脳腫瘍の治療のための移植可能な神経前駆および幹細胞
【課題】異なる型の神経細胞中に分化する能力を有し、それにより細胞がニューロン細胞が投与される第一の位置から腫瘍細胞が存在する位置までの移動能力を有し、複数のニューロン細胞が腫瘍を囲むように周囲を移動する能力を有すること；そして浸潤性腫瘍細胞の跡をたどって浸潤性および転移性腫瘍を治療する能力を有するヒト神経幹細胞もしくはヒト神経幹細胞子孫のクローンの提供。
【解決手段】生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する個々の明確な細胞系としてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定に維持される遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞もしくはヒト神経幹細胞子孫のクローンまたはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定な細胞系として維持され、生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞。
【解決手段】生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する個々の明確な細胞系としてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定に維持される遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞もしくはヒト神経幹細胞子孫のクローンまたはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定な細胞系として維持され、生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子治療の分野、より具体的には脳腫瘍を治療するためのニューロン細胞の使用の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍の治療のための有効な遺伝子治療は長年の間つかみどころのない最終目標であった。事実上治療不可能である多形膠芽腫およびより小さく悪性の未分化星状細胞腫は米国で年間に診断される５，０００の頭蓋内神経膠腫の約１／４の原因であり；成人での神経膠腫の７５パーセントはこの範疇のものである。その深刻かつ均一の罹患率のため、それはいずれかの他の腫瘍がするよりひとり当たりに基づく癌の費用により大きく寄与する。普遍的には人生の第五の１０年に襲われる患者は、放射線および化学療法の比較的無効な治療に伴う進行性合併症を経験する一方で反復性の入院および手術の周期に入る（“Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”アイゼルバッハー（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ）、ブラウンヴァルト（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）、ウィルソン（Ｗｉｌｌｓｏｎ）、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）、ファウチ（Ｆａｕｃｉ）とカスパー（Ｋａｓｐｅｒ）により編、第１３版、ｐ．２２６２、マグロー・ヒル インク（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．）１９９４）。
【０００３】
神経膠腫のような脳腫瘍の遺伝子治療に対する妨害の一は、それらが拡張する、広範に移動する、そして正常細胞に浸潤する度合にあった。今日までの大部分の遺伝子治療戦略はウイルスベクターを基礎とするが、それにもかかわらず典型的に必要な細胞の大きな領域および数に十分な量へのウイルスベクター媒介性の遺伝子の広範囲の分布はしばしばがっかりさせることに制限されている。興味深いことに、正常の神経前駆および幹細胞の検定の特徴の一はそれらの移動性の質にある。神経幹細胞（ＮＳＣ）は発生中のそして成人においてさえもＣＮＳに存在する未熟な未前駆(uncommitted)細胞であり、そして整然と並んだＣＮＳのより特化された(specialized)細胞を生じさせるものと仮定される。それらは、複数の解剖学的および発生の情況において自己新生する(self-renew)ならびに大部分の（全部でない場合）ニューロンおよび膠の系統の細胞に分化する、ならびに発達するおよび／もしくは退化するＣＮＳ領域を占める(populate)それらの能力により機能的に定義される1-5。
【０００４】
培養物中で再生産される幹細胞の特性をもつ神経細胞が哺乳動物の脳中に再移植され得、そこでそれらは神経の構造に適切にかつ一様に再統合しそして外来遺伝子を安定に発現し得るという最初の認識をもって6-7、遺伝子治療者はこうした現象が治療の目的上どのように利用されうるかを推測することを開始した。これら、およびそれらが植え付けられた研究（別の場所で1-5,8総説される）は、神経前駆／幹細胞の使用はそれらの固有の生物学のおかげで現在利用可能な遺伝子導入ベヒクル（例えば非神経細胞、ウイルスベクター、合成ポンプ）の現在の制限のいくつかを回避することができ、かつ、多様な新規治療戦略に基礎を提供しうるという希望を提供した。
【０００５】
移植片材料としてのそれらの使用は原型の神経前駆クローンＣ１７．２（われわれが広範囲の経験を有し6,9-16,17かつここで提示される研究で使用されたクローン）によりはっきりとかつ具体的に説明されてきた。Ｃ１７．２はトリのｍｙｃ遺伝子を含有するレトロウイルス構築物での感染により不死化された生後第０日の小脳からのマウス細胞系である。この系統はｌａｃＺおよびｎｅｏＲ遺伝子を構成的に発現するように導入された。脳全体の胚領域に移植される場合、これらの細胞はマウスの中枢神経軸に沿って複数の段階で（胎児から成体）移動し、分割を停止し、そして複数の領域の正常な発生に参画して正
常な非腫瘍原性細胞構築学的構成要素として多様なニューロンおよびグリア細胞型に適切に分化することが示されている。それらは内在性の神経前駆／幹細胞と非破壊的に混ざって類似の様式で同一の空間的かつ一時的刺激に応答する。治療上考慮すべき事柄として重要な、Ｃ１７．２細胞が寄与する構造が発生しそして神経解剖学的正常度を維持する。それらの最も初期の治療上の使用において、それらはリソゾーム欠損状態を伴うマウスの脳全体に欠けている遺伝子産物を送達させるのに役立ち、そしてリソゾーム酵素の放出および取り込みにより宿主細胞を交差修正した(cross-corrected)9。ＣＮＳに対しそしてそれ全体に直接に治療分子を送達するための神経前駆／幹細胞を基礎とした戦略の実行可能性は、最初に、ヒトで精神遅滞および早期死亡を引き起こす状態であるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）遺伝子の遺伝的欠失により引き起こされる遺伝的神経変性性リソゾーム貯蔵疾患ムコ多糖症タイプＶＩＩのマウスモデルの広まった神経病理学を修正することにより確認された。宿主のＣＮＳ全体に拡散的に移植そして構造の不可欠な構成員となるそれらの能力を活用して、ＧＵＳＢ分泌性のＮＳＣが出生時に脳室下の胚領域に導入され、そして突然変異体の脳全体でニューロンおよびグリア中のリソソームの貯蔵の修正を提供した。そうすることにおいて、それは、神経前駆細胞の神経移植が新規治療様式を提供し得たことを確立した。
【０００６】
必要とされるものは拡散性、浸潤性および／もしくは転移性である腫瘍を治療する一つの方法である。必要とされるものは腫瘍に対する影響を最大にし、そして患者に対する毒性を低下させるように局所的に腫瘍を治療する一つの方法である。
【発明の概要】
【０００７】
少なくとも異なる型の神経細胞中に分化する能力を有する単離された多分化能ニューロン細胞が開示される。この多分化能細胞はそれにより細胞がニューロン細胞が投与される第一の位置から最低１個の腫瘍細胞が存在する第二の位置まで移動することが可能である移動能力を有すること、それにより複数のニューロン細胞が腫瘍を囲むことができるような腫瘍を通ってかつその周囲を移動する能力を有すること；そして最低１個の浸潤性腫瘍細胞の跡をたどりそれにより浸潤性および転移性腫瘍を治療する能力を有することをさらに特徴とする。
【０００８】
当該ニューロン細胞は単離された神経幹細胞でありうる。当該ニューロン細胞は場合によっては細胞傷害性物質を分泌するよう処理される。当該ニューロン細胞は、あるいは腫瘍性細胞の分化を直接促進する因子で形質転換される。あるいは、当該ニューロン細胞は腫瘍細胞により組み込まれるべき治療遺伝子をコードするウイルスベクターで形質転換される。別の態様において、当該ニューロン細胞は腫瘍細胞中に組み込まれるべき自殺遺伝子、分化性剤もしくはトロフィンに対するレセプターをコードするウイルスベクターで形質転換され得る。当該ニューロン細胞は腫瘍から脳の同一の側もしくは反対側に投与される場合に腫瘍に達することが可能である。
【０００９】
別の態様において、移動性のニューロン細胞の移動性のパッケージング／プロデューサー細胞への転化方法が提供され、前記方法は、ａ）β−ｇａｌのようなマーカーを構成的に産生するニューロン細胞を提供すること；ｂ）両栄養性ｐ（または両種性）ＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびｐＰＧＫｐｕｒｏ中のピューロマイシン選択プラスミドでニューロン細胞をコトランスフェクションすること；ｃ）トランスフェクションされた細胞をピューロマイシン中で選択すること；ｄ）両栄養性エンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現について選択すること；ｅ）モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して蛍光活性化細胞選別により細胞を単離すること；およびｆ）どのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について段階ｅ）の細胞をスクリーニングすること、という段階を包含する。従って、選択の遺伝子でトランスフェクションされることが可能な移動性ニューロン細胞が産
生され、その結果選択の遺伝子を発現するウイルス粒子が産生され、そして複数のトランスフェクションされたパッケージング細胞により中枢神経系の広範な領域にわたって播種される。
【００１０】
その中で段階ｆ）がβ−ｇａｌ産生についてのウイルスフォーカスアッセイにより実施される移動性ニューロン細胞のパッケージング細胞系への転化方法。あるいは、当該方法は選択の遺伝子としてプロドラッグ活性化酵素を用いて実施され得る。あるいは、このプロドラッグ活性化酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＨＳＶ−ＴＫもしくはチトクロームｐ４５０である。より好ましくは、プロドラッグ活性化酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）である。
【００１１】
中枢神経系のための新規細胞パッケージング系もまた開示される。当該細胞系はニューロン細胞を包含し、それは、βｇａｌのようなマーカーを構成的に産生し、両栄養性ｐＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびピューロマイシン選択プラスミドｐＰＧＫｐｕｒｏでコトランスフェクションされており；モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して両栄養性のエンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現および蛍光について、ならびにどのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について、ピューロマイシン中で選択される。生じる細胞は粒子もしくはベクターをパッケージングおよび放出することが可能であり、それらは順に中枢神経系細胞への遺伝子導入のためのベクターとして役立ちうる。新規細胞パッケージング系中の粒子は複製欠損レトロウイルス粒子であり得る。新規細胞パッケージング系中のベクターは複製が条件的な(replication-conditional)ヘルペスウイルスベクターであり得る。
【００１２】
（発明の詳細な記述）
本明細書で提示される実験は、ＮＳＣ（原型クローンＣ１７．２）が実験的神経膠腫に移植される場合にそれらのレポーター遺伝子ｌａｃＺを発現することを継続する一方で腫瘍全体に分布しそして攻撃的に前進する腫瘍細胞と一緒に移動することができることを立証する。（使用された神経膠腫系の一すなわち星状細胞腫細胞系ＣＮＳ−１はヒト膠芽腫のものに類似の単一細胞浸潤および侵襲性の特徴を立証する18）。さらに、神経前駆／幹細胞は侵襲性腫瘍の境界をわずかに越えて移動しかつそれを囲むように思われる。神経前駆体が同一半球、反対半球もしくは側脳室中に腫瘍床から離れた部位に移植された付加的実験において、それらは正常細胞を通って移動しとりわけＣＮＳ−１腫瘍細胞に向かって動いた。それらは腫瘍床中もしくはその付近ならびに個々の浸潤性腫瘍細胞付近もしくはそれと直接並んで蓄積することが見出された。
【００１３】
いずれかの特定の理論により束縛されることを願わないが、発明者は、この神経前駆／幹細胞系が腫瘍細胞により産生された成長因子の栄養勾配に向かって移動することを提案する。従って、ＮＳＣは既に到達不可能であった腫瘍の近接もしくはその中への治療遺伝子の播種のための独特の基盤を提供しうる。これらの観察結果は多数の他の新たな遺伝子治療のアプローチをさらに示唆する。これらは細胞傷害性の遺伝子産物の播種を包含しうるが、しかし腫瘍性細胞の分化ならびに腫瘍細胞により取り込まれるべき治療遺伝子（例えば自殺遺伝子、分化性剤、トロフィンに対するレセプター）をコードするウイルスベクターのより効率的な送達を直接促進する因子もまた包含し得る。ＮＳＣは、順にＣＮＳ細胞への遺伝子の導入のためのベクターとして役立ちうる複製欠損レトロウイルス粒子もしくは複製が条件的なヘルペスウイルスベクターをパッケージングかつ放出するよう工作され得るため、神経前駆／幹細胞は脳中の大きな領域へのウイルス媒介性の遺伝子送達の効率を拡大するのに役立つはずである。
【００１４】
実験的脳腫瘍に対する治療の一有効様式はプロドラッグの活性化であった。当初、プロ
ドラッグ活性化酵素は腫瘍濃縮抗原に対し向けられた抗体に制限された。新たな戦略はこれらの酵素のための遺伝子をウイルスベクター中に組み込む。神経膠腫に有効であることが示されたプロドラッグ活性化酵素のなかで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＨＳＶ−ＴＫおよびチトクロームｐ４５０が薬物媒介性の傍観者(bystander)効果を有することが立証されている。これらのうちでＣＤが最良に報告された「傍観者」効果を与える。ＣＤは非毒性のプロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウリジン（５−ＦＵ）代謝物に転化する。５−ＦＵは能動的に分割する細胞に対する選択的毒性を有する化学療法剤であり、従って主として腫瘍細胞に標的を定める。加えて、５−ＦＵおよびその毒性の代謝物質は促進されない拡散により隣接のおよび周囲の細胞に容易に進み得る。脳腫瘍は、全身性の非毒性レベルの５−ＦＣで治療される場合に有意の抗腫瘍効果を生じさせるために少数のＣＤを発現する細胞（約２％の均一に分布された）のみを必要としうる。われわれの結果は、導入されたＮＳＣが腫瘍全体に効率的にＣＤ発現を分散させることができ、かつ、単一の移動する「逃れる」腫瘍細胞の「跡をたどる」ことでさえできるという仮説を支持する。
【００１５】
脳腫瘍の遺伝子治療に対する別のアプローチは薬物療法とともに腫瘍細胞への選択的遺伝子導入であり、例えばＨＳＶ−ＴＫ遺伝子はレトロウイルスを介して脳腫瘍細胞の分割する集団に導入される場合に薬物ガンシクロビルに対する致死的感受性を与える。感染および細胞特異的ターゲッティングの効率を増大させるためのレトロウイルス構築物の最近の改変はこの戦略の能力を高めることについて見込みを保持する。再度、「傍観者効果」により、腫瘍の破壊は細胞の一画分のみがＨＳＶ−ＴＫを発現する場合でさえ有効であり；ＨＳＶ−ＴＫを発現しない隣接する腫瘍細胞もまた排除されるようである。腫瘍の破壊の効率を改善するための試みはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞の数を増加させることに集中した。パッケージング細胞（その後自己排除されうる）としてのＮＳＣの使用は近隣の有糸分裂腫瘍細胞、とりわけ個々の浸潤性腫瘍細胞への致死的遺伝子の有効な拡大された送達系であることが判明しうる。
【００１６】
結論として、遺伝子的に改変された神経前駆／幹細胞は成熟および発生する脳全体にある範囲の腫瘍選択性の作用物質を供給する能力を有する。ここで提示される実験は、（１）実験的神経膠腫に直接移植される場合に主腫瘍床全体に迅速かつ効果的に移動／分布する；（２）侵襲性腫瘍の境界を越えて移動しそしてそれを「取り囲む」（含有するかのように）；（３）周囲組織への個々の浸潤性腫瘍細胞を表面上「跡をたどる」；（４）離れた部位から標的のＣＮＳ−１腫瘍まで正常組織を通って移動する；そして（５）腫瘍床全体でかつ腫瘍細胞に並んで外来遺伝子（この場合はｌａｃＺ）の安定な発現を示す、ＮＳＣの能力を立証する。これらの結果は将来の治療的脳腫瘍研究のための下地を作り、腫瘍に向けられたベクター媒介性の酵素／プロドラッグ遺伝子治療のための有効な送達ベヒクルとしての神経前駆／幹細胞の使用のための決定的な支持を提供する。
他の細胞 ＨＣＮ−１細胞系は一側巨脳症成長を伴う患者の大脳皮質組織からの親細胞系由来である（ロネット（Ｒｏｎｎｅｔｔ Ｇ．Ｖ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：６０３−５、１９９０）。ＨＣＮ−１Ａ細胞はニューロン様の形態に分化しそして神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼおよびｐ７５ＮＧＦＲについて（しかしミエリン塩基性タンパク質、Ｓ−１００もしくはグリア筋原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）についてでない）陽性に染色するよう誘導された。これらの細胞はγ−アミノ酪酸およびグルタミン酸についてもまた陽性に染色するため、それらは神経伝達体となるようである。以前に、ポルトラク（Ｐｏｌｔｏｒａｋ Ｍ．）ら（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １（１）：３−１５、１９９２）はＨＣＮ−１細胞が脳実質中で生存したことを観察し、そしてこれらの細胞がヒトでの脳内移植に適しうることを提案した。
【００１７】
ロネット（Ｒｏｎｎｅｔｔ ＧＶ）ら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６３（４）：１０８１−９９、１９９４）は、ＨＣＮ−１細胞が神経成長因子ジブチリル環状ＡＭＰおよび
イソブチルメチルキサンチンに曝露された場合にニューロンに似る過程を成長したことを報告した。
【００１８】
神経細胞は末梢神経細胞への曝露により活性化されているマクロファージとともにもまた投与され得る。こうした活性化されたマクロファージはＣＮＳの外傷の部位、例えば切断された視神経を浄化することが示され、この後に新たな神経伸長が開始して損傷にわたって成長した。ＣＮＳ組織（マクロファージを阻害する化学物質を分泌する）に曝露されたもしくは全く何にもされないマクロファージを移植することはほとんどもしくは全く再生をもたらさなかった（ラザロフ−シュピーグラー（Ｌａｚａｒｏｖ−Ｓｐｉｅｇｌｅｒ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：１、１９９６）。
【００１９】
ブタ胎児細胞がパーキンソン病およびハンチントン舞踏病ならびに難治性発作のような神経変性性疾患を伴う患者に移植され、こうした患者では興奮領域の外科的除去がそうでなければ実施されることができた。こうした細胞は、レトロウイルスについて適正にスクリーニングされる場合に発明の方法でもまた使用され得る。
【００２０】
神経堤細胞が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が５ｎｇ／ｍｌの増分で５から１００ｎｇ／ｍｌまでの範囲にわたる濃度で培地に添加されるという改変を伴ってステンプル（Ｓｔｅｍｐｌｅ）とアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（米国特許第５，６５４，１８３号）（引用により本明細書に組み込まれる）に従って単離かつ培養される。そのように培養された神経堤細胞は約１ないし５ｎｇ／ｍｌの増大する濃度のＦＧＦの存在により刺激されることが見出される。こうした細胞は末梢神経細胞に分化し、それが本発明で使用され得る。他のサイトカイン、成長因子および薬物 あるサイトカイン、成長因子および薬物が移植領域で場合によっては使用されるか、もしくは移植と付随して投与されうる。
【００２１】
既知のサイトカインはインターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩｌ−１１；組織壊死因子はＴＮＦ、ＴＮＦα、またリンホトキシン（ＬＴ）およびＴＮＦβ；インターフェロン（ＩＦＮ）はＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγ；ならびに組織成長因子（ＴＧＦ）を包含する。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は幹細胞の産生、分化および機能に関与していると考えられる特定の糖タンパク質である。
【００２２】
神経成長因子（ＮＧＦ）はおそらくコリン作動性の経路に対して作用することによりentorhinal傷害後に空間的変化の任務の回復の速度を増大させることが示された（シュタイン（Ｓｔｅｉｎ）とウィル（Ｗｉｌｌ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２６１：１２７−３１、１９８３）。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】１Ａおよび１Ｂは、本発明にかかる、インビトロでの神経前駆／幹Ｃ１７．２細胞の移動能力を具体的に説明する。インキュベーションの５日後にＣ１７．２細胞の幅広い分布が存在し（図１Ｂ）、それらが、筒中の最初の植付け(seeding)の領域に局在されたままであったＴＲ−１０細胞（図１Ａ）と比較して筒中のそれらの最初の植付けから離れて移動したことを示唆する。これらのパターンは、細胞が神経膠腫細胞の上部で直接プレート培養された（右のわきに置かれた筒［矢印］）にしろ、単にそれらに並んだ（中央の筒［矢印］）にしろ、観察された。
【図２】２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、本発明にかかる、移動性腫瘍細胞の「跡をたどる」ようにみえる実験的腫瘍塊全体および前進する腫瘍の縁をわずかに越える外来遺伝子を発現する神経前駆／幹細胞の広範囲の移動を具体的に説明する。（図２Ａ）４×で示される第２日；矢尻は腫瘍塊のおおよその縁の境界を定める；（図２Ｂ）１０×での高出力、ここでＸ−ｇａｌすなわち青色に染色するＮＳＣ［矢印］が暗赤色に染色する腫瘍細胞の間に点在される。（図２Ｃ）Ｘｇａｌ＋青色を示す腫瘍内注入１０日後の腫瘍塊の眺め(view)、Ｃ１７．２ ＮＳＣは腫瘍に浸潤したが、しかし青色に染色するＮＳＣが侵襲する「逃れる」細胞［矢印］（１０×）の「後を追って」いるように見える場合に周囲組織への若干の移動を伴った暗赤色に染色された腫瘍組織の縁で大部分は停止する。（図２Ｄ）成体ヌードマウスの前頭皮質に移植されたＣＮＳ−１腫瘍細胞、浸潤する実験的腫瘍床全体で浸潤性の腫瘍縁［矢印］までかつそれに沿って青色のＣ１７．２細胞の広範囲の移動および分布が存在し、かつ、そこで多くの腫瘍細胞が攻撃性腫瘍細胞［矢印］に実際に並んで周囲組織中に正常組織に侵襲している（１０×）。
【図３】３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇおよび３Ｈは、本発明にかかる、主腫瘍塊から離れて移動性腫瘍細胞の「跡をたどる」神経前駆／幹細胞の外観を具体的に説明し；（図３Ａ、３Ｂ）平行切片：低出力のＣ１７．２細胞は腫瘍全体および周囲の縁に分布した［図３Ａ）Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド、図３Ｂ）テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識］；（図３Ｃ、３Ｄ）Ｃ１７．２細胞に並んだ腫瘍の縁および移動性腫瘍細胞の低および高出力（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）；（図３Ｇ、３Ｈ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性腫瘍細胞の低および高出力（テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識）。
【図４】４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆおよび４Ｇは、本発明にかかる、 正常組織の標的ＣＮＳ−１腫瘍細胞全体を移動する主腫瘍床から離れた部位に移植された神経前駆／幹細胞を具体的に説明し；（図４Ａ、４Ｂ）同一半球：３×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を右前頭葉に移植した。第６日に、４×１０4個のＣ１７．２細胞を右前頭頭頂葉に注入した（４ｍｍ尾側の腫瘍注入）。動物を第１２（示される）および２１日に殺し、Ｃ１７−２細胞が腫瘍床中にみられる（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）。（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ）反対側半球：３×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を左前頭葉に移植し、また、５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を左前頭頭頂葉に移植した。第６日に、８×１０4個のＣ１７−２細胞を右前頭葉に注入した。動物を第１２および２１日（示される）に殺した；ｃ）４×Ｃ１７．２（赤色）が脳の反対側から腫瘍（緑色）に向かって移動するのがみられ、ｄ）１０×Ｃ１７．２細胞（赤色）が中央交連を横断して能動的に移動するのがみられる（二重免疫蛍光）、ｅ）２０×Ｃ１７−２細胞（青色）が腫瘍（黒色矢印）に進入するのがみられる（Ｘｇａｌ／ニュートラルレッド）。（図４Ｆ、４Ｇ）脳室内：５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を右前頭葉に移植した。第６日に、８×１０4個のＣ１７．２細胞を右もしくは左（示される）側脳室に注入した。
【００２８】
実施例
実験方法
細胞：
Ｃ１７−２およびＴＲ−１０細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）、５％ウマ血清（ＨＳ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％グルタミン（２ｍＭ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ワシントンＤＣ）中で維持した。ＣＮＳ−１細胞は既に記述されたとおり（アブーディ・グーテルマン（Ａｂｏｏｄｙ−Ｇｕｔｅｒｍａｎ）ら、１９９７を参照）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するようにＰＧＫ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＮｅｏＲレトロウイルスベクター構築物を用いて安定に導入し、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたＲＰＭＩ−１６４０（バイオ ウィッタカー（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））中で維持した。細胞構造の研究を、標準的条件すなわち加湿、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター下で１００ｍｍペトリ皿中で実施した。インビトロ研究；ＣＮＳ−１神経膠腫細胞を、そ
の中に４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞が一夜プレート培養された５ｍｍ筒（すなわちＣＮＳ−１細胞を含まない）の周囲におよそ６０〜７０％コンフルエンスまでプレート培養した。同時に、４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を、付着されたＣＮＳ−１細胞の上部に直接置かれた５ｍｍ筒中に置いた。翌日、筒を除去し、そしてプレートをＰＢＳで十分にすすいでいかなる浮遊細胞も除去し、培地を置き換え、そしてプレートを５日間インキュベーションした。プレートをその後、０．５％グルタルアルデヒド固定後に一夜β−ガラクトシダーゼについて染色した（注：Ｃ１７．２およびＴＲ−１０細胞双方がＸ−ｇａｌ染色で＞９０％青色である）。インビボ研究；移植４８時間前にＣ１７．２およびＴＲ−１０細胞を１０μＭの濃度のＢＵｄＲ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））とともにインキュベーションした。プレート培養された細胞をＰＢＳですすぎ、トリプシン処理し、培地に再懸濁しそしてコールターカウンター上で計数した。所望の数の細胞を遠心分離器中で４分間かつ１１００ｒｐｍで４℃で回転させてペレットを得た。培地を除去し；細胞をＰＢＳに再懸濁することによりすすぎ、そして再回転した。ＰＢＳを除去し、そして適切な量のＰＢＳを添加して最終の所望の濃度で細胞を再懸濁した。細胞を氷上に保ち、そして各動物注入に先立ち穏やかに摩砕した。ＢＵｄＲで標識されなかった細胞を類似の様式での注入のため調製した。
【００２９】
動物：
動物研究は動物治療に関するマサチューセッツ総合病院小委員会（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）により出された指針に従って実施した。使用された動物：成体ＣＤ−フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））および８〜１０週齢の成体のおよそ２０グラムの雌性ヌードマウス（コックス（Ｃｏｘ）７、ＭＧＨ−イースト（Ｅａｓｔ）から得られた無作為繁殖されたスイス（Ｓｗｉｓｓ）白色）。
【００３０】
外科手術および殺傷：
動物を０．１５ｍｌの２０％ケタミン塩酸塩（ケタラール（ＫＥＴＡＬＡＲ）１００ｍｇ／ｍｌ；パーク・デービス（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ニュージャージー州モリスプレインズ）、２０％キシラジン（ロムプン（ＲＯＭＰＵＮ）２０ｍｇ／ｍｌ；マイルズ インク（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．）、カンサス州スワニーミッション）、６０％塩化ナトリウム（０．９％；アボット ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、イリノイ州ノースシカゴ）のｉ．ｐ．注入により麻酔し、そして定位装置（コフ（Ｋｏｐｆ）、カリフォルニア州チュジュンガ）中に固定した。脳内注入を、頭蓋の頂上に直線状のメス皮膚切開を作成することにより定位的に実施した。バーホールを冠状縫合上のブレグマに対し２ｍｍ側方に高速ドリルで頭蓋中にドリルで穴をあけた。滅菌針で硬膜を切開しそして止血を得た後に１μｌの１×ダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ヴァージニア州ヘルンドン）に懸濁された所望の数の腫瘍細胞を、３ないし５分の期間にわたって特定された位置（下のプロトコルを参照）に２６ゲージの５μｌハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジで注入した。針を２〜４分の期間にわたって引っ込めた後に骨蝋（ｂｏｎｅ−ｗａｘ）（エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）、ニュージャージー州ソマーヴィル）を使用してバーホールを閉塞し、ベタジンを手術領域に適用し、そして皮膚を縫合して封鎖した。後日２回目の注入を受領する動物を、特別のプロトコルにより（下を参照）麻酔し、定位装置中に固定しそして細胞を注入した。動物を提示された(stated)日に麻酔薬の過剰投与およびその後のＰＢＳ次いで４％パラホルムアルデヒド＋２ｍＭＭｇＣｌ2（ｐＨ７．４）での頭蓋内灌流で殺した。脳を取り出しそして４℃で一夜後固定し、そしてその後３〜７日間ＰＢＳ＋２ｍＭＭｇＣｌ2（ｐＨ７．４）中３０％ショ糖に移して凍結保護した(cryoprotect)。脳を−８０℃で貯蔵し、そしてその後１０〜１５ミクロンの冠状連続切片を低温槽に切断した（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＣＭ３０００）。
【００３１】
移植されたＣ１７−２細胞のＢＵｄＲ標識：
選択された動物は殺す前２４時間にわたって１ｍｌ／１００ｇ体重の２０μＭＢＵｄＲストック溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の３回の腹腔内注入を受領した（２０ｇのマウスあたり０．２ｍｌ／注入）。
【００３２】
組織病理学的および免疫組織化学的研究：
組織切片を（１）Ｘｇａｌおよびニュートラルレッドで対染色（２）ヘマトキシリンおよびエオシン（３）で染色し、二重免疫蛍光標識をテキサスレッド抗β−ガラクトシダーゼおよびＦＩＴＣ抗ＧＦＰで実施した。スライドガラスを光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査で検査した。ＣＮＳ−１腫瘍細胞もまた共焦点蛍光顕微鏡検査下で染色なしで検査した。
【００３３】
実施例１．培養物中のＮＳＣの移動能力
神経膠腫細胞とともにのＮＳＣの特性を決定するため、神経膠腫細胞と共培養された場合の線維芽細胞（ｌａｃＺ発現ＴＲ−１０線維芽細胞系）に対するＮＳＣ（クローンＣ１７．２）の相対的移動能力を比較する研究を最初に培養物中で実施した。Ｃ１７．２およびＴＲ−１０細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）、５％ウマ血清（ＨＳ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％グルタミン（２ｍＭ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ワシントンＤＣ）中で維持した。ＣＮＳ−１細胞は既に記述されたとおり（アブーディ・グーテルマン（Ａｂｏｏｄｙ−Ｇｕｔｅｒｍａｎ）ら、１９９７を参照）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するようにＰＧＫ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＮｅｏＲレトロウイルスベクター構築物を用いて安定に導入し、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたＲＰＭＩ−１６４０（バイオ ウィッタカー（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））中で維持した。細胞構造の研究を、標準的条件すなわち加湿、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター下で１００ｍｍペトリ皿中で実施した。ＣＮＳ−１神経膠腫細胞を、その中に４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞が一夜プレート培養された５ｍｍ筒（すなわちＣＮＳ−１細胞を含まない）の周囲におよそ６０〜７０％コンフルエンスまでプレート培養した。同時に、４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を、付着されたＣＮＳ−１細胞の上部に直接置かれた５ｍｍ筒中に置いた。翌日、筒を除去し、そしてプレートをＰＢＳで十分にすすいでいかなる浮遊細胞も除去し、培地を置き換え、そしてプレートを５日間インキュベーションした。プレートをその後、０．５％グルタルアルデヒド固定後に一夜β−ガラクトシダーゼについて染色した（注：Ｃ１７．２およびＴＲ−１０細胞双方がＸ−ｇａｌ染色で＞９０％青色である）。
【００３４】
Ｃ１７．２細胞の広範な分布が存在し（図１Ｂ）、それらが筒中の当初の植付けの領域に局在されたままであったＴＲ−１０細胞（図１Ａ）に比較して筒中のそれらの当初の部位から離れて移動していたことを示唆した。これらのパターンは、細胞が神経膠腫細胞の上部に直接プレート培養された（右のわきに置かれた(right-sided)筒［矢印］）にしろ、単にそれらに並んだ（中央の筒［矢印］）にしろ観察された。
【００３５】
実施例２．インビボの侵襲性腫瘍塊全体でおよびそれを越えてのトランスジーンを発現するＮＳＣの移動
脳腫瘍中に導入されたクローンＣ１７．２のＮＳＣの挙動を決定するため、実験動物（同系の成体ラット）が最初に右前頭葉に注入された１μｌ中の４×１０4個のＤ７４ラット神経膠腫細胞の移植片を受領した。４日後、１．５μｌのＰＢＳ中の１×１０5個のＣ１７．２のＮＳＣをＤ７４腫瘍床中に直接同一座標で注入した。動物をその後、腫瘍内注
入後第２、６、および１０日に殺し、そして脳の低温槽切片を、β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）活性についてＸｇａｌ組織化学で処理して供与体由来細胞を検出し、かつ、ニュートラルレッドで対染色して腫瘍細胞を検出した。
【００３６】
供与体Ｃ１７．２ ＮＳＣは注入後２日と同じくらい迅速に腫瘍の約８ｍｍ幅にわたって数日以内に腫瘍全体に広範囲に分散されて見出された（図２Ａ、２Ｂ）。これは実験的脳腫瘍に移植された３Ｔ３線維芽細胞の以前の報告33に比較してずっとより広範囲かつ迅速な分散である。第１０日までに、Ｃ１７．２細胞は、変性性の環境によりいくぶん引かれ、浸潤する腫瘍の縁にはっきりと沿ってかつそれをわずかに越えて腫瘍の大部分全体でみられ、移動性腫瘍細胞の「跡をたどる」ように思われた（図２Ｃ、２Ｄ）。Ｃ１７．２細胞それら自身は腫瘍原性にならなかった。
【００３７】
（図２Ａ）４×で示される第２日；矢尻は腫瘍塊のおおよその縁の境界を定め；より低出力でさえ腫瘍は青色のＮＳＣで混合されることが見られ得る［矢印］。これは１０×で（図２Ｂ）でより高出力でより劇的に認識され、ここでＸｇａｌ＋すなわち青色に染色するＮＳＣ［矢印］は暗赤色に染色する腫瘍細胞の間に点在される。（図２Ｃ）腫瘍内注入１０日後の腫瘍塊のこの眺めは、Ｘｇａｌ＋青色のＣ１７．２のＮＳＣは腫瘍に浸潤したがしかし青色に染色するＮＳＣが「逃れる」腫瘍細胞［矢印］の「後を追って」かつ侵襲しているように見える場合に周囲組織への若干の移動を伴った暗赤色に染色された腫瘍組織の縁（境界が矢尻により示される）で大部分は停止することを申し分なく示す（１０×）。この現象は、ヌードマウスの脳中の実験的ＣＮＳ−１星状細胞腫Ｄ７４よりなおより毒性の侵襲性かつ攻撃的腫瘍でさえＣ１７．２のＮＳＣの挙動を検査する場合により劇的にさえなる（図２Ｄ）。ＣＮＳ−１腫瘍細胞を成体ヌードマウスの前頭皮質に移植した（第０日）。第６日に４×１０4個のＣ１７．２細胞を腫瘍床に直接移植した。（図２Ｄ）に写真で示された動物を腫瘍移植後第１２日、腫瘍内注入後第６日に殺した。写真で示された低温槽切片を、β−ガラクトシダーゼ活性についてＸｇａｌの組織化学で処理して青色のＣ１７．２のＮＳＣを検出し、また、ニュートラルレッドで対染色して暗赤色の腫瘍細胞を示した。浸潤性の実験的腫瘍床全体に浸潤する腫瘍の縁［白色矢印］までそしてそれに沿って青色のＣ１７．２細胞の広範囲の移動および分布が存在し、そしてここで多くの腫瘍細胞が攻撃性腫瘍細胞［矢印］と実際に並んで周囲の組織中に正常組織に侵襲する（１０×）。
【００３８】
実施例３．ＮＳＣは浸潤性腫瘍細胞の「跡をたどる」
ＣＮＳ−１腫瘍細胞を主腫瘍床から離れた単一の細胞をより良好に区別するために移植に先立ち緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をもつレトロウイルス導入により標識した17。１μｌのＰＢＳ中のＧＦＰを発現するＣＮＳ−１神経膠腫細胞（３×１０4個）を定位座標でブレグマに対し２ｍｍ側方に冠状縫合上に硬膜から深さ３ｍｍに右前頭葉に注入した。１μｌのＰＢＳ中の４×１０4個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を第６日に腫瘍床中に直接同一座標で注入した。３〜４匹のＣ１７．２動物（２匹はＢＵｄＲ標識された、１匹はＢＵｄＲを間歇的に投与された）および１〜２匹のＴＲ−１０対照動物（１匹はＢＵｄＲ標識された）。動物を腫瘍移植後第９、１２、１６および２１日に殺した。低温槽切片にされた固定された脳組織をβ−ガラクトシダーゼ（Ｃ１７．２細胞青色）およびニュートラルレッド（腫瘍細胞暗赤色）、またはテキサスレッド抗β−ガラクトシダーゼ（Ｃ１７．２細胞赤色）およびＦＩＴＣ抗ＧＦＰ（腫瘍細胞緑色）での二重免疫蛍光のいずれかで染色した。
（図３Ａ、３Ｂ）平行切片：低出力のＣ１７．２細胞は腫瘍全体および周囲の縁に分布した［図３Ａ）Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド、図３Ｂ）テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識］。
（図３Ｃ、３Ｄ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性腫瘍細胞の低および高出力（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）。
（図３Ｅ、３Ｆ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性腫瘍細胞の低および高出力（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）
（図３Ｇ、３Ｈ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性細胞の低および高出力（テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識）。
【００３９】
実施例４．離れた部位に移植されたＮＳＣは腫瘍に向かって移動する
正常組織およびとりわけを標的の腫瘍細胞を通って移動するＮＳＣの能力を検査するため、供与体ＮＳＣを３種の別個の状況すなわち同一半球、反対半球もしくは側脳室への主腫瘍床から離れた巻き込まれていない部位に注入した。
【００４０】
同一半球：１μｌＰＢＳ中のＣＮＳ−１神経芽腫細胞（３×１０4個）を、定位座標で冠状縫合上でブレグマに対し２ｍｍ側方の硬膜から深さ３ｍｍに右前頭葉に注入した。１μｌのＰＢＳ中の４×１０4個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を第６日に定位座標でブレグマに対し３ｍｍ側方かつ４ｍｍ尾側に硬膜から深さ３ｍｍに右前頭頭頂葉に注入した。２匹の動物を第１２および２１日に殺した。全時間点で、ＮＳＣは主腫瘍床内にならびに周囲組織中の移動性腫瘍細胞に並んで分布されて見出された（図４Ａ、４Ｂ）。
【００４１】
反対半球：１μｌＰＢＳ中の３×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を、定位座標で冠状縫合上でブレグマに対し２ｍｍ側方に硬膜から深さ３ｍｍに左前頭葉に注入し、１μｌのＰＢＳ中の５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を、ブレグマに対し３ｍｍ側方かつ４ｍｍ尾側に硬膜から深さ３ｍｍに左前頭頭頂葉に注入し、２μｌのＰＢＳ中の８×１０4個のＣ１７．２細胞を第６日にブレグマに対し２ｍｍ側方かつ２ｍｍ尾側に硬膜から深さ３ｍｍに右前頭葉に注入した。２匹の動物を第１２および２１日に殺した（対照−腫瘍なし 座標：ブレグマの２ｍｍＲ、２ｍｍ尾側、３ｍｍ深）。ＮＳＣは脳の反対側の腫瘍に向かって中央交連を横断して能動的に移動し、そしてその後腫瘍に進入してみられた（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ）。
【００４２】
ＣＮＳ−１腫瘍床から離れた移植（脳室内）：
この最後の状況では、１μｌのＰＢＳ中の５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞をブレグマに対し２ｍｍ側方に冠状縫合上に硬膜から３ｍｍ深さで右前頭葉に注入した。２μｌのＰＢＳ中の８×１０4個のＣ１７．２細胞を第６日にブレグマに対し１ｍｍ側方かつ３ｍｍ尾側に硬膜から２ｍｍ深さに左もしくは右脳室に注入した。２匹の動物を第１２および２１日に殺した。ＮＳＣは、再度、主腫瘍床内ならびに移動性腫瘍細胞と並んでみられた（図４Ｆ、４Ｇ）。
【００４３】
各場合で、供与体ＮＳＣは正常組織を通って移動しかつ腫瘍に「標的を定める」ことが見出された。
【００４４】
（本発明の主要な態様または特徴）
本発明の主要な態様または特徴として次のものを挙げることができる。
態様１：少なくとも異なる型の神経細胞に分化する能力を有する単離された多分化能のニューロン細胞であって、
ａ．移動能力を有し、それにより当該細胞がニューロン細胞が投与される第一の位置から最低１個の腫瘍細胞が存在する第二の位置まで移動することが可能であり；
ｂ．腫瘍を通ってかつそれの周囲を移動する能力を有し、それにより複数のニューロン細胞が腫瘍を取り囲むことが可能であり；そして
ｃ．最低１個の浸潤性腫瘍細胞の跡をたどる能力を有し、それにより浸潤性かつ転移性の腫瘍を治療する、
ことをさらなる特徴とするニューロン細胞。
態様２：ニューロン細胞が単離された神経幹細胞を含んで成る、態様１のニューロン細胞
。
態様３：ニューロン細胞が細胞傷害性物質を分泌するよう処理されている、態様１のニューロン細胞
態様４：ニューロン細胞が腫瘍性細胞の分化を直接促進する因子で形質転換されている、態様１のニューロン細胞。
態様５：ニューロン細胞が腫瘍細胞により組み込まれるべき治療遺伝子をコードするウイルスで形質転換されている、態様１のニューロン細胞。
態様６：ニューロン細胞が腫瘍細胞中に組み込まれるべき自殺遺伝子、分化剤もしくはトロフィンに対するレセプターをコードするウイルスで形質転換されている、態様１のニューロン細胞。
態様７：腫瘍から脳の同一の側もしくは反対側に投与されたニューロン細胞が腫瘍に達することが可能である、態様１のニューロン細胞。
態様８：移動性ニューロン細胞の移動性パッケージング／プロデューサー細胞への転化方法であって、
ａ．β−ｇａｌのようなマーカーを構成的に産生するニューロン細胞を提供すること；
ｂ．両栄養性ｐＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびピューロマイシン選択プラスミドｐＰＧＫｐｕｒｏでニューロン細胞をコトランスフェクションすること；
ｃ．トランスフェクションされた細胞をピューロマイシン中で選択すること；
ｄ．両栄養性エンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現について選択すること；ｅ．モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して蛍光活性化細胞選別により細胞を単離すること；
ｆ．どのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について段階ｅの細胞をスクリーニングすること；
を含んで成り、
それにより選択の遺伝子でトランスフェクションされることが可能な移動性ニューロン細胞を産生し、その結果選択の遺伝子を発現するウイルス粒子が産生され、そして複数のトランスフェクションされたパッケージング細胞により中枢神経系の広範な領域にわたって播種される前記方法。
態様９：段階ｆがβ−ｇａｌ産生についてのウイルスフォーカスアッセイにより実施される、態様１の方法。
態様１０：選択の遺伝子がプロドラッグ活性化酵素である、態様８の方法。
態様１１：プロドラッグ活性化酵素が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＨＳＶ−ＴＫもしくはチトクロームｐ４５０である、態様１０の方法。
態様１２：プロドラッグ活性化酵素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）である、態様１０の方法。
態様１３：中枢神経系のための新規細胞パッケージング系であって、
β−ｇａｌのようなマーカーを構成的に産生するニューロン細胞を含んで成り、
当該ニューロン細胞は両栄養性ｐＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびピューロマイシン選択プラスミドｐＰＧＫｐｕｒｏでコトランスフェクションされており；
当該トランスフェクションされた細胞が、モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して両栄養性エンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現および蛍光について、ならびにどのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について、ピューロマイシンの存在下で選択され；
生じる細胞は、粒子もしくはベクターをパッケージングかつ放出することが可能であり、それらは順に中枢神経系細胞への遺伝子導入のためのベクターとして役立ちうるものである、新規細胞パッケージング系。
態様１４：粒子が複製欠損レトロウイルス粒子である、態様１３：の新規細胞パッケージング系。
態様１５：ベクターが複製が条件的なヘルペスウイルスベクターを含んで成る、態様１３
の新規細胞パッケージング系。
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子治療の分野、より具体的には脳腫瘍を治療するためのニューロン細胞の使用の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍の治療のための有効な遺伝子治療は長年の間つかみどころのない最終目標であった。事実上治療不可能である多形膠芽腫およびより小さく悪性の未分化星状細胞腫は米国で年間に診断される５，０００の頭蓋内神経膠腫の約１／４の原因であり；成人での神経膠腫の７５パーセントはこの範疇のものである。その深刻かつ均一の罹患率のため、それはいずれかの他の腫瘍がするよりひとり当たりに基づく癌の費用により大きく寄与する。普遍的には人生の第五の１０年に襲われる患者は、放射線および化学療法の比較的無効な治療に伴う進行性合併症を経験する一方で反復性の入院および手術の周期に入る（“Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”アイゼルバッハー（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ）、ブラウンヴァルト（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）、ウィルソン（Ｗｉｌｌｓｏｎ）、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）、ファウチ（Ｆａｕｃｉ）とカスパー（Ｋａｓｐｅｒ）により編、第１３版、ｐ．２２６２、マグロー・ヒル インク（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．）１９９４）。
【０００３】
神経膠腫のような脳腫瘍の遺伝子治療に対する妨害の一は、それらが拡張する、広範に移動する、そして正常細胞に浸潤する度合にあった。今日までの大部分の遺伝子治療戦略はウイルスベクターを基礎とするが、それにもかかわらず典型的に必要な細胞の大きな領域および数に十分な量へのウイルスベクター媒介性の遺伝子の広範囲の分布はしばしばがっかりさせることに制限されている。興味深いことに、正常の神経前駆および幹細胞の検定の特徴の一はそれらの移動性の質にある。神経幹細胞（ＮＳＣ）は発生中のそして成人においてさえもＣＮＳに存在する未熟な未前駆(uncommitted)細胞であり、そして整然と並んだＣＮＳのより特化された(specialized)細胞を生じさせるものと仮定される。それらは、複数の解剖学的および発生の情況において自己新生する(self-renew)ならびに大部分の（全部でない場合）ニューロンおよび膠の系統の細胞に分化する、ならびに発達するおよび／もしくは退化するＣＮＳ領域を占める(populate)それらの能力により機能的に定義される1-5。
【０００４】
培養物中で再生産される幹細胞の特性をもつ神経細胞が哺乳動物の脳中に再移植され得、そこでそれらは神経の構造に適切にかつ一様に再統合しそして外来遺伝子を安定に発現し得るという最初の認識をもって6-7、遺伝子治療者はこうした現象が治療の目的上どのように利用されうるかを推測することを開始した。これら、およびそれらが植え付けられた研究（別の場所で1-5,8総説される）は、神経前駆／幹細胞の使用はそれらの固有の生物学のおかげで現在利用可能な遺伝子導入ベヒクル（例えば非神経細胞、ウイルスベクター、合成ポンプ）の現在の制限のいくつかを回避することができ、かつ、多様な新規治療戦略に基礎を提供しうるという希望を提供した。
【０００５】
移植片材料としてのそれらの使用は原型の神経前駆クローンＣ１７．２（われわれが広範囲の経験を有し6,9-16,17かつここで提示される研究で使用されたクローン）によりはっきりとかつ具体的に説明されてきた。Ｃ１７．２はトリのｍｙｃ遺伝子を含有するレトロウイルス構築物での感染により不死化された生後第０日の小脳からのマウス細胞系である。この系統はｌａｃＺおよびｎｅｏＲ遺伝子を構成的に発現するように導入された。脳全体の胚領域に移植される場合、これらの細胞はマウスの中枢神経軸に沿って複数の段階で（胎児から成体）移動し、分割を停止し、そして複数の領域の正常な発生に参画して正
常な非腫瘍原性細胞構築学的構成要素として多様なニューロンおよびグリア細胞型に適切に分化することが示されている。それらは内在性の神経前駆／幹細胞と非破壊的に混ざって類似の様式で同一の空間的かつ一時的刺激に応答する。治療上考慮すべき事柄として重要な、Ｃ１７．２細胞が寄与する構造が発生しそして神経解剖学的正常度を維持する。それらの最も初期の治療上の使用において、それらはリソゾーム欠損状態を伴うマウスの脳全体に欠けている遺伝子産物を送達させるのに役立ち、そしてリソゾーム酵素の放出および取り込みにより宿主細胞を交差修正した(cross-corrected)9。ＣＮＳに対しそしてそれ全体に直接に治療分子を送達するための神経前駆／幹細胞を基礎とした戦略の実行可能性は、最初に、ヒトで精神遅滞および早期死亡を引き起こす状態であるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）遺伝子の遺伝的欠失により引き起こされる遺伝的神経変性性リソゾーム貯蔵疾患ムコ多糖症タイプＶＩＩのマウスモデルの広まった神経病理学を修正することにより確認された。宿主のＣＮＳ全体に拡散的に移植そして構造の不可欠な構成員となるそれらの能力を活用して、ＧＵＳＢ分泌性のＮＳＣが出生時に脳室下の胚領域に導入され、そして突然変異体の脳全体でニューロンおよびグリア中のリソソームの貯蔵の修正を提供した。そうすることにおいて、それは、神経前駆細胞の神経移植が新規治療様式を提供し得たことを確立した。
【０００６】
必要とされるものは拡散性、浸潤性および／もしくは転移性である腫瘍を治療する一つの方法である。必要とされるものは腫瘍に対する影響を最大にし、そして患者に対する毒性を低下させるように局所的に腫瘍を治療する一つの方法である。
【発明の概要】
【０００７】
少なくとも異なる型の神経細胞中に分化する能力を有する単離された多分化能ニューロン細胞が開示される。この多分化能細胞はそれにより細胞がニューロン細胞が投与される第一の位置から最低１個の腫瘍細胞が存在する第二の位置まで移動することが可能である移動能力を有すること、それにより複数のニューロン細胞が腫瘍を囲むことができるような腫瘍を通ってかつその周囲を移動する能力を有すること；そして最低１個の浸潤性腫瘍細胞の跡をたどりそれにより浸潤性および転移性腫瘍を治療する能力を有することをさらに特徴とする。
【０００８】
当該ニューロン細胞は単離された神経幹細胞でありうる。当該ニューロン細胞は場合によっては細胞傷害性物質を分泌するよう処理される。当該ニューロン細胞は、あるいは腫瘍性細胞の分化を直接促進する因子で形質転換される。あるいは、当該ニューロン細胞は腫瘍細胞により組み込まれるべき治療遺伝子をコードするウイルスベクターで形質転換される。別の態様において、当該ニューロン細胞は腫瘍細胞中に組み込まれるべき自殺遺伝子、分化性剤もしくはトロフィンに対するレセプターをコードするウイルスベクターで形質転換され得る。当該ニューロン細胞は腫瘍から脳の同一の側もしくは反対側に投与される場合に腫瘍に達することが可能である。
【０００９】
別の態様において、移動性のニューロン細胞の移動性のパッケージング／プロデューサー細胞への転化方法が提供され、前記方法は、ａ）β−ｇａｌのようなマーカーを構成的に産生するニューロン細胞を提供すること；ｂ）両栄養性ｐ（または両種性）ＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびｐＰＧＫｐｕｒｏ中のピューロマイシン選択プラスミドでニューロン細胞をコトランスフェクションすること；ｃ）トランスフェクションされた細胞をピューロマイシン中で選択すること；ｄ）両栄養性エンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現について選択すること；ｅ）モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して蛍光活性化細胞選別により細胞を単離すること；およびｆ）どのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について段階ｅ）の細胞をスクリーニングすること、という段階を包含する。従って、選択の遺伝子でトランスフェクションされることが可能な移動性ニューロン細胞が産
生され、その結果選択の遺伝子を発現するウイルス粒子が産生され、そして複数のトランスフェクションされたパッケージング細胞により中枢神経系の広範な領域にわたって播種される。
【００１０】
その中で段階ｆ）がβ−ｇａｌ産生についてのウイルスフォーカスアッセイにより実施される移動性ニューロン細胞のパッケージング細胞系への転化方法。あるいは、当該方法は選択の遺伝子としてプロドラッグ活性化酵素を用いて実施され得る。あるいは、このプロドラッグ活性化酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＨＳＶ−ＴＫもしくはチトクロームｐ４５０である。より好ましくは、プロドラッグ活性化酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）である。
【００１１】
中枢神経系のための新規細胞パッケージング系もまた開示される。当該細胞系はニューロン細胞を包含し、それは、βｇａｌのようなマーカーを構成的に産生し、両栄養性ｐＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびピューロマイシン選択プラスミドｐＰＧＫｐｕｒｏでコトランスフェクションされており；モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して両栄養性のエンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現および蛍光について、ならびにどのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について、ピューロマイシン中で選択される。生じる細胞は粒子もしくはベクターをパッケージングおよび放出することが可能であり、それらは順に中枢神経系細胞への遺伝子導入のためのベクターとして役立ちうる。新規細胞パッケージング系中の粒子は複製欠損レトロウイルス粒子であり得る。新規細胞パッケージング系中のベクターは複製が条件的な(replication-conditional)ヘルペスウイルスベクターであり得る。
【００１２】
（発明の詳細な記述）
本明細書で提示される実験は、ＮＳＣ（原型クローンＣ１７．２）が実験的神経膠腫に移植される場合にそれらのレポーター遺伝子ｌａｃＺを発現することを継続する一方で腫瘍全体に分布しそして攻撃的に前進する腫瘍細胞と一緒に移動することができることを立証する。（使用された神経膠腫系の一すなわち星状細胞腫細胞系ＣＮＳ−１はヒト膠芽腫のものに類似の単一細胞浸潤および侵襲性の特徴を立証する18）。さらに、神経前駆／幹細胞は侵襲性腫瘍の境界をわずかに越えて移動しかつそれを囲むように思われる。神経前駆体が同一半球、反対半球もしくは側脳室中に腫瘍床から離れた部位に移植された付加的実験において、それらは正常細胞を通って移動しとりわけＣＮＳ−１腫瘍細胞に向かって動いた。それらは腫瘍床中もしくはその付近ならびに個々の浸潤性腫瘍細胞付近もしくはそれと直接並んで蓄積することが見出された。
【００１３】
いずれかの特定の理論により束縛されることを願わないが、発明者は、この神経前駆／幹細胞系が腫瘍細胞により産生された成長因子の栄養勾配に向かって移動することを提案する。従って、ＮＳＣは既に到達不可能であった腫瘍の近接もしくはその中への治療遺伝子の播種のための独特の基盤を提供しうる。これらの観察結果は多数の他の新たな遺伝子治療のアプローチをさらに示唆する。これらは細胞傷害性の遺伝子産物の播種を包含しうるが、しかし腫瘍性細胞の分化ならびに腫瘍細胞により取り込まれるべき治療遺伝子（例えば自殺遺伝子、分化性剤、トロフィンに対するレセプター）をコードするウイルスベクターのより効率的な送達を直接促進する因子もまた包含し得る。ＮＳＣは、順にＣＮＳ細胞への遺伝子の導入のためのベクターとして役立ちうる複製欠損レトロウイルス粒子もしくは複製が条件的なヘルペスウイルスベクターをパッケージングかつ放出するよう工作され得るため、神経前駆／幹細胞は脳中の大きな領域へのウイルス媒介性の遺伝子送達の効率を拡大するのに役立つはずである。
【００１４】
実験的脳腫瘍に対する治療の一有効様式はプロドラッグの活性化であった。当初、プロ
ドラッグ活性化酵素は腫瘍濃縮抗原に対し向けられた抗体に制限された。新たな戦略はこれらの酵素のための遺伝子をウイルスベクター中に組み込む。神経膠腫に有効であることが示されたプロドラッグ活性化酵素のなかで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＨＳＶ−ＴＫおよびチトクロームｐ４５０が薬物媒介性の傍観者(bystander)効果を有することが立証されている。これらのうちでＣＤが最良に報告された「傍観者」効果を与える。ＣＤは非毒性のプロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウリジン（５−ＦＵ）代謝物に転化する。５−ＦＵは能動的に分割する細胞に対する選択的毒性を有する化学療法剤であり、従って主として腫瘍細胞に標的を定める。加えて、５−ＦＵおよびその毒性の代謝物質は促進されない拡散により隣接のおよび周囲の細胞に容易に進み得る。脳腫瘍は、全身性の非毒性レベルの５−ＦＣで治療される場合に有意の抗腫瘍効果を生じさせるために少数のＣＤを発現する細胞（約２％の均一に分布された）のみを必要としうる。われわれの結果は、導入されたＮＳＣが腫瘍全体に効率的にＣＤ発現を分散させることができ、かつ、単一の移動する「逃れる」腫瘍細胞の「跡をたどる」ことでさえできるという仮説を支持する。
【００１５】
脳腫瘍の遺伝子治療に対する別のアプローチは薬物療法とともに腫瘍細胞への選択的遺伝子導入であり、例えばＨＳＶ−ＴＫ遺伝子はレトロウイルスを介して脳腫瘍細胞の分割する集団に導入される場合に薬物ガンシクロビルに対する致死的感受性を与える。感染および細胞特異的ターゲッティングの効率を増大させるためのレトロウイルス構築物の最近の改変はこの戦略の能力を高めることについて見込みを保持する。再度、「傍観者効果」により、腫瘍の破壊は細胞の一画分のみがＨＳＶ−ＴＫを発現する場合でさえ有効であり；ＨＳＶ−ＴＫを発現しない隣接する腫瘍細胞もまた排除されるようである。腫瘍の破壊の効率を改善するための試みはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞の数を増加させることに集中した。パッケージング細胞（その後自己排除されうる）としてのＮＳＣの使用は近隣の有糸分裂腫瘍細胞、とりわけ個々の浸潤性腫瘍細胞への致死的遺伝子の有効な拡大された送達系であることが判明しうる。
【００１６】
結論として、遺伝子的に改変された神経前駆／幹細胞は成熟および発生する脳全体にある範囲の腫瘍選択性の作用物質を供給する能力を有する。ここで提示される実験は、（１）実験的神経膠腫に直接移植される場合に主腫瘍床全体に迅速かつ効果的に移動／分布する；（２）侵襲性腫瘍の境界を越えて移動しそしてそれを「取り囲む」（含有するかのように）；（３）周囲組織への個々の浸潤性腫瘍細胞を表面上「跡をたどる」；（４）離れた部位から標的のＣＮＳ−１腫瘍まで正常組織を通って移動する；そして（５）腫瘍床全体でかつ腫瘍細胞に並んで外来遺伝子（この場合はｌａｃＺ）の安定な発現を示す、ＮＳＣの能力を立証する。これらの結果は将来の治療的脳腫瘍研究のための下地を作り、腫瘍に向けられたベクター媒介性の酵素／プロドラッグ遺伝子治療のための有効な送達ベヒクルとしての神経前駆／幹細胞の使用のための決定的な支持を提供する。
他の細胞 ＨＣＮ−１細胞系は一側巨脳症成長を伴う患者の大脳皮質組織からの親細胞系由来である（ロネット（Ｒｏｎｎｅｔｔ Ｇ．Ｖ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：６０３−５、１９９０）。ＨＣＮ−１Ａ細胞はニューロン様の形態に分化しそして神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼおよびｐ７５ＮＧＦＲについて（しかしミエリン塩基性タンパク質、Ｓ−１００もしくはグリア筋原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）についてでない）陽性に染色するよう誘導された。これらの細胞はγ−アミノ酪酸およびグルタミン酸についてもまた陽性に染色するため、それらは神経伝達体となるようである。以前に、ポルトラク（Ｐｏｌｔｏｒａｋ Ｍ．）ら（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １（１）：３−１５、１９９２）はＨＣＮ−１細胞が脳実質中で生存したことを観察し、そしてこれらの細胞がヒトでの脳内移植に適しうることを提案した。
【００１７】
ロネット（Ｒｏｎｎｅｔｔ ＧＶ）ら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６３（４）：１０８１−９９、１９９４）は、ＨＣＮ−１細胞が神経成長因子ジブチリル環状ＡＭＰおよび
イソブチルメチルキサンチンに曝露された場合にニューロンに似る過程を成長したことを報告した。
【００１８】
神経細胞は末梢神経細胞への曝露により活性化されているマクロファージとともにもまた投与され得る。こうした活性化されたマクロファージはＣＮＳの外傷の部位、例えば切断された視神経を浄化することが示され、この後に新たな神経伸長が開始して損傷にわたって成長した。ＣＮＳ組織（マクロファージを阻害する化学物質を分泌する）に曝露されたもしくは全く何にもされないマクロファージを移植することはほとんどもしくは全く再生をもたらさなかった（ラザロフ−シュピーグラー（Ｌａｚａｒｏｖ−Ｓｐｉｅｇｌｅｒ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：１、１９９６）。
【００１９】
ブタ胎児細胞がパーキンソン病およびハンチントン舞踏病ならびに難治性発作のような神経変性性疾患を伴う患者に移植され、こうした患者では興奮領域の外科的除去がそうでなければ実施されることができた。こうした細胞は、レトロウイルスについて適正にスクリーニングされる場合に発明の方法でもまた使用され得る。
【００２０】
神経堤細胞が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が５ｎｇ／ｍｌの増分で５から１００ｎｇ／ｍｌまでの範囲にわたる濃度で培地に添加されるという改変を伴ってステンプル（Ｓｔｅｍｐｌｅ）とアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（米国特許第５，６５４，１８３号）（引用により本明細書に組み込まれる）に従って単離かつ培養される。そのように培養された神経堤細胞は約１ないし５ｎｇ／ｍｌの増大する濃度のＦＧＦの存在により刺激されることが見出される。こうした細胞は末梢神経細胞に分化し、それが本発明で使用され得る。他のサイトカイン、成長因子および薬物 あるサイトカイン、成長因子および薬物が移植領域で場合によっては使用されるか、もしくは移植と付随して投与されうる。
【００２１】
既知のサイトカインはインターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩｌ−１１；組織壊死因子はＴＮＦ、ＴＮＦα、またリンホトキシン（ＬＴ）およびＴＮＦβ；インターフェロン（ＩＦＮ）はＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγ；ならびに組織成長因子（ＴＧＦ）を包含する。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は幹細胞の産生、分化および機能に関与していると考えられる特定の糖タンパク質である。
【００２２】
神経成長因子（ＮＧＦ）はおそらくコリン作動性の経路に対して作用することによりentorhinal傷害後に空間的変化の任務の回復の速度を増大させることが示された（シュタイン（Ｓｔｅｉｎ）とウィル（Ｗｉｌｌ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２６１：１２７−３１、１９８３）。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】１Ａおよび１Ｂは、本発明にかかる、インビトロでの神経前駆／幹Ｃ１７．２細胞の移動能力を具体的に説明する。インキュベーションの５日後にＣ１７．２細胞の幅広い分布が存在し（図１Ｂ）、それらが、筒中の最初の植付け(seeding)の領域に局在されたままであったＴＲ−１０細胞（図１Ａ）と比較して筒中のそれらの最初の植付けから離れて移動したことを示唆する。これらのパターンは、細胞が神経膠腫細胞の上部で直接プレート培養された（右のわきに置かれた筒［矢印］）にしろ、単にそれらに並んだ（中央の筒［矢印］）にしろ、観察された。
【図２】２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、本発明にかかる、移動性腫瘍細胞の「跡をたどる」ようにみえる実験的腫瘍塊全体および前進する腫瘍の縁をわずかに越える外来遺伝子を発現する神経前駆／幹細胞の広範囲の移動を具体的に説明する。（図２Ａ）４×で示される第２日；矢尻は腫瘍塊のおおよその縁の境界を定める；（図２Ｂ）１０×での高出力、ここでＸ−ｇａｌすなわち青色に染色するＮＳＣ［矢印］が暗赤色に染色する腫瘍細胞の間に点在される。（図２Ｃ）Ｘｇａｌ＋青色を示す腫瘍内注入１０日後の腫瘍塊の眺め(view)、Ｃ１７．２ ＮＳＣは腫瘍に浸潤したが、しかし青色に染色するＮＳＣが侵襲する「逃れる」細胞［矢印］（１０×）の「後を追って」いるように見える場合に周囲組織への若干の移動を伴った暗赤色に染色された腫瘍組織の縁で大部分は停止する。（図２Ｄ）成体ヌードマウスの前頭皮質に移植されたＣＮＳ−１腫瘍細胞、浸潤する実験的腫瘍床全体で浸潤性の腫瘍縁［矢印］までかつそれに沿って青色のＣ１７．２細胞の広範囲の移動および分布が存在し、かつ、そこで多くの腫瘍細胞が攻撃性腫瘍細胞［矢印］に実際に並んで周囲組織中に正常組織に侵襲している（１０×）。
【図３】３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇおよび３Ｈは、本発明にかかる、主腫瘍塊から離れて移動性腫瘍細胞の「跡をたどる」神経前駆／幹細胞の外観を具体的に説明し；（図３Ａ、３Ｂ）平行切片：低出力のＣ１７．２細胞は腫瘍全体および周囲の縁に分布した［図３Ａ）Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド、図３Ｂ）テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識］；（図３Ｃ、３Ｄ）Ｃ１７．２細胞に並んだ腫瘍の縁および移動性腫瘍細胞の低および高出力（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）；（図３Ｇ、３Ｈ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性腫瘍細胞の低および高出力（テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識）。
【図４】４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆおよび４Ｇは、本発明にかかる、 正常組織の標的ＣＮＳ−１腫瘍細胞全体を移動する主腫瘍床から離れた部位に移植された神経前駆／幹細胞を具体的に説明し；（図４Ａ、４Ｂ）同一半球：３×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を右前頭葉に移植した。第６日に、４×１０4個のＣ１７．２細胞を右前頭頭頂葉に注入した（４ｍｍ尾側の腫瘍注入）。動物を第１２（示される）および２１日に殺し、Ｃ１７−２細胞が腫瘍床中にみられる（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）。（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ）反対側半球：３×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を左前頭葉に移植し、また、５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を左前頭頭頂葉に移植した。第６日に、８×１０4個のＣ１７−２細胞を右前頭葉に注入した。動物を第１２および２１日（示される）に殺した；ｃ）４×Ｃ１７．２（赤色）が脳の反対側から腫瘍（緑色）に向かって移動するのがみられ、ｄ）１０×Ｃ１７．２細胞（赤色）が中央交連を横断して能動的に移動するのがみられる（二重免疫蛍光）、ｅ）２０×Ｃ１７−２細胞（青色）が腫瘍（黒色矢印）に進入するのがみられる（Ｘｇａｌ／ニュートラルレッド）。（図４Ｆ、４Ｇ）脳室内：５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を右前頭葉に移植した。第６日に、８×１０4個のＣ１７．２細胞を右もしくは左（示される）側脳室に注入した。
【００２８】
実施例
実験方法
細胞：
Ｃ１７−２およびＴＲ−１０細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）、５％ウマ血清（ＨＳ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％グルタミン（２ｍＭ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ワシントンＤＣ）中で維持した。ＣＮＳ−１細胞は既に記述されたとおり（アブーディ・グーテルマン（Ａｂｏｏｄｙ−Ｇｕｔｅｒｍａｎ）ら、１９９７を参照）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するようにＰＧＫ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＮｅｏＲレトロウイルスベクター構築物を用いて安定に導入し、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたＲＰＭＩ−１６４０（バイオ ウィッタカー（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））中で維持した。細胞構造の研究を、標準的条件すなわち加湿、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター下で１００ｍｍペトリ皿中で実施した。インビトロ研究；ＣＮＳ−１神経膠腫細胞を、そ
の中に４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞が一夜プレート培養された５ｍｍ筒（すなわちＣＮＳ−１細胞を含まない）の周囲におよそ６０〜７０％コンフルエンスまでプレート培養した。同時に、４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を、付着されたＣＮＳ−１細胞の上部に直接置かれた５ｍｍ筒中に置いた。翌日、筒を除去し、そしてプレートをＰＢＳで十分にすすいでいかなる浮遊細胞も除去し、培地を置き換え、そしてプレートを５日間インキュベーションした。プレートをその後、０．５％グルタルアルデヒド固定後に一夜β−ガラクトシダーゼについて染色した（注：Ｃ１７．２およびＴＲ−１０細胞双方がＸ−ｇａｌ染色で＞９０％青色である）。インビボ研究；移植４８時間前にＣ１７．２およびＴＲ−１０細胞を１０μＭの濃度のＢＵｄＲ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））とともにインキュベーションした。プレート培養された細胞をＰＢＳですすぎ、トリプシン処理し、培地に再懸濁しそしてコールターカウンター上で計数した。所望の数の細胞を遠心分離器中で４分間かつ１１００ｒｐｍで４℃で回転させてペレットを得た。培地を除去し；細胞をＰＢＳに再懸濁することによりすすぎ、そして再回転した。ＰＢＳを除去し、そして適切な量のＰＢＳを添加して最終の所望の濃度で細胞を再懸濁した。細胞を氷上に保ち、そして各動物注入に先立ち穏やかに摩砕した。ＢＵｄＲで標識されなかった細胞を類似の様式での注入のため調製した。
【００２９】
動物：
動物研究は動物治療に関するマサチューセッツ総合病院小委員会（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）により出された指針に従って実施した。使用された動物：成体ＣＤ−フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））および８〜１０週齢の成体のおよそ２０グラムの雌性ヌードマウス（コックス（Ｃｏｘ）７、ＭＧＨ−イースト（Ｅａｓｔ）から得られた無作為繁殖されたスイス（Ｓｗｉｓｓ）白色）。
【００３０】
外科手術および殺傷：
動物を０．１５ｍｌの２０％ケタミン塩酸塩（ケタラール（ＫＥＴＡＬＡＲ）１００ｍｇ／ｍｌ；パーク・デービス（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ニュージャージー州モリスプレインズ）、２０％キシラジン（ロムプン（ＲＯＭＰＵＮ）２０ｍｇ／ｍｌ；マイルズ インク（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．）、カンサス州スワニーミッション）、６０％塩化ナトリウム（０．９％；アボット ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、イリノイ州ノースシカゴ）のｉ．ｐ．注入により麻酔し、そして定位装置（コフ（Ｋｏｐｆ）、カリフォルニア州チュジュンガ）中に固定した。脳内注入を、頭蓋の頂上に直線状のメス皮膚切開を作成することにより定位的に実施した。バーホールを冠状縫合上のブレグマに対し２ｍｍ側方に高速ドリルで頭蓋中にドリルで穴をあけた。滅菌針で硬膜を切開しそして止血を得た後に１μｌの１×ダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ヴァージニア州ヘルンドン）に懸濁された所望の数の腫瘍細胞を、３ないし５分の期間にわたって特定された位置（下のプロトコルを参照）に２６ゲージの５μｌハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジで注入した。針を２〜４分の期間にわたって引っ込めた後に骨蝋（ｂｏｎｅ−ｗａｘ）（エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）、ニュージャージー州ソマーヴィル）を使用してバーホールを閉塞し、ベタジンを手術領域に適用し、そして皮膚を縫合して封鎖した。後日２回目の注入を受領する動物を、特別のプロトコルにより（下を参照）麻酔し、定位装置中に固定しそして細胞を注入した。動物を提示された(stated)日に麻酔薬の過剰投与およびその後のＰＢＳ次いで４％パラホルムアルデヒド＋２ｍＭＭｇＣｌ2（ｐＨ７．４）での頭蓋内灌流で殺した。脳を取り出しそして４℃で一夜後固定し、そしてその後３〜７日間ＰＢＳ＋２ｍＭＭｇＣｌ2（ｐＨ７．４）中３０％ショ糖に移して凍結保護した(cryoprotect)。脳を−８０℃で貯蔵し、そしてその後１０〜１５ミクロンの冠状連続切片を低温槽に切断した（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＣＭ３０００）。
【００３１】
移植されたＣ１７−２細胞のＢＵｄＲ標識：
選択された動物は殺す前２４時間にわたって１ｍｌ／１００ｇ体重の２０μＭＢＵｄＲストック溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の３回の腹腔内注入を受領した（２０ｇのマウスあたり０．２ｍｌ／注入）。
【００３２】
組織病理学的および免疫組織化学的研究：
組織切片を（１）Ｘｇａｌおよびニュートラルレッドで対染色（２）ヘマトキシリンおよびエオシン（３）で染色し、二重免疫蛍光標識をテキサスレッド抗β−ガラクトシダーゼおよびＦＩＴＣ抗ＧＦＰで実施した。スライドガラスを光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査で検査した。ＣＮＳ−１腫瘍細胞もまた共焦点蛍光顕微鏡検査下で染色なしで検査した。
【００３３】
実施例１．培養物中のＮＳＣの移動能力
神経膠腫細胞とともにのＮＳＣの特性を決定するため、神経膠腫細胞と共培養された場合の線維芽細胞（ｌａｃＺ発現ＴＲ−１０線維芽細胞系）に対するＮＳＣ（クローンＣ１７．２）の相対的移動能力を比較する研究を最初に培養物中で実施した。Ｃ１７．２およびＴＲ−１０細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）、５％ウマ血清（ＨＳ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％グルタミン（２ｍＭ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ワシントンＤＣ）中で維持した。ＣＮＳ−１細胞は既に記述されたとおり（アブーディ・グーテルマン（Ａｂｏｏｄｙ−Ｇｕｔｅｒｍａｎ）ら、１９９７を参照）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するようにＰＧＫ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＮｅｏＲレトロウイルスベクター構築物を用いて安定に導入し、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補充されたＲＰＭＩ−１６４０（バイオ ウィッタカー（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））中で維持した。細胞構造の研究を、標準的条件すなわち加湿、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター下で１００ｍｍペトリ皿中で実施した。ＣＮＳ−１神経膠腫細胞を、その中に４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞が一夜プレート培養された５ｍｍ筒（すなわちＣＮＳ−１細胞を含まない）の周囲におよそ６０〜７０％コンフルエンスまでプレート培養した。同時に、４０，０００個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を、付着されたＣＮＳ−１細胞の上部に直接置かれた５ｍｍ筒中に置いた。翌日、筒を除去し、そしてプレートをＰＢＳで十分にすすいでいかなる浮遊細胞も除去し、培地を置き換え、そしてプレートを５日間インキュベーションした。プレートをその後、０．５％グルタルアルデヒド固定後に一夜β−ガラクトシダーゼについて染色した（注：Ｃ１７．２およびＴＲ−１０細胞双方がＸ−ｇａｌ染色で＞９０％青色である）。
【００３４】
Ｃ１７．２細胞の広範な分布が存在し（図１Ｂ）、それらが筒中の当初の植付けの領域に局在されたままであったＴＲ−１０細胞（図１Ａ）に比較して筒中のそれらの当初の部位から離れて移動していたことを示唆した。これらのパターンは、細胞が神経膠腫細胞の上部に直接プレート培養された（右のわきに置かれた(right-sided)筒［矢印］）にしろ、単にそれらに並んだ（中央の筒［矢印］）にしろ観察された。
【００３５】
実施例２．インビボの侵襲性腫瘍塊全体でおよびそれを越えてのトランスジーンを発現するＮＳＣの移動
脳腫瘍中に導入されたクローンＣ１７．２のＮＳＣの挙動を決定するため、実験動物（同系の成体ラット）が最初に右前頭葉に注入された１μｌ中の４×１０4個のＤ７４ラット神経膠腫細胞の移植片を受領した。４日後、１．５μｌのＰＢＳ中の１×１０5個のＣ１７．２のＮＳＣをＤ７４腫瘍床中に直接同一座標で注入した。動物をその後、腫瘍内注
入後第２、６、および１０日に殺し、そして脳の低温槽切片を、β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）活性についてＸｇａｌ組織化学で処理して供与体由来細胞を検出し、かつ、ニュートラルレッドで対染色して腫瘍細胞を検出した。
【００３６】
供与体Ｃ１７．２ ＮＳＣは注入後２日と同じくらい迅速に腫瘍の約８ｍｍ幅にわたって数日以内に腫瘍全体に広範囲に分散されて見出された（図２Ａ、２Ｂ）。これは実験的脳腫瘍に移植された３Ｔ３線維芽細胞の以前の報告33に比較してずっとより広範囲かつ迅速な分散である。第１０日までに、Ｃ１７．２細胞は、変性性の環境によりいくぶん引かれ、浸潤する腫瘍の縁にはっきりと沿ってかつそれをわずかに越えて腫瘍の大部分全体でみられ、移動性腫瘍細胞の「跡をたどる」ように思われた（図２Ｃ、２Ｄ）。Ｃ１７．２細胞それら自身は腫瘍原性にならなかった。
【００３７】
（図２Ａ）４×で示される第２日；矢尻は腫瘍塊のおおよその縁の境界を定め；より低出力でさえ腫瘍は青色のＮＳＣで混合されることが見られ得る［矢印］。これは１０×で（図２Ｂ）でより高出力でより劇的に認識され、ここでＸｇａｌ＋すなわち青色に染色するＮＳＣ［矢印］は暗赤色に染色する腫瘍細胞の間に点在される。（図２Ｃ）腫瘍内注入１０日後の腫瘍塊のこの眺めは、Ｘｇａｌ＋青色のＣ１７．２のＮＳＣは腫瘍に浸潤したがしかし青色に染色するＮＳＣが「逃れる」腫瘍細胞［矢印］の「後を追って」かつ侵襲しているように見える場合に周囲組織への若干の移動を伴った暗赤色に染色された腫瘍組織の縁（境界が矢尻により示される）で大部分は停止することを申し分なく示す（１０×）。この現象は、ヌードマウスの脳中の実験的ＣＮＳ−１星状細胞腫Ｄ７４よりなおより毒性の侵襲性かつ攻撃的腫瘍でさえＣ１７．２のＮＳＣの挙動を検査する場合により劇的にさえなる（図２Ｄ）。ＣＮＳ−１腫瘍細胞を成体ヌードマウスの前頭皮質に移植した（第０日）。第６日に４×１０4個のＣ１７．２細胞を腫瘍床に直接移植した。（図２Ｄ）に写真で示された動物を腫瘍移植後第１２日、腫瘍内注入後第６日に殺した。写真で示された低温槽切片を、β−ガラクトシダーゼ活性についてＸｇａｌの組織化学で処理して青色のＣ１７．２のＮＳＣを検出し、また、ニュートラルレッドで対染色して暗赤色の腫瘍細胞を示した。浸潤性の実験的腫瘍床全体に浸潤する腫瘍の縁［白色矢印］までそしてそれに沿って青色のＣ１７．２細胞の広範囲の移動および分布が存在し、そしてここで多くの腫瘍細胞が攻撃性腫瘍細胞［矢印］と実際に並んで周囲の組織中に正常組織に侵襲する（１０×）。
【００３８】
実施例３．ＮＳＣは浸潤性腫瘍細胞の「跡をたどる」
ＣＮＳ−１腫瘍細胞を主腫瘍床から離れた単一の細胞をより良好に区別するために移植に先立ち緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をもつレトロウイルス導入により標識した17。１μｌのＰＢＳ中のＧＦＰを発現するＣＮＳ−１神経膠腫細胞（３×１０4個）を定位座標でブレグマに対し２ｍｍ側方に冠状縫合上に硬膜から深さ３ｍｍに右前頭葉に注入した。１μｌのＰＢＳ中の４×１０4個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を第６日に腫瘍床中に直接同一座標で注入した。３〜４匹のＣ１７．２動物（２匹はＢＵｄＲ標識された、１匹はＢＵｄＲを間歇的に投与された）および１〜２匹のＴＲ−１０対照動物（１匹はＢＵｄＲ標識された）。動物を腫瘍移植後第９、１２、１６および２１日に殺した。低温槽切片にされた固定された脳組織をβ−ガラクトシダーゼ（Ｃ１７．２細胞青色）およびニュートラルレッド（腫瘍細胞暗赤色）、またはテキサスレッド抗β−ガラクトシダーゼ（Ｃ１７．２細胞赤色）およびＦＩＴＣ抗ＧＦＰ（腫瘍細胞緑色）での二重免疫蛍光のいずれかで染色した。
（図３Ａ、３Ｂ）平行切片：低出力のＣ１７．２細胞は腫瘍全体および周囲の縁に分布した［図３Ａ）Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド、図３Ｂ）テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識］。
（図３Ｃ、３Ｄ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性腫瘍細胞の低および高出力（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）。
（図３Ｅ、３Ｆ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性腫瘍細胞の低および高出力（Ｘｇａｌおよびニュートラルレッド）
（図３Ｇ、３Ｈ）Ｃ１７．２細胞に並んだ単一の移動性細胞の低および高出力（テキサスレッドおよびＦＩＴＣでの二重免疫蛍光標識）。
【００３９】
実施例４．離れた部位に移植されたＮＳＣは腫瘍に向かって移動する
正常組織およびとりわけを標的の腫瘍細胞を通って移動するＮＳＣの能力を検査するため、供与体ＮＳＣを３種の別個の状況すなわち同一半球、反対半球もしくは側脳室への主腫瘍床から離れた巻き込まれていない部位に注入した。
【００４０】
同一半球：１μｌＰＢＳ中のＣＮＳ−１神経芽腫細胞（３×１０4個）を、定位座標で冠状縫合上でブレグマに対し２ｍｍ側方の硬膜から深さ３ｍｍに右前頭葉に注入した。１μｌのＰＢＳ中の４×１０4個のＣ１７．２もしくはＴＲ−１０細胞を第６日に定位座標でブレグマに対し３ｍｍ側方かつ４ｍｍ尾側に硬膜から深さ３ｍｍに右前頭頭頂葉に注入した。２匹の動物を第１２および２１日に殺した。全時間点で、ＮＳＣは主腫瘍床内にならびに周囲組織中の移動性腫瘍細胞に並んで分布されて見出された（図４Ａ、４Ｂ）。
【００４１】
反対半球：１μｌＰＢＳ中の３×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を、定位座標で冠状縫合上でブレグマに対し２ｍｍ側方に硬膜から深さ３ｍｍに左前頭葉に注入し、１μｌのＰＢＳ中の５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞を、ブレグマに対し３ｍｍ側方かつ４ｍｍ尾側に硬膜から深さ３ｍｍに左前頭頭頂葉に注入し、２μｌのＰＢＳ中の８×１０4個のＣ１７．２細胞を第６日にブレグマに対し２ｍｍ側方かつ２ｍｍ尾側に硬膜から深さ３ｍｍに右前頭葉に注入した。２匹の動物を第１２および２１日に殺した（対照−腫瘍なし 座標：ブレグマの２ｍｍＲ、２ｍｍ尾側、３ｍｍ深）。ＮＳＣは脳の反対側の腫瘍に向かって中央交連を横断して能動的に移動し、そしてその後腫瘍に進入してみられた（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ）。
【００４２】
ＣＮＳ−１腫瘍床から離れた移植（脳室内）：
この最後の状況では、１μｌのＰＢＳ中の５×１０4個のＣＮＳ−１腫瘍細胞をブレグマに対し２ｍｍ側方に冠状縫合上に硬膜から３ｍｍ深さで右前頭葉に注入した。２μｌのＰＢＳ中の８×１０4個のＣ１７．２細胞を第６日にブレグマに対し１ｍｍ側方かつ３ｍｍ尾側に硬膜から２ｍｍ深さに左もしくは右脳室に注入した。２匹の動物を第１２および２１日に殺した。ＮＳＣは、再度、主腫瘍床内ならびに移動性腫瘍細胞と並んでみられた（図４Ｆ、４Ｇ）。
【００４３】
各場合で、供与体ＮＳＣは正常組織を通って移動しかつ腫瘍に「標的を定める」ことが見出された。
【００４４】
（本発明の主要な態様または特徴）
本発明の主要な態様または特徴として次のものを挙げることができる。
態様１：少なくとも異なる型の神経細胞に分化する能力を有する単離された多分化能のニューロン細胞であって、
ａ．移動能力を有し、それにより当該細胞がニューロン細胞が投与される第一の位置から最低１個の腫瘍細胞が存在する第二の位置まで移動することが可能であり；
ｂ．腫瘍を通ってかつそれの周囲を移動する能力を有し、それにより複数のニューロン細胞が腫瘍を取り囲むことが可能であり；そして
ｃ．最低１個の浸潤性腫瘍細胞の跡をたどる能力を有し、それにより浸潤性かつ転移性の腫瘍を治療する、
ことをさらなる特徴とするニューロン細胞。
態様２：ニューロン細胞が単離された神経幹細胞を含んで成る、態様１のニューロン細胞
。
態様３：ニューロン細胞が細胞傷害性物質を分泌するよう処理されている、態様１のニューロン細胞
態様４：ニューロン細胞が腫瘍性細胞の分化を直接促進する因子で形質転換されている、態様１のニューロン細胞。
態様５：ニューロン細胞が腫瘍細胞により組み込まれるべき治療遺伝子をコードするウイルスで形質転換されている、態様１のニューロン細胞。
態様６：ニューロン細胞が腫瘍細胞中に組み込まれるべき自殺遺伝子、分化剤もしくはトロフィンに対するレセプターをコードするウイルスで形質転換されている、態様１のニューロン細胞。
態様７：腫瘍から脳の同一の側もしくは反対側に投与されたニューロン細胞が腫瘍に達することが可能である、態様１のニューロン細胞。
態様８：移動性ニューロン細胞の移動性パッケージング／プロデューサー細胞への転化方法であって、
ａ．β−ｇａｌのようなマーカーを構成的に産生するニューロン細胞を提供すること；
ｂ．両栄養性ｐＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびピューロマイシン選択プラスミドｐＰＧＫｐｕｒｏでニューロン細胞をコトランスフェクションすること；
ｃ．トランスフェクションされた細胞をピューロマイシン中で選択すること；
ｄ．両栄養性エンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現について選択すること；ｅ．モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して蛍光活性化細胞選別により細胞を単離すること；
ｆ．どのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について段階ｅの細胞をスクリーニングすること；
を含んで成り、
それにより選択の遺伝子でトランスフェクションされることが可能な移動性ニューロン細胞を産生し、その結果選択の遺伝子を発現するウイルス粒子が産生され、そして複数のトランスフェクションされたパッケージング細胞により中枢神経系の広範な領域にわたって播種される前記方法。
態様９：段階ｆがβ−ｇａｌ産生についてのウイルスフォーカスアッセイにより実施される、態様１の方法。
態様１０：選択の遺伝子がプロドラッグ活性化酵素である、態様８の方法。
態様１１：プロドラッグ活性化酵素が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＨＳＶ−ＴＫもしくはチトクロームｐ４５０である、態様１０の方法。
態様１２：プロドラッグ活性化酵素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）である、態様１０の方法。
態様１３：中枢神経系のための新規細胞パッケージング系であって、
β−ｇａｌのようなマーカーを構成的に産生するニューロン細胞を含んで成り、
当該ニューロン細胞は両栄養性ｐＰＡＭ３パッケージングプラスミドおよびピューロマイシン選択プラスミドｐＰＧＫｐｕｒｏでコトランスフェクションされており；
当該トランスフェクションされた細胞が、モノクローナル抗体８３Ａ２５を使用して両栄養性エンベロープ糖タンパク質コートの細胞表面の発現および蛍光について、ならびにどのコロニーが感染性ウイルス粒子中にｌａｃＺをパッケージングしたかを評価することによりそれらのパッケージング能力について、ピューロマイシンの存在下で選択され；
生じる細胞は、粒子もしくはベクターをパッケージングかつ放出することが可能であり、それらは順に中枢神経系細胞への遺伝子導入のためのベクターとして役立ちうるものである、新規細胞パッケージング系。
態様１４：粒子が複製欠損レトロウイルス粒子である、態様１３：の新規細胞パッケージング系。
態様１５：ベクターが複製が条件的なヘルペスウイルスベクターを含んで成る、態様１３
の新規細胞パッケージング系。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する個々の明確な細胞系としてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定に維持される遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞のクローンであって、（ｉ）遺伝的に改変されたヒト神経幹細胞に由来し、単一の該ヒト神経幹細胞の子孫であり、（ｉｉ）有糸分裂性で、自己再生性細胞系としてインビトロで継代する間に未前駆及び未分化のまま残存し、（ｉｉｉ）未前駆細胞としてインビボで移植可能であり、（ｉｖ）移植後に、移植部位から他の解剖学的部位へ移動して生きている宿主被験者の神経系内に組込まれてもよく、（ｖ）生きている宿主被験者の局所解剖学的部位の実質組織中に移植後その場で組込まれ、（ｖｉ）ニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞からなる群より選ばれる基本細胞型の少なくとも一種に組込まれた後その場で分化し、（ｖｉｉ）共通に前記遺伝子的に改変されたヒトゲノムＤＮＡを有する、複数の始原ヒト神経幹細胞を含んでなり、かつ、前記ＤＮＡが特定のタンパク質をコードする外来の遺伝子を含有する少なくとも一つのＤＮＡセグメントを保持するウイルスベクターを含有するように遺伝的に改変されたものである、上記クローン。
【請求項２】
生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する個々の明確な細胞系としてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定に維持される遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞子孫のクローンであって、（ｉ）遺伝的に改変されたヒト神経幹細胞に由来し、単一の該ヒト神経幹細胞の下行性の子孫であり、（ｉｉ）有糸分裂性細胞としてインビトロで継代する間に未分化のまま残存し、（ｉｉｉ）未分化細胞としてインビボで移植可能であり、（ｉｖ）移植後に、移植部位から他の解剖学的部位へ移動して生きている宿主被験者の神経系内に組込まれてもよく、（ｖ）生きている宿主被験者の局所解剖学的部位の実質組織中に移植後その場で組込まれ、（ｖｉ）ニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞からなる群より選ばれる基本細胞型の少なくとも一種に組込まれた後その場で分化し、（ｖｉｉ）共通に前記遺伝子的に改変されたヒトゲノムＤＮＡを有する、複数の多能性生存子孫細胞を含んでなり、かつ、前記ＤＮＡが特定のタンパク質をコードする外来の遺伝子を含有する少なくとも一つのＤＮＡセグメントを保持するウイルスベクターを含有するように遺伝的に改変されたものである、上記クローン。
【請求項３】
ウイルスベクターが両種性レトロウイルスベクターである、請求項１または２記載のクローン。
【請求項４】
ウイルスベクターが外来のｖｍｙｃ ＤＮＡ配列を含有し、かつ、（ｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビトロで高度に発現されて、インビトロで維持されている間に増殖細胞周期にあり、迅速に増殖するヒト神経幹細胞をもたらし、（ｉｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビボ細胞移植後に、インビボで細胞増殖を中止するように生きている宿主被験者の構成組織により制御され、ダウンレギュレーションされる、請求項１または２記載のクローン。
【請求項５】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定な細胞系として維持され、生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞であって、（ｉ）有糸分裂細胞としてインビトロで維持されている間に未分化のまま残存し、（ｉｉ）未前駆細胞として選択された移植部位においてインビボで移植可能であり、（ｉｉｉ）移植後に、移植部位から他の解剖学的部位へ移動して生きている宿主被験者の神経系内に組込まれてもよく、（ｉｖ）生きている宿主被験者の局所解剖学的部位の実質組織中に移植後その場で組込まれ、（ｖ）ニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞からなる群より選ばれる基本細胞型の少なくとも一種に組込まれた後その場で分化するヒト神経幹細胞起源の多能性子孫細胞を含んでなり、か
つ、前記ＤＮＡが特定のタンパク質をコードする異種遺伝子を含有する少なくとも一つのＤＮＡセグメントを保持するウイルスベクターを含有するように遺伝的に改変されたものである、上記遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞。
【請求項６】
ウイルスベクターが両種性レトロウイルスベクターである、請求項５記載の遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞。
【請求項７】
ウイルスベクターが異種ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列を保持し、かつ、（ｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビトロで高度に発現されて、インビトロで維持されている間に増殖細胞周期にあり、迅速に増殖する多能性子孫細胞をもたらし、（ｉｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビボで移植後に、インビボで多能性細胞増殖を明らかに低減するように生きている宿主被験者の構成組織により制御され、ダウンレギュレーションされる、請求項５記載のクローン。
【請求項１】
生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する個々の明確な細胞系としてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定に維持される遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞のクローンであって、（ｉ）遺伝的に改変されたヒト神経幹細胞に由来し、単一の該ヒト神経幹細胞の子孫であり、（ｉｉ）有糸分裂性で、自己再生性細胞系としてインビトロで継代する間に未前駆及び未分化のまま残存し、（ｉｉｉ）未前駆細胞としてインビボで移植可能であり、（ｉｖ）移植後に、移植部位から他の解剖学的部位へ移動して生きている宿主被験者の神経系内に組込まれてもよく、（ｖ）生きている宿主被験者の局所解剖学的部位の実質組織中に移植後その場で組込まれ、（ｖｉ）ニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞からなる群より選ばれる基本細胞型の少なくとも一種に組込まれた後その場で分化し、（ｖｉｉ）共通に前記遺伝子的に改変されたヒトゲノムＤＮＡを有する、複数の始原ヒト神経幹細胞を含んでなり、かつ、前記ＤＮＡが特定のタンパク質をコードする外来の遺伝子を含有する少なくとも一つのＤＮＡセグメントを保持するウイルスベクターを含有するように遺伝的に改変されたものである、上記クローン。
【請求項２】
生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する個々の明確な細胞系としてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定に維持される遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞子孫のクローンであって、（ｉ）遺伝的に改変されたヒト神経幹細胞に由来し、単一の該ヒト神経幹細胞の下行性の子孫であり、（ｉｉ）有糸分裂性細胞としてインビトロで継代する間に未分化のまま残存し、（ｉｉｉ）未分化細胞としてインビボで移植可能であり、（ｉｖ）移植後に、移植部位から他の解剖学的部位へ移動して生きている宿主被験者の神経系内に組込まれてもよく、（ｖ）生きている宿主被験者の局所解剖学的部位の実質組織中に移植後その場で組込まれ、（ｖｉ）ニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞からなる群より選ばれる基本細胞型の少なくとも一種に組込まれた後その場で分化し、（ｖｉｉ）共通に前記遺伝子的に改変されたヒトゲノムＤＮＡを有する、複数の多能性生存子孫細胞を含んでなり、かつ、前記ＤＮＡが特定のタンパク質をコードする外来の遺伝子を含有する少なくとも一つのＤＮＡセグメントを保持するウイルスベクターを含有するように遺伝的に改変されたものである、上記クローン。
【請求項３】
ウイルスベクターが両種性レトロウイルスベクターである、請求項１または２記載のクローン。
【請求項４】
ウイルスベクターが外来のｖｍｙｃ ＤＮＡ配列を含有し、かつ、（ｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビトロで高度に発現されて、インビトロで維持されている間に増殖細胞周期にあり、迅速に増殖するヒト神経幹細胞をもたらし、（ｉｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビボ細胞移植後に、インビボで細胞増殖を中止するように生きている宿主被験者の構成組織により制御され、ダウンレギュレーションされる、請求項１または２記載のクローン。
【請求項５】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で安定な細胞系として維持され、生きている宿主被験者へ要求に応じてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で移植するのに適する遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞であって、（ｉ）有糸分裂細胞としてインビトロで維持されている間に未分化のまま残存し、（ｉｉ）未前駆細胞として選択された移植部位においてインビボで移植可能であり、（ｉｉｉ）移植後に、移植部位から他の解剖学的部位へ移動して生きている宿主被験者の神経系内に組込まれてもよく、（ｉｖ）生きている宿主被験者の局所解剖学的部位の実質組織中に移植後その場で組込まれ、（ｖ）ニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞からなる群より選ばれる基本細胞型の少なくとも一種に組込まれた後その場で分化するヒト神経幹細胞起源の多能性子孫細胞を含んでなり、か
つ、前記ＤＮＡが特定のタンパク質をコードする異種遺伝子を含有する少なくとも一つのＤＮＡセグメントを保持するウイルスベクターを含有するように遺伝的に改変されたものである、上記遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞。
【請求項６】
ウイルスベクターが両種性レトロウイルスベクターである、請求項５記載の遺伝子的に改変されたヒト神経幹細胞の生きている子孫細胞。
【請求項７】
ウイルスベクターが異種ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列を保持し、かつ、（ｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビトロで高度に発現されて、インビトロで維持されている間に増殖細胞周期にあり、迅速に増殖する多能性子孫細胞をもたらし、（ｉｉ）該ｖｍｙｃ ＤＮＡ配列が、インビボで移植後に、インビボで多能性細胞増殖を明らかに低減するように生きている宿主被験者の構成組織により制御され、ダウンレギュレーションされる、請求項５記載のクローン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−６２２０６（Ｐ２０１１−６２２０６Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４５４５４（Ｐ２０１０−２４５４５４）
【出願日】平成２２年１１月１日（２０１０．１１．１）
【分割の表示】特願２０００−５７４６５８（Ｐ２０００−５７４６５８）の分割
【原出願日】平成１１年９月１７日（１９９９．９．１７）
【出願人】（５０１０６０８０６）ザ・チルドレンズ・メデイカル・センター・コーポレーシヨン (3)
【出願人】（５９１００４９４０）ザ・ジエネラル・ホスピタル・コーポレーシヨン (1)
【出願人】（５００１２９８１２）ノースイースタン・オハイオ・ユニバーシテイーズ・カレツジ・オブ・メデイシン (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１日（２０１０．１１．１）
【分割の表示】特願２０００−５７４６５８（Ｐ２０００−５７４６５８）の分割
【原出願日】平成１１年９月１７日（１９９９．９．１７）
【出願人】（５０１０６０８０６）ザ・チルドレンズ・メデイカル・センター・コーポレーシヨン (3)
【出願人】（５９１００４９４０）ザ・ジエネラル・ホスピタル・コーポレーシヨン (1)
【出願人】（５００１２９８１２）ノースイースタン・オハイオ・ユニバーシテイーズ・カレツジ・オブ・メデイシン (1)
【Ｆターム（参考）】
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