１．５℃ずつ低下する。このように、約７５％超の配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いることで観察され得る。
【００２５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄は、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、プローブのその標的とのアニーリング率を最大にするためには、そのハイブリダイゼーションを通常、算出されたそのハイブリッドのＴｍよりも２０〜２５℃低い温度条件および塩条件で行う。洗浄条件は、プローブの標的に対する同一性の程度について、可能な限りストリンジェントにすべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりも約１２ ２０℃以下となるよう選択される。本発明の核酸に関し、中程度のストリンジェントハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（denatured salmon sperm DNA）における４２℃でのハイブリダイゼーション、及び２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける５５℃での１５分間の洗浄と規定される。高ストリンジェントハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける６５℃での１５分間の洗浄と規定される。非常に高いストリンジェントハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける６５℃での１５分間の洗浄と規定される。
【００２６】
用語「単離された」は、それに天然に付随し得る他の化合物から十分に分離された化合物または複合体を意味し得る。「単離された」は、他の成分または物質を含む人工または合成混合物、或いは基本的な活性もしくは後のアッセイと干渉しない不純物および例えば不完全な精製のために存在し得る不純物の存在、又は安定化剤の添加を排除することを意味するものではない。
【００２７】
本明細書で用いられる「使用説明書類」は、本発明に係る方法を実施するための本発明に係る組成物の有用性を伝達するために用い得る刊行物、記録、図表またはその他のいずれかの表現媒体を含む。
【００２８】
語句「固体支持体」は、いずれかの固体表面を意味し、限定するものではないが、いずれかのチップ（例えば二酸化ケイ素ベースのガラスまたは金のチップ）、ガラススライド、メンブレン、プレート、ビーズ、固体粒子（例えばアガロース、セファロース、ポリスチレンまたは磁気ビーズ）、カラム（またはカラム材料）、試験管またはマイクロタイター皿を含む、固体表面を意味する。
【００２９】
本明細書中で用いられる用語「アレイ」は、ハイブリダイズ可能なアレイされる構成因子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）の整然とした配置を意味する。アレイされる構成因子は、少なくとも１つ以上の異なるアレイされる構成因子が固体支持体上に存在するよう配置される。特定の実施形態において、アレイされる構成因子はオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００３０】
「医薬上許容される」は、動物、より具体的にはヒトでの使用に関しての、連邦政府または州政府の監督機関による承認を指す、或いは米国薬局方または他の一般に承認された薬局方にリストされていることを指す。
【００３１】
「担体」は、例えば、本発明の活性物質が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、補助剤またはビヒクルを意味する。医薬上許容される担体は、水および油などの滅菌液、例えば石油、動物、植物もしくは合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などであってよい。水または水性塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、担体として、特に注射溶液として好ましくは用いられる。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)）および「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（Ed. Troy; Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD）に記載されている。
【００３２】
診断方法、キットおよびスクリーニング方法
本発明は、被検体（例えば、動物、ヒト）における肥満症に対する罹患率／リスクを診断および／または測定する方法を提供する。本方法は、関連する健康問題についての予後を提供することをさらに含み得る。被検体が肥満症のリスクがあると診断された場合、その被検体の食事は肥満症を回避／低減／処置するために変更することができる；その被検体は肥満症を予防／処置するための治療薬を投与され得る；および／またはその被検体は運動療法が提供され得る。
【００３３】
１つの実施形態において、本方法は、患者から得られた生体試料中の表３、４または７で提供される少なくとも１つの遺伝子座のゲノムコピー数を決定することを含む。他の実施形態において、本方法は、患者から得られた生体試料中のＥＰＨＡ６、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢおよびＲＰＡＰ３からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のコピー数を決定することを含む。
【００３４】
他の実施形態において、遺伝子は、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＮＸＰＨ１、ＧＰＲ９８、ＢＣ０４８９９７およびＡＫ０９１６２６からなる群より選択される。
【００３５】
さらなる他の実施形態において、遺伝子は、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１およびＡＲＬ１５からなる群より選択される。
【００３６】
よりさらなる他の実施形態において、遺伝子は、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＤＮＡＪＣ１５からなる群より選択される。さらなる他の実施形態において、遺伝子は、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２ＢおよびＡＲＬ１５からなる群より選択される。
【００３７】
特定の実施形態において、遺伝子がＥＰＨＡ６、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２およびＣＥＮＴＤ１からなる群より選択される場合、肥満症のコピー数バリエーション指標は欠失（deletion）である。
【００３８】
他の実施形態において、遺伝子がＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢおよびＲＰＡＰ３からなる群より選択される場合、肥満症のコピー数バリエーション指標は重複（duplication）である。
【００３９】
上記遺伝子のＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ番号およびＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する）は以下のとおりである：
ＥＤＩＬ３（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3）：GeneID: 10085
Ｓ１ＰＲ５sphingosine-1-phosphate receptor 5; also known as EDG8; 別名ＥＤＧ８）：GeneID: 53637
ＦＯＸＰ２（forkhead box P2）：GeneID: 93986
ＴＢＣＡ（tubulin folding cofactor A）：GeneID: 6902
ＡＢＣＢ５（ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 5）：GeneID: 340273
ＺＰＬＤ１（zona pellucida-like domain containing 1）：GeneID: 131368
ＤＥＲＡ（2-deoxyribose-5-phosphate aldolase homolog）：GeneID: 51071
ＰＮＬＩＰＲＰ１（pancreatic lipase-related protein 1）：GeneID: 5407
ＰＲＲ２０Ａ（proline rich 20A; 別名ＦＬＪ４０２９６）：GeneID: 122183
ＢＣ０１５４３２：GenBank Accession No. BC015432.1
ＣＤＳ２（CDP-diacylglycerol synthase (phosphatidate cytidylyltransferase) 2）：GeneID：8760
ＣＡＣＮＡ２Ｄ４（calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 4）：GeneID: 93589
ＬＲＴＭ２（leucine-rich repeats and transmembrane domains 2）：GeneID: 654429
ＣＥＮＴＤ１（centaurin, delta 1; 別名ＡＲＡＰ２）：GeneID: 116984
ＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）：GeneID: 84643
ＢＣ０７３９３５：GenBank受入番号BC073935.1
ＣＲ６１１６５３：GenBank受入番号CR611653.1
ＢＲＤＴ（bromodomain, testis-specific）：GeneID: 676
ＤＮＡＪＣ１５（DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 15）：GeneID: 29103
ＡＧＲ３（anterior gradient homolog 3）：GeneID: 155465
ＤＦＮＢ３１（deafness, autosomal recessive 31）：GeneID: 25861
ＣＯＬ２７Ａ１（collagen, type XXVII, alpha 1）：GeneID: 85301
ＡＫＮＡ（AT-hook transcription factor）：GeneID: 80709
ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１（ATPase, H+ transporting, lysosomal 13kDa, V1 subunit G1）：GeneID: 9550
ＯＲＭ１（orosomucoid１）：GeneID: 5004
ＯＲＭ２（orosomucoid2）：GeneID: 5005
Ｃ９ｏｒｆ９１（chromosome 9 open reading frame 91）：GeneID: 203197
ＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）：GeneID: 54622
ＢＣＭＯ１（beta-carotene 15,15'-monooxygenase 1; 別名BCDO）：GeneID: 53630
ＰＫＤ１Ｌ２（polycystic kidney disease 1-like 2）：GeneID: 114780
ＭＩＣＢ（MHC class I polypeptide-related sequence B）：GeneID: 4277
ＣＯＭＴ（catechol-O-methyltransferase）：GeneID: 1312
ＳＬＣＯ１Ａ２（solute carrier organic anion transporter family, member 1A2): GeneID: 6579
ＮＸＰＨ１（neurexophilin 1）：GeneID: 30010
ＥＧＦＬ１１（EGF-like-domain, multiple 11; 別名EYS）：GeneID: 346007
ＮＡＡＬＡＤＬ２（N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2）：GeneID: 254827
ＧＰＲ９８（G protein-coupled receptor 98; 別名KIAA0686）：GeneID: 84059
ＰＣＤＨ２０（protocadherin 20）：GeneID: 64881
ＢＣ０４８９９７：GenBank受入番号BC048997.1
ＡＫ０９１６２６：GenBank受入番号AK091626.1
ＡＰＯＢ（apolipoprotein B）：GeneID: 338
ＲＰＡＰ３（RNA polymerase II associated protein 3）：GeneID: 79657
ＥＰＨＡ６（ephrin receptor A6; UNQ6114; MIM 600066）：Gene ID: 285220
【００４０】
コピー数バリエーションは、当分野で公知のいずれかの方法によって検出できる。例えば、コピー数バリエーションは、ＰＣＲ（例えばｑＰＣＲ）、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションおよびバーチャル染色体分析により検出することができる。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの遺伝子と特異的にハイブリッド形成するプローブおよびプライマーも本発明に包含される。プローブおよびプライマーは、遺伝子のコピー数を測定するのに用いることができる。プローブは、固体支持体に固定化されてもよい。実際、本発明に係る遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも６つ、またはその全てに対する少なくとも１つのプローブを含むアレイも本発明に包含される。特定の実施形態において、アレイは、上記のグループの各遺伝子に対する少なくとも１つのプローブを含む。
【００４２】
本発明のプローブ、プライマーおよび／またはアレイは、キットに組み込まれてもよい。キットは、使用説明書類、バッファおよび／または容器を更に含んでもよい。
【００４３】
上記に加えて、本発明は、肥満症の処置、阻害および／または予防のための治療薬のスクリーニング（例えば、ハイスループットスクリーニング）方法を含む。本明細書中で特定されるＣＮＶｓが肥満症の病因と関係したため、遺伝子およびそれらのコード産物の活性を調節する（例えば、正常レベルに戻す）薬剤を特定する方法は、この状態の処置に有効な治療薬（例えば核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなど）、タンパク質、ポリペプチド、リガンド、抗体、小分子など）の創生を結果的にもたらし得る。特定の実施形態において、試験される薬剤は、合理的な薬物設計によって開発された。例えば、遺伝子の欠失および遺伝子および／または遺伝子産物（例えば上記ＧｅｎｅＩＤリファレンスで示されるもの）の活性における付随する消失があるＣＮＶｓに関しては、活性レベル（例えば、野生型のレベルに）を上昇させる治療薬が望ましいであろう。加えて、遺伝子が重複されている、及び当該遺伝子および／または遺伝子産物の活性における付随する増加があるＣＮＶｓに関しては、活性レベル（例えば、野生型レベルに）を低下させる治療薬が望ましいであろう。
【００４４】
特定の実施形態において、スクリーニング方法は、本発明の少なくとも１つのＣＮＶを含む細胞を化合物と接触させること、及び該ＣＮＶにより影響を受ける遺伝子および／または遺伝子産物の活性が調節されるかどうか（例えば、野生型に近くづくか）を評価し、それによって治療薬を特定することを含む。特定の実施形態において、細胞は被検体から得られる。さらに他の実施形態において、ＣＮＶｓを試験管内で細胞において生じさせる。細胞内で遺伝子または遺伝子座のＣＮを調節する方法は、当分野で周知である。さらなる他の実施形態において、スクリーニング方法は、本発明の少なくとも１つのＣＮＶを含む動物（例えばトランスジェニック動物（例えばマウス））にて実施することができる。
【００４５】
細胞性代謝における本明細書に記載のＣＮＶｓによる役割の説明は、肥満症の処置および診断に有用な医薬組成物の開発を容易にする。これらの組成物は、上記の物質のうちの１つに加え、医薬上許容されるキャリア（例えば、当業者に周知の賦形剤、キャリア、バッファ、スタビライザまたは他の材料）を含んでいてもよい。そのような材料は、無毒であり、かつ活性成分の有効性に干渉しないものでなければならない。個人に与えられる本発明のポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子または他の医薬的に有用な化合物であるかどうかに関係なく、投与は、望ましくは「予防上の有効量」または「治療上の有効量」（場合によっては、予防は治療と考えられてもよい）で、これが個人に有益性を示すのに十分な量である。
【００４６】
さらなる他の実施形態において、本発明は、薬理ゲノミクスを包含する。より詳しくは、本発明は、治療薬の効能を予測するため、又は処置に最も有効な治療薬を選択するために被検体をスクリーニングする方法を包含する。特定の実施形態において、患者から生体試料を得ること、及び本発明の少なくとも１つのＣＮＶの有無を決定することを含む。次いで、ＣＮＶを有する被検体への治療薬の投与が有効であり、許容できない副作用がないことが実際に示される場合に、検体は該治療薬が投与される。
【００４７】
以下の実施例は、本発明を実施する方法を例示するものであり、本発明の範囲がいかようにも限定されることを意図するものではない。
【００４８】
実施例
方法
試験被験者
すべての被験者は、フィラデルフィア州の子供病院（Children’s Hospital）にて、グレーター・フィラデルフィア地域から２００６年から２００９年まで連続的に募集された。本研究は、ＣＮＶｓに関して厳格に確立されたデータ品質閾値に適合する１，０８０人の白色人種の肥満症児（ＢＭＩ≧９５パーセンタイル）、２，５００人の白色人種の痩せ対照（ＢＭＩ＜５０パーセンタイル）、１，４７９人のＡＡの肥満症児および１，５７５人のＡＡの痩せ対照から構成された。これらの参加者は全員、血液を６ｍｌのＥＤＴＡ血液採取管に採取され、次いでジェノタイピングのためにＤＮＡ抽出された。ＢＭＩ≧９５パーセンタイルは、疾病管理センター（Center for Disease control：ＣＤＣ）ｚ−スコア＝１．６４５（www.cdc.gov/nchs/about/major/nhanes/growthcharts/datafiles.htm）を用いて定義した。被験者は全員、生物学的に無関係であり（利用可能なＳＮＰデータ（ペアワイズＩＤＢを０．２５以上の相関性を示す個人を除去するのに用いた）に基づき）、２〜１８歳の年齢であった（表１）。被験者は全員、ＣＤＣ補正したＢＭＩの−３〜＋３の標準偏差の間にあった（すなわち、異常値を、潜在的な測定誤差の結果または極度の肥満症のメンデル原因を避けるために除外した；従って、後者のカテゴリーは、ＣＮＶディスカバリーに関して既報のカテゴリーに入る個人を特異的に除外した（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70; Walters et al. (2010) Nature 463:671-5））。自己申告の民族性は、多次元スケーリング法によって確認した。全体的な系統は、ヨーロッパおよびアフリカの人々における特異な集団の民族系統を保証するためにＥｉｇｅｎｓｔｒａｔを用いて決定された。本研究は、フィラデルフィア州の子供病院の施設内倫理委員会により承認された。親のインフォームドコンセントは、血液採取および以降のジェノタイピングの両方に関する各試験の参加者について行った。
【表１】
表１：研究した集団における性および年齢の分布
【００４９】
ＣＮＶディスカバリーについてのイルミナ（Illumina（登録商標））Infiniumアッセイ
ハイスループット・ゲノムワイドＳＮＰジェノタイピングは、フィラデルフィア州の子供病院のCenter for Applied Genomicsにおいて、Infinium（商標）II HumanHap550 BeadChip テクノロジー（Illumina（登録商標）; San Diego, CA)を用いて実施された。ジェノタイピングアレイにより提供される強度データと共に、ジェノタイプデータの内容は、ＣＮＶコールについて高い信頼性を与える。重要なことに、同じ実験設定での強度データおよびジェノタイプデータの同時分析は、正常な２倍体状態およびその何らかの逸脱に関する高い精度の同定を確立する。ＣＮＶｓをコールするために、複数の情報源、例えば各ＳＮＰマーカーにおける対数Ｒ比（Log R Ratio：ＬＲＲ）およびＢアレル頻度（B Allele Frequency：ＢＡＦ）を、ＳＮＰ間隔（SNP spacing）、trained hidden MarkovモデルおよびＢアレルの集団内頻度と共に含むＰｅｎｎＣＮＶアルゴリズム（www.openbioinformatics.org/penncnv/）を用い、CNVコールを生成した。各試料は、事例の状況を伏せられてＣＮＶｓがコールされた。陽性の結果を、類似サイズのアフリカ系統の独立した再現集団で評価した。ＣＮＶフィルターリングおよび試験工程のフロー図を図５に提供する。
【００５０】
ＣＮＶ品質管理
品質管理（ＱＣ）単位（measure）は、低品質のＤＮＡ試料および偽陽性ＣＮＶｓを除外するための統計分布に基づくＨｕｍａｎＨａｐ５５０ＧＷＡＳデータで算出した。第１閾値は、首尾よくジェノタイプされた計画されたＳＮＰｓパーセンテージである。コール率＞９８％の試料だけを含めた。ゲノム全体の強度シグナルは、可能な限りノイズを持たないものでなければならない。規格化した強度（ＬＲＲ）の標準偏差（ＳＤ）＜０．３０を有する検体だけを含めた。すべての試料は、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）のスコアリングに基づく明らかな白系（Caucasian）またはアフリカ系の民族性を有していなければならず、その他の試料は全て除外した。低品質の全長ＤＮＡに関するハイブリダイゼーション・バイアスの結果として生じるＧＣ含有量と概して相関する波長のアーティファクトが、コピー数バリエーションの正確な推定に干渉することが知られている（Diskin et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36:e126）。波長のモデルに対してＬＲＲのＧＣ波長の要因が−０．１＜Ｘ＜０．１の間の範囲にある試料だけを受け入れた。ＰｅｎｎＣＮＶによるＣＮＶコールのカウントが１００を上回る場合（図１）、そのＤＮＡの品質は通常劣っている。かくして、ＣＮＶコールカウント＜１００を有する試料だけを含めた。何らかの重複試料（例えば、１卵双胎）は一方の試料を除外した。
【００５１】
ＣＮＶｓの統計分析
事例と対照との間のＣＮＶ頻度は、フィッシャーの正確確率検定を用いて各ＳＮＰを評価した。事例と対照との間で有意であった（ｐ＜０．０５）遺伝子座であって、ヨーロッパ系アメリカ人の場合、ディスカバリー集団（discovery cohort）では同じバリエーションを有し、アフリカ系アメリカ人で再現され、いずれの対照被験者でも発見されず、独立した方法によっても検証された遺伝子座だけを考慮した。統計学的極小が、互いに１Ｍｂ以内に存在するＳＮＰｓを含む名目上有意な領域に関して関連を狭くすることが報告されている。結果として生じる有意なＣＮＶＲｓが以下の基準のいずれかを満たす場合、それらを除外した：ｉ）テロメアまたはセントロメア近傍のサイトバンド（cytoband）に存在する；ｉｉ）ＣＮＶコールの境界端（boundary truncation）における変動により生じる共通のＣＮＶの「島（peninsula）」に生じている；ｉｉｉ）ゲノム領域がハイブリダイゼーション・バイアスをもたらす過度のＧＣ含有量を有する；またはｉｖ）試料が多重ＣＮＶＲｓに寄与する。ＤＡＶＩＤ（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）（Dennis et al. (2003) Genome Biol., 4:P3; Huang da et al. (2007) Genome Biol., 8:R183）を用いて、独立して関連づけられたＣＮＶ結果のＩｎｔｅｒＰｒｏカテゴリーへの機能的アノテーション・クラスタリングの有意性を評価した（上位の結果がＵｎｉＰｒｏｔカテゴリーである：ビジョン（Vision） Ｐ＝０．００６９（CACNA2D4、GPR98、DFNB31））。実施した試験数を調整するために、１６の欠失および１９の重複ＣＮＶＲｓの補正を、ヨーロッパ系アメリカ人集団の有意性に基づいて行った。
【００５２】
ＣＮＶフィルターリング工程
多重ＣＮＶフィルターリング工程を分析の一部として実施した。第１に、Ｉｌｌｕｍｉｎａアレイ上の５３２，８９８のＳＮＰｓのうち、ヨーロッパ系アメリカ人のディスカバリー集団における少なくとも３つ以上の無関係な事例で８，６７２（１．６２７％）が欠失を示し、そして６，７６３（１．２６９％）が重複を示した点は注目すべき重要なことである（頻度≧０．２７８％）。３つの事例の閾値を選択する。なぜならば、所定の領域でのコールに関する再現性を与えるための最小の事例頻度のためである。この事前の除外は、ＧＷＡ ＳＮＰジェノタイプ研究における１％のマイナー・アレル頻度（Minor Allele Frequency）に関する内包の閾値（inclusion threshold）と非常に類似している。これで、ゲノムワイド試験について補正するために実施される試験の数が劇的に減る。
【００５３】
第２に、すべてのＳＮＶｓを事例と対照の両方で同時にコールし、マルチスクリプトで規定されたようにＣＮＶＲｓに分類した。合計２７２の欠失および１７４の重複ＣＮＶＲｓが確認された。第３に、新規ＣＮＶｓを調査するために、白色人種の対照集団で観察された全てのＣＮＶＲｓを除去して事例における独占性を確立し、そして生データ（ＢＡＦおよびＬＲＲ）を、方法の項で記載したように正確なＣＮＶコーリングおよび統計学的な有意性のために慎重に批評した。これで、１２の欠失および１９の重複のＣＮＶＲｓが残った。
【００５４】
従って、このデータセットは、新規な肥満ＣＮＶｓについて試験するために用いたディスカバリー集団からのＣＮＶＲｓを規定する。次いで、これらのＣＮＶＲｓの再現を独立したアフリカ系アメリカ人の事例−対照データセットで試験した。６つの欠失および７つの重複ＣＮＶＲｓが再現基準に対して残り（アフリカ系アメリカ人の事例で観察され、アフリカ系アメリカ人対照セットでは無かった）、次いで、少なくとも１つの独立した方法（ＱＰＣＲおよびＦＩＳＨ）により実験的に検証した。これらの結果を表３に示す。
【００５５】
多数の理由で、例えば、提供されるＤＮＡにおける変動性、アレイタイプ、ＤＮＡ処理、データ処理、品質管理、ＣＮＶコーリング・アルゴリズム、ゲノム特徴、ゲノムの範囲および領域の統計学的提示に関するいずれかのプラットフォームによって、ＣＮＶコーリングが明確に達成されないことは注目すべき重要なことである。これが、交絡する寄与度をそれぞれ規格化および調節するための多大な努力にもかかわらず、最初の検査での高い擬陽性率をもたらし得る。
【００５６】
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によるＣＮＶ検証
ユニバーサル・プローブ・ライブラリー（UPL; Roche, Indianapolis, IN）のプローブを、ProbeFinder v2.41 Software（Roche, Indianapolis, IN）を用いて選択した。定量ＰＣＲを、ABI 7500 Real Time PCR InstrumentまたはABI Prism（商標）7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA）にて実施した。各試料を、２５μｌの反応混合液（２５０ｎＭのプローブ、９００ｎＭの各プライマー、ロシュ（Roche）のFast Start TaqMan Probe Master、および１０ｎｇのゲノムＤＮＡ）または１０μｌの反応混合液（１００ｎＭのプローブ、２００ｎＭの各プライマー、インビトロジェン（Invitrogen）のＲＯＸを含む１×Platinum Quantitative PCR SuperMix-Uracil-DNA-Glycosylase（ＵＤＧ）および２５ｎｇのゲノムＤＮＡ）のいずれかで４重に分析した。その値を、Sequence Detection Software v2.2.1（Applied Biosystems, CA）を用いて評価した。データ分析は、ΔΔＣＴ法を用いて更に実施した。ＣＯＢＬ（MIM 610317）、ＧＵＳＢ（MIM 611499）、およびＳＮＣＡ（MIM 163890）から選択したリファレンス遺伝子を、最小の変動係数に基づいて含め、次いで、データを正常対照の値を１に設定することによって規格化した。これらの稀なＣＮＶｓは、アレイに存在する単一の共通ＳＮＰによっても効果的にタグ付けされることはなかった。
【００５７】
【表２−１】
【００５８】
【表２−２】
【００５９】
表２：マーカー間の連鎖不平衡レベルを反映する、ＣＮＶｓに対する最良のＳＮＰジェノタイプ代替物および各々のｒ２値。ＳＮＰｓ＞１％の一般的性質およびＣＮＶｓ＜１％の稀な性質のために、ＣＮＶｓに関する代替ＳＮＰジェノタイプを同定することは挑戦的なことである。ＣＮＶの１Ｍｂ内でジェノタイプされたＳＮＰｓのｒ２値はほとんどゼロに近かった。
【００６０】
結果
本研究は、厳格に確立されたＣＮＶｓに関するデータ品質閾値に適合する１，０８０人の白色人種の肥満症児（ＢＭＩ≧９５パーセンタイル）、２，５００人の白色人種の痩せ対照（ＢＭＩ＜５０パーセンタイル）、１，４７９人のＡＡ肥満症児および１，５７５人のＡＡ痩せ対照（２−１８歳）から構成された。しかしながら、被験者はすべて、潜在的な測定誤差の結果または極端な肥満のメンデル原因となり得る異常値を排除するために、ＣＤＣ補正したＢＭＩ標準偏差が−３〜＋３の間になければならない。実際、後者のカテゴリーは、ＣＮＶディスカバリーに関して既報のカテゴリーに入る個人を特異的に除去する。
【００６１】
PennCNVソフトウェア（Wang et al. (2007) Genome Res., 17:1665-74）を用いて、ヨーロッパ系アメリカ人（ＥＡ）事例および対照それぞれにおいて、個人につき平均２２．０および１９．５ＣＮＶコールを行い、９３％の被験者が８−４５ＣＮＶコールを有した（図３）。４つの異なるコピー数状態をＥＡの事例／対照集団についてコールし、９１９／２，１０９ホモ接合性欠失（コピー数またはＣＮ＝０）、１３，６７８／２８，９１７ヘミ接合性欠失（ＣＮ＝１）、６，７６７／１６，６８９の１コピー重複（ＣＮ＝３）および３４４／１，１３９の２コピー重複（ＣＮ＝４）を含んだ。図２は、BeadStudioソフトウェアで概観される生のイルミナ・データの例および結果的に得られるＣＮＶコールを示す。ＣＮＶコールは３〜７９０３ＳＮＰｓに及び、ＣＮＶコールあたり平均１９ＳＮＰｓを有し、および、そのサイズは５０ｂｐ〜３３Ｍｂの範囲であり、平均８１ｋｂサイズであった。
【００６２】
９３％のアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）被験者も、８−４５のＣＮＶコールを有していた（図１）。個人あたり平均２４．１および２５．１のＣＮＶコールが、ＡＡ事例および対照でそれぞれなされた。それらの中で、８９７／１，０２６ＣＮ＝０、２５，６５０／２８，７９３ＣＮ＝１、８，７７８／１０，２５１ＣＮ＝３および４１８／５３５ＣＮ＝４が確認された。ＣＮＶは３〜７９０３のＳＮＰに及び、ＣＮＶコールあたり平均１５のＳＮＰｓを有し、および、それらのサイズは５０ｂｐ〜３３Ｍｂの範囲にあり、６７ｋｂの平均サイズであった。
【００６３】
ＥＡ被験者において潜在的に無症候性小児肥満症に寄与する新規ゲノム座を同定するために、対照と比較される事例に、より頻繁なコピー数変化を有する連続的なＳＮＰｓについてゲノムをスキャンするセグメントベースのスコアリングアプローチを適用した。これらの連続的なＳＮＰｓのためのゲノムスパンが、一般のコピー数バリエーション領域またはＣＮＶＲｓを定める。
【００６４】
局所系統（Local ancestry）を平均３００のＳＮＰジェノタイプを含む各ＣＮＶ遺伝子座を囲む１ＭＢの領域を用いて評価し、結果として、有意に逸脱した個人を含まないよくクラスター形成された集団となった。統計学的極小が、互いに１Ｍｂ以内に存在するＳＮＰｓを含む名目上有意な領域に関して関連を狭くすることが報告されている。結果として生じる有意なＣＮＶＲｓが以下の基準のいずれかを満たす場合、それらを除外した：ｉ）テロメアまたはセントロメア近傍のサイトバンドに存在する；ｉｉ）ＣＮＶコールの境界端における変動により生じる共通のＣＮＶの「島」に生じている；ｉｉｉ）ゲノム領域がハイブリダイゼーション・バイアスをもたらす過度のＧＣ含有量を有する；またはｉｖ）試料が多重ＣＮＶＲｓに寄与する。
【００６５】
少なくとも３つのＥＡの事例に独占的に存在した３４の推定ＣＮＶＲ遺伝子座（１５の欠失および１９の重複）が同定された（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、欠失のうちの３つは、ＣＮＶｓの独立した検証に一般的に用いられる方法である定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた検証過程の間に偽陽性であることが判明した（図３および図４）。実験的検証はすべて、いずれのバイアスも最小に抑えるために盲検様式で独立した研究グループにより実施された。これは別のレベルの信用を実験の検証結果に加えるものである。ＣＮＶ再発（recurrence）に関連した問題、精度、遺伝子座依存（locus dependence）およびＧＣ含有量に関連する困難は、ｑＰＣＲを４重に実施し、試行にまたがる低い標準偏差を観察し、同一ゲノム領域に関する対照試料をアッセイし、そして異なるゲノム領域で同じ試料をアッセイすることにより緩和した。
【００６６】
【表３−１】
【００６７】
【表３−２】
【００６８】
表３：ヨーロッパ系アメリカ人における及びアフリカ系アメリカ人での再現試行における小児肥満症に独占的なＳＮＰレベルでのＣＮＶｓ（ｑＰＣＲ検証されたが公に存在するかについては選別されていない）。アフリカ系アメリカ人の事例で独占的に再現されたＣＮＶｓを太字で強調する。配置（co-ordinate）はUCSC Build hg 18から得た。「近接遺伝子からのＢＰ（BP from nearest gene）」カラムは、ＣＮＶが列挙された遺伝子を包含する場合はゼロを、又はＣＮＶが列挙された遺伝子の近傍にある場合は値を記入する。個々のＣＮＶコールはＳＮＰベースの統計値として割り当てられる。従って、事例がゼロでない値および対照がゼロ値を示す隣接ＳＮＰｓは、列挙されたＣＮＶＲｓであるＣＮＶ領域を形成する。試験したＳＮＰは、再現において正確なオーバーラップを確実にするためにＣＮＶＲ領域の中央のＳＮＰである。
【００６９】
再現試行で、３１の検証されたＣＮＶＲ遺伝子座のうち１３（４１．９％）が、１以上のＡＡの事例に独占的に存在することも明らかとなった（６つの欠失および７つの重複）（表３）。ＣＮＶＲ遺伝子座のうち１７のみが、この集団に特有であり（即ち、Genomic VariantsのDatabaseにより対照において報告されていない）、そのうち８つ（４７．１％）がＡＡの事例で独占的に再現された（６つの欠失および２つの重複）（表４）。再現の目的に関して異なる人種群の使用は、同じ民族で類似の試行を行うことよりも高い障壁を意味する。例えば、２型糖尿病と関連したＴＣＦ７Ｌ２（MIM 602228）における共通のバリアントが、アフリカ人でのその疾患とも類似の程度で関連した場合（Helgason et al. (2007) Nat. Genet., 39:218-225）、それは、この疾患における役割を有するものとして、より確定されるものと考えられた；加えて、最近の喘息ＧＷＡＳ研究結果がアフリカ系アメリカ人でも観察され、それは、我々にこの観察のより高いレベルでの確実性をもたらした（Sleiman et al. (2010) New Eng. J. Med., 362:36-44）。多くのバリアントが異なる人種集団で異なる頻度を有することが示されたため、それぞれ同じ表現型のＥＡとＡＡ集団において独占的なものと同じＣＮＶの観察は、集団の階層化（population stratification）の影響を交絡させる可能性を最小限に抑える。図３は、ヒトゲノムのUCSC Genome Browser with Build hg18（March 2006; genome.ucsc.edu/ cgi-bin/hgGateway）を用いた欠失または重複により最も頻繁に影響を受ける代表的な遺伝子座を可視化する。鍵となるＣＮＶｓのいずれかが、データを利用できた家族の肥満症と一緒に分離されたかどうかも評価し、少なくとも４つのＣＮＶｓが肥満症の親から遺伝的に受け継がれ、そして少なくとも４つがデノボであったことを立証できた（表５）。
【００７０】
【表４−１】
【００７１】
【表４−２】
【００７２】
表４：ヨーロッパ系アメリカ集団およびアフリカ系アメリカ人での再現試行における小児肥満症に独占的なＳＮＰレベルでのＣＮＶｓ（公に存在するか及びｑＰＣＲ検証もしていない）。アフリカ系アメリカ人の事例で独占的に再現されたＣＮＶｓを太字で強調した。配置はUCSC Build hg18から得た。「近接遺伝子からのＢＰ」カラムは、ＣＮＶが列挙された遺伝子を包含する場合はゼロを、又はＣＮＶが列挙された遺伝子の近傍にある場合は値を記入する。これらの遺伝子座は、寄与試料にわたって、欠失遺伝子座についてはＣＮ＝１および再現遺伝子座についてはＣＮ＝３を示した。その他の状態、例えばＣＮ＝０又はＣＮ＝４はこれらの遺伝子座では観察されなかった。個々のＣＮＶコールはＳＮＰベースの統計値として割り当てられる。従って、事例がゼロでない値および対照がゼロ値を示す隣接ＳＮＰｓは、列挙されたＣＮＶＲｓであるＣＮＶの領域を形成する。試験したＳＮＰは、再現における正確なオーバーラップを確実にするためにＣＮＶＲ領域の中央のＳＮＰである。
【００７３】
【表５】
表５：利用可能な家族データに基づき観察されたＣＮＶｓの遺伝的形質。
【００７４】
これらの知見の有意性をさらに確立するために、分布の他のテイル（tail）（すなわち対照の中の独占的なＣＮＶＲｓ）を調べた。最初に、３人の肥満症被験者に対する独占性がＥＡの事例の中で名目上有意な観察を構成したのに対し、本研究での豊富な対照のために、１０人のＥＡ対照が同じ有意な閾値に到達するために要求された。このように分析され、独占的な欠失は観察されなかった、そして、ＥＡ対照における独占的な重複が４つだけ観察された。しかしながら、これらの重複のいずれも、ＡＡ対照では独占的に再現されなかった。このように、これらの対照観察と対照的に、多量の独占的なＣＮＶＲｓにわたる高い有意性が、ＥＡ事例で見られ、ＡＡの事例でも独占的に再現することは、偽陽性ディスカバリー率が１２％より低いことを明らかにした。
【００７５】
既報の＜１％の個人に＞５００ｋｂのサイズで存在する大型の稀な欠失（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-670）を評価したが、ゲノムワイドの過度の大型の稀な欠失は観察されなかった（表６）。これは、以前の報告が重篤な早期発症肥満症が単独で評価された場合でなく発育遅延の被験者を含む場合の有意性を見出しただけであったと想定すれば、予想外のことではない。
【００７６】
【表６】
表６：ゲノムワイドな大型の稀なＣＮＶ負荷（load）の比較
【００７７】
両方の民族からの事例で独占的な欠失を保有する遺伝子座は、直接的に影響を与えた４つの遺伝子、すなわちＳ１ＰＲ５（endothelial differentiation, sphingolipid；MIM605146）、ＦＯＸＰ２（forkhead box P2；MIM 605317）、ＴＢＣＡ（tubulin-specific chaperone a；MIM 610058）およびＡＢＣＢ５（ATP-binding cassette, sub-family B, member 5；MIM 611785）から成る一方で、２つの欠失がＥＤＩＬ３（EGF-like repeats- and discoidin I-like domains-containing protein 3；MIM 606018）およびＺＰＬＤ１（zona pellucida-like domain containing 1）にそれぞれ近接していた。
【００７８】
両方の民族からの事例で独占的な重複を保有する遺伝子座は、直接的に影響を与えた４つの遺伝子、すなわちＢＣ０７３９３５−ＣＲ６１１６５３、ＤＮＡＪＣ１５（DnaJ homolog, subfamily C, member 15）、ＡＧＲ３（breast cancer membrane protein 11 precursor）およびＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）に加えて、９ｑ３２の遺伝子クラスターから成った。加えて、２つの重複は、ＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）およびＢＲＤＴ（testis-specific bromodomain protein）に近接していた。
【００７９】
グローバルとローカルの両方の対号ＩＢＤは、ＥＤＩＬ３欠失を有する５つの事例の間でゼロに近い低い値を示した；事例間を分ける正確なＣＮＶの分断点は分析の必要なパラメータではなかったが、それは特異的なコピー数多形性が観察されたことを示すものである。両方の民族性からの事例で独占的な重複を保有する２つの遺伝子座は、直接的に影響を与えた１つの遺伝子、即ち、ＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）およびＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）に近接したものから成った。
【００８０】
本研究で明らかにされた遺伝子座に保有する遺伝子の大多数が、これまでは肥満症には関わっていないものとされていた。しかしながら、最も顕著な発見はＡＲＬ１５であり、それは、冠状動脈性心疾患および２型糖尿病のより高いリスクとも関係している同じリスクのアレルで、アディポネクチン・レベルのＧＷＡ研究において最近明らかにされた（Richards et al. (2009) PLoS Genet., 5:e1000768）。
【００８１】
加えて、ヒトＦｏｒｋｈｅａｄ−ｂｏｘ（ＦＯＸ）遺伝子ファミリのメンバーが代謝の形質に強く関係しているとされたが（Katoh et al. (2004) Int. J. Oncol., 25:1495-500）、ＦＯＸＰ２における突然変異がヒトでの発育上の発話障害と言語障害を引き起こすことで最も有名である（Vernes et al. (2008) N. Engl. J. Med., 359:2337-45）。自閉症がＥＡ事例の１つで記録され、ＡＤＨＤがＡＡ事例の１つ（報告された合併症とで再現された遺伝子座のうちの唯一のもの）で記録されたが、ＦＯＸＰ２のＣＮＶｓにより影響を受ける小児には典型的な症候群の所見がなかった。ヒトの言語および発話の成長と小児肥満症との関わりは明白ではないが、発話に関する問題が、社会的孤立の大きな可能性をもたらし、こうして低い活動性をもたらすという仮説を立てることができそうである。実際、この仮説は、はっきりした発話特徴および言語特徴が一般に病的肥満症を呈するプラダーウィリ症候群を有する小児にあるという事実によって裏づけられる（Akefeldt et al. (1997) J. Intellect Disabil. Res., 41:302-11; Kleppe et al. (1990) J. Speech Hear. Disord., 55:300-9）。
【００８２】
ＥＡ集団をディスカバリーに用いた。なぜならば、このディスカバリー設定で独占的で最も包括的に観察及び確立をするために、利用可能な対照群がこの民族で非常に多かったためである。しかしながら、更なる独占的な遺伝子座の可能性を探索するために、ＡＡ集団もディスカバリー集団として分析し、ＥＡ集団における再現を試みた（表7）。5つのＡＡ事例に対する独占性が、この集団のより少ない痩せの対照のために、この設定でのディスカバリー段階で名目上の有意性を達成することが必要とされたが、ＡＡ事例で独占的であったＥＰＨＡ６−ＵＮＱ６１１４遺伝子座（MIM 600066；例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ 600066）での欠失に関する証拠が観察された。
【００８３】
【表７】
【００８４】
表７：ディスカバリー集団としてのアフリカ系アメリカ集団および再現としてのヨーロッパ系アメリカ人。ヨーロッパ系アメリカ人の事例で独占的に再現されたＣＮＶｓを太字で強調した。アフリカ系アメリカ人集団で独占的な最低５つのＣＮＶｓが、ディスカバリーにおける名目上の有意性（Ｐ＜０．０５）に到達するために必要とされたことに留意すべきである。主として、集団における痩せのヨーロッパ系アメリカ人に対して痩せのアフリカ系アメリカ人のメンバーが少ないためである。
【００８５】
【表８−１】
【００８６】
【表８−２】
表８：頻度閾値に対するディスカバリーの有意性の正当化（justification）。
【００８７】
現在まで、成人での設定における遺伝子座を明らかにするだけの研究では、小児肥満症のＧＷＡ研究に関する不足は顕著であり（Frayling et al. (2007) Science 316:889-94; Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746; Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361; Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6; Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115; Loos et al. (2008) Nat. Genet., 40:768-75; Thorleifsson et al. (2009) Nat. Genet., 41:18-24; Willer et al. (2009) Nat. Genet., 41:25-34）、現在まで、症候性形態（syndromic form）とは対照的に非症候性形質（non-syndromic trait）と有意に関係するＣＮＶｓを報告した研究はなかった（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70; Walters et al. (2010) Nature 463:671-5）。このように、本研究は、小児肥満におけるＣＮＶｓの最初の大規模な不偏のゲノムワイド・スキャンを意味する。本研究で明らかにさらた遺伝子座は、小児肥満症で初めて独占的に観察され、異なる民族性から独立したケースコントロール・データセットで再現される。この結果は、定評のあるＦＴＯ（Frayling et al. (2007) Science 316:889-94; Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746; Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361; Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6; Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115）としての追加の信憑性を与えるものであり、遺伝子座はＥＡ集団においてＢＭＩと肥満症の両方と非常に強い関連性がある（Grant et al. (2008) PLoS One, 3:e1746; Zhao et al. (2009) ２型糖尿病ＧＷＡＳ遺伝子座に関する調査は、小児のＢＭＩ．糖尿病に影響を与える遺伝子座としてＨＨＥＸ−ＩＤＥを明らかにする）。興味深いことに、発育遅延を有する極度の症候性小児肥満症において既に報告されたCNVsのいずれとも関連が観察されなかった（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70）。加えて、ＮＥＧＲ１（ＭＩＭ６１３１７３）に隣接するまたはＳＨ２Ｂ１（ＭＩＭ６０８９３７）を包含する既報の共通するＣＮＶはさらに研究されなかった。
【００８８】
これらを併せると、全ゲノムを評価するための本件の不偏アプローチは、２つの異なる民族における事例に独占的であって、以前には肥満症という面に直接関係するものはなく、さらなる特徴付けを待つこともなかったＣＮＶｓにより影響を受ける新規な遺伝子を明らかにした。更なる機能研究を行い、小児肥満症に関するこれらの遺伝子座でのより完全に遺伝子機能を特徴づけることができる。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態の幾つかを記載し、以上で具体的に例示したが、本発明がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。添付する特許請求の範囲に記載される本願発明の範囲および意図を逸脱することなく、上記実施形態に様々な改変を施すことができよう。
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６１／３０７，２０５号（２０１０年２月２３日提出）および米国の仮出願第６１／３９２，６７９号（２０１０年１０月１３日提出）について３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。前記出願は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により与えられたグラント番号Ｒ０１ ＨＤ０５６４６５−０１Ａ１のもと政府の支援によりなされた。政府は、本発明について特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は肥満症の分野に関する。具体的には、本発明は、肥満症、特に小児肥満症に関するマーカーおよびその使用の方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
いくつかの刊行物および特許文献が、本発明が属する分野の技術水準を説明するために本明細書を通じて引用される。これらの引用文献はそれぞれ出典明示により完全に記載されたように本明細書の一部とされる。
【０００５】
肥満症は現代の社会の大きな健康問題であり、西側社会で、特に小児において有病率が上昇している（Troiano et al. (1998) Pediatrics, 101:497-504）。肥満症およびその付随する表現形であるインスリン抵抗性（Reaven, G.M. (1988) Diabetes, 37:1595-607; DeFronzo et al. (1991) Diabetes Care, 14:173-94）は、米国における主な死因の一因とも考えられており、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧と他の慢性疾患に関する重要な危険因子でもある（National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement (1985) Ann. Intern. Med., 103:147-51）。約７０％の肥満症の若者は成長して肥満症の成人となる（Nicklas et al. (2001) J. Am. Coll. Nutr., 20:599-608; Whitaker et al. (1997) N. Engl. J. Med., 337:869-73; Parsons et al. (1999) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 23(Suppl 8): S1-107）。実際、青年期の肥満が、成人における増加した総死亡率と関係していることが示された（Must, A. (2003) Nutr. Rev., 61:139-42）。
【０００６】
ここ３０年ににわたる環境の変化、特に座りっぱなしの生活様式と共に便利な非常に高カロリー食品の無制限の供給にもかかわらず、肥満症のリスクに対する遺伝的要素に関する強力な証拠もある（Friedman, J.M. (2004) Nat. Med., 10:563-9; Lyon et al. (2005) Am. J. Clin. Nutr., 82:215S-217S）。これは人種集団間の有病率の差に反映される（Knowler et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:1-27; Zimmet et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:91-124）。加えて、肥満症の家族性発症は、一卵性（ＭＺ）双生児の間で体脂肪量７０〜９０％の一致であると報告され、二卵性（ＤＺ）双生児における３５〜４５％の一致より高いことが長い注目されていた（Stunkard et al. (1986) JAMA 256:51-4; Borjeson et al. (1976) Acta Paediatr. Scand., 65:279-87）。したがって、ＢＭＩの推定遺伝率は３０〜７０％の範囲にある（Hebebrand et al. (2003) Obes. Rev., 4:139-46; Farooqi et al. (2005) Int. J. Obes. (Lond), 29:1149-52; Bell et al. (2005) Nat. Rev. Genet., 6:221-34; Schousboe et al. (2003) Twin Res., 6:409-21）。
【０００７】
過去３年で、１３の遺伝子座が、主に成人のゲノムワイド関連（ＧＷＡ）研究の結果からＢＭＩに関連づけられた。インスリン誘発遺伝子２（ＩＮＳＩＧ２）は、この方法によって肥満症における役割が報告された最初の遺伝子座であったが(Herbert et al. (2006) Science 312:279-83)、再現試行では一致しない結果が得られた（Loos et al. (2007) Science 315:187; Dina et al. (2007) Science 315:187; Rosskopf et al. (2007) Science 315:187; Lyon et al. (2007) PLoS Genet., 3:e61; Hotta et al. (2008) J. Hum. Genet., 53:857-62）。二番目に報告された遺伝子座、体脂肪および肥満症関連の遺伝子（fat mass- and obesity-associated gene）（FTO; Frayling et al. (2007) Science 316:889-94）は、他の方法によりより強固に観察された（Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746; Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361; Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6; Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115）。後のより大規模な研究により、１１個のさらなる遺伝子座が明らかにされた（Loos et al. (2008) Nat. Genet., 40:768-75; Thorleifsson et al. (2009) Nat. Genet., 41:18-24; Willer et al. (2009) Nat. Genet., 41:25-34）。加えて、発育遅延のある小児における極度の症候性肥満症に関するコピー数バリエーション（copy number variation）の研究では、形質に寄与する少数のまれなバリアントが報告された（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Troiano et al. (1998) Pediatrics, 101:497-504
【非特許文献２】Reaven, G.M. (1988) Diabetes, 37:1595-607
【非特許文献３】DeFronzo et al. (1991) Diabetes Care, 14:173-94
【非特許文献４】National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement (1985) Ann. Intern. Med., 103:147-51
【非特許文献５】Nicklas et al. (2001) J. Am. Coll. Nutr., 20:599-608
【非特許文献６】Whitaker et al. (1997) N. Engl. J. Med., 337:869-73
【非特許文献７】Parsons et al. (1999) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 23(Suppl 8): S1-107
【非特許文献８】Must, A. (2003) Nutr. Rev., 61:139-42
【非特許文献９】Friedman, J.M. (2004) Nat. Med., 10:563-9
【非特許文献１０】Lyon et al. (2005) Am. J. Clin. Nutr., 82:215S-217S
【非特許文献１１】Knowler et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:1-27
【非特許文献１２】Zimmet et al. (1990) Diabetes Metab. Rev., 6:91-124
【非特許文献１３】Stunkard et al. (1986) JAMA 256:51-4
【非特許文献１４】Borjeson et al. (1976) Acta Paediatr. Scand., 65:279-87
【非特許文献１５】Hebebrand et al. (2003) Obes. Rev., 4:139-46
【非特許文献１６】Farooqi et al. (2005) Int. J. Obes. (Lond), 29:1149-52
【非特許文献１７】Bell et al. (2005) Nat. Rev. Genet., 6:221-34
【非特許文献１８】Schousboe et al. (2003) Twin Res., 6:409-21
【非特許文献１９】Herbert et al. (2006) Science 312:279-83
【非特許文献２０】Loos et al. (2007) Science 315:187
【非特許文献２１】Dina et al. (2007) Science 315:187
【非特許文献２２】Rosskopf et al. (2007) Science 315:187
【非特許文献２３】Lyon et al. (2007) PLoS Genet., 3:e61
【非特許文献２４】Hotta et al. (2008) J. Hum. Genet., 53:857-62
【非特許文献２５】FTO; Frayling et al. (2007) Science 316:889-94
【非特許文献２６】Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746
【非特許文献２７】Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361
【非特許文献２８】Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6
【非特許文献２９】Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115
【非特許文献３０】Loos et al. (2008) Nat. Genet., 40:768-75
【非特許文献３１】Thorleifsson et al. (2009) Nat. Genet., 41:18-24
【非特許文献３２】Willer et al. (2009) Nat. Genet., 41:25-34
【非特許文献３３】Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明によれば、患者における肥満症に関する増大したリスクを診断する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記方法は、患者由来の生体試料における少なくとも１つのコピー数バリエーションの存在を評価することを含む。１つの実施形態において、コピー数バリエーションは、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＤＮＡＪＣ１５からなる群より選択される遺伝子におけるものである。１つの実施形態において、コピー数バリエーションは、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＥＰＨＡ６からなる群より選択される遺伝子におけるものである。コピー数バリエーションは、欠失または重複であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図１Ｂ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図１Ｃ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図１Ｄ】各集団の個人ごとにコールされたコピー数バリエーションの数の分布を示すグラフ。
【図２】Ｂ−アレル頻度（ＢＡＦ）およびログＲ比（ＬＲＲ）に基づくＣＮＶ観察の例。ＣＮＶ数の分布は、各集団の個人ごとにコールした。ＬＲＲは規格化した強度であり、ＢＡＦは規格化したジェノタイプ・データである。ＢＡＦ値およびＬＲＲ値は、クラスター中心から各ＳＮＰに対する各試料の偏差に基づく。ＬＲＲは、予想される２倍体の強度信号を意味する０付近にある傾向がある。ＬＲＲが上昇する場合、より多くのＤＮＡは結合されて、重複があることを示す。反対に、ＬＲＲの減少した信号は、より少ない程度でしかＤＮＡが結合していないことを示し、欠失と一致する。前後して、ＢＡＦは３つの正常な２倍体モード０＝ＡＡ、０．５＝ＡＢおよび１＝ＢＢを有する。０．５値がＳＮＰの隣接する領域で観察されない場合、欠失があるおそれがある。０．５値が観察されず、０．３３値および０．６６値が観察される場合、重複はＡＡＢおよびＡＢＢジェノタイプを裏付け得る。ＲＯＨ：ホモ接合性のコピー数ニュートラルラン（copy number neutral run）。ホモ接合性はＢＡＦでは明らかであるが、ＬＲＲはゼロから実質的に乖離せず、結果的に、欠失コールではなく、むしろＲＯＨコールとなる。
【図３】ヒトゲノムのBuild ３６（２００６年３月）を供えたＵＣＳＣゲノム・ブラウザを用いて、欠失または重複により直接影響を受ける遺伝子座を示す。図３Ａ〜Ｃは、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５およびＦＯＸＰ２それぞれに直接影響を与える欠失を示す。図３Ｄ〜Ｆは、ＫＩＦ２Ｂ、ＤＮＡＪＣ１５とＡＲＬ１５それぞれに影響を与える重複を示す。
【図４】表示の遺伝子座でのＣＮＶｓの定量ＰＣＲ検証のグラフ。エラーバーは４重試行の標準偏差を示す。
【図５】ＰｅｎｎＣＮＶ（Illumina（登録商標）アレイに対して用いた５３２，８９８のＳＮＰｓ）からのＣＮＶコールの統計情報に関する分析フローダイアグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳しい説明）
米国の小児と成人における肥満症の有病率は、過去１０年で劇的に増加し、米国の成人集団の３０％が３０超のＢＭＩを有し、５％が４０超のＢＭＩを有する。成人肥満症の多くの遺伝的決定基が、ゲノムワイドな関連解析研究および小児期における症候性肥満症の研究を通じてすでに確立されている。通常の小児肥満症（regular childhood obesity）（ＢＭＩの≧９５パーセンタイル）に対して罹病性を与えるＣＮＶｓを包括的に同定しようとする試みにおいて、全ゲノムＣＮＶ検査を、５５０,０００のＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型をジェノタイプしたヨーロッパ系の１，０８０の小児肥満症の事例と２,５００の痩せの対照（ＢＭＩの＜５０パーセンタイル）に対して実施した。陽性所見が、アフリカ系の１，４７９の小児肥満症の事例および１，５７５の痩せの対照群で評価された。ヨーロッパ系アメリカ人の事例で独特であった３５のＣＮＶ遺伝子座が同定され、そのうち１５（４２．９％）がアフリカ系アメリカ人の事例でも独占的に再現された（７つの重複および８つの欠失）。少なくとも３のＥＡの事例で独特であった１７のＣＮＶ遺伝子座が同定され、その両方が既に公に報告されたものではなく、定量ＰＣＲを用いて確認された。それらの遺伝子座のうち８つ（４７．１％）もまたＡＡの事例で独占的に再現された（６つの欠失および２つの重複）。再現された欠失した遺伝子座は、ＥＤＩＬ３（EGF-like repeats- and discoidin I-like domains-containing protein 3）、Ｓ１ＰＲ５（endothelial differentiation, sphingolipid）、ＦＯＸＰ２（forkhead box P2）、ＴＢＣＡ（tubulin folding cofactor A）、ＡＢＣＢ５（ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 5）、およびＺＰＬＤ１（zona pellucida-like domain containing 1）を含んだが、一方で、再現された重複の遺伝子座では、ＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）、ＡＧＲ３（breast cancer membrane protein 11 precursor）、ＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）、およびＤＮＡＪＣ１５（DnaJ homolog, subfamily C, member 15）、特にＫＩＦ２ＢおよびＡＲＬ１５を含んだ。ＥＰＨＡ６−ＵＮＱ６１１４遺伝子座における欠失についての証拠も、ＡＡ集団をディスカバリー・セット（discovery set）として調査した場合に観察された。すべてのバリアントは、定量ＰＣＲを用いて実験的に検証された。これらのバリアントは、肥満症の病因の重要なメディエーターである神経機能に関係する遺伝子を標的とする。これらの結果は、ＣＮＶｓが複数の民族で肥満症に関する遺伝的罹病性に寄与することを示す。
【００１２】
定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００１３】
本明細書中で用いられる用語「肥満症」は被検体における過剰の体脂肪がある状態を一般に意味する。「肥満症」は、被検体が３０．０ｋｇ／ｍ２以上のボディーマスインデックス（ＢＭＩ；身長の平方メートルあたりの体重（ｋｇ／ｍ２））を有することによる状態を意味し得る。「肥満症の被検体」は、３０．０ｋｇ／ｍ２以上のボディーマスインデックス（ＢＭＩ）を有する被検体である。「体重超過の被検体」は２５．０ｋｇ／ｍ２超から３０．０ｋｇ／ｍ２までのＢＭＩを有する被検体である。
【００１４】
用語「コピー数」は、本明細書で用いられるように、試料のゲノムＤＮＡにおける特定領域のコピーの数を意味する。あるゲノム領域が「コピー数バリエーション」を有する場合、そのゲノム領域は、ゲノムのその他の平均コピー数のそれ（例えばヒトでは２コピー）と異なるコピー数を有する。
【００１５】
本明細書で用いられる「生体試料」は、被検体、好ましくはヒト被検体、例えば組織、組織標本、細胞試料、腫瘍サンプルおよび生体液（例えば血液、尿または羊水）から得られる生体物質試料を意味する。特定の実施例において、生体試料は血液である。
【００１６】
本明細書で用いられる「診断」は、被検体における疾患または障害を検出および同定することを意味する。本用語は、疾患または障害を有することが知られている患者において、該疾患または障害の状態（進行、退行、安定化、処置に対する応答など）を評価または判断することも包含し得る。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「予後」は、被検体の将来の健康（例えば予想される病的状態または死亡率、糖尿病に罹る可能性および心血管疾患のリスク）に関する疾患または障害の存在による影響に関する情報を提供すること（例えば、本発明の診断法で決定されるように）を意味する。換言すれば、用語「予後」は、疾患/障害から見込みのある経過および結果の予測、または疾患/障害からの回復の可能性を提供することを意味する。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「処置」は、疾患または障害に苦しむ患者に利益をもたらす処置、例えば、患者の状態（例えば１以上の症状）における改善、状態の進行における遅延などをもたらす種類の処置を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「プローブ」は、プローブに対して相補的な配列を有する核酸にアニーリングまたは特異的にハイブリダイズすることができる、純粋な制限酵素消化で天然に生じた又は人工的に生成されたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸、ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかを意味する。プローブは一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの正確な長さは、多くの因子、例えば温度、プローブの供給源および方法の使用に依存し得る。例えば、診断適用に関しては、目標配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは概して約１０−１００、約１０−５０、約１５−３０、約１５−２５、約２０−５０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より短いヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書中のプローブは、特定の目標核酸配列の異なるストランドに相補的となるように選択されてもよい。これは、プローブが所定の条件セット下で各々の標的ストランドと「特異的にハイブリダイズする」またはアニールすることができるように、十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プローブ配列は標的の正確な相補的配列を反映する必要はないが、反映していてもよい。例えば、プローブ配列の残りの部分が標的ストランドと相補的であれば、相補的でないヌクレオチド断片がそのプローブの５’または３’端に付着されてもよい。あるいは、プローブ配列が標的核酸配列と十分に相補的であり、標的核酸と特異的にアニールするのであれば、相補的でない塩基または長い配列がそのプローブ中に挿入されていてもよい。
【００２０】
本明細書中で用いられる用語「プライマー」は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの、一本鎖または二本鎖のいずれかの、生物系に由来するか、制限酵素消化により生成するか若しくは合成的に製造される、オリゴヌクレオチドであって、適当な環境に置いた場合に、テンプレート依存的な核酸合成の開始物質として機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。適当な核酸テンプレート、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適当な補因子および適当な温度やｐＨなどの条件にプライマーを置いた場合に、ポリメラーゼまたは同様の活性の作用によるヌクレオチドの付加によりその３’末端で伸長し、プライマー伸長産物を得ることができる。プライマーは、特定の条件およびアプリケーションの要求に応じて長さを変更することができる。例えば、診断適用では、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に約１０〜２５以上のヌクレオチド長である。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始するために、即ち、ポリメラーゼもしくは類似の酵素による合成の開始に使用する適当に並置されたプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な様式で所望のテンプレート鎖とアニールを可能とするために、該所望のテンプレートと十分に相補的でなければならない。プライマー配列が所望のテンプレートの正確な相補鎖である必要はない。例えば、相補的でないヌクレオチド配列が、それ以外は相補的なプライマーの５’端に付着されてよい。あるいは、そのオリゴヌクレオチドプライマー配列が所望のテンプレート鎖の配列と十分に相補的であり、伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を機能的に提供できる場合、相補的でない塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に挿入されていてもよい。
【００２１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は米国特許４，６８３，１９５、４，８００，１９５および４，９６５，１８８に記載され、それらの全開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００２２】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関し、用語「特異的にハイブリダイズする」は、当分野で一般に用いられる所定の条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列からなる２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の会合を意味する（場合により、「実質的に相補的」と称される）。特に、前記用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを意味し、一本鎖核酸の相補的でない配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除することを意味する。種々の相補性を有する一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適当な条件は、当該分野では周知である。
【００２３】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを実施するために要求されるストリンジェントな条件は、以下に記載される（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press):
Tm = 81.5 ℃ + 16.6Log [Na+] + 0.41(%G+C) - 0.63(％ホルムアミド) - 600/二本鎖の#bp
【００２４】
上記式の例証として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミド、ＧＣ含有率４２％および平均プローブサイズ２００塩基対を用いた場合、Ｔｍは５７℃である。二本鎖ＤＮＡのＴｍはホモロジーが１％低下するごとに１〜１．５℃ずつ低下する。このように、約７５％超の配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いることで観察され得る。
【００２５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄は、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、プローブのその標的とのアニーリング率を最大にするためには、そのハイブリダイゼーションを通常、算出されたそのハイブリッドのＴｍよりも２０〜２５℃低い温度条件および塩条件で行う。洗浄条件は、プローブの標的に対する同一性の程度について、可能な限りストリンジェントにすべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりも約１２ ２０℃以下となるよう選択される。本発明の核酸に関し、中程度のストリンジェントハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（denatured salmon sperm DNA）における４２℃でのハイブリダイゼーション、及び２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける５５℃での１５分間の洗浄と規定される。高ストリンジェントハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける６５℃での１５分間の洗浄と規定される。非常に高いストリンジェントハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける６５℃での１５分間の洗浄と規定される。
【００２６】
用語「単離された」は、それに天然に付随し得る他の化合物から十分に分離された化合物または複合体を意味し得る。「単離された」は、他の成分または物質を含む人工または合成混合物、或いは基本的な活性もしくは後のアッセイと干渉しない不純物および例えば不完全な精製のために存在し得る不純物の存在、又は安定化剤の添加を排除することを意味するものではない。
【００２７】
本明細書で用いられる「使用説明書類」は、本発明に係る方法を実施するための本発明に係る組成物の有用性を伝達するために用い得る刊行物、記録、図表またはその他のいずれかの表現媒体を含む。
【００２８】
語句「固体支持体」は、いずれかの固体表面を意味し、限定するものではないが、いずれかのチップ（例えば二酸化ケイ素ベースのガラスまたは金のチップ）、ガラススライド、メンブレン、プレート、ビーズ、固体粒子（例えばアガロース、セファロース、ポリスチレンまたは磁気ビーズ）、カラム（またはカラム材料）、試験管またはマイクロタイター皿を含む、固体表面を意味する。
【００２９】
本明細書中で用いられる用語「アレイ」は、ハイブリダイズ可能なアレイされる構成因子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）の整然とした配置を意味する。アレイされる構成因子は、少なくとも１つ以上の異なるアレイされる構成因子が固体支持体上に存在するよう配置される。特定の実施形態において、アレイされる構成因子はオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００３０】
「医薬上許容される」は、動物、より具体的にはヒトでの使用に関しての、連邦政府または州政府の監督機関による承認を指す、或いは米国薬局方または他の一般に承認された薬局方にリストされていることを指す。
【００３１】
「担体」は、例えば、本発明の活性物質が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、補助剤またはビヒクルを意味する。医薬上許容される担体は、水および油などの滅菌液、例えば石油、動物、植物もしくは合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などであってよい。水または水性塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、担体として、特に注射溶液として好ましくは用いられる。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)）および「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（Ed. Troy; Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD）に記載されている。
【００３２】
診断方法、キットおよびスクリーニング方法
本発明は、被検体（例えば、動物、ヒト）における肥満症に対する罹患率／リスクを診断および／または測定する方法を提供する。本方法は、関連する健康問題についての予後を提供することをさらに含み得る。被検体が肥満症のリスクがあると診断された場合、その被検体の食事は肥満症を回避／低減／処置するために変更することができる；その被検体は肥満症を予防／処置するための治療薬を投与され得る；および／またはその被検体は運動療法が提供され得る。
【００３３】
１つの実施形態において、本方法は、患者から得られた生体試料中の表３、４または７で提供される少なくとも１つの遺伝子座のゲノムコピー数を決定することを含む。他の実施形態において、本方法は、患者から得られた生体試料中のＥＰＨＡ６、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢおよびＲＰＡＰ３からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のコピー数を決定することを含む。
【００３４】
他の実施形態において、遺伝子は、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＮＸＰＨ１、ＧＰＲ９８、ＢＣ０４８９９７およびＡＫ０９１６２６からなる群より選択される。
【００３５】
さらなる他の実施形態において、遺伝子は、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１およびＡＲＬ１５からなる群より選択される。
【００３６】
よりさらなる他の実施形態において、遺伝子は、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＤＮＡＪＣ１５からなる群より選択される。さらなる他の実施形態において、遺伝子は、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２ＢおよびＡＲＬ１５からなる群より選択される。
【００３７】
特定の実施形態において、遺伝子がＥＰＨＡ６、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２およびＣＥＮＴＤ１からなる群より選択される場合、肥満症のコピー数バリエーション指標は欠失（deletion）である。
【００３８】
他の実施形態において、遺伝子がＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢおよびＲＰＡＰ３からなる群より選択される場合、肥満症のコピー数バリエーション指標は重複（duplication）である。
【００３９】
上記遺伝子のＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ番号およびＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する）は以下のとおりである：
ＥＤＩＬ３（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3）：GeneID: 10085
Ｓ１ＰＲ５sphingosine-1-phosphate receptor 5; also known as EDG8; 別名ＥＤＧ８）：GeneID: 53637
ＦＯＸＰ２（forkhead box P2）：GeneID: 93986
ＴＢＣＡ（tubulin folding cofactor A）：GeneID: 6902
ＡＢＣＢ５（ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 5）：GeneID: 340273
ＺＰＬＤ１（zona pellucida-like domain containing 1）：GeneID: 131368
ＤＥＲＡ（2-deoxyribose-5-phosphate aldolase homolog）：GeneID: 51071
ＰＮＬＩＰＲＰ１（pancreatic lipase-related protein 1）：GeneID: 5407
ＰＲＲ２０Ａ（proline rich 20A; 別名ＦＬＪ４０２９６）：GeneID: 122183
ＢＣ０１５４３２：GenBank Accession No. BC015432.1
ＣＤＳ２（CDP-diacylglycerol synthase (phosphatidate cytidylyltransferase) 2）：GeneID：8760
ＣＡＣＮＡ２Ｄ４（calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 4）：GeneID: 93589
ＬＲＴＭ２（leucine-rich repeats and transmembrane domains 2）：GeneID: 654429
ＣＥＮＴＤ１（centaurin, delta 1; 別名ＡＲＡＰ２）：GeneID: 116984
ＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）：GeneID: 84643
ＢＣ０７３９３５：GenBank受入番号BC073935.1
ＣＲ６１１６５３：GenBank受入番号CR611653.1
ＢＲＤＴ（bromodomain, testis-specific）：GeneID: 676
ＤＮＡＪＣ１５（DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 15）：GeneID: 29103
ＡＧＲ３（anterior gradient homolog 3）：GeneID: 155465
ＤＦＮＢ３１（deafness, autosomal recessive 31）：GeneID: 25861
ＣＯＬ２７Ａ１（collagen, type XXVII, alpha 1）：GeneID: 85301
ＡＫＮＡ（AT-hook transcription factor）：GeneID: 80709
ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１（ATPase, H+ transporting, lysosomal 13kDa, V1 subunit G1）：GeneID: 9550
ＯＲＭ１（orosomucoid１）：GeneID: 5004
ＯＲＭ２（orosomucoid2）：GeneID: 5005
Ｃ９ｏｒｆ９１（chromosome 9 open reading frame 91）：GeneID: 203197
ＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）：GeneID: 54622
ＢＣＭＯ１（beta-carotene 15,15'-monooxygenase 1; 別名BCDO）：GeneID: 53630
ＰＫＤ１Ｌ２（polycystic kidney disease 1-like 2）：GeneID: 114780
ＭＩＣＢ（MHC class I polypeptide-related sequence B）：GeneID: 4277
ＣＯＭＴ（catechol-O-methyltransferase）：GeneID: 1312
ＳＬＣＯ１Ａ２（solute carrier organic anion transporter family, member 1A2): GeneID: 6579
ＮＸＰＨ１（neurexophilin 1）：GeneID: 30010
ＥＧＦＬ１１（EGF-like-domain, multiple 11; 別名EYS）：GeneID: 346007
ＮＡＡＬＡＤＬ２（N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2）：GeneID: 254827
ＧＰＲ９８（G protein-coupled receptor 98; 別名KIAA0686）：GeneID: 84059
ＰＣＤＨ２０（protocadherin 20）：GeneID: 64881
ＢＣ０４８９９７：GenBank受入番号BC048997.1
ＡＫ０９１６２６：GenBank受入番号AK091626.1
ＡＰＯＢ（apolipoprotein B）：GeneID: 338
ＲＰＡＰ３（RNA polymerase II associated protein 3）：GeneID: 79657
ＥＰＨＡ６（ephrin receptor A6; UNQ6114; MIM 600066）：Gene ID: 285220
【００４０】
コピー数バリエーションは、当分野で公知のいずれかの方法によって検出できる。例えば、コピー数バリエーションは、ＰＣＲ（例えばｑＰＣＲ）、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションおよびバーチャル染色体分析により検出することができる。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの遺伝子と特異的にハイブリッド形成するプローブおよびプライマーも本発明に包含される。プローブおよびプライマーは、遺伝子のコピー数を測定するのに用いることができる。プローブは、固体支持体に固定化されてもよい。実際、本発明に係る遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも６つ、またはその全てに対する少なくとも１つのプローブを含むアレイも本発明に包含される。特定の実施形態において、アレイは、上記のグループの各遺伝子に対する少なくとも１つのプローブを含む。
【００４２】
本発明のプローブ、プライマーおよび／またはアレイは、キットに組み込まれてもよい。キットは、使用説明書類、バッファおよび／または容器を更に含んでもよい。
【００４３】
上記に加えて、本発明は、肥満症の処置、阻害および／または予防のための治療薬のスクリーニング（例えば、ハイスループットスクリーニング）方法を含む。本明細書中で特定されるＣＮＶｓが肥満症の病因と関係したため、遺伝子およびそれらのコード産物の活性を調節する（例えば、正常レベルに戻す）薬剤を特定する方法は、この状態の処置に有効な治療薬（例えば核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなど）、タンパク質、ポリペプチド、リガンド、抗体、小分子など）の創生を結果的にもたらし得る。特定の実施形態において、試験される薬剤は、合理的な薬物設計によって開発された。例えば、遺伝子の欠失および遺伝子および／または遺伝子産物（例えば上記ＧｅｎｅＩＤリファレンスで示されるもの）の活性における付随する消失があるＣＮＶｓに関しては、活性レベル（例えば、野生型のレベルに）を上昇させる治療薬が望ましいであろう。加えて、遺伝子が重複されている、及び当該遺伝子および／または遺伝子産物の活性における付随する増加があるＣＮＶｓに関しては、活性レベル（例えば、野生型レベルに）を低下させる治療薬が望ましいであろう。
【００４４】
特定の実施形態において、スクリーニング方法は、本発明の少なくとも１つのＣＮＶを含む細胞を化合物と接触させること、及び該ＣＮＶにより影響を受ける遺伝子および／または遺伝子産物の活性が調節されるかどうか（例えば、野生型に近くづくか）を評価し、それによって治療薬を特定することを含む。特定の実施形態において、細胞は被検体から得られる。さらに他の実施形態において、ＣＮＶｓを試験管内で細胞において生じさせる。細胞内で遺伝子または遺伝子座のＣＮを調節する方法は、当分野で周知である。さらなる他の実施形態において、スクリーニング方法は、本発明の少なくとも１つのＣＮＶを含む動物（例えばトランスジェニック動物（例えばマウス））にて実施することができる。
【００４５】
細胞性代謝における本明細書に記載のＣＮＶｓによる役割の説明は、肥満症の処置および診断に有用な医薬組成物の開発を容易にする。これらの組成物は、上記の物質のうちの１つに加え、医薬上許容されるキャリア（例えば、当業者に周知の賦形剤、キャリア、バッファ、スタビライザまたは他の材料）を含んでいてもよい。そのような材料は、無毒であり、かつ活性成分の有効性に干渉しないものでなければならない。個人に与えられる本発明のポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子または他の医薬的に有用な化合物であるかどうかに関係なく、投与は、望ましくは「予防上の有効量」または「治療上の有効量」（場合によっては、予防は治療と考えられてもよい）で、これが個人に有益性を示すのに十分な量である。
【００４６】
さらなる他の実施形態において、本発明は、薬理ゲノミクスを包含する。より詳しくは、本発明は、治療薬の効能を予測するため、又は処置に最も有効な治療薬を選択するために被検体をスクリーニングする方法を包含する。特定の実施形態において、患者から生体試料を得ること、及び本発明の少なくとも１つのＣＮＶの有無を決定することを含む。次いで、ＣＮＶを有する被検体への治療薬の投与が有効であり、許容できない副作用がないことが実際に示される場合に、検体は該治療薬が投与される。
【００４７】
以下の実施例は、本発明を実施する方法を例示するものであり、本発明の範囲がいかようにも限定されることを意図するものではない。
【００４８】
実施例
方法
試験被験者
すべての被験者は、フィラデルフィア州の子供病院（Children’s Hospital）にて、グレーター・フィラデルフィア地域から２００６年から２００９年まで連続的に募集された。本研究は、ＣＮＶｓに関して厳格に確立されたデータ品質閾値に適合する１，０８０人の白色人種の肥満症児（ＢＭＩ≧９５パーセンタイル）、２，５００人の白色人種の痩せ対照（ＢＭＩ＜５０パーセンタイル）、１，４７９人のＡＡの肥満症児および１，５７５人のＡＡの痩せ対照から構成された。これらの参加者は全員、血液を６ｍｌのＥＤＴＡ血液採取管に採取され、次いでジェノタイピングのためにＤＮＡ抽出された。ＢＭＩ≧９５パーセンタイルは、疾病管理センター（Center for Disease control：ＣＤＣ）ｚ−スコア＝１．６４５（www.cdc.gov/nchs/about/major/nhanes/growthcharts/datafiles.htm）を用いて定義した。被験者は全員、生物学的に無関係であり（利用可能なＳＮＰデータ（ペアワイズＩＤＢを０．２５以上の相関性を示す個人を除去するのに用いた）に基づき）、２〜１８歳の年齢であった（表１）。被験者は全員、ＣＤＣ補正したＢＭＩの−３〜＋３の標準偏差の間にあった（すなわち、異常値を、潜在的な測定誤差の結果または極度の肥満症のメンデル原因を避けるために除外した；従って、後者のカテゴリーは、ＣＮＶディスカバリーに関して既報のカテゴリーに入る個人を特異的に除外した（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70; Walters et al. (2010) Nature 463:671-5））。自己申告の民族性は、多次元スケーリング法によって確認した。全体的な系統は、ヨーロッパおよびアフリカの人々における特異な集団の民族系統を保証するためにＥｉｇｅｎｓｔｒａｔを用いて決定された。本研究は、フィラデルフィア州の子供病院の施設内倫理委員会により承認された。親のインフォームドコンセントは、血液採取および以降のジェノタイピングの両方に関する各試験の参加者について行った。
【表１】
表１：研究した集団における性および年齢の分布
【００４９】
ＣＮＶディスカバリーについてのイルミナ（Illumina（登録商標））Infiniumアッセイ
ハイスループット・ゲノムワイドＳＮＰジェノタイピングは、フィラデルフィア州の子供病院のCenter for Applied Genomicsにおいて、Infinium（商標）II HumanHap550 BeadChip テクノロジー（Illumina（登録商標）; San Diego, CA)を用いて実施された。ジェノタイピングアレイにより提供される強度データと共に、ジェノタイプデータの内容は、ＣＮＶコールについて高い信頼性を与える。重要なことに、同じ実験設定での強度データおよびジェノタイプデータの同時分析は、正常な２倍体状態およびその何らかの逸脱に関する高い精度の同定を確立する。ＣＮＶｓをコールするために、複数の情報源、例えば各ＳＮＰマーカーにおける対数Ｒ比（Log R Ratio：ＬＲＲ）およびＢアレル頻度（B Allele Frequency：ＢＡＦ）を、ＳＮＰ間隔（SNP spacing）、trained hidden MarkovモデルおよびＢアレルの集団内頻度と共に含むＰｅｎｎＣＮＶアルゴリズム（www.openbioinformatics.org/penncnv/）を用い、CNVコールを生成した。各試料は、事例の状況を伏せられてＣＮＶｓがコールされた。陽性の結果を、類似サイズのアフリカ系統の独立した再現集団で評価した。ＣＮＶフィルターリングおよび試験工程のフロー図を図５に提供する。
【００５０】
ＣＮＶ品質管理
品質管理（ＱＣ）単位（measure）は、低品質のＤＮＡ試料および偽陽性ＣＮＶｓを除外するための統計分布に基づくＨｕｍａｎＨａｐ５５０ＧＷＡＳデータで算出した。第１閾値は、首尾よくジェノタイプされた計画されたＳＮＰｓパーセンテージである。コール率＞９８％の試料だけを含めた。ゲノム全体の強度シグナルは、可能な限りノイズを持たないものでなければならない。規格化した強度（ＬＲＲ）の標準偏差（ＳＤ）＜０．３０を有する検体だけを含めた。すべての試料は、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）のスコアリングに基づく明らかな白系（Caucasian）またはアフリカ系の民族性を有していなければならず、その他の試料は全て除外した。低品質の全長ＤＮＡに関するハイブリダイゼーション・バイアスの結果として生じるＧＣ含有量と概して相関する波長のアーティファクトが、コピー数バリエーションの正確な推定に干渉することが知られている（Diskin et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36:e126）。波長のモデルに対してＬＲＲのＧＣ波長の要因が−０．１＜Ｘ＜０．１の間の範囲にある試料だけを受け入れた。ＰｅｎｎＣＮＶによるＣＮＶコールのカウントが１００を上回る場合（図１）、そのＤＮＡの品質は通常劣っている。かくして、ＣＮＶコールカウント＜１００を有する試料だけを含めた。何らかの重複試料（例えば、１卵双胎）は一方の試料を除外した。
【００５１】
ＣＮＶｓの統計分析
事例と対照との間のＣＮＶ頻度は、フィッシャーの正確確率検定を用いて各ＳＮＰを評価した。事例と対照との間で有意であった（ｐ＜０．０５）遺伝子座であって、ヨーロッパ系アメリカ人の場合、ディスカバリー集団（discovery cohort）では同じバリエーションを有し、アフリカ系アメリカ人で再現され、いずれの対照被験者でも発見されず、独立した方法によっても検証された遺伝子座だけを考慮した。統計学的極小が、互いに１Ｍｂ以内に存在するＳＮＰｓを含む名目上有意な領域に関して関連を狭くすることが報告されている。結果として生じる有意なＣＮＶＲｓが以下の基準のいずれかを満たす場合、それらを除外した：ｉ）テロメアまたはセントロメア近傍のサイトバンド（cytoband）に存在する；ｉｉ）ＣＮＶコールの境界端（boundary truncation）における変動により生じる共通のＣＮＶの「島（peninsula）」に生じている；ｉｉｉ）ゲノム領域がハイブリダイゼーション・バイアスをもたらす過度のＧＣ含有量を有する；またはｉｖ）試料が多重ＣＮＶＲｓに寄与する。ＤＡＶＩＤ（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）（Dennis et al. (2003) Genome Biol., 4:P3; Huang da et al. (2007) Genome Biol., 8:R183）を用いて、独立して関連づけられたＣＮＶ結果のＩｎｔｅｒＰｒｏカテゴリーへの機能的アノテーション・クラスタリングの有意性を評価した（上位の結果がＵｎｉＰｒｏｔカテゴリーである：ビジョン（Vision） Ｐ＝０．００６９（CACNA2D4、GPR98、DFNB31））。実施した試験数を調整するために、１６の欠失および１９の重複ＣＮＶＲｓの補正を、ヨーロッパ系アメリカ人集団の有意性に基づいて行った。
【００５２】
ＣＮＶフィルターリング工程
多重ＣＮＶフィルターリング工程を分析の一部として実施した。第１に、Ｉｌｌｕｍｉｎａアレイ上の５３２，８９８のＳＮＰｓのうち、ヨーロッパ系アメリカ人のディスカバリー集団における少なくとも３つ以上の無関係な事例で８，６７２（１．６２７％）が欠失を示し、そして６，７６３（１．２６９％）が重複を示した点は注目すべき重要なことである（頻度≧０．２７８％）。３つの事例の閾値を選択する。なぜならば、所定の領域でのコールに関する再現性を与えるための最小の事例頻度のためである。この事前の除外は、ＧＷＡ ＳＮＰジェノタイプ研究における１％のマイナー・アレル頻度（Minor Allele Frequency）に関する内包の閾値（inclusion threshold）と非常に類似している。これで、ゲノムワイド試験について補正するために実施される試験の数が劇的に減る。
【００５３】
第２に、すべてのＳＮＶｓを事例と対照の両方で同時にコールし、マルチスクリプトで規定されたようにＣＮＶＲｓに分類した。合計２７２の欠失および１７４の重複ＣＮＶＲｓが確認された。第３に、新規ＣＮＶｓを調査するために、白色人種の対照集団で観察された全てのＣＮＶＲｓを除去して事例における独占性を確立し、そして生データ（ＢＡＦおよびＬＲＲ）を、方法の項で記載したように正確なＣＮＶコーリングおよび統計学的な有意性のために慎重に批評した。これで、１２の欠失および１９の重複のＣＮＶＲｓが残った。
【００５４】
従って、このデータセットは、新規な肥満ＣＮＶｓについて試験するために用いたディスカバリー集団からのＣＮＶＲｓを規定する。次いで、これらのＣＮＶＲｓの再現を独立したアフリカ系アメリカ人の事例−対照データセットで試験した。６つの欠失および７つの重複ＣＮＶＲｓが再現基準に対して残り（アフリカ系アメリカ人の事例で観察され、アフリカ系アメリカ人対照セットでは無かった）、次いで、少なくとも１つの独立した方法（ＱＰＣＲおよびＦＩＳＨ）により実験的に検証した。これらの結果を表３に示す。
【００５５】
多数の理由で、例えば、提供されるＤＮＡにおける変動性、アレイタイプ、ＤＮＡ処理、データ処理、品質管理、ＣＮＶコーリング・アルゴリズム、ゲノム特徴、ゲノムの範囲および領域の統計学的提示に関するいずれかのプラットフォームによって、ＣＮＶコーリングが明確に達成されないことは注目すべき重要なことである。これが、交絡する寄与度をそれぞれ規格化および調節するための多大な努力にもかかわらず、最初の検査での高い擬陽性率をもたらし得る。
【００５６】
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によるＣＮＶ検証
ユニバーサル・プローブ・ライブラリー（UPL; Roche, Indianapolis, IN）のプローブを、ProbeFinder v2.41 Software（Roche, Indianapolis, IN）を用いて選択した。定量ＰＣＲを、ABI 7500 Real Time PCR InstrumentまたはABI Prism（商標）7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA）にて実施した。各試料を、２５μｌの反応混合液（２５０ｎＭのプローブ、９００ｎＭの各プライマー、ロシュ（Roche）のFast Start TaqMan Probe Master、および１０ｎｇのゲノムＤＮＡ）または１０μｌの反応混合液（１００ｎＭのプローブ、２００ｎＭの各プライマー、インビトロジェン（Invitrogen）のＲＯＸを含む１×Platinum Quantitative PCR SuperMix-Uracil-DNA-Glycosylase（ＵＤＧ）および２５ｎｇのゲノムＤＮＡ）のいずれかで４重に分析した。その値を、Sequence Detection Software v2.2.1（Applied Biosystems, CA）を用いて評価した。データ分析は、ΔΔＣＴ法を用いて更に実施した。ＣＯＢＬ（MIM 610317）、ＧＵＳＢ（MIM 611499）、およびＳＮＣＡ（MIM 163890）から選択したリファレンス遺伝子を、最小の変動係数に基づいて含め、次いで、データを正常対照の値を１に設定することによって規格化した。これらの稀なＣＮＶｓは、アレイに存在する単一の共通ＳＮＰによっても効果的にタグ付けされることはなかった。
【００５７】
【表２−１】
【００５８】
【表２−２】
【００５９】
表２：マーカー間の連鎖不平衡レベルを反映する、ＣＮＶｓに対する最良のＳＮＰジェノタイプ代替物および各々のｒ２値。ＳＮＰｓ＞１％の一般的性質およびＣＮＶｓ＜１％の稀な性質のために、ＣＮＶｓに関する代替ＳＮＰジェノタイプを同定することは挑戦的なことである。ＣＮＶの１Ｍｂ内でジェノタイプされたＳＮＰｓのｒ２値はほとんどゼロに近かった。
【００６０】
結果
本研究は、厳格に確立されたＣＮＶｓに関するデータ品質閾値に適合する１，０８０人の白色人種の肥満症児（ＢＭＩ≧９５パーセンタイル）、２，５００人の白色人種の痩せ対照（ＢＭＩ＜５０パーセンタイル）、１，４７９人のＡＡ肥満症児および１，５７５人のＡＡ痩せ対照（２−１８歳）から構成された。しかしながら、被験者はすべて、潜在的な測定誤差の結果または極端な肥満のメンデル原因となり得る異常値を排除するために、ＣＤＣ補正したＢＭＩ標準偏差が−３〜＋３の間になければならない。実際、後者のカテゴリーは、ＣＮＶディスカバリーに関して既報のカテゴリーに入る個人を特異的に除去する。
【００６１】
PennCNVソフトウェア（Wang et al. (2007) Genome Res., 17:1665-74）を用いて、ヨーロッパ系アメリカ人（ＥＡ）事例および対照それぞれにおいて、個人につき平均２２．０および１９．５ＣＮＶコールを行い、９３％の被験者が８−４５ＣＮＶコールを有した（図３）。４つの異なるコピー数状態をＥＡの事例／対照集団についてコールし、９１９／２，１０９ホモ接合性欠失（コピー数またはＣＮ＝０）、１３，６７８／２８，９１７ヘミ接合性欠失（ＣＮ＝１）、６，７６７／１６，６８９の１コピー重複（ＣＮ＝３）および３４４／１，１３９の２コピー重複（ＣＮ＝４）を含んだ。図２は、BeadStudioソフトウェアで概観される生のイルミナ・データの例および結果的に得られるＣＮＶコールを示す。ＣＮＶコールは３〜７９０３ＳＮＰｓに及び、ＣＮＶコールあたり平均１９ＳＮＰｓを有し、および、そのサイズは５０ｂｐ〜３３Ｍｂの範囲であり、平均８１ｋｂサイズであった。
【００６２】
９３％のアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）被験者も、８−４５のＣＮＶコールを有していた（図１）。個人あたり平均２４．１および２５．１のＣＮＶコールが、ＡＡ事例および対照でそれぞれなされた。それらの中で、８９７／１，０２６ＣＮ＝０、２５，６５０／２８，７９３ＣＮ＝１、８，７７８／１０，２５１ＣＮ＝３および４１８／５３５ＣＮ＝４が確認された。ＣＮＶは３〜７９０３のＳＮＰに及び、ＣＮＶコールあたり平均１５のＳＮＰｓを有し、および、それらのサイズは５０ｂｐ〜３３Ｍｂの範囲にあり、６７ｋｂの平均サイズであった。
【００６３】
ＥＡ被験者において潜在的に無症候性小児肥満症に寄与する新規ゲノム座を同定するために、対照と比較される事例に、より頻繁なコピー数変化を有する連続的なＳＮＰｓについてゲノムをスキャンするセグメントベースのスコアリングアプローチを適用した。これらの連続的なＳＮＰｓのためのゲノムスパンが、一般のコピー数バリエーション領域またはＣＮＶＲｓを定める。
【００６４】
局所系統（Local ancestry）を平均３００のＳＮＰジェノタイプを含む各ＣＮＶ遺伝子座を囲む１ＭＢの領域を用いて評価し、結果として、有意に逸脱した個人を含まないよくクラスター形成された集団となった。統計学的極小が、互いに１Ｍｂ以内に存在するＳＮＰｓを含む名目上有意な領域に関して関連を狭くすることが報告されている。結果として生じる有意なＣＮＶＲｓが以下の基準のいずれかを満たす場合、それらを除外した：ｉ）テロメアまたはセントロメア近傍のサイトバンドに存在する；ｉｉ）ＣＮＶコールの境界端における変動により生じる共通のＣＮＶの「島」に生じている；ｉｉｉ）ゲノム領域がハイブリダイゼーション・バイアスをもたらす過度のＧＣ含有量を有する；またはｉｖ）試料が多重ＣＮＶＲｓに寄与する。
【００６５】
少なくとも３つのＥＡの事例に独占的に存在した３４の推定ＣＮＶＲ遺伝子座（１５の欠失および１９の重複）が同定された（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、欠失のうちの３つは、ＣＮＶｓの独立した検証に一般的に用いられる方法である定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた検証過程の間に偽陽性であることが判明した（図３および図４）。実験的検証はすべて、いずれのバイアスも最小に抑えるために盲検様式で独立した研究グループにより実施された。これは別のレベルの信用を実験の検証結果に加えるものである。ＣＮＶ再発（recurrence）に関連した問題、精度、遺伝子座依存（locus dependence）およびＧＣ含有量に関連する困難は、ｑＰＣＲを４重に実施し、試行にまたがる低い標準偏差を観察し、同一ゲノム領域に関する対照試料をアッセイし、そして異なるゲノム領域で同じ試料をアッセイすることにより緩和した。
【００６６】
【表３−１】
【００６７】
【表３−２】
【００６８】
表３：ヨーロッパ系アメリカ人における及びアフリカ系アメリカ人での再現試行における小児肥満症に独占的なＳＮＰレベルでのＣＮＶｓ（ｑＰＣＲ検証されたが公に存在するかについては選別されていない）。アフリカ系アメリカ人の事例で独占的に再現されたＣＮＶｓを太字で強調する。配置（co-ordinate）はUCSC Build hg 18から得た。「近接遺伝子からのＢＰ（BP from nearest gene）」カラムは、ＣＮＶが列挙された遺伝子を包含する場合はゼロを、又はＣＮＶが列挙された遺伝子の近傍にある場合は値を記入する。個々のＣＮＶコールはＳＮＰベースの統計値として割り当てられる。従って、事例がゼロでない値および対照がゼロ値を示す隣接ＳＮＰｓは、列挙されたＣＮＶＲｓであるＣＮＶ領域を形成する。試験したＳＮＰは、再現において正確なオーバーラップを確実にするためにＣＮＶＲ領域の中央のＳＮＰである。
【００６９】
再現試行で、３１の検証されたＣＮＶＲ遺伝子座のうち１３（４１．９％）が、１以上のＡＡの事例に独占的に存在することも明らかとなった（６つの欠失および７つの重複）（表３）。ＣＮＶＲ遺伝子座のうち１７のみが、この集団に特有であり（即ち、Genomic VariantsのDatabaseにより対照において報告されていない）、そのうち８つ（４７．１％）がＡＡの事例で独占的に再現された（６つの欠失および２つの重複）（表４）。再現の目的に関して異なる人種群の使用は、同じ民族で類似の試行を行うことよりも高い障壁を意味する。例えば、２型糖尿病と関連したＴＣＦ７Ｌ２（MIM 602228）における共通のバリアントが、アフリカ人でのその疾患とも類似の程度で関連した場合（Helgason et al. (2007) Nat. Genet., 39:218-225）、それは、この疾患における役割を有するものとして、より確定されるものと考えられた；加えて、最近の喘息ＧＷＡＳ研究結果がアフリカ系アメリカ人でも観察され、それは、我々にこの観察のより高いレベルでの確実性をもたらした（Sleiman et al. (2010) New Eng. J. Med., 362:36-44）。多くのバリアントが異なる人種集団で異なる頻度を有することが示されたため、それぞれ同じ表現型のＥＡとＡＡ集団において独占的なものと同じＣＮＶの観察は、集団の階層化（population stratification）の影響を交絡させる可能性を最小限に抑える。図３は、ヒトゲノムのUCSC Genome Browser with Build hg18（March 2006; genome.ucsc.edu/ cgi-bin/hgGateway）を用いた欠失または重複により最も頻繁に影響を受ける代表的な遺伝子座を可視化する。鍵となるＣＮＶｓのいずれかが、データを利用できた家族の肥満症と一緒に分離されたかどうかも評価し、少なくとも４つのＣＮＶｓが肥満症の親から遺伝的に受け継がれ、そして少なくとも４つがデノボであったことを立証できた（表５）。
【００７０】
【表４−１】
【００７１】
【表４−２】
【００７２】
表４：ヨーロッパ系アメリカ集団およびアフリカ系アメリカ人での再現試行における小児肥満症に独占的なＳＮＰレベルでのＣＮＶｓ（公に存在するか及びｑＰＣＲ検証もしていない）。アフリカ系アメリカ人の事例で独占的に再現されたＣＮＶｓを太字で強調した。配置はUCSC Build hg18から得た。「近接遺伝子からのＢＰ」カラムは、ＣＮＶが列挙された遺伝子を包含する場合はゼロを、又はＣＮＶが列挙された遺伝子の近傍にある場合は値を記入する。これらの遺伝子座は、寄与試料にわたって、欠失遺伝子座についてはＣＮ＝１および再現遺伝子座についてはＣＮ＝３を示した。その他の状態、例えばＣＮ＝０又はＣＮ＝４はこれらの遺伝子座では観察されなかった。個々のＣＮＶコールはＳＮＰベースの統計値として割り当てられる。従って、事例がゼロでない値および対照がゼロ値を示す隣接ＳＮＰｓは、列挙されたＣＮＶＲｓであるＣＮＶの領域を形成する。試験したＳＮＰは、再現における正確なオーバーラップを確実にするためにＣＮＶＲ領域の中央のＳＮＰである。
【００７３】
【表５】
表５：利用可能な家族データに基づき観察されたＣＮＶｓの遺伝的形質。
【００７４】
これらの知見の有意性をさらに確立するために、分布の他のテイル（tail）（すなわち対照の中の独占的なＣＮＶＲｓ）を調べた。最初に、３人の肥満症被験者に対する独占性がＥＡの事例の中で名目上有意な観察を構成したのに対し、本研究での豊富な対照のために、１０人のＥＡ対照が同じ有意な閾値に到達するために要求された。このように分析され、独占的な欠失は観察されなかった、そして、ＥＡ対照における独占的な重複が４つだけ観察された。しかしながら、これらの重複のいずれも、ＡＡ対照では独占的に再現されなかった。このように、これらの対照観察と対照的に、多量の独占的なＣＮＶＲｓにわたる高い有意性が、ＥＡ事例で見られ、ＡＡの事例でも独占的に再現することは、偽陽性ディスカバリー率が１２％より低いことを明らかにした。
【００７５】
既報の＜１％の個人に＞５００ｋｂのサイズで存在する大型の稀な欠失（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-670）を評価したが、ゲノムワイドの過度の大型の稀な欠失は観察されなかった（表６）。これは、以前の報告が重篤な早期発症肥満症が単独で評価された場合でなく発育遅延の被験者を含む場合の有意性を見出しただけであったと想定すれば、予想外のことではない。
【００７６】
【表６】
表６：ゲノムワイドな大型の稀なＣＮＶ負荷（load）の比較
【００７７】
両方の民族からの事例で独占的な欠失を保有する遺伝子座は、直接的に影響を与えた４つの遺伝子、すなわちＳ１ＰＲ５（endothelial differentiation, sphingolipid；MIM605146）、ＦＯＸＰ２（forkhead box P2；MIM 605317）、ＴＢＣＡ（tubulin-specific chaperone a；MIM 610058）およびＡＢＣＢ５（ATP-binding cassette, sub-family B, member 5；MIM 611785）から成る一方で、２つの欠失がＥＤＩＬ３（EGF-like repeats- and discoidin I-like domains-containing protein 3；MIM 606018）およびＺＰＬＤ１（zona pellucida-like domain containing 1）にそれぞれ近接していた。
【００７８】
両方の民族からの事例で独占的な重複を保有する遺伝子座は、直接的に影響を与えた４つの遺伝子、すなわちＢＣ０７３９３５−ＣＲ６１１６５３、ＤＮＡＪＣ１５（DnaJ homolog, subfamily C, member 15）、ＡＧＲ３（breast cancer membrane protein 11 precursor）およびＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）に加えて、９ｑ３２の遺伝子クラスターから成った。加えて、２つの重複は、ＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）およびＢＲＤＴ（testis-specific bromodomain protein）に近接していた。
【００７９】
グローバルとローカルの両方の対号ＩＢＤは、ＥＤＩＬ３欠失を有する５つの事例の間でゼロに近い低い値を示した；事例間を分ける正確なＣＮＶの分断点は分析の必要なパラメータではなかったが、それは特異的なコピー数多形性が観察されたことを示すものである。両方の民族性からの事例で独占的な重複を保有する２つの遺伝子座は、直接的に影響を与えた１つの遺伝子、即ち、ＡＲＬ１５（ADP-ribosylation factor-like 15）およびＫＩＦ２Ｂ（kinesin family member 2B）に近接したものから成った。
【００８０】
本研究で明らかにされた遺伝子座に保有する遺伝子の大多数が、これまでは肥満症には関わっていないものとされていた。しかしながら、最も顕著な発見はＡＲＬ１５であり、それは、冠状動脈性心疾患および２型糖尿病のより高いリスクとも関係している同じリスクのアレルで、アディポネクチン・レベルのＧＷＡ研究において最近明らかにされた（Richards et al. (2009) PLoS Genet., 5:e1000768）。
【００８１】
加えて、ヒトＦｏｒｋｈｅａｄ−ｂｏｘ（ＦＯＸ）遺伝子ファミリのメンバーが代謝の形質に強く関係しているとされたが（Katoh et al. (2004) Int. J. Oncol., 25:1495-500）、ＦＯＸＰ２における突然変異がヒトでの発育上の発話障害と言語障害を引き起こすことで最も有名である（Vernes et al. (2008) N. Engl. J. Med., 359:2337-45）。自閉症がＥＡ事例の１つで記録され、ＡＤＨＤがＡＡ事例の１つ（報告された合併症とで再現された遺伝子座のうちの唯一のもの）で記録されたが、ＦＯＸＰ２のＣＮＶｓにより影響を受ける小児には典型的な症候群の所見がなかった。ヒトの言語および発話の成長と小児肥満症との関わりは明白ではないが、発話に関する問題が、社会的孤立の大きな可能性をもたらし、こうして低い活動性をもたらすという仮説を立てることができそうである。実際、この仮説は、はっきりした発話特徴および言語特徴が一般に病的肥満症を呈するプラダーウィリ症候群を有する小児にあるという事実によって裏づけられる（Akefeldt et al. (1997) J. Intellect Disabil. Res., 41:302-11; Kleppe et al. (1990) J. Speech Hear. Disord., 55:300-9）。
【００８２】
ＥＡ集団をディスカバリーに用いた。なぜならば、このディスカバリー設定で独占的で最も包括的に観察及び確立をするために、利用可能な対照群がこの民族で非常に多かったためである。しかしながら、更なる独占的な遺伝子座の可能性を探索するために、ＡＡ集団もディスカバリー集団として分析し、ＥＡ集団における再現を試みた（表7）。5つのＡＡ事例に対する独占性が、この集団のより少ない痩せの対照のために、この設定でのディスカバリー段階で名目上の有意性を達成することが必要とされたが、ＡＡ事例で独占的であったＥＰＨＡ６−ＵＮＱ６１１４遺伝子座（MIM 600066；例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ 600066）での欠失に関する証拠が観察された。
【００８３】
【表７】
【００８４】
表７：ディスカバリー集団としてのアフリカ系アメリカ集団および再現としてのヨーロッパ系アメリカ人。ヨーロッパ系アメリカ人の事例で独占的に再現されたＣＮＶｓを太字で強調した。アフリカ系アメリカ人集団で独占的な最低５つのＣＮＶｓが、ディスカバリーにおける名目上の有意性（Ｐ＜０．０５）に到達するために必要とされたことに留意すべきである。主として、集団における痩せのヨーロッパ系アメリカ人に対して痩せのアフリカ系アメリカ人のメンバーが少ないためである。
【００８５】
【表８−１】
【００８６】
【表８−２】
表８：頻度閾値に対するディスカバリーの有意性の正当化（justification）。
【００８７】
現在まで、成人での設定における遺伝子座を明らかにするだけの研究では、小児肥満症のＧＷＡ研究に関する不足は顕著であり（Frayling et al. (2007) Science 316:889-94; Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746; Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361; Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6; Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115; Loos et al. (2008) Nat. Genet., 40:768-75; Thorleifsson et al. (2009) Nat. Genet., 41:18-24; Willer et al. (2009) Nat. Genet., 41:25-34）、現在まで、症候性形態（syndromic form）とは対照的に非症候性形質（non-syndromic trait）と有意に関係するＣＮＶｓを報告した研究はなかった（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70; Walters et al. (2010) Nature 463:671-5）。このように、本研究は、小児肥満におけるＣＮＶｓの最初の大規模な不偏のゲノムワイド・スキャンを意味する。本研究で明らかにさらた遺伝子座は、小児肥満症で初めて独占的に観察され、異なる民族性から独立したケースコントロール・データセットで再現される。この結果は、定評のあるＦＴＯ（Frayling et al. (2007) Science 316:889-94; Grant et al. (2008) PLoS ONE 3:e1746; Hinney et al. (2007) PLoS ONE 2:e1361; Dina et al. (2007) Nat. Genet., 39:724-6; Scuteri et al. (2007) PLoS Genet., 3:e115）としての追加の信憑性を与えるものであり、遺伝子座はＥＡ集団においてＢＭＩと肥満症の両方と非常に強い関連性がある（Grant et al. (2008) PLoS One, 3:e1746; Zhao et al. (2009) ２型糖尿病ＧＷＡＳ遺伝子座に関する調査は、小児のＢＭＩ．糖尿病に影響を与える遺伝子座としてＨＨＥＸ−ＩＤＥを明らかにする）。興味深いことに、発育遅延を有する極度の症候性小児肥満症において既に報告されたCNVsのいずれとも関連が観察されなかった（Bochukova et al. (2010) Nature 463:666-70）。加えて、ＮＥＧＲ１（ＭＩＭ６１３１７３）に隣接するまたはＳＨ２Ｂ１（ＭＩＭ６０８９３７）を包含する既報の共通するＣＮＶはさらに研究されなかった。
【００８８】
これらを併せると、全ゲノムを評価するための本件の不偏アプローチは、２つの異なる民族における事例に独占的であって、以前には肥満症という面に直接関係するものはなく、さらなる特徴付けを待つこともなかったＣＮＶｓにより影響を受ける新規な遺伝子を明らかにした。更なる機能研究を行い、小児肥満症に関するこれらの遺伝子座でのより完全に遺伝子機能を特徴づけることができる。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態の幾つかを記載し、以上で具体的に例示したが、本発明がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。添付する特許請求の範囲に記載される本願発明の範囲および意図を逸脱することなく、上記実施形態に様々な改変を施すことができよう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における肥満症の増大したリスクを診断する方法であって、前記被検体から得られた生体試料中の少なくとも１つの遺伝子のコピー数を決定することを含み、
前記遺伝子が、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢ、ＲＰＡＰ３およびＥＰＨＡ６からなる群より選択され、
少なくとも１つの前記遺伝子のコピー数におけるバリエーションの存在が、該ヒトにおける肥満症の増大したリスクの指標である、前記方法。
【請求項２】
遺伝子が、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１およびＡＲＬ１５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子が、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＤＮＡＪＣ１５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コピー数におけるバリエーションが欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コピー数におけるバリエーションが重複である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
肥満症の処置のための治療試薬を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも１つのコピー数バリアントを発現する細胞を提供すること、ここで、前記コピー数バリアントが、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢ、ＲＰＡＰ３およびＥＰＨＡ６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である；
ｂ）工程ａ）の細胞を、被検試薬と接触させること；および
ｃ）前記試薬が、前記遺伝子の活性を調節するかどうかを決定すること、ここで、野生型の活性に対するコピー数バリアントの活性の調節が治療試薬の指標である、
を含む、前記方法。
【請求項７】
工程ａ）の細胞が非ヒト動物におけるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１】
被検体における肥満症の増大したリスクを診断する方法であって、前記被検体から得られた生体試料中の少なくとも１つの遺伝子のコピー数を決定することを含み、
前記遺伝子が、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢ、ＲＰＡＰ３およびＥＰＨＡ６からなる群より選択され、
少なくとも１つの前記遺伝子のコピー数におけるバリエーションの存在が、該ヒトにおける肥満症の増大したリスクの指標である、前記方法。
【請求項２】
遺伝子が、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１およびＡＲＬ１５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子が、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＲＬ１５およびＤＮＡＪＣ１５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コピー数におけるバリエーションが欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コピー数におけるバリエーションが重複である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
肥満症の処置のための治療試薬を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも１つのコピー数バリアントを発現する細胞を提供すること、ここで、前記コピー数バリアントが、ＥＤＩＬ３、Ｓ１ＰＲ５、ＦＯＸＰ２、ＴＢＣＡ、ＡＢＣＢ５、ＺＰＬＤ１、ＤＥＲＡ、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＰＲＲ２０Ａ、ＢＣ０１５４３２、ＣＤＳ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＬＲＴＭ２、ＣＥＮＴＤ１、ＫＩＦ２Ｂ、ＢＣ０７３９３５、ＣＲ６１１６５３、ＢＲＤＴ、ＤＮＡＪＣ１５、ＡＧＲ３、ＤＦＮＢ３１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＡＫＮＡ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＡＲＬ１５、ＰＫＤ１Ｌ２、ＢＣＭＯ１、ＭＩＣＢ、ＣＯＭＴ、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＮＸＰＨ１、ＥＧＦＬ１１、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＧＰＲ９８、ＰＣＤＨ２０、ＢＣ０４８９９７、ＡＫ０９１６２６、ＡＰＯＢ、ＲＰＡＰ３およびＥＰＨＡ６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である；
ｂ）工程ａ）の細胞を、被検試薬と接触させること；および
ｃ）前記試薬が、前記遺伝子の活性を調節するかどうかを決定すること、ここで、野生型の活性に対するコピー数バリアントの活性の調節が治療試薬の指標である、
を含む、前記方法。
【請求項７】
工程ａ）の細胞が非ヒト動物におけるものである、請求項６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５２０２０１（Ｐ２０１３−５２０２０１Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５０７７（Ｐ２０１２−５５５０７７）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５６８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６３１０
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（３０１０４０９５８）ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア (3)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＯＦ ＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５６８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６３１０
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（３０１０４０９５８）ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア (3)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＯＦ ＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ
【Ｆターム（参考）】
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