脱皮ホルモン受容体及び当該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法
害虫駆除剤等に応用可能な物質を効率的にスクリーニングすべく、全く新規な脱皮ホルモン受容体を提供する。 以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる昆虫脱皮ホルモン受容体。（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、エクジステロイド等の昆虫脱皮ホルモンに対して結合能を有する脱皮ホルモン受容体及び当該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
田畑等の農業生産現場における害虫駆除は、生産性の向上、生産品質の向上といった諸問題を解決することができる。このため、害虫駆除に関する諸研究がなされているが、例えば、昆虫成長抑制物質を主体とする害虫駆除剤の開発が望まれている。
一方、昆虫の脱皮・変態は、昆虫を特徴付ける現象であり、ホルモンにより制御されている。昆虫における脱皮・変態の制御は、ステロイドホルモンであるエクジステロイドによることが知られている。先ず、昆虫体内で合成されたエクジステロイドは、細胞膜を通過して、核内に存在する脱皮ホルモン受容体及びＵＳＰ（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）のヘテロダイマーと結合して複合体を形成する。次に、この複合体は、初期遺伝子群の上流に存在する応答配列に結合することで、当該初期遺伝子群の発現を誘導する。その後、初期遺伝子群の発現を契機にして、昆虫の脱皮・変態に関連する遺伝子群の発現を促進するとともに昆虫の脱皮・変態が進行する。
このように、脱皮ホルモン受容体は、昆虫が脱皮・変態する際のシグナル伝達経路において最上流に位置することが知られている。したがって、上述したような昆虫成長抑制物質として、エクジステロイドと脱皮ホルモン受容体との結合を阻害する物質を探索することが、害虫駆除剤の開発に有効であることが判る。
しかしながら、エクジステロイドと脱皮ホルモン受容体との結合を阻害する物質のスクリーニング方法としては確立されたものはなく、害虫駆除剤として有効な物質を容易にスクリーニングすることができなかった。また、従来、昆虫成長抑制物質のスクリーニングには、昆虫全体を用いる系、表皮等の一部の組織を用いる系及び培養細胞を用いる系などのスクリーニング系が知られている（非特許文献１乃至４参照）。しかしながら、昆虫成長抑制物質のスクリーニングについて、分子レベル（タンパク質レベル）での研究は殆ど行われていないの現状である。
【非特許文献１】Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｍｉｋｉｔａｎｉ Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．３１（４）：５３１−５３６
Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｃｄｙｓｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｐｏｒｔａｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ５’−ｕｐｓｔｒｅｍｅｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｄｉｐｔｅｒａ； Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）ａｃｅｔｈｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ
【非特許文献２】Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｍｉｋｉｔａｎｉ Ｊ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４２：（１０）９３７−９４１ ＯＣＴ １９９６
Ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ ａｇｏｎｉｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ ｉｎ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ
【非特許文献３】Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｍｉｋｉｔａｎｉ ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．２２７：（２）４２７−４３２ ＯＣＴ １４ １９９６
Ａ ｎｅｗ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，５−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ ｓｈｏｗｓ ａｐｐａｒｅｎｔ ｉｎｓｅｃｔｍｏｌｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖｅｌｓ
【非特許文献４】Ｔｒｉｓｙｏｎｏ Ａ，Ｇｏｏｄｍａｎ ＣＬ，Ｇｒａｓｅｌａ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ−ＡＮＩＭＡＬ ３６：（６）４００−４０４ ＪＵＮ ２０００
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｃｄｙｓｏｎｅ ａｇｏｎｉｓｔｓ
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、害虫駆除剤等に応用可能な物質を効率的にスクリーニングすべく、全く新規な脱皮ホルモン受容体及び当該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供することを目的としている。
【発明の開示】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、脱皮ホルモンと、脱皮ホルモン受容体の各ドメインとの結合について新たな知見を見いだし本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる昆虫脱皮ホルモン受容体。
（ａ）配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（２）上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする（１）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
（３）上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする（１）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
（４）（１）乃至（３）いずれか一に記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に、供試物質を作用させる第１工程と、前記複合体と前記供試物質との結合を測定する第２工程とを含む脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（５）上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、３０〜９０分反応させることを特徴とする（４）記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（６）上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、２０〜３７℃の条件下で反応させることを特徴とする（４）記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（７）上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、実質的に塩を含まない条件下で反応させることを特徴とする（４）記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（８）以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる、昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
（ａ）配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（９）上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする（７）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
（１０）上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする（８）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０３１６０６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、（ａ）はＥｃＲのドメイン構成を模式的に示す構成図であり、（ｂ）はＵＳＰのドメイン構成を模式的に示す構成図である。
図２は、ＥｃＲのｃＤＮＡクローニングにおいて作製したプライマーの位置及び配列を示す模式図である。
図３は、ＵＳＰのｃＤＮＡクローニングにおいて作製したプライマーの位置及び配列を示す模式図である。
図４は、実施例２で作製した様々な長さのＥｃＲ組換え体を示す模式図である。
図５は、実施例２で作製した様々な長さのＵＳＰ組換え体を示す模式図である。
図６は、大腸菌で発現したＥｃＲ組換え体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図７は、大腸菌で発現したＵＳＰ組換え体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図８は、ＥｃＲ組換え体を確認するために行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図９Ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｂは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｃは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｄは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｅは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図１０は、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてすべてのＥｃＲ組換え体についてリフォールディング反応を行い、すべてのＥｃＲ組換え体について排除限界の位置に溶出されたことを確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１１は、精製したＥｃＲ組換え体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１２は、ＵＳＰ組換え体をアフィニティー精製した後の各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１３は、実施例３で作製した発現ベクターを示す模式図である。
図１４は、哺乳類細胞を用いてＥｃＲ組換え体を発現させた系において、当該ＥｃＲ組換え体を確認するために行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図１５は、実施例４における実験の工程を示すフローチャートである。
図１６は、大腸菌で発現させたＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いて、ポナステロンＡとの結合能を測定した結果を示す特性図である。
図１７は、哺乳類細胞で発現させたＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いて、ポナステロンＡとの結合能を測定した結果を示す特性図である。
図１８は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの最適なモル比を検討した結果を示す特性図である。
図１９は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応時間を検討した結果を示す特性図である。
図２０は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応温度を検討した結果を示す特性図である。
図２１は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な塩濃度を検討した結果を示す特性図である。
図２２は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応における、結合曲線を示す特性図である。
図２３は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応における、スキャッチャード解析を行った結果を示す特性図である。
図２４は、エクダイソン及びエクダイソンアゴニストとＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体との結合を解析した結果を示す特性図である。
図２５は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体と内分泌攪乱物質及び女性ホルモンとの結合を解析した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を適用したスクリーニング方法（以下、単に「本スクリーニング法」と称する）は、ハスモンヨトウ由来の脱皮ホルモン受容体（以下、ＥｃＲと略記する場合もある）におけるＤ領域からＦ領域までのセグメント（以下、ＥｃＲ−ＤＦと略記する場合もある）と、ハスモンヨトウ由来のＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ（以下、ＵＳＰと略記する場合もある）のＡ領域からＥ領域までのセグメント（以下、ＵＳＰ−ＡＥと略記する場合もある）若しくは当該ＵＳＰにおけるＤ領域からＥ領域までのセグメント（以下、ＵＳＰ−ＤＥと略記する場合もある）との複合体を、供試物質に作用させ、その後、前記複合体と前記供試物質との結合を測定することで、供試物質における脱皮ホルモン受容体に対する結合能（リガンド能）を評価するものである。
ここで、脱皮ホルモン受容体とは、図１ａに示すように、Ａ／Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域、Ｅ領域及びＦ領域の６領域から構成された、脱皮ホルモンに対する受容体である。ハスモンヨトウ以外の昆虫においても脱皮ホルモン受容体は同定されており、このようなハスモンヨトウ以外の昆虫における研究からＥｃＲのＣ領域はＤＮＡ結合領域であることが示唆されている。また、ハスモンヨトウ以外の昆虫において、ＥｃＲのＥ領域はホルモン結合領域であることが示唆されている。
また、ＵＳＰとは、図１ｂに示すように、Ａ／Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域及びＥ領域の５領域から構成され、脱皮ホルモン受容体とヘテロダイマーを形成するオーファン受容体である。
先ず、本スクリーニング方法において使用するＥｃＲ−ＤＦについて説明する。ＥｃＲ−ＤＦとしては、例えば、配列番号１に表すアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。しかしながら、ＥｃＲ−ＤＦは、配列番号１に表すアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号１に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、ＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態でエクダイソンと結合できるものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」としては、例えば２〜５０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個である。
また、ＥｃＲ−ＤＦは、ＥｃＲのＤ領域及びＦ領域を含むセグメントであれば良く、例えばＥｃＲのＤ領域のＮ末端側にＣ領域の一部を含んでいても良い。すなわち、配列番号１に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列としては、ＥｃＲのＤ領域及びＦ領域を含み、当該Ｄ領域のＮ末端側にＣ領域の一部が含まれているアミノ酸配列を挙げることができる。ここで、Ｃ領域の一部とは、例えば１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸である。
次に、ＥｃＲ−ＤＦの調製方法について説明する。本スクリーニング方法において、ＥｃＲ−ＤＦの調整方法としては特に限定されないが、例えば以下のように調製することができる。すなわち、先ず、ハスモンヨトウのｃＤＮＡライブラリーを作製し、所定のプライマーを用いてＥｃＲをコードするｃＤＮＡをクローニングする。次に、このＥｃＲのｃＤＮＡを用いてＥｃＲ遺伝子のコーディング領域の塩基配列を決定する。塩基配列に基づいて設計したＥｃＲ−ＤＦをコードする領域を増幅するためのプライマーを用い、ＥｃＲのｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡを増幅する。その後、増幅したＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、適当な宿主に形質転換した後、得られた形質転換体において発現させたＥｃＲ−ＤＦを回収することで、ＥｃＲ−ＤＦを調製することができる。
このＥｃＲの調製方法において、ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのｍＲＮＡは、ハスモンヨトウの成虫、幼虫、蛹の如何なる段階から抽出しても良いし、ハスモンヨトウの如何なる部位から抽出してもよい。具体的に、ハスモンヨトウ幼虫に脂肪体から全量ＲＮＡを抽出し、抽出した全量ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡを使用することができる。
全量ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブリーの作製は、定法に従って行うことができる。すなわち、全量ＲＮＡを用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＥｃＲのｃＤＮＡをクローニングすることができる。
ＥｃＲのｃＤＮＡをクローニングする際のプライマーとしては、他の鱗翅目昆虫において保存されている配列を基に設計した縮重プライマーを使用することができる。具体的に、縮重プライマーとしては、図２に示すように６組の縮重プライマーを挙げることができる。これら６組の縮重プライマーは、それぞれＥｃＲ−Ｆ１及びＥｃＲ−Ｒ１と、ＥｃＲ−Ｆ２及びＥｃＲ−Ｒ２と、ＥｃＲ−Ｆ３及びＥｃＲ−Ｒ３と、ＥｃＲ−Ｆ４及びＥｃＲ−Ｒ４と、ＥｃＲ−Ｆ５及びＥｃＲ−Ｒ５と、ＥｃＲ−Ｆ６及びＥｃＲ−Ｒ６と命名された。
また、縮重プライマーの塩基配列を以下に示す。
これら縮重プライマーを用いて、全量ＲＮＡから合成したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を合成することができる。そして、合成したｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、他の鱗翅目昆虫におけるＥｃＲとの相同性を検討する。
そして他の鱗翅目昆虫におけるＥｃＲとの相同性が高いことから、ＥｃＲのｃＤＮＡであると判断することができる。
次に、この塩基配列に基づいて、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡ塩基配列を決定するための５’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＥｃＲ−５’Ｒ）及び３’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＥｃＲ−３’Ｆ１）を設計することができる。
これら、ＥｃＲ−５’Ｒ及びＥｃＲ−３’Ｆ１と、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔのアンカー配列に特異的なプライマー（ＵＰＭ）とを用いて、全量ＲＮＡから合成したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を合成することができる。ＵＰＭの塩基配列を以下に示す。
そして、合成したｃＤＮＡ断片の塩基配列と、上記縮重プライマーを用いて合成したｃＤＮＡ断片の塩基配列とから、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。ＥｃＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１９に示し、ＥｃＲの演繹アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
ＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するには、先ず、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１９）に基づいて設計したプライマーＥｃＲ−Ｄ：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号２１）及びプライマーＥｃＲ−Ｆ：５’−ＴＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４６）を用い、クローニングしたＥｃＲのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによってＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡ断片を取得する。
次に、このＤＮＡ断片を宿主に応じて適当なベクターに挿入することによって、発現ベクターを構築することができる。また、宿主内でＥｃＲ−ＤＦを発現させる場合、ＥｃＲ−ＤＦのＮ末端にヒスチジンタグを付加するように発現ベクターを構築してもよい。
ここで、宿主としては、比較的に大量のＥｃＲ−ＤＦを得る目的で大腸菌を使用することが好ましい。なお、宿主としては、大腸菌に限定されず、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞株、Ｓｆ−９等の昆虫細胞など、従来より遺伝子発現系で用いられている各種細胞を用いることができる。
例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、発現ベクターは、例えば、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）を使用することができる。大腸菌発現用ベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）によれば、発現するＥｃＲ−ＤＦのＮ末端にヒスチジンタグを付加することができる。
宿主内で発現したＥｃＲ−ＤＦは、定法に従って生成することができる。なお、宿主として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡをｐＥＴ−２８ｂ（＋）に組み込んでなる発現ベクターで形質転換し、ＩＰＴＧにより発現誘導した場合、ＥｃＲ−ＤＦは不溶性の封入体を形成する。このため、この場合には、封入体を可溶化させた後にリフォールディングさせることで、目的とするかたちでＥｃＲ−ＤＦを取得することができる。
次に、本スクリーニング方法において使用するＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥについて説明する。
ＵＳＰ−ＡＥとしては、例えば、配列番号２に表すアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。しかしながら、ＵＳＰ−ＡＥは、配列番号２に表すアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号２に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、ＥｃＲ−ＤＦと複合体をなしうるものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」としては、例えば２〜２００個であり、好ましくは２〜１００個であり、より好ましくは２〜５０個である。
ＵＳＰ−ＤＥとしては、例えば、配列番号３に表すアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。しかしながら、ＵＳＰ−ＤＥは、配列番号３に表すアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号３に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、ＥｃＲ−ＤＦと複合体をなしうるものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」としては、例えば２〜２０個であり、好ましくは２〜１０個であり、より好ましくは２〜５個である。
これらＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥの調製方法は、上述したＥｃＲ−ＤＦの調製方法に準じて行うことができる。特に、ＵＳＰのｃＤＮＡをクローニングする際の４組の縮重プライマー、５’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー及び３’ＲＡＣＥ用の特異的プライマーを図３に示す。これら４組の縮重プライマーは、それぞれＵＳＰ−Ｆ１及びＵＳＰ−Ｒ１と、ＵＳＰ−Ｆ２及びＵＳＰ−Ｒ２と、ＵＳＰ−Ｆ３及びＵＳＰ−Ｒ３と、ＵＳＰ−Ｆ４及びＵＳＰ−Ｒ４と命名された。
４種類の縮重プライマー、５’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＵＳＰ−５’Ｒ１、ＵＳＰ−５’Ｒ２）、３’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＵＳＰ−３’Ｆ１、ＵＳＰ−３’Ｆ２）及びＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔのアンカー配列に特異的なプライマー（ＵＰＭ、ＮＵＰ、ＲＴＧ、ＲＴＧ−Ｎ）の塩基配列を以下に示す。
上述したＥｃＲ−ＤＦの調製方法に準じてクローニングされたＵＳＰのｃＤＮＡ塩基配列を配列番号３９に示し、ＵＳＰの演繹アミノ酸配列を配列番号４０に示す。
ＥｃＲのｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡを増幅する。その後、増幅したＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、適当な宿主に形質転換した後、得られた形質転換体において発現させたＥｃＲ−ＤＦを回収することで、ＥｃＲ−ＤＦを調製することができる。
ＵＳＰ−ＡＥをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するには、プライマーＵＳＰ−Ａ：５’−ＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＧＡＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号４１）及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１：５’−ＡＴＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＡＴＧ−３’（配列番号４２）を用い、ＵＳＰ−ＤＥをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するには、プライマーＵＳＰ−Ｄ：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号４３）及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１（配列番号４２）を用いることによって、上述したＥｃＲ−ＤＦの場合と同様に、ＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥを取得することができる。
本スクリーニング法では、上述のように得られるＥｃＲ−ＤＦ、ＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥを用いて、供試物質の脱皮ホルモン受容体に対する結合能（リガンド能）を評価する。例えば、供試物質に対して標識することで、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体に対する供試物質の結合能を評価することができる。このとき、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥと供試物質とを混合して、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体に対する供試物質の結合能を評価しても良いし、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体を予め調製した後に、供試物質を作用させ、その結合能を評価しても良い。
また、供試物質の標識には、放射性同位元素を用いる方法を使用することができる。
以上のように、本スクリーニング法によれば、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体を用いて、ＥｃＲとＵＳＰとのヘテロダイマーによる脱皮・変態に関連する遺伝子群の発現誘導を抑制するような物質を探求する有力な手段を提供することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ハスモンヨトウ由来ＥｃＲ及びＵＳＰの塩基配列決定
材料
本実施例では、クミアイ化学工業株式会社より供与されたハスモンヨトウ幼虫（終齢（６齢）幼虫（体長約４ｃｍ、重さ約１．５ｇ））を使用した。ハスモンヨトウ幼虫を実体顕微鏡下で解剖し、ピンセットを用いて脂肪体を摘出し、エッペンドルフチューブに回収、液体窒素で凍結後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出に用いるまで−８０℃で保存した。
ＲＴ−ＰＣＲ
摘出したハスモンヨトウの脂肪体よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する際には、ＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を、製品付属のプロトコールに従って用いた。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液は、一部をＤＥＰＣ処理水で希釈して分光光度計を用いその濃度を定量した。
得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液から２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、これをＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、製品付属のプロトコールに従い、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成を行った。またこれとは別に、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡより、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いたｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成も行った。
合成したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡをテンプレートとして、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。縮重プライマーとしては、図２及び図３に示したものを使用した。また、ＰＣＲ反応液の組成を表１に示した。
また、反応サイクルは、９４℃で３分維持した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニール及び７２℃で３０秒の伸長を３５サイクル行った後、７２℃で７分の処理を行うものとした。
ＰＣＲ産物はＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングを行った。キットに含まれるベクター（ｐＣＲ２．１）にＰＣＲ産物をライゲーションし、得られたプラスミドＤＮＡをコンピテントセルＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。そして、ＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択して、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。プラスミドＤＮＡを鋳型としたサイクルシーケンス反応は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｙ５．５ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥ
上記ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡ断片の塩基配列を基にして、５’ＲＡＣＥ用のプライマー及び３’ＲＡＣＥ用のプライマーを作製した。また、テンプレートとなるｃＤＮＡは、５’ＲＡＣＥにおいては、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて合成したものを使用した。また３’ＲＡＣＥにおいては、テンプレートとなるｃＤＮＡとしてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔを用いて合成したものを使用した。
これにより、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡ塩基配列及びＵＳＰの全長ｃＤＮＡ塩基配列を決定することができた。ＥｃＲの全長ｃＤＮＡ塩基配列を配列番号１９、ＥｃＲの演繹アミノ酸配列を配列番号２０に示した。また、ＵＳＰの全長ｃＤＮＡ塩基配列を配列番号３９、ＵＳＰの演繹アミノ酸配列を配列番号４０に示した。
〔実施例２〕ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の発現（大腸菌）
ＤＮＡ断片の調製
まず、ＥｃＲのリガンド結合領域（Ｅ領域）を含む、様々な長さの組換え体を作製するために、実施例１で得られた塩基配列を基に、特定の制限酵素サイトの配列を付加したプライマーを以下のように設計した。
また、ＵＳＰのリガンド結合領域（Ｅ領域）を含む、様々な長さの組換え体を作製するために、実施例１で得られた塩基配列を基に、特定の制限酵素サイトの配列を付加したプライマーを以下のように設計した。
これらプライマーを用いて、実施例１でクローニングに用いたプラスミドをテンプレートＤＮＡとして、ＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物をサブクローニングした。ＰＣＲ反応液の組成を表２に示した。
また、反応サイクルは、９４℃で３分維持した後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニール及び７２℃で１分の伸長を１５サイクル行った後、７２℃で７分の処理を行うものとした。
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから回収した後、ＴＯＰＯ ＴＡ ＣｌｏｎｉｎｇＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製品付属のプロトコールに従ってサブクローニングを行った。ＤＮＡシーケンサーを用い、目的のＰＣＲ産物の塩基配列に間違いがないことを確認した後、特定の制限酵素（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、もしくはＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの組み合わせ）でプラスミドを消化した。これを再び１％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルより目的のＤＮＡ断片を回収した。
なお、本実施例では、図４に示すように、プライマーＥｃＲ−Ａ及びプライマーＥｃＲ−Ｆにより全長のＥｃＲ（ＥｃＲ−ＡＦ）、プライマーＥｃＲ−Ｄ及びプライマーＥｃＲ−ＦによりＥｃＲのＤ領域からＦ領域までのセグメント（ＥｃＲ−ＤＦ）、プライマーＥｃＲ−Ｄ及びプライマーＥｃＲ−Ｅｒ１によりＥｃＲのＤ領域からＥ領域までのセグメント（ＥｃＲ−ＤＥ）、プライマーＥｃＲ−Ｅｆ及びプライマーＥｃＲ−ＦによりＥｃＲのＥ領域からＦ領域までのセグメント（ＥｃＲ−ＥＦ）並びに、プライマーＥｃＲ−Ｅｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｅｒ１によりＥｃＲのＥ領域セグメント（ＥｃＲ−Ｅ）をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ取得した。また、本実施例では、図５に示すように、プライマーＵＳＰ−Ａ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１によりＵＳＰのＡ領域からＥ領域までのセグメント（ＵＳＰ−ＡＥ）、プライマーＵＳＰ−Ｄ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１によりＵＳＰのＤ領域からＥ領域までのセグメント（ＵＳＰ−ＤＥ）並びにプライマーＵＳＰ−Ｅｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１によりＵＳＰのＥ領域セグメント（ＵＳＰ−Ｅ）をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ取得した。
形質転換
先ず、得られたＤＮＡ断片がコードするＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を、大腸菌内で発現させるため、形質転換ようの発現ベクターを構築した。プラスミドベクターはｐＥＴ−２８ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。このベクターには、目的タンパク質のＮ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）タグが付加されるように構成されている。このプラスミドＤＮＡは、２５ｍｌの培養液よりＨｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＬＩＮＧＥＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて調製した。目的のインサートＤＮＡが、トリプレットコドンのフレームのずれがなく、正確にベクターに挿入されていることを確認し、以降の実験に供する発現ベクターとした。
次に、上述のように構築した発現ベクター及び大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて、ヒートショック法及びエレクトロポレーション法によって形質転換した。
目的タンパク質の発現
上述した発現ベクターを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のシングルコロニーを、５ｍＬのＬＢ培地に植菌し３７℃で一晩浸盪培養した（前培養）。その後、培養容器は５００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコあるいは坂口フラスコを用い、そこに１００ｍｌのＬＢ培地、１００μｌのカナマイシンを加え、これに５ｍｌの前培養液を加えた。３７℃で浸盪培養し（本培養）、ＯＤ６００が０．６〜０．８になったところでＩＰＴＧを加え、目的タンパク質の誘導を開始した。各コンストラクトの誘導条件を表３に示した。なお、ＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＥｃＲ−ＤＥ、ＥｃＲ−ＥＦ及びＥｃＲ−Ｅについては、同一の条件で行った。
誘導後、培養液を４℃、８，０００ｒｐｍ、５分間遠心して集菌した。ＥｃＲ組換え体は、菌体を１５ｍｌのＰＢＳで、ＵＳＰ組換え体は、１０ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／３００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０））で良く懸濁し、それぞれに１０ｍｇのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を加え、低温室にてローテーターを用い、１時間ゆるやかに懸濁した後、−８０℃で凍結させた。１時間以上経過した後、解凍し超音波破砕機を用いて１２０Ｗで５分間（ＵＳＰ組換え体）、もしくは１０分間（ＥｃＲ組換え体）菌体を破砕し、４℃、１０，０００ｒｐｍ、で１５分間遠心した。
ＥｃＲ組換え体については、遠心後の沈殿画分を４ｍｌのＰＢＳに懸濁し、これに２５％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ−１００を１ｍｌを加えて室温で４時間〜一晩、ローテーターでゆるやかに懸濁した。次に４℃、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を４ｍｌのＰＢＳで４℃、９，０００ｒｐｍで５分間遠心し、洗浄した。この操作は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除くように（沈殿がサラサラになるまで）５〜１０回繰り返した。最後に沈殿画分は上清を完全に除去した後、精製に用いるまで−２０℃で保存した。一方、ＵＳＰ組換え体については菌体破砕、遠心後の上清画分を次の精製に用いた。
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した結果、発現したＥｃＲ組換え体（ＥｃＲ−ＡＦ、−ＤＦ、−ＤＥ、−ＥＦ、−Ｅ）は、不溶性の封入体画分に存在した（図６）。一方、ＵＳＰのすべての発現した組換え体（ＵＳＰ−ＡＥ、−ＤＥ、−Ｅ）は、その一部が可溶性画分で回収された（図７）。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに際しては、以下のように行った。サンプルは適量のサンプルバッファー（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／８％ＳＤＳ／２４％β−ＭＥ／４０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．０５％ＢＰＢ）と混合し、１００℃で５分間処理して調製した。また、分子量マーカーは、ＬＭＷ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＳＤＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。泳動終了後、ゲルを脱色液（５０％メタノール／７％酢酸）で１５分間固定した後、ＣＢＢ染色液（０．２５％ＣＢＢ Ｒ−２５０／５０％メタノール／５％酢酸）中で１５分間浸盪した。最後に、脱色液でバックグラウンドの色が抜けるまで脱色した。
発現した組換え体が目的のものであることを確認するために、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。分子量マーカーは、プレシジョンプレステインドスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。泳動終了後、ブロッティング装置を用いて、ゲルをＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ）に１００ｍＡで３０分間ブロッティングした。ブロッティング終了後、抗体の非特異的な吸着を防ぐために、５％スキムミルク入りのＴＢＳＴ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ／２．６８ｍＭ ＫＣｌ／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で２時間から一晩、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、ＴＢＳＴで１０分間、４回、膜を洗浄した。次にＴＢＳＴで２，０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温にてインキュベートした。１．５時間後、ＴＢＳＴで１０分間、４回、膜を洗浄しＴＢＳＴで５，０００倍希釈したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＨＲＰを加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＴＢＳＴで１０分間、４回、膜を洗浄し、ＨＲＰの基質としてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、化学発光させ、イメージングアナライザーで分析した。その結果、図８に示すように、すべての発現産物は目的のものであった。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したサンプルをゲルより切り出して、トリプシン消化により得られた消化物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてその分子質量を測定した。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ及び９Ｅに示すように、目的産物の消化物が確認されたことからも、今回の発現産物はすべて目的のものであった。
目的タンパク質の精製
（ＥｃＲ組換え体）
ＥｃＲの組換え体は、上述したように、すべて不溶性の封入体を形成し、発現産物は封入体に存在していた。このままでは、後述するリガンドとの結合実験に用いることができないので、可溶化させリガンドと結合するように、リフォールディングする必要があった。リフォールディング反応には、封入体を高濃度の尿素やグアニジン塩酸塩水溶液で可溶化後、徐々にそれらを除去していくことが必要である。そのために、透析法や、希釈法などが良く行われている。本実施例では、まず、８Ｍの尿素で可溶化したＥｃＲ組換え体を、希釈法を用いたリフォールディング反応を試みたが、尿素の終濃度が１Ｍ以下になると、可溶化していたタンパク質が再び沈殿になり、不溶化したのが観察された。そこで、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたリフォールディングを試みた。この方法の狙いは、排除限界が小さいゲルを用いることによって、ゲルの孔隙に入ることのできないＥｃＲ組換え体が排除限界の位置に溶出される。一方、尿素は低分子量のために、ゲルの孔隙に入り込み、ＥｃＲ組換え体より遅れて溶出される。これにより、可溶化したＥｃＲ組換え体尿素溶液より、尿素を除くことができ、ＥｃＲ組換え体は可溶化した状態で回収できるのではないかと考えた。このゲルろ過クロマトグラフィーを用いたリフォールディング反応を行った結果、すべてのＥｃＲ組換え体は、排除限界の位置に溶出されたことを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１０）。
溶出されたそれぞれのＥｃＲ組換え体を、限外ろ過により濃縮した。このサンプルの濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。その結果、２５ｍｌの培養液から１８６μｇのＥｃＲ−ＡＦ、２０６μｇのＥｃＲ−ＤＦ、９８μｇのＥｃＲ−ＤＥ、４６μｇのＥｃＲ−ＥＦ、１８２μｇのＥｃＲ−Ｅが得られた。このように精製したＥｃＲ組換え体溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した際の結果を図１１に示す。
（ＵＳＰ組換え体）
ＵＳＰ組換え体は、上述したように、その一部が可溶性画分に存在していた（図７参照）。このＵＳＰ組換え体には、Ｎ末端にＨｉｓ−タグが付加していることを利用して、ニッケル樹脂を用いたアフィニティー精製を行った（図１２）。限外ろ過により濃縮後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。その結果、１００ｍｌの培養液から、８１４μｇのＵＳＰ−ＡＥ、４１７μｇのＵＳＰ−ＤＥ、１．３ｍｇのＵＳＰ−Ｅが得られた。
〔実施例３〕ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の発現（動物培養細胞）
実施例３では、後述する実施例４「ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いたリガンド結合能解析」におけるポジティブコントロールとして、動物培養細胞でＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を発現させ、細胞からの抽出液を調製した。
動物培養細胞としてはＣＯＳ−７細胞を用いた。発現用プラスミドとしては、ＳＲαプロモーターの下流にＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＵＳＰ−ＡＥ又はＵＳＰ−ＤＥを挿入し、それぞれのＮ末端にＦＬＡＧタグを付けたものを用いた（図１３）。
この発現用プラスミドに組み込まれるＥｃＲ−ＡＦは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＥｃＲ−Ａｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｆｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、発現用プラスミドに組み込まれるＥｃＲ−ＤＦは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＥｃＲ−Ｄｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｆｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。なお、プライマーＥｃＲ−Ａｆ、プライマーＥｃＲ−Ｄｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｆｒの塩基配列を以下に示す。
また、この発現用プラスミドに組み込まれるＵＳＰ−ＡＥは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＵＳＰ−Ａｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、発現用プラスミドに組み込まれるＵＳＰ−ＤＥは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＵＳＰ−Ｄｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。なお、プライマーＵＳＰ−Ａｆ、プライマーＵＳＰ−Ｄｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒの塩基配列を以下に示す。
各発現用プラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して単独で形質導入し、４８時間後の細胞から抽出液をそれぞれ調製した。また、ＥｃＲ−ＡＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＡＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。さらにＥｃＲ−ＤＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＡＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。さらにＥｃＲ−ＡＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＤＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。さらにＥｃＲ−ＤＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＤＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。なお、ＣＯＳ−７細胞における目的産物の発現は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって確認した。
以上のようにして、ＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥを単独で含む４種類の抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＡＦ及びＵＳＰ−ＡＥを含む抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥを含む抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＡＦ及びＵＳＰ−ＤＥを含む抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＤＥを含む抽出液とを準備した。
得られた抽出液に対して抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、目的タンパク質の発現を確認した結果を図１４に示す。図１４に示すように、すべての抽出液において、目的とするタンパク質の単独発現及び共発現を確認することができた。
〔実施例４〕ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いたリガンド結合能解析
実施例４では、実施例２及び実施例３で得られたＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いて、これらＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の複合体とリガンドとの結合能に関して解析した。本例では、リガンドとして、植物由来のエクダイソンアゴニストであるポナステロンＡを使用した。
実施例４において、結合型と遊離型を分離するために、チャコールデキストラン法を用いた。これはステロイドホルモンをリガンドとする場合の一般的な方法で、反応停止の際に、デキストランでコーティングされた活性炭溶液を加えることにより、活性炭が受容体と未結合のリガンドを吸着する。これを遠心分離することによって活性炭画分（沈殿画分）と、受容体／リガンドの複合体が存在する上清画分とに分けることが可能となる。
実施例４における実験のフローを図１５に示した。すなわち、まず、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）／５ｍＭ ＤＴＴ／１ｍＭ ＰＭＳＦ）にポナステロンＡの受容体（ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の複合体）への非特異的な結合を防ぐため１％のＢＳＡを添加した。これに、実施例２で精製したＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＥｃＲ−ＤＥ、ＥｃＲ−ＥＦ或いはＥｃＲ−Ｅに対し、それぞれＵＳＰ−ＡＥ或いはＵＳＰ−ＤＥを混ぜ、終濃度１．３７ｎＭの［３Ｈ］ポナステロンＡ（［２４，２５，２６，２７−３Ｈ］Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ Ａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．））を加えた。これを２５℃で反応させ、４０分後に２００μｌの活性炭溶液（０．５％Ｃｈａｒｃｏａｌ，ｄｅｘｔｒａｎ ｃｏａｔｅｄ（ＳＩＧＭＡ）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ）添加により反応を停止させた。遠心分離後の上清画分を液体シンチレーターと混合させ、これを液体シンチレーションカウンタ（ＡＬＯＫＡ ＬＳＣ−５１００）を用いて放射活性（ＤＰＭ）を測定した。この時の測定値を全結合量とした。また、［３Ｈ］ポナステロンＡの１０，０００倍の非放射能標識ポナステロンＡを加えて同様の実験を行い、受容体に対するリガンドの非特異的結合量を求めた。受容体に対するリガンドの特異的結合量は、全結合量から非特異的結合量を引いた値とした。
結果を図１６に示す。図１６により、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体と、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＤＥの複合体には、リガンドとの結合能が認められた。一方、のＥｃＲおよびＵＳＰはいずれの長さでも、単独では特異的な結合は見られなかった。
一方、実施例３で調製した抽出液を用いて、同様に結合実験を行った。その結果、図１７に示すように、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ、およびＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＤＥを細胞内で共発現させた場合に、リガンドとの強い結合が見られた（ｌａｎｅ７及び８）。しかし、これらの組み合わせを、それぞれ単独で発現させたものを、後で混合した場合には、結合が見られなかった（ｌａｎｅ３及び４）。また、ＥｃＲ−ＡＦとＵＳＰ−ＡＥ、およびＥｃＲ−ＡＦとＵＳＰ−ＤＥとの組み合わせにおいては共発現、およびそれぞれ単独発現後に混合したもののいずれにおいても、リガンドとの結合は見られなかった。
以上の結果より、ＥｃＲ−ＤＦがポナステロンＡと結合することから、Ｅ領域に加え、少なくともＤ領域とＦ領域の両方がポナステロンＡとの結合に必要であることが分かった。これまでＤ領域はＵＳＰとの二量体化に関与することが示唆されている。本実施例でえられた結果では、二量体化がリガンドとの結合に必須であることを強く支持する。Ｆ領域に関しては、そのアミノ酸の長さが非常に短く、各生物間の保存性も低くその構造化学的な活性についての役割があいまいなのが現状であるが、少なくともリガンドとの結合に重要な役割を担っている領域であることが判明した。
一方、大腸菌を用いた発現系及び哺乳類細胞を用いた発現系の両方において、ＥｃＲの全長の組換え体（ＥｃＲ−ＡＦ）とポナステロンＡとの結合が認められたが、極めて弱いものであった。したがって、ＥｃＲに対するリガンドをスクリーニングする際には、全長のＥｃＲを用いるのではなく、ＥｃＲ−ＤＦ組換え体を用いる必要があることが、本実施例によって初めて明らかとなった。
〔実施例５〕結合実験の条件検討
実施例５では、上述したＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合をより高効率で見られるように、複合体−リガンド間の相互作用に重要であると考えられる、モル比、反応時間、反応温度、および塩濃度の条件を検討することにした。
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥのモル比の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応時間を以下のようにして検討した。先ず、一定量のＥｃＲ−ＤＦに対し、種々の濃度のＵＳＰ−ＡＥを加え、ウォーターバス中２５℃にて４０分間反応させた。なお、反応溶液中のポナステロンＡは１．３４ｎＭとした。そして、ポナステロンＡの複合体に対する結合を測定した結果を図１８に示す。図１８から判るように、ＥｃＲ−ＤＦ：ＵＳＰ−ＡＥが約１：１でポナステロンＡのＥｃＲ−ＤＦ／ＵＳＰ−ＡＥ複合体に対する結合が飽和状態に達した。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、ＥｃＲ−ＤＦ：ＵＳＰ−ＡＥを、モル比で１：１とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験ではＥｃＲ−ＤＦ：ＵＳＰ−ＡＥをモル比で１：１で行うことにした。
反応時間の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応時間を以下のようにして検討した。まず、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥをモル比１：１で混合し、ウォーターバス中２５℃にて１分、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分間反応させた。なお、反応溶液中のポナステロンＡは１．３４ｎＭとした。その結果を図１９に示す。図１９から判るように、６０分間の反応で、ポナステロンＡの当該複合体に対する結合が、ほぼ飽和状態に達した。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、３０〜９０分の反応時間とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験では反応時間は６０分で行うことにした。
反応温度の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応温度を以下のようにして検討した。まず、低温室内４℃にて反応させる以外は、上記「反応時間の検討」と同様に結合反応を行った。その結果を図２０に示す。図２０から判るように、低温室内４℃においては、結合が飽和に達する時間は８時間であった。これに対して、図２０に示したように、反応温度２５℃においては、結合が飽和に達する時間は６０分であった。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、２０〜３７℃の反応温度とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験では反応温度は２５℃で行うことにした。
塩濃度の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な塩濃度を以下のようにして検討した。まず、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥとをモル比１：１で混合し、ウォーターバス中２５℃で反応させた。この時の反応溶液中の塩（ＮａＣｌ）濃度を終濃度０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭで行った。その結果を図２１に示す。図２１から判るように、塩濃度の増加と共に、当該複合体に対するリガンドの特異的結合が減少した。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、０〜１００ｍＭの塩濃度とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験では反応溶液には塩を加えないものを使用した。
〔実施例６〕複合体とリガンドとの結合のスキャッチャード解析
実施例６では、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥを用いて、以下のようにして、複合体のポナステロンＡに対する解離定数を（Ｋｄ）を求めた。まず、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥをモル比１：１で混合し、これに種々の濃度の［３Ｈ］ポナステロンＡを加えた。この反応液に遊離のリガンドを除くために活性炭溶液を加えた。ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体の［３Ｈ］ポナステロンＡに対する結合量（全結合量）は、遠心分離後の上清画分の放射活性を測定することにより求めた。また、［３Ｈ］ポナステロンＡの１０，０００倍の非放射標識ポナステロンＡを加えて同様の実験を行い、非特異的結合を求めた。測定結果より結合曲線をプロットし他結果を図２２に示す。そして、図２２に示した結合曲線における値をもとにスキャッチャード解析を行った。結果を図２３に示す。なお図２３において、横軸は［３Ｈ］ポナステロンＡの特異的結合量（ｎＭ）を示し、縦軸は特異的結合量（ｂｏｕｎｄ）／全結合量−特異的結合量（ｆｒｅｅ）を示す。
図２３から判るように、スキャッチャード解析の結果１本の直線が得られ、Ｋｄ＝２．７９ｎＭ、Ｂｍａｘ＝０．１７ｎＭとなった。
〔実施例７〕昆虫抑制物質のスクリーニング系の構築
実施例７では、実施例１乃至６の結果に基づいて、昆虫抑制物質のスクリーニング系を構築した。実施例１乃至６に示したように、エクダイソンアゴニストであるポナステロンＡを用いた結合解析を行った結果、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体に対するポナステロンＡの結合が示された。この系がスクリーニング系として機能するかどうかは、他のエクダイソンアゴニストとの結合も観察されなければならない。そこで、昆虫の生体内での活性型のエクダイソンである２０−ヒドロキシエクダイソンと、合成エクダイソンアゴニストであるテブフェノジド（ＲＨ−５９９２）とを用いて、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体との結合実験を試みた。
まず、実施例４と同様に、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにＥｃＲ−ＤＦに対してＵＳＰ−ＡＥを混ぜ、［３Ｈ］ポナステロンＡを加えた。また、［３Ｈ］ポナステロンＡの１０，０００倍の２０−ヒドロキシエクダイソン、またはテブフェノジドを加えて同様の実験を行い、非特異的結合を求めた。その結果、２０−ヒドロキシエクダイソン及びテブフェノジド共にＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体との結合活性が認められた。そこで、２０−ヒドロキシエクダイソン、またはテブフェノジドの濃度を変化させて同様の実験を行った。その結果を図２４に示す。図２４から判るように、２０−ヒドロキシエクダイソン及びテブフェノジドは、共に濃度依存的に［３Ｈ］ポナステロンＡの当該複合体への結合を阻害することが分かった。
以上の結果より、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥを用いた結合実験を、昆虫成育制御物質のスクリーニング系に用いることができることが判明した。
次に、本実施例では、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体に対する結合能を指標としたスクリーニング系を用いて、４種の化合物について当該結合能を評価した。化合物としては、４−ノニルフェノール、スチルベストロール、フタル酸ジエチル（内分泌攪乱物質）及び１７β−エストラジオール（女性ホルモン）を用いた。
結果を図２５に示す。図２５から判るように、４−ノニルフェノール、スチルベストロール、１７β−エストラジオールについて、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体に対する結合活性が認められた。特に４−ノニルフェノール、スチルベストロールについては結合活性が強いものであった。これまでＥｃＲは、基本的にポナステロンＡなど、ステロイド骨格を有する化合物と結合することが知られている。一方、ステロイド骨格を持たないものでは、テブフェノジドなど数種に限られていた。本実施例において結合活性を示した物質は、いずれもステロイド骨格は有しておらず、またＥｃＲとの結合はこれまで知られていなかった。また、この結果から、大腸菌において発現したＥｃＲ−ＤＦと、ＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとを用いたスクリーニング系を、昆虫成育制御物質の探索のための新たな系として確立することができた。
【産業上の利用の可能性】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、昆虫脱皮ホルモンに対して結合することができる全く新規な脱皮ホルモン受容体を提供することができる。また、本発明によれば、この脱皮ホルモン受容体を用いることで、害虫駆除剤等に応用可能な物質を効率的にスクリーニングことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【技術分野】
本発明は、エクジステロイド等の昆虫脱皮ホルモンに対して結合能を有する脱皮ホルモン受容体及び当該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
田畑等の農業生産現場における害虫駆除は、生産性の向上、生産品質の向上といった諸問題を解決することができる。このため、害虫駆除に関する諸研究がなされているが、例えば、昆虫成長抑制物質を主体とする害虫駆除剤の開発が望まれている。
一方、昆虫の脱皮・変態は、昆虫を特徴付ける現象であり、ホルモンにより制御されている。昆虫における脱皮・変態の制御は、ステロイドホルモンであるエクジステロイドによることが知られている。先ず、昆虫体内で合成されたエクジステロイドは、細胞膜を通過して、核内に存在する脱皮ホルモン受容体及びＵＳＰ（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）のヘテロダイマーと結合して複合体を形成する。次に、この複合体は、初期遺伝子群の上流に存在する応答配列に結合することで、当該初期遺伝子群の発現を誘導する。その後、初期遺伝子群の発現を契機にして、昆虫の脱皮・変態に関連する遺伝子群の発現を促進するとともに昆虫の脱皮・変態が進行する。
このように、脱皮ホルモン受容体は、昆虫が脱皮・変態する際のシグナル伝達経路において最上流に位置することが知られている。したがって、上述したような昆虫成長抑制物質として、エクジステロイドと脱皮ホルモン受容体との結合を阻害する物質を探索することが、害虫駆除剤の開発に有効であることが判る。
しかしながら、エクジステロイドと脱皮ホルモン受容体との結合を阻害する物質のスクリーニング方法としては確立されたものはなく、害虫駆除剤として有効な物質を容易にスクリーニングすることができなかった。また、従来、昆虫成長抑制物質のスクリーニングには、昆虫全体を用いる系、表皮等の一部の組織を用いる系及び培養細胞を用いる系などのスクリーニング系が知られている（非特許文献１乃至４参照）。しかしながら、昆虫成長抑制物質のスクリーニングについて、分子レベル（タンパク質レベル）での研究は殆ど行われていないの現状である。
【非特許文献１】Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｍｉｋｉｔａｎｉ Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．３１（４）：５３１−５３６
Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｃｄｙｓｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｐｏｒｔａｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ５’−ｕｐｓｔｒｅｍｅｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｄｉｐｔｅｒａ； Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）ａｃｅｔｈｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ
【非特許文献２】Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｍｉｋｉｔａｎｉ Ｊ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４２：（１０）９３７−９４１ ＯＣＴ １９９６
Ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ ａｇｏｎｉｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ ｉｎ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ
【非特許文献３】Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｍｉｋｉｔａｎｉ ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．２２７：（２）４２７−４３２ ＯＣＴ １４ １９９６
Ａ ｎｅｗ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，５−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ ｓｈｏｗｓ ａｐｐａｒｅｎｔ ｉｎｓｅｃｔｍｏｌｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖｅｌｓ
【非特許文献４】Ｔｒｉｓｙｏｎｏ Ａ，Ｇｏｏｄｍａｎ ＣＬ，Ｇｒａｓｅｌａ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ−ＡＮＩＭＡＬ ３６：（６）４００−４０４ ＪＵＮ ２０００
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｃｄｙｓｏｎｅ ａｇｏｎｉｓｔｓ
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、害虫駆除剤等に応用可能な物質を効率的にスクリーニングすべく、全く新規な脱皮ホルモン受容体及び当該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供することを目的としている。
【発明の開示】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、脱皮ホルモンと、脱皮ホルモン受容体の各ドメインとの結合について新たな知見を見いだし本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる昆虫脱皮ホルモン受容体。
（ａ）配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（２）上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする（１）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
（３）上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする（１）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
（４）（１）乃至（３）いずれか一に記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に、供試物質を作用させる第１工程と、前記複合体と前記供試物質との結合を測定する第２工程とを含む脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（５）上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、３０〜９０分反応させることを特徴とする（４）記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（６）上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、２０〜３７℃の条件下で反応させることを特徴とする（４）記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（７）上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、実質的に塩を含まない条件下で反応させることを特徴とする（４）記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
（８）以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる、昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
（ａ）配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１（ＥｃＲ−ＤＦ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２（ＵＳＰ−ＡＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３（ＵＳＰ−ＤＥ）のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（９）上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする（７）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
（１０）上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする（８）記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０３１６０６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、（ａ）はＥｃＲのドメイン構成を模式的に示す構成図であり、（ｂ）はＵＳＰのドメイン構成を模式的に示す構成図である。
図２は、ＥｃＲのｃＤＮＡクローニングにおいて作製したプライマーの位置及び配列を示す模式図である。
図３は、ＵＳＰのｃＤＮＡクローニングにおいて作製したプライマーの位置及び配列を示す模式図である。
図４は、実施例２で作製した様々な長さのＥｃＲ組換え体を示す模式図である。
図５は、実施例２で作製した様々な長さのＵＳＰ組換え体を示す模式図である。
図６は、大腸菌で発現したＥｃＲ組換え体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図７は、大腸菌で発現したＵＳＰ組換え体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図８は、ＥｃＲ組換え体を確認するために行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図９Ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｂは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｃは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｄは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図９Ｅは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてＥｃＲ組換え体の分子質量を測定した結果を示す特性図である。
図１０は、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてすべてのＥｃＲ組換え体についてリフォールディング反応を行い、すべてのＥｃＲ組換え体について排除限界の位置に溶出されたことを確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１１は、精製したＥｃＲ組換え体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１２は、ＵＳＰ組換え体をアフィニティー精製した後の各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１３は、実施例３で作製した発現ベクターを示す模式図である。
図１４は、哺乳類細胞を用いてＥｃＲ組換え体を発現させた系において、当該ＥｃＲ組換え体を確認するために行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図１５は、実施例４における実験の工程を示すフローチャートである。
図１６は、大腸菌で発現させたＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いて、ポナステロンＡとの結合能を測定した結果を示す特性図である。
図１７は、哺乳類細胞で発現させたＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いて、ポナステロンＡとの結合能を測定した結果を示す特性図である。
図１８は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの最適なモル比を検討した結果を示す特性図である。
図１９は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応時間を検討した結果を示す特性図である。
図２０は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応温度を検討した結果を示す特性図である。
図２１は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な塩濃度を検討した結果を示す特性図である。
図２２は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応における、結合曲線を示す特性図である。
図２３は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応における、スキャッチャード解析を行った結果を示す特性図である。
図２４は、エクダイソン及びエクダイソンアゴニストとＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体との結合を解析した結果を示す特性図である。
図２５は、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体と内分泌攪乱物質及び女性ホルモンとの結合を解析した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を適用したスクリーニング方法（以下、単に「本スクリーニング法」と称する）は、ハスモンヨトウ由来の脱皮ホルモン受容体（以下、ＥｃＲと略記する場合もある）におけるＤ領域からＦ領域までのセグメント（以下、ＥｃＲ−ＤＦと略記する場合もある）と、ハスモンヨトウ由来のＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ（以下、ＵＳＰと略記する場合もある）のＡ領域からＥ領域までのセグメント（以下、ＵＳＰ−ＡＥと略記する場合もある）若しくは当該ＵＳＰにおけるＤ領域からＥ領域までのセグメント（以下、ＵＳＰ−ＤＥと略記する場合もある）との複合体を、供試物質に作用させ、その後、前記複合体と前記供試物質との結合を測定することで、供試物質における脱皮ホルモン受容体に対する結合能（リガンド能）を評価するものである。
ここで、脱皮ホルモン受容体とは、図１ａに示すように、Ａ／Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域、Ｅ領域及びＦ領域の６領域から構成された、脱皮ホルモンに対する受容体である。ハスモンヨトウ以外の昆虫においても脱皮ホルモン受容体は同定されており、このようなハスモンヨトウ以外の昆虫における研究からＥｃＲのＣ領域はＤＮＡ結合領域であることが示唆されている。また、ハスモンヨトウ以外の昆虫において、ＥｃＲのＥ領域はホルモン結合領域であることが示唆されている。
また、ＵＳＰとは、図１ｂに示すように、Ａ／Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域及びＥ領域の５領域から構成され、脱皮ホルモン受容体とヘテロダイマーを形成するオーファン受容体である。
先ず、本スクリーニング方法において使用するＥｃＲ−ＤＦについて説明する。ＥｃＲ−ＤＦとしては、例えば、配列番号１に表すアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。しかしながら、ＥｃＲ−ＤＦは、配列番号１に表すアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号１に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、ＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態でエクダイソンと結合できるものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」としては、例えば２〜５０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個である。
また、ＥｃＲ−ＤＦは、ＥｃＲのＤ領域及びＦ領域を含むセグメントであれば良く、例えばＥｃＲのＤ領域のＮ末端側にＣ領域の一部を含んでいても良い。すなわち、配列番号１に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列としては、ＥｃＲのＤ領域及びＦ領域を含み、当該Ｄ領域のＮ末端側にＣ領域の一部が含まれているアミノ酸配列を挙げることができる。ここで、Ｃ領域の一部とは、例えば１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸である。
次に、ＥｃＲ−ＤＦの調製方法について説明する。本スクリーニング方法において、ＥｃＲ−ＤＦの調整方法としては特に限定されないが、例えば以下のように調製することができる。すなわち、先ず、ハスモンヨトウのｃＤＮＡライブラリーを作製し、所定のプライマーを用いてＥｃＲをコードするｃＤＮＡをクローニングする。次に、このＥｃＲのｃＤＮＡを用いてＥｃＲ遺伝子のコーディング領域の塩基配列を決定する。塩基配列に基づいて設計したＥｃＲ−ＤＦをコードする領域を増幅するためのプライマーを用い、ＥｃＲのｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡを増幅する。その後、増幅したＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、適当な宿主に形質転換した後、得られた形質転換体において発現させたＥｃＲ−ＤＦを回収することで、ＥｃＲ−ＤＦを調製することができる。
このＥｃＲの調製方法において、ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのｍＲＮＡは、ハスモンヨトウの成虫、幼虫、蛹の如何なる段階から抽出しても良いし、ハスモンヨトウの如何なる部位から抽出してもよい。具体的に、ハスモンヨトウ幼虫に脂肪体から全量ＲＮＡを抽出し、抽出した全量ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡを使用することができる。
全量ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブリーの作製は、定法に従って行うことができる。すなわち、全量ＲＮＡを用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＥｃＲのｃＤＮＡをクローニングすることができる。
ＥｃＲのｃＤＮＡをクローニングする際のプライマーとしては、他の鱗翅目昆虫において保存されている配列を基に設計した縮重プライマーを使用することができる。具体的に、縮重プライマーとしては、図２に示すように６組の縮重プライマーを挙げることができる。これら６組の縮重プライマーは、それぞれＥｃＲ−Ｆ１及びＥｃＲ−Ｒ１と、ＥｃＲ−Ｆ２及びＥｃＲ−Ｒ２と、ＥｃＲ−Ｆ３及びＥｃＲ−Ｒ３と、ＥｃＲ−Ｆ４及びＥｃＲ−Ｒ４と、ＥｃＲ−Ｆ５及びＥｃＲ−Ｒ５と、ＥｃＲ−Ｆ６及びＥｃＲ−Ｒ６と命名された。
また、縮重プライマーの塩基配列を以下に示す。
これら縮重プライマーを用いて、全量ＲＮＡから合成したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を合成することができる。そして、合成したｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、他の鱗翅目昆虫におけるＥｃＲとの相同性を検討する。
そして他の鱗翅目昆虫におけるＥｃＲとの相同性が高いことから、ＥｃＲのｃＤＮＡであると判断することができる。
次に、この塩基配列に基づいて、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡ塩基配列を決定するための５’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＥｃＲ−５’Ｒ）及び３’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＥｃＲ−３’Ｆ１）を設計することができる。
これら、ＥｃＲ−５’Ｒ及びＥｃＲ−３’Ｆ１と、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔのアンカー配列に特異的なプライマー（ＵＰＭ）とを用いて、全量ＲＮＡから合成したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を合成することができる。ＵＰＭの塩基配列を以下に示す。
そして、合成したｃＤＮＡ断片の塩基配列と、上記縮重プライマーを用いて合成したｃＤＮＡ断片の塩基配列とから、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。ＥｃＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１９に示し、ＥｃＲの演繹アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
ＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するには、先ず、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１９）に基づいて設計したプライマーＥｃＲ−Ｄ：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号２１）及びプライマーＥｃＲ−Ｆ：５’−ＴＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４６）を用い、クローニングしたＥｃＲのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによってＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡ断片を取得する。
次に、このＤＮＡ断片を宿主に応じて適当なベクターに挿入することによって、発現ベクターを構築することができる。また、宿主内でＥｃＲ−ＤＦを発現させる場合、ＥｃＲ−ＤＦのＮ末端にヒスチジンタグを付加するように発現ベクターを構築してもよい。
ここで、宿主としては、比較的に大量のＥｃＲ−ＤＦを得る目的で大腸菌を使用することが好ましい。なお、宿主としては、大腸菌に限定されず、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞株、Ｓｆ−９等の昆虫細胞など、従来より遺伝子発現系で用いられている各種細胞を用いることができる。
例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、発現ベクターは、例えば、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）を使用することができる。大腸菌発現用ベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）によれば、発現するＥｃＲ−ＤＦのＮ末端にヒスチジンタグを付加することができる。
宿主内で発現したＥｃＲ−ＤＦは、定法に従って生成することができる。なお、宿主として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡをｐＥＴ−２８ｂ（＋）に組み込んでなる発現ベクターで形質転換し、ＩＰＴＧにより発現誘導した場合、ＥｃＲ−ＤＦは不溶性の封入体を形成する。このため、この場合には、封入体を可溶化させた後にリフォールディングさせることで、目的とするかたちでＥｃＲ−ＤＦを取得することができる。
次に、本スクリーニング方法において使用するＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥについて説明する。
ＵＳＰ−ＡＥとしては、例えば、配列番号２に表すアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。しかしながら、ＵＳＰ−ＡＥは、配列番号２に表すアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号２に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、ＥｃＲ−ＤＦと複合体をなしうるものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」としては、例えば２〜２００個であり、好ましくは２〜１００個であり、より好ましくは２〜５０個である。
ＵＳＰ−ＤＥとしては、例えば、配列番号３に表すアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。しかしながら、ＵＳＰ−ＤＥは、配列番号３に表すアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号３に表すアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、ＥｃＲ−ＤＦと複合体をなしうるものであっても良い。ここで、「複数のアミノ酸」としては、例えば２〜２０個であり、好ましくは２〜１０個であり、より好ましくは２〜５個である。
これらＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥの調製方法は、上述したＥｃＲ−ＤＦの調製方法に準じて行うことができる。特に、ＵＳＰのｃＤＮＡをクローニングする際の４組の縮重プライマー、５’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー及び３’ＲＡＣＥ用の特異的プライマーを図３に示す。これら４組の縮重プライマーは、それぞれＵＳＰ−Ｆ１及びＵＳＰ−Ｒ１と、ＵＳＰ−Ｆ２及びＵＳＰ−Ｒ２と、ＵＳＰ−Ｆ３及びＵＳＰ−Ｒ３と、ＵＳＰ−Ｆ４及びＵＳＰ−Ｒ４と命名された。
４種類の縮重プライマー、５’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＵＳＰ−５’Ｒ１、ＵＳＰ−５’Ｒ２）、３’ＲＡＣＥ用の特異的プライマー（ＵＳＰ−３’Ｆ１、ＵＳＰ−３’Ｆ２）及びＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔのアンカー配列に特異的なプライマー（ＵＰＭ、ＮＵＰ、ＲＴＧ、ＲＴＧ−Ｎ）の塩基配列を以下に示す。
上述したＥｃＲ−ＤＦの調製方法に準じてクローニングされたＵＳＰのｃＤＮＡ塩基配列を配列番号３９に示し、ＵＳＰの演繹アミノ酸配列を配列番号４０に示す。
ＥｃＲのｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってＥｃＲ−ＤＦをコードするＤＮＡを増幅する。その後、増幅したＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、適当な宿主に形質転換した後、得られた形質転換体において発現させたＥｃＲ−ＤＦを回収することで、ＥｃＲ−ＤＦを調製することができる。
ＵＳＰ−ＡＥをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するには、プライマーＵＳＰ−Ａ：５’−ＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＧＡＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号４１）及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１：５’−ＡＴＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＡＴＧ−３’（配列番号４２）を用い、ＵＳＰ−ＤＥをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するには、プライマーＵＳＰ−Ｄ：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号４３）及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１（配列番号４２）を用いることによって、上述したＥｃＲ−ＤＦの場合と同様に、ＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥを取得することができる。
本スクリーニング法では、上述のように得られるＥｃＲ−ＤＦ、ＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥを用いて、供試物質の脱皮ホルモン受容体に対する結合能（リガンド能）を評価する。例えば、供試物質に対して標識することで、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体に対する供試物質の結合能を評価することができる。このとき、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥと供試物質とを混合して、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体に対する供試物質の結合能を評価しても良いし、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体を予め調製した後に、供試物質を作用させ、その結合能を評価しても良い。
また、供試物質の標識には、放射性同位元素を用いる方法を使用することができる。
以上のように、本スクリーニング法によれば、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとの複合体を用いて、ＥｃＲとＵＳＰとのヘテロダイマーによる脱皮・変態に関連する遺伝子群の発現誘導を抑制するような物質を探求する有力な手段を提供することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ハスモンヨトウ由来ＥｃＲ及びＵＳＰの塩基配列決定
材料
本実施例では、クミアイ化学工業株式会社より供与されたハスモンヨトウ幼虫（終齢（６齢）幼虫（体長約４ｃｍ、重さ約１．５ｇ））を使用した。ハスモンヨトウ幼虫を実体顕微鏡下で解剖し、ピンセットを用いて脂肪体を摘出し、エッペンドルフチューブに回収、液体窒素で凍結後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出に用いるまで−８０℃で保存した。
ＲＴ−ＰＣＲ
摘出したハスモンヨトウの脂肪体よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する際には、ＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を、製品付属のプロトコールに従って用いた。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液は、一部をＤＥＰＣ処理水で希釈して分光光度計を用いその濃度を定量した。
得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液から２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、これをＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、製品付属のプロトコールに従い、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成を行った。またこれとは別に、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡより、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いたｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成も行った。
合成したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡをテンプレートとして、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。縮重プライマーとしては、図２及び図３に示したものを使用した。また、ＰＣＲ反応液の組成を表１に示した。
また、反応サイクルは、９４℃で３分維持した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニール及び７２℃で３０秒の伸長を３５サイクル行った後、７２℃で７分の処理を行うものとした。
ＰＣＲ産物はＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングを行った。キットに含まれるベクター（ｐＣＲ２．１）にＰＣＲ産物をライゲーションし、得られたプラスミドＤＮＡをコンピテントセルＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。そして、ＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択して、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。プラスミドＤＮＡを鋳型としたサイクルシーケンス反応は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｙ５．５ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥ
上記ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡ断片の塩基配列を基にして、５’ＲＡＣＥ用のプライマー及び３’ＲＡＣＥ用のプライマーを作製した。また、テンプレートとなるｃＤＮＡは、５’ＲＡＣＥにおいては、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて合成したものを使用した。また３’ＲＡＣＥにおいては、テンプレートとなるｃＤＮＡとしてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔを用いて合成したものを使用した。
これにより、ＥｃＲの全長ｃＤＮＡ塩基配列及びＵＳＰの全長ｃＤＮＡ塩基配列を決定することができた。ＥｃＲの全長ｃＤＮＡ塩基配列を配列番号１９、ＥｃＲの演繹アミノ酸配列を配列番号２０に示した。また、ＵＳＰの全長ｃＤＮＡ塩基配列を配列番号３９、ＵＳＰの演繹アミノ酸配列を配列番号４０に示した。
〔実施例２〕ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の発現（大腸菌）
ＤＮＡ断片の調製
まず、ＥｃＲのリガンド結合領域（Ｅ領域）を含む、様々な長さの組換え体を作製するために、実施例１で得られた塩基配列を基に、特定の制限酵素サイトの配列を付加したプライマーを以下のように設計した。
また、ＵＳＰのリガンド結合領域（Ｅ領域）を含む、様々な長さの組換え体を作製するために、実施例１で得られた塩基配列を基に、特定の制限酵素サイトの配列を付加したプライマーを以下のように設計した。
これらプライマーを用いて、実施例１でクローニングに用いたプラスミドをテンプレートＤＮＡとして、ＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物をサブクローニングした。ＰＣＲ反応液の組成を表２に示した。
また、反応サイクルは、９４℃で３分維持した後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニール及び７２℃で１分の伸長を１５サイクル行った後、７２℃で７分の処理を行うものとした。
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから回収した後、ＴＯＰＯ ＴＡ ＣｌｏｎｉｎｇＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製品付属のプロトコールに従ってサブクローニングを行った。ＤＮＡシーケンサーを用い、目的のＰＣＲ産物の塩基配列に間違いがないことを確認した後、特定の制限酵素（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、もしくはＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの組み合わせ）でプラスミドを消化した。これを再び１％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルより目的のＤＮＡ断片を回収した。
なお、本実施例では、図４に示すように、プライマーＥｃＲ−Ａ及びプライマーＥｃＲ−Ｆにより全長のＥｃＲ（ＥｃＲ−ＡＦ）、プライマーＥｃＲ−Ｄ及びプライマーＥｃＲ−ＦによりＥｃＲのＤ領域からＦ領域までのセグメント（ＥｃＲ−ＤＦ）、プライマーＥｃＲ−Ｄ及びプライマーＥｃＲ−Ｅｒ１によりＥｃＲのＤ領域からＥ領域までのセグメント（ＥｃＲ−ＤＥ）、プライマーＥｃＲ−Ｅｆ及びプライマーＥｃＲ−ＦによりＥｃＲのＥ領域からＦ領域までのセグメント（ＥｃＲ−ＥＦ）並びに、プライマーＥｃＲ−Ｅｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｅｒ１によりＥｃＲのＥ領域セグメント（ＥｃＲ−Ｅ）をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ取得した。また、本実施例では、図５に示すように、プライマーＵＳＰ−Ａ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１によりＵＳＰのＡ領域からＥ領域までのセグメント（ＵＳＰ−ＡＥ）、プライマーＵＳＰ−Ｄ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１によりＵＳＰのＤ領域からＥ領域までのセグメント（ＵＳＰ−ＤＥ）並びにプライマーＵＳＰ−Ｅｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒ１によりＵＳＰのＥ領域セグメント（ＵＳＰ−Ｅ）をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ取得した。
形質転換
先ず、得られたＤＮＡ断片がコードするＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を、大腸菌内で発現させるため、形質転換ようの発現ベクターを構築した。プラスミドベクターはｐＥＴ−２８ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。このベクターには、目的タンパク質のＮ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）タグが付加されるように構成されている。このプラスミドＤＮＡは、２５ｍｌの培養液よりＨｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＬＩＮＧＥＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて調製した。目的のインサートＤＮＡが、トリプレットコドンのフレームのずれがなく、正確にベクターに挿入されていることを確認し、以降の実験に供する発現ベクターとした。
次に、上述のように構築した発現ベクター及び大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて、ヒートショック法及びエレクトロポレーション法によって形質転換した。
目的タンパク質の発現
上述した発現ベクターを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のシングルコロニーを、５ｍＬのＬＢ培地に植菌し３７℃で一晩浸盪培養した（前培養）。その後、培養容器は５００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコあるいは坂口フラスコを用い、そこに１００ｍｌのＬＢ培地、１００μｌのカナマイシンを加え、これに５ｍｌの前培養液を加えた。３７℃で浸盪培養し（本培養）、ＯＤ６００が０．６〜０．８になったところでＩＰＴＧを加え、目的タンパク質の誘導を開始した。各コンストラクトの誘導条件を表３に示した。なお、ＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＥｃＲ−ＤＥ、ＥｃＲ−ＥＦ及びＥｃＲ−Ｅについては、同一の条件で行った。
誘導後、培養液を４℃、８，０００ｒｐｍ、５分間遠心して集菌した。ＥｃＲ組換え体は、菌体を１５ｍｌのＰＢＳで、ＵＳＰ組換え体は、１０ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／３００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０））で良く懸濁し、それぞれに１０ｍｇのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を加え、低温室にてローテーターを用い、１時間ゆるやかに懸濁した後、−８０℃で凍結させた。１時間以上経過した後、解凍し超音波破砕機を用いて１２０Ｗで５分間（ＵＳＰ組換え体）、もしくは１０分間（ＥｃＲ組換え体）菌体を破砕し、４℃、１０，０００ｒｐｍ、で１５分間遠心した。
ＥｃＲ組換え体については、遠心後の沈殿画分を４ｍｌのＰＢＳに懸濁し、これに２５％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ−１００を１ｍｌを加えて室温で４時間〜一晩、ローテーターでゆるやかに懸濁した。次に４℃、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を４ｍｌのＰＢＳで４℃、９，０００ｒｐｍで５分間遠心し、洗浄した。この操作は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除くように（沈殿がサラサラになるまで）５〜１０回繰り返した。最後に沈殿画分は上清を完全に除去した後、精製に用いるまで−２０℃で保存した。一方、ＵＳＰ組換え体については菌体破砕、遠心後の上清画分を次の精製に用いた。
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した結果、発現したＥｃＲ組換え体（ＥｃＲ−ＡＦ、−ＤＦ、−ＤＥ、−ＥＦ、−Ｅ）は、不溶性の封入体画分に存在した（図６）。一方、ＵＳＰのすべての発現した組換え体（ＵＳＰ−ＡＥ、−ＤＥ、−Ｅ）は、その一部が可溶性画分で回収された（図７）。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに際しては、以下のように行った。サンプルは適量のサンプルバッファー（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／８％ＳＤＳ／２４％β−ＭＥ／４０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．０５％ＢＰＢ）と混合し、１００℃で５分間処理して調製した。また、分子量マーカーは、ＬＭＷ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＳＤＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。泳動終了後、ゲルを脱色液（５０％メタノール／７％酢酸）で１５分間固定した後、ＣＢＢ染色液（０．２５％ＣＢＢ Ｒ−２５０／５０％メタノール／５％酢酸）中で１５分間浸盪した。最後に、脱色液でバックグラウンドの色が抜けるまで脱色した。
発現した組換え体が目的のものであることを確認するために、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。分子量マーカーは、プレシジョンプレステインドスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。泳動終了後、ブロッティング装置を用いて、ゲルをＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ）に１００ｍＡで３０分間ブロッティングした。ブロッティング終了後、抗体の非特異的な吸着を防ぐために、５％スキムミルク入りのＴＢＳＴ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ／２．６８ｍＭ ＫＣｌ／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で２時間から一晩、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、ＴＢＳＴで１０分間、４回、膜を洗浄した。次にＴＢＳＴで２，０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温にてインキュベートした。１．５時間後、ＴＢＳＴで１０分間、４回、膜を洗浄しＴＢＳＴで５，０００倍希釈したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＨＲＰを加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＴＢＳＴで１０分間、４回、膜を洗浄し、ＨＲＰの基質としてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、化学発光させ、イメージングアナライザーで分析した。その結果、図８に示すように、すべての発現産物は目的のものであった。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したサンプルをゲルより切り出して、トリプシン消化により得られた消化物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いてその分子質量を測定した。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ及び９Ｅに示すように、目的産物の消化物が確認されたことからも、今回の発現産物はすべて目的のものであった。
目的タンパク質の精製
（ＥｃＲ組換え体）
ＥｃＲの組換え体は、上述したように、すべて不溶性の封入体を形成し、発現産物は封入体に存在していた。このままでは、後述するリガンドとの結合実験に用いることができないので、可溶化させリガンドと結合するように、リフォールディングする必要があった。リフォールディング反応には、封入体を高濃度の尿素やグアニジン塩酸塩水溶液で可溶化後、徐々にそれらを除去していくことが必要である。そのために、透析法や、希釈法などが良く行われている。本実施例では、まず、８Ｍの尿素で可溶化したＥｃＲ組換え体を、希釈法を用いたリフォールディング反応を試みたが、尿素の終濃度が１Ｍ以下になると、可溶化していたタンパク質が再び沈殿になり、不溶化したのが観察された。そこで、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたリフォールディングを試みた。この方法の狙いは、排除限界が小さいゲルを用いることによって、ゲルの孔隙に入ることのできないＥｃＲ組換え体が排除限界の位置に溶出される。一方、尿素は低分子量のために、ゲルの孔隙に入り込み、ＥｃＲ組換え体より遅れて溶出される。これにより、可溶化したＥｃＲ組換え体尿素溶液より、尿素を除くことができ、ＥｃＲ組換え体は可溶化した状態で回収できるのではないかと考えた。このゲルろ過クロマトグラフィーを用いたリフォールディング反応を行った結果、すべてのＥｃＲ組換え体は、排除限界の位置に溶出されたことを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１０）。
溶出されたそれぞれのＥｃＲ組換え体を、限外ろ過により濃縮した。このサンプルの濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。その結果、２５ｍｌの培養液から１８６μｇのＥｃＲ−ＡＦ、２０６μｇのＥｃＲ−ＤＦ、９８μｇのＥｃＲ−ＤＥ、４６μｇのＥｃＲ−ＥＦ、１８２μｇのＥｃＲ−Ｅが得られた。このように精製したＥｃＲ組換え体溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した際の結果を図１１に示す。
（ＵＳＰ組換え体）
ＵＳＰ組換え体は、上述したように、その一部が可溶性画分に存在していた（図７参照）。このＵＳＰ組換え体には、Ｎ末端にＨｉｓ−タグが付加していることを利用して、ニッケル樹脂を用いたアフィニティー精製を行った（図１２）。限外ろ過により濃縮後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。その結果、１００ｍｌの培養液から、８１４μｇのＵＳＰ−ＡＥ、４１７μｇのＵＳＰ−ＤＥ、１．３ｍｇのＵＳＰ−Ｅが得られた。
〔実施例３〕ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の発現（動物培養細胞）
実施例３では、後述する実施例４「ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いたリガンド結合能解析」におけるポジティブコントロールとして、動物培養細胞でＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を発現させ、細胞からの抽出液を調製した。
動物培養細胞としてはＣＯＳ−７細胞を用いた。発現用プラスミドとしては、ＳＲαプロモーターの下流にＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＵＳＰ−ＡＥ又はＵＳＰ−ＤＥを挿入し、それぞれのＮ末端にＦＬＡＧタグを付けたものを用いた（図１３）。
この発現用プラスミドに組み込まれるＥｃＲ−ＡＦは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＥｃＲ−Ａｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｆｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、発現用プラスミドに組み込まれるＥｃＲ−ＤＦは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＥｃＲ−Ｄｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｆｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。なお、プライマーＥｃＲ−Ａｆ、プライマーＥｃＲ−Ｄｆ及びプライマーＥｃＲ−Ｆｒの塩基配列を以下に示す。
また、この発現用プラスミドに組み込まれるＵＳＰ−ＡＥは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＵＳＰ−Ａｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、発現用プラスミドに組み込まれるＵＳＰ−ＤＥは、実施例１でクローニングに用いたプラスミドを鋳型として、一対のプライマーＵＳＰ−Ｄｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒを用いたＰＣＲによって得ることができる。なお、プライマーＵＳＰ−Ａｆ、プライマーＵＳＰ−Ｄｆ及びプライマーＵＳＰ−Ｅｒの塩基配列を以下に示す。
各発現用プラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して単独で形質導入し、４８時間後の細胞から抽出液をそれぞれ調製した。また、ＥｃＲ−ＡＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＡＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。さらにＥｃＲ−ＤＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＡＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。さらにＥｃＲ−ＡＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＤＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。さらにＥｃＲ−ＤＦを挿入したプラスミドＤＮＡ及びＵＳＰ−ＤＥを挿入したプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に対して共に形質導入し、同様に抽出液を調製した。なお、ＣＯＳ−７細胞における目的産物の発現は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって確認した。
以上のようにして、ＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＵＳＰ−ＡＥ及びＵＳＰ−ＤＥを単独で含む４種類の抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＡＦ及びＵＳＰ−ＡＥを含む抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥを含む抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＡＦ及びＵＳＰ−ＤＥを含む抽出液と、共発現させたＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＤＥを含む抽出液とを準備した。
得られた抽出液に対して抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、目的タンパク質の発現を確認した結果を図１４に示す。図１４に示すように、すべての抽出液において、目的とするタンパク質の単独発現及び共発現を確認することができた。
〔実施例４〕ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いたリガンド結合能解析
実施例４では、実施例２及び実施例３で得られたＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体を用いて、これらＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の複合体とリガンドとの結合能に関して解析した。本例では、リガンドとして、植物由来のエクダイソンアゴニストであるポナステロンＡを使用した。
実施例４において、結合型と遊離型を分離するために、チャコールデキストラン法を用いた。これはステロイドホルモンをリガンドとする場合の一般的な方法で、反応停止の際に、デキストランでコーティングされた活性炭溶液を加えることにより、活性炭が受容体と未結合のリガンドを吸着する。これを遠心分離することによって活性炭画分（沈殿画分）と、受容体／リガンドの複合体が存在する上清画分とに分けることが可能となる。
実施例４における実験のフローを図１５に示した。すなわち、まず、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）／５ｍＭ ＤＴＴ／１ｍＭ ＰＭＳＦ）にポナステロンＡの受容体（ＥｃＲ組換え体及びＵＳＰ組換え体の複合体）への非特異的な結合を防ぐため１％のＢＳＡを添加した。これに、実施例２で精製したＥｃＲ−ＡＦ、ＥｃＲ−ＤＦ、ＥｃＲ−ＤＥ、ＥｃＲ−ＥＦ或いはＥｃＲ−Ｅに対し、それぞれＵＳＰ−ＡＥ或いはＵＳＰ−ＤＥを混ぜ、終濃度１．３７ｎＭの［３Ｈ］ポナステロンＡ（［２４，２５，２６，２７−３Ｈ］Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ Ａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．））を加えた。これを２５℃で反応させ、４０分後に２００μｌの活性炭溶液（０．５％Ｃｈａｒｃｏａｌ，ｄｅｘｔｒａｎ ｃｏａｔｅｄ（ＳＩＧＭＡ）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ）添加により反応を停止させた。遠心分離後の上清画分を液体シンチレーターと混合させ、これを液体シンチレーションカウンタ（ＡＬＯＫＡ ＬＳＣ−５１００）を用いて放射活性（ＤＰＭ）を測定した。この時の測定値を全結合量とした。また、［３Ｈ］ポナステロンＡの１０，０００倍の非放射能標識ポナステロンＡを加えて同様の実験を行い、受容体に対するリガンドの非特異的結合量を求めた。受容体に対するリガンドの特異的結合量は、全結合量から非特異的結合量を引いた値とした。
結果を図１６に示す。図１６により、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体と、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＤＥの複合体には、リガンドとの結合能が認められた。一方、のＥｃＲおよびＵＳＰはいずれの長さでも、単独では特異的な結合は見られなかった。
一方、実施例３で調製した抽出液を用いて、同様に結合実験を行った。その結果、図１７に示すように、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥ、およびＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＤＥを細胞内で共発現させた場合に、リガンドとの強い結合が見られた（ｌａｎｅ７及び８）。しかし、これらの組み合わせを、それぞれ単独で発現させたものを、後で混合した場合には、結合が見られなかった（ｌａｎｅ３及び４）。また、ＥｃＲ−ＡＦとＵＳＰ−ＡＥ、およびＥｃＲ−ＡＦとＵＳＰ−ＤＥとの組み合わせにおいては共発現、およびそれぞれ単独発現後に混合したもののいずれにおいても、リガンドとの結合は見られなかった。
以上の結果より、ＥｃＲ−ＤＦがポナステロンＡと結合することから、Ｅ領域に加え、少なくともＤ領域とＦ領域の両方がポナステロンＡとの結合に必要であることが分かった。これまでＤ領域はＵＳＰとの二量体化に関与することが示唆されている。本実施例でえられた結果では、二量体化がリガンドとの結合に必須であることを強く支持する。Ｆ領域に関しては、そのアミノ酸の長さが非常に短く、各生物間の保存性も低くその構造化学的な活性についての役割があいまいなのが現状であるが、少なくともリガンドとの結合に重要な役割を担っている領域であることが判明した。
一方、大腸菌を用いた発現系及び哺乳類細胞を用いた発現系の両方において、ＥｃＲの全長の組換え体（ＥｃＲ−ＡＦ）とポナステロンＡとの結合が認められたが、極めて弱いものであった。したがって、ＥｃＲに対するリガンドをスクリーニングする際には、全長のＥｃＲを用いるのではなく、ＥｃＲ−ＤＦ組換え体を用いる必要があることが、本実施例によって初めて明らかとなった。
〔実施例５〕結合実験の条件検討
実施例５では、上述したＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合をより高効率で見られるように、複合体−リガンド間の相互作用に重要であると考えられる、モル比、反応時間、反応温度、および塩濃度の条件を検討することにした。
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥのモル比の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応時間を以下のようにして検討した。先ず、一定量のＥｃＲ−ＤＦに対し、種々の濃度のＵＳＰ−ＡＥを加え、ウォーターバス中２５℃にて４０分間反応させた。なお、反応溶液中のポナステロンＡは１．３４ｎＭとした。そして、ポナステロンＡの複合体に対する結合を測定した結果を図１８に示す。図１８から判るように、ＥｃＲ−ＤＦ：ＵＳＰ−ＡＥが約１：１でポナステロンＡのＥｃＲ−ＤＦ／ＵＳＰ−ＡＥ複合体に対する結合が飽和状態に達した。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、ＥｃＲ−ＤＦ：ＵＳＰ−ＡＥを、モル比で１：１とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験ではＥｃＲ−ＤＦ：ＵＳＰ−ＡＥをモル比で１：１で行うことにした。
反応時間の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応時間を以下のようにして検討した。まず、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥをモル比１：１で混合し、ウォーターバス中２５℃にて１分、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分間反応させた。なお、反応溶液中のポナステロンＡは１．３４ｎＭとした。その結果を図１９に示す。図１９から判るように、６０分間の反応で、ポナステロンＡの当該複合体に対する結合が、ほぼ飽和状態に達した。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、３０〜９０分の反応時間とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験では反応時間は６０分で行うことにした。
反応温度の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な反応温度を以下のようにして検討した。まず、低温室内４℃にて反応させる以外は、上記「反応時間の検討」と同様に結合反応を行った。その結果を図２０に示す。図２０から判るように、低温室内４℃においては、結合が飽和に達する時間は８時間であった。これに対して、図２０に示したように、反応温度２５℃においては、結合が飽和に達する時間は６０分であった。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、２０〜３７℃の反応温度とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験では反応温度は２５℃で行うことにした。
塩濃度の検討
ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に関して、最適な塩濃度を以下のようにして検討した。まず、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥとをモル比１：１で混合し、ウォーターバス中２５℃で反応させた。この時の反応溶液中の塩（ＮａＣｌ）濃度を終濃度０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭで行った。その結果を図２１に示す。図２１から判るように、塩濃度の増加と共に、当該複合体に対するリガンドの特異的結合が減少した。この結果から、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体とリガンドとの結合反応に際して、０〜１００ｍＭの塩濃度とすることが好ましいと言える。なお、以降の実験では反応溶液には塩を加えないものを使用した。
〔実施例６〕複合体とリガンドとの結合のスキャッチャード解析
実施例６では、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥを用いて、以下のようにして、複合体のポナステロンＡに対する解離定数を（Ｋｄ）を求めた。まず、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥをモル比１：１で混合し、これに種々の濃度の［３Ｈ］ポナステロンＡを加えた。この反応液に遊離のリガンドを除くために活性炭溶液を加えた。ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体の［３Ｈ］ポナステロンＡに対する結合量（全結合量）は、遠心分離後の上清画分の放射活性を測定することにより求めた。また、［３Ｈ］ポナステロンＡの１０，０００倍の非放射標識ポナステロンＡを加えて同様の実験を行い、非特異的結合を求めた。測定結果より結合曲線をプロットし他結果を図２２に示す。そして、図２２に示した結合曲線における値をもとにスキャッチャード解析を行った。結果を図２３に示す。なお図２３において、横軸は［３Ｈ］ポナステロンＡの特異的結合量（ｎＭ）を示し、縦軸は特異的結合量（ｂｏｕｎｄ）／全結合量−特異的結合量（ｆｒｅｅ）を示す。
図２３から判るように、スキャッチャード解析の結果１本の直線が得られ、Ｋｄ＝２．７９ｎＭ、Ｂｍａｘ＝０．１７ｎＭとなった。
〔実施例７〕昆虫抑制物質のスクリーニング系の構築
実施例７では、実施例１乃至６の結果に基づいて、昆虫抑制物質のスクリーニング系を構築した。実施例１乃至６に示したように、エクダイソンアゴニストであるポナステロンＡを用いた結合解析を行った結果、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体に対するポナステロンＡの結合が示された。この系がスクリーニング系として機能するかどうかは、他のエクダイソンアゴニストとの結合も観察されなければならない。そこで、昆虫の生体内での活性型のエクダイソンである２０−ヒドロキシエクダイソンと、合成エクダイソンアゴニストであるテブフェノジド（ＲＨ−５９９２）とを用いて、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体との結合実験を試みた。
まず、実施例４と同様に、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにＥｃＲ−ＤＦに対してＵＳＰ−ＡＥを混ぜ、［３Ｈ］ポナステロンＡを加えた。また、［３Ｈ］ポナステロンＡの１０，０００倍の２０−ヒドロキシエクダイソン、またはテブフェノジドを加えて同様の実験を行い、非特異的結合を求めた。その結果、２０−ヒドロキシエクダイソン及びテブフェノジド共にＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体との結合活性が認められた。そこで、２０−ヒドロキシエクダイソン、またはテブフェノジドの濃度を変化させて同様の実験を行った。その結果を図２４に示す。図２４から判るように、２０−ヒドロキシエクダイソン及びテブフェノジドは、共に濃度依存的に［３Ｈ］ポナステロンＡの当該複合体への結合を阻害することが分かった。
以上の結果より、ＥｃＲ−ＤＦとＵＳＰ−ＡＥを用いた結合実験を、昆虫成育制御物質のスクリーニング系に用いることができることが判明した。
次に、本実施例では、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体に対する結合能を指標としたスクリーニング系を用いて、４種の化合物について当該結合能を評価した。化合物としては、４−ノニルフェノール、スチルベストロール、フタル酸ジエチル（内分泌攪乱物質）及び１７β−エストラジオール（女性ホルモン）を用いた。
結果を図２５に示す。図２５から判るように、４−ノニルフェノール、スチルベストロール、１７β−エストラジオールについて、ＥｃＲ−ＤＦ及びＵＳＰ−ＡＥの複合体に対する結合活性が認められた。特に４−ノニルフェノール、スチルベストロールについては結合活性が強いものであった。これまでＥｃＲは、基本的にポナステロンＡなど、ステロイド骨格を有する化合物と結合することが知られている。一方、ステロイド骨格を持たないものでは、テブフェノジドなど数種に限られていた。本実施例において結合活性を示した物質は、いずれもステロイド骨格は有しておらず、またＥｃＲとの結合はこれまで知られていなかった。また、この結果から、大腸菌において発現したＥｃＲ−ＤＦと、ＵＳＰ−ＡＥ若しくはＵＳＰ−ＤＥとを用いたスクリーニング系を、昆虫成育制御物質の探索のための新たな系として確立することができた。
【産業上の利用の可能性】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、昆虫脱皮ホルモンに対して結合することができる全く新規な脱皮ホルモン受容体を提供することができる。また、本発明によれば、この脱皮ホルモン受容体を用いることで、害虫駆除剤等に応用可能な物質を効率的にスクリーニングことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる昆虫脱皮ホルモン受容体。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
【請求項２】
上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする請求項１記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
【請求項３】
上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする請求項１記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか１項記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に、供試物質を作用させる第１工程と、
前記複合体と前記供試物質との結合を測定する第２工程と
を含む脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項５】
上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、３０〜９０分反応させることを特徴とする請求項４記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項６】
上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、２０〜３７℃の条件下で反応させることを特徴とする請求項４記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項７】
上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、実質的に塩を含まない条件下で反応させることを特徴とする請求項４記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる、昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
【請求項９】
上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする請求項８記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
【請求項１０】
上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする請求項８記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
【請求項１】
以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる昆虫脱皮ホルモン受容体。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
【請求項２】
上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする請求項１記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
【請求項３】
上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする請求項１記載の昆虫脱皮ホルモン受容体。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか１項記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に、供試物質を作用させる第１工程と、
前記複合体と前記供試物質との結合を測定する第２工程と
を含む脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項５】
上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、３０〜９０分反応させることを特徴とする請求項４記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項６】
上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、２０〜３７℃の条件下で反応させることを特徴とする請求項４記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項７】
上記第１工程では、上記昆虫脱皮ホルモン受容体と上記供試物質とを混合した後、実質的に塩を含まない条件下で反応させることを特徴とする請求項４記載の脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の（ａ）のポリペプチドと、（ｂ）のポリペプチド若しくは（ｃ）のポリペプチドとからなる、昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり下記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドと複合体をなし且つ当該複合体をなした状態で脱皮ホルモンと結合できるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり上記（ａ）のポリペプチドと複合体をなしうるポリペプチド
【請求項９】
上記（ａ）のポリペプチド、上記（ｂ）のポリペプチド及び上記（ｃ）のポリペプチドが大腸菌で発現したものであることを特徴とする請求項８記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
【請求項１０】
上記（ａ）のポリペプチドは、大腸菌で発現させた後にゲルろ過によって、上記（ｂ）のポリペプチド又は上記（ｃ）のポリペプチドに対する結合活性をもつようにしたものであることを特徴とする請求項８記載の昆虫脱皮ホルモン受容体に対するリガンドのスクリーニング剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７００２８
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４８１７（Ｐ２００５−５０４８１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１００６
【国際出願日】平成１６年２月２日（２００４．２．２）
【出願人】（００００００１６９）クミアイ化学工業株式会社 (86)
【出願人】（５０３０５３９８５）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１００６
【国際出願日】平成１６年２月２日（２００４．２．２）
【出願人】（００００００１６９）クミアイ化学工業株式会社 (86)
【出願人】（５０３０５３９８５）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]