自己自制ラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）株
【課題】環境的に制限された増殖および生存性を伴った組換ラクトコッカス株を提供する。
【解決手段】環境的に制限された増殖と生存可能性を所持した組換えラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）。特定の培地成分が存在する培地中でのみ生き残ることのできるラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）。好ましい実施態様は、該培地成分が存在している宿主生物中でのみ生存できるが、該培地成分のない宿主生物の外では生存できないラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）。該ラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）は、予防用及び／又は治療用分子で形質転換され、炎症性腸疾患の疾病治療に使用される。
【解決手段】環境的に制限された増殖と生存可能性を所持した組換えラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）。特定の培地成分が存在する培地中でのみ生き残ることのできるラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）。好ましい実施態様は、該培地成分が存在している宿主生物中でのみ生存できるが、該培地成分のない宿主生物の外では生存できないラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）。該ラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）は、予防用及び／又は治療用分子で形質転換され、炎症性腸疾患の疾病治療に使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境的に制限された増殖と生存可能性を所持した組換えラクトコッカス（Loctococcus）株に関するものである。特に、明確な培地成分が存在する培地中でのみ生き残ることのできるラクトコッカス（Loctococcus）に関するものである。好ましい実施態様は、該培地成分が存在している宿主生物中でのみ生存できるが、しかし、該培地成分のない宿主生物の外では生存できないラクトコッカス（Loctococcus）である。さらに、該ラクトコッカス（Loctococcus）は、予防用及び／又は治療用分子で形質転換され、そして、したがって炎症性腸疾患のような疾病治療に使用されうる。
【０００２】
発見の背景
乳酸菌は、長い間幅広くさまざまな産業的発酵製法で使われてきた。それらは、一般に安全とみなされる地位にあり、商業的に重要なたんぱく質生産のための潜在的に有効な生物となっている。実際、インターロイキン２のようないくつかの異種たんぱく質が、ラクトコッカス（Loctococcus spp）で首尾よく生産されている（Steidler et al., 1995）。しかしながら、そのような遺伝的に改良されたマイクロの生物が、環境中で生き残りそして広がることは望まれていない。遺伝的に改良された微生物の意図しない放出を避けるために、物理的封じ込めのための安全取り扱いおよび技術的必要条件のための特別なガイドラインが用いられている。これは、産業的発酵では有効であるかもしれないけれども、物理的封じ込めは、一般には十分とは考えられていない、そして、追加の生物学的封じ込め方法が環境中での遺伝的に改良された微生物の生存可能性を減らすためにとられている。生物学的封じ込めは、物理的封じ込めが困難又はさらに適応できないところの場合はきわめて重要である。これは、遺伝的に改良された微生物が生ワクチン又は治療用化合物の配送のための乗り物として使われるような応用の場合ではとりわけである。そのような応用が、たとえば、ＷＯ ９７／１４８０６で記述されている、これは、主題に組換え非侵襲性又は非病原性微生物のよるサイトカインのような生物学的活性ペプチドの配送を公開している。ＷＯ ９６／１１２７７は、治療用たんぱく質をコードする組換え微生物の投与による人を含めた動物への治療用化合物の配送を記述している。Steidler et al. (2000）は、インターロイキン１０を分泌する組換えLoctococcus lactisの投与による大腸炎の治療を記述している。そのような配送は、病気に犯された人又は動物の疾病の治療にはきわめて有効であるかもしれない、しかし、病気に犯されていない対象に入ったときに組換え微生物が、有害で病原性の微生物として働くかもしれない、そしてそのような意図しない微生物の広がりを避ける効果的な生物学的封じ込めが必要とされる。
【０００３】
宿主細胞に対する生物学的封じ込めシステムは、外部環境では存在しない又は低濃度で存在するような特別な増殖因子又は栄養素に対する宿主の厳密な要求性に基づいた受動的、又は、宿主が特異な環境条件下でのみ発現するプロモーターの制御下にある遺伝子でコードされる細胞致死機能により外部環境で殺される宿主のいわゆる自殺的遺伝的要素に基づいた能動的なものであってもよい。
【０００４】
受動的生物学的封じ込めシステムは、大腸菌や酵母のような微生物ではよく知られている。そのような大腸菌が、たとえば、ＵＳ１００４９５で公開されている。ＷＯ ９５／１０６１は、乳酸微生物のサプレッサー変異株および乳酸微生物での生物学的封じ込め手段としてそれらの使用を公開している、しかし、その場合、封じ込めは宿主株のレベルというよりもむしろプラスミドレベルで、そして宿主でのプラスミドを安定化するが、しかし遺伝的に改良された宿主自身に対する封じ込めを提供してはいない。
【０００５】
能動的な自殺システムは、幾人かの著者によって記述されている。そのようなシステムは、２つの要素：致死遺伝子及び致死遺伝子の発現を非許容条件下でスイッチを入れる制御配列からなる。ＷＯ ９５／１０６１４は、致死遺伝子として細胞膜で働く不完全そして／又は変異型黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のヌクレアーゼの使用を公開している。ＷＯ ９６／４０９４７は、細胞が許容条件下にあるとき発現しそして細胞が非許容条件下にあるときには発現しないか又は一時的な発現であるような必須遺伝子、そして／又は、その遺伝子の発現が細胞に致死でその致死遺伝子は細胞が非許容条件下にあるときに発現し、しかし、細胞が許容条件下にあるときには発現しないような致死遺伝子のどちらかの発現に基づいた環境的に制限された生存可能性を有する組換え細菌システムを公開している。ＷＯ ９９／５８６５２は、ｒｅｌＥ細胞毒素に基づいた生物学的封じ込めシステムを公開している。しかしながら、ほとんどのシステムは、大腸菌（Tedkin et al., 1995; Knudsen et al., 1995; Schweder et al., 1995）又はシュードモナス（Kaplan et al., 1999; Molino et al., 1998）に対して詳しく述べられている。いくつかの封じ込めシステムは理論的には乳酸菌に適用できるけれども、疾病の予防そして／又は治療のための予防用そして／又は治療用分子配送のために自己自制の形質転換ラクトコッカスの使用を可能にするラクトコッカスに対する特異的生物学的封じ込めシステムは記述されていない。
【０００６】
発明の記述
ラクトコッカスに対する適切な生物学的封じ込めシステムを提供することが本発明の目的である。
【０００７】
本発明の最初の概念は、欠陥チミジル酸合成酵素遺伝子を含むラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の単離株である。好ましくは、該欠損チミジル酸合成酵素遺伝子は、遺伝子破壊によって不活化される。さらにより好ましくは、該ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス（Lactcocuus lactis.）である。特別な実施態様は、ラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）株であり、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactcocuus lactis.）であり、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactcocuus lactis.）ＭＧ１３６３誘導株（ここではチミジル酸合成酵素遺伝子は、破壊されインターロイキン１０発現ユニットに置き換えられている）である。該インターロイキン１０発現ユニットは、これに限定されないが好ましくはヒトインターロイキン１０発現ユニット又はヒトインターロイキン１０をコードしている遺伝子である。
【０００８】
本発明のもうひとつの概念は、形質転換プラスミドが完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まない形質転換のための宿主としての上記の株の使用である。本発明の更なる別の概念は、完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まないプラスミドを含む上記のラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株である。本発明の別の概念は、インターロイキン１０のような予防用そして／又は治療用分子をコードする遺伝子又は発現ユニットを含むラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株に関する。結論的として、本発明は、また疾病を治療するために予防用そして／又は治療用分子およびそのようなものを配送するためのラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株の使用に関する。炎症性腸疾患のような疾病の治療のための該分子や方法を配送する方法は、この参照として本明細書に盛り込まれるSteidler等（Science 2000, 289:1352）およびSteidler等のＷＯ ９７／１４８０６およびＷＯ ００／２３４７１で詳細に説明されている。
本発明の別の概念は、上記のラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株を含む医療用調製物である。
【０００９】
ラクトコッカス・ラクティス・亜種ラクティス（Lactcocuus lactis.subsp lactis.）のチミジル酸合成酵素遺伝子（ｔｈｙＡ）は、Ross 等（1990a）によってクローン化された；その配列は、配列番号３および配列番号５に含まれる。ＥＰ０４０６００３は、選択マーカーとして抗生物質耐性を欠くがチミジル酸合成酵素遺伝子を保持するベクターを開示している。；同じベクターがRoss等（1990b）によって記述されている。しかしながら、このベクターは、記述されていないが適切なｔｈｙＡ変異を欠いているせいでラクトコッカス・ラクティス株では使用できない。本発明は、ラクトコッカスでの相同組換えを使用した遺伝子破壊によりそのような変異株を構築する方法を開示する。好ましい実施態様は、ｔｈｙＡ遺伝子が機能的なヒトインターロイキン１０発現カセットで破壊される。しかしながら、ｔｈｙＡ遺伝子の不活化又は不活性なチミジル酸合成酵素を生じる限りはどの構築も遺伝子破壊のために使用できることは明白である。限定されない例として、相同組換えは、遺伝子欠失、チミジル酸合成酵素の不活化型にいたる一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、又はたんぱく質の不完全型を生じるようなフレームシフト変異を生じてもよい。
【００１０】
そのようなラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）ｔｈｙＡ変異株は、純粋に物理的封じ込め以上の厳しい封じ込めを必要とする状況では形質転換のための宿主として非常に有効である。実際ｔｈｙＡ変異株は、チミジンそして／又はチミンのない又は限定濃度しかない環境では生存できない。そのような株が完全なｔｈｙＡ遺伝子を含まないそして変異を相補できないプラスミドで形質転換されたとき、形質転換株は、チミジン／チミンの乏しい環境では自殺的となる。そのような株は、発酵槽での物理的封じ込めに対する追加的防御として使用できる。さらに、本発明は、そのような株が動物体内での配送体として使用される場合では特に有効であることを開示している。実際、そのような形質転換株が、たとえば経口的に人を含め動物に与えられたとき、十分な高濃度のチミジン／チミンが存在する腸で生存し、そして該動物にとって有益であるかもしれないヒトインターロイキン１０のような同種又は異種たんぱく質を生産する。本発明は、さらに形質転換株が驚くべきことにコントロール株と同じスピードで腸を通過し、そして生存率の損失が実際コントロール株のそれと違いがないということを示した。しかしながら、該株が環境中にいったん分泌されると、たとえば糞便中においても、もはや生存することはできない。
【００１１】
形質転換プラスミドは、ｔｈｙＡ変異を相補できない限り任意のプラスミドでもあり得る。好ましくは、ひとつ又はそれ以上の興味ある遺伝子そしてひとつ又はそれ以上耐性マーカーを所持する自己複製型プラスミドか又は組み込み型プラスミドであってもよい。後者の場合、組み込み型プラスミドそれ自身がｔｈｙＡ部位で組み込みを起こすことによって、それによってｔｈｙＡ遺伝子は不活化するが、変異を作るために使われてもよい。おそらく、活性型ｔｈｙＡ遺伝子は、ｔｈｙＡターゲット部位への挿入を標的とするターゲット配列で両脇をはさまれた興味ある遺伝子又は遺伝子群からなるカセットによるダブル相同組換えによって置き換えられる。ターゲット部位で配列組み込みを得るためには、これら配列は、十分に長くそして十分に相同であることが極めて重要である。好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の少なくとも１００の連続ヌクレオチドそして逆側で配列番号２の少なくとも１００の連続ヌクレオチドからなり；より好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の少なくとも５００の連続ヌクレオチドそして逆側で配列番号２の少なくとも５００の連続ヌクレオチドからなり；最も好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１そして逆側で配列番号２からなり、又は、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１００ヌクレオチドそして逆側で配列番号２領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１００ヌクレオチドからなり、好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも５００ヌクレオチドそして逆側で配列番号２領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも５００ヌクレオチドからなり、最も好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１０００ヌクレオチドそして逆側で配列番号２領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１０００ヌクレオチドからなる。パーセンテージ同一は、Altschul等（1997）記載のブラスト（BLAST）で測定される。配列番号１に相同である配列の好ましい例は、配列番号７で与えられる。本発明の目的のために、配列番号１と配列番号７は交換可能である。ラクトコッカスの形質転換方法は、当業者に周知でありプロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションを含むがこれに限定されない。本発明記載の形質転換ラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）株は、予防用そして／又は治療用分子の配送に有効でありそして医薬用組成物で使用できる。そのような分子の配送は、非限定例として、ＷＯ ９７／１４８０６そしてＷＯ ９８／３１７８６で開示されている。予防用そして／又は治療用分子には、限定されないが、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、グループ１サイトカイン、グループ２サイトカインそしてグループ３サイトカインのようなポリペプチドそして病原細菌からの多糖抗原のような多糖を含む。好ましい実施態様には、ヒトインターロイキン１０を配送するための上記のラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）株の使用がある。この株は、上記で示めされるクローン病を治療するための薬剤製造で使用されうる。
【００１２】
実施例
ラクトコッカス・ラクティス（ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis））MG1363（Gasson, 1983）から、Ross等（1990a）記載の配列隣接領域をクローン化した。
【００１３】
これらの配列の知見は、ｔｈｙＡの５′末端（配列番号１）の１０００bp範囲と３′末端（配列番号２）の１０００bp範囲、すなわち“ｔｈｙＡターゲット”でのダブル相同組換えを用いるので、以下で述べるように全てのラクトコッカス株を遺伝子工学するためには決定的に重要である。この配列は、今日まで公の供給源から入手できない。われわれ、これらの隣接ＤＮＡ断片をクローン化しそれら配列を同定した。全遺伝子座の配列は、配列番号３に示される；この配列の変異版が配列番号５に示される。５′と３′配列の両方とも、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＩＬ１４０３の配列（Bolotin、印刷中）を登録しているジーンバンク（genebank）のＡＥ００６３８５の配列又はラクトコッカス・ラクティス・亜種ラクティス（L. lactis subsp. lactis）ＣＨＣＣ３７３配列の登録ＡＦ３３６３６８の配列とは異なっている。文献から、公開のｈｙＡ隣接配列（Ross et al., 1990a）（５′末端の８６bpと３′末端の３１bp）を使用した相同組換えが配列の短さから実質的に不可能であることは明らかである。実際、Biswas等は、相同配列の長さと組み込み頻度間の対数的減少関係を記述している。本発明で決定されたｔｈｙＡ座のラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１１、Ｔｈｙ１２、、Ｔｈｙ１５そしてＴｈｙ１６の配列が、それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２で与えられる。
【００１４】
ｔｈｙＡの置換は、以下の述べるようにｔｈｙＡターゲットバージョンを保持するプラスミドで適切な置換することによってなされた。キャリアープラスミドはｐＯＲＩ１９（Law et al., 1995）複製欠損プラスミドの誘導体であり、これは、ｔｈｙＡターゲットの５′１０００bpまたは３′１０００bpのどちらかで最初の相同組換えする時に、エリスロマイシン耐性を所定の株に移すだけである。ｔｈｙＡターゲットの３′１０００bpまたは５′１０００bpでの２回目の相同組換えで望みの株は生じる。
【００１５】
ｔｈｙＡ遺伝子は、（ａ）ヒトインターロイキン１０（ｈＩＬ−１０）の成熟部分、又は（ｂ）２位のプロリンがアラニンに置換されたｈＩＬ−１０の成熟部分、又は（ｃ）最初の２アミノ酸が欠失したｈＩＬ−１０の成熟部分：以外の同一アミノ酸配列のたんぱく質に融合するラクトコッカス・ラクティス（L. lactis））のＵｓｐ４５分泌リーダー（van Asseldonk et al., 1990）を有するたんぱく質をコードする合成遺伝子で置換される；（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はｈＩＬ−１０類似体と呼ばれ、その融合産物は、Ｕｓｐ４５−ｈＩＬ−１０と呼ばれる。
ｔｈｙＡ遺伝子は、ラクトコッカル（lactococcal）Ｐ１プロモーター（Waterfield et al., 1995）、大腸菌バクテリアファージＴ７発現シグナル：推定ＲＮＡ安定化配列および改変遺伝子１０リボゾーム結合部（Wells and Schofield, 1996）を含む発現ユニットで置換される。
【００１６】
５′末端での挿入はｔｈｙＡのＡＴＧがＰ１−Ｔ７Ｕｓｐ４５−ｈＩＬ１０発現ユニットに融合されるような方法でなされる。
【００１７】
5'agataggaaaatttcatgacttacgcagatcaagttttt. . .thyA野生型
gattaagtcatcttacctctt. . .P1-T7-usp45-hIL10
5'agataggaaaatttcatggattaagtcatcttacctctt. . .thyA-,P1-T7-usp45-hIL10
【００１８】
あるいは、５′末端での挿入はｔｈｙＡのＡＴＧが含まないような方法でなされる。
【００１９】
5'agataggaaaatttcacttacgcagatcaagttttt. . .thyA野生型
gattaagtcatcttacctctt. . .P1-T7-usp45-hIL10
5'agataggaaaatttcgattaagtcatcttacctctt. . .thyA-,P1-T7-usp45-hIL10
【００２０】
あるいは、５′末端での挿入はｔｈｙＡプロモーター（Ross, 1990a）が含まないような方法でなされる。
【００２１】
5'tctgagaggttattttgggaaatactattgaaccatatcgaggtgtgtggtataatgaagggaattaaaaaagataggaaaatttcatg. . .thyA野生型
gattaagtcatcttacctctt. .P1-T7-usp45-hIL10
5'tctgagaggttattttgggaaatactagattaagtcatcttacctctt. . .thyA-, P1-T7-usp45-hIL10
【００２２】
３′末端のＡＣＴＡＧＴ ＳｐｅＩ制限部位が、ｕｓｐ４５−ｈＩＬ１０配列のＴＡＡ停止コドンの間近に接して設計された。これが、ｔｈｙＡ停止コドンのすぐ次に設計されているＴＣＴＡＧＡ ＸｂａＩ制限部位で連結された。
【００２３】
aaaatccgtaactaactagt3'...usp45-hIL10
gatttagcaatttaaattaaattaatctataagtt3'. . .thyA-野生型
tctagaattaatctataagttactga3'. . .設計thyAターゲット
aaaatccgtaactaactagaattaatctataagttactga3'. . . thyA-,usp45-hIL10
【００２４】
これら構造は、図２に示されている。ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、ｐＯＴｈｙ１１５及びｐＯＴｈｙ１６の配列が、配列番号２３、２４、２５、２６によってそれぞれ与えられている。
結果として生じた株は、ｔｈｙＡ欠損で、いまだラクトコッカス・ラクティス（L. lactis））で記述されていない変異株である。増殖のためにはチミン又はチミジン添加に厳密に依存している。
【００２５】
欠失の地図、及び本発明の単離株／変異株のすべてのＰＣＲ分析が、図３及び図４に示されている。野生型株及び独立した単離株／変異株のチミジル酸合成酵素及びインターロイキン１０遺伝子の存在は、図５および６に示されたようにサザンブロット分析によって分析された。挿入ｈＩＬ１０遺伝子周囲の領域がＰＣＲで単離されＤＮＡ配列が確認された。構造は予想配列と一致する。
【００２６】
変異株のヒトインターロイキン１０生産が、ウェスタンブロット分析でチェックされ、そして陰性コントロールとしてｐＴＲＥＸ１で形質転換された親株と陽性コントロールとしてＩＬ１０生産プラスミドｐＴ１ＨＩＬ１０ａｐｘａで形質転換された親株とで比較された（図７）。培養上清の濃度がＥＬＩＳＡを用いて定量された。図７Ｂで示されるように、変異の両単離株は、非組込み型プラスミドｐＴ１ＨＩＬ１０ａｐｘａの形質転換株よりかなり少ないが、比較しうる意義ある量のｈＩＬ１０を生産する。図８（パネルＡ及びＢ）は、さらにすべての変異株が意義ある量のＩＬ１０を生産していることを示している。
【００２７】
図９は、ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、又はｐＯＴｈｙ１６のいずれかを保持するラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）株ＬＬ１０８によるｈＩＬ１０の生産を示している。ｈＩＬ１０の定量（ＥＬＩＳＡによる）は、指定株の培養上清中の存在を示す。組換えｈＩＬ１０のＮ末端たんぱく質配列はエドマン分解によって決定されそして成熟組換えｈＩＬ１０について予測される構造との一致を示した。たんぱく質は十分な生物活性を示した。ＬＬ１０８は、ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、ｐＯＴｈｙ１５、又はｐＯＴｈｙ１６のようなｐＯＲＩ１９誘導プラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子をゲノムに組み込んでいるラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）株である。この株は、グローニンゲン（Groningen）大学のD r. Jan Kok、によって丁寧に示されている。プラスミドｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、ｐＯＴｈｙ１５、そしてｐＯＴｈｙ１６は、ｔｈｙＡ座の上流及び下流にｔｈｙＡ座から誘導されたゲノムＤＮＡのおよそ１ｋＢと隣接してさまざまなプロモーター構成（図２参照）で合成ヒトＩＬ１０遺伝子を有する。これらのプラスミドは、記述のゲノム組み込み構築のために使われた。
【００２８】
チミジン無し及びチミジン補給培地での増殖へのチミジル酸欠損効果が試験された；結果が図１０と１１にまとめられている。培地中のチミジンの不存在は、強く変異株の増殖を制限しそしてさらに培養４時間後でのコロニー形成単位の減少を引き起こした。培地へのチミジンの添加は、野生型株と比較して同一の増殖曲線およびコロニー形成単位を生じた、これはこの変異株がチミジン補給培地では増殖又は生存性に影響しないということを示している。図１１はＴｈｙ１２の生存性が、チミジンの不存在でひどく損なわれるということを明白に示している。図１２は、最終的にラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１２が、ＭＧ１３６３と同じスピードでマウスの腸を通過することを示している。生存性の損失はＴｈｙ１２とＭＧ１３６３間で違いは見られない。Ｔｈｙ１２は、増殖において完全にチミジン依存性であることをあらわし、Ｔｈｙ１２細菌が外部のｔｈｙＡ遺伝子を手に入れていないことを示している。
【００２９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＭＧ１３６３ ｔｈｙＡ 座の地図
【図２】ｈＩＬ−１０の遺伝子成分およびｐＯＴｈｙ プラスミド上に存在するさまざまな発現モジュールの表示概略図。黒部分は、本来のラクトコッカス・ラクティス（L. lactis） ＭＧ１３６３遺伝子情報を、白部分は組換え遺伝子情報を表している。
【図３】Ｔｈｙ１１のＰＣＲ同定（Ｔｈｙ１１ １．１およびＴｈｙ１１ ７．１は独立して得られた、同一クローンであることを表している）。標準的なＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型源として指定株の飽和培養液のアリコートを使ってなされた。パネルＡは、指定のＰＣＲ反応産物のアガロースゲルを示す。パネルＢは、プライマーが、ｔｈｙＡ（１）、上流（２）又は（３）下流ＰＣＲで付着する位置を示す。使われたオリゴヌクレオチドプライマー：（１）：ＡＴｇＡＣＴＴＡＣｇＣＡｇＡＴＣＡＡｇＴＴＴＴＴ及びＴＴＡＡＡＴＴｇＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴｇ、（２）：ＴＣＴｇＡＴＴｇＡｇＴＡＣＣＴＴｇＡＣＣ及びｇＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＴｇｇＴＴＴＴＡＴＴｇ、（３）：ＣＴＴＡＣＡＴｇＡＣＴＡＴｇＡＡＡＡＴＣＣｇ及びｃＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡｇｇｇＡＡＡｇＣＡ。
【図４】Ｔｈｙ１１、Ｔｈｙ１２、Ｔｈｙ１５及びＴｈｙ１６のＰＣＲ同定。標準ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型源として指定株の３日間培養コロニーを使ってなされた。パネルＡは、プライマーが、上流（１）、下流（２）又はｔｈｙＡ（３）ＰＣＲの付着する位置を示す。使われたオリゴヌクレオチド：（１）：ＡＴｇＡＣＴＴＡＣｇＣＡｇＡＴＣＡＡｇＴＴＴＴＴ及びＴＴＡＡＡＴＴｇＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴｇ、（２）：ＴＣＴｇＡＴＴｇＡｇＴＡＣＣＴＴｇＡＣＣ及びｇＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＴｇｇＴＴＴＴＡＴＴｇ、（３）：ＣＴＴＡＣＡＴｇＡＣＴＡＴｇＡＡＡＡＴＣＣｇ及びｃＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡｇｇｇＡＡＡｇＣＡ。パネルＢは、指定のＰＣＲ反応産物のアガロースゲルを示す。
【図５】指定株のサザンブロット分析。染色体ＤＮＡは、抽出されそして指定の制限酵素で消化される。アガロースゲル電気泳動に続いて、ＤＮＡは膜に移されそしてｔｈｙＡ座の周りの染色体構造がＤＩＧ標識ｔｈｙＡ又はｈＩＬ−１０ ＤＮＡ断片の使用によって明らかにされた（パネルＡ）。パネルＢは、ＭＧ１３６３およびＴｈｙ１１両方でのｔｈｙＡ座の推測構造の概略図を示す。
【図６】パネルＡは、ＭＧ１３６３、Ｔｈｙ１１、Ｔｈｙ１２、Ｔｈｙ１５及びＴｈｙ１６におけるｔｈｙＡ座でのラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）染色体推測構造の一部概略図を示す。パネルＢは、指定株のサザンブロット分析。染色体ＤＮＡは、抽出されそしてＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で消化される。アガロースゲル電気泳動に続いて、ＤＮＡは膜に移されそしてｔｈｙＡ座の周りの染色体構造がＤＩＧ標識ｔｈｙＡ又はｈＩＬ−１０ ＤＮＡ断片の使用によって明らかにされた。
【図７】ｈＩＬ−１０の生産。パネルＡは、抗ＩＬ−１０抗体で明らかにされた指定株の培養上清および細胞関連たんぱく質のウェスタンブロットを示す。パネルＢは、培養上清中に存在するｈＩＬ−１０の（ＥＬＩＳＡによる）定量を示す。
【図８】ｈＩＬ−１０の生産。パネルＡは、指定株の培養上清中に存在するｈＩＬ−１０の（ＥＬＩＳＡによる）定量を示す。パネルＢは、抗ＩＬ−１０抗体で明らかにされた指定株の培養上清たんぱく質のウェスタンブロットを示す。
【図９】ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、又はｐＯＴｈｙ１６いずれかを保持しているラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）株ＬＬ１０８によるｈＩＬ−１０の生産。指定株の培養上清中に存在するｈＩＬ−１０の（ＥＬＩＳＡによる）定量を示す。組換えＩＬ−１０のＮ−末端たんぱく質配列はエドマン分解法で決定されそして成熟組換えｈＩＬ−１０に対して予測される構造と一致を示した。このたんぱく質は、完全な生物学的活性を示した。
【図１０】１００μg/ml（Ｔ１００）５０μg/ml（Ｔ５０）２５μg/ml（Ｔ２５）又は無し（Ｔ０）の追加のチミジンを含みそしてあるいは５μg/ml（Ｅ）エリスロマイシンを補給されたＧＭ１７での指定株の増殖率。飽和終夜培養（Ｔ５０で調製された）は、指定培地で１００倍希釈された。パネルＡは、吸光度集積動態を示す。パネルＢは、培地ｍｌあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）数の動態を示す。
【図１１】チミジン無し培地（ＴＦＭ）でのＭＧ１３６３およびＴｈｙ１２の増殖率。ＴＦＭは、ＧＭ１７でラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１２菌を増殖し、続く遠心により菌を除去し、そして０．２２μｍ孔径フィルター上でろ過し、ｐＨを７．０に調整し、そして加圧滅菌することによって調製された。ＭＧ１３６３およびＴｈｙ１２菌は、それぞれＧＭ１７又は５０μg/mlのチミジン＋ＧＭ１７での終夜培養から集められ、そしてＭ９緩衝液（水に６g/l Ｎａ2ＨＰＯ4、３g/l ＫＨ2ＰＯ4、１g/l ＮＨ4Ｃｌ、０．５g/l ＮａＣｌ）で洗浄された両懸濁液は、ＴＦＭ又は５０μg/mlのチミジン（Ｔ５０）を補給されたＴＦＭのどちらかで希釈された。ＣＦＵ計測は、さまざまな時間ポイント：ｔ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０そして２０時間で測定された。これは、Ｔｈｙ１２の生存可能性がチミジン無しでひどく損なわれるということを示している。
【図１２】腸通過および生存可能性：ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３は、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性マーカーを所持しているプラスミドｐＬＥＴ２Ｎで形質転換された。ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１２は、エリスロマイシン（Ｅｍ）耐性マーカーを所持しているプラスミドｐＴ１ＮＸで形質転換された。両株の１０9の菌が、ＢＭ９（２５mM ＮａＨＣＯ3＋２５mM Ｎａ2ＣＯ3に６g/l Ｎａ2ＨＰＯ4、３g/l ＫＨ2ＰＯ4、１g/l ＮＨ4Ｃｌ、０．５g/l ＮａＣｌ）で再懸濁され、混合されそして３匹のマウスにｔ＝０時に接種された。糞便が、−１から０、０から１、１から２、２から３、３から４、４から５、５から６、６から７、７から８、８から９、９から１０、そして１０から終夜といった時間間隔で集められた。すべてのサンプルは、等張緩衝液に再懸濁しそして適当な希釈液が、Ｃｍ、Ｅｍ、又は５０μg/mlのチミジン＋Ｅｍのいずれかを含むＧＭ１７（０．５％グルコースで補給されたＭ１７培地、デフィコ（Difico）、セントルイス（St. Louis））プレート上に蒔かれた。さまざまなプレートのコロニー形成単位がグラフで表されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境的に制限された増殖と生存可能性を所持した組換えラクトコッカス（Loctococcus）株に関するものである。特に、明確な培地成分が存在する培地中でのみ生き残ることのできるラクトコッカス（Loctococcus）に関するものである。好ましい実施態様は、該培地成分が存在している宿主生物中でのみ生存できるが、しかし、該培地成分のない宿主生物の外では生存できないラクトコッカス（Loctococcus）である。さらに、該ラクトコッカス（Loctococcus）は、予防用及び／又は治療用分子で形質転換され、そして、したがって炎症性腸疾患のような疾病治療に使用されうる。
【０００２】
発見の背景
乳酸菌は、長い間幅広くさまざまな産業的発酵製法で使われてきた。それらは、一般に安全とみなされる地位にあり、商業的に重要なたんぱく質生産のための潜在的に有効な生物となっている。実際、インターロイキン２のようないくつかの異種たんぱく質が、ラクトコッカス（Loctococcus spp）で首尾よく生産されている（Steidler et al., 1995）。しかしながら、そのような遺伝的に改良されたマイクロの生物が、環境中で生き残りそして広がることは望まれていない。遺伝的に改良された微生物の意図しない放出を避けるために、物理的封じ込めのための安全取り扱いおよび技術的必要条件のための特別なガイドラインが用いられている。これは、産業的発酵では有効であるかもしれないけれども、物理的封じ込めは、一般には十分とは考えられていない、そして、追加の生物学的封じ込め方法が環境中での遺伝的に改良された微生物の生存可能性を減らすためにとられている。生物学的封じ込めは、物理的封じ込めが困難又はさらに適応できないところの場合はきわめて重要である。これは、遺伝的に改良された微生物が生ワクチン又は治療用化合物の配送のための乗り物として使われるような応用の場合ではとりわけである。そのような応用が、たとえば、ＷＯ ９７／１４８０６で記述されている、これは、主題に組換え非侵襲性又は非病原性微生物のよるサイトカインのような生物学的活性ペプチドの配送を公開している。ＷＯ ９６／１１２７７は、治療用たんぱく質をコードする組換え微生物の投与による人を含めた動物への治療用化合物の配送を記述している。Steidler et al. (2000）は、インターロイキン１０を分泌する組換えLoctococcus lactisの投与による大腸炎の治療を記述している。そのような配送は、病気に犯された人又は動物の疾病の治療にはきわめて有効であるかもしれない、しかし、病気に犯されていない対象に入ったときに組換え微生物が、有害で病原性の微生物として働くかもしれない、そしてそのような意図しない微生物の広がりを避ける効果的な生物学的封じ込めが必要とされる。
【０００３】
宿主細胞に対する生物学的封じ込めシステムは、外部環境では存在しない又は低濃度で存在するような特別な増殖因子又は栄養素に対する宿主の厳密な要求性に基づいた受動的、又は、宿主が特異な環境条件下でのみ発現するプロモーターの制御下にある遺伝子でコードされる細胞致死機能により外部環境で殺される宿主のいわゆる自殺的遺伝的要素に基づいた能動的なものであってもよい。
【０００４】
受動的生物学的封じ込めシステムは、大腸菌や酵母のような微生物ではよく知られている。そのような大腸菌が、たとえば、ＵＳ１００４９５で公開されている。ＷＯ ９５／１０６１は、乳酸微生物のサプレッサー変異株および乳酸微生物での生物学的封じ込め手段としてそれらの使用を公開している、しかし、その場合、封じ込めは宿主株のレベルというよりもむしろプラスミドレベルで、そして宿主でのプラスミドを安定化するが、しかし遺伝的に改良された宿主自身に対する封じ込めを提供してはいない。
【０００５】
能動的な自殺システムは、幾人かの著者によって記述されている。そのようなシステムは、２つの要素：致死遺伝子及び致死遺伝子の発現を非許容条件下でスイッチを入れる制御配列からなる。ＷＯ ９５／１０６１４は、致死遺伝子として細胞膜で働く不完全そして／又は変異型黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のヌクレアーゼの使用を公開している。ＷＯ ９６／４０９４７は、細胞が許容条件下にあるとき発現しそして細胞が非許容条件下にあるときには発現しないか又は一時的な発現であるような必須遺伝子、そして／又は、その遺伝子の発現が細胞に致死でその致死遺伝子は細胞が非許容条件下にあるときに発現し、しかし、細胞が許容条件下にあるときには発現しないような致死遺伝子のどちらかの発現に基づいた環境的に制限された生存可能性を有する組換え細菌システムを公開している。ＷＯ ９９／５８６５２は、ｒｅｌＥ細胞毒素に基づいた生物学的封じ込めシステムを公開している。しかしながら、ほとんどのシステムは、大腸菌（Tedkin et al., 1995; Knudsen et al., 1995; Schweder et al., 1995）又はシュードモナス（Kaplan et al., 1999; Molino et al., 1998）に対して詳しく述べられている。いくつかの封じ込めシステムは理論的には乳酸菌に適用できるけれども、疾病の予防そして／又は治療のための予防用そして／又は治療用分子配送のために自己自制の形質転換ラクトコッカスの使用を可能にするラクトコッカスに対する特異的生物学的封じ込めシステムは記述されていない。
【０００６】
発明の記述
ラクトコッカスに対する適切な生物学的封じ込めシステムを提供することが本発明の目的である。
【０００７】
本発明の最初の概念は、欠陥チミジル酸合成酵素遺伝子を含むラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の単離株である。好ましくは、該欠損チミジル酸合成酵素遺伝子は、遺伝子破壊によって不活化される。さらにより好ましくは、該ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス（Lactcocuus lactis.）である。特別な実施態様は、ラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）株であり、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactcocuus lactis.）であり、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactcocuus lactis.）ＭＧ１３６３誘導株（ここではチミジル酸合成酵素遺伝子は、破壊されインターロイキン１０発現ユニットに置き換えられている）である。該インターロイキン１０発現ユニットは、これに限定されないが好ましくはヒトインターロイキン１０発現ユニット又はヒトインターロイキン１０をコードしている遺伝子である。
【０００８】
本発明のもうひとつの概念は、形質転換プラスミドが完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まない形質転換のための宿主としての上記の株の使用である。本発明の更なる別の概念は、完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まないプラスミドを含む上記のラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株である。本発明の別の概念は、インターロイキン１０のような予防用そして／又は治療用分子をコードする遺伝子又は発現ユニットを含むラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株に関する。結論的として、本発明は、また疾病を治療するために予防用そして／又は治療用分子およびそのようなものを配送するためのラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株の使用に関する。炎症性腸疾患のような疾病の治療のための該分子や方法を配送する方法は、この参照として本明細書に盛り込まれるSteidler等（Science 2000, 289:1352）およびSteidler等のＷＯ ９７／１４８０６およびＷＯ ００／２３４７１で詳細に説明されている。
本発明の別の概念は、上記のラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）の形質転換株を含む医療用調製物である。
【０００９】
ラクトコッカス・ラクティス・亜種ラクティス（Lactcocuus lactis.subsp lactis.）のチミジル酸合成酵素遺伝子（ｔｈｙＡ）は、Ross 等（1990a）によってクローン化された；その配列は、配列番号３および配列番号５に含まれる。ＥＰ０４０６００３は、選択マーカーとして抗生物質耐性を欠くがチミジル酸合成酵素遺伝子を保持するベクターを開示している。；同じベクターがRoss等（1990b）によって記述されている。しかしながら、このベクターは、記述されていないが適切なｔｈｙＡ変異を欠いているせいでラクトコッカス・ラクティス株では使用できない。本発明は、ラクトコッカスでの相同組換えを使用した遺伝子破壊によりそのような変異株を構築する方法を開示する。好ましい実施態様は、ｔｈｙＡ遺伝子が機能的なヒトインターロイキン１０発現カセットで破壊される。しかしながら、ｔｈｙＡ遺伝子の不活化又は不活性なチミジル酸合成酵素を生じる限りはどの構築も遺伝子破壊のために使用できることは明白である。限定されない例として、相同組換えは、遺伝子欠失、チミジル酸合成酵素の不活化型にいたる一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、又はたんぱく質の不完全型を生じるようなフレームシフト変異を生じてもよい。
【００１０】
そのようなラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）ｔｈｙＡ変異株は、純粋に物理的封じ込め以上の厳しい封じ込めを必要とする状況では形質転換のための宿主として非常に有効である。実際ｔｈｙＡ変異株は、チミジンそして／又はチミンのない又は限定濃度しかない環境では生存できない。そのような株が完全なｔｈｙＡ遺伝子を含まないそして変異を相補できないプラスミドで形質転換されたとき、形質転換株は、チミジン／チミンの乏しい環境では自殺的となる。そのような株は、発酵槽での物理的封じ込めに対する追加的防御として使用できる。さらに、本発明は、そのような株が動物体内での配送体として使用される場合では特に有効であることを開示している。実際、そのような形質転換株が、たとえば経口的に人を含め動物に与えられたとき、十分な高濃度のチミジン／チミンが存在する腸で生存し、そして該動物にとって有益であるかもしれないヒトインターロイキン１０のような同種又は異種たんぱく質を生産する。本発明は、さらに形質転換株が驚くべきことにコントロール株と同じスピードで腸を通過し、そして生存率の損失が実際コントロール株のそれと違いがないということを示した。しかしながら、該株が環境中にいったん分泌されると、たとえば糞便中においても、もはや生存することはできない。
【００１１】
形質転換プラスミドは、ｔｈｙＡ変異を相補できない限り任意のプラスミドでもあり得る。好ましくは、ひとつ又はそれ以上の興味ある遺伝子そしてひとつ又はそれ以上耐性マーカーを所持する自己複製型プラスミドか又は組み込み型プラスミドであってもよい。後者の場合、組み込み型プラスミドそれ自身がｔｈｙＡ部位で組み込みを起こすことによって、それによってｔｈｙＡ遺伝子は不活化するが、変異を作るために使われてもよい。おそらく、活性型ｔｈｙＡ遺伝子は、ｔｈｙＡターゲット部位への挿入を標的とするターゲット配列で両脇をはさまれた興味ある遺伝子又は遺伝子群からなるカセットによるダブル相同組換えによって置き換えられる。ターゲット部位で配列組み込みを得るためには、これら配列は、十分に長くそして十分に相同であることが極めて重要である。好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の少なくとも１００の連続ヌクレオチドそして逆側で配列番号２の少なくとも１００の連続ヌクレオチドからなり；より好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の少なくとも５００の連続ヌクレオチドそして逆側で配列番号２の少なくとも５００の連続ヌクレオチドからなり；最も好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１そして逆側で配列番号２からなり、又は、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１００ヌクレオチドそして逆側で配列番号２領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１００ヌクレオチドからなり、好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも５００ヌクレオチドそして逆側で配列番号２領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも５００ヌクレオチドからなり、最も好ましくは、該ターゲット配列が、興味ある遺伝子の片側で配列番号１の領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１０００ヌクレオチドそして逆側で配列番号２領域と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である少なくとも１０００ヌクレオチドからなる。パーセンテージ同一は、Altschul等（1997）記載のブラスト（BLAST）で測定される。配列番号１に相同である配列の好ましい例は、配列番号７で与えられる。本発明の目的のために、配列番号１と配列番号７は交換可能である。ラクトコッカスの形質転換方法は、当業者に周知でありプロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションを含むがこれに限定されない。本発明記載の形質転換ラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）株は、予防用そして／又は治療用分子の配送に有効でありそして医薬用組成物で使用できる。そのような分子の配送は、非限定例として、ＷＯ ９７／１４８０６そしてＷＯ ９８／３１７８６で開示されている。予防用そして／又は治療用分子には、限定されないが、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、グループ１サイトカイン、グループ２サイトカインそしてグループ３サイトカインのようなポリペプチドそして病原細菌からの多糖抗原のような多糖を含む。好ましい実施態様には、ヒトインターロイキン１０を配送するための上記のラクトコッカス種（Lactcocuus sp.）株の使用がある。この株は、上記で示めされるクローン病を治療するための薬剤製造で使用されうる。
【００１２】
実施例
ラクトコッカス・ラクティス（ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis））MG1363（Gasson, 1983）から、Ross等（1990a）記載の配列隣接領域をクローン化した。
【００１３】
これらの配列の知見は、ｔｈｙＡの５′末端（配列番号１）の１０００bp範囲と３′末端（配列番号２）の１０００bp範囲、すなわち“ｔｈｙＡターゲット”でのダブル相同組換えを用いるので、以下で述べるように全てのラクトコッカス株を遺伝子工学するためには決定的に重要である。この配列は、今日まで公の供給源から入手できない。われわれ、これらの隣接ＤＮＡ断片をクローン化しそれら配列を同定した。全遺伝子座の配列は、配列番号３に示される；この配列の変異版が配列番号５に示される。５′と３′配列の両方とも、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＩＬ１４０３の配列（Bolotin、印刷中）を登録しているジーンバンク（genebank）のＡＥ００６３８５の配列又はラクトコッカス・ラクティス・亜種ラクティス（L. lactis subsp. lactis）ＣＨＣＣ３７３配列の登録ＡＦ３３６３６８の配列とは異なっている。文献から、公開のｈｙＡ隣接配列（Ross et al., 1990a）（５′末端の８６bpと３′末端の３１bp）を使用した相同組換えが配列の短さから実質的に不可能であることは明らかである。実際、Biswas等は、相同配列の長さと組み込み頻度間の対数的減少関係を記述している。本発明で決定されたｔｈｙＡ座のラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１１、Ｔｈｙ１２、、Ｔｈｙ１５そしてＴｈｙ１６の配列が、それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２で与えられる。
【００１４】
ｔｈｙＡの置換は、以下の述べるようにｔｈｙＡターゲットバージョンを保持するプラスミドで適切な置換することによってなされた。キャリアープラスミドはｐＯＲＩ１９（Law et al., 1995）複製欠損プラスミドの誘導体であり、これは、ｔｈｙＡターゲットの５′１０００bpまたは３′１０００bpのどちらかで最初の相同組換えする時に、エリスロマイシン耐性を所定の株に移すだけである。ｔｈｙＡターゲットの３′１０００bpまたは５′１０００bpでの２回目の相同組換えで望みの株は生じる。
【００１５】
ｔｈｙＡ遺伝子は、（ａ）ヒトインターロイキン１０（ｈＩＬ−１０）の成熟部分、又は（ｂ）２位のプロリンがアラニンに置換されたｈＩＬ−１０の成熟部分、又は（ｃ）最初の２アミノ酸が欠失したｈＩＬ−１０の成熟部分：以外の同一アミノ酸配列のたんぱく質に融合するラクトコッカス・ラクティス（L. lactis））のＵｓｐ４５分泌リーダー（van Asseldonk et al., 1990）を有するたんぱく質をコードする合成遺伝子で置換される；（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はｈＩＬ−１０類似体と呼ばれ、その融合産物は、Ｕｓｐ４５−ｈＩＬ−１０と呼ばれる。
ｔｈｙＡ遺伝子は、ラクトコッカル（lactococcal）Ｐ１プロモーター（Waterfield et al., 1995）、大腸菌バクテリアファージＴ７発現シグナル：推定ＲＮＡ安定化配列および改変遺伝子１０リボゾーム結合部（Wells and Schofield, 1996）を含む発現ユニットで置換される。
【００１６】
５′末端での挿入はｔｈｙＡのＡＴＧがＰ１−Ｔ７Ｕｓｐ４５−ｈＩＬ１０発現ユニットに融合されるような方法でなされる。
【００１７】
5'agataggaaaatttcatgacttacgcagatcaagttttt. . .thyA野生型
gattaagtcatcttacctctt. . .P1-T7-usp45-hIL10
5'agataggaaaatttcatggattaagtcatcttacctctt. . .thyA-,P1-T7-usp45-hIL10
【００１８】
あるいは、５′末端での挿入はｔｈｙＡのＡＴＧが含まないような方法でなされる。
【００１９】
5'agataggaaaatttcacttacgcagatcaagttttt. . .thyA野生型
gattaagtcatcttacctctt. . .P1-T7-usp45-hIL10
5'agataggaaaatttcgattaagtcatcttacctctt. . .thyA-,P1-T7-usp45-hIL10
【００２０】
あるいは、５′末端での挿入はｔｈｙＡプロモーター（Ross, 1990a）が含まないような方法でなされる。
【００２１】
5'tctgagaggttattttgggaaatactattgaaccatatcgaggtgtgtggtataatgaagggaattaaaaaagataggaaaatttcatg. . .thyA野生型
gattaagtcatcttacctctt. .P1-T7-usp45-hIL10
5'tctgagaggttattttgggaaatactagattaagtcatcttacctctt. . .thyA-, P1-T7-usp45-hIL10
【００２２】
３′末端のＡＣＴＡＧＴ ＳｐｅＩ制限部位が、ｕｓｐ４５−ｈＩＬ１０配列のＴＡＡ停止コドンの間近に接して設計された。これが、ｔｈｙＡ停止コドンのすぐ次に設計されているＴＣＴＡＧＡ ＸｂａＩ制限部位で連結された。
【００２３】
aaaatccgtaactaactagt3'...usp45-hIL10
gatttagcaatttaaattaaattaatctataagtt3'. . .thyA-野生型
tctagaattaatctataagttactga3'. . .設計thyAターゲット
aaaatccgtaactaactagaattaatctataagttactga3'. . . thyA-,usp45-hIL10
【００２４】
これら構造は、図２に示されている。ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、ｐＯＴｈｙ１１５及びｐＯＴｈｙ１６の配列が、配列番号２３、２４、２５、２６によってそれぞれ与えられている。
結果として生じた株は、ｔｈｙＡ欠損で、いまだラクトコッカス・ラクティス（L. lactis））で記述されていない変異株である。増殖のためにはチミン又はチミジン添加に厳密に依存している。
【００２５】
欠失の地図、及び本発明の単離株／変異株のすべてのＰＣＲ分析が、図３及び図４に示されている。野生型株及び独立した単離株／変異株のチミジル酸合成酵素及びインターロイキン１０遺伝子の存在は、図５および６に示されたようにサザンブロット分析によって分析された。挿入ｈＩＬ１０遺伝子周囲の領域がＰＣＲで単離されＤＮＡ配列が確認された。構造は予想配列と一致する。
【００２６】
変異株のヒトインターロイキン１０生産が、ウェスタンブロット分析でチェックされ、そして陰性コントロールとしてｐＴＲＥＸ１で形質転換された親株と陽性コントロールとしてＩＬ１０生産プラスミドｐＴ１ＨＩＬ１０ａｐｘａで形質転換された親株とで比較された（図７）。培養上清の濃度がＥＬＩＳＡを用いて定量された。図７Ｂで示されるように、変異の両単離株は、非組込み型プラスミドｐＴ１ＨＩＬ１０ａｐｘａの形質転換株よりかなり少ないが、比較しうる意義ある量のｈＩＬ１０を生産する。図８（パネルＡ及びＢ）は、さらにすべての変異株が意義ある量のＩＬ１０を生産していることを示している。
【００２７】
図９は、ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、又はｐＯＴｈｙ１６のいずれかを保持するラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）株ＬＬ１０８によるｈＩＬ１０の生産を示している。ｈＩＬ１０の定量（ＥＬＩＳＡによる）は、指定株の培養上清中の存在を示す。組換えｈＩＬ１０のＮ末端たんぱく質配列はエドマン分解によって決定されそして成熟組換えｈＩＬ１０について予測される構造との一致を示した。たんぱく質は十分な生物活性を示した。ＬＬ１０８は、ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、ｐＯＴｈｙ１５、又はｐＯＴｈｙ１６のようなｐＯＲＩ１９誘導プラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子をゲノムに組み込んでいるラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）株である。この株は、グローニンゲン（Groningen）大学のD r. Jan Kok、によって丁寧に示されている。プラスミドｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、ｐＯＴｈｙ１５、そしてｐＯＴｈｙ１６は、ｔｈｙＡ座の上流及び下流にｔｈｙＡ座から誘導されたゲノムＤＮＡのおよそ１ｋＢと隣接してさまざまなプロモーター構成（図２参照）で合成ヒトＩＬ１０遺伝子を有する。これらのプラスミドは、記述のゲノム組み込み構築のために使われた。
【００２８】
チミジン無し及びチミジン補給培地での増殖へのチミジル酸欠損効果が試験された；結果が図１０と１１にまとめられている。培地中のチミジンの不存在は、強く変異株の増殖を制限しそしてさらに培養４時間後でのコロニー形成単位の減少を引き起こした。培地へのチミジンの添加は、野生型株と比較して同一の増殖曲線およびコロニー形成単位を生じた、これはこの変異株がチミジン補給培地では増殖又は生存性に影響しないということを示している。図１１はＴｈｙ１２の生存性が、チミジンの不存在でひどく損なわれるということを明白に示している。図１２は、最終的にラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１２が、ＭＧ１３６３と同じスピードでマウスの腸を通過することを示している。生存性の損失はＴｈｙ１２とＭＧ１３６３間で違いは見られない。Ｔｈｙ１２は、増殖において完全にチミジン依存性であることをあらわし、Ｔｈｙ１２細菌が外部のｔｈｙＡ遺伝子を手に入れていないことを示している。
【００２９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＭＧ１３６３ ｔｈｙＡ 座の地図
【図２】ｈＩＬ−１０の遺伝子成分およびｐＯＴｈｙ プラスミド上に存在するさまざまな発現モジュールの表示概略図。黒部分は、本来のラクトコッカス・ラクティス（L. lactis） ＭＧ１３６３遺伝子情報を、白部分は組換え遺伝子情報を表している。
【図３】Ｔｈｙ１１のＰＣＲ同定（Ｔｈｙ１１ １．１およびＴｈｙ１１ ７．１は独立して得られた、同一クローンであることを表している）。標準的なＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型源として指定株の飽和培養液のアリコートを使ってなされた。パネルＡは、指定のＰＣＲ反応産物のアガロースゲルを示す。パネルＢは、プライマーが、ｔｈｙＡ（１）、上流（２）又は（３）下流ＰＣＲで付着する位置を示す。使われたオリゴヌクレオチドプライマー：（１）：ＡＴｇＡＣＴＴＡＣｇＣＡｇＡＴＣＡＡｇＴＴＴＴＴ及びＴＴＡＡＡＴＴｇＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴｇ、（２）：ＴＣＴｇＡＴＴｇＡｇＴＡＣＣＴＴｇＡＣＣ及びｇＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＴｇｇＴＴＴＴＡＴＴｇ、（３）：ＣＴＴＡＣＡＴｇＡＣＴＡＴｇＡＡＡＡＴＣＣｇ及びｃＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡｇｇｇＡＡＡｇＣＡ。
【図４】Ｔｈｙ１１、Ｔｈｙ１２、Ｔｈｙ１５及びＴｈｙ１６のＰＣＲ同定。標準ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型源として指定株の３日間培養コロニーを使ってなされた。パネルＡは、プライマーが、上流（１）、下流（２）又はｔｈｙＡ（３）ＰＣＲの付着する位置を示す。使われたオリゴヌクレオチド：（１）：ＡＴｇＡＣＴＴＡＣｇＣＡｇＡＴＣＡＡｇＴＴＴＴＴ及びＴＴＡＡＡＴＴｇＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴｇ、（２）：ＴＣＴｇＡＴＴｇＡｇＴＡＣＣＴＴｇＡＣＣ及びｇＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＴｇｇＴＴＴＴＡＴＴｇ、（３）：ＣＴＴＡＣＡＴｇＡＣＴＡＴｇＡＡＡＡＴＣＣｇ及びｃＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡｇｇｇＡＡＡｇＣＡ。パネルＢは、指定のＰＣＲ反応産物のアガロースゲルを示す。
【図５】指定株のサザンブロット分析。染色体ＤＮＡは、抽出されそして指定の制限酵素で消化される。アガロースゲル電気泳動に続いて、ＤＮＡは膜に移されそしてｔｈｙＡ座の周りの染色体構造がＤＩＧ標識ｔｈｙＡ又はｈＩＬ−１０ ＤＮＡ断片の使用によって明らかにされた（パネルＡ）。パネルＢは、ＭＧ１３６３およびＴｈｙ１１両方でのｔｈｙＡ座の推測構造の概略図を示す。
【図６】パネルＡは、ＭＧ１３６３、Ｔｈｙ１１、Ｔｈｙ１２、Ｔｈｙ１５及びＴｈｙ１６におけるｔｈｙＡ座でのラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）染色体推測構造の一部概略図を示す。パネルＢは、指定株のサザンブロット分析。染色体ＤＮＡは、抽出されそしてＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で消化される。アガロースゲル電気泳動に続いて、ＤＮＡは膜に移されそしてｔｈｙＡ座の周りの染色体構造がＤＩＧ標識ｔｈｙＡ又はｈＩＬ−１０ ＤＮＡ断片の使用によって明らかにされた。
【図７】ｈＩＬ−１０の生産。パネルＡは、抗ＩＬ−１０抗体で明らかにされた指定株の培養上清および細胞関連たんぱく質のウェスタンブロットを示す。パネルＢは、培養上清中に存在するｈＩＬ−１０の（ＥＬＩＳＡによる）定量を示す。
【図８】ｈＩＬ−１０の生産。パネルＡは、指定株の培養上清中に存在するｈＩＬ−１０の（ＥＬＩＳＡによる）定量を示す。パネルＢは、抗ＩＬ−１０抗体で明らかにされた指定株の培養上清たんぱく質のウェスタンブロットを示す。
【図９】ｐＯＴｈｙ１１、ｐＯＴｈｙ１２、又はｐＯＴｈｙ１６いずれかを保持しているラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）株ＬＬ１０８によるｈＩＬ−１０の生産。指定株の培養上清中に存在するｈＩＬ−１０の（ＥＬＩＳＡによる）定量を示す。組換えＩＬ−１０のＮ−末端たんぱく質配列はエドマン分解法で決定されそして成熟組換えｈＩＬ−１０に対して予測される構造と一致を示した。このたんぱく質は、完全な生物学的活性を示した。
【図１０】１００μg/ml（Ｔ１００）５０μg/ml（Ｔ５０）２５μg/ml（Ｔ２５）又は無し（Ｔ０）の追加のチミジンを含みそしてあるいは５μg/ml（Ｅ）エリスロマイシンを補給されたＧＭ１７での指定株の増殖率。飽和終夜培養（Ｔ５０で調製された）は、指定培地で１００倍希釈された。パネルＡは、吸光度集積動態を示す。パネルＢは、培地ｍｌあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）数の動態を示す。
【図１１】チミジン無し培地（ＴＦＭ）でのＭＧ１３６３およびＴｈｙ１２の増殖率。ＴＦＭは、ＧＭ１７でラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１２菌を増殖し、続く遠心により菌を除去し、そして０．２２μｍ孔径フィルター上でろ過し、ｐＨを７．０に調整し、そして加圧滅菌することによって調製された。ＭＧ１３６３およびＴｈｙ１２菌は、それぞれＧＭ１７又は５０μg/mlのチミジン＋ＧＭ１７での終夜培養から集められ、そしてＭ９緩衝液（水に６g/l Ｎａ2ＨＰＯ4、３g/l ＫＨ2ＰＯ4、１g/l ＮＨ4Ｃｌ、０．５g/l ＮａＣｌ）で洗浄された両懸濁液は、ＴＦＭ又は５０μg/mlのチミジン（Ｔ５０）を補給されたＴＦＭのどちらかで希釈された。ＣＦＵ計測は、さまざまな時間ポイント：ｔ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０そして２０時間で測定された。これは、Ｔｈｙ１２の生存可能性がチミジン無しでひどく損なわれるということを示している。
【図１２】腸通過および生存可能性：ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３は、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性マーカーを所持しているプラスミドｐＬＥＴ２Ｎで形質転換された。ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）Ｔｈｙ１２は、エリスロマイシン（Ｅｍ）耐性マーカーを所持しているプラスミドｐＴ１ＮＸで形質転換された。両株の１０9の菌が、ＢＭ９（２５mM ＮａＨＣＯ3＋２５mM Ｎａ2ＣＯ3に６g/l Ｎａ2ＨＰＯ4、３g/l ＫＨ2ＰＯ4、１g/l ＮＨ4Ｃｌ、０．５g/l ＮａＣｌ）で再懸濁され、混合されそして３匹のマウスにｔ＝０時に接種された。糞便が、−１から０、０から１、１から２、２から３、３から４、４から５、５から６、６から７、７から８、８から９、９から１０、そして１０から終夜といった時間間隔で集められた。すべてのサンプルは、等張緩衝液に再懸濁しそして適当な希釈液が、Ｃｍ、Ｅｍ、又は５０μg/mlのチミジン＋Ｅｍのいずれかを含むＧＭ１７（０．５％グルコースで補給されたＭ１７培地、デフィコ（Difico）、セントルイス（St. Louis））プレート上に蒔かれた。さまざまなプレートのコロニー形成単位がグラフで表されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
欠陥チミジル酸合成酵素遺伝子を含むラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の単離株。
【請求項２】
該遺伝子が、遺伝子破壊によって不活化されている請求項１又は２記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の単離株。
【請求項３】
該ラクトコッカス種（Lactococcus sp.）がラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis.）である請求項１又は２記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の単離株。
【請求項４】
完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まない形質転換プラスミドによる形質転換のための宿主株としての請求項１−３のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）株の使用。
【請求項５】
完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まない形質転換プラスミドを含む請求項１−３のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株。
【請求項６】
予防用及び／又は治療用分子をコードする遺伝子を含む請求項１−４のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株。
【請求項７】
該予防用及び／又は治療用分子がインターロイキン１０である、請求項６記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株。
【請求項８】
予防用及び／又は治療的用分子の配送のための請求項５−７のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株の使用。
【請求項９】
請求項５−７のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株を含む医薬組成物。
【請求項１０】
炎症性腸疾患治療用医薬の調製のための請求項６−７のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株の使用。
【請求項１】
欠陥チミジル酸合成酵素遺伝子を含むラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の単離株。
【請求項２】
該遺伝子が、遺伝子破壊によって不活化されている請求項１又は２記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の単離株。
【請求項３】
該ラクトコッカス種（Lactococcus sp.）がラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis.）である請求項１又は２記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の単離株。
【請求項４】
完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まない形質転換プラスミドによる形質転換のための宿主株としての請求項１−３のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）株の使用。
【請求項５】
完全なチミジル酸合成酵素遺伝子を含まない形質転換プラスミドを含む請求項１−３のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株。
【請求項６】
予防用及び／又は治療用分子をコードする遺伝子を含む請求項１−４のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株。
【請求項７】
該予防用及び／又は治療用分子がインターロイキン１０である、請求項６記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株。
【請求項８】
予防用及び／又は治療的用分子の配送のための請求項５−７のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株の使用。
【請求項９】
請求項５−７のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株を含む医薬組成物。
【請求項１０】
炎症性腸疾患治療用医薬の調製のための請求項６−７のいずれか１項記載のラクトコッカス種（Lactococcus sp.）の形質転換株の使用。
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−６０９１３（Ｐ２００９−６０９１３Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−２６０５９１（Ｐ２００８−２６０５９１）
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【分割の表示】特願２００２−５８７６１１（Ｐ２００２−５８７６１１）の分割
【原出願日】平成１４年５月３日（２００２．５．３）
【出願人】（５０７０５５５０１）アクトジェニックス・エヌブイ (11)
【氏名又は名称原語表記】Ａｃｔｏｇｅｎｉｘ ＮＶ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６０５９１（Ｐ２００８−２６０５９１）
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【分割の表示】特願２００２−５８７６１１（Ｐ２００２−５８７６１１）の分割
【原出願日】平成１４年５月３日（２００２．５．３）
【出願人】（５０７０５５５０１）アクトジェニックス・エヌブイ (11)
【氏名又は名称原語表記】Ａｃｔｏｇｅｎｉｘ ＮＶ
【Ｆターム（参考）】
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