舌の衛生状態の判定方法
【課題】舌の衛生状態を簡便に判定する手段の提供。
【解決手段】舌苔試料中のトリプシン活性を測定することを特徴とする舌の衛生状態の判定方法。
【解決手段】舌苔試料中のトリプシン活性を測定することを特徴とする舌の衛生状態の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口臭やネバつきに深く関与する舌の衛生状態の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
舌の衛生状態は舌苔の付着に反映され、舌の衛生状態の悪化は、口腔内全体の環境悪化に影響する。舌苔は口臭・ネバつきの原因の１つであり、細菌が繁殖する温床ともなるため、結果的に口腔疾患に感染するリスクが高まると考えられる。
【０００３】
舌苔は、フソバクテリウム属に属する菌（Ｆｎ）が介在する口腔細菌の共凝集によって細菌叢が複雑化し、口臭等の発生の原因となる。しかし、舌苔量や口臭の程度から舌の衛生状態を評価することは難しく、一般的な方法としては、舌苔の程度を目視で判断する相対的な方法しかなかった（非特許文献１）。また、舌苔の細菌叢を評価する場合には、ＰＣＲや培養といった高度な技術、機器と時間が必要であった。
さらに、舌苔の増加に伴い、口腔内環境の因子である口臭やネバつきと云った症状が増加するが、口臭やネバつきを自分で正確に判断するのは難しく、機器で判定する場合には、特定の機器やそれを取り扱う技術が必要である。
【非特許文献１】小島 健：舌苔の臨床的研究，日口腔誌，３１：１６５９〜１６７８，１９８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、口臭やネバつきの原因となる舌の衛生状態を簡便かつ正確に判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、舌から舌苔を採取して、試料とし、この試料の生化学的性質とＦｎ菌、口臭、ネバつき等との関係について検討したところ、合成基質を用いる手段により簡便に測定可能なトリプシン活性と、Ｆｎ菌、口臭、ネバつき等とが高い相関性を有し、トリプシン活性を測定することにより舌の衛生状態が簡便かつ正確に判定できることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、舌苔試料中のトリプシン活性を測定することを特徴とする舌の衛生状態の判定方法を提供するものである。
また本発明は、トリプシン活性測定試薬を含有する舌の衛生状態の判定用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明方法によれば、舌苔試料中のトリプシン活性を簡便な合成基質法により測定することにより、口臭やネバつき、Ｆｎ菌数等が判定できることから、舌の衛生状態が簡便に判定できる。さらに、本発明方法は簡便であるため、歯科の専門家が口腔疾患の診断のために使用するためだけではなく、口腔疾患を伴わない生理的な口臭やネバつきの程度を知るためにも利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明における、測定試料は舌苔である。口腔内試料としては唾液が一般的であるが、唾液を試料とした場合には、トリプシン活性とＦｎ菌、口臭、ネバつき等との相関性がみられなかった。舌苔は、歯ブラシ、綿棒、ろ紙、不織布、舌清掃具等によって容易に採取可能である。舌苔の採取量は、５〜５０mgで十分である。
【０００９】
採取した舌苔試料は、そのままトリプシン活性の測定に供してもよいが、例えばリン酸緩衝液等のpH７程度（pH６．５〜７．４）緩衝液あるいは生理食塩水で希釈して用いるのが好ましい。
【００１０】
本発明は、舌苔試料のトリプシン活性と舌の衛生状態との間に相関性があることを見出した点に基づいている。後述の比較例に示すように、舌苔試料のアミノペプチダーゼ活性と舌の衛生状態との間には相関性は認められなかった。
【００１１】
舌苔試料のトリプシン活性は、酵素認識合成基質を用いて測定するのが簡便であり、好ましい。合成基質としては、トリプシンに特異的な合成基質であれば特に限定されないが、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−のアミノ酸配列を有する合成基質が特に好ましい。
【００１２】
合成基質としては、トリプシンに特異的であればよく、発色基質、発光基質のいずれも用いることができる。発色基質又は発光基質としては、トリプシンが認識するアミノ酸配列を有するペプチド又はアミノ酸に発色物質又は発光物質が結合した合成基質が好ましい。当該合成基質に、トリプシンを使用させ、遊離した発色物質又は発光物質由来の信号を分析する。
【００１３】
前記発色物質としては、種々の公知物質を用いることができる。例えば、ｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロアニリン、若しくはβ−ナフチルアミン等、又はそれらの誘導体を挙げることができる。前記発光物質としては、種々の公知物質を用いることができる。例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン若しくは４−メトキシ−２−ナフチルアミン等、又はそれらの誘導体を挙げることができる。特に好ましい合成基質は、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−に発色物質又は発光物質が結合した基質である。また、発色物質としては市販されている合成基質等を用いることができる。
【００１４】
トリプシン活性測定法の具体例としては、例えば舌苔試料をリン酸緩衝液などで２〜５０倍に希釈し、これに上記合成基質を添加して２５〜４０℃、５〜３０分間インキュベートした後、その反応液中の発色物質量又は発光物質量を測定することにより行なわれる。ここで発色物質量又は発光物質量は、通常の吸光度の測定手段によって測定することができる。
【００１５】
本発明の舌の衛生状態の判定用キットは、上記のトリプシン活性測定試薬、すなわち舌苔試料中のトリプシン活性を測定し得る試薬を含有する。判定するキットとしては、予め合成基質を含浸させた不織布等を舌表面に数回擦りつける等によって舌苔を採取し、この不織布等を表面等に貼り付けることによりインキュベートした後に、一定時間後不織布等の色の変化によって判別できる簡便な測定・判定キットが望ましい。
【００１６】
得られた舌苔試料のトリプシン活性は、舌苔中のフソバクテリウム属細菌（Ｆｎ）数、口腔内口臭成分である揮発性硫黄成分（ＶＳＣ）量、及び唾液中のネバつき成分である唾液中タンパク質濃度と高い相関性を示す。従って、舌苔試料中のトリプシン活性は、Ｆｎ菌数、口臭及びネバつきと高い相関性を有し、トリプシン活性を測定することにより舌の衛生状態を判定することができる。
【実施例】
【００１７】
実施例および比較例
＜試料の採取＞
２６〜５４歳の健常な被験者１６名を対象に、舌に不織布を担持した電動歯ブラシを一定荷重で一定時間あてることにより舌苔を採取（５ｍｇ）し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）５mLに懸濁させたものを試料とし、予めＤＭＳＯ等の溶媒に溶解させた酵素認識基質（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（４−メチルクマリン−７−アミド）；ペプチド研究所）を用いて酵素活性を測定した。比較例１〜３は、上記酵素として表１のものを使用した以外は実施例と同様の方法により測定を行った。
また、同時に、舌苔中細菌数（総菌数、レンサ球菌数、Ｆｎ菌数）、口中のネバつき成分である唾液中タンパク質濃度、及び口臭成分ＶＳＣ濃度を測定し、各酵素活性値との相関を調べた。
【００１８】
（１）酵素活性の測定
前述の方法で採取した舌苔のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）懸濁液を試料とした。蛍光測定用マイクロプレートのウェルにアッセイ用緩衝液（０．１％アルブミン含有リン酸緩衝液）を２００μL注入し、そこに１０mM合成基質溶液５μL、及び試料９μLを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、蛍光測定用マイクロプレートリーダーにて蛍光強度を測定し、試料を添加していない対照との蛍光強度の差分を単位舌苔量当たりの量（FI/mg）として表したものを、酵素活性値とした
【００１９】
（２）舌苔中細菌数の測定
前述の方法で採取した舌苔のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）懸濁液を試料とした。
偏性嫌気性細菌数は、変法ＧＵＭ寒天培地に試料を播種し、３７℃、嫌気条件下にて３日培養し、コロニー数から算出した。
レンサ球菌数は、ミティスーサリヴァリウス寒天培地に試料を播種し、３７℃好気条件下にて２日培養し、コロニー数から算出した。
フゾバクテリウム属細菌数は、変法ＦＭ培地に試料を播種し、３７℃嫌気条件下にて３日培養し、コロニー数から算出した。
【００２０】
（３）唾液中タンパク質濃度の測定
吐出法にて採取した唾液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、ローリー法によりタンパク質濃度を測定した。
【００２１】
（４）ＶＳＣ濃度の測定
６〜７mLのイオン交換水を６０秒洗口した洗口だ液を試料とし、その気層中に揮発してきた揮発性硫黄成分（ＶＳＣ）である硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィドの４成分について、ガスクロマトグラフィを用いて定量し、それらの合計をＶＳＣ値（ng/mL）とした。
【００２２】
得られた結果を表１に示し、相関性を表２に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
表１及び表２より実施例（トリプシン酵素活性）において、口臭成分ＶＳＣ濃度、口中のネバつき成分である唾液タンパク質濃度、及び舌苔Ｆｎ菌数に高い相関が見られた。特に、細菌数については、実施例のトリプシン酵素活性がＦｎ菌数と特異的に相関していることがわかった。一方、比較例１、２は、トリプシンではなくアミノペプチダーゼ様酵素活性を測定したものであるが、口臭成分、唾液タンパク質濃度、及び舌苔Ｆｎ菌数いずれとも相関がなかった。トリプシンだけでなく、トリプターゼ及びプロテアーゼ活性を測定した比較例３では口臭成分ＶＳＣ及び唾液タンパク質との間に相関はみられなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口臭やネバつきに深く関与する舌の衛生状態の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
舌の衛生状態は舌苔の付着に反映され、舌の衛生状態の悪化は、口腔内全体の環境悪化に影響する。舌苔は口臭・ネバつきの原因の１つであり、細菌が繁殖する温床ともなるため、結果的に口腔疾患に感染するリスクが高まると考えられる。
【０００３】
舌苔は、フソバクテリウム属に属する菌（Ｆｎ）が介在する口腔細菌の共凝集によって細菌叢が複雑化し、口臭等の発生の原因となる。しかし、舌苔量や口臭の程度から舌の衛生状態を評価することは難しく、一般的な方法としては、舌苔の程度を目視で判断する相対的な方法しかなかった（非特許文献１）。また、舌苔の細菌叢を評価する場合には、ＰＣＲや培養といった高度な技術、機器と時間が必要であった。
さらに、舌苔の増加に伴い、口腔内環境の因子である口臭やネバつきと云った症状が増加するが、口臭やネバつきを自分で正確に判断するのは難しく、機器で判定する場合には、特定の機器やそれを取り扱う技術が必要である。
【非特許文献１】小島 健：舌苔の臨床的研究，日口腔誌，３１：１６５９〜１６７８，１９８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、口臭やネバつきの原因となる舌の衛生状態を簡便かつ正確に判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、舌から舌苔を採取して、試料とし、この試料の生化学的性質とＦｎ菌、口臭、ネバつき等との関係について検討したところ、合成基質を用いる手段により簡便に測定可能なトリプシン活性と、Ｆｎ菌、口臭、ネバつき等とが高い相関性を有し、トリプシン活性を測定することにより舌の衛生状態が簡便かつ正確に判定できることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、舌苔試料中のトリプシン活性を測定することを特徴とする舌の衛生状態の判定方法を提供するものである。
また本発明は、トリプシン活性測定試薬を含有する舌の衛生状態の判定用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明方法によれば、舌苔試料中のトリプシン活性を簡便な合成基質法により測定することにより、口臭やネバつき、Ｆｎ菌数等が判定できることから、舌の衛生状態が簡便に判定できる。さらに、本発明方法は簡便であるため、歯科の専門家が口腔疾患の診断のために使用するためだけではなく、口腔疾患を伴わない生理的な口臭やネバつきの程度を知るためにも利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明における、測定試料は舌苔である。口腔内試料としては唾液が一般的であるが、唾液を試料とした場合には、トリプシン活性とＦｎ菌、口臭、ネバつき等との相関性がみられなかった。舌苔は、歯ブラシ、綿棒、ろ紙、不織布、舌清掃具等によって容易に採取可能である。舌苔の採取量は、５〜５０mgで十分である。
【０００９】
採取した舌苔試料は、そのままトリプシン活性の測定に供してもよいが、例えばリン酸緩衝液等のpH７程度（pH６．５〜７．４）緩衝液あるいは生理食塩水で希釈して用いるのが好ましい。
【００１０】
本発明は、舌苔試料のトリプシン活性と舌の衛生状態との間に相関性があることを見出した点に基づいている。後述の比較例に示すように、舌苔試料のアミノペプチダーゼ活性と舌の衛生状態との間には相関性は認められなかった。
【００１１】
舌苔試料のトリプシン活性は、酵素認識合成基質を用いて測定するのが簡便であり、好ましい。合成基質としては、トリプシンに特異的な合成基質であれば特に限定されないが、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−のアミノ酸配列を有する合成基質が特に好ましい。
【００１２】
合成基質としては、トリプシンに特異的であればよく、発色基質、発光基質のいずれも用いることができる。発色基質又は発光基質としては、トリプシンが認識するアミノ酸配列を有するペプチド又はアミノ酸に発色物質又は発光物質が結合した合成基質が好ましい。当該合成基質に、トリプシンを使用させ、遊離した発色物質又は発光物質由来の信号を分析する。
【００１３】
前記発色物質としては、種々の公知物質を用いることができる。例えば、ｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロアニリン、若しくはβ−ナフチルアミン等、又はそれらの誘導体を挙げることができる。前記発光物質としては、種々の公知物質を用いることができる。例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン若しくは４−メトキシ−２−ナフチルアミン等、又はそれらの誘導体を挙げることができる。特に好ましい合成基質は、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−に発色物質又は発光物質が結合した基質である。また、発色物質としては市販されている合成基質等を用いることができる。
【００１４】
トリプシン活性測定法の具体例としては、例えば舌苔試料をリン酸緩衝液などで２〜５０倍に希釈し、これに上記合成基質を添加して２５〜４０℃、５〜３０分間インキュベートした後、その反応液中の発色物質量又は発光物質量を測定することにより行なわれる。ここで発色物質量又は発光物質量は、通常の吸光度の測定手段によって測定することができる。
【００１５】
本発明の舌の衛生状態の判定用キットは、上記のトリプシン活性測定試薬、すなわち舌苔試料中のトリプシン活性を測定し得る試薬を含有する。判定するキットとしては、予め合成基質を含浸させた不織布等を舌表面に数回擦りつける等によって舌苔を採取し、この不織布等を表面等に貼り付けることによりインキュベートした後に、一定時間後不織布等の色の変化によって判別できる簡便な測定・判定キットが望ましい。
【００１６】
得られた舌苔試料のトリプシン活性は、舌苔中のフソバクテリウム属細菌（Ｆｎ）数、口腔内口臭成分である揮発性硫黄成分（ＶＳＣ）量、及び唾液中のネバつき成分である唾液中タンパク質濃度と高い相関性を示す。従って、舌苔試料中のトリプシン活性は、Ｆｎ菌数、口臭及びネバつきと高い相関性を有し、トリプシン活性を測定することにより舌の衛生状態を判定することができる。
【実施例】
【００１７】
実施例および比較例
＜試料の採取＞
２６〜５４歳の健常な被験者１６名を対象に、舌に不織布を担持した電動歯ブラシを一定荷重で一定時間あてることにより舌苔を採取（５ｍｇ）し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）５mLに懸濁させたものを試料とし、予めＤＭＳＯ等の溶媒に溶解させた酵素認識基質（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（４−メチルクマリン−７−アミド）；ペプチド研究所）を用いて酵素活性を測定した。比較例１〜３は、上記酵素として表１のものを使用した以外は実施例と同様の方法により測定を行った。
また、同時に、舌苔中細菌数（総菌数、レンサ球菌数、Ｆｎ菌数）、口中のネバつき成分である唾液中タンパク質濃度、及び口臭成分ＶＳＣ濃度を測定し、各酵素活性値との相関を調べた。
【００１８】
（１）酵素活性の測定
前述の方法で採取した舌苔のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）懸濁液を試料とした。蛍光測定用マイクロプレートのウェルにアッセイ用緩衝液（０．１％アルブミン含有リン酸緩衝液）を２００μL注入し、そこに１０mM合成基質溶液５μL、及び試料９μLを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、蛍光測定用マイクロプレートリーダーにて蛍光強度を測定し、試料を添加していない対照との蛍光強度の差分を単位舌苔量当たりの量（FI/mg）として表したものを、酵素活性値とした
【００１９】
（２）舌苔中細菌数の測定
前述の方法で採取した舌苔のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）懸濁液を試料とした。
偏性嫌気性細菌数は、変法ＧＵＭ寒天培地に試料を播種し、３７℃、嫌気条件下にて３日培養し、コロニー数から算出した。
レンサ球菌数は、ミティスーサリヴァリウス寒天培地に試料を播種し、３７℃好気条件下にて２日培養し、コロニー数から算出した。
フゾバクテリウム属細菌数は、変法ＦＭ培地に試料を播種し、３７℃嫌気条件下にて３日培養し、コロニー数から算出した。
【００２０】
（３）唾液中タンパク質濃度の測定
吐出法にて採取した唾液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、ローリー法によりタンパク質濃度を測定した。
【００２１】
（４）ＶＳＣ濃度の測定
６〜７mLのイオン交換水を６０秒洗口した洗口だ液を試料とし、その気層中に揮発してきた揮発性硫黄成分（ＶＳＣ）である硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィドの４成分について、ガスクロマトグラフィを用いて定量し、それらの合計をＶＳＣ値（ng/mL）とした。
【００２２】
得られた結果を表１に示し、相関性を表２に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
表１及び表２より実施例（トリプシン酵素活性）において、口臭成分ＶＳＣ濃度、口中のネバつき成分である唾液タンパク質濃度、及び舌苔Ｆｎ菌数に高い相関が見られた。特に、細菌数については、実施例のトリプシン酵素活性がＦｎ菌数と特異的に相関していることがわかった。一方、比較例１、２は、トリプシンではなくアミノペプチダーゼ様酵素活性を測定したものであるが、口臭成分、唾液タンパク質濃度、及び舌苔Ｆｎ菌数いずれとも相関がなかった。トリプシンだけでなく、トリプターゼ及びプロテアーゼ活性を測定した比較例３では口臭成分ＶＳＣ及び唾液タンパク質との間に相関はみられなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
舌苔試料中のトリプシン活性を測定することを特徴とする舌の衛生状態の判定方法。
【請求項２】
舌の衛生状態が、舌苔の形成に関与するフソバクテリウム属細菌の菌数、口腔内のネバつき及び口臭の程度である請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−のアミノ酸配列を有する合成基質を用いてトリプシン活性を測定する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
トリプシン活性測定試薬を含有する舌の衛生状態の判定用キット。
【請求項１】
舌苔試料中のトリプシン活性を測定することを特徴とする舌の衛生状態の判定方法。
【請求項２】
舌の衛生状態が、舌苔の形成に関与するフソバクテリウム属細菌の菌数、口腔内のネバつき及び口臭の程度である請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−のアミノ酸配列を有する合成基質を用いてトリプシン活性を測定する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
トリプシン活性測定試薬を含有する舌の衛生状態の判定用キット。
【公開番号】特開２００９−１００７０１（Ｐ２００９−１００７０１Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７７２５５（Ｐ２００７−２７７２５５）
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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