自己免疫性皮膚炎発現マウス
【課題】本発明の目的は、主として、新規な自己免疫性皮膚炎発現マウス、及び当該マウスを用いた自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【解決手段】本発明は、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス）由来の単核球を免疫不全マウスに移植することにより得られる、自己免疫性皮膚炎発現マウス、及び当該マウスに被験物質を投与し、当該被験物質による、自己免疫性皮膚炎の治療効果を調べることを含む、自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法に関するものである。
【解決手段】本発明は、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス）由来の単核球を免疫不全マウスに移植することにより得られる、自己免疫性皮膚炎発現マウス、及び当該マウスに被験物質を投与し、当該被験物質による、自己免疫性皮膚炎の治療効果を調べることを含む、自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な自己免疫性皮膚炎発現マウスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫性皮膚炎の病態は、複数の因子により形成されることが知られている。例えば、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）、ＩＫＫ２（ＩκＢ ｋｉｎａｓｅ ２）が病態の形成に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
【０００３】
これまでにも自己免疫性皮膚炎を発現するマウスが報告されている。例えば、特定の遺伝子発現を人為的に操作することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウス、特定の細胞集団を免疫不全マウスに移植することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウスが報告されている。
具体的には、特定の遺伝子発現を人為的に操作することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウスとしては、角化細胞特異的にＳＴＡＴ３を発現するトランスジェニックマウス、上皮細胞特異的にＩＫＫ２をノックアウトしたマウスが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。また、特定の細胞集団を免疫不全マウスに移植することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウスとしては、ｍｉｎｏｒ ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ：主要組織適合性抗原）が不適合なマウスのＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴリンパ球をＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに移植したマウス、インターフェロン−γをノックアウトしたＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴリンパ球をＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに移植したマウスが報告されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４を参照）。
【０００４】
しかしながら、上述したように自己免疫性皮膚炎は複数の因子により病態が形成されるものであるため、特定の遺伝子発現を人為的に操作した病態発現マウスが発症する自己免疫性皮膚炎が、ヒト等での自己免疫性皮膚炎を正確に反映しているか否かは不明である。また、上述したＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴリンパ球を免疫不全マウスに移植したマウスは、重篤な慢性炎症性腸炎を発症するために移植後の生存期間は短い。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｉｇｅｔｏｓｈｉ Ｓａｎｏら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、２００５年、１１巻、ｐ．４３−４９
【非特許文献２】Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ Ｓｔｒａｔｉｓら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、２００６年、１１６巻、ｐ．２０９４−２１０４
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｐ．Ｓｃｈｏｎら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、１９９７年、３巻、ｐ．１８３−１８８
【非特許文献４】Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｈｏｎｇら、“Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９９年、１６２巻、ｐ．７４８０−７４９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、主として、新規な自己免疫性皮膚炎発現マウス、及び当該マウスを用いた自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、例えば、下記１、２に記載の発明を見出し、本発明を完成した。
１．ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の単核球を免疫不全マウスに移植することにより得られる自己免疫性皮膚炎発現マウス（以下、「本発明マウス」という）。
２．上記１のマウスに被験物質を投与し、当該被験物質による、自己免疫性皮膚炎の治療効果を調べることを含む、自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法（以下、「本発明スクリーニング方法」という）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
Ｉ．本発明マウス
【０００９】
本発明における「自己免疫性皮膚炎」は、主にＴヘルパー１（以下、「Ｔｈ１」という）型の炎症性細胞が病態の形成に関与する皮膚炎を意味する。自己免疫性皮膚炎としては、例えば、乾癬、急性皮膚炎、慢性皮膚炎、扁平苔癬又は菌状息肉症を挙げることができる。
【００１０】
Ｔｈ１型の炎症性細胞としては、例えば、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球を挙げることができる。
【００１１】
本発明マウスの作成に用い得る「ＢＡＬＢ／ｃ系マウス」としては、特に制限されず、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ系の各亜系マウス、ＢＡＬＢ／ｃＢ系の各亜系マウス及びＢＡＬＢ／ｃＣｒマウスを挙げることができる。それらの中で、特にＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスが好ましい。なお、ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスは、日本新薬株式会社より入手することが可能である。また、平成１９年４月からは、日本クレア株式会社から販売される予定であるから、そこから入手することも可能である。
【００１２】
本発明マウスの作成に用い得る「単核球」としては、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の単核球であれば特に制限されず、例えば、ＣＤ２５（−）単核球、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球及びＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球を挙げることができる。それらの中で、特にＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球及びＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球が好ましい。
【００１３】
上記「単核球」の調製方法としては、特に制限されず、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓、骨髄、リンパ節、末梢血又は胸腺を用いて、常法により調製することができる。
【００１４】
ＣＤ２５（−）単核球又はＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球は、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓より調製した単核球より、蛍光標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体及び／又は抗マウスＣＤ２５抗体を用いて、常法により調製することができる。
【００１５】
ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球は、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓より調製した単核球より、市販のキットを用いて、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）単核球を除去することにより調製することができる。
【００１６】
本発明マウスの作成に用い得る「免疫不全マウス」としては、特に制限されず、例えば、市販されている免疫不全マウスや、特許文献又は非特許文献で報告されている免疫不全マウスを挙げることができる。市販されている免疫不全マウスとしては、例えば、Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−マウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｂ２ｍ−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ２）マウス、ＡＦ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｆ３４４Ｎ−ｒｎｕ／ｒｎｕマウス、ＣＴＳ／Ｓｈｉマウス及びＫＳＮマウスを挙げることができる。それらの中で、特にＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスが好ましい。
【００１７】
単核球の移植方法としては、特に制限されず、例えば、尾静脈、腹腔又は皮下より投与する方法を挙げることができる。それらの中で、特に尾静脈より投与する方法が好ましい。
【００１８】
免疫不全マウスに移植する単核球の細胞数としては、移植する単核球の性質や免疫不全マウスの種類、性別、週齢等により異なるが、例えば、１×１０６個〜１×１０８個の範囲内が適当であり、５×１０６個〜１×１０８個の範囲内が好ましく、１×１０７個〜５×１０７個の範囲内がより好ましい。
【００１９】
本発明マウスの飼育条件は、例えば、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）条件下で飼育することができる。
【００２０】
本発明マウスは、下記（１）〜（３）の特徴を有する：
（１）自己免疫性皮膚炎を自然発症すること、
（２）皮膚炎発症後６ヶ月以上生存すること、
（３）病変が皮膚に限局すること。
【００２１】
また、本発明マウスは、上記（１）〜（３）の特徴に加えて、下記（１）〜（８）の特徴を有していることが好ましい：
（１）病変部位の表皮が肥厚（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）すること、
（２）病変部位の角化細胞が分化異常（Ｐａｒａｋｅｒａｔｏｓｉｓ）、過増殖（Ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）を起こすこと、
（３）病変部位にＴｈ１型の炎症性細胞が浸潤すること、
（４）病変部位のＴｈ１型サイトカインの産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（５）病変部位において、Ｔｈ１型サイトカインの産生量が、Ｔヘルパー２（以下、「Ｔｈ２」という）型サイトカインの産生量の１０倍以上であること、
（６）病変部位のインターロイキン（以下、「ＩＬ」という）−２３の産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（７）病変部位の活性型ＳＴＡＴ３の活性が、非病変部位の活性の３倍以上であること、
（８）非病変部位において、過剰創傷治癒現象（Ｋｏｅｂｎｅｒ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）が生じること。
【００２２】
上記「自然発症する」とは、特定の遺伝子発現を人為的に操作することなく、ＳＰＦ環境下で自然に症状が生じることをいう。
【００２３】
Ｔｈ１型のサイトカインとしては、例えば、インターフェロン（以下、「ＩＦＮ」という）−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−βを挙げることができる。
【００２４】
Ｔｈ２型のサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を挙げることができる。
【００２５】
上記「過剰創傷治癒現象」とは、皮膚炎を発症している動物の非病変部位に物理的、化学的、生物的な刺激（例えば、擦過、紫外線、薬剤、のみ、ダニ）が加わることによりその部位が病変化する現象をいう。なお、角化細胞に活性型ＳＴＡＴ３を過剰発現させることにより、過剰創傷治癒現象が生じることが報告されている（例えば、Ｓｉｇｅｔｏｓｈｉ Ｓａｎｏら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、２００５年、１１巻、ｐ．４３−４９を参照）。
【００２６】
病変部位でのＴｈ１型サイトカインの産生量は、非病変部位の産生量の５倍以上であることが適当であり、１０倍以上であることが好ましく、４０倍以上であることがより好ましい。
【００２７】
病変部位のＴｈ１型サイトカインの産生量は、病変部位のＴｈ２型サイトカインの産生量の１０倍以上であることが適当であり、５０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましい。
【００２８】
病変部位のＩＬ−２３の産生量は、非病変部位の産生量の５倍以上であることが適当であり、１０倍以上であることが好ましく、２０倍以上であることがより好ましい。
【００２９】
病変部位の活性型ＳＴＡＴ３の活性は、非病変部位の活性の３倍以上であることが適当であり、５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることがより好ましい。
【００３０】
II．本発明スクリーニング方法
【００３１】
本発明スクリーニング方法における「被験物質の投与方法」は、適宜選択することができる。例えば、静脈、経口、経皮、皮内、皮下、筋肉、髄腔、腹腔又は気道から被験物質を投与することができる。また、投与回数も適宜選択することができる。例えば、単回、反復又は持続的に投与することができる。
【００３２】
本発明スクリーニング方法における「治療効果を調べる方法」としては、例えば、肉眼により皮膚炎の症状を観察する方法、病変部位の組織切片を観察する方法、病変部位における角化細胞が産生する因子を測定する方法、病変部位におけるＴリンパ球が産生する因子を測定する方法、病変部位における単球系細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞）が産生する因子を測定する方法を挙げることができる。
【実施例】
【００３３】
以下に、調製例、実施例、比較例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
【００３４】
調製例１ ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来の単核球懸濁液の調製
皮膚炎を発症したＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス（１８〜２５週齢、雌）（日本新薬社製）を頚椎脱臼法により安楽死させた後、脾臓を採取した。採取した脾臓を、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、「無血清培地」という）１ｍＬを入れたシャーレに入れ、氷上にて２枚のスライドガラスで挟み、穏やかにすり潰した。
得られた懸濁液に９ｍＬの無血清培地を加え、格子径１００μｍのナイロンメッシュを通し、大きな組織片を除去した。得られた懸濁液を８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した後、沈降した細胞分画を１ｍＬの赤血球溶解液（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で懸濁し、氷上で５分間放置し、赤血球を溶血させた。そこに０．５％牛胎仔血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ社製）、２ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を含むリン酸緩衝液（以下、「緩衝液Ａ」という）９ｍＬを加え、格子径４０μｍのナイロンメッシュを通し、溶血した赤血球の凝固塊を除去した。得られた懸濁液を８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した後、沈降した細胞分画を１５ｍＬの緩衝液Ａで懸濁し、格子径４０μｍのナイロンメッシュを通すことにより、単核球懸濁液を調製した。
【００３５】
調製例２ ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来のＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、調製例１で調製した単核球懸濁液よりＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球を除去することにより、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
得られたＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球中の総細胞数を測定した。また、ＰＥ（Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識した抗マウスＣＤ２５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識した抗マウスＣＤ４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、以下同じ）により純度を測定した。その結果、純度は９０％以上であった。
【００３６】
調製例３ ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来のＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
調製例１で調製した単核球１×１０８個を３４０μＬの緩衝液Ａに懸濁し、そこへ５０μＬのＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、以下同じ）及び１１０μＬのＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、以下同じ）を加え、遮光下で、４℃にて２０分間静置した。
その後、５ｍＬの緩衝液Ａを加え細胞を洗浄し、８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。同様の操作を繰り返した。沈降した細胞分画を３００μＬの緩衝液Ａで懸濁し、１００μＬの抗ＰＥマイクロ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）と１００μＬの抗ＦＩＴＣマイクロ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とを加え、遮光下で、４℃にて１５分間静置した。
その後、５ｍＬの緩衝液Ａを加え細胞を洗浄し、８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。沈降した細胞分画を５００μＬの緩衝液Ａで懸濁し、磁性体カラムＬＤ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）及び磁力分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、単核球分画よりＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体及びＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体で標識した細胞を除去することにより、ＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
得られたＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液中の総細胞数を測定した。また、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体及びＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体を用いて、フローサイトメーターにより純度を測定した。その結果、純度は９０％以上であった。
【００３７】
調製例４ ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
（１）単核球懸濁液の調製
ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスの代わりにＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス（１８〜２２週齢、雌）（日本クレア社製）を用いて、調製例１と同様に単核球懸濁液を調製した。
（２）ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
上記（１）で調製した単核球懸濁液を用いて、調製例２と同様にＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
【００３８】
調製例５ Ａｌｙ／Ｎｓｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来のＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
（１）単核球懸濁液の調製
ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスの代わりにＡｌｙ／Ｎｓｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス（２８週齢、雌）（日本クレア社製）を用いて、調製例１と同様に単核球懸濁液を調製した。
（２）ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
上記（１）で調製した単核球懸濁液を用いて、調製例２と同様にＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
【００３９】
実施例１ 本発明マウスの作成（１）
調製例１で調製した単核球懸濁液を用いて、２．５×１０８個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液をＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス（８〜１０週齢、雌）（日本クレア社製）の尾静脈より投与することにより、本発明マウスを作成した。なお、本発明マウスは、ＳＰＦ環境下で飼育した。
【００４０】
実施例２ 本発明マウスの作成（２）
調製例２で調製した単核球懸濁液を用いて、５×１０６個〜５×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に本発明マウスを作成した。
【００４１】
実施例３ 本発明マウスの作成（３）
調製例３で調製した単核球懸濁液を用いて、１×１０７個〜２．５×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に本発明マウスを作成した。
【００４２】
実施例４ 本発明マウスの作成（４）
調製例４で調製した単核球懸濁液を用いて、５×１０６個〜１×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に本発明マウスを作成した。
【００４３】
比較例１ 比較対照用マウスの作成
調製例５で調製した単核球懸濁液を用いて、５×１０６個〜１×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に比較対照用マウスを作成した。
【００４４】
試験例１ 皮膚炎発症の評価
実施例１で作成した本発明マウスは、移植後８〜１０週で、全例（３匹）に眼周囲の発赤が認められた。実施例２で作成した本発明マウスは、移植後４〜６週で、全例（２１匹）に眼周囲の発赤が認められた。実施例３で作成した本発明マウスは、移植後３〜４週で、全例（４匹）に眼周囲の発赤が認められた。実施例４で作成した本発明マウスは、移植後１５週目で、６匹中３匹に眼周囲の発赤が認められた。なお、比較例１で作成した比較対照用マウスは、移植後２５週を経過しても皮膚炎を発症しなかった。
実施例１〜４で作成した本発明マウスは、発症後も６ヶ月以上にわたり皮膚炎症状を維持しながら生存した。
【００４５】
試験例２ 病理所見の評価
実施例２で作成した本発明マウスを移植後８週間飼育した後、病変部位等の組織像を病理学的に評価した。
（１）評価方法
皮膚病変部位として後背部皮膚、四肢内側皮膚、腹側皮膚、鼻周辺部及び耳介を、一般臓器として胸腺、肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、顎下リンパ節、腸間膜リンパ節、心臓、小腸及び唾液腺をそれぞれ評価した。各組織は、常法に従い、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。なお、評価には、９匹の本発明マウスを用いた。
（２）結果
図１、２に本発明マウスの後背部皮膚及び耳介のヘマトキシリン・エオジン染色した組織像をそれぞれ示す。
観察した全ての個体で、後背部皮膚の上皮の肥厚が認められた。内、６匹については、角化細胞の分化異常及び増殖が認められた。本発明マウス８匹で、真皮層に単球、マクロファージ様細胞、好中球、リンパ球様細胞等の炎症性細胞の浸潤が認められた。四肢内側皮膚、腹側皮膚、鼻周辺部及び耳介においても同様の所見が認められた。なお、全ての個体において病変部位への好酸球、肥満細胞の浸潤は認められなかった。
観察した全ての個体で、リンパ節の皮質−髄質境界領域に炎症性細胞の浸潤が認められた。本発明マウス８匹で、肝臓の胆管周囲に軽度の炎症性細胞の浸潤が認められた。本発明マウス５匹で、膵臓の小葉膵管に軽度の炎症性細胞の浸潤が認められた。また、本発明マウス３匹で、下顎腺に炎症性細胞の浸潤が認められた。その他の組織では、異常な所見は認められなかった。
【００４６】
試験例３ サイトカインの産生量の評価
実施例２で作成した本発明マウスの後背部皮膚におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２３の産生量を評価した。
（１）評価方法
ｉ）組織抽出液の調製
実施例２で作成した本発明マウスを頚椎脱臼法により安楽死させた後、後背部皮膚より直径１１ｍｍの円形領域を採取した。蛋白分解酵素阻害剤［Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ社製］を溶解した生理食塩水（大塚製薬社製）１ｍＬ中で、採取した組織を氷上で約７等分し、これを５ｍＬのプラスチックチューブに移し、ホモジナイザー（ＮＳ−３１０Ｅ；ＮＩＴＩ−ＯＮ社製、以下同じ）を用いて粉砕した。更に、超音波粉砕機（ＳＯＮＩＦＥＲ ２５０；ＢＲＡＮＳＯＮ社製、以下同じ）を用いて粉砕した後、１．５ｍＬのチューブに移し、１３，０００×ｇ、４℃の条件下で２０分間遠心し、組織抽出液を得た。
なお、陰性対照として、移植を行っていないＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの後背部皮膚を用いた。
ｉｉ）サイトカインの産生量の測定
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２３の産生量は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２３；ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＩＬ−４；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付文書に従い測定した。
（２）結果
図３に示すように、本発明マウスの後背部皮膚（病変部位）におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２３の産生量は、陰性対照の産生量より高かった。一方、ＩＬ−４の産生量は、本発明マウスと陰性対照との間で差はなかった。また、病変部位において、ＩＦＮ−γの産生量は、ＩＬ−４の産生量より高かった。
【００４７】
試験例４ 過剰創傷治癒現象の評価
実施例２で作成した本発明マウスにおける過剰創傷治癒現象を、活性型ＳＴＡＴ３の活性及び組織像から評価した。
（１）評価方法
ｉ）核抽出液の調製
実施例２で作成した本発明マウスを頚椎脱臼法により安楽死させた後、後背部非病変皮膚（部位１）、後背部病変皮膚（部位２）より直径１１ｍｍの円形領域を採取した。また、実施例２で作成した本発明マウスの後背部を刷毛し、外見上皮膚炎を発症していない臀部に近い部位をプラスチック片で１０回軽く擦過した。この操作を３日おきに３回繰り返し、最終擦過の１週間後に安楽死させた後、後背部非病変部位（部位３）より同様にして円形領域を採取した。
採取した組織を、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）のＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（以下、「緩衝液Ｂ」という）１ｍＬ中で、氷上で約７等分し、これを５ｍＬのプラスチックチューブに移し、ホモジナイザーを用いて粉砕した。８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した後、上清を除去し、１ｍＬの緩衝液Ｂで懸濁した。再度、ホモジナイザーを用いた粉砕工程及び遠心分離操作を行った。得られた沈降画分を３００μＬの緩衝液Ｂで懸濁し、超音波粉砕機を用いて更に粉砕した後、１３，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。得られた上清を０．４５μｍのフィルターに通し、核抽出液を得た。
なお、陰性対照として、移植を行っていないＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの後背部皮膚を用いた。
ｉｉ）活性型ＳＴＡＴ３の活性の測定
活性型ＳＴＡＴ３の活性は、Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＳＴＡＴ３ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）を用いて、添付文書に従い測定した。
（２）結果
図４に示すように、本発明マウスの後背部病変皮膚（部位２）及び後背部非病変皮膚（部位３）における活性型ＳＴＡＴ３の活性は、陰性対照及び後背部非病変皮膚（部位１）における活性型ＳＴＡＴ３の活性より高かった。また、本発明マウスの後背部非病変皮膚（部位１）における活性型ＳＴＡＴ３の活性は、陰性対照における活性型ＳＴＡＴ３の活性より高かった。
図５に示すように、本発明マウスの後背部非病変皮膚（部位３）のヘマトキシリン・エオジン染色した組織像から、当該部位では自然発症した病変部位と同様の表皮の肥厚、角化細胞の分化異常、過増殖が認められた。
以上より、本発明マウスには、非病変部位において過剰創傷治癒現象を生じることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明マウスの後背部皮膚の組織像を表す。
【００４９】
【図２】図２は、本発明マウスの耳介の組織像を表す。
【００５０】
【図３】図３は、サイトカインの産生量を表す。縦軸は吸光度を示す。
【００５１】
【図４】図４は、活性型ＳＴＡＴ３の活性を表す。縦軸は吸光度を示す。
【００５２】
【図５】図５は、本発明マウスの後背部皮膚の組織像を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な自己免疫性皮膚炎発現マウスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫性皮膚炎の病態は、複数の因子により形成されることが知られている。例えば、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）、ＩＫＫ２（ＩκＢ ｋｉｎａｓｅ ２）が病態の形成に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
【０００３】
これまでにも自己免疫性皮膚炎を発現するマウスが報告されている。例えば、特定の遺伝子発現を人為的に操作することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウス、特定の細胞集団を免疫不全マウスに移植することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウスが報告されている。
具体的には、特定の遺伝子発現を人為的に操作することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウスとしては、角化細胞特異的にＳＴＡＴ３を発現するトランスジェニックマウス、上皮細胞特異的にＩＫＫ２をノックアウトしたマウスが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。また、特定の細胞集団を免疫不全マウスに移植することにより自己免疫性皮膚炎を発現するマウスとしては、ｍｉｎｏｒ ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ：主要組織適合性抗原）が不適合なマウスのＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴリンパ球をＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに移植したマウス、インターフェロン−γをノックアウトしたＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴリンパ球をＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに移植したマウスが報告されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４を参照）。
【０００４】
しかしながら、上述したように自己免疫性皮膚炎は複数の因子により病態が形成されるものであるため、特定の遺伝子発現を人為的に操作した病態発現マウスが発症する自己免疫性皮膚炎が、ヒト等での自己免疫性皮膚炎を正確に反映しているか否かは不明である。また、上述したＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴリンパ球を免疫不全マウスに移植したマウスは、重篤な慢性炎症性腸炎を発症するために移植後の生存期間は短い。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｉｇｅｔｏｓｈｉ Ｓａｎｏら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、２００５年、１１巻、ｐ．４３−４９
【非特許文献２】Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ Ｓｔｒａｔｉｓら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、２００６年、１１６巻、ｐ．２０９４−２１０４
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｐ．Ｓｃｈｏｎら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、１９９７年、３巻、ｐ．１８３−１８８
【非特許文献４】Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｈｏｎｇら、“Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９９年、１６２巻、ｐ．７４８０−７４９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、主として、新規な自己免疫性皮膚炎発現マウス、及び当該マウスを用いた自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、例えば、下記１、２に記載の発明を見出し、本発明を完成した。
１．ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の単核球を免疫不全マウスに移植することにより得られる自己免疫性皮膚炎発現マウス（以下、「本発明マウス」という）。
２．上記１のマウスに被験物質を投与し、当該被験物質による、自己免疫性皮膚炎の治療効果を調べることを含む、自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法（以下、「本発明スクリーニング方法」という）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
Ｉ．本発明マウス
【０００９】
本発明における「自己免疫性皮膚炎」は、主にＴヘルパー１（以下、「Ｔｈ１」という）型の炎症性細胞が病態の形成に関与する皮膚炎を意味する。自己免疫性皮膚炎としては、例えば、乾癬、急性皮膚炎、慢性皮膚炎、扁平苔癬又は菌状息肉症を挙げることができる。
【００１０】
Ｔｈ１型の炎症性細胞としては、例えば、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球を挙げることができる。
【００１１】
本発明マウスの作成に用い得る「ＢＡＬＢ／ｃ系マウス」としては、特に制限されず、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ系の各亜系マウス、ＢＡＬＢ／ｃＢ系の各亜系マウス及びＢＡＬＢ／ｃＣｒマウスを挙げることができる。それらの中で、特にＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスが好ましい。なお、ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスは、日本新薬株式会社より入手することが可能である。また、平成１９年４月からは、日本クレア株式会社から販売される予定であるから、そこから入手することも可能である。
【００１２】
本発明マウスの作成に用い得る「単核球」としては、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の単核球であれば特に制限されず、例えば、ＣＤ２５（−）単核球、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球及びＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球を挙げることができる。それらの中で、特にＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球及びＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球が好ましい。
【００１３】
上記「単核球」の調製方法としては、特に制限されず、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓、骨髄、リンパ節、末梢血又は胸腺を用いて、常法により調製することができる。
【００１４】
ＣＤ２５（−）単核球又はＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球は、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓より調製した単核球より、蛍光標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体及び／又は抗マウスＣＤ２５抗体を用いて、常法により調製することができる。
【００１５】
ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球は、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓より調製した単核球より、市販のキットを用いて、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）単核球を除去することにより調製することができる。
【００１６】
本発明マウスの作成に用い得る「免疫不全マウス」としては、特に制限されず、例えば、市販されている免疫不全マウスや、特許文献又は非特許文献で報告されている免疫不全マウスを挙げることができる。市販されている免疫不全マウスとしては、例えば、Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−マウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｂ２ｍ−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ２）マウス、ＡＦ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｆ３４４Ｎ−ｒｎｕ／ｒｎｕマウス、ＣＴＳ／Ｓｈｉマウス及びＫＳＮマウスを挙げることができる。それらの中で、特にＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスが好ましい。
【００１７】
単核球の移植方法としては、特に制限されず、例えば、尾静脈、腹腔又は皮下より投与する方法を挙げることができる。それらの中で、特に尾静脈より投与する方法が好ましい。
【００１８】
免疫不全マウスに移植する単核球の細胞数としては、移植する単核球の性質や免疫不全マウスの種類、性別、週齢等により異なるが、例えば、１×１０６個〜１×１０８個の範囲内が適当であり、５×１０６個〜１×１０８個の範囲内が好ましく、１×１０７個〜５×１０７個の範囲内がより好ましい。
【００１９】
本発明マウスの飼育条件は、例えば、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）条件下で飼育することができる。
【００２０】
本発明マウスは、下記（１）〜（３）の特徴を有する：
（１）自己免疫性皮膚炎を自然発症すること、
（２）皮膚炎発症後６ヶ月以上生存すること、
（３）病変が皮膚に限局すること。
【００２１】
また、本発明マウスは、上記（１）〜（３）の特徴に加えて、下記（１）〜（８）の特徴を有していることが好ましい：
（１）病変部位の表皮が肥厚（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）すること、
（２）病変部位の角化細胞が分化異常（Ｐａｒａｋｅｒａｔｏｓｉｓ）、過増殖（Ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）を起こすこと、
（３）病変部位にＴｈ１型の炎症性細胞が浸潤すること、
（４）病変部位のＴｈ１型サイトカインの産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（５）病変部位において、Ｔｈ１型サイトカインの産生量が、Ｔヘルパー２（以下、「Ｔｈ２」という）型サイトカインの産生量の１０倍以上であること、
（６）病変部位のインターロイキン（以下、「ＩＬ」という）−２３の産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（７）病変部位の活性型ＳＴＡＴ３の活性が、非病変部位の活性の３倍以上であること、
（８）非病変部位において、過剰創傷治癒現象（Ｋｏｅｂｎｅｒ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）が生じること。
【００２２】
上記「自然発症する」とは、特定の遺伝子発現を人為的に操作することなく、ＳＰＦ環境下で自然に症状が生じることをいう。
【００２３】
Ｔｈ１型のサイトカインとしては、例えば、インターフェロン（以下、「ＩＦＮ」という）−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−βを挙げることができる。
【００２４】
Ｔｈ２型のサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を挙げることができる。
【００２５】
上記「過剰創傷治癒現象」とは、皮膚炎を発症している動物の非病変部位に物理的、化学的、生物的な刺激（例えば、擦過、紫外線、薬剤、のみ、ダニ）が加わることによりその部位が病変化する現象をいう。なお、角化細胞に活性型ＳＴＡＴ３を過剰発現させることにより、過剰創傷治癒現象が生じることが報告されている（例えば、Ｓｉｇｅｔｏｓｈｉ Ｓａｎｏら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、２００５年、１１巻、ｐ．４３−４９を参照）。
【００２６】
病変部位でのＴｈ１型サイトカインの産生量は、非病変部位の産生量の５倍以上であることが適当であり、１０倍以上であることが好ましく、４０倍以上であることがより好ましい。
【００２７】
病変部位のＴｈ１型サイトカインの産生量は、病変部位のＴｈ２型サイトカインの産生量の１０倍以上であることが適当であり、５０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましい。
【００２８】
病変部位のＩＬ−２３の産生量は、非病変部位の産生量の５倍以上であることが適当であり、１０倍以上であることが好ましく、２０倍以上であることがより好ましい。
【００２９】
病変部位の活性型ＳＴＡＴ３の活性は、非病変部位の活性の３倍以上であることが適当であり、５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることがより好ましい。
【００３０】
II．本発明スクリーニング方法
【００３１】
本発明スクリーニング方法における「被験物質の投与方法」は、適宜選択することができる。例えば、静脈、経口、経皮、皮内、皮下、筋肉、髄腔、腹腔又は気道から被験物質を投与することができる。また、投与回数も適宜選択することができる。例えば、単回、反復又は持続的に投与することができる。
【００３２】
本発明スクリーニング方法における「治療効果を調べる方法」としては、例えば、肉眼により皮膚炎の症状を観察する方法、病変部位の組織切片を観察する方法、病変部位における角化細胞が産生する因子を測定する方法、病変部位におけるＴリンパ球が産生する因子を測定する方法、病変部位における単球系細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞）が産生する因子を測定する方法を挙げることができる。
【実施例】
【００３３】
以下に、調製例、実施例、比較例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
【００３４】
調製例１ ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来の単核球懸濁液の調製
皮膚炎を発症したＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス（１８〜２５週齢、雌）（日本新薬社製）を頚椎脱臼法により安楽死させた後、脾臓を採取した。採取した脾臓を、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、「無血清培地」という）１ｍＬを入れたシャーレに入れ、氷上にて２枚のスライドガラスで挟み、穏やかにすり潰した。
得られた懸濁液に９ｍＬの無血清培地を加え、格子径１００μｍのナイロンメッシュを通し、大きな組織片を除去した。得られた懸濁液を８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した後、沈降した細胞分画を１ｍＬの赤血球溶解液（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で懸濁し、氷上で５分間放置し、赤血球を溶血させた。そこに０．５％牛胎仔血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ社製）、２ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を含むリン酸緩衝液（以下、「緩衝液Ａ」という）９ｍＬを加え、格子径４０μｍのナイロンメッシュを通し、溶血した赤血球の凝固塊を除去した。得られた懸濁液を８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した後、沈降した細胞分画を１５ｍＬの緩衝液Ａで懸濁し、格子径４０μｍのナイロンメッシュを通すことにより、単核球懸濁液を調製した。
【００３５】
調製例２ ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来のＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、調製例１で調製した単核球懸濁液よりＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球を除去することにより、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
得られたＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球中の総細胞数を測定した。また、ＰＥ（Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識した抗マウスＣＤ２５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識した抗マウスＣＤ４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、以下同じ）により純度を測定した。その結果、純度は９０％以上であった。
【００３６】
調製例３ ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来のＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
調製例１で調製した単核球１×１０８個を３４０μＬの緩衝液Ａに懸濁し、そこへ５０μＬのＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、以下同じ）及び１１０μＬのＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、以下同じ）を加え、遮光下で、４℃にて２０分間静置した。
その後、５ｍＬの緩衝液Ａを加え細胞を洗浄し、８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。同様の操作を繰り返した。沈降した細胞分画を３００μＬの緩衝液Ａで懸濁し、１００μＬの抗ＰＥマイクロ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）と１００μＬの抗ＦＩＴＣマイクロ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とを加え、遮光下で、４℃にて１５分間静置した。
その後、５ｍＬの緩衝液Ａを加え細胞を洗浄し、８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。沈降した細胞分画を５００μＬの緩衝液Ａで懸濁し、磁性体カラムＬＤ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）及び磁力分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、単核球分画よりＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体及びＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体で標識した細胞を除去することにより、ＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
得られたＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液中の総細胞数を測定した。また、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｂ抗体及びＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体を用いて、フローサイトメーターにより純度を測定した。その結果、純度は９０％以上であった。
【００３７】
調製例４ ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
（１）単核球懸濁液の調製
ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスの代わりにＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス（１８〜２２週齢、雌）（日本クレア社製）を用いて、調製例１と同様に単核球懸濁液を調製した。
（２）ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
上記（１）で調製した単核球懸濁液を用いて、調製例２と同様にＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
【００３８】
調製例５ Ａｌｙ／Ｎｓｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス由来のＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
（１）単核球懸濁液の調製
ＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウスの代わりにＡｌｙ／Ｎｓｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス（２８週齢、雌）（日本クレア社製）を用いて、調製例１と同様に単核球懸濁液を調製した。
（２）ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液の調製
上記（１）で調製した単核球懸濁液を用いて、調製例２と同様にＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球懸濁液を調製した。
【００３９】
実施例１ 本発明マウスの作成（１）
調製例１で調製した単核球懸濁液を用いて、２．５×１０８個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液をＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス（８〜１０週齢、雌）（日本クレア社製）の尾静脈より投与することにより、本発明マウスを作成した。なお、本発明マウスは、ＳＰＦ環境下で飼育した。
【００４０】
実施例２ 本発明マウスの作成（２）
調製例２で調製した単核球懸濁液を用いて、５×１０６個〜５×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に本発明マウスを作成した。
【００４１】
実施例３ 本発明マウスの作成（３）
調製例３で調製した単核球懸濁液を用いて、１×１０７個〜２．５×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に本発明マウスを作成した。
【００４２】
実施例４ 本発明マウスの作成（４）
調製例４で調製した単核球懸濁液を用いて、５×１０６個〜１×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に本発明マウスを作成した。
【００４３】
比較例１ 比較対照用マウスの作成
調製例５で調製した単核球懸濁液を用いて、５×１０６個〜１×１０７個／２００μＬの細胞懸濁液を調製した。当該懸濁液を用いて、実施例１と同様に比較対照用マウスを作成した。
【００４４】
試験例１ 皮膚炎発症の評価
実施例１で作成した本発明マウスは、移植後８〜１０週で、全例（３匹）に眼周囲の発赤が認められた。実施例２で作成した本発明マウスは、移植後４〜６週で、全例（２１匹）に眼周囲の発赤が認められた。実施例３で作成した本発明マウスは、移植後３〜４週で、全例（４匹）に眼周囲の発赤が認められた。実施例４で作成した本発明マウスは、移植後１５週目で、６匹中３匹に眼周囲の発赤が認められた。なお、比較例１で作成した比較対照用マウスは、移植後２５週を経過しても皮膚炎を発症しなかった。
実施例１〜４で作成した本発明マウスは、発症後も６ヶ月以上にわたり皮膚炎症状を維持しながら生存した。
【００４５】
試験例２ 病理所見の評価
実施例２で作成した本発明マウスを移植後８週間飼育した後、病変部位等の組織像を病理学的に評価した。
（１）評価方法
皮膚病変部位として後背部皮膚、四肢内側皮膚、腹側皮膚、鼻周辺部及び耳介を、一般臓器として胸腺、肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、顎下リンパ節、腸間膜リンパ節、心臓、小腸及び唾液腺をそれぞれ評価した。各組織は、常法に従い、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。なお、評価には、９匹の本発明マウスを用いた。
（２）結果
図１、２に本発明マウスの後背部皮膚及び耳介のヘマトキシリン・エオジン染色した組織像をそれぞれ示す。
観察した全ての個体で、後背部皮膚の上皮の肥厚が認められた。内、６匹については、角化細胞の分化異常及び増殖が認められた。本発明マウス８匹で、真皮層に単球、マクロファージ様細胞、好中球、リンパ球様細胞等の炎症性細胞の浸潤が認められた。四肢内側皮膚、腹側皮膚、鼻周辺部及び耳介においても同様の所見が認められた。なお、全ての個体において病変部位への好酸球、肥満細胞の浸潤は認められなかった。
観察した全ての個体で、リンパ節の皮質−髄質境界領域に炎症性細胞の浸潤が認められた。本発明マウス８匹で、肝臓の胆管周囲に軽度の炎症性細胞の浸潤が認められた。本発明マウス５匹で、膵臓の小葉膵管に軽度の炎症性細胞の浸潤が認められた。また、本発明マウス３匹で、下顎腺に炎症性細胞の浸潤が認められた。その他の組織では、異常な所見は認められなかった。
【００４６】
試験例３ サイトカインの産生量の評価
実施例２で作成した本発明マウスの後背部皮膚におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２３の産生量を評価した。
（１）評価方法
ｉ）組織抽出液の調製
実施例２で作成した本発明マウスを頚椎脱臼法により安楽死させた後、後背部皮膚より直径１１ｍｍの円形領域を採取した。蛋白分解酵素阻害剤［Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ社製］を溶解した生理食塩水（大塚製薬社製）１ｍＬ中で、採取した組織を氷上で約７等分し、これを５ｍＬのプラスチックチューブに移し、ホモジナイザー（ＮＳ−３１０Ｅ；ＮＩＴＩ−ＯＮ社製、以下同じ）を用いて粉砕した。更に、超音波粉砕機（ＳＯＮＩＦＥＲ ２５０；ＢＲＡＮＳＯＮ社製、以下同じ）を用いて粉砕した後、１．５ｍＬのチューブに移し、１３，０００×ｇ、４℃の条件下で２０分間遠心し、組織抽出液を得た。
なお、陰性対照として、移植を行っていないＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの後背部皮膚を用いた。
ｉｉ）サイトカインの産生量の測定
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２３の産生量は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２３；ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＩＬ−４；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付文書に従い測定した。
（２）結果
図３に示すように、本発明マウスの後背部皮膚（病変部位）におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２３の産生量は、陰性対照の産生量より高かった。一方、ＩＬ−４の産生量は、本発明マウスと陰性対照との間で差はなかった。また、病変部位において、ＩＦＮ−γの産生量は、ＩＬ−４の産生量より高かった。
【００４７】
試験例４ 過剰創傷治癒現象の評価
実施例２で作成した本発明マウスにおける過剰創傷治癒現象を、活性型ＳＴＡＴ３の活性及び組織像から評価した。
（１）評価方法
ｉ）核抽出液の調製
実施例２で作成した本発明マウスを頚椎脱臼法により安楽死させた後、後背部非病変皮膚（部位１）、後背部病変皮膚（部位２）より直径１１ｍｍの円形領域を採取した。また、実施例２で作成した本発明マウスの後背部を刷毛し、外見上皮膚炎を発症していない臀部に近い部位をプラスチック片で１０回軽く擦過した。この操作を３日おきに３回繰り返し、最終擦過の１週間後に安楽死させた後、後背部非病変部位（部位３）より同様にして円形領域を採取した。
採取した組織を、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）のＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（以下、「緩衝液Ｂ」という）１ｍＬ中で、氷上で約７等分し、これを５ｍＬのプラスチックチューブに移し、ホモジナイザーを用いて粉砕した。８００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した後、上清を除去し、１ｍＬの緩衝液Ｂで懸濁した。再度、ホモジナイザーを用いた粉砕工程及び遠心分離操作を行った。得られた沈降画分を３００μＬの緩衝液Ｂで懸濁し、超音波粉砕機を用いて更に粉砕した後、１３，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。得られた上清を０．４５μｍのフィルターに通し、核抽出液を得た。
なお、陰性対照として、移植を行っていないＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの後背部皮膚を用いた。
ｉｉ）活性型ＳＴＡＴ３の活性の測定
活性型ＳＴＡＴ３の活性は、Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＳＴＡＴ３ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）を用いて、添付文書に従い測定した。
（２）結果
図４に示すように、本発明マウスの後背部病変皮膚（部位２）及び後背部非病変皮膚（部位３）における活性型ＳＴＡＴ３の活性は、陰性対照及び後背部非病変皮膚（部位１）における活性型ＳＴＡＴ３の活性より高かった。また、本発明マウスの後背部非病変皮膚（部位１）における活性型ＳＴＡＴ３の活性は、陰性対照における活性型ＳＴＡＴ３の活性より高かった。
図５に示すように、本発明マウスの後背部非病変皮膚（部位３）のヘマトキシリン・エオジン染色した組織像から、当該部位では自然発症した病変部位と同様の表皮の肥厚、角化細胞の分化異常、過増殖が認められた。
以上より、本発明マウスには、非病変部位において過剰創傷治癒現象を生じることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明マウスの後背部皮膚の組織像を表す。
【００４９】
【図２】図２は、本発明マウスの耳介の組織像を表す。
【００５０】
【図３】図３は、サイトカインの産生量を表す。縦軸は吸光度を示す。
【００５１】
【図４】図４は、活性型ＳＴＡＴ３の活性を表す。縦軸は吸光度を示す。
【００５２】
【図５】図５は、本発明マウスの後背部皮膚の組織像を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の単核球を免疫不全マウスに移植することにより得られる自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項２】
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスがＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ系の各亜系マウス、ＢＡＬＢ／ｃＢ系の各亜系マウス又はＢＡＬＢ／ｃＣｒマウスである、請求項１に記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項３】
移植される単核球がＣＤ２５（−）単核球である、請求項１又は２のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項４】
移植される単核球がＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球である、請求項１又は２のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項５】
移植される単核球がＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球である、請求項１又は２のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項６】
免疫不全マウスがＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−マウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｂ２ｍ−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ２）マウス、ＡＦ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｆ３４４Ｎ−ｒｎｕ／ｒｎｕマウス、ＣＴＳ／Ｓｈｉマウス又はＫＳＮマウスである、請求項１〜５のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項７】
自己免疫性皮膚炎が乾癬、急性皮膚炎、慢性皮膚炎、扁平苔癬又は菌状息肉症である、請求項１〜６のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項８】
次の（１）〜（３）の特徴を有する自己免疫性皮膚炎発現マウス：
（１）自己免疫性皮膚炎を自然発症すること、
（２）皮膚炎発症後６ヶ月以上生存すること、
（３）病変が皮膚に限局すること。
【請求項９】
更に次の（１）〜（８）の特徴を有する、請求項８に記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス：
（１）病変部位の表皮が肥厚すること、
（２）病変部位の角化細胞が分化異常、過増殖を起こすこと、
（３）病変部位にＴヘルパー１型の炎症性細胞が浸潤すること、
（４）病変部位のＴヘルパー１型のサイトカインの産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（５）病変部位において、Ｔヘルパー１型のサイトカインの産生量が、Ｔヘルパー２型のサイトカインの産生量の１０倍以上であること、
（６）病変部位のインターロイキン−２３の産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（７）病変部位での活性型ＳＴＡＴ３の活性が、非病変部位の活性の３倍以上であること、
（８）非病変部位において、過剰創傷治癒現象が生じること。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のマウスに被験物質を投与し、当該被験物質による、自己免疫性皮膚炎の治療効果を調べることを含む、自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
自己免疫性皮膚炎が乾癬、急性皮膚炎、慢性皮膚炎、扁平苔癬又は菌状息肉症である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の単核球を免疫不全マウスに移植することにより得られる自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項２】
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスがＢＡＬＢ／ｃ−ａｌｙ／ａｌｙマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ系の各亜系マウス、ＢＡＬＢ／ｃＢ系の各亜系マウス又はＢＡＬＢ／ｃＣｒマウスである、請求項１に記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項３】
移植される単核球がＣＤ２５（−）単核球である、請求項１又は２のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項４】
移植される単核球がＣＤ４（＋）ＣＤ２５（−）単核球である、請求項１又は２のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項５】
移植される単核球がＣＤ１１ｂ（−）ＣＤ２５（−）単核球である、請求項１又は２のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項６】
免疫不全マウスがＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−マウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｒａｇ１−／−Ｉｌ２−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｂ２ｍ−／−マウス、ＮＯＤ．ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ２）マウス、ＡＦ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ／ｎｕマウス、Ｆ３４４Ｎ−ｒｎｕ／ｒｎｕマウス、ＣＴＳ／Ｓｈｉマウス又はＫＳＮマウスである、請求項１〜５のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項７】
自己免疫性皮膚炎が乾癬、急性皮膚炎、慢性皮膚炎、扁平苔癬又は菌状息肉症である、請求項１〜６のいずれかに記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス。
【請求項８】
次の（１）〜（３）の特徴を有する自己免疫性皮膚炎発現マウス：
（１）自己免疫性皮膚炎を自然発症すること、
（２）皮膚炎発症後６ヶ月以上生存すること、
（３）病変が皮膚に限局すること。
【請求項９】
更に次の（１）〜（８）の特徴を有する、請求項８に記載の自己免疫性皮膚炎発現マウス：
（１）病変部位の表皮が肥厚すること、
（２）病変部位の角化細胞が分化異常、過増殖を起こすこと、
（３）病変部位にＴヘルパー１型の炎症性細胞が浸潤すること、
（４）病変部位のＴヘルパー１型のサイトカインの産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（５）病変部位において、Ｔヘルパー１型のサイトカインの産生量が、Ｔヘルパー２型のサイトカインの産生量の１０倍以上であること、
（６）病変部位のインターロイキン−２３の産生量が、非病変部位の産生量の５倍以上であること、
（７）病変部位での活性型ＳＴＡＴ３の活性が、非病変部位の活性の３倍以上であること、
（８）非病変部位において、過剰創傷治癒現象が生じること。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のマウスに被験物質を投与し、当該被験物質による、自己免疫性皮膚炎の治療効果を調べることを含む、自己免疫性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
自己免疫性皮膚炎が乾癬、急性皮膚炎、慢性皮膚炎、扁平苔癬又は菌状息肉症である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２２０２２９（Ｐ２００８−２２０２２９Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６１１９５（Ｐ２００７−６１１９５）
【出願日】平成１９年３月１２日（２００７．３．１２）
【出願人】（０００００４１５６）日本新薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１２日（２００７．３．１２）
【出願人】（０００００４１５６）日本新薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
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