脳炎の診断方法及び脳炎の診断システム
【課題】早期かつ確実な診断を可能とする、脳炎の診断方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る脳炎の診断方法は、患者から生物サンプルを採取する採取工程と、前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程と、を有する。前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する。抗原性が高い部位は、ＮＴ２である。グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２である。測定はＥＬＩＳＡで行う。
【解決手段】本発明に係る脳炎の診断方法は、患者から生物サンプルを採取する採取工程と、前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程と、を有する。前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する。抗原性が高い部位は、ＮＴ２である。グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２である。測定はＥＬＩＳＡで行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳炎の診断方法及び脳炎の診断システムに関し、より具体的には、急性脳炎の診断方法及び診断システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）には１、２型の亜型がある。成人・老人の単純ヘルペス脳炎（ヘルペス脳炎）は、主としてＨＳＶ１型による。
【０００３】
ＨＳＶ２型による神経感染は、新生児の急性脳炎を除き、急性の脊髄炎・髄膜炎が知られている。
【０００４】
ＨＳＶ１型による急性脳炎は、側頭葉・大脳辺縁系を好発部位とする。polymerase chain
reaction(PCR)、ＭＲＩの導入によって脳幹脳炎型、あるいは再発・慢性型等多様な臨床像が捉られている。
【０００５】
早期診断・早期治療の普及により、我国の本症の致命率は約１０％程度になり、約３０％程度に社会復帰例が散見される。
【０００６】
もっとも、生存例の多くで健忘、記銘力障害、人格障害等の後遺症が残り、家庭あるいは社会復帰の困難な例も少なからず存在する。
【０００７】
一方、非ヘルペス性辺縁系脳炎は、ヘルペス脳炎、傍腫瘍性辺縁系脳炎とスペクトルムを組む新しい亜型と考えられている。
【０００８】
非ヘルペス性辺縁系脳炎は、非ヘルペス性急性辺縁系脳炎等の名称でも報告されている。
【０００９】
非ヘルペス性辺縁系脳炎は、臨床症状、臨床経過、両側側頭葉内側（海馬等）のＭＲＩ異常が特徴的であり、主たる病態、原因は同定されていないが、種々のウイルス感染、傍腫瘍性、膠原病等を引き金とした免疫学的機序が有力である。
【００１０】
非ヘルペス性辺縁系脳炎では、グルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ）抗体の関与が注目されている。
【００１１】
日本の成人の非ヘルペス性辺縁系脳炎罹患率は４．１／１００万人年で、急性脳炎罹患率は１９．０／１００万人年であることから、急性脳炎の２４．５％を占めると推定される。
【００１２】
非ヘルペス性急性辺縁系脳炎（non-herpetic acute limbic encephalitis、 NHALE）は年間５５０人の発生があると推定され、重要な疾患である。
【００１３】
ところで、脳炎の一種であるラスムッセン脳炎に関して、特許文献１に記載されているスクリーニング方法がある。
【００１４】
しかしながら、特許文献１に記載されている方法では、早期診断が困難である。
【特許文献１】特表平９−５０１７７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、早期かつ確実な診断を可能とする、脳炎の診断方法及び脳炎の診断システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る脳炎の診断方法は、
患者から生物サンプルを採取する採取工程と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程と、を有することを特徴とする。
【００１７】
また、前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、ことも可能である。
【００１８】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、ことも可能である。
【００１９】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、ことも可能である。
【００２０】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、ことも可能である。
【００２１】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、ことも可能である。
【００２２】
また、前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、ことも可能である。
【００２３】
また、前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、ことも可能である。
【００２４】
また、前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２５】
また、前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２６】
また、前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２７】
また、前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２８】
また、前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、ことも可能である。
【００２９】
次に、上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係る脳炎の診断システムは、
患者から生物サンプルを採取する採取手段と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択手段と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定手段と、を有する、ことを特徴とする。
【００３０】
また、前記測定手段では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、ことも可能である。
【００３１】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、ことも可能である。
【００３２】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、ことも可能である。
【００３３】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、ことも可能である。
【００３４】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、ことも可能である。
【００３５】
また、前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、ことも可能である。
【００３６】
また、前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、ことも可能である。
【００３７】
また、前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００３８】
また、前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００３９】
また、前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００４０】
また、前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００４１】
また、前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、ことも可能である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の脳炎の診断方法及び脳炎の診断システムは、早期にかつ確実な診断を行うことができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明に係る脳炎の診断方法では、まず、患者から生物サンプルを採取する。
【００４４】
生物サンプルは、患者の体液である。
【００４５】
具体的には、生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである。
【００４６】
後述する抗ＧｌｕＲε２抗体は、急性期の急性非ヘルペス性辺縁系脳炎で、血清・髄液中に高い確率で検出される。そのため、生物サンプルとしては、血清若しくは髄液が好ましい。
【００４７】
次に、生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する。
【００４８】
グルタミン酸受容体は、中枢神経系における高次脳機能を担う重要な分子である。一部のグルタミン酸受容体に対する自己抗体が、脳炎や傍腫瘍症候群を来たし、様々な中枢神経症状を呈する。
【００４９】
グルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択するから、簡易かつ短時間での診断が可能となる。
【００５０】
また、抗原性が高い部位のペプチドを合成し、ペプチドを抗原として、抗体を測定する。ペプチド合成は市販のキットで行うことができる。このため、合成ペプチドさえあれば一般病院の検査室でも可能となり、簡易に診断を行うことができる。
【００５１】
図１は、グルタミン酸受容体：ＧｌｕＲε２のアミノ酸配列を示すものである。
【００５２】
グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体（イオノトロピック受容体）、若しくは、Ｇ蛋白質共役受容体である代謝型グルタミン酸受容体を使用できる。
【００５３】
イオンチャネル型のグルタミン酸受容体としては、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、若しくは、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、ＧｌｕＲδ２等を使用できる。例えば、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を好適に使用できる。
【００５４】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、図２に示され、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、若しくは、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２を使用できる。
【００５５】
抗原性が高い部位は、例えばＮ末側のアミノ酸である。
【００５６】
抗ＧｌｕＲε２抗体測定目的で検体送付を受けた急性脳炎・脳症関連症例から、腫瘍合併例、再発例、慢性例、膠原病合併例、インフルエンザ脳症、単純ヘルペスウィルスＰＣＲ陽性例等を除き、辺縁系症状で神経症状が始まった１５歳以上のNHALE91例による検討では、（１）血清中抗ＧｌｕＲε２抗体（ＩｇＧまたはＩｇＭ）は、急性期から慢性期においてNHALEの約５５％に見られること、（２）髄液中抗ＧｌｕＲε２抗体は急性期の約５０％、回復期の約４０％、慢性期の約３０％の症例に見られ、陽性率は次第に低下すること、（３）髄液中の抗ＧｌｕＲε２抗体は急性期でもかなり早い時期に出現すること、（４）抗ＧｌｕＲε２抗体のエピトープ解析は髄液中の抗ＧｌｕＲε２抗体陽性の４例で行い、４例ともＮ末エピトープ(ＮＴ１)を含んでいること、が判明している。
【００５７】
よって、血液中にできた抗ＧｌｕＲε２抗体は、血液脳関門の破綻等により中枢神経系に至り、何らかの急性期脳炎症状に寄与するが、回復期・慢性期になると血液脳関門の回復により髄液中での濃度が低下する可能性がある。また、Ｎ末−ＧｌｕＲε２抗体（エピトープ）の測定がNHALEの診断に重要と考えられる。
【００５８】
抗原性が高い部位は、例えば、図１に示されるように、ＮＴ２である。ＮＴ２は、ＫＥ ＲＫＷＥＲＶＧＫＷＫ ＤＫである。
【００５９】
また、抗原性が高い部位として、例えば、ＮＴ１を使用することもできる。このＮＴ１は、早期診断を可能とするため、遺伝子合成ではなく、ペプチド合成を用いることが好ましい。ＮＴ１は、ＲＳＱＫ ＳＰＰＳＩＧＩＡＶＩ ＬＶＧＴＳＤＥＶＡＩ ＫＤＡＨＥＫＤＤＦＨＨＬＳＶＶＰＲＶＥＬ ＶＡＭＮである。
【００６０】
また、抗原性が高い部位として、例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４を使用することもできる。Ｍ１は、ＶＷＶ ＭＭＦＶＭＬＬＩＶＳ ＡＶＡＶＦＶＦである。Ｍ２は、ＦＴＩＧＫＡＩＷＬＬＷ ＧＬＶＦＮＮＳＶＰである。Ｍ３は、Ｉ ＭＶＳＶＷＡＦＦＡＶ ＩＦＬＡＳＹＴＡである。
【００６１】
また、抗原性が高い部位として、例えば、ＣＴ１を使用することもできる。ＣＴ１は、ＤＩＹＫＥＲＳＤ ＤＦＫＲＤＳである。
【００６２】
さらに、抗原性が高い部位として、Ｍ３−４を使用することも可能である。Ｍ３−４は、ＳＤＫＫ ＦＱＲＰＮＤＦＳＰＰである。
【００６３】
抗体の測定は、図３に示されるように、ＥＬＩＳＡ法による。
【００６４】
本実施形態に係る測定により、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎等を診断できる。
【００６５】
また、これらに分類できない脳炎も診断できる。なお、本発明における脳炎は、脳症も含む概念である。
【実施例】
【００６６】
患者の髄液中のグルタミン酸受容体のうちＮＴ２のペプチドを合成し、抗原としてＥＬＩＳＡ法により抗体を測定した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ法による測定は、図４に示されるスキームにより行った。測定時間は約２日であった。
【００６８】
一方、スクリーニングに使ってきた全長ＧｌｕＲε２分子を抗原とした抗ＧｌｕＲε２抗体測定、そのＮ末（ＮＴ１）エピトープ測定は、遺伝子組み換えによりＮＩＨ３Ｔ３細胞や大腸菌において合成した蛋白・ペプチドを用いたイムノブロット法であるため、感度が低く、下記の表１に示されるように、測定に５日必要であった。さらに、抗原の精製には１０〜２０日を要した。
【００６９】
【表１】
【００７０】
測定をした対照血清の抗ＮＴ２抗体は0.415±0.102（OD）、疾病対照髄液の抗ＮＴ２抗体は0.200±0.098（OD）であった。
【００７１】
対照の平均+2SD（OD）をカットオフとすると、血清抗ＮＴ２抗体は、抗ＮＴ１抗体陽性７例中７例で陽性、抗ＮＴ１抗体陰性７例中７例でも陽性であった。
【００７２】
図５に示されるように、血清抗ＮＴ２抗体平均（OD）値は、抗ＮＴ１抗体陰性群（0.85）より陽性群（1.19）で高値であった（Mann-Whitney’s U test, p=0.02）。ＮＴ１＋は、イムノブロット法によるＮＴ１を抗原とする抗体陽性群である。ＮＴ１−は、イムノブロット法によるＮＴ１を抗原とする抗体陰性群である。Ｄ＋は、Ｄａｌｍａｕらの方法によるＮＭＤＡ型ＧｌｕＲ複合体抗体陽性例である。Ｃは、正常のヒトのものである。縦軸は抗ＮＴ２抗体の相対的検出量である。
【００７３】
図６に示されるように、髄液抗ＮＴ２抗体は、抗ＮＴ１抗体陽性４例中２例で陽性、抗ＮＴ１抗体陰性４例中２例で陽性であった。
【００７４】
また、図７に示されるように、NHALEでは髄液抗ＮＴ２抗体値が発病後日数と比例して上昇する傾向を示し、４/５例で陽性であった。横軸は発病日を示す。
【００７５】
このように、約２日で測定可能なＥＬＩＳＡ法による抗ＮＴ２抗体は、脳炎の診断マーカーとして有用であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】グルタミン酸受容体の配列を説明する図である。
【図２】グルタミン酸受容体の概略を説明する図である。
【図３】ＥＬＩＳＡ法による抗体の測定を説明する図である。
【図４】ＥＬＩＳＡ法によるスキームを説明する図である。
【図５】血清中の抗ＮＴ２抗体の測定結果を説明する図である。
【図６】髄液中の抗ＮＴ２抗体の測定結果を説明する図である。
【図７】髄液抗ＮＴ２抗体値の発病後日数依存性を説明する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳炎の診断方法及び脳炎の診断システムに関し、より具体的には、急性脳炎の診断方法及び診断システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）には１、２型の亜型がある。成人・老人の単純ヘルペス脳炎（ヘルペス脳炎）は、主としてＨＳＶ１型による。
【０００３】
ＨＳＶ２型による神経感染は、新生児の急性脳炎を除き、急性の脊髄炎・髄膜炎が知られている。
【０００４】
ＨＳＶ１型による急性脳炎は、側頭葉・大脳辺縁系を好発部位とする。polymerase chain
reaction(PCR)、ＭＲＩの導入によって脳幹脳炎型、あるいは再発・慢性型等多様な臨床像が捉られている。
【０００５】
早期診断・早期治療の普及により、我国の本症の致命率は約１０％程度になり、約３０％程度に社会復帰例が散見される。
【０００６】
もっとも、生存例の多くで健忘、記銘力障害、人格障害等の後遺症が残り、家庭あるいは社会復帰の困難な例も少なからず存在する。
【０００７】
一方、非ヘルペス性辺縁系脳炎は、ヘルペス脳炎、傍腫瘍性辺縁系脳炎とスペクトルムを組む新しい亜型と考えられている。
【０００８】
非ヘルペス性辺縁系脳炎は、非ヘルペス性急性辺縁系脳炎等の名称でも報告されている。
【０００９】
非ヘルペス性辺縁系脳炎は、臨床症状、臨床経過、両側側頭葉内側（海馬等）のＭＲＩ異常が特徴的であり、主たる病態、原因は同定されていないが、種々のウイルス感染、傍腫瘍性、膠原病等を引き金とした免疫学的機序が有力である。
【００１０】
非ヘルペス性辺縁系脳炎では、グルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ）抗体の関与が注目されている。
【００１１】
日本の成人の非ヘルペス性辺縁系脳炎罹患率は４．１／１００万人年で、急性脳炎罹患率は１９．０／１００万人年であることから、急性脳炎の２４．５％を占めると推定される。
【００１２】
非ヘルペス性急性辺縁系脳炎（non-herpetic acute limbic encephalitis、 NHALE）は年間５５０人の発生があると推定され、重要な疾患である。
【００１３】
ところで、脳炎の一種であるラスムッセン脳炎に関して、特許文献１に記載されているスクリーニング方法がある。
【００１４】
しかしながら、特許文献１に記載されている方法では、早期診断が困難である。
【特許文献１】特表平９−５０１７７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、早期かつ確実な診断を可能とする、脳炎の診断方法及び脳炎の診断システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る脳炎の診断方法は、
患者から生物サンプルを採取する採取工程と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程と、を有することを特徴とする。
【００１７】
また、前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、ことも可能である。
【００１８】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、ことも可能である。
【００１９】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、ことも可能である。
【００２０】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、ことも可能である。
【００２１】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、ことも可能である。
【００２２】
また、前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、ことも可能である。
【００２３】
また、前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、ことも可能である。
【００２４】
また、前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２５】
また、前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２６】
また、前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２７】
また、前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００２８】
また、前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、ことも可能である。
【００２９】
次に、上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係る脳炎の診断システムは、
患者から生物サンプルを採取する採取手段と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択手段と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定手段と、を有する、ことを特徴とする。
【００３０】
また、前記測定手段では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、ことも可能である。
【００３１】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、ことも可能である。
【００３２】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、ことも可能である。
【００３３】
また、前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、ことも可能である。
【００３４】
また、前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、ことも可能である。
【００３５】
また、前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、ことも可能である。
【００３６】
また、前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、ことも可能である。
【００３７】
また、前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００３８】
また、前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００３９】
また、前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００４０】
また、前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、ことも可能である。
【００４１】
また、前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、ことも可能である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の脳炎の診断方法及び脳炎の診断システムは、早期にかつ確実な診断を行うことができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明に係る脳炎の診断方法では、まず、患者から生物サンプルを採取する。
【００４４】
生物サンプルは、患者の体液である。
【００４５】
具体的には、生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである。
【００４６】
後述する抗ＧｌｕＲε２抗体は、急性期の急性非ヘルペス性辺縁系脳炎で、血清・髄液中に高い確率で検出される。そのため、生物サンプルとしては、血清若しくは髄液が好ましい。
【００４７】
次に、生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する。
【００４８】
グルタミン酸受容体は、中枢神経系における高次脳機能を担う重要な分子である。一部のグルタミン酸受容体に対する自己抗体が、脳炎や傍腫瘍症候群を来たし、様々な中枢神経症状を呈する。
【００４９】
グルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択するから、簡易かつ短時間での診断が可能となる。
【００５０】
また、抗原性が高い部位のペプチドを合成し、ペプチドを抗原として、抗体を測定する。ペプチド合成は市販のキットで行うことができる。このため、合成ペプチドさえあれば一般病院の検査室でも可能となり、簡易に診断を行うことができる。
【００５１】
図１は、グルタミン酸受容体：ＧｌｕＲε２のアミノ酸配列を示すものである。
【００５２】
グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体（イオノトロピック受容体）、若しくは、Ｇ蛋白質共役受容体である代謝型グルタミン酸受容体を使用できる。
【００５３】
イオンチャネル型のグルタミン酸受容体としては、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、若しくは、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、ＧｌｕＲδ２等を使用できる。例えば、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を好適に使用できる。
【００５４】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、図２に示され、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、若しくは、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２を使用できる。
【００５５】
抗原性が高い部位は、例えばＮ末側のアミノ酸である。
【００５６】
抗ＧｌｕＲε２抗体測定目的で検体送付を受けた急性脳炎・脳症関連症例から、腫瘍合併例、再発例、慢性例、膠原病合併例、インフルエンザ脳症、単純ヘルペスウィルスＰＣＲ陽性例等を除き、辺縁系症状で神経症状が始まった１５歳以上のNHALE91例による検討では、（１）血清中抗ＧｌｕＲε２抗体（ＩｇＧまたはＩｇＭ）は、急性期から慢性期においてNHALEの約５５％に見られること、（２）髄液中抗ＧｌｕＲε２抗体は急性期の約５０％、回復期の約４０％、慢性期の約３０％の症例に見られ、陽性率は次第に低下すること、（３）髄液中の抗ＧｌｕＲε２抗体は急性期でもかなり早い時期に出現すること、（４）抗ＧｌｕＲε２抗体のエピトープ解析は髄液中の抗ＧｌｕＲε２抗体陽性の４例で行い、４例ともＮ末エピトープ(ＮＴ１)を含んでいること、が判明している。
【００５７】
よって、血液中にできた抗ＧｌｕＲε２抗体は、血液脳関門の破綻等により中枢神経系に至り、何らかの急性期脳炎症状に寄与するが、回復期・慢性期になると血液脳関門の回復により髄液中での濃度が低下する可能性がある。また、Ｎ末−ＧｌｕＲε２抗体（エピトープ）の測定がNHALEの診断に重要と考えられる。
【００５８】
抗原性が高い部位は、例えば、図１に示されるように、ＮＴ２である。ＮＴ２は、ＫＥ ＲＫＷＥＲＶＧＫＷＫ ＤＫである。
【００５９】
また、抗原性が高い部位として、例えば、ＮＴ１を使用することもできる。このＮＴ１は、早期診断を可能とするため、遺伝子合成ではなく、ペプチド合成を用いることが好ましい。ＮＴ１は、ＲＳＱＫ ＳＰＰＳＩＧＩＡＶＩ ＬＶＧＴＳＤＥＶＡＩ ＫＤＡＨＥＫＤＤＦＨＨＬＳＶＶＰＲＶＥＬ ＶＡＭＮである。
【００６０】
また、抗原性が高い部位として、例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４を使用することもできる。Ｍ１は、ＶＷＶ ＭＭＦＶＭＬＬＩＶＳ ＡＶＡＶＦＶＦである。Ｍ２は、ＦＴＩＧＫＡＩＷＬＬＷ ＧＬＶＦＮＮＳＶＰである。Ｍ３は、Ｉ ＭＶＳＶＷＡＦＦＡＶ ＩＦＬＡＳＹＴＡである。
【００６１】
また、抗原性が高い部位として、例えば、ＣＴ１を使用することもできる。ＣＴ１は、ＤＩＹＫＥＲＳＤ ＤＦＫＲＤＳである。
【００６２】
さらに、抗原性が高い部位として、Ｍ３−４を使用することも可能である。Ｍ３−４は、ＳＤＫＫ ＦＱＲＰＮＤＦＳＰＰである。
【００６３】
抗体の測定は、図３に示されるように、ＥＬＩＳＡ法による。
【００６４】
本実施形態に係る測定により、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎等を診断できる。
【００６５】
また、これらに分類できない脳炎も診断できる。なお、本発明における脳炎は、脳症も含む概念である。
【実施例】
【００６６】
患者の髄液中のグルタミン酸受容体のうちＮＴ２のペプチドを合成し、抗原としてＥＬＩＳＡ法により抗体を測定した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ法による測定は、図４に示されるスキームにより行った。測定時間は約２日であった。
【００６８】
一方、スクリーニングに使ってきた全長ＧｌｕＲε２分子を抗原とした抗ＧｌｕＲε２抗体測定、そのＮ末（ＮＴ１）エピトープ測定は、遺伝子組み換えによりＮＩＨ３Ｔ３細胞や大腸菌において合成した蛋白・ペプチドを用いたイムノブロット法であるため、感度が低く、下記の表１に示されるように、測定に５日必要であった。さらに、抗原の精製には１０〜２０日を要した。
【００６９】
【表１】
【００７０】
測定をした対照血清の抗ＮＴ２抗体は0.415±0.102（OD）、疾病対照髄液の抗ＮＴ２抗体は0.200±0.098（OD）であった。
【００７１】
対照の平均+2SD（OD）をカットオフとすると、血清抗ＮＴ２抗体は、抗ＮＴ１抗体陽性７例中７例で陽性、抗ＮＴ１抗体陰性７例中７例でも陽性であった。
【００７２】
図５に示されるように、血清抗ＮＴ２抗体平均（OD）値は、抗ＮＴ１抗体陰性群（0.85）より陽性群（1.19）で高値であった（Mann-Whitney’s U test, p=0.02）。ＮＴ１＋は、イムノブロット法によるＮＴ１を抗原とする抗体陽性群である。ＮＴ１−は、イムノブロット法によるＮＴ１を抗原とする抗体陰性群である。Ｄ＋は、Ｄａｌｍａｕらの方法によるＮＭＤＡ型ＧｌｕＲ複合体抗体陽性例である。Ｃは、正常のヒトのものである。縦軸は抗ＮＴ２抗体の相対的検出量である。
【００７３】
図６に示されるように、髄液抗ＮＴ２抗体は、抗ＮＴ１抗体陽性４例中２例で陽性、抗ＮＴ１抗体陰性４例中２例で陽性であった。
【００７４】
また、図７に示されるように、NHALEでは髄液抗ＮＴ２抗体値が発病後日数と比例して上昇する傾向を示し、４/５例で陽性であった。横軸は発病日を示す。
【００７５】
このように、約２日で測定可能なＥＬＩＳＡ法による抗ＮＴ２抗体は、脳炎の診断マーカーとして有用であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】グルタミン酸受容体の配列を説明する図である。
【図２】グルタミン酸受容体の概略を説明する図である。
【図３】ＥＬＩＳＡ法による抗体の測定を説明する図である。
【図４】ＥＬＩＳＡ法によるスキームを説明する図である。
【図５】血清中の抗ＮＴ２抗体の測定結果を説明する図である。
【図６】髄液中の抗ＮＴ２抗体の測定結果を説明する図である。
【図７】髄液抗ＮＴ２抗体値の発病後日数依存性を説明する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から生物サンプルを採取する採取工程と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程と、を有する、
ことを特徴とする脳炎の診断方法。
【請求項２】
前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、
ことを特徴とする請求項１記載の脳炎の診断方法。
【請求項３】
前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、
ことを特徴とする請求項１又は２記載の脳炎の診断方法。
【請求項４】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、
ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項５】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、
ことを特徴とする請求項２記載の脳炎の診断方法。
【請求項６】
前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、
ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項７】
前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、
ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項８】
前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、
ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項９】
前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項８記載の脳炎の診断方法。
【請求項１０】
前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項９記載の脳炎の診断方法。
【請求項１１】
前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項１２】
前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項１３】
前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、
ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項１４】
患者から生物サンプルを採取する採取手段と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択手段と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定手段と、を有する、
ことを特徴とする脳炎の診断システム。
【請求項１５】
前記測定手段では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、
ことを特徴とする請求項１４記載の脳炎の診断システム。
【請求項１６】
前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、
ことを特徴とする請求項１４又は１５記載の脳炎の診断システム。
【請求項１７】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、
ことを特徴とする請求項１４乃至１６の何れ１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項１８】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、
ことを特徴とする請求項１５記載の脳炎の診断システム。
【請求項１９】
前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、
ことを特徴とする請求項１４乃至１６の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２０】
前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、
ことを特徴とする請求項１４乃至１６の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２１】
前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、
ことを特徴とする請求項１４乃至２０の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２２】
前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート））、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項２１記載の脳炎の診断システム。
【請求項２３】
前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項２２記載の脳炎の診断システム。
【請求項２４】
前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１４乃至２３の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２５】
前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１４乃至２４の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２６】
前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、
ことを特徴とする請求項１４乃至２５のいずれか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項１】
患者から生物サンプルを採取する採取工程と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程と、を有する、
ことを特徴とする脳炎の診断方法。
【請求項２】
前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、
ことを特徴とする請求項１記載の脳炎の診断方法。
【請求項３】
前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、
ことを特徴とする請求項１又は２記載の脳炎の診断方法。
【請求項４】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、
ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項５】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、
ことを特徴とする請求項２記載の脳炎の診断方法。
【請求項６】
前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、
ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項７】
前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、
ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項８】
前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、
ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項９】
前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項８記載の脳炎の診断方法。
【請求項１０】
前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項９記載の脳炎の診断方法。
【請求項１１】
前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項１２】
前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項１３】
前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、
ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の脳炎の診断方法。
【請求項１４】
患者から生物サンプルを採取する採取手段と、
前記生物サンプル中のグルタミン酸受容体の分子のうち、抗原性が高い部位を選択する選択手段と、
前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定手段と、を有する、
ことを特徴とする脳炎の診断システム。
【請求項１５】
前記測定手段では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定する、
ことを特徴とする請求項１４記載の脳炎の診断システム。
【請求項１６】
前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸である、
ことを特徴とする請求項１４又は１５記載の脳炎の診断システム。
【請求項１７】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ２である、
ことを特徴とする請求項１４乃至１６の何れ１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項１８】
前記抗原性が高い部位は、ＮＴ１である、
ことを特徴とする請求項１５記載の脳炎の診断システム。
【請求項１９】
前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、Ｍ３−Ｍ４の少なくともいずれか一つである、
ことを特徴とする請求項１４乃至１６の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２０】
前記抗原性が高い部位は、ＣＴ１である、
ことを特徴とする請求項１４乃至１６の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２１】
前記グルタミン酸受容体は、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体である、
ことを特徴とする請求項１４乃至２０の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２２】
前記グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート）、ＫＡ型グルタミン酸受容体（カイネート）、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート））、ＧｌｕＲδ１、及び、ＧｌｕＲδ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項２１記載の脳炎の診断システム。
【請求項２３】
前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＧｌｕＲε２、ＧｌｕＲε１、ＧｌｕＲε３、ＧｌｕＲε４、ＧｌｕＲζ１、ＧｌｕＲχ１、及び、ＧｌｕＲχ２のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項２２記載の脳炎の診断システム。
【請求項２４】
前記脳炎は、単純ヘルペス性脳炎、ウイルス直接侵襲脳炎、傍感染性脳炎、傍腫瘍性脳炎、及び、全身性膠原病合併脳炎のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１４乃至２３の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２５】
前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つである、
ことを特徴とする請求項１４乃至２４の何れか１項に記載の脳炎の診断システム。
【請求項２６】
前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による、
ことを特徴とする請求項１４乃至２５のいずれか１項に記載の脳炎の診断システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２４４２２５（Ｐ２００９−２４４２２５Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４０３２（Ｐ２００８−９４０３２）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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