肺炎球菌感染を治療または予防するための組成物および方法
【課題】肺炎球菌感染を治療または予防するためのポリペプチド、多糖類−ポリペプチド共役体、および発現ベクターを提供する。
【解決手段】肺炎連鎖球菌のニューモリシンに対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含むヌクレオチド哺乳動物に投与されると、抗肺炎球菌免疫応答を誘導する。この組成物は、感染した個体において、当該個体を予防的にワクチン化する、および／または治療的に治療的免疫応答を誘導するために用いられうる。
【解決手段】肺炎連鎖球菌のニューモリシンに対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含むヌクレオチド哺乳動物に投与されると、抗肺炎球菌免疫応答を誘導する。この組成物は、感染した個体において、当該個体を予防的にワクチン化する、および／または治療的に治療的免疫応答を誘導するために用いられうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する米国出願
本願は、２００２年１１月７日に提出された、米国仮出願第６０／４２４，４９７号の優先権を主張する。従来の出願の全ての内容は、参照により本明細書中に引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリペプチド、肺炎球菌多糖類−ポリペプチド共役体、肺炎球菌ポリペプチドをコードする発現ベクター、抗肺炎球菌免疫応答の誘導方法、および、肺炎球菌感染を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、小児、高齢者、および免疫不全の個体における、細菌性の肺炎、髄膜炎、中耳炎および菌血症の共通の原因である。肺炎連鎖球菌は、自身の莢膜多糖類に基づき、約９０種の血清型に細分されうる。しかしながら、疾患は一般的に、約３０のタイプの肺炎連鎖球菌の単離体により引き起こされる。世界保健機関は、小児における肺炎球菌性の髄膜炎および敗血症による年間の死者は１００万人であり、これらの９８％は発展途上国において発生していると見積もっている。抗微生物剤に耐性を有する肺炎球菌株の発生により、抗微生物剤に加えて、方法によって肺炎球菌感染を治療および予防することの必要性が強調されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
一形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に共役したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており（例えば、カルボキシ末端で）、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、組成物を特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【０００５】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有しうる。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６０を含む。他の実施形態では、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６４、配列番号１のアミノ酸１〜４６５、配列番号１のアミノ酸１〜４６６、配列番号１のアミノ酸１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸１〜４７０を含む。
【０００６】
このポリペプチドは、必要であれば、アミノ酸配列ＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２３）またはアミノ酸配列ＹＰＱＶＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２４）を欠失していてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６０、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６４、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６５、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６６、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸残基１〜４７０からなる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記莢膜多糖類は、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群から選択される。一例を挙げると、前記莢膜多糖類は、血清型１４である。他の例を挙げると、前記莢膜多糖類は、血清型１８Ｃである。前記組成物は、必要であれば、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群から選択される複数の異なる莢膜多糖類を含んでもよい。この組成物により誘発される免疫応答は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に対するものであってもよいし、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質に対するものであってもよいし、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類および肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質に対するものであってもよい。
【０００９】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており（例えば、カルボキシ末端で）、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、前記ポリペプチドが、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、哺乳動物発現ベクターを特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１０】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有しうる。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６０を含む。他の実施形態では、このコードされるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６４、配列番号１のアミノ酸１〜４６５、配列番号１のアミノ酸１〜４６６、配列番号１のアミノ酸１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸１〜４７０を含む。
【００１１】
このコードされるポリペプチドは、必要であれば、アミノ酸配列ＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２３）またはアミノ酸配列ＹＰＱＶＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２４）を欠失していてもよい。
【００１２】
いくつかの実施形態において、このコードされるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６０、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６４、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６５、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６６、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸残基１〜４７０からなる。このコードされるポリペプチドにより誘発される免疫応答は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質に対するものであってもよい。
【００１３】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌のオートリシンポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、前記ポリペプチドが、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、哺乳動物発現ベクターを特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、このコードされるポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。
【００１５】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌の表面タンパク質Ａポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、前記ポリペプチドが、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、哺乳動物発現ベクターを特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、このコードされるポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列からなる。
【００１７】
他の形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１〜４６０、配列番号１のアミノ酸１〜４６４、配列番号１のアミノ酸１〜４６６、および配列番号１のアミノ酸１〜４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特徴とする。
【００１８】
他の形態において、本発明は、哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘導するのに有効な量の本明細書に記載の組成物を哺乳動物へ投与することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記免疫応答は、前記組成物中に存在する莢膜多糖類の血清型（例えば、血清型７、６Ｂ、１８Ｃ、または２３Ｆ）とは異なる肺炎連鎖球菌の血清型の少なくとも１つに対して交差反応性である。いくつかの実施形態において、前記免疫応答は、少なくとも１つの連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌以外の種に対して交差反応性である。
【００２０】
他の形態において、本発明は、哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘導するのに有効な量の本明細書に記載の発現ベクター（例えば、ニューモリシン、シュードニューモリシン、オートリシン、または肺炎球菌表面タンパク質Ａの発現ベクター）を哺乳動物へ投与することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。いくつかの実施形態において、当該免疫応答は、少なくとも１つの連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌以外の種に対して交差反応性である。
【００２１】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含む哺乳動物発現ベクターを、哺乳動物に対して投与し；さらに、精製されたニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントを、哺乳動物に対して投与して、これらの投与の組み合わせにより、哺乳動物における肺炎連鎖球菌のニューモリシンに対する免疫応答を誘発することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を特徴とする。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記哺乳動物には、前記発現ベクターを、少なくとも２つの、３つの、またはそれ以上の異なる用量で投与する。当該用量には、必要であれば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日数を置く。
【００２３】
いくつかの実施形態において、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントの投与は、前記発現ベクターの投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日数後である。
【００２４】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌以外の細菌の多糖類に共役したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、哺乳動物へ投与されると前記肺炎連鎖球菌以外の細菌に対する免疫応答を誘発する、組成物を特 徴とする。
【００２５】
いくつかの例を挙げると、前記肺炎連鎖球菌以外の細菌は、肺炎球菌、インフルエンザ菌タイプｂ、髄膜炎菌グループＡ、ＢまたはＣ、およびグループＢ連鎖球菌タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩＩからなる群から選択される。かような組成物は、当該組成物の有効量を哺乳動物に対して投与して、哺乳動物における肺炎連鎖球菌以外の細菌に対する免疫応答を誘導することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導するために用いられうる。
【００２６】
他の形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物またはポリペプチドに対して結合する（例えば、選択的に結合する）精製された抗体を特徴とする。例えば抗体は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に共役したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており（例えば、カルボキシ末端で）、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、組成物に対して特異的に結合しうる。かような抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。本明細書に記載の抗体を分泌する、ハイブリドーマのような細胞系が調製されうる。当該抗体は、精製された抗体の治療上または予防上有効量を哺乳動物に対して投与することにより、哺乳動物における肺炎連鎖球菌感染を治療または予防しうる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明の利点は、肺炎連鎖球菌の第１の血清型の多糖類−ポリペプチド共役体が、予期せぬことに、肺炎連鎖球菌の第２の血清型による感染に対する交差耐性を提供しうるということである。かような交差耐性によれば、肺炎連鎖球菌の２種以上の血清型による感染の治療または予防における所定の共役体の有効性が増大しうる。従って、それぞれに特異的な血清型を有する共役体を必ずしも提供することなく、肺炎連鎖球菌の複数の血清型に対する耐性が提供されうる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明の他の利点は、シュードニューモリシンポリペプチドが溶血作用を示さないということである。従って、かようなシュードニューモリシン共役体ベクターは、溶血作用を示す天然に存在するニューモリシンまたは部分的に溶血作用を示すトキソイド化ニューモリシンを含む組成物と比較して、毒性が低減されているかまたは消失している。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明の他の利点は、ニューモリシン断片をコードする発現ベクターは、ニューモリシン点変異体をコードする核酸とは対照的に、復帰突然変異によって溶血作用を示す毒性タンパク質をコードする虞が少ないということである。
【００３０】
前記ニューモリシン断片は、ニューモリシンの溶血作用に関与している領域を欠失していることから、前記発現ベクターのヌクレオチド配列におけるどのような変異によっても、毒性が再生することはありえない。
【００３１】
そうでないと定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同様である。適当な方法および材料を以下に記載するが、本発明を実施または試験する際には、本明細書に記載されるのと類似のまたは等価な方法および材料が用いられうる。本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により引用される。専門用語における争いが生じた場合には、本明細書が優先する。また、記載される材料および方法は例示のみを目的とし、限定を意図するものではない。
【００３２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図２】図２は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図３】図３は、血清型１８Ｃの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図４】図４は、血清型１８Ｃの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図５】図５は、血清型１９Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図６】図６は、血清型１９Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図７】図７は、血清型２３Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図８】図８は、血清型２３Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図９】図９は、血清型４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１０】図１０は、血清型４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１１】図１１は、血清型６Ｂの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１２】図１２は、血清型６Ｂの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１３】図１３は、血清型９Ｖの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１４】図１４は、血清型９Ｖの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１５】図１５は、肺炎連鎖球菌の血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体の３回目の注射後の肺炎連鎖球菌の血清型１４の多糖類に対する抗体の応答を示すグラフである。
【図１６】図１６は、シュードニューモリシンＤＮＡのワクチン投与のためにプライム−ブースト法を用いた、ウサギにおけるニューモリシンに対する抗体の応答を示すグラフである。
【図１７】図１７は、肺炎球菌の表面タンパク質ＡのＤＮＡワクチンをコードする発現ベクターの注射後の抗体の応答を示すグラフである。
【図１８】図１８は、オートリシンのＤＮＡワクチンをコードする発現ベクターの注射後の抗体の応答を示すグラフである。
【図１９】図１９は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型１４に感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２０】図２０は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型７に感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２１】図２１は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型６Ｂに感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２２】図２２は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型１８Ｃに感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２３】図２３は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型２３Ｆに感染したマウスにおける、感染１時間後の細菌の減少を示すグラフである。
【図２４】図２４は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型２３Ｆに感染したマウスにおける、感染３時間後の細菌の減少を示すグラフである。
【図２５】図２５は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型２３Ｆに感染したマウスにおける、感染５時間後の細菌の減少を示すグラフである。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、肺炎球菌感染を治療または予防するための組成物および方法を提供する。本明細書に記載のポリペプチド、多糖類−ポリペプチド共役体、および発現ベクターは、哺乳動物に対して投与されると、当該哺乳動物において抗肺炎球菌免疫応答を誘導する。これらの組成物は、個体に予防接種するために予防的に、および／または、感染した個体における治療的な免疫応答を誘導するために、用いられうる。
【００３５】
多糖類−タンパク質共役体
ポリペプチドは、共有結合または非共有結合の方法により、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に共役しうる。一般的に、この共役体のポリペプチド成分は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質または肺炎連鎖球菌の変異型ニューモリシンタンパク質の一部を含み、アミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており、そして溶血作用を示さない。この多糖類−ポリペプチド共役体は、哺乳動物に対して投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発する。当該免疫応答は、前記ポリペプチド、前記多糖類、または前記ポリペプチドおよび前記多糖類の組み合わせに対するものであってもよい。
【００３６】
この共役体のポリペプチド成分は、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されてもよく、自然源から精製されてもよく、または化学的に合成されてもよい。一般的に、前記ポリペプチド成分は、アミノ酸配列の点で天然に存在する肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質とは異なる。肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａニューモリシンポリペプチドの配列は、配列番号１で示される（実施例１を参照）。共役体のポリペプチド成分の例としては、以下に制限されないが、配列番号１のアミノ酸１〜４６０、１〜４６１、１〜４６２、１〜４６３、１〜４６４、１〜４６５、１〜４６６、１〜４６９、および１〜４７０が挙げられる。
【００３７】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の断片型および／または変異型をコードする核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製されうる。かようなタンパク質をコードする核酸は、特定の発現系に好ましい、または好ましくないコドンを有することで選別されうる。例えば、前記核酸は、その配列が大腸菌、酵母、ヒト、昆虫、またはＣＨＯ細胞における発現に最適となるように、少なくとも１つのコドン、好ましくはコドンの少なくとも１０％、または２０％が改変されている。
【００３８】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の断片型および／または変異型をコードする核酸は、（１）オートリシン、表面タンパク質Ａ、ノイラミニダ−ゼ、ヒアルロン酸塩溶解物、コリン結合タンパク質Ａなどの他の肺炎球菌のタンパク質、あるいは（２）インフルエンザ菌ｂ、髄膜炎菌グループＡ、ＢもしくはＣ、または連鎖球菌グループＢなどの有機体からの肺炎球菌以外のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合しうる。かような融合タンパク質をコードする核酸は、発現系において発現しうる。
【００３９】
ニューモリシン断片は、宿主において予め多糖類の担体に対する抗体が存在していない場合に、かような多糖類の担体として有用である。ニューモリシンは肺炎球菌感染における毒性因子であり、異なるサブタイプを有する肺炎球菌間でのニューモリシンの抗原性の変動はほとんどない。
【００４０】
多糖類−タンパク質共役体は、ヒトのような哺乳動物に対して投与されると、量、型、および／または期間の点で、多糖類成分単独での哺乳動物への投与により誘導される免疫応答を超える免疫応答を誘導する。従って、前記ポリペプチド成分は、かような向上した免疫応答を誘導するのに充分な長さでなければならない。肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質のフラグメントについて、当該フラグメントは少なくとも８、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４２５、４５０、４６０、４６５、４６０、４６５、またはそれを超えるアミノ酸長である。肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質由来の配列の異なるポリペプチドについて、当該ポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれを超えて、例えば配列番号１の肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質と一致する。
【００４１】
前記ポリペプチド成分は、好ましくは、肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質に存在する溶血作用を示さない。一般的に、前記ポリペプチド成分は、肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質の溶血作用の３０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満の溶血作用しか示さない。溶血作用は、実施例３で詳述するように測定されうる。一般的に、ポリペプチドの溶血作用は、ポリペプチドを赤血球（例えば、ヒツジ赤血球）とインキュベートし、当該ポリペプチドにより誘導された溶血を測定することにより決定されうる（典型的な溶血アッセイの説明については、例えば、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２１：２１７−２２２を参照）。
【００４２】
前記共役体の多糖類成分は、肺炎連鎖球菌の任意の莢膜多糖類であり、以下に制限されないが、サブタイプ１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、３３Ｆ、または３４が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記莢膜多糖類は、サブタイプ４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記多糖類は、血清型１４である。他の実施形態において、前記多糖類は、血清型１８Ｃである。１または２以上の異なる莢膜多糖類が、単一のまたは複数のポリペプチドに共役しうる。例えば、多価共役体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる莢膜多糖類を含みうる。多糖類は、例えばモノマー性の結合（多糖類の一方の末端のみがポリペプチドに連結される）、環状の結合（単一のポリペプチドが環状の多糖類に連結される）、または架橋（複数の多糖類が複数のポリペプチドに連結される）を介してポリペプチドに共役しうる。
【００４３】
ポリペプチド（例えば、シュードニューモリシンポリペプチド）を精製するための方法は実施例に記載されており、ポリペプチドへの多糖類の共役は実施例４に記載されている。ポリペプチドまたは多糖類の精製および共役プロセスに関するさらなる詳細は、例えば、米国特許第４，２４２，５０１号、米国特許第４，６８６，１０２号、米国特許第５，６２３，０５７号、および米国特許第５，５６５，２０４号に記載されている。
【００４４】
本明細書に記載の共役体またはポリペプチドは、哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（予防的および／または治療的免疫応答）を誘発する目的で、哺乳動物に対して投与されうる。共役体またはポリペプチドを含有する薬剤組成物は、製薬上許容しうる担体、緩衝液、または、以下に制限されないが、生理食塩水もしくは他の注射用液体などのワクチンに適当な保存剤においてデリバリーされうる。ワクチンに汎用される添加剤（例えば、ラクトースまたはソルビトールのような安定化剤、およびリン酸アルミニウム、水酸化物、もしくは硫酸塩およびステアリルチロシンのような免疫応答を増強させるためのアジュバント）もまた、存在してもよい。製造されるワクチンはまた、複数の感染性物質に対する免疫応答を誘発する多価ワクチンの成分として用いられうる。
【００４５】
前記組成物は、本技術分野において周知の手法により（例えば、経口で、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮内に、腹腔内に、鼻腔内に、肺内に、眼内に、膣内に、直腸内に、または皮下に）投与されうる。前記組成物は、例えば、前記共役体を含有する溶液または粉末の吸入により、胃腸管または呼吸管中に導入されうる。いくつかの実施形態において、前記組成物は、皮膚パッチを介して投与されうる。
【００４６】
薬剤組成物（例えば、ワクチン）は、免疫応答の一部である抗体の産生を誘発するのに充分な量で投与される。任意の所定の患者に対する用量は、患者のサイズ、健康状態、性別、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、投与時間および投与経路、並びに同時に投与されている他の薬剤などの多くの要因に依存する。最適用量の決定は、通常の技能を有する薬理学者の能力の範囲内に充分に含まれる。
【００４７】
組成物が宿主哺乳動物において免疫応答を誘発する能力は、免疫応答を測定するための本技術分野において周知の方法を用いることにより試験されうる。例えば、細胞障害性Ｔ細胞の生成は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞間のサイトカインの発現もしくは分泌を測定することにより、または主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）テトラマーを用いることにより、立証されうる。Ｔ細胞活性化に起因するサイトカインプロファイルを測定するためには、酵素免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または酵素免疫スポット（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（ＥＬＩＳＰＯＴ）のような標準的なアッセイが用いられうる。Ｔ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みおよび、本技術分野において周知の他のアッセイを用いて測定されうる。Ｂ細胞の応答は、ＥＬＩＳＡのような本技術分野において認識されているアッセイを用いて測定されうる。他の手法もまた用いられうる。疾病に関連する病原体に対する、または他の病原体レベルに対する前記共役体の効果（例えば、共役体を用いて処置された感染マウスにおける肺炎球菌の減少）を一般的に評価するためには、他の方法論もまた、用いられうる。
【００４８】
本明細書に記載の組成物は、肺炎連鎖球菌による感染または当該感染に関連する症状を予防または治療するための医薬の製造に用いられうる。
【００４９】
抗体
多糖類、ニューモリシン、またはこれらの組み合わせに対する抗体は、第１の個体から第２の個体を免疫する目的で（例えば、肺炎連鎖球菌に対する第２の個体の免疫応答を増大させる目的で、または第２の個体が易感染性患者である場合に応答を提供する目的で）、予防的なまたは治療的な適用に用いられうる。多糖類、ニューモリシン、またはこれらの組み合わせに対する抗体は、免疫応答性宿主において生成し（例えば、本明細書に記載の共役体を免疫応答性宿主に対して投与することにより）、前記宿主から回収され、治療または予防の必要性に応じてレシピエントに輸血され、これによりニューモリシン毒に対するだけではなく肺炎連鎖球菌および、前記共役体（例えば、前記共役体の多糖類成分）により誘発される抗体に結合する他の任意の可能な細菌に対する耐性が、レシピエントに付与される。
【００５０】
本明細書に記載の組成物により誘発される抗体は、薬剤組成物として配合され、個体に対して予防的または治療的免疫応答を付与するために用いられうる。薬剤組成物の投与に適当な成分および方法は、本明細書に記載されている。受動免疫を誘発するために、前記薬剤組成物はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらのフラグメントの誘導体を含んでもよい。薬剤組成物は、標準的な臨床的技術により決定されるような、予防上または治療上有効量の抗体、フラグメント、または誘導体を含む。
【００５１】
肺炎球菌ポリペプチドをコードする核酸
肺炎球菌ポリペプチドまたは肺炎球菌ポリペプチドのフラグメントもしくは変異体をコードする核酸は、哺乳動物における予防的および／または治療的免疫応答を引き起こす目的で、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されうる。当該免疫応答は、抗肺炎球菌の液性および／または細胞性免疫でありうる。
【００５２】
前記核酸構築物によりコードされうるポリペプチドとしては、本明細書に記載の共役体のポリペプチド成分、実施例に記載のシュードニューモリシンポリペプチド、並びにオートリシンおよび肺炎球菌の表面タンパク質Ａおよびそのフラグメントおよび変異体が挙げられる。さらに、核酸は、２以上のかようなポリペプチド、フラグメント、または変異体をコードしうる。
【００５３】
核酸発現構築物は、組み換えＤＮＡの標準的な手法を用いて調製されうる。ポリペプチドをコードする核酸の発現を促進させる目的で、構築物中には制御エレメントが含まれうる。これらのエレメントとしては、ヒトまたは他の哺乳動物細胞における発現を増強させるための配列（例えば、プロモータ、コーディング配列の５’側および／または３’側のＲＮＡ安定化配列、イントロン（コーディング配列の内部またはこれに隣接する任意の位置に配置されうる）、およびポリ（Ａ）付加部位）、並びに、複製開始部位および、構築物の複製および原核および／または真核宿主における選択を可能とする選択可能なマーカーをコードする１以上の遺伝子が挙げられる。必要であれば、Ｔ７プロモータまた他のタイプのプロモータ（例えば、組織特異的プロモータもしくは筋特異的プロモータのような細胞特異的プロモータ）が、コーディング配列の５’末端に存在してもよく、また、必要であれば、ＦＬＡＧまたは他のｍＡｂ決定因子をコードする配列が、コーディング配列の３’末端に存在してもよい。前記構築物はまた、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列のような他の転写および翻訳シグナルを含んでもよい。
【００５４】
前記構築物は、コードされたポリペプチドを所望の細胞内区画へと指向する、前記ポリペプチドに連結された標的化シグナルをコードする配列をさらに含んでもよく、前記標的化シグナルとしては、標的化シグナルは、コードされたポリペプチドを、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、核、リソソーム、クラスＩＩペプチドローディング区画、またはエンドソームへと指向するものであってもよく、シグナルペプチド、ＥＲ残留ペプチド、およびリソソーム標的化ペプチドが挙げられる。
【００５５】
前記核酸は、哺乳動物の細胞中での発現を可能とする任意のベクター中で用いられうる。当該ベクターは、例えば、プラスミドまたは細菌ベクターのような非ウイルスベクター、組み込み型ウイルスベクター、または非組み込み型ウイルスベクターであってもよい。適当なベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ哺乳動物発現ベクターのファミリー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））があり、これによればＰＣＲ産物の直接かつ迅速なクローニングが可能となる。
【００５６】
ポリペプチドをコードする核酸を適切な細胞へとデリバリーする目的で、種々のデリバリーシステムが用いられうる。ポリペプチドをコードする核酸は、生理食塩水のような製薬上許容しうる担体中で、またはコロイド性懸濁液として、または粉末として、希釈剤を用いてもしくは用いずに、デリバリーされうる。前記核酸は「裸」であってもよいし、デリバリーベヒクルと関連していてもよく、脂質、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロ粒子、またはマイクロカプセル、金粒子、ＩＳＣＯＭＳ、ナノ粒子、ポリマー、縮合剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、ＱＳ２１、吸着増強剤、アジュバント、または脂肪酸のような本技術分野において周知のデリバリーシステムを用いてデリバリーされうる。核酸はまた、インビトロまたはインビボで、エレクトロポレーションを用いて、細胞（例えば、骨格筋細胞）へとデリバリーされうる。
【００５７】
核酸は、標準的な方法（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７６：１４５， １９９４、および、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：３４１， １９９５に記載の方法）を用いて投与されてもよく、本技術分野において周知の方法によって（例えば、経口で、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮内に、腹腔内に、鼻腔内に、肺内に、眼内に、膣内に、直腸内に、または皮下に）患者にデリバリーされうる。拡散は、例えば、当該核酸を含有する溶液または粉末の吸入により、胃腸管または呼吸管中に導入されうる。投与は局所的であってもよいし、全身的であってもよい。
【００５８】
個体に対しては、約１００〜２０００μｇ核酸の用量が投与されるであろうと予想される。患者が成人のヒトの場合、予防接種の手法としては、例えば、マイクロ粒子中でデリバリーされるときには１０〜１０００μｇのプラスミドＤＮＡを、筋肉内、皮内、吸入、または皮下へ投与すること、または、約１０〜２５００μｇ（例えば、１００〜２０００、もしくは５００〜１０００μｇ）の裸のプラスミドＤＮＡを、３〜６回繰り返して、筋肉内にまたは皮内に投与することが挙げられる。医療の技術分野においては周知のように、任意の所定の患者に対する用量は、患者のサイズ、健康状態、性別、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、投与時間および投与経路、並びに同時に投与されている他の薬剤などの多くの要因に依存する。最適用量の決定は、通常の技能を有する薬理学者の能力の範囲内に充分に含まれる。
【００５９】
他の標準的なデリバリー方法（例えば、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）移入またはエクスビボ処置）もまた、用いられうる。エクスビボ処置においては、樹状細胞、末梢血単核細胞、または骨髄細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、患者または適切なドナーから得られ、核酸を用いてエクスビボで活性化され、次いで患者に対して移植または再注入されうる。
【００６０】
核酸は、単独でまたは本技術分野において周知の他の治療法（例えば、抗微生物剤）と組み合わせて投与されうる。さらに、核酸は、本技術分野において周知のように、免疫応答を増強するように設計された他の治療法と組み合わせて（例えば、アジュバント、サイトカイン（もしくはサイトカインをコードする核酸）、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと一緒の投与により）投与されうる。
【００６１】
核酸が宿主哺乳動物において免疫応答を誘発する能力は、免疫応答を測定するための本技術分野において周知の方法を用いることにより試験されうる。例えば、細胞障害性Ｔ細胞の生成は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞間のサイトカインの発現もしくは分泌を測定することにより、またはＭＨＣテトラマーを用いることにより、立証されうる。Ｔ細胞活性化に起因するサイトカインプロファイルを測定するためには、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴのような標準的なアッセイが用いられうる。Ｔ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みおよび、本技術分野において周知の他のアッセイを用いて測定されうる。Ｂ細胞の応答は、ＥＬＩＳＡのような本技術分野において認識されているアッセイを用いて測定されうる。他の手法もまた用いられうる。疾病に関連する病原体に対する、または他の病原体レベルに対する前記共役体の効果（例えば、共役体を用いて処置された感染マウスにおける肺炎球菌の減少）を一般的に評価するためには、他の方法論もまた、用いられうる。
【００６２】
本明細書に記載の核酸は、肺炎連鎖球菌による感染または当該感染に関連する症状を予防または治療するための医薬の製造に用いられうる。
【００６３】
本発明を下記の実施例によりさらに説明するが、当該実施例により特許請求の範囲に記載の発明の技術的範囲は限定されない。
【実施例】
【００６４】
実施例
実施例１：シュードニューモリシン発現ベクターの構築
断片型のニューモリシンポリペプチドを発現するベクターを、実施例１Ａ〜１Ｅ二記載する。「シュードニューモリシン」と称される、コードされる断片型のポリペプチドは、共役ワクチンを調製する目的で肺炎球菌の多糖類に共役させるために用いられうる。さらに、シュードニューモリシンをコードするポリペプチドは、コードされるポリペプチドに対する免疫応答を生じさせる目的で個体に投与されうる。
【００６５】
肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行い、ニューモリシン遺伝子の種々のフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応に用いたセンスプライマーは、翻訳開始コドンのすぐ上流のニューモリシン遺伝子のコーディング配列にアニールし、特異的な制限酵素部位を組み込んだ。ＬＹＳＮ−１と称されるセンスプライマー：
【００６６】
【化１】
【００６７】
は、ニューモリシン遺伝子の５’末端のヌクレオチド１〜２４に相補的である。ＬＹＳＮ−３と称されるアンチセンスプライマー：
【００６８】
【化２】
【００６９】
は、ニューモリシン遺伝子の３’末端のヌクレオチド１３９６〜１４１３に相補的である。このプライマーは、４７１アミノ酸の全長ニューモリシンタンパク質をコードする１４１３塩基対のＤＮＡを増幅する。肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａのニューモリシンポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【００７０】
【化３】
【００７１】
ＰＣＲは一般的に、以下のように行った：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、および７２℃にて１．５分間を３０サイクル；並びに、７２℃にて１０分間を１サイクル。ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクター中にライゲーションした（これにより、ｐＳＡ−１４を作製）。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いた消化により、インサートの存在を確認した。
【００７２】
増幅したＤＮＡフラグメントは、野生型のゲノム配列と比較して、３’末端のヌクレオチドを欠失している。これらの修飾核酸によりコードされるシュードニューモリシンポリペプチドの多くは、非溶血性であり、非毒性であるが、免疫原性は保持していることが判明した。
【００７３】
Ａ．ｐＳＡ−１発現ベクターの構築
ｐＳＡ−１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６０からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００７４】
【化４】
【００７５】
および、ＬＳＹＮ−４プライマー：
【００７６】
【化５】
【００７７】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１３８０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【００７８】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【００７９】
コードされる４６０アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する１１アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【００８０】
【化６】
【００８１】
Ｂ．ｐＳＡ−４９発現ベクターの構築
ｐＳＡ−４９発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６４からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００８２】
【化７】
【００８３】
および、ＬＳＹＮ−５４プライマー：
【００８４】
【化８】
【００８５】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１３９２塩基対のＤＮＡを増幅した。
【００８６】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−４９を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【００８７】
コードされる４６４アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する７アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【００８８】
【化９】
【００８９】
Ｃ．ｐＳＡ−１１発現ベクターの構築
ｐＳＡ−１１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６６からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００９０】
【化１０】
【００９１】
および、ＬＳＹＮ−１７プライマー：
【００９２】
【化１１】
【００９３】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１３９８塩基対のＤＮＡを増幅した。
【００９４】
ＰＣＲにより合成した上記のＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−１１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【００９５】
コードされる４６６アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する５アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【００９６】
【化１２】
【００９７】
Ｄ．ｐＳＡ−３２発現ベクターの構築
ｐＳＡ−３２発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６９からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００９８】
【化１３】
【００９９】
および、ＬＳＹＮ−３７プライマー：
【０１００】
【化１４】
【０１０１】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１４０７塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１０２】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−３２を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【０１０３】
コードされる４６９アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する２アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【０１０４】
【化１５】
【０１０５】
Ｅ．ｐＳＡ−３１発現ベクターの構築
ｐＳＡ−３１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４７０からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【０１０６】
【化１６】
【０１０７】
および、ＬＳＹＮ−３８プライマー：
【０１０８】
【化１７】
【０１０９】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１４１０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１１０】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−３１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【０１１１】
コードされる４７０アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する１アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【０１１２】
【化１８】
【０１１３】
実施例２：組み換えシュードニューモリシンポリペプチドの発現、精製、および特性
実施例１に記載されているように、ｐＥＴ発現ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングした。組み換えＤＮＡで大腸菌を形質転換し、形質転換体を、抗生物質を含有するプレート上で選択した。インサートＤＮＡの配列を、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。組み換え大腸菌を３７℃にて一晩増殖させ、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を誘導剤として培地に添加し、この細胞を続けて３時間増殖させた。発現した組み換えポリペプチドを、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価した。アフィニティクロマトグラフィを用いて組み換えポリペプチドを精製し、ヒツジまたはヒトの赤血球を用いた溶血アッセイにより溶血作用を試験した（実施例３に詳述する）。
【０１１４】
実施例３：シュードニューモリシンポリペプチドの溶血作用の決定
以下の手法に従って、コードされたポリペプチドの溶血作用を決定した。
【０１１５】
１）ヒトまたはヒツジの赤血球の２％懸濁液を調製する。０．２ｍＬの新鮮な血球を１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に添加する。この懸濁液を３０００ｒｐｍにて３０秒間スピンさせ、ペレットを１０ｍＬのＰＢＳに３回再懸濁させる。
【０１１６】
２）１μｇのポリペプチドを０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に添加し、０．５ｍＬの洗浄した２％ＲＢＣ懸濁液と混合する。
【０１１７】
３）この混合物を３７℃にて１時間インキュベートし、次いで、エッペンドルフマイクロ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）中で１０，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離する。
【０１１８】
４）５４１ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定する。全長ニューモリシンポリペプチドと比較したＯＤ吸収の百分率として、溶血作用を測定する。
【０１１９】
表１に示すように、Ｃ末端の７、６、２、または１アミノ酸を欠失しているニューモリシンの断片は溶血作用を示さなかった。Ｃ末端の５アミノ酸を欠失している断片では、溶血作用の一部が失われていた。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
実施例４：多糖類−タンパク質共役体の調製
Ａ．多糖類の酸化
肺炎球菌の莢膜多糖類（例えば、４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８、１９Ｆ、および２３Ｆ）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、ヴァージニア州）から購入した。１０ｍｇの多糖類を、４℃にて一晩、１ｍＬの蒸留水に溶解させた。次の日に、１ｍＬの０．２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加した。室温にて１０分間、暗室で２ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（ＭＷ：２１３．９、シグマ）と反応させることにより、多糖類を酸化させた。最終濃度２５ｍＭのエチレングリコール（ＭＷ：６２．０７）との反応により、過剰な過ヨウ素酸ナトリウムを分解させた。多糖類を含有する反応混合物を、１０００ｍＬの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で３回、充分に透析した。
【０１２２】
Ｂ．イムノ−アフィニティカラムの調製
（ｉ）全長Ｈｉｓ−タグニューモリシンの精製
大腸菌（Ｃ−Ｈｉｓタグニューモリシンを含有するｐＥＴ２４ｂ）を、４０μＬの２０％グルコースおよび４μＬの５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する４ｍＬのＬＢ培地中で増殖させ、３７℃にて一晩、１６０ｒｐｍで連続振盪しながらインキュベートした。一晩培養した培地の３ｍＬを、１ｍＬの２０％グルコースおよび１００μＬの５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃にて１６０ｒｐｍで連続振盪しながら、ＯＤ６００が０．４〜０．５に達するまでインキュベートした。４００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを、ＩＰＴＧの最終濃度が４ｍＭとなるように、１００ｍＬの培地に移した。遺伝子発現の誘導の３時間後に、４０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離によって細胞を回収した。インビトロジェン（カールスバッド、カリフォルニア州）により提供されるプロボンド精製システム（ＰｒｏＢｏｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）の手法に従って、全長Ｈｉｓ−タグニューモリシンを精製した。
【０１２３】
（ｉｉ）Ｈｉｓ−タグニューモリシンに対するポリクローナル抗体の製造
ニュージーランド白ウサギの４箇所の異なる部位に、それぞれ２５μｇの４つの等量の乳化Ｈｉｓ−タグニューモリシンおよびタイターマックス（ＴｉｔｅｒＭａｘ）アジュバント（４００μＬの１ｍｇ／ｍＬ Ｈｉｓ−タグニューモリシンおよび４００μＬのタイターマックスアジュバント）を注射した；それぞれの大腿筋（ｉ．ｍ．）にそれぞれ１箇所、および、背中の縦方向の筋に沿って脊椎のそれぞれの側の皮下（ｓ．ｃ．）。１４日後、上記のウサギから耳静脈経由で５ｍＬの血液を回収した。
【０１２４】
血清からの抗体の力価が１：３０００の希釈レベルに達していれば、その動物からは最終的に血液を採取した。抗体の力価が１：３０００未満であれば、第２の用量の抗原を注射し、当該動物を１週間後に試験した（第２の用量の７日後）。このサイクルを、充分な力価が達成されるまで続けた。
【０１２５】
（ｉｉｉ）アフィ−ゲル（Ａｆｉ−Ｇｅｌ）タンパク質Ａアガロースを用いたウサギＩｇＧの精製
Ｈｉｓ−タグニューモリシンを用いて免疫されたウサギからの血清を、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．２）を用いて平衡化したアフィ−ゲルタンパク質Ａカラムにアプライした。１０ベッド体積を用いて洗浄した後、２〜５体積の１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いて免疫グロブリンを溶出させた。溶出したＩｇＧを回収してプールし、２８０におけるＯＤを測定した。３ｍＬの精製ＩｇＧを１０ＤＧカラムにさらにアプライし、カラムから溶出した最初の３ｍＬを捨てた。このカラムに、３．５ｍＬのカップリング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５）または０．１Ｍの３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液のいずれかを添加した。３．５ｍＬの溶出ＩｇＧを回収しプールして、さらにアフィ−ゲルＨｚまたはアフィ−ゲル１０のいずれかとカップリングさせた。
【０１２６】
（ｉｖ）アフィ−ゲル１０へのＩｇＧのランダムカップリングを用いたイムノアフィニティカラムの調製
アフィ−ゲル１０は、誘導体化された架橋アガロースゲルビーズ担体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、第１級アミンを介して全てのリガンドとカップリングする。ＩｇＧとのカップリングのために、アフィ−ゲル１０を１５ｍＬチューブに移し、冷ＤＤＨ２Ｏで３回、および冷０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。予め洗浄されたアフィ−ゲル１０を含む１５ｍＬチューブに精製ＩｇＧを添加し、４℃にて４時間逆さまに回転させた。１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を添加しさらに４℃にて０．５時間で、アフィ−ゲル１０の残留活性エステルをブロックした。このゲルを１．５×９．０ｃｍのカラムに移した。カラムの溶出液を回収し、２８０でのＯＤを測定した。２ベッド体積の０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いて、このアフィ−ゲル１０イムノアフィニティカラムを洗浄した。カラムの溶出液を再度回収し、２８０でのＯＤを測定した。全ＩｇＧおよび非カップリングＩｇＧの濃度に基づき、カップリング効率を算出した。
【０１２７】
（ｖ）イムノアフィニティカラムの試験
イムノアフィニティカラムを試験するために、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィからのシュードニューモリシンを含む画分を、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％トリトンＸ−１００に添加した。０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化された６．５ｍＬのアフィ−ゲルカラム（１，５×１２ｃｍ）に、この試料を１ｍＬ／２分の流速でアプライした。フロースルー画分を回収した。１５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いて、このカラムを２〜３回洗浄した。５ｍＬの４Ｍ尿素を用いてこのカラムを再度洗浄した。７ｍＬの４Ｍ尿素を用いて、結合したシュードニューモリシンタンパク質を２回溶出させた。最初の７ｍＬの４Ｍ尿素画分からのタンパク質試料を、９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブリリアントブルーＲ−２０で染色することにより可視化した。
【０１２８】
Ｃ．組み換えシュードニューモリシンタンパク質の調製
発現ベクターｐＳＡ−４９（ニューモリシンのＣ末端の７アミノ酸を欠失しているポリペプチドをコードする；実施例１を参照）で形質転換された細菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する３０ｍＬのＬＢ培地を含む５０ｍＬチューブ中で、３７℃にて一晩増殖させた。翌朝、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．２％のグルコースを含有する、１Ｌフラスコ中の４００ｍＬのＬＢ培地に、一晩培養物の１３ｍＬを接種し、３７℃にて振盪しながらインキュベートした。０．５のＡ６００に相当する細胞密度で、２または４ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、シュードニューモリシンタンパク質を３時間誘導した。
【０１２９】
５００ｍＬ遠心チューブ中で６，５００ｒｐｍにて１０分間、細菌を遠心分離した。１００μｇ／ｍＬのリゾチームを含む４０ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に細菌ペレットを再懸濁させ、氷上で１５分間インキュベートし、氷上で１０秒間のバーストで３回超音波分解した。溶解物を−８０℃にて１０分間凍結させて、３７℃にて５分間融解させた。この細胞溶解物に、超音波分解−凍結−融解によりさらに２回処理した。６，０００ｒｐｍにて２０分間の遠心分離により、不溶性の細胞の破片を除去した。上清の溶解物を、さらに０．８μＭフィルタを通過させた。フロースルータンパク質を９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により試験し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色により可視化した。未精製の溶解物を、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィによりさらに精製した。
【０１３０】
２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを含むカラム（５×１２ｃｍ）に、２０ｍＬの未精製の細菌溶解物をロードした。最初のフロースルーを回収した後、１０ｍＬの２５ｍＭトリス塩酸をカラムに添加した。１０ｍＬのフロースルーを回収し、最初のフロースルー画分とプールした（画分１）。次いで、３５ｍＬの２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）をアプライし、フロースルーを回収した（画分２）。さらに３５ｍＬの２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）をアプライし、フロースルーを再度回収した（画分３）。４Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸を用いて、結合している細菌タンパク質を溶出させた（画分４）。２８０ｎｍでのＯＤを測ることにより、各画分中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質試料を９％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クマシーブルーＲ−２０で染色して可視化した。シュードニューモリシンを含有するフロースルー画分（１および２）を、イムノアフィニティクロマトグラフィによりさらに精製した。
【０１３１】
ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィの後、シュードニューモリシンを含む画分を、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％トリトンＸ−１００に添加した。０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化した、ウサギ抗ニューモリシンＩｇＧをカップリングした６．５ｍＬのアフィ−ゲル１０カラム（１．５×１２ｃｍ）に、この試料を１ｍＬ／２分の流速でアプライした。フロースルー画分を回収した。１５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いてこのカラムを３回洗浄した。５ｍＬの４Ｍ尿素を用いてこのカラムを再度洗浄した。７ｍＬの４Ｍ尿素を用いて、結合しているシュードニューモリシンタンパク質を２回溶出させた。非結合画分および結合画分からのタンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブリリアントブルーＲ−２０での染色により可視化した。
【０１３２】
イムノアフィニティクロマトグラフィの後、シュードニューモリシンを含有する４Ｍ尿素溶出画分を、１０ＤＧクロマトグラフィによりさらに精製し、尿素を除去した。１×ＰＢＳ緩衝液で平衡化された１０ＤＧカラム（１．５×１２ｃｍ）に、３．０ｍＬの試料をアプライした。最初の３．０ｍＬのフロースルーを捨てた。このカラムに３．９ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液を添加した。カラムから回収したこの３．９ｍＬの画分について、２８０でのＯＤを測定し、タンパク質画分を回収した。９％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質の純度を評価した。
【０１３３】
Ｄ．多糖類−タンパク質共役体の調製
２μｇの肺炎連鎖球菌の多糖類１８Ｃを、還元アミノ化アッセイを用いた直接共役により、シュードニューモリシンタンパク質（上記の項Ｃに記載）に共役させた。酸化された多糖類反応混合物に、０．１Ｍ ＰＢＳ中の１０ｍｇのシュードニューモリシンを添加し、緩やかに撹拌しながら室温にて３０分間インキュベートした。シアノボロヒドリドナトリウムを、２０ｍＭの最終濃度で添加した（例えば、７５０μＬの１００ｍＭシアノボロヒドリドを、３ｍＬの酸化された多糖類とシュードニューモリシンとの混合物に添加した）。この混合物を緩やかに撹拌しながら室温にて５日間インキュベートした。この共役体を９，０００ｒｐｍにて１０分間沈殿させ、次いで１〜２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解させた。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（１．５×１００ｃｍ）を用い、この混合物をクロマトグラフにかけた。タンパク質および多糖類の双方を含む画分をプールし、アミコン セントリコン−３０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０）（分子量カットオフ３０，０００）により濃縮し、次いでタンパク質および多糖類の含量をアッセイした。
【０１３４】
実施例５：多糖類−タンパク質共役体に対するマウスの抗体応答
実施例４に記載のように調製した肺炎連鎖球菌１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、４、６Ｂおよび９Ｖの多糖類シュードニューモリシンタンパク質共役体について、マウスで多糖類およびニューモリシンに対する抗体を増強する能力を試験した。水酸化アルミニウムアジュバント（０．１ｍｇ／用量）と混合された多糖類の用量あたり０．３、１、３μｇの共役体を、雌のＮＩＨスイスマウスの群に腹腔内注射した。いくつかの実験では、第２のマウス群は１μｇの多糖類を投与され、および／または、第３のマウス群は１μｇのシュードニューモリシンを投与された。２週間の間隔でマウスに２回のブースターを投与した。最後の注射の７日後、抗多糖類抗体および抗ニューモリシン抗体の血清レベルを測定した。表２に、投与された特定の共役体および、それぞれ図１〜１４に示される実験で測定された免疫応答をまとめた。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
図１〜１４の説明文では以下の略語が用いられている：リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）；共役体（「Ｃ」）；水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａ」）；および、シュードニューモリシン（「ＰＰＮ」）。
【０１３７】
前記多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスでは、Ｈｉｓ−タグ野生型ニューモリシンを用いたＥＬＩＳＡに反応する抗体が誘導された。共役体およびアジュバントを投与された全ての群について、抗ニューモリシンおよび抗多糖類抗体のレベルがＰＢＳおよびアジュバントのコントロールよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１、ｔ−検定）。共役体を投与されたマウスの血清は、驚くべきことに、ＰＢＳ単独で投与されたマウスと比較して、血清希釈係数がそれぞれ７６８００および９６００と高力価の高ニューモリシンおよび高多糖類抗体を発現した。最高の抗ニューモリシンおよび抗多糖類抗体レベルは、３．０μｇの多糖類−ニューモリシン共役体を投与されたマウスにおいて観察された（図１〜１４）。アジュバントを投与したシュードニューモリシン群（図３）またはアジュバントを投与しなかったシュードニューモリシン群（図６）と比較して、多糖類−シュードニューモリシン共役体をアジュバントとともに投与された群で抗ニューモリシン抗体レベルが高かった。
【０１３８】
表３および４によれば、３．０μｇの共役体を投与されたマウスが最高の応答百分率を有していたことが示される。これらの結果から、多糖類のシュードニューモリシンタンパク質への共役によって肺炎球菌ワクチンの有効性が改善されうることが示唆される。抗体の応答に加えて、共役体ワクチンを投与されたマウスにおいては、交差反応性免疫および細菌の減少も試験した（実施例８を参照）。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
図１５は、マウスにおける、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体の３回目の注射の７日後の血清型１４の多糖類に対する抗体の応答を示すグラフである。図１５において、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３はそれぞれ、マウスあたり０．３μｇ、１，０μｇおよび３．０μｇの共役体ワクチンを注射されたマウスの群である。Ｇ４は、１．０μｇの血清型１４の多糖類を単独で注射されたマウスを示す。Ｇ５およびＧ６はそれぞれ、１．０および３．０μｇのシュードニューモリシンを単独で注射されたマウスの群である。Ｇ７は、１．０μｇの血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体ワクチンをアジュバントなしで注射されたマウスの群である。Ｇ４、Ｇ５およびＧ６のマウスでは、ほとんどまたは全く、多糖類に対する抗体の応答が観察されなかった。
【０１４２】
実施例６：シュードニューモリシン、肺炎球菌オートリシン、および肺炎球菌表面タンパク質ＤＮＡワクチンのための発現ベクターの構築
Ａ．ＤＮＡワクチンの構築のためのｐＶＡＸ１ベクター
ＤＮＡワクチンの開発に用いるために、ｐＶＡＸ１ベクター（インビトロジェン）を特異的に設計した。この構築は、１９９６年１２月２２日に出版された食品医薬品局の文書である「感染性疾患の予防的適応のためのプラスミドＤＮＡワクチンについて考慮すべきポイント」に沿ったものである。
【０１４３】
Ｂ．シュードニューモリシンのクローニングおよび発現
プライマーおよびテンプレートである肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡを含むレディトゥゴー（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ）ＰＣＲビーズ（アマシャム ファルマシア バイオテック インコーポレイテッド、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１．５分間を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。
【０１４４】
増幅したＰＣＲ産物を制限酵素を用いて消化し、ｐＶＡＸ１ベクターの部位へライゲーションし、ｐＳＡ−８、ｐＳＡ−４５、ｐＳＡ−１２、ｐＳＡ−４２、およびｐＳＡ−４１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、制限酵素を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、インサート遺伝子を分析した。ＴｎＴキットを用いて製造者の説明書（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）に従い、インビトロでの転写および翻訳を行って、インサート遺伝子の発現を確認した。
【０１４５】
ｐＳＡ−８発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６０からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、上記のように、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１４６】
【化１９】
【０１４７】
および、ＬＳＹＮ−４プライマー：
【０１４８】
【化２０】
【０１４９】
を用いて、１３８０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１５０】
次いで、この１３８０塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−８を作製した。
【０１５１】
ｐＳＡ−４５発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６４からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１５２】
【化２１】
【０１５３】
および、ＬＳＹＮ−１０５プライマー：
【０１５４】
【化２２】
【０１５５】
を用いて、１３９２塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１５６】
次いで、この１３９２塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−４５を作製した。
【０１５７】
ｐＳＡ−１２発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６６からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１５８】
【化２３】
【０１５９】
および、ＬＳＹＮ−１７プライマー：
【０１６０】
【化２４】
【０１６１】
を用いて、１３９８塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１６２】
次いで、この１３９８塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−１２を作製した。
【０１６３】
ｐＳＡ−４２発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６９からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１６４】
【化２５】
【０１６５】
および、ＬＳＹＮ−３７プライマー：
【０１６６】
【化２６】
【０１６７】
を用いて、１４０７塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１６８】
次いで、この１４０７塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−４２を作製した。
【０１６９】
ｐＳＡ−４１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４７０からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１７０】
【化２７】
【０１７１】
および、ＬＳＹＮ−３８プライマー：
【０１７２】
【化２８】
【０１７３】
を用いて、１４１０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１７４】
次いで、この１４１０塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−４１を作製した。
【０１７５】
非メチル化シトシン−グアニン（「ＣｐＧ」）ジヌクレオチドを特定の配列順またはモチーフ中に含む核酸は、インビトロにおける種々のタイプの免疫細胞の強力な刺激剤でありうる。ＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞を刺激して免疫グロブリン、ＩＬ−６およびＩＬ−１０、ＩＦＮ−γを産生するＮＫ細胞、並びにＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＴ−αおよびＩＦＮ−αを産生する単球および樹状細胞を増殖および分泌させることにより、先天的な免疫系を直接活性化しうる。２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンに連結された非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドからなるＤＮＡモチーフは、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生するＢ細胞を刺激し、ＩＬ−６およびＩＦＮ−ガンマを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激しうる。
【０１７６】
ニューモリシンの構造−機能分析によれば、システイン残基を含む、当該ポリペプチドのＣ末端のドメイン（アミノ酸４２７〜４３７に位置する）が細胞毒性に重要であることが示された。このシステインモチーフは、チオールにより活性化される細胞溶解素ファミリー間で高度に保存されている。このドメイン中での種々の一アミノ酸置換により、ニューモリシンの細胞毒性は有意に低下する。以下の核酸は、ニューモリシンのヌクレオチドの１２７２位および１２７４位に（部位特異的突然変異誘発法を用いて）ＧＡＧＣＧＴＴを導入することにより、このシステインモチーフをＣｐＧで置換している。ＧＡＧＣＧＴＴ免疫刺激性配列を含むこの変異核酸は、以下の通りである：
【０１７７】
【化２９】
【０１７８】
他の実施形態においては、Ｃ末端の３３ヌクレオチドを欠失したシュードニューモリシンのヌクレオチドの１２７２位および１２７４位に、（部位特異的突然変異誘発法を用いて）免疫刺激性ＤＮＡ配列であるＧＡＧＣＧＴＴを導入した。
【０１７９】
免疫刺激性配列を含むシュードニューモリシンＤＮＡは、以下の通りである：
【０１８０】
【化３０】
【０１８１】
Ｄ．肺炎球菌オートリシン遺伝子のクローニングおよび発現
ｐＳＡ−５９発現ベクターは、３１６アミノ酸のオートリシン（Ａｌｙ）ポリペプチドをコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＡｌｙ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５０℃にて１分間；７２℃にて１分間１５秒を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。このインサートは、ＬＳＹＮ−７４プライマー：
【０１８２】
【化３１】
【０１８３】
および、ＬＳＹＮ−８９プライマー：
【０１８４】
【化３２】
【０１８５】
を用いて、９４８塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１８６】
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、ＰＣＲで合成したＤＮＡを消化し、ｐＶＡＸ１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−５９（Ａｌｙ）を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、Ａｌｙインサートを確認した。ＴｎＴキットを用いて製造者の説明書（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）に従い、インビトロでの転写および翻訳を行って、ｐＳＡ−５９の発現を確認した。
【０１８７】
ｐＳＡ−５９Ａｌｙインサートの核酸配列は以下の通りである：
【０１８８】
【化３３】
【０１８９】
このｐＳＡ−５９Ａｌｙインサートによりコードされるアミノ酸配列は以下の通りである：
【０１９０】
【化３４】
【０１９１】
Ｅ．Ｎ末端肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）遺伝子のクローニングおよび発現
ｐＳＡ−６０発現ベクターは、４５９アミノ酸のＰｓｐＡポリペプチドをコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＰｓｐＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５０℃にて１分間；７２℃にて１分間１５秒を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。このインサートは、ＬＳＹＮ−９０プライマー：
【０１９２】
【化３５】
【０１９３】
および、ＬＳＹＮ−７８プライマー：
【０１９４】
【化３６】
【０１９５】
を用いて、１３７７塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１９６】
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、ＰＣＲで合成したＤＮＡを消化し、ｐＶＡＸ１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−６０（ＰｓｐＡ）を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、ＰｓｐＡインサートを確認した。ＴｎＴキットを用いて製造者の説明書（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）に従い、インビトロでの転写および翻訳を行って、ｐＳＡ−６０の発現を確認した。
【０１９７】
ｐＳＡ−６０ＰｓｐＡインサートの核酸配列は以下の通りである：
【０１９８】
【化３７】
【０１９９】
このｐＳＡ−６０ＰｓｐＡインサートによりコードされるアミノ酸配列は以下の通りである：
【０２００】
【化３８】
【０２０１】
実施例７：ＤＮＡワクチンの免疫原性
プラスミドベクターｐＳＡ−７は、全長ニューモリシンタンパク質をコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＰｌｙ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１．５分間を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。Ｐｌｙの５’末端のヌクレオチド１〜２４に相補的なＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０２０２】
【化３９】
【０２０３】
を、Ｐｌｙの３’末端のヌクレオチド１３９６〜１４１３に相補的なＬＳＹＮ−３プライマー：
【０２０４】
【化４０】
【０２０５】
とともに用いて、４７１アミノ酸の全長の野生型Ｐｌｙタンパク質をコードする１４１３塩基対のＤＮＡを増幅した。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて、ＰＣＲで増幅したこのＤＮＡフラグメントを処理し、ｐＶＡＸ１発現ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−７を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、血清型１９Ａの野生型Ｐｌｙ遺伝子インサートを確認した。
【０２０６】
プラスミドベクターｐＳＡ−１０は、Ｃ末端が断片化されたニューモリシンタンパク質（ＰｌｙのＣ末端の１１４アミノ酸を欠失している）をコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＰｌｙ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１．５分間を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。Ｐｌｙヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド１〜２４に相補的なＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０２０７】
【化４１】
【０２０８】
を、３’末端のヌクレオチド１０５４〜１０７１に相補的なＬＳＹＮ−６プライマー：
【０２０９】
【化４２】
【０２１０】
とともに用いて、３５７アミノ酸のポリペプチドをコードする１０７１塩基対のＤＮＡを増幅した。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて、ＰＣＲで増幅したこのＤＮＡフラグメントを処理し、ｐＶＡＸ１発現ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−１０を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、血清型１９Ａのシュードニューモリシン遺伝子インサートを確認した。
【０２１１】
プラスミドベクターｐＳＡ−２６は、ＣｐＧモチーフを有する全長ニューモリシンをコードする。３’末端にＣｐＧを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーＬＳＹＮ−３４およびＬＳＹＮ−３３を用いて、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２を作製した。第２のプライマーであるＬＳＹＮ−１５およびＬＳＹＮ−３はそれぞれ、ニューモリシンのＮ末端およびＣ末端の配列に相補的である。それぞれの増幅において、プライマーＬＳＹＮ−１５および３４（ＰＣＲ１）並びにＬＳＹＮ−３３および３（ＰＣＲ２）、並びに全長ニューモリシン遺伝子を含有するテンプレートｐＳＡ−７を含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、第１のＰＣＲ産物であるＰＣＲ１（１．２ｋｂ）およびＰＣＲ２（１５０ｋｂ）を作製した。第１のＰＣＲ産物を混合し、変性させ、第２のプライマーセットであるＬＳＹＮ−１５および３により作製される第２のＰＣＲ産物を作製するためのテンプレートとして用いた。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてこの第２のＰＣＲ産物を切断し、ｐＶＡＸ１のＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＳＡ−２６を作製した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１分間を３０サイクル；および、７２℃にて８分間を１サイクル。
【０２１２】
プライマーＬＳＹＮ−３、ＬＳＹＮ−１５、ＬＳＹＮ−３３、およびＬＳＹＮ−３４の配列は以下の通りである：
ＬＳＹＮ−３プライマー；
【０２１３】
【化４３】
【０２１４】
ＬＳＹＮ−１５プライマー；
【０２１５】
【化４４】
【０２１６】
ＬＳＹＮ−３３プライマー；
【０２１７】
【化４５】
【０２１８】
ＬＳＹＮ−３４プライマー；
【０２１９】
【化４６】
【０２２０】
この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、ＣｐＧモチーフを有する血清型１９Ａの野生型Ｐｌｙ遺伝子インサートを確認した。
【０２２１】
プラスミドベクターｐＳＡ−２７はＣｐＧモチーフを含み、ニューモリシンのＣ末端断片をコードする（１１アミノ酸を欠失している）。３’末端にＣｐＧを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーＬＳＹＮ−３４およびＬＳＹＮ−３３を用いて、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２を作製した。第２のプライマーであるＬＳＹＮ−１５およびＬＳＹＮ−３はそれぞれ、ニューモリシンのＮ末端およびＣ末端の配列に相補的である。それぞれの増幅において、プライマーＬＳＹＮ−１５および３４（ＰＣＲ１）並びにＬＳＹＮ−３３および３（ＰＣＲ２）、並びに全長ニューモリシン遺伝子を含有するテンプレートｐＳＡ−７を含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、第１のＰＣＲ産物であるＰＣＲ１（１．２ｋｂ）およびＰＣＲ２（１５０ｋｂ）を作製した。
【０２２２】
第１のＰＣＲ産物を混合し、変性させ、第２のプライマーセットであるＬＳＹＮ−１５および４により作製される第２のＰＣＲ産物を作製するためのテンプレートとして用いた。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてこの第２のＰＣＲ産物を切断し、ｐＶＡＸ１のＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＳＡ−２７を作製した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１分間を３０サイクル；および、７２℃にて８分間を１サイクル。
【０２２３】
プライマーＬＳＹＮ−３、ＬＳＹＮ−４、ＬＳＹＮ−１５、ＬＳＹＮ−３３、およびＬＳＹＮ−３４のオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
ＬＳＹＮ−３プライマー；
【０２２４】
【化４７】
【０２２５】
ＬＳＹＮ−４プライマー；
【０２２６】
【化４８】
【０２２７】
ＬＳＹＮ−１５プライマー；
【０２２８】
【化４９】
【０２２９】
ＬＳＹＮ−３３プライマー；
【０２３０】
【化５０】
【０２３１】
ＬＳＹＮ−３４プライマー；
【０２３２】
【化５１】
【０２３３】
この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、ＣｐＧモチーフを有する血清型１９Ａのシュードニューモリシン遺伝子インサートを確認した。
【０２３４】
ＤＮＡベクターを用いた作製およびタンパク質を用いた増強を伴うワクチン化プログラムによって高レベルの特異的な免疫が生成し、場合によっては、現在ワクチンの開発に大きな問題を引き起こしている病原体に対する予防も可能となった。これらの実験では、ニューモリシンＤＮＡベクターを用いて３回免疫し、アジュバントなしでニューモリシンタンパク質を用いて増強した。
【０２３５】
図１６は、上述したシュードニューモリシンＤＮＡのワクチン化のためにプライム−ブースト法を用いた、ウサギにおける抗ニューモリシン抗体の応答を示すグラフである。レーン１、２、および３は、第１の（１）、第２の（２）、および第３の（３）筋内へのシュードニューモリシンＤＮＡのワクチン化の７日後の免疫応答を示す。レーン４はタンパク質増強（２００μｇニューモリシン）の１０日後の応答を示す。レーン５は、タイターマックスアジュバントと一緒に２００μｇのニューモリシンタンパク質を注射した１０日後の抗体の応答を示す。この結果から、ＤＮＡの３回の注射にタンパク質を用いた増強を加えると、アジュバントを用いた従来のタンパク質ワクチン化法と比較してより高い抗体の応答が得られることが示される。
【０２３６】
全体積０．１ｍＬの１×ＰＢＳ中のそれぞれ１００μｇの量のＤＮＡワクチンであるｐＳＡ−５９およびｐＳＡ−６０、並びに１つのベクターコントロールプラスミドＤＮＡを、それぞれＢａｌｂ／Ｃマウスの双方の大腿四頭筋または後肢に筋肉注射した。マウスには注射の間に２週間の間隔を置いて１００μｇのＤＮＡワクチンの４用量を注射した。最後の注射の７日後に、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ抗体の血清レベルを測定した。４回の注射によるＤＮＡワクチンを投与されたマウスは、コントロール群の９６００倍超のＩｇＧ Ａｂを産生した。これらの結果から、プラスミドＤＮＡは、マウスにおいてインビボでオートリシンまたは肺炎球菌表面タンパク質Ａ抗原を発現でき、免疫系を刺激して高レベルの特異的なＩｇＧ抗体を産生させうることが示される。
【０２３７】
図１７は、ＰｓｐＡ ＤＮＡワクチンを用いた４回目の注射の７日後の肺炎球菌の表面タンパク質Ａに対する抗体の応答を示すグラフである。図１８は、オートリシンＤＮＡワクチンを用いた４回目の注射の７日後の肺炎球菌オートリシンに対する抗体の応答を示すグラフである。
【０２３８】
実施例８：毒性肺炎球菌のヘテロ血清型への感染に対する予防的免疫および交差耐性
２．５μｇの血清型１４多糖類−シュードニューモリシン（−７アミノ酸）共役体の３用量を、２週間の間隔を置いてマウスに腹腔内投与した。コントロール群では、前記共役体をＰＢＳで置換した。３回目の注射の８日後に、０．１ｍＬあたり１×１０５〜１×１０６ＣＦＵ（コロニー形成単位）肺炎球菌を、免疫されたマウスに感染させた。注射されたミリリットルあたりのＣＦＵの正確な数を、ヒツジ血液寒天プレート上でのプレート計数により決定した。感染の１、３、および５時間後に、各マウスの５μＬおよび２０μＬの血液試料をヒツジ血液寒天プレート上に塗布し、３７℃にて一晩インキュベートした。共役体でワクチン化されたマウスでは、感染後に、コントロールに対して血液試料からの細菌の減少の有意な差が検出された。
【０２３９】
図１９は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型１４の肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。
【０２４０】
図２０は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型７の肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４１】
図２１は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型６Ｂの肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０５）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４２】
図２２は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型１８Ｃの肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４３】
図２３〜２５は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型２３Ｆの肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１時間後（図２３）、３時間後（図２４）、および５時間後（図２５）のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４４】
実施例９：オプソニン化食作用アッセイ
Ａ．オプソニン化食作用アッセイ
ヒト多形核白血球（ＰＭＮＬ）を用いたオプソニン化食作用アッセイにより、血清型１４の肺炎球菌の多糖類に対する抗体の機能的活性を測定した。抗血清を直列希釈（２倍）し、２０μＬの各血清試料を、ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｔｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地中に約２００ＣＦＵを含有する細菌懸濁液２０μＬと混合し、３７℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬの新生児ウサギ補体および４０μＬのＰＭＮＬ（４×１０５細胞）を添加した。この混合物を５％ＣＯ２雰囲気中で６０分間、３７℃にてインキュベートした。生存可能な細胞を計数するために、各試料からの２０μＬのアリコートを血液寒天プレート上に３枚播種し、３７℃に一晩維持した。補体コントロールは、肺炎球菌に対する抗体を除く全ての試験試薬を含んでいた。オプソニン化食作用力価は、補体中での増殖と比較して５０％超の細菌が死滅する最高の血清希釈の逆数として示した。
【０２４５】
Ｂ．食作用
健康な成人ボランティアから、単核球およびＰＭＮＬのデキストラン沈降およびフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＃１６−９２２−５４ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）分離によって、新鮮なＰＭＮＬを単離した。ＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＦｌｕｉｄｓ， Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ｐ３０４−１００）を用いて赤血球を溶解させた。ＢＭＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）中で細胞の最終濃度を１×１０７細胞／ｍＬに調節した。各試料について、ＰＭＮＬ２〜４×１０５細胞の４０μＬを用いた。
【０２４６】
Ｃ．マウス血清および細菌
１４多糖類に対するマウス抗血清をブレインハートインフュージョン培地で直列希釈（２倍、１：２〜１：２５６）し、各抗血清試料の２０μＬを、３７℃にて１５分間、２０μＬの細胞懸濁液（２００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌血清型１４）と混合した。
【０２４７】
血清型１４の肺炎連鎖球菌をブレインハートインフュージョン培地中で３７℃にて１０時間培養した。１０倍直列希釈により、本実験に用いるための細菌の数を決定した。１００μＬの試料をプレート上にアプライした。１：１０７希釈の試料を用いたプレート上では１０ＣＦＵが観察され。１：１０６希釈の試料を用いたプレート上では９１ＣＦＵが観察された。従って、本実験に用いるための細菌の濃度は約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬと決定された。血清型１４の肺炎連鎖球菌の１×１０９ＣＦＵ／ｍＬを、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。各試料について、２００ＣＦＵ／２０μＬを用いた。
【０２４８】
Ｄ．補体およびＰＭＮＬ
インキュベーション後、１０μＬの新生児ウサギ補体（若いウサギの血清から新鮮に回収され、使用まで−８０℃にて貯蔵されたアリコート）および４０μＬのＰＭＮＬ２．８×１０５細胞を添加した。この混合物を、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて６０分間インキュベートした。
【０２４９】
Ｅ．ＣＦＵの計数
生存可能な細胞を計数するために、各試料由来の２つの希釈（１：１０および１：１００）の２０μＬアリコートを、血液寒天プレート上に３枚播種し、３７℃に一晩維持した。補体コントロールは、肺炎球菌に対する抗体を除き、全ての試験試薬を含んでいた。
【０２５０】
Ｆ．オプソニン化食作用活性
オプソニン化食作用力価は、補体中での増殖と比較して５０％超の細菌が死滅する最高の血清希釈の逆数として示した。オプソニン化食作用の力価は、
【０２５１】
【表５】
【０２５２】
【表６】
【０２５３】
表５および６に示すように、血清型１４多糖類およびシュードニューモリシンに対してより高い抗体の応答を有するマウス（例えば、マウス番号１、２、３、４、５、および７）は、より高いオプソニン化活性を示したのに対し、血清型１４多糖類およびシュードニューモリシンに対してより低い抗体力価を有するマウス（例えば、マウス番号６および８）は、より低いオプソニン化活性を示した。ＰＢＳを注射されたマウスではオプソニン化活性は検出されなかった。
【０２５４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載したが、上記の記載は例示のためのものであって、本発明の技術的範囲を制限するものではないと解されるべきである。本発明の他の形態、利点、および修飾は、下記の特許請求の範囲内のものである。
【技術分野】
【０００１】
関連する米国出願
本願は、２００２年１１月７日に提出された、米国仮出願第６０／４２４，４９７号の優先権を主張する。従来の出願の全ての内容は、参照により本明細書中に引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリペプチド、肺炎球菌多糖類−ポリペプチド共役体、肺炎球菌ポリペプチドをコードする発現ベクター、抗肺炎球菌免疫応答の誘導方法、および、肺炎球菌感染を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、小児、高齢者、および免疫不全の個体における、細菌性の肺炎、髄膜炎、中耳炎および菌血症の共通の原因である。肺炎連鎖球菌は、自身の莢膜多糖類に基づき、約９０種の血清型に細分されうる。しかしながら、疾患は一般的に、約３０のタイプの肺炎連鎖球菌の単離体により引き起こされる。世界保健機関は、小児における肺炎球菌性の髄膜炎および敗血症による年間の死者は１００万人であり、これらの９８％は発展途上国において発生していると見積もっている。抗微生物剤に耐性を有する肺炎球菌株の発生により、抗微生物剤に加えて、方法によって肺炎球菌感染を治療および予防することの必要性が強調されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
一形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に共役したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており（例えば、カルボキシ末端で）、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、組成物を特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【０００５】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有しうる。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６０を含む。他の実施形態では、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６４、配列番号１のアミノ酸１〜４６５、配列番号１のアミノ酸１〜４６６、配列番号１のアミノ酸１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸１〜４７０を含む。
【０００６】
このポリペプチドは、必要であれば、アミノ酸配列ＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２３）またはアミノ酸配列ＹＰＱＶＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２４）を欠失していてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６０、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６４、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６５、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６６、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸残基１〜４７０からなる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記莢膜多糖類は、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群から選択される。一例を挙げると、前記莢膜多糖類は、血清型１４である。他の例を挙げると、前記莢膜多糖類は、血清型１８Ｃである。前記組成物は、必要であれば、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群から選択される複数の異なる莢膜多糖類を含んでもよい。この組成物により誘発される免疫応答は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に対するものであってもよいし、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質に対するものであってもよいし、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類および肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質に対するものであってもよい。
【０００９】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており（例えば、カルボキシ末端で）、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、前記ポリペプチドが、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、哺乳動物発現ベクターを特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１０】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有しうる。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６０を含む。他の実施形態では、このコードされるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４６４、配列番号１のアミノ酸１〜４６５、配列番号１のアミノ酸１〜４６６、配列番号１のアミノ酸１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸１〜４７０を含む。
【００１１】
このコードされるポリペプチドは、必要であれば、アミノ酸配列ＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２３）またはアミノ酸配列ＹＰＱＶＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号２４）を欠失していてもよい。
【００１２】
いくつかの実施形態において、このコードされるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６０、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６４、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６５、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６６、配列番号１のアミノ酸残基１〜４６９、または配列番号１のアミノ酸残基１〜４７０からなる。このコードされるポリペプチドにより誘発される免疫応答は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質に対するものであってもよい。
【００１３】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌のオートリシンポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、前記ポリペプチドが、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、哺乳動物発現ベクターを特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、このコードされるポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。
【００１５】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌の表面タンパク質Ａポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、前記ポリペプチドが、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、哺乳動物発現ベクターを特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、このコードされるポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列からなる。
【００１７】
他の形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１〜４６０、配列番号１のアミノ酸１〜４６４、配列番号１のアミノ酸１〜４６６、および配列番号１のアミノ酸１〜４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特徴とする。
【００１８】
他の形態において、本発明は、哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘導するのに有効な量の本明細書に記載の組成物を哺乳動物へ投与することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記免疫応答は、前記組成物中に存在する莢膜多糖類の血清型（例えば、血清型７、６Ｂ、１８Ｃ、または２３Ｆ）とは異なる肺炎連鎖球菌の血清型の少なくとも１つに対して交差反応性である。いくつかの実施形態において、前記免疫応答は、少なくとも１つの連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌以外の種に対して交差反応性である。
【００２０】
他の形態において、本発明は、哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘導するのに有効な量の本明細書に記載の発現ベクター（例えば、ニューモリシン、シュードニューモリシン、オートリシン、または肺炎球菌表面タンパク質Ａの発現ベクター）を哺乳動物へ投与することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を特徴とする。当該免疫応答は、予防的免疫応答および／または治療的免疫応答でありうる。いくつかの実施形態において、当該免疫応答は、少なくとも１つの連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌以外の種に対して交差反応性である。
【００２１】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含む哺乳動物発現ベクターを、哺乳動物に対して投与し；さらに、精製されたニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントを、哺乳動物に対して投与して、これらの投与の組み合わせにより、哺乳動物における肺炎連鎖球菌のニューモリシンに対する免疫応答を誘発することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を特徴とする。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記哺乳動物には、前記発現ベクターを、少なくとも２つの、３つの、またはそれ以上の異なる用量で投与する。当該用量には、必要であれば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日数を置く。
【００２３】
いくつかの実施形態において、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントの投与は、前記発現ベクターの投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日数後である。
【００２４】
他の形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌以外の細菌の多糖類に共役したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、哺乳動物へ投与されると前記肺炎連鎖球菌以外の細菌に対する免疫応答を誘発する、組成物を特 徴とする。
【００２５】
いくつかの例を挙げると、前記肺炎連鎖球菌以外の細菌は、肺炎球菌、インフルエンザ菌タイプｂ、髄膜炎菌グループＡ、ＢまたはＣ、およびグループＢ連鎖球菌タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩＩからなる群から選択される。かような組成物は、当該組成物の有効量を哺乳動物に対して投与して、哺乳動物における肺炎連鎖球菌以外の細菌に対する免疫応答を誘導することにより、哺乳動物における免疫応答を誘導するために用いられうる。
【００２６】
他の形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物またはポリペプチドに対して結合する（例えば、選択的に結合する）精製された抗体を特徴とする。例えば抗体は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に共役したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の少なくとも４００個の連続したアミノ酸のフラグメントを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており（例えば、カルボキシ末端で）、前記ポリペプチドが溶血作用を示さず、哺乳動物へ投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発する、組成物に対して特異的に結合しうる。かような抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。本明細書に記載の抗体を分泌する、ハイブリドーマのような細胞系が調製されうる。当該抗体は、精製された抗体の治療上または予防上有効量を哺乳動物に対して投与することにより、哺乳動物における肺炎連鎖球菌感染を治療または予防しうる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明の利点は、肺炎連鎖球菌の第１の血清型の多糖類−ポリペプチド共役体が、予期せぬことに、肺炎連鎖球菌の第２の血清型による感染に対する交差耐性を提供しうるということである。かような交差耐性によれば、肺炎連鎖球菌の２種以上の血清型による感染の治療または予防における所定の共役体の有効性が増大しうる。従って、それぞれに特異的な血清型を有する共役体を必ずしも提供することなく、肺炎連鎖球菌の複数の血清型に対する耐性が提供されうる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明の他の利点は、シュードニューモリシンポリペプチドが溶血作用を示さないということである。従って、かようなシュードニューモリシン共役体ベクターは、溶血作用を示す天然に存在するニューモリシンまたは部分的に溶血作用を示すトキソイド化ニューモリシンを含む組成物と比較して、毒性が低減されているかまたは消失している。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明の他の利点は、ニューモリシン断片をコードする発現ベクターは、ニューモリシン点変異体をコードする核酸とは対照的に、復帰突然変異によって溶血作用を示す毒性タンパク質をコードする虞が少ないということである。
【００３０】
前記ニューモリシン断片は、ニューモリシンの溶血作用に関与している領域を欠失していることから、前記発現ベクターのヌクレオチド配列におけるどのような変異によっても、毒性が再生することはありえない。
【００３１】
そうでないと定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同様である。適当な方法および材料を以下に記載するが、本発明を実施または試験する際には、本明細書に記載されるのと類似のまたは等価な方法および材料が用いられうる。本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により引用される。専門用語における争いが生じた場合には、本明細書が優先する。また、記載される材料および方法は例示のみを目的とし、限定を意図するものではない。
【００３２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図２】図２は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図３】図３は、血清型１８Ｃの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図４】図４は、血清型１８Ｃの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図５】図５は、血清型１９Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図６】図６は、血清型１９Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図７】図７は、血清型２３Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図８】図８は、血清型２３Ｆの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図９】図９は、血清型４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１０】図１０は、血清型４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１１】図１１は、血清型６Ｂの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１２】図１２は、血清型６Ｂの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１３】図１３は、血清型９Ｖの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗ニューモリシンＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１４】図１４は、血清型９Ｖの多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後にマウスにおいて誘発された抗多糖類ＩｇＧ抗体の産生を示すグラフである。
【図１５】図１５は、肺炎連鎖球菌の血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体の３回目の注射後の肺炎連鎖球菌の血清型１４の多糖類に対する抗体の応答を示すグラフである。
【図１６】図１６は、シュードニューモリシンＤＮＡのワクチン投与のためにプライム−ブースト法を用いた、ウサギにおけるニューモリシンに対する抗体の応答を示すグラフである。
【図１７】図１７は、肺炎球菌の表面タンパク質ＡのＤＮＡワクチンをコードする発現ベクターの注射後の抗体の応答を示すグラフである。
【図１８】図１８は、オートリシンのＤＮＡワクチンをコードする発現ベクターの注射後の抗体の応答を示すグラフである。
【図１９】図１９は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型１４に感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２０】図２０は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型７に感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２１】図２１は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型６Ｂに感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２２】図２２は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型１８Ｃに感染したマウスにおける細菌の減少を示すグラフである。
【図２３】図２３は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型２３Ｆに感染したマウスにおける、感染１時間後の細菌の減少を示すグラフである。
【図２４】図２４は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型２３Ｆに感染したマウスにおける、感染３時間後の細菌の減少を示すグラフである。
【図２５】図２５は、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体を用いた免疫後に、肺炎連鎖球菌の血清型２３Ｆに感染したマウスにおける、感染５時間後の細菌の減少を示すグラフである。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、肺炎球菌感染を治療または予防するための組成物および方法を提供する。本明細書に記載のポリペプチド、多糖類−ポリペプチド共役体、および発現ベクターは、哺乳動物に対して投与されると、当該哺乳動物において抗肺炎球菌免疫応答を誘導する。これらの組成物は、個体に予防接種するために予防的に、および／または、感染した個体における治療的な免疫応答を誘導するために、用いられうる。
【００３５】
多糖類−タンパク質共役体
ポリペプチドは、共有結合または非共有結合の方法により、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に共役しうる。一般的に、この共役体のポリペプチド成分は、肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質または肺炎連鎖球菌の変異型ニューモリシンタンパク質の一部を含み、アミノ酸配列ＫＶＥＮＤ（配列番号２２）を欠失しており、そして溶血作用を示さない。この多糖類−ポリペプチド共役体は、哺乳動物に対して投与されると肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発する。当該免疫応答は、前記ポリペプチド、前記多糖類、または前記ポリペプチドおよび前記多糖類の組み合わせに対するものであってもよい。
【００３６】
この共役体のポリペプチド成分は、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されてもよく、自然源から精製されてもよく、または化学的に合成されてもよい。一般的に、前記ポリペプチド成分は、アミノ酸配列の点で天然に存在する肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質とは異なる。肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａニューモリシンポリペプチドの配列は、配列番号１で示される（実施例１を参照）。共役体のポリペプチド成分の例としては、以下に制限されないが、配列番号１のアミノ酸１〜４６０、１〜４６１、１〜４６２、１〜４６３、１〜４６４、１〜４６５、１〜４６６、１〜４６９、および１〜４７０が挙げられる。
【００３７】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の断片型および／または変異型をコードする核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製されうる。かようなタンパク質をコードする核酸は、特定の発現系に好ましい、または好ましくないコドンを有することで選別されうる。例えば、前記核酸は、その配列が大腸菌、酵母、ヒト、昆虫、またはＣＨＯ細胞における発現に最適となるように、少なくとも１つのコドン、好ましくはコドンの少なくとも１０％、または２０％が改変されている。
【００３８】
肺炎連鎖球菌のニューモリシンタンパク質の断片型および／または変異型をコードする核酸は、（１）オートリシン、表面タンパク質Ａ、ノイラミニダ−ゼ、ヒアルロン酸塩溶解物、コリン結合タンパク質Ａなどの他の肺炎球菌のタンパク質、あるいは（２）インフルエンザ菌ｂ、髄膜炎菌グループＡ、ＢもしくはＣ、または連鎖球菌グループＢなどの有機体からの肺炎球菌以外のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合しうる。かような融合タンパク質をコードする核酸は、発現系において発現しうる。
【００３９】
ニューモリシン断片は、宿主において予め多糖類の担体に対する抗体が存在していない場合に、かような多糖類の担体として有用である。ニューモリシンは肺炎球菌感染における毒性因子であり、異なるサブタイプを有する肺炎球菌間でのニューモリシンの抗原性の変動はほとんどない。
【００４０】
多糖類−タンパク質共役体は、ヒトのような哺乳動物に対して投与されると、量、型、および／または期間の点で、多糖類成分単独での哺乳動物への投与により誘導される免疫応答を超える免疫応答を誘導する。従って、前記ポリペプチド成分は、かような向上した免疫応答を誘導するのに充分な長さでなければならない。肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質のフラグメントについて、当該フラグメントは少なくとも８、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４２５、４５０、４６０、４６５、４６０、４６５、またはそれを超えるアミノ酸長である。肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質由来の配列の異なるポリペプチドについて、当該ポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれを超えて、例えば配列番号１の肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質と一致する。
【００４１】
前記ポリペプチド成分は、好ましくは、肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質に存在する溶血作用を示さない。一般的に、前記ポリペプチド成分は、肺炎連鎖球菌の天然に存在するニューモリシンタンパク質の溶血作用の３０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満の溶血作用しか示さない。溶血作用は、実施例３で詳述するように測定されうる。一般的に、ポリペプチドの溶血作用は、ポリペプチドを赤血球（例えば、ヒツジ赤血球）とインキュベートし、当該ポリペプチドにより誘導された溶血を測定することにより決定されうる（典型的な溶血アッセイの説明については、例えば、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２１：２１７−２２２を参照）。
【００４２】
前記共役体の多糖類成分は、肺炎連鎖球菌の任意の莢膜多糖類であり、以下に制限されないが、サブタイプ１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、３３Ｆ、または３４が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記莢膜多糖類は、サブタイプ４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記多糖類は、血清型１４である。他の実施形態において、前記多糖類は、血清型１８Ｃである。１または２以上の異なる莢膜多糖類が、単一のまたは複数のポリペプチドに共役しうる。例えば、多価共役体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる莢膜多糖類を含みうる。多糖類は、例えばモノマー性の結合（多糖類の一方の末端のみがポリペプチドに連結される）、環状の結合（単一のポリペプチドが環状の多糖類に連結される）、または架橋（複数の多糖類が複数のポリペプチドに連結される）を介してポリペプチドに共役しうる。
【００４３】
ポリペプチド（例えば、シュードニューモリシンポリペプチド）を精製するための方法は実施例に記載されており、ポリペプチドへの多糖類の共役は実施例４に記載されている。ポリペプチドまたは多糖類の精製および共役プロセスに関するさらなる詳細は、例えば、米国特許第４，２４２，５０１号、米国特許第４，６８６，１０２号、米国特許第５，６２３，０５７号、および米国特許第５，５６５，２０４号に記載されている。
【００４４】
本明細書に記載の共役体またはポリペプチドは、哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答（予防的および／または治療的免疫応答）を誘発する目的で、哺乳動物に対して投与されうる。共役体またはポリペプチドを含有する薬剤組成物は、製薬上許容しうる担体、緩衝液、または、以下に制限されないが、生理食塩水もしくは他の注射用液体などのワクチンに適当な保存剤においてデリバリーされうる。ワクチンに汎用される添加剤（例えば、ラクトースまたはソルビトールのような安定化剤、およびリン酸アルミニウム、水酸化物、もしくは硫酸塩およびステアリルチロシンのような免疫応答を増強させるためのアジュバント）もまた、存在してもよい。製造されるワクチンはまた、複数の感染性物質に対する免疫応答を誘発する多価ワクチンの成分として用いられうる。
【００４５】
前記組成物は、本技術分野において周知の手法により（例えば、経口で、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮内に、腹腔内に、鼻腔内に、肺内に、眼内に、膣内に、直腸内に、または皮下に）投与されうる。前記組成物は、例えば、前記共役体を含有する溶液または粉末の吸入により、胃腸管または呼吸管中に導入されうる。いくつかの実施形態において、前記組成物は、皮膚パッチを介して投与されうる。
【００４６】
薬剤組成物（例えば、ワクチン）は、免疫応答の一部である抗体の産生を誘発するのに充分な量で投与される。任意の所定の患者に対する用量は、患者のサイズ、健康状態、性別、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、投与時間および投与経路、並びに同時に投与されている他の薬剤などの多くの要因に依存する。最適用量の決定は、通常の技能を有する薬理学者の能力の範囲内に充分に含まれる。
【００４７】
組成物が宿主哺乳動物において免疫応答を誘発する能力は、免疫応答を測定するための本技術分野において周知の方法を用いることにより試験されうる。例えば、細胞障害性Ｔ細胞の生成は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞間のサイトカインの発現もしくは分泌を測定することにより、または主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）テトラマーを用いることにより、立証されうる。Ｔ細胞活性化に起因するサイトカインプロファイルを測定するためには、酵素免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または酵素免疫スポット（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（ＥＬＩＳＰＯＴ）のような標準的なアッセイが用いられうる。Ｔ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みおよび、本技術分野において周知の他のアッセイを用いて測定されうる。Ｂ細胞の応答は、ＥＬＩＳＡのような本技術分野において認識されているアッセイを用いて測定されうる。他の手法もまた用いられうる。疾病に関連する病原体に対する、または他の病原体レベルに対する前記共役体の効果（例えば、共役体を用いて処置された感染マウスにおける肺炎球菌の減少）を一般的に評価するためには、他の方法論もまた、用いられうる。
【００４８】
本明細書に記載の組成物は、肺炎連鎖球菌による感染または当該感染に関連する症状を予防または治療するための医薬の製造に用いられうる。
【００４９】
抗体
多糖類、ニューモリシン、またはこれらの組み合わせに対する抗体は、第１の個体から第２の個体を免疫する目的で（例えば、肺炎連鎖球菌に対する第２の個体の免疫応答を増大させる目的で、または第２の個体が易感染性患者である場合に応答を提供する目的で）、予防的なまたは治療的な適用に用いられうる。多糖類、ニューモリシン、またはこれらの組み合わせに対する抗体は、免疫応答性宿主において生成し（例えば、本明細書に記載の共役体を免疫応答性宿主に対して投与することにより）、前記宿主から回収され、治療または予防の必要性に応じてレシピエントに輸血され、これによりニューモリシン毒に対するだけではなく肺炎連鎖球菌および、前記共役体（例えば、前記共役体の多糖類成分）により誘発される抗体に結合する他の任意の可能な細菌に対する耐性が、レシピエントに付与される。
【００５０】
本明細書に記載の組成物により誘発される抗体は、薬剤組成物として配合され、個体に対して予防的または治療的免疫応答を付与するために用いられうる。薬剤組成物の投与に適当な成分および方法は、本明細書に記載されている。受動免疫を誘発するために、前記薬剤組成物はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらのフラグメントの誘導体を含んでもよい。薬剤組成物は、標準的な臨床的技術により決定されるような、予防上または治療上有効量の抗体、フラグメント、または誘導体を含む。
【００５１】
肺炎球菌ポリペプチドをコードする核酸
肺炎球菌ポリペプチドまたは肺炎球菌ポリペプチドのフラグメントもしくは変異体をコードする核酸は、哺乳動物における予防的および／または治療的免疫応答を引き起こす目的で、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されうる。当該免疫応答は、抗肺炎球菌の液性および／または細胞性免疫でありうる。
【００５２】
前記核酸構築物によりコードされうるポリペプチドとしては、本明細書に記載の共役体のポリペプチド成分、実施例に記載のシュードニューモリシンポリペプチド、並びにオートリシンおよび肺炎球菌の表面タンパク質Ａおよびそのフラグメントおよび変異体が挙げられる。さらに、核酸は、２以上のかようなポリペプチド、フラグメント、または変異体をコードしうる。
【００５３】
核酸発現構築物は、組み換えＤＮＡの標準的な手法を用いて調製されうる。ポリペプチドをコードする核酸の発現を促進させる目的で、構築物中には制御エレメントが含まれうる。これらのエレメントとしては、ヒトまたは他の哺乳動物細胞における発現を増強させるための配列（例えば、プロモータ、コーディング配列の５’側および／または３’側のＲＮＡ安定化配列、イントロン（コーディング配列の内部またはこれに隣接する任意の位置に配置されうる）、およびポリ（Ａ）付加部位）、並びに、複製開始部位および、構築物の複製および原核および／または真核宿主における選択を可能とする選択可能なマーカーをコードする１以上の遺伝子が挙げられる。必要であれば、Ｔ７プロモータまた他のタイプのプロモータ（例えば、組織特異的プロモータもしくは筋特異的プロモータのような細胞特異的プロモータ）が、コーディング配列の５’末端に存在してもよく、また、必要であれば、ＦＬＡＧまたは他のｍＡｂ決定因子をコードする配列が、コーディング配列の３’末端に存在してもよい。前記構築物はまた、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列のような他の転写および翻訳シグナルを含んでもよい。
【００５４】
前記構築物は、コードされたポリペプチドを所望の細胞内区画へと指向する、前記ポリペプチドに連結された標的化シグナルをコードする配列をさらに含んでもよく、前記標的化シグナルとしては、標的化シグナルは、コードされたポリペプチドを、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、核、リソソーム、クラスＩＩペプチドローディング区画、またはエンドソームへと指向するものであってもよく、シグナルペプチド、ＥＲ残留ペプチド、およびリソソーム標的化ペプチドが挙げられる。
【００５５】
前記核酸は、哺乳動物の細胞中での発現を可能とする任意のベクター中で用いられうる。当該ベクターは、例えば、プラスミドまたは細菌ベクターのような非ウイルスベクター、組み込み型ウイルスベクター、または非組み込み型ウイルスベクターであってもよい。適当なベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ哺乳動物発現ベクターのファミリー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））があり、これによればＰＣＲ産物の直接かつ迅速なクローニングが可能となる。
【００５６】
ポリペプチドをコードする核酸を適切な細胞へとデリバリーする目的で、種々のデリバリーシステムが用いられうる。ポリペプチドをコードする核酸は、生理食塩水のような製薬上許容しうる担体中で、またはコロイド性懸濁液として、または粉末として、希釈剤を用いてもしくは用いずに、デリバリーされうる。前記核酸は「裸」であってもよいし、デリバリーベヒクルと関連していてもよく、脂質、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロ粒子、またはマイクロカプセル、金粒子、ＩＳＣＯＭＳ、ナノ粒子、ポリマー、縮合剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、ＱＳ２１、吸着増強剤、アジュバント、または脂肪酸のような本技術分野において周知のデリバリーシステムを用いてデリバリーされうる。核酸はまた、インビトロまたはインビボで、エレクトロポレーションを用いて、細胞（例えば、骨格筋細胞）へとデリバリーされうる。
【００５７】
核酸は、標準的な方法（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７６：１４５， １９９４、および、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：３４１， １９９５に記載の方法）を用いて投与されてもよく、本技術分野において周知の方法によって（例えば、経口で、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮内に、腹腔内に、鼻腔内に、肺内に、眼内に、膣内に、直腸内に、または皮下に）患者にデリバリーされうる。拡散は、例えば、当該核酸を含有する溶液または粉末の吸入により、胃腸管または呼吸管中に導入されうる。投与は局所的であってもよいし、全身的であってもよい。
【００５８】
個体に対しては、約１００〜２０００μｇ核酸の用量が投与されるであろうと予想される。患者が成人のヒトの場合、予防接種の手法としては、例えば、マイクロ粒子中でデリバリーされるときには１０〜１０００μｇのプラスミドＤＮＡを、筋肉内、皮内、吸入、または皮下へ投与すること、または、約１０〜２５００μｇ（例えば、１００〜２０００、もしくは５００〜１０００μｇ）の裸のプラスミドＤＮＡを、３〜６回繰り返して、筋肉内にまたは皮内に投与することが挙げられる。医療の技術分野においては周知のように、任意の所定の患者に対する用量は、患者のサイズ、健康状態、性別、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、投与時間および投与経路、並びに同時に投与されている他の薬剤などの多くの要因に依存する。最適用量の決定は、通常の技能を有する薬理学者の能力の範囲内に充分に含まれる。
【００５９】
他の標準的なデリバリー方法（例えば、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）移入またはエクスビボ処置）もまた、用いられうる。エクスビボ処置においては、樹状細胞、末梢血単核細胞、または骨髄細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、患者または適切なドナーから得られ、核酸を用いてエクスビボで活性化され、次いで患者に対して移植または再注入されうる。
【００６０】
核酸は、単独でまたは本技術分野において周知の他の治療法（例えば、抗微生物剤）と組み合わせて投与されうる。さらに、核酸は、本技術分野において周知のように、免疫応答を増強するように設計された他の治療法と組み合わせて（例えば、アジュバント、サイトカイン（もしくはサイトカインをコードする核酸）、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと一緒の投与により）投与されうる。
【００６１】
核酸が宿主哺乳動物において免疫応答を誘発する能力は、免疫応答を測定するための本技術分野において周知の方法を用いることにより試験されうる。例えば、細胞障害性Ｔ細胞の生成は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞間のサイトカインの発現もしくは分泌を測定することにより、またはＭＨＣテトラマーを用いることにより、立証されうる。Ｔ細胞活性化に起因するサイトカインプロファイルを測定するためには、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴのような標準的なアッセイが用いられうる。Ｔ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みおよび、本技術分野において周知の他のアッセイを用いて測定されうる。Ｂ細胞の応答は、ＥＬＩＳＡのような本技術分野において認識されているアッセイを用いて測定されうる。他の手法もまた用いられうる。疾病に関連する病原体に対する、または他の病原体レベルに対する前記共役体の効果（例えば、共役体を用いて処置された感染マウスにおける肺炎球菌の減少）を一般的に評価するためには、他の方法論もまた、用いられうる。
【００６２】
本明細書に記載の核酸は、肺炎連鎖球菌による感染または当該感染に関連する症状を予防または治療するための医薬の製造に用いられうる。
【００６３】
本発明を下記の実施例によりさらに説明するが、当該実施例により特許請求の範囲に記載の発明の技術的範囲は限定されない。
【実施例】
【００６４】
実施例
実施例１：シュードニューモリシン発現ベクターの構築
断片型のニューモリシンポリペプチドを発現するベクターを、実施例１Ａ〜１Ｅ二記載する。「シュードニューモリシン」と称される、コードされる断片型のポリペプチドは、共役ワクチンを調製する目的で肺炎球菌の多糖類に共役させるために用いられうる。さらに、シュードニューモリシンをコードするポリペプチドは、コードされるポリペプチドに対する免疫応答を生じさせる目的で個体に投与されうる。
【００６５】
肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行い、ニューモリシン遺伝子の種々のフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応に用いたセンスプライマーは、翻訳開始コドンのすぐ上流のニューモリシン遺伝子のコーディング配列にアニールし、特異的な制限酵素部位を組み込んだ。ＬＹＳＮ−１と称されるセンスプライマー：
【００６６】
【化１】
【００６７】
は、ニューモリシン遺伝子の５’末端のヌクレオチド１〜２４に相補的である。ＬＹＳＮ−３と称されるアンチセンスプライマー：
【００６８】
【化２】
【００６９】
は、ニューモリシン遺伝子の３’末端のヌクレオチド１３９６〜１４１３に相補的である。このプライマーは、４７１アミノ酸の全長ニューモリシンタンパク質をコードする１４１３塩基対のＤＮＡを増幅する。肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａのニューモリシンポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【００７０】
【化３】
【００７１】
ＰＣＲは一般的に、以下のように行った：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、および７２℃にて１．５分間を３０サイクル；並びに、７２℃にて１０分間を１サイクル。ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクター中にライゲーションした（これにより、ｐＳＡ−１４を作製）。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いた消化により、インサートの存在を確認した。
【００７２】
増幅したＤＮＡフラグメントは、野生型のゲノム配列と比較して、３’末端のヌクレオチドを欠失している。これらの修飾核酸によりコードされるシュードニューモリシンポリペプチドの多くは、非溶血性であり、非毒性であるが、免疫原性は保持していることが判明した。
【００７３】
Ａ．ｐＳＡ−１発現ベクターの構築
ｐＳＡ−１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６０からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００７４】
【化４】
【００７５】
および、ＬＳＹＮ−４プライマー：
【００７６】
【化５】
【００７７】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１３８０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【００７８】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【００７９】
コードされる４６０アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する１１アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【００８０】
【化６】
【００８１】
Ｂ．ｐＳＡ−４９発現ベクターの構築
ｐＳＡ−４９発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６４からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００８２】
【化７】
【００８３】
および、ＬＳＹＮ−５４プライマー：
【００８４】
【化８】
【００８５】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１３９２塩基対のＤＮＡを増幅した。
【００８６】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−４９を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【００８７】
コードされる４６４アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する７アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【００８８】
【化９】
【００８９】
Ｃ．ｐＳＡ−１１発現ベクターの構築
ｐＳＡ−１１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６６からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００９０】
【化１０】
【００９１】
および、ＬＳＹＮ−１７プライマー：
【００９２】
【化１１】
【００９３】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１３９８塩基対のＤＮＡを増幅した。
【００９４】
ＰＣＲにより合成した上記のＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−１１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【００９５】
コードされる４６６アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する５アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【００９６】
【化１２】
【００９７】
Ｄ．ｐＳＡ−３２発現ベクターの構築
ｐＳＡ−３２発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６９からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【００９８】
【化１３】
【００９９】
および、ＬＳＹＮ−３７プライマー：
【０１００】
【化１４】
【０１０１】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１４０７塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１０２】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−３２を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【０１０３】
コードされる４６９アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する２アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【０１０４】
【化１５】
【０１０５】
Ｅ．ｐＳＡ−３１発現ベクターの構築
ｐＳＡ−３１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４７０からなるポリペプチドをコードする。ＬＳＹＮ−１プライマー：
【０１０６】
【化１６】
【０１０７】
および、ＬＳＹＮ−３８プライマー：
【０１０８】
【化１７】
【０１０９】
を用い、肺炎連鎖球菌の血清型１９Ａの染色体ＤＮＡについてＰＣＲを行い、１４１０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１１０】
ＰＣＲにより合成したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１１ｂ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲーションして、ｐＳＡ−３１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換により大腸菌ＤＥ３細胞中に導入した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化により、インサートの存在を確認し、さらにＤＮＡ配列を確認した。
【０１１１】
コードされる４７０アミノ酸のポリペプチドは、野生型のニューモリシンタンパク質のカルボキシ末端に存在する１アミノ酸が欠失しており、以下の配列を有する：
【０１１２】
【化１８】
【０１１３】
実施例２：組み換えシュードニューモリシンポリペプチドの発現、精製、および特性
実施例１に記載されているように、ｐＥＴ発現ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングした。組み換えＤＮＡで大腸菌を形質転換し、形質転換体を、抗生物質を含有するプレート上で選択した。インサートＤＮＡの配列を、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。組み換え大腸菌を３７℃にて一晩増殖させ、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を誘導剤として培地に添加し、この細胞を続けて３時間増殖させた。発現した組み換えポリペプチドを、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価した。アフィニティクロマトグラフィを用いて組み換えポリペプチドを精製し、ヒツジまたはヒトの赤血球を用いた溶血アッセイにより溶血作用を試験した（実施例３に詳述する）。
【０１１４】
実施例３：シュードニューモリシンポリペプチドの溶血作用の決定
以下の手法に従って、コードされたポリペプチドの溶血作用を決定した。
【０１１５】
１）ヒトまたはヒツジの赤血球の２％懸濁液を調製する。０．２ｍＬの新鮮な血球を１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に添加する。この懸濁液を３０００ｒｐｍにて３０秒間スピンさせ、ペレットを１０ｍＬのＰＢＳに３回再懸濁させる。
【０１１６】
２）１μｇのポリペプチドを０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に添加し、０．５ｍＬの洗浄した２％ＲＢＣ懸濁液と混合する。
【０１１７】
３）この混合物を３７℃にて１時間インキュベートし、次いで、エッペンドルフマイクロ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）中で１０，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離する。
【０１１８】
４）５４１ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定する。全長ニューモリシンポリペプチドと比較したＯＤ吸収の百分率として、溶血作用を測定する。
【０１１９】
表１に示すように、Ｃ末端の７、６、２、または１アミノ酸を欠失しているニューモリシンの断片は溶血作用を示さなかった。Ｃ末端の５アミノ酸を欠失している断片では、溶血作用の一部が失われていた。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
実施例４：多糖類−タンパク質共役体の調製
Ａ．多糖類の酸化
肺炎球菌の莢膜多糖類（例えば、４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８、１９Ｆ、および２３Ｆ）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、ヴァージニア州）から購入した。１０ｍｇの多糖類を、４℃にて一晩、１ｍＬの蒸留水に溶解させた。次の日に、１ｍＬの０．２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加した。室温にて１０分間、暗室で２ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（ＭＷ：２１３．９、シグマ）と反応させることにより、多糖類を酸化させた。最終濃度２５ｍＭのエチレングリコール（ＭＷ：６２．０７）との反応により、過剰な過ヨウ素酸ナトリウムを分解させた。多糖類を含有する反応混合物を、１０００ｍＬの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で３回、充分に透析した。
【０１２２】
Ｂ．イムノ−アフィニティカラムの調製
（ｉ）全長Ｈｉｓ−タグニューモリシンの精製
大腸菌（Ｃ−Ｈｉｓタグニューモリシンを含有するｐＥＴ２４ｂ）を、４０μＬの２０％グルコースおよび４μＬの５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する４ｍＬのＬＢ培地中で増殖させ、３７℃にて一晩、１６０ｒｐｍで連続振盪しながらインキュベートした。一晩培養した培地の３ｍＬを、１ｍＬの２０％グルコースおよび１００μＬの５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃にて１６０ｒｐｍで連続振盪しながら、ＯＤ６００が０．４〜０．５に達するまでインキュベートした。４００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを、ＩＰＴＧの最終濃度が４ｍＭとなるように、１００ｍＬの培地に移した。遺伝子発現の誘導の３時間後に、４０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離によって細胞を回収した。インビトロジェン（カールスバッド、カリフォルニア州）により提供されるプロボンド精製システム（ＰｒｏＢｏｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）の手法に従って、全長Ｈｉｓ−タグニューモリシンを精製した。
【０１２３】
（ｉｉ）Ｈｉｓ−タグニューモリシンに対するポリクローナル抗体の製造
ニュージーランド白ウサギの４箇所の異なる部位に、それぞれ２５μｇの４つの等量の乳化Ｈｉｓ−タグニューモリシンおよびタイターマックス（ＴｉｔｅｒＭａｘ）アジュバント（４００μＬの１ｍｇ／ｍＬ Ｈｉｓ−タグニューモリシンおよび４００μＬのタイターマックスアジュバント）を注射した；それぞれの大腿筋（ｉ．ｍ．）にそれぞれ１箇所、および、背中の縦方向の筋に沿って脊椎のそれぞれの側の皮下（ｓ．ｃ．）。１４日後、上記のウサギから耳静脈経由で５ｍＬの血液を回収した。
【０１２４】
血清からの抗体の力価が１：３０００の希釈レベルに達していれば、その動物からは最終的に血液を採取した。抗体の力価が１：３０００未満であれば、第２の用量の抗原を注射し、当該動物を１週間後に試験した（第２の用量の７日後）。このサイクルを、充分な力価が達成されるまで続けた。
【０１２５】
（ｉｉｉ）アフィ−ゲル（Ａｆｉ−Ｇｅｌ）タンパク質Ａアガロースを用いたウサギＩｇＧの精製
Ｈｉｓ−タグニューモリシンを用いて免疫されたウサギからの血清を、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．２）を用いて平衡化したアフィ−ゲルタンパク質Ａカラムにアプライした。１０ベッド体積を用いて洗浄した後、２〜５体積の１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いて免疫グロブリンを溶出させた。溶出したＩｇＧを回収してプールし、２８０におけるＯＤを測定した。３ｍＬの精製ＩｇＧを１０ＤＧカラムにさらにアプライし、カラムから溶出した最初の３ｍＬを捨てた。このカラムに、３．５ｍＬのカップリング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５）または０．１Ｍの３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液のいずれかを添加した。３．５ｍＬの溶出ＩｇＧを回収しプールして、さらにアフィ−ゲルＨｚまたはアフィ−ゲル１０のいずれかとカップリングさせた。
【０１２６】
（ｉｖ）アフィ−ゲル１０へのＩｇＧのランダムカップリングを用いたイムノアフィニティカラムの調製
アフィ−ゲル１０は、誘導体化された架橋アガロースゲルビーズ担体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、第１級アミンを介して全てのリガンドとカップリングする。ＩｇＧとのカップリングのために、アフィ−ゲル１０を１５ｍＬチューブに移し、冷ＤＤＨ２Ｏで３回、および冷０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。予め洗浄されたアフィ−ゲル１０を含む１５ｍＬチューブに精製ＩｇＧを添加し、４℃にて４時間逆さまに回転させた。１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を添加しさらに４℃にて０．５時間で、アフィ−ゲル１０の残留活性エステルをブロックした。このゲルを１．５×９．０ｃｍのカラムに移した。カラムの溶出液を回収し、２８０でのＯＤを測定した。２ベッド体積の０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いて、このアフィ−ゲル１０イムノアフィニティカラムを洗浄した。カラムの溶出液を再度回収し、２８０でのＯＤを測定した。全ＩｇＧおよび非カップリングＩｇＧの濃度に基づき、カップリング効率を算出した。
【０１２７】
（ｖ）イムノアフィニティカラムの試験
イムノアフィニティカラムを試験するために、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィからのシュードニューモリシンを含む画分を、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％トリトンＸ−１００に添加した。０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化された６．５ｍＬのアフィ−ゲルカラム（１，５×１２ｃｍ）に、この試料を１ｍＬ／２分の流速でアプライした。フロースルー画分を回収した。１５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いて、このカラムを２〜３回洗浄した。５ｍＬの４Ｍ尿素を用いてこのカラムを再度洗浄した。７ｍＬの４Ｍ尿素を用いて、結合したシュードニューモリシンタンパク質を２回溶出させた。最初の７ｍＬの４Ｍ尿素画分からのタンパク質試料を、９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブリリアントブルーＲ−２０で染色することにより可視化した。
【０１２８】
Ｃ．組み換えシュードニューモリシンタンパク質の調製
発現ベクターｐＳＡ−４９（ニューモリシンのＣ末端の７アミノ酸を欠失しているポリペプチドをコードする；実施例１を参照）で形質転換された細菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する３０ｍＬのＬＢ培地を含む５０ｍＬチューブ中で、３７℃にて一晩増殖させた。翌朝、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．２％のグルコースを含有する、１Ｌフラスコ中の４００ｍＬのＬＢ培地に、一晩培養物の１３ｍＬを接種し、３７℃にて振盪しながらインキュベートした。０．５のＡ６００に相当する細胞密度で、２または４ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、シュードニューモリシンタンパク質を３時間誘導した。
【０１２９】
５００ｍＬ遠心チューブ中で６，５００ｒｐｍにて１０分間、細菌を遠心分離した。１００μｇ／ｍＬのリゾチームを含む４０ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に細菌ペレットを再懸濁させ、氷上で１５分間インキュベートし、氷上で１０秒間のバーストで３回超音波分解した。溶解物を−８０℃にて１０分間凍結させて、３７℃にて５分間融解させた。この細胞溶解物に、超音波分解−凍結−融解によりさらに２回処理した。６，０００ｒｐｍにて２０分間の遠心分離により、不溶性の細胞の破片を除去した。上清の溶解物を、さらに０．８μＭフィルタを通過させた。フロースルータンパク質を９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により試験し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色により可視化した。未精製の溶解物を、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィによりさらに精製した。
【０１３０】
２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを含むカラム（５×１２ｃｍ）に、２０ｍＬの未精製の細菌溶解物をロードした。最初のフロースルーを回収した後、１０ｍＬの２５ｍＭトリス塩酸をカラムに添加した。１０ｍＬのフロースルーを回収し、最初のフロースルー画分とプールした（画分１）。次いで、３５ｍＬの２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）をアプライし、フロースルーを回収した（画分２）。さらに３５ｍＬの２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）をアプライし、フロースルーを再度回収した（画分３）。４Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸を用いて、結合している細菌タンパク質を溶出させた（画分４）。２８０ｎｍでのＯＤを測ることにより、各画分中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質試料を９％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クマシーブルーＲ−２０で染色して可視化した。シュードニューモリシンを含有するフロースルー画分（１および２）を、イムノアフィニティクロマトグラフィによりさらに精製した。
【０１３１】
ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィの後、シュードニューモリシンを含む画分を、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％トリトンＸ−１００に添加した。０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化した、ウサギ抗ニューモリシンＩｇＧをカップリングした６．５ｍＬのアフィ−ゲル１０カラム（１．５×１２ｃｍ）に、この試料を１ｍＬ／２分の流速でアプライした。フロースルー画分を回収した。１５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いてこのカラムを３回洗浄した。５ｍＬの４Ｍ尿素を用いてこのカラムを再度洗浄した。７ｍＬの４Ｍ尿素を用いて、結合しているシュードニューモリシンタンパク質を２回溶出させた。非結合画分および結合画分からのタンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブリリアントブルーＲ−２０での染色により可視化した。
【０１３２】
イムノアフィニティクロマトグラフィの後、シュードニューモリシンを含有する４Ｍ尿素溶出画分を、１０ＤＧクロマトグラフィによりさらに精製し、尿素を除去した。１×ＰＢＳ緩衝液で平衡化された１０ＤＧカラム（１．５×１２ｃｍ）に、３．０ｍＬの試料をアプライした。最初の３．０ｍＬのフロースルーを捨てた。このカラムに３．９ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液を添加した。カラムから回収したこの３．９ｍＬの画分について、２８０でのＯＤを測定し、タンパク質画分を回収した。９％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質の純度を評価した。
【０１３３】
Ｄ．多糖類−タンパク質共役体の調製
２μｇの肺炎連鎖球菌の多糖類１８Ｃを、還元アミノ化アッセイを用いた直接共役により、シュードニューモリシンタンパク質（上記の項Ｃに記載）に共役させた。酸化された多糖類反応混合物に、０．１Ｍ ＰＢＳ中の１０ｍｇのシュードニューモリシンを添加し、緩やかに撹拌しながら室温にて３０分間インキュベートした。シアノボロヒドリドナトリウムを、２０ｍＭの最終濃度で添加した（例えば、７５０μＬの１００ｍＭシアノボロヒドリドを、３ｍＬの酸化された多糖類とシュードニューモリシンとの混合物に添加した）。この混合物を緩やかに撹拌しながら室温にて５日間インキュベートした。この共役体を９，０００ｒｐｍにて１０分間沈殿させ、次いで１〜２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解させた。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（１．５×１００ｃｍ）を用い、この混合物をクロマトグラフにかけた。タンパク質および多糖類の双方を含む画分をプールし、アミコン セントリコン−３０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０）（分子量カットオフ３０，０００）により濃縮し、次いでタンパク質および多糖類の含量をアッセイした。
【０１３４】
実施例５：多糖類−タンパク質共役体に対するマウスの抗体応答
実施例４に記載のように調製した肺炎連鎖球菌１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、４、６Ｂおよび９Ｖの多糖類シュードニューモリシンタンパク質共役体について、マウスで多糖類およびニューモリシンに対する抗体を増強する能力を試験した。水酸化アルミニウムアジュバント（０．１ｍｇ／用量）と混合された多糖類の用量あたり０．３、１、３μｇの共役体を、雌のＮＩＨスイスマウスの群に腹腔内注射した。いくつかの実験では、第２のマウス群は１μｇの多糖類を投与され、および／または、第３のマウス群は１μｇのシュードニューモリシンを投与された。２週間の間隔でマウスに２回のブースターを投与した。最後の注射の７日後、抗多糖類抗体および抗ニューモリシン抗体の血清レベルを測定した。表２に、投与された特定の共役体および、それぞれ図１〜１４に示される実験で測定された免疫応答をまとめた。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
図１〜１４の説明文では以下の略語が用いられている：リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）；共役体（「Ｃ」）；水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａ」）；および、シュードニューモリシン（「ＰＰＮ」）。
【０１３７】
前記多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスでは、Ｈｉｓ−タグ野生型ニューモリシンを用いたＥＬＩＳＡに反応する抗体が誘導された。共役体およびアジュバントを投与された全ての群について、抗ニューモリシンおよび抗多糖類抗体のレベルがＰＢＳおよびアジュバントのコントロールよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１、ｔ−検定）。共役体を投与されたマウスの血清は、驚くべきことに、ＰＢＳ単独で投与されたマウスと比較して、血清希釈係数がそれぞれ７６８００および９６００と高力価の高ニューモリシンおよび高多糖類抗体を発現した。最高の抗ニューモリシンおよび抗多糖類抗体レベルは、３．０μｇの多糖類−ニューモリシン共役体を投与されたマウスにおいて観察された（図１〜１４）。アジュバントを投与したシュードニューモリシン群（図３）またはアジュバントを投与しなかったシュードニューモリシン群（図６）と比較して、多糖類−シュードニューモリシン共役体をアジュバントとともに投与された群で抗ニューモリシン抗体レベルが高かった。
【０１３８】
表３および４によれば、３．０μｇの共役体を投与されたマウスが最高の応答百分率を有していたことが示される。これらの結果から、多糖類のシュードニューモリシンタンパク質への共役によって肺炎球菌ワクチンの有効性が改善されうることが示唆される。抗体の応答に加えて、共役体ワクチンを投与されたマウスにおいては、交差反応性免疫および細菌の減少も試験した（実施例８を参照）。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
図１５は、マウスにおける、血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体の３回目の注射の７日後の血清型１４の多糖類に対する抗体の応答を示すグラフである。図１５において、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３はそれぞれ、マウスあたり０．３μｇ、１，０μｇおよび３．０μｇの共役体ワクチンを注射されたマウスの群である。Ｇ４は、１．０μｇの血清型１４の多糖類を単独で注射されたマウスを示す。Ｇ５およびＧ６はそれぞれ、１．０および３．０μｇのシュードニューモリシンを単独で注射されたマウスの群である。Ｇ７は、１．０μｇの血清型１４の多糖類−シュードニューモリシン共役体ワクチンをアジュバントなしで注射されたマウスの群である。Ｇ４、Ｇ５およびＧ６のマウスでは、ほとんどまたは全く、多糖類に対する抗体の応答が観察されなかった。
【０１４２】
実施例６：シュードニューモリシン、肺炎球菌オートリシン、および肺炎球菌表面タンパク質ＤＮＡワクチンのための発現ベクターの構築
Ａ．ＤＮＡワクチンの構築のためのｐＶＡＸ１ベクター
ＤＮＡワクチンの開発に用いるために、ｐＶＡＸ１ベクター（インビトロジェン）を特異的に設計した。この構築は、１９９６年１２月２２日に出版された食品医薬品局の文書である「感染性疾患の予防的適応のためのプラスミドＤＮＡワクチンについて考慮すべきポイント」に沿ったものである。
【０１４３】
Ｂ．シュードニューモリシンのクローニングおよび発現
プライマーおよびテンプレートである肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡを含むレディトゥゴー（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ）ＰＣＲビーズ（アマシャム ファルマシア バイオテック インコーポレイテッド、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１．５分間を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。
【０１４４】
増幅したＰＣＲ産物を制限酵素を用いて消化し、ｐＶＡＸ１ベクターの部位へライゲーションし、ｐＳＡ−８、ｐＳＡ−４５、ｐＳＡ−１２、ｐＳＡ−４２、およびｐＳＡ−４１を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、制限酵素を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、インサート遺伝子を分析した。ＴｎＴキットを用いて製造者の説明書（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）に従い、インビトロでの転写および翻訳を行って、インサート遺伝子の発現を確認した。
【０１４５】
ｐＳＡ−８発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６０からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、上記のように、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１４６】
【化１９】
【０１４７】
および、ＬＳＹＮ−４プライマー：
【０１４８】
【化２０】
【０１４９】
を用いて、１３８０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１５０】
次いで、この１３８０塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−８を作製した。
【０１５１】
ｐＳＡ−４５発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６４からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１５２】
【化２１】
【０１５３】
および、ＬＳＹＮ−１０５プライマー：
【０１５４】
【化２２】
【０１５５】
を用いて、１３９２塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１５６】
次いで、この１３９２塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−４５を作製した。
【０１５７】
ｐＳＡ−１２発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６６からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１５８】
【化２３】
【０１５９】
および、ＬＳＹＮ−１７プライマー：
【０１６０】
【化２４】
【０１６１】
を用いて、１３９８塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１６２】
次いで、この１３９８塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−１２を作製した。
【０１６３】
ｐＳＡ−４２発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４６９からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１６４】
【化２５】
【０１６５】
および、ＬＳＹＮ−３７プライマー：
【０１６６】
【化２６】
【０１６７】
を用いて、１４０７塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１６８】
次いで、この１４０７塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−４２を作製した。
【０１６９】
ｐＳＡ−４１発現ベクターは、配列番号１のニューモリシンタンパク質のアミノ酸１〜４７０からなるポリペプチドをコードする。このインサートは、ＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０１７０】
【化２７】
【０１７１】
および、ＬＳＹＮ−３８プライマー：
【０１７２】
【化２８】
【０１７３】
を用いて、１４１０塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１７４】
次いで、この１４１０塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ｐＶＡＸ１ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−４１を作製した。
【０１７５】
非メチル化シトシン−グアニン（「ＣｐＧ」）ジヌクレオチドを特定の配列順またはモチーフ中に含む核酸は、インビトロにおける種々のタイプの免疫細胞の強力な刺激剤でありうる。ＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞を刺激して免疫グロブリン、ＩＬ−６およびＩＬ−１０、ＩＦＮ−γを産生するＮＫ細胞、並びにＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＴ−αおよびＩＦＮ−αを産生する単球および樹状細胞を増殖および分泌させることにより、先天的な免疫系を直接活性化しうる。２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンに連結された非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドからなるＤＮＡモチーフは、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生するＢ細胞を刺激し、ＩＬ−６およびＩＦＮ−ガンマを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激しうる。
【０１７６】
ニューモリシンの構造−機能分析によれば、システイン残基を含む、当該ポリペプチドのＣ末端のドメイン（アミノ酸４２７〜４３７に位置する）が細胞毒性に重要であることが示された。このシステインモチーフは、チオールにより活性化される細胞溶解素ファミリー間で高度に保存されている。このドメイン中での種々の一アミノ酸置換により、ニューモリシンの細胞毒性は有意に低下する。以下の核酸は、ニューモリシンのヌクレオチドの１２７２位および１２７４位に（部位特異的突然変異誘発法を用いて）ＧＡＧＣＧＴＴを導入することにより、このシステインモチーフをＣｐＧで置換している。ＧＡＧＣＧＴＴ免疫刺激性配列を含むこの変異核酸は、以下の通りである：
【０１７７】
【化２９】
【０１７８】
他の実施形態においては、Ｃ末端の３３ヌクレオチドを欠失したシュードニューモリシンのヌクレオチドの１２７２位および１２７４位に、（部位特異的突然変異誘発法を用いて）免疫刺激性ＤＮＡ配列であるＧＡＧＣＧＴＴを導入した。
【０１７９】
免疫刺激性配列を含むシュードニューモリシンＤＮＡは、以下の通りである：
【０１８０】
【化３０】
【０１８１】
Ｄ．肺炎球菌オートリシン遺伝子のクローニングおよび発現
ｐＳＡ−５９発現ベクターは、３１６アミノ酸のオートリシン（Ａｌｙ）ポリペプチドをコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＡｌｙ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５０℃にて１分間；７２℃にて１分間１５秒を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。このインサートは、ＬＳＹＮ−７４プライマー：
【０１８２】
【化３１】
【０１８３】
および、ＬＳＹＮ−８９プライマー：
【０１８４】
【化３２】
【０１８５】
を用いて、９４８塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１８６】
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、ＰＣＲで合成したＤＮＡを消化し、ｐＶＡＸ１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−５９（Ａｌｙ）を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、Ａｌｙインサートを確認した。ＴｎＴキットを用いて製造者の説明書（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）に従い、インビトロでの転写および翻訳を行って、ｐＳＡ−５９の発現を確認した。
【０１８７】
ｐＳＡ−５９Ａｌｙインサートの核酸配列は以下の通りである：
【０１８８】
【化３３】
【０１８９】
このｐＳＡ−５９Ａｌｙインサートによりコードされるアミノ酸配列は以下の通りである：
【０１９０】
【化３４】
【０１９１】
Ｅ．Ｎ末端肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）遺伝子のクローニングおよび発現
ｐＳＡ−６０発現ベクターは、４５９アミノ酸のＰｓｐＡポリペプチドをコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＰｓｐＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５０℃にて１分間；７２℃にて１分間１５秒を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。このインサートは、ＬＳＹＮ−９０プライマー：
【０１９２】
【化３５】
【０１９３】
および、ＬＳＹＮ−７８プライマー：
【０１９４】
【化３６】
【０１９５】
を用いて、１３７７塩基対のＤＮＡを増幅した。
【０１９６】
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、ＰＣＲで合成したＤＮＡを消化し、ｐＶＡＸ１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−６０（ＰｓｐＡ）を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、ＰｓｐＡインサートを確認した。ＴｎＴキットを用いて製造者の説明書（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）に従い、インビトロでの転写および翻訳を行って、ｐＳＡ−６０の発現を確認した。
【０１９７】
ｐＳＡ−６０ＰｓｐＡインサートの核酸配列は以下の通りである：
【０１９８】
【化３７】
【０１９９】
このｐＳＡ−６０ＰｓｐＡインサートによりコードされるアミノ酸配列は以下の通りである：
【０２００】
【化３８】
【０２０１】
実施例７：ＤＮＡワクチンの免疫原性
プラスミドベクターｐＳＡ−７は、全長ニューモリシンタンパク質をコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＰｌｙ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１．５分間を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。Ｐｌｙの５’末端のヌクレオチド１〜２４に相補的なＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０２０２】
【化３９】
【０２０３】
を、Ｐｌｙの３’末端のヌクレオチド１３９６〜１４１３に相補的なＬＳＹＮ−３プライマー：
【０２０４】
【化４０】
【０２０５】
とともに用いて、４７１アミノ酸の全長の野生型Ｐｌｙタンパク質をコードする１４１３塩基対のＤＮＡを増幅した。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて、ＰＣＲで増幅したこのＤＮＡフラグメントを処理し、ｐＶＡＸ１発現ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−７を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、血清型１９Ａの野生型Ｐｌｙ遺伝子インサートを確認した。
【０２０６】
プラスミドベクターｐＳＡ−１０は、Ｃ末端が断片化されたニューモリシンタンパク質（ＰｌｙのＣ末端の１１４アミノ酸を欠失している）をコードする。プライマーおよび肺炎球菌１９Ａ染色体ＤＮＡ由来のテンプレートを含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、血清型１９ＡのＰｌｙ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１．５分間を３０サイクル；および、７２℃にて１０分間を１サイクル。Ｐｌｙヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド１〜２４に相補的なＬＳＹＮ−１５プライマー：
【０２０７】
【化４１】
【０２０８】
を、３’末端のヌクレオチド１０５４〜１０７１に相補的なＬＳＹＮ−６プライマー：
【０２０９】
【化４２】
【０２１０】
とともに用いて、３５７アミノ酸のポリペプチドをコードする１０７１塩基対のＤＮＡを増幅した。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて、ＰＣＲで増幅したこのＤＮＡフラグメントを処理し、ｐＶＡＸ１発現ベクターのＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＳＡ−１０を作製した。この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、血清型１９Ａのシュードニューモリシン遺伝子インサートを確認した。
【０２１１】
プラスミドベクターｐＳＡ−２６は、ＣｐＧモチーフを有する全長ニューモリシンをコードする。３’末端にＣｐＧを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーＬＳＹＮ−３４およびＬＳＹＮ−３３を用いて、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２を作製した。第２のプライマーであるＬＳＹＮ−１５およびＬＳＹＮ−３はそれぞれ、ニューモリシンのＮ末端およびＣ末端の配列に相補的である。それぞれの増幅において、プライマーＬＳＹＮ−１５および３４（ＰＣＲ１）並びにＬＳＹＮ−３３および３（ＰＣＲ２）、並びに全長ニューモリシン遺伝子を含有するテンプレートｐＳＡ−７を含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、第１のＰＣＲ産物であるＰＣＲ１（１．２ｋｂ）およびＰＣＲ２（１５０ｋｂ）を作製した。第１のＰＣＲ産物を混合し、変性させ、第２のプライマーセットであるＬＳＹＮ−１５および３により作製される第２のＰＣＲ産物を作製するためのテンプレートとして用いた。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてこの第２のＰＣＲ産物を切断し、ｐＶＡＸ１のＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＳＡ−２６を作製した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１分間を３０サイクル；および、７２℃にて８分間を１サイクル。
【０２１２】
プライマーＬＳＹＮ−３、ＬＳＹＮ−１５、ＬＳＹＮ−３３、およびＬＳＹＮ−３４の配列は以下の通りである：
ＬＳＹＮ−３プライマー；
【０２１３】
【化４３】
【０２１４】
ＬＳＹＮ−１５プライマー；
【０２１５】
【化４４】
【０２１６】
ＬＳＹＮ−３３プライマー；
【０２１７】
【化４５】
【０２１８】
ＬＳＹＮ−３４プライマー；
【０２１９】
【化４６】
【０２２０】
この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、ＣｐＧモチーフを有する血清型１９Ａの野生型Ｐｌｙ遺伝子インサートを確認した。
【０２２１】
プラスミドベクターｐＳＡ−２７はＣｐＧモチーフを含み、ニューモリシンのＣ末端断片をコードする（１１アミノ酸を欠失している）。３’末端にＣｐＧを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーＬＳＹＮ−３４およびＬＳＹＮ−３３を用いて、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２を作製した。第２のプライマーであるＬＳＹＮ−１５およびＬＳＹＮ−３はそれぞれ、ニューモリシンのＮ末端およびＣ末端の配列に相補的である。それぞれの増幅において、プライマーＬＳＹＮ−１５および３４（ＰＣＲ１）並びにＬＳＹＮ−３３および３（ＰＣＲ２）、並びに全長ニューモリシン遺伝子を含有するテンプレートｐＳＡ−７を含むレディトゥゴーＰＣＲビーズを用いたＰＣＲにより、第１のＰＣＲ産物であるＰＣＲ１（１．２ｋｂ）およびＰＣＲ２（１５０ｋｂ）を作製した。
【０２２２】
第１のＰＣＲ産物を混合し、変性させ、第２のプライマーセットであるＬＳＹＮ−１５および４により作製される第２のＰＣＲ産物を作製するためのテンプレートとして用いた。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてこの第２のＰＣＲ産物を切断し、ｐＶＡＸ１のＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＳＡ−２７を作製した。ＰＣＲは以下のように実施した：９４℃にて４分間を１サイクル；９４℃にて１分間；５５℃にて１分間；７２℃にて１分間を３０サイクル；および、７２℃にて８分間を１サイクル。
【０２２３】
プライマーＬＳＹＮ−３、ＬＳＹＮ−４、ＬＳＹＮ−１５、ＬＳＹＮ−３３、およびＬＳＹＮ−３４のオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
ＬＳＹＮ−３プライマー；
【０２２４】
【化４７】
【０２２５】
ＬＳＹＮ−４プライマー；
【０２２６】
【化４８】
【０２２７】
ＬＳＹＮ−１５プライマー；
【０２２８】
【化４９】
【０２２９】
ＬＳＹＮ−３３プライマー；
【０２３０】
【化５０】
【０２３１】
ＬＳＹＮ−３４プライマー；
【０２３２】
【化５１】
【０２３３】
この組み換えＤＮＡを、形質転換によって大腸菌ＤＥ５α細胞に導入し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いた消化によりチェックした。ＤＮＡ配列決定により、ＣｐＧモチーフを有する血清型１９Ａのシュードニューモリシン遺伝子インサートを確認した。
【０２３４】
ＤＮＡベクターを用いた作製およびタンパク質を用いた増強を伴うワクチン化プログラムによって高レベルの特異的な免疫が生成し、場合によっては、現在ワクチンの開発に大きな問題を引き起こしている病原体に対する予防も可能となった。これらの実験では、ニューモリシンＤＮＡベクターを用いて３回免疫し、アジュバントなしでニューモリシンタンパク質を用いて増強した。
【０２３５】
図１６は、上述したシュードニューモリシンＤＮＡのワクチン化のためにプライム−ブースト法を用いた、ウサギにおける抗ニューモリシン抗体の応答を示すグラフである。レーン１、２、および３は、第１の（１）、第２の（２）、および第３の（３）筋内へのシュードニューモリシンＤＮＡのワクチン化の７日後の免疫応答を示す。レーン４はタンパク質増強（２００μｇニューモリシン）の１０日後の応答を示す。レーン５は、タイターマックスアジュバントと一緒に２００μｇのニューモリシンタンパク質を注射した１０日後の抗体の応答を示す。この結果から、ＤＮＡの３回の注射にタンパク質を用いた増強を加えると、アジュバントを用いた従来のタンパク質ワクチン化法と比較してより高い抗体の応答が得られることが示される。
【０２３６】
全体積０．１ｍＬの１×ＰＢＳ中のそれぞれ１００μｇの量のＤＮＡワクチンであるｐＳＡ−５９およびｐＳＡ−６０、並びに１つのベクターコントロールプラスミドＤＮＡを、それぞれＢａｌｂ／Ｃマウスの双方の大腿四頭筋または後肢に筋肉注射した。マウスには注射の間に２週間の間隔を置いて１００μｇのＤＮＡワクチンの４用量を注射した。最後の注射の７日後に、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ抗体の血清レベルを測定した。４回の注射によるＤＮＡワクチンを投与されたマウスは、コントロール群の９６００倍超のＩｇＧ Ａｂを産生した。これらの結果から、プラスミドＤＮＡは、マウスにおいてインビボでオートリシンまたは肺炎球菌表面タンパク質Ａ抗原を発現でき、免疫系を刺激して高レベルの特異的なＩｇＧ抗体を産生させうることが示される。
【０２３７】
図１７は、ＰｓｐＡ ＤＮＡワクチンを用いた４回目の注射の７日後の肺炎球菌の表面タンパク質Ａに対する抗体の応答を示すグラフである。図１８は、オートリシンＤＮＡワクチンを用いた４回目の注射の７日後の肺炎球菌オートリシンに対する抗体の応答を示すグラフである。
【０２３８】
実施例８：毒性肺炎球菌のヘテロ血清型への感染に対する予防的免疫および交差耐性
２．５μｇの血清型１４多糖類−シュードニューモリシン（−７アミノ酸）共役体の３用量を、２週間の間隔を置いてマウスに腹腔内投与した。コントロール群では、前記共役体をＰＢＳで置換した。３回目の注射の８日後に、０．１ｍＬあたり１×１０５〜１×１０６ＣＦＵ（コロニー形成単位）肺炎球菌を、免疫されたマウスに感染させた。注射されたミリリットルあたりのＣＦＵの正確な数を、ヒツジ血液寒天プレート上でのプレート計数により決定した。感染の１、３、および５時間後に、各マウスの５μＬおよび２０μＬの血液試料をヒツジ血液寒天プレート上に塗布し、３７℃にて一晩インキュベートした。共役体でワクチン化されたマウスでは、感染後に、コントロールに対して血液試料からの細菌の減少の有意な差が検出された。
【０２３９】
図１９は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型１４の肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。
【０２４０】
図２０は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型７の肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４１】
図２１は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型６Ｂの肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０５）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４２】
図２２は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型１８Ｃの肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１、３、および５時間後のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４３】
図２３〜２５は、血清型１４多糖類−シュードニューモリシン共役体で免疫されたマウスが血清型２３Ｆの肺炎球菌に感染した際の当該マウスの血液からの細菌の減少を示す。共役体で処理された群とＰＢＳで処理された群とでは、感染の１時間後（図２３）、３時間後（図２４）、および５時間後（図２５）のＣＦＵに有意差がみられた（ｐ＜０．０１）。これらのデータによっても、共役体で免疫されたマウスによって異種の肺炎球菌の血清型への感染に対する交差耐性が提供されることが示される。
【０２４４】
実施例９：オプソニン化食作用アッセイ
Ａ．オプソニン化食作用アッセイ
ヒト多形核白血球（ＰＭＮＬ）を用いたオプソニン化食作用アッセイにより、血清型１４の肺炎球菌の多糖類に対する抗体の機能的活性を測定した。抗血清を直列希釈（２倍）し、２０μＬの各血清試料を、ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｔｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地中に約２００ＣＦＵを含有する細菌懸濁液２０μＬと混合し、３７℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬの新生児ウサギ補体および４０μＬのＰＭＮＬ（４×１０５細胞）を添加した。この混合物を５％ＣＯ２雰囲気中で６０分間、３７℃にてインキュベートした。生存可能な細胞を計数するために、各試料からの２０μＬのアリコートを血液寒天プレート上に３枚播種し、３７℃に一晩維持した。補体コントロールは、肺炎球菌に対する抗体を除く全ての試験試薬を含んでいた。オプソニン化食作用力価は、補体中での増殖と比較して５０％超の細菌が死滅する最高の血清希釈の逆数として示した。
【０２４５】
Ｂ．食作用
健康な成人ボランティアから、単核球およびＰＭＮＬのデキストラン沈降およびフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＃１６−９２２−５４ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）分離によって、新鮮なＰＭＮＬを単離した。ＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＦｌｕｉｄｓ， Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ｐ３０４−１００）を用いて赤血球を溶解させた。ＢＭＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）中で細胞の最終濃度を１×１０７細胞／ｍＬに調節した。各試料について、ＰＭＮＬ２〜４×１０５細胞の４０μＬを用いた。
【０２４６】
Ｃ．マウス血清および細菌
１４多糖類に対するマウス抗血清をブレインハートインフュージョン培地で直列希釈（２倍、１：２〜１：２５６）し、各抗血清試料の２０μＬを、３７℃にて１５分間、２０μＬの細胞懸濁液（２００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌血清型１４）と混合した。
【０２４７】
血清型１４の肺炎連鎖球菌をブレインハートインフュージョン培地中で３７℃にて１０時間培養した。１０倍直列希釈により、本実験に用いるための細菌の数を決定した。１００μＬの試料をプレート上にアプライした。１：１０７希釈の試料を用いたプレート上では１０ＣＦＵが観察され。１：１０６希釈の試料を用いたプレート上では９１ＣＦＵが観察された。従って、本実験に用いるための細菌の濃度は約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬと決定された。血清型１４の肺炎連鎖球菌の１×１０９ＣＦＵ／ｍＬを、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。各試料について、２００ＣＦＵ／２０μＬを用いた。
【０２４８】
Ｄ．補体およびＰＭＮＬ
インキュベーション後、１０μＬの新生児ウサギ補体（若いウサギの血清から新鮮に回収され、使用まで−８０℃にて貯蔵されたアリコート）および４０μＬのＰＭＮＬ２．８×１０５細胞を添加した。この混合物を、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて６０分間インキュベートした。
【０２４９】
Ｅ．ＣＦＵの計数
生存可能な細胞を計数するために、各試料由来の２つの希釈（１：１０および１：１００）の２０μＬアリコートを、血液寒天プレート上に３枚播種し、３７℃に一晩維持した。補体コントロールは、肺炎球菌に対する抗体を除き、全ての試験試薬を含んでいた。
【０２５０】
Ｆ．オプソニン化食作用活性
オプソニン化食作用力価は、補体中での増殖と比較して５０％超の細菌が死滅する最高の血清希釈の逆数として示した。オプソニン化食作用の力価は、
【０２５１】
【表５】
【０２５２】
【表６】
【０２５３】
表５および６に示すように、血清型１４多糖類およびシュードニューモリシンに対してより高い抗体の応答を有するマウス（例えば、マウス番号１、２、３、４、５、および７）は、より高いオプソニン化活性を示したのに対し、血清型１４多糖類およびシュードニューモリシンに対してより低い抗体力価を有するマウス（例えば、マウス番号６および８）は、より低いオプソニン化活性を示した。ＰＢＳを注射されたマウスではオプソニン化活性は検出されなかった。
【０２５４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載したが、上記の記載は例示のためのものであって、本発明の技術的範囲を制限するものではないと解されるべきである。本発明の他の形態、利点、および修飾は、下記の特許請求の範囲内のものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における肺炎連鎖球菌のニューモリシンに対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含む哺乳動物発現ベクター、および、精製されたニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントの使用。
【請求項２】
前記哺乳動物に対して、前記発現ベクターを少なくとも２つの異なる用量で投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントの投与が、前記発現ベクターの投与の少なくとも１週間後である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
肺炎連鎖球菌の表面タンパク質Ａポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、ベクターが哺乳動物へ投与されたときに、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発する、哺乳動物発現ベクター。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列からなる、請求項４または５に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項７】
前記免疫応答が、液性免疫応答を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項８】
前記免疫応答が、細胞性免疫応答を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項９】
哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における、請求項４〜８のいずれか１項に記載の哺乳動物ベクターの使用。
【請求項１０】
前記免疫応答は、少なくとも１つの連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌以外の種に対して交差反応性である、請求項９に記載の使用。
【請求項１】
哺乳動物における肺炎連鎖球菌のニューモリシンに対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における、肺炎連鎖球菌のニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含む哺乳動物発現ベクター、および、精製されたニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントの使用。
【請求項２】
前記哺乳動物に対して、前記発現ベクターを少なくとも２つの異なる用量で投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ニューモリシンポリペプチドまたはその抗原性フラグメントの投与が、前記発現ベクターの投与の少なくとも１週間後である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
肺炎連鎖球菌の表面タンパク質Ａポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレオチド配列に対して作動可能なように結合したプロモータを含み、ベクターが哺乳動物へ投与されたときに、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発する、哺乳動物発現ベクター。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列からなる、請求項４または５に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項７】
前記免疫応答が、液性免疫応答を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項８】
前記免疫応答が、細胞性免疫応答を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項９】
哺乳動物における肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における、請求項４〜８のいずれか１項に記載の哺乳動物ベクターの使用。
【請求項１０】
前記免疫応答は、少なくとも１つの連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌以外の種に対して交差反応性である、請求項９に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２０１２−１３９２２１（Ｐ２０１２−１３９２２１Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２５４５１（Ｐ２０１２−２５４５１）
【出願日】平成２４年２月８日（２０１２．２．８）
【分割の表示】特願２００９−２５３５３６（Ｐ２００９−２５３５３６）の分割
【原出願日】平成１５年１１月６日（２００３．１１．６）
【出願人】（５０５１６８９７５）シナジー アメリカ，インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月８日（２０１２．２．８）
【分割の表示】特願２００９−２５３５３６（Ｐ２００９−２５３５３６）の分割
【原出願日】平成１５年１１月６日（２００３．１１．６）
【出願人】（５０５１６８９７５）シナジー アメリカ，インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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