芳香族ホスホニウム塩及びマススペクトロメトリー分析における標識試薬としてのこれらの使用
本発明は、各物質がカチオン性トリアリールホスホニウム基で標識されたサンプル中の目的の複数の物質（「被分析物」）のそれぞれを、アッセイ、検出、定量、位置決定、又は分析するための方法及び試薬に関する。本発明はさらに、低分子量の被分析物を含有するサンプルの分析がマトリックス成分によって妨害されないＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー技術を提供する。本発明はまた、ＭＳ分析の前に被分析物の標識において使用するための標識試薬を提供する。ここにおいて、標識された被分析物はＭＡＬＤＩ技術の有用な検出閾値よりも大きな分子量を有する。いくつかの側面において、本発明は、サンプルの成分の定量的ＭＳ分析の方法を提供する。本発明の方法は、ピコモル量、フェトモル量、及びアトモル量で分子の分離／イオン化のための感受性の高い技術を含む。本発明の別の利点は、ｍ／Ｚ値の測定が、低分子干渉によって複雑化せず、マトリックスが正常に提供されることであり、従って、本発明は、低分子サンプル、及び低分子サンプル及び高分子サンプルの混合物のＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
マススペクトロメトリー（「ＭＳ」）は例えば高エネルギーの電子を用いた衝撃によって目的の被分析物を含有するサンプルがイオン化される、分析技術である。得られたイオン及び親物質の荷電したフラグメントを電場及び磁場によって収束させ、荷電したフラグメントのスペクトルを得る。ＭＳはサンプル分子の分子量及びこのフラグメント化特性を測定するために、日常的に使用される。ＭＳは、典型的には、サンプルが低圧で電子線中を通る気相中で行われる。電子線は、典型的には電気的に中性のサンプル分子に衝突し、１つまたはそれ以上の電子が飛び出し、陽電荷を持つイオンが生じる。次いで、イオン化されたサンプルは磁場を通り、この磁場を通るイオン化されたサンプルの経路に依存して、イオンの電荷に対する分子の質量が測定される。
【０００２】
マススペクトロメトリーは、イオンの電荷に対する分子の質量比を測定する。この質量は、通常は、原子質量単位（Ｄａｌｔｏｎと呼ばれる）の用語で表される。荷電又はイオン化は、通常は複数の電荷の用語で表される。この２つの比率は、「ｍ／Ｚ」値（質量／電荷又は質量／イオン化比）として表される。このイオンは通常は１個の電荷を有するため、ｍ／Ｚ比は通常は「分子イオン」の質量、すなわちこの分子量（「ＭＷ」）である。サンプルの質量を測定する１つの方法は、荷電した分子、すなわちイオンを磁場中で促進することである。このサンプルイオンは、磁場の影響によって移動する。検出器は、磁場を通る経路の末端に配置することができ、分子のｍ／Ｚは磁場を通る経路及び磁場の強度の関数として計算することができる。サンプルの質量を測定するための別の技術は、飛行時間（「ＴＯＦ」）マススペクトロメトリーである。ＴＯＦ ＭＳでは、サンプルイオンは、公知の電圧によって促進され、サンプルイオン又はこれらのフラグメントが公知の距離を移動する時間を測定する。
【０００３】
マススペクトロメトリーは、通常は、電気的に中性のサンプルが低圧でイオン化される気相中で行われる。最も単純な質量分析計は、気体の電気的に中性のサンプルを、通常は約１０−６ｔｏｒｒ以下の減圧中に導入する。次いで、イオン化されたサンプルは磁場を通り、イオン化されたサンプルが磁場を通る経路に依存して、イオンの電荷に対する分子の質量が測定される。容易に気体状態にならない分子、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリマー、及び他の高分子化合物は、ＭＳによって分析することはさらに困難である。しかし、脱離イオン化技術を含む、高分子量サンプルを揮発するためのいくつかの技術が存在する。
【背景技術】
【０００４】
気体状態のサンプルで出発する代わりに、基本的なＭＳにおけるように、脱離ＭＳは、基質に吸着したサンプルに適用されてもよい。サンプル分子が基質に付着する場合、サンプルはこの基質に吸着していると言われる。脱離は、基質に吸着した分子が基質から離れるときに起こる。１つの脱離ＭＳ技術は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）である。この技術において、サンプルは、適切な基質上に付着し、次いで、蒸発プロセスの一部分として、有機マトリックスからサンプルにプロトンが移動することによってイオン化される。サンプルのイオン化は、電子線イオン化またはプロトン移動イオン化によって達成されてもよい。例えば、Ｍ．Ｋａｒａｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｒｏｃ．７８，５３−６８（１９８７）；Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２，１５１−５３（１９８８）を参照。
【０００５】
典型的なＭＡＬＤＩ実験において、サンプルは、パルスレーザー照射によって気化する固体の光吸収有機マトリックスに溶解され、気化したマトリックスとともにサンプルが移動する。この様式で、高分子量サンプルは、マススペクトロメトリー分析によって揮発されてもよい。現代のＭＡＬＤＩ質量分析計、例えばＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）は、高い感受性及び再現性を有して、１つの基質上のいくつかのサンプルの連続的な高スループット分析を可能にする。この技術は広範囲に使用され、強力な技術であるが、ＭＡＬＤＩは、マトリックスがｍ／Ｚ未満、すなわち、約５００から７００の電荷に対する質量の測定を阻害するため、一般的に低分子の試験には適していない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、各物質がカチオン性トリアリールホスホニウム基で標識されるサンプル中で、目的の複数の物質（「被分析物」）のそれぞれをアッセイ、検出、定量、位置決定、又は分析するための方法及び試薬に関する。本発明はさらに、低分子量の被分析物を含有するサンプルの分析がマトリックス成分によって妨害されないＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー技術を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、ＭＳ分析の前に被分析物の標識において使用するための、標識された被分析物がＭＡＬＤＩ技術の有用な検出閾値よりも大きな分子量を有する、標識試薬を提供する。本発明の標識試薬は、式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−で表されてよく、ここで、各Ａｒはアリール基であり（これら全ては同じであっても異なっていてよい。）、Ｐはリン原子であり、Ｒは「反応基」であり、Ｘ−は負に荷電した対イオンである。
【０００８】
いくつかの側面において、本発明は、サンプルの成分の定量的ＭＳ分析の方法を提供する。本発明の方法は、ピコモル量、フェトモル量、及びアトモル量で分子の分離／イオン化のための感受性の高い技術を含む。本発明の別の利点は、ｍ／Ｚ値の測定が、低分子干渉によって複雑化せず、マトリックスが正常に提供されることであり、従って、本発明は、低分子サンプル、及び高分子サンプル及び低分子サンプルの混合物のＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、トリアリールホスホニウム標識試薬を有するサンプルにおいて、被分析物を標識又はタグ化することによって、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法に関する。
【００１０】
１．標識試薬
本発明の標識試薬は、式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−で表されてよく、ここで、各Ａｒはアリール基であり（これら全ては同じであっても異なっていてよい。）、Ｐはリン原子であり、Ｒは「反応基」であり、Ｘ−は負に荷電した対イオンである。この反応基は、被分析物の露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって被分析物が標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する反応性官能基を有する。反応基Ｒは、−Ｚ−Ψによって表されてよく、ここで、Ｚは結合基であり、Ψは反応性官能基であり、特に、被分析物の露出した官能基と反応する官能基である。従って、本発明の標識試薬は、式Ｉによって表されてよい：
【００１１】
【化１７】
【００１２】
反応性官能基（Ψ）の性質は、標識される被分析物の化学的特徴に依存する。一般的に、本発明の標識試薬は、被分析物の露出した官能基と反応する。本明細書中で使用される場合、「露出した」官能基は、本発明の標識試薬に共有結合するようになる化学反応に参加するために利用可能な官能基である。最も単純な用語において、被分析物が求核性の露出した官能基を有する場合、求電子性Ψ基を有する標識試薬を使用してよく、この逆もよい。
【００１３】
一般に、用語「求核性試薬」は、例えば、１分子反応（「ＳＮ１」として公知である）又は２分子反応（「ＳＮ２」）のような脂肪族化学において通常生じるような、脱離基（通常は別の求核性試薬）と置き換わることによって化合物と反応する反応性電子対を有する化学基を意味すると当該技術分野で理解される。求核性試薬の例としては、電荷を有さない化合物、例えば、アミン、メルカプタン、及びアルコール、及び電荷を有する基、例えば、アルコキシド、チオレート、カルボアニオン、及び種々の有機アニオン及び無機アニオンが挙げられる。例示的なアニオン性求核性試薬としては、とりわけ、単純アニオン、例えば、アジド、シアニド、チオシアネート、アセテート、ホルメート、又はクロロホルメート、及びビスルファイトが挙げられる。適切な反応条件下では、有機金属試薬、例えば、有機銅、有機亜鉛、有機リチウム、グリニャール試薬、エノレート、及びアセチリドが好適な求核性試薬である。
【００１４】
同様に、「求電子性試薬」は、例えば、典型的に求電子置換反応中に生じるような、電子対を、特に求核性試薬から受け取ることが可能な原子、分子、又はイオンを意味する。求電子置換反応において、求電子性試薬は、例えば、別の求電子性試薬、例えば、芳香族基質（例えばベンゼン）上のニトロニウムイオンによるプロトン置換によって、別の求電子試薬を排除して基質に結合する。求電子性試薬としては、環状化合物、例えば、エポキシド、アジリジン、エピスルフィド、環状サルフェート、カーボネート、ラクトン、及びラクタム；及びサルフェート、スルホネート（例えばトシレート）、クロリド、ブロミド、及びヨージドを含む非環状求電子性試薬が挙げられる。一般的に、求電子性試薬は、脱離基二結合した飽和炭素原子（例えば、メチレン基）であり得るが、求電子性試薬はさらに、求核性試薬との反応で付加物を形成する、不飽和基、例えば、アルデヒド、ケトン、エステル、又はこれらの共役した（α，β−不飽和）アナログであり得る。
【００１５】
用語「脱離基」は、一般的に、求核性試薬（例えば、アミン、チオール、アルコール、又はシアニド）によって容易に交換され、置換される基を指す。このような脱離基は周知であり、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素）、アルコキシド、チオアルコキシドが挙げられる。種々の硫黄ベースの脱離基は、通常合成化学で使用され、アルカンスルホニルオキシ基（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルカン、例えば、メタンスルホニルオキシ、エタンスルホニルオキシ、プロパンスルホニルオキシ、及びブタンスルホニルオキシ基）及びハロゲン化アナログ（例えば、ハロゲノ（Ｃ１−Ｃ４アルカン）スルホニルオキシ基、例えば、トリフルオロメタンスルホニルオキシ（すなわち、トリフレート）、２，２，２−トリクロロエタンスルホニルオキシ、３，３，３−トリブロモプロパンスルホニルオキシ、及び４，４，４−トリフルオロブタンスルホニルオキシ基）、及びアリールスルホニルオキシ基（例えば、場合により１から３個のＣ１−Ｃ４アルキル基によって置換されたＣ６−Ｃ１０アリール、例えば、ベンゼンスルホニルオキシ、α−ナフチルスルホニルオキシ、β−ナフチルスルホニルオキシ、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（すなわち、トシレート）、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルホニルオキシ、メシチレンスルホニルオキシ、及び６−エチル−α−ナフチルスルホニルオキシ基）を含む。
【００１６】
「活性化されたエステル」は、式−ＣＯＬで表し得、ここで、Ｌは脱離基であり、この典型例としては、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基；電子吸引基（例えば、ｐ−ニトロ、ペンタフルオロ、ペンタクロロ、ｐ−シアノ、ｐ−トリフルオロメチル）で置換されたアリールオキシ基；及びカルボジイミドで活性化され、酸無水物又は混合酸無水物を形成するカルボン酸、例えば、−ＯＣＯＲａまたは−ＯＣＮＲａＮＨＲｂ、ここで、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ５−Ｃ８アルキル（例えば、シクロヘキシル）、Ｃ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、又はＣ１−Ｃ６アルコキシ基である。活性化されたエステルは、系中で形成されるか、又は単離可能な試薬であり得る。
【００１７】
用語「電子吸引基」は、当該技術分野で認識され、置換基が隣の原子から価電子（例えば、π電子）を吸引する、例えば、置換基が隣の原子よりもより電子的に陰性であるか、又は置換基が同じ位置で水素原子よりも置換基自身に対して電子をひきつける能力を記載する。Ｈａｍｍｅｔｔのシグマ値（σ）は、基の電子供与能力及び電子吸引能力の受容された測定値であり、特に、シグマパラ値（σｐ）である。例えば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３６８−７５（２００１）を参照。Ｈａｍｍｅｔｔ定数値は、一般的に、電子供与基でマイナスであり（ＮＨ２でσｐ＝−０．６６）、電子吸引基でプラスである（ニトロ基でσｐ＝０．７８）、σｐはパラ置換を示す。例となる電子吸引基としては、中でも、ニトロ、アシル（ケトン）、ホルミル（アルデヒド）、スルホニル、トリフルオロメチル、ハロゲノ（例えば、クロロ及びフルオロ）、及びシアノ基が挙げられる。逆に、「電子供与基」は、分子中の同じ位置に占められる場合、水素よりも電子を与える置換基を示す。例としては、中でも、アミノ（アルキルアミノ及びジアルキルアミノを含む）、アリール、アルコキシ（アラルコキシを含む）、アリールオキシ、メルカプト及びアルキルチオ、及びヒドロキシル基が挙げられる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、アルキル基としては、１つまたはそれ以上の炭素原子を有し、直鎖アルキル基を含有する飽和炭化水素（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等）、環状アルキル基（すなわち「シクロアルキル」又は「脂環式」又は「炭素環式環」基）（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル等）、及びアルキル置換されたアルキル基（例えば、アルキル置換されたシクロアルキル基及びシクロアルキル置換されたアルキル基）が挙げられる。用語「脂肪族基」は、直鎖又は分枝鎖によって特徴付けられる有機部分を含み、典型的には、１から２２個の炭素原子を有する。複雑な構造において、この鎖は、分枝、架橋（ｂｒｉｄｇｅ）、又は架橋（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）されていてよい。脂肪族基としては、アルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基が挙げられる。
【００１９】
特定の実施態様では、直鎖又は分枝鎖アルキル基は、この骨格中に３０以下の炭素原子、例えば、直鎖についてＣ１−Ｃ３０、又は分枝鎖についてＣ３−Ｃ３０を有していてよい。特定の実施態様では、直鎖又は分枝鎖アルキル基は、この骨格中に２０以下の炭素原子、例えば、直鎖についてＣ１−Ｃ２０、又は分枝鎖についてＣ３−Ｃ２０、さらに好ましくは１８以下の炭素原子を有していてよい。同様に、好ましいシクロアルキル基は、この環構造中に４から１０個の炭素原子、さらに好ましくは、この環構造中に４から７個の炭素原子を有する。用語「低級アルキル」は、鎖中に１から６個の炭素を有するアルキル基、及び環構造中に３から６個の炭素を有するシクロアルキル基を指す。
【００２０】
炭素数が他に特定されない限り、「低級脂肪族」、「低級アルキル」、「低級アルケニル」等におけるような「低級」は、本明細書中で使用される場合、この部分が少なくとも１個の炭素原子を有し、約８個未満の炭素原子を有することを意味する。特定の実施態様では、直鎖又は分枝鎖の低級アルキル基は、この骨格中に６個以下の炭素原子を有し（例えば、直鎖についてＣ１−Ｃ６、分枝鎖についてＣ３−Ｃ６）、さらに好ましくは４以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキル基は、この環構造中に３から８個の炭素原子、好ましくはこの環構造中に５又は６個の炭素を有する。「Ｃ１−Ｃ６アルキル」におけるような用語「Ｃ１−Ｃ６」は、１から６個の炭素原子を含有するアルキル基を意味する。
【００２１】
さらに、他に特定されなければ、アルキルとの用語は、「置換されていないアルキル」及び「置換されたアルキル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１つまたはそれ以上の炭素上で１つまたはそれ以上の水素を交換する置換基を有するアルキル基を指す。このような置換基としては、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲノ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族（ヘテロ芳香族基を含む。）が挙げ得る。
【００２２】
「アリールアルキル」基は、アリール基で置換されたアルキル基（例えば、フェニルメチル（すなわち、ベンジル））である。「アルキルアリール」部分は、アルキル基で置換されたアリール基（例えば、ｐ−メチルフェニル（すなわち、ｐ−トリル））である。用語「ｎ−アルキル」は、直鎖（すなわち、分岐していない。）置換されていないアルキル基を意味する。「アルキレン」基は、対応するアルキル基の二価アナログである。用語「アルケニル」及び「アルキニル」は、アルキルに類似であるが、少なくとも１つの二重結合又は三重結合の炭素−炭素結合をそれぞれ含有する不飽和脂肪族基を指す。好適なアルケニル及びアルキニル基としては、２から約１２個の炭素原子、好ましくは２から約６個の炭素原子を有する基を含む。
【００２３】
用語「芳香族基」又は「アリール基」は、１以上の環を含有する、不飽和及び芳香族の環状炭化水素、及び不飽和及び芳香族のヘテロ環を含む。アリール基はさらに、芳香族ではない脂環式環又はヘテロ環式環と融合又は架橋して多環式環（例えば、テトラリン）を形成し得る。「アリーレン」基は、アリール基の二価アナログである。
【００２４】
用語「ヘテロ環式基」は、環中の１つまたはそれ以上の炭素原子が炭素以外の元素、例えば、窒素、硫黄、又は酸素である、炭素環式基に類似の閉環構造を含む。ヘテロ環式基は、飽和であっても不飽和であってもよい。さらに、ヘテロ環式基（例えば、ピロリル、ピリジル、イソキノリル、キノリル、プリニル、及びフリル）は、芳香族性を有していてもよく、この場合、これらのヘテロ環式基は、「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」基と称され得る。
【００２５】
他に定められない限り、アリール及びヘテロ環式（ヘテロアリールを含む）基はさらに、１つまたはそれ以上の構成原子で置換されてもよい。ヘテロ芳香族及びヘテロ環式基の例は、１つの環あたり３から約８個の原子及び１つまたはそれ以上のＮ、Ｏ又はＳヘテロ原子を含む１から３の別個の環又は縮合環を有し得る。概して、用語「ヘテロ原子」は、炭素又は水素以外の任意の元素の原子を含み、これらの好ましい例としては、窒素、酸素、硫黄、及びリンが挙げられる。ヘテロ環基は、飽和又は不飽和の芳香族であり得る。
【００２６】
通常の炭化水素アリール基は、１個の環を有するフェニル基である。２環の炭化水素アリール基としては、ナフチル、インデニル、ベンゾシクロオクテニル、ベンゾシクロヘプテニル、ペンタレニル及びアズレニル基、並びにこれらの部分的に水素化されたアナログ（インダニル及びテトラヒドロナフチルなど）が挙げられる。例示的な３環の炭化水素アリール基としては、アセフチレニル、フルオレニル、フェナレニル、フェナントレニル、及びアントラセニル基が挙げられる。
【００２７】
アリール基はさらに、ヘテロ一環式アリール基、すなわち、１個の環のヘテロアリール基、例えば、チエニル、フリル、ピラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、及びピリダジニル基；及びこれらの酸化されたアナログ、例えば、ピリドニル、オキサゾロニル、ピラゾロニル、イソキサゾロニル、及びチアゾロニル基を含む。対応する水素化された（すなわち、非芳香族の）ヘテロ一環式基としては、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル及びピペリジノ、ピペラジニル、及びモルホリノ及びモルホリニル基が挙げられる。
【００２８】
アリール基はさらに、縮合した２環のヘテロアリール、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、クロメニル、イソクロメニル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノロニル、キノロニル、ナフチリジニル、及びプテリジニル基、及び部分的に水素化されたアナログ、例えば、クロマニル、イソクロマニル、インドリニル、イソインドリニル、及びテトラヒドロインドリル基を含む。アリール基はさらに、縮合した３環の基、例えば、フェノキサチイニル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、及びジベンゾフラニル基を含む。
【００２９】
用語「アミノ」は、本明細書中で使用される場合、式−ＮＲａＲｂの非置換又は置換の部分を指し、ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して水素、アルキル、アリール、又はヘテロシクリルであるか、又はＲａ及びＲｂは、これらが結合する窒素原子とともに、環中に３から８個の原子を有する環状部分を形成する。従って、用語「アミノ」は、他に言及されない限り、環状アミノ部分、例えば、ピペリジニル又はピロリジニル基を含む。従って、用語「アルキルアミノ」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基に結合したアミノ基を有するアルキル基を意味する。好適なアルキルアミノ基としては、１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられる。
【００３０】
用語「アルキルチオ」は、アルキル基に結合したスルフヒドリル基を有するアルキル基を指す。好適なアルキルチオ基としては、１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられる。
【００３１】
用語「アルキルカルボキシル」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基に結合したカルボキシル基を有するアルキル基を意味する。
【００３２】
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基に結合した酸素原子を有するアルキル基を意味する。代表的なアルコキシ基としては、１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。
【００３３】
用語「ニトロ」は−ＮＯ２を意味し；用語「ハロゲン」又は「ハロゲノ」又は「ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを示し；用語「チオール」、「チオ」、又は「メルカプト」はＳＨを意味し；用語「ヒドロキシル」又は「ヒドロキシ」は−ＯＨを意味する。
【００３４】
他に特定されない限り、上述の基を含む本発明の化合物の化学部分は、置換されていても置換されていなくてもよい。いくつかの実施態様において、用語「置換」は、上記部分が、水素以外の部分に配置され（すなわち、ほとんどの場合、水素を交換して）、この分子が目的の機能を行うことができるような置換基を有することを意味する。置換基の例としては、直鎖又は分枝のアルキル（好ましくはＣ１−Ｃ５）、シクロアルキル（好ましくはＣ３−Ｃ８）、アルコキシ（好ましくはＣ１−Ｃ６）、チオアルキル（好ましくはＣ１−Ｃ６）、アルケニル（好ましくはＣ２−Ｃ６）、アルキニル（好ましくはＣ２−Ｃ６）、ヘテロ環、炭素環のアリール（例えばフェニル）、アリールオキシ（例えばフェノキシ）、アラルキル（例えばベンジル）、アリールオキシアルキル（例えばフェニルオキシアルキル）、アリールアセトアミドイル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル、アルキルカルボニル及びアリールカルボニル又は他のこのようなアシル基、ヘテロアリールカルボニル、及びヘテロアリール基、及び（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＮＲ’Ｒ”（例えば、−ＮＨ２）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＮ（例えば、−ＣＮ）、−ＮＯ２、ハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉ）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｃ（ハロゲン）３（例えば、−ＣＦ３）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３（ＣＮＨ）ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（Ｏ）１−２ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（Ｏ）０−３Ｒ’（例えば、−ＳＯ３Ｈ）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ（例えば、−ＣＨ２ＯＣＨ３及び−ＯＣＨ３）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ（例えば、−ＳＨ及び−ＳＣＨ３）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＯＨ（例えば、−ＯＨ）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ”）０−３（置換又は非置換フェニル）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３（Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯ２Ｒ’（例えば、−ＣＯ２Ｈ）、及び（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＯＲ’基（ここで、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である。）；又は天然に生じる任意のアミノ酸の側鎖から選択される部分が挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施態様では、「置換基」は、例えば、ハロゲノ、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロシクリル、アラルキル、及びアリール（ヘテロアリールを含む）基からなる群から選択されてよい。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明の標識試薬は、活性化されたエステル反応性官能基（Ψ）を有し、従って式ＩＩによって表されてよく、ここで、Ｌは脱離基である。このような標識試薬は、求核性の露出した官能基（例えばアミン）を有する被分析物の標識に有用である。本発明の類似の実施態様において、活性化されたエステルは、式ＩＩａにおけるように、メチレン基（すなわち、Ｚ＝ＣＨ２）によってトリアリールホスホニウム基に接続される。
【００３７】
【化１８】
【００３８】
スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロチオフェノールエステル、及びスルホテトラフルオロフェノールは、式ＩＩの好ましい実施態様である。しかし、式ＩＩのエステル脱離基は、例えば、置換又は非置換のＣ１−Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、又はヘキシル）、又は置換又は非置換のＣ６−Ｃ１４アリール又はヘテロ環式基、例えば、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、２，２−ジブロモエチル、２，２，２−トリクロロエチル、３−フルオロプロピル、４−クロロブチル、メトキシメチル、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル、エトキシメチル、Ｎ−プロポキシメチル、イソプロポキシメチル、Ｎ−ブトキシメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、１−エトキシエチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−（イソプロポキシ）エチル、３−メトキシプロピル−４−メトキシブチル、フルオロメトキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル）、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、３−フルオロプロポキシメチル、４−クロロブトキシエチル、ジブロモメトキシエチル、２−クロロエトキシプロピル、フルオロメトキシブチル、２−メトキシエトキシメチル、エトキシメトキシエチル、メトキシエトキシプロピル、メトキシエトキシブチル、ベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、９−アントリルメチル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、３，４，５−トリメチルベンジル、４−メトキシベンジル、４−メトキシフェニルジフェニルメチル、２−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、４−クロロベンジル、４−ブロモベンジル、４−シアノベンジル、４−シアノベンジルジフェニルメチル、又はビス（２−ニトロフェニル）メチル基であってもよい。
【００３９】
１つの側面では、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、最初に被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（この反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）の標識試薬と反応させる工程を含む。
【００４０】
別の実施態様では、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；露出した基を含有し、上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる被分析物を含有するサンプルを得る工程；及び上記標識試薬と上記被分析物とを反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物が形成させる工程を含む。このような方法によれば、標識試薬は、構造［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（この反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）を有し得る。
【００４１】
別の側面では、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、最初に被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、前記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物と少なくとも２つの標識試薬（又は複数の試薬）とを反応させる工程（標識試薬のそれぞれは［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；各標識試薬のＡｒ３Ｐ基の分子量は、他の標識試薬のＡｒ３Ｐ基の分子量に対して固有である。）を有する。）を含む。
【００４２】
また、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法である。この方法は、それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程（ここで、上記標識試薬の反応基は全て同じであり、上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）；被分析物（上記被分析物は、露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び上記標識試薬を上記被分析物と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる、工程を含む。
【００４３】
本発明の方法において、トリアリールホスホニウム基の分子量における上述の差がマススペクトロメトリーで識別可能であることが好ましい。同様に、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の分子量における差がマススペクトロメトリーで識別可能であることが好ましい。分子量は、これらのＭＳシグナルが有意に重ならないか、又は各分子イオンのピークエリアが互いに干渉しない場合、マススペクトロメトリーで識別可能である。
【００４４】
別の代表例において、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−、［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−、［Ａｒ＊＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−等（式中、各Ａｒ基（すなわち、Ａｒ、Ａｒ＊、及びＡｒ＊＊等）はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、各標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は固有であり；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。）の少なくとも２つの標識試薬と反応させる工程を含む。
【００４５】
本発明はさらに、サンプルを分析する方法であって、この方法は、被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。）と反応させることによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程を含む。
【００４６】
なお別の実施態様において、本発明は、サンプルを分析する方法であって、この方法は、反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；被分析物（上記被分析物は、露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；上記標識試薬を上記被分析物と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程を含む。このような方法において、本発明の標識試薬は、構造［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）を有し得る。
【００４７】
従って、本発明は、サンプルを分析する方法を含み、この方法は、被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−及び［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒ及びＡｒ＊はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、Ａｒ３Ｐの分子量はＡｒ＊３Ｐの分子量とは異なっており；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。）の少なくとも２つの標識試薬と反応させる工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程を含む。
【００４８】
なお別の側面において、本発明は、サンプルを分析する方法であって、この方法は、それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程（ここで、上記標識試薬の反応基は全て同じであり、上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）；被分析物（上記被分析物は露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び上記標識試薬を上記被分析物と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程を含む。このような方法によれば、各標識試薬は、構造［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）を有し得る。
【００４９】
本発明の方法によれば、分析する工程は、典型的にはマススペクトロメトリー技術である。マススペクトロメトリー技術は、好ましくは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化マススペクトロメトリー又はエレクトロスプレーマススペクトロメトリーである。さらに、マススペクトロメトリー技術は好ましくは定量的である。
【００５０】
本発明の定量的方法の例として、それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程（ここで、上記標識試薬の反応基は全て同じであり、上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）；被分析物（上記被分析物は露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；第１容器中で、上記の第１標識試薬を上記サンプルの第１部分と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び第２容器中で、上記の第２標識試薬を上記サンプルの第２部分と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程を含む。反応が終了した後、上記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物と上記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物とを併せて混合物を形成し；次いで、上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する。
【００５１】
このような定量的方法は、場合により、上記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を上記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物に対して定量的に比較する工程をさらに含んでよい。いくつかの場合において、定量的な比較は、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の相対量と相関関係にある。例えば、サンプルの第２部分に対する前記サンプルの前記第１部分の比率が予め決定され、明確であり、これにより定量化が可能である。この比率は、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物のＭＳシグナルと相関関係にあってよい。また、上記第１標識試薬で標識された被分析物のシグナルと、上記第２標識試薬で標識された同じ被分析物のシグナルにおける違いが、上記混合物中のこれらの濃度の違いに対して直線的に関連し得る。
【００５２】
本発明の標識試薬において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のアリール基からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のヘテロアリール基からなる群から選択される。他の実施態様において、各Ａｒ基は、置換又は非置換の芳香族炭化水素からなる群から選択される。
【００５３】
なおさらなる実施態様において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリル基からなる群から選択される。
【００５４】
さらに、各Ａｒ基は、置換又は非置換の５−及び６−員環単環基からなる群から選択される。別の側面において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のフェニル、ピロリル、フリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、及びピリミジニル基からなる群から選択される。
【００５５】
各Ａｒ基はさらに、置換又は非置換の多環式アリール基からなる群から選択されてもよい。各Ａｒ基はさらに、置換又は非置換のナフチル、テトラヒドロナフチル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、メチレンジオキシフェニル、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、インドリル、ベンゾフラニル、プリニル、デアザプリニル、及びインドリジニル基からなる群から選択されてもよい。１つの側面において、２つのＡｒ基はともに１つの二価芳香族基を形成し、例えば、二価芳香族基は、置換又は非置換の１，１’−ビナフタ−２，２’−ジイル、フェニレン、及びキシリレン基からなる群から選択される。さらに、各Ａｒ基は、非置換フェニル、非置換ナフチル、非置換インデニル、非置換アントラセニル、置換フェニル、置換ナフチル、置換インデニル、及び置換アントラセニル基からなる群から選択されてもよい。
【００５６】
１つの実施態様では、Ａｒ３Ｐ基は、置換又は非置換のトリフェニルホスフィン、ナフチルジフェニルホスフィン、ジナフチルフェニルホスフィン、トリナフチルホスフィン、９−アントリルジフェニルホスフィン、９−アントリルジナフチルホスフィン、ジフェニルピレニルホスフィン、ジナフチルピレニルホスフィンからなる群から選択される。さらに特定的な実施態様では、ナフチルは１−ナフチル又は２−ナフチルである。
【００５７】
上記アリール基は置換されていてよい。上記置換基は、例えば、アルキル又はアルコキシ基であってよい。上記置換基はさらに、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択されてよい。いくつかの場合において、上記置換基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はＣ１−Ｃ４アルキルアルコキシ基である。
【００５８】
上記アリール置換基はさらに、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択し得る。
【００５９】
上記Ａｒ３Ｐ基は、置換トリフェニルホスフィン、例えば、トリ（ｐ−メトキシフェニル）−ホスフィンであり得る。
【００６０】
別の代表例において、本発明の標識試薬は、式Ｉ
【００６１】
【化１９】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（上記反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及び
ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、上記Ｙ基はいずれも上記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する。より特定的には、上記標識試薬は、下式
【００６２】
【化２０】
の構造を有してよい。いずれかの場合において、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択されてよい。
【００６３】
同様に、標識試薬は、下式
【００６４】
【化２１】
の構造を有してよく、又は標識試薬は、下式
【００６５】
【化２２】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（上記反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；
ｎは０から５の整数であり；
Ｙは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、上記Ｙ基はいずれも上記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有してもよい。
【００６６】
いくつかの場合において、Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択される。
【００６７】
本発明の標識試薬はさらに、下式
【００６８】
【化２３】
〔式中、Ｙ、ｎ及びＸは上のいずれかの実施態様において定義されたとおりである。〕
の構造を有してもよい。
【００６９】
１つの実施態様による本発明の標識試薬において、トリアリールホスホニウム標識試薬はそれぞれ同じ化学構造を有し、各トリアリールホスホニウム標識試薬は、他のトリアリールホスホニウム標識試薬と比較して同位体が豊富である。トリアリールホスホニウム標識試薬は、１２Ｃ、１２Ｃ、１Ｈ、又は２Ｈの同位体が豊富である。例えば、上に記載される構造において、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、Ｏ１２Ｃ１Ｈ３、Ｏ１２Ｃ２Ｈ３、Ｏ１３Ｃ１Ｈ３、及びＯ１３Ｃ２Ｈ３からなる群から選択されてもよい。
【００７０】
対イオンＸ−は、ハライド、トリフレート、サルフェート、ニトレート、ヒドロキシド、カーボネート、ビカーボネート、アセテート、ホスフェート、オギザレート、シアニド、アルキルカルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、アルコキシド、チオアルコキシド、アルカンスルホニルオキシ、ハロゲン化アルカンスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ、ビサルフェート、オギザレート、バレレート、オレエート、パルミテート、ステアレート、ラウレート、ボレート、ベンゾエート、ラクテート、シトレート、マレエート、フマレート、スクシネート、タートレート、ナフチルレートメシレート、グルコヘプトネート、又はラクトビオネートであってよい。いくつかの場合において、対イオンＸ−はアニオン性Ｙ基であり、標識試薬は両性イオン性である。
【００７１】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるような標識試薬を含む組成物であってよい。さらに、本発明は、本明細書中に記載される新規な任意の化学化合物に関する。
【００７２】
例えば、本発明は、それぞれが式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。〕の少なくとも２つの異なる標識試薬を含む組成物であり得る。
【００７３】
同様に、本発明は、少なくとも２つの異なる標識試薬を含み、それぞれが、下式
【００７４】
【化２４】
〔式中、Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ；スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、上記Ｙ基はいずれも上記Ｒ基と反応しなく；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。〕
の異なる分子量を有する、組成物を含む。
【００７５】
本発明の標識試薬は、標識される被分析物に対して求電子性又は求核性であってよい。標識試薬の電気的特性は、これらのアリール基の選択、及びこれらに結合する置換基の選択によって少なくとも部分的に制御されてよい。標識試薬の溶解性及び反応性は、アリール基又はこれらの置換基を選択する場合にさらに考慮して設計される。
【００７６】
２．反応性官能基（Ψ）及び結合基（Ｚ）
本発明の標識試薬は、多種類の基質を標識するが、但し、標識される基質は、少なくとも１つの反応性官能基（Ψ）との適切な反応性を有する官能基を含有する。本発明の、標識試薬において、Ｒ基は、結合基（Ｚ）を介してトリアリールホスホニウムのリン原子と結合する少なくとも１つの反応性官能基（Ψ）を含有する。
【００７７】
反応性官能基は、被分析物の露出した官能基の反応性を補完するように選択される。典型的には、反応基Ψは、適切な反応性を保持している反応基の最も単純なバージョンである。官能基の種類は、典型的には、接合される有機被分析物又は無機被分析物上に存在し、例としては、限定されないが、アミン、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、イミダゾール、ヒドラゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、カルボン酸、又はこれらの基の組み合わせが挙げられる。アミン、チオール、及びアルコールは、特に生体分子中で、他の官能基よりも反応性が高く、利用しやすいため、コンジュゲート形成のための露出した基として好ましい。
【００７８】
遊離アミン基（すなわち、−ＮＨ２）は、Ψが、カルボン酸、カルボン酸の誘導体、又はカルボン酸の活性化されたエステル、好ましくは、スクシンイミジル又はスルホスクシンイミジルエステルである標識試薬と簡便に反応する。アミン反応性の標識試薬は、特に、遊離アミン基を保有するタンパク質及びポリペプチドの標識において有用である。アミン反応性標識試薬はさらに、遊離アミン基で置換された物質、例えば、アミノ−デキストラン、又はアミン含有ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び核酸を標識するために使用し得る。
【００７９】
遊離のチオール基を有する被分析物を標識するために使用される標識試薬は、好ましくは、Ψが、ハロアルキル、ハロアセトアミド、ハロメチルベンズアミド、マレイミド基、又はスルホネートエステルであり、ここで、スルホン酸は、アルキルスルホン酸、ペルフルオロアルキルスルホン酸、又はアリールスルホン酸である。いくつかの実施態様において、Ψ基は、ヨードアセトアミド、マレイミド、又はハロメチルベンズアミドであり得る。好ましいアルコール反応性及びフェノール反応性標識試薬は、Ψ基がイソシアネート又はアシルニトリルである、本発明の標識試薬である。
【００８０】
典型的には、Ψ基は、アミン、チオール、又はアルコールと共有結合を形成する反応性官能基である。１つの実施態様では、反応基Ψは、カルボン酸、カルボン酸の活性化されたエステル、アシルアジド、アシルハライド、対称又は非対称酸無水物、アクリルアミド、アルコール、チオール、アルデヒド、アミン、アジド、イミドエステル、スルホネートエステル、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、又はマレイミド基である。別の実施態様では、Ψは、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、アミン、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、イソチオシアネート、又はマレイミド基である。
【００８１】
典型的には、Ψがカルボン酸の活性化されたエステルである場合、Ψはスクシンイミジルエステルである。なお別の実施態様において、Ψは、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、アミン、酸無水物、アニリン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホニルハライド、又はチオール基である反応性官能基である。
【００８２】
特定の実施態様において、反応基Ψは、得られる標識された物質をトリアリールホスホニウム自身から分離するためのスペーサーとして役立つ、複数の介在する原子（本明細書中で「結合基」と称される）を介して、トリアリールホスホニウムに結合している。この結合基は、式Ｉにおいて「Ｚ」によって表される。この結合基は、典型的には、安定な化学結合（典型的には炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、及び炭素−硫黄結合を含む。）を用いて、反応性官能基Ψにトリアリールホスホニウムが結合するように選択される。結合基Ｚは、炭素−炭素の単結合、二重結合、酸重結合又は芳香族の結合に加えて、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、尿素、又はウレタン官能部分であり得る。好ましいＺ部分は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１から２０個の非水素原子を有する。結合Ｚの最も長い直鎖セグメントは、好ましくは、１から６個の非水素原子を含有する。結合基は、任意の目的とする標識反応に対して不活性であるべきである。
【００８３】
結合基Ｚは、１個のメチレン基（すなわち、ＣＨ２）であり得る。別の実施態様において、結合基は、ポリメチレン、−（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−であり、ここで、ｎは１から１０、又は１から６、又は１から４、又は１から２であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である。
【００８４】
１つの好ましい実施態様において、トリアリールホスホニウム基のリン原子は、メチレン基に結合し、この場合、結合基は、式−（ＣＨ２）（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−によって表わし得、ここで、ｎは０から９、又は０から５、又は０から３、又は０であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である。従って、本発明の標識試薬は、式ＩＩＩ及びＩＩＩａ（ここで、Ｒ’及びＲ”は水素である。）によって表わし得る。
【００８５】
【化２５】
【００８６】
典型的には、この反応基は、標識される物質上にすでにある官能基と適切な反応性を有するように選択される。標識試薬の反応性官能基及び被分析物の露出した官能基は、典型的には、容易に反応して共有結合を生成する求電子性試薬及び求核性試薬である。典型的には（そうでなければならないのでないが）、標識試薬上の反応性官能基は求電子性試薬であり、標識される基質上の露出した官能基は求核性試薬である。一般に、アミン、チオール、及びアルコールは、生体分子の修飾のために反応性が高く、利用しやすいので、コンジュゲート形成のための好ましい求核性の露出した官能基である。しかし、多種類の他の官能基（カルボン酸、アルデヒド及びケトンを含む。）が当業者によって十分に理解されている条件下で反応する。官能基及び結合の選択された例が以下の表１に示され、ここで、求電子性基及び求核性基の反応により、共有結合が生じる。
【００８７】
【表１】
【００８８】
被分析物にトリアリールホスホニウム基が結合する特定の共有結合は、典型的には、被分析物自身に天然に存在する官能基、又は当該技術分野で一般的に公知の方法に従う被分析物の誘導体化の結果として存在する官能基に依存する。本発明の好ましい側面では、反応性官能基（Ψ）は、イソチオシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、アシルニトリル、スクシンイミジル及びチオスクシンイミジルエステル、活性化されたカルボン酸、スルホニルクロリド、酸クロリド、アルデヒド、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、マレイミド、アルキル化試薬、ジスルフィド、ホウ酸、ヒドラジン、及びアミンからなる群から選択される。
【００８９】
イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、及びアシルニトリル。イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）は、長期保存中に劣化する場合がある。しかし、いくつかのアシルアジドは、８０℃に加熱するとイソシアネートに容易に変換される（以下に示すＣｕｒｔｉｕｓ転移による）。イソシアネートは、アミンと反応して尿素を形成する。
【００９０】
【化２６】
【００９１】
アルコールは、水溶液中よりも無水有機溶媒中で、かなり容易に修飾される。アシルアジド及びアシルニトライトは、脂肪族アミンと直接反応して、対応するスクシンイミジルエステルが反応するのと同じ生成物になる。しかし、有機溶媒中で反応させる場合、これらの試薬はさらに、アルコール及びフェノールの誘導体を形成する場合がある。本発明のイソシアネート標識試薬及びアシルアジド標識試薬は、以下の式ＩＶ及びＶのものを含む。
【００９２】
【化２７】
【００９３】
イソシアネートは、イソチオシアネートよりも、アルコール（及びアミン）との反応性がかなり高い。典型的なプロトコルにおいて、アシルアジド及びアルコールは、有機溶媒中でともに加熱され、イソシアネートはすぐにアルコールと反応して、以下に示すように、安定なウレタンを形成する。
【００９４】
【化２８】
【００９５】
アシルニトリルは、有機溶媒中のアルコールと反応して、カルボン酸エステルを与える。本発明のアシルニトリル標識試薬は、以下の式ＶＩ及びＶＩａ（ここで、Ｚはメチレン基である。）のものを含む。
【００９６】
【化２９】
【００９７】
イソシアネートに対する代替物は、イソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）であり、これは、水及び他の溶媒中で中程度に反応性であるが、より安定である。イソチオシアネートは、以下に示されるように、アミンと反応してチオウレアを形成する。
【００９８】
【化３０】
【００９９】
チオウレア生成物は、適度に安定であるが、一般に、スクシンイミジルエステル及びスルホニルハライドの生成物と同程度には安定でない。
【０１００】
スクシンイミジル及びチオスクシンイミジルエステル、活性化されたカルボン酸。スクシンイミジル（「ＮＨＳ」）エステルは、得られたアミド結合がペプチド結合と同等に安定であるため、アミン修飾のための好ましい反応基である。本発明のＮＨＳエステル標識試薬は、式ＶＩＩの構造を有する。
【０１０１】
【化３１】
【０１０２】
Ψがカルボン酸のスクシンイミジルエステルである場合、反応性標識試薬は、特に、標識されたタンパク質又はオリゴヌクレオチドを調製するために有用である。この試薬は、乾燥していれば長期間安定であり、以下に示されるように、芳香族アミン、アルコール及びフェノールよりも、脂肪族アミンと選択的に反応する。
【０１０３】
【化３２】
【０１０４】
スクシンイミジルエステルはさらに、チオールと反応してチオエステルを生成するが、このようなチオアシル基は、付近のアミンに移動する（例えば、タンパク質中のＣｙｓ→Ｌｙｓ）。スクシンイミジルエステルの加水分解は、標識反応と競争するが、この副反応はｐＨ＜９に維持することによって制限し得る。以下に示される式ＶＩＩＩ及びＶＩＩＩａのスルホスクシンイミジル（「ＮＨＳＳ」）エステル、式ＩＸのペンタフルオロチオフェノールエステル、及び式Ｘ及びＸａのスルホテトラフルオロフェノール（「ＳＩＰ」）エステルは、異なる溶解性を有するＮＨＳエステルの代わりとなるものである。
【０１０５】
【化３３】
【０１０６】
これらのスルホネート化試薬は、ＮＨＳエステルよりも高い水溶性を有し、有機溶媒の存在しない媒体中で使用されてよい。スルホスクシンイミジルエステル及びＳＴＰエステルは、カルボン酸標識試薬、カルボジイミド、及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド又は４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノールからそれぞれインサイチューで調製し得る。
【０１０７】
カルボン酸はさらに、酸クロリド及び酸無水物を調製するために有用であり得、スクシンイミジルエステルとは異なり、芳香族アミン及びアルコールを標識するためにさらに有用である。ヒドラジン誘導体はさらに、アミンとよく似た反応性を有し、ある場合には、水溶性のカルボジイミド活性化されたカルボン酸基に結合させることができる。
【０１０８】
【化３４】
【０１０９】
式ＸＩ、ＸＩａ、ＸＩＩ、及びＸＩＩａの標識試薬のアミン及びカルボキシレート反応性官能基は、ペプチド合成における通常の種々のアミド結合形成方法において使用してもよい。このような方法は、典型的には、カルボジイミド、活性化された酸無水物及びエステル、及びアシルハライド、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド、ＤＰＰＡ、ＰＰＡ、ＢＯＰ試薬、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、オキサリルクロリド、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＨＢＰｙＵ、ＨＢＰｉｐＵ、ＰｙＢｒｏＰ、ＴＤＢＴＵ、ＴＯＴＵ、ＢｒｏＰ、ＰｙＣｌｏＰ、ＰｙＣＩＵ、ＰｉｐＣＩＵ、クロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−フォルムアミジニウムテトラフルオロボレート、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムテトラフルオロボレート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−エチルオキシカルボニル−２−エチルオキシ−１，２−ジヒドロキノン、及びプロパンホスホン酸、酸無水物を含む、カップリング試薬を使用する。例えば、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１１０６５−１３３（１９９３）；Ｍ．Ａ．Ｇａｌｌｏｐら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３−５１（１９９４）；Ｒ．Ｓｃｈｗｙｚｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｓｉｅｂｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４９，１３４（１９６６）；Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１９６３）；Ｂ．Ｇｕｔｔｅ及びＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｉｂｉｄ．９１，５０１（１９６９）；及び米国特許第４，５０７，２３０号；第５，２５８，４５４号；及び第６，２０４，３６１号を参照。
【０１１０】
典型的には、アミン又はアニリンは、その遊離アミノ基を介して、好適なカルボジイミドカップリング薬剤、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（「ＤＣＣ」）を用いて、場合により触媒、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（「ＨＯＢｔ」）、及びジメチルアミノピリジン（「ＤＭＡＰ」）の存在下で、適切なカルボン基質に結合する。他の方法としては、活性化エステル及び酸無水物の形成後、場合により塩基の存在下で、遊離アミンとの反応によるものが挙げられる。例えば、保護されたＢｏｃ−アミノ酸又はＣｂｚ−アミジノ安息香酸は、塩基（例えば、Ｎ−メチルモルホリン、ＤＭＡＰ、又はトリアルキルアミン）の存在下で、イソブチルクロロホルメートを用いて無水溶媒中で処理され、「活性化された酸無水物」を形成し、これは、次いで、アミンと反応する。
【０１１１】
スルホニルクロリド及び酸クロリド。式ＸＩＩＩ及びＸＩＩＩａのスルホニルクロリド及び式ＸＩＶ及びＸＩＶａの酸クロリドは、水中で、特に脂肪族アミンとの反応に必要とされるさらに高いｐＨで高反応性であり、不安定であり、これらは、ｐＨ８．３の水溶液で室温で２から３分で加水分解される。従って、このような試薬は、好ましくは、低温で使用される。得られたスルホンアミドは、通常は非常に安定である。スルホニルクロリドは、フェノール（チロシンを含む）、脂肪族アルコール（多糖類を含む）、チオール（例えばシステイン）、及びイミダゾール（例えばヒスチジン）と反応するが、生成物は一般的に不安定であり、特に、脂肪族アルコールとの生成物は、求核置換を受けやすい。これらの反応性のために、非求核性溶媒が好ましい。
【０１１２】
【化３５】
【０１１３】
アルデヒド。式ＸＶ及びＸＶａのアルデヒド標識試薬は、アミンと反応してＳｃｈｉｆｆ塩基（たとえば、式ＸＶＩ）を形成し、これは、水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元アミノ化によってさらに安定化されてもよい。
【０１１４】
【化３６】
【０１１５】
ヨードアセトアミド及びブロモアセトアミド。ヨードアセトアミド標識試薬（式ＸＶＩＩ、ここでＸはヨウ素原子である）は、全てのチオール（ペプチド及びタンパク質中に見出されるものを含む）と容易に反応し、チオエーテルを形成する。これらは、対応するブロモアセトアミド（式ＸＶＩＩ、ここでＸは臭素原子である）よりもいくらか反応性が高い。ヨードアセトアミド及びブロモアセトアミドはさらに、ヒスチジン又はチロシンと反応し得るが、一般的に、遊離のチオールのみが存在する場合、これらはカルボキシレート又はアルコールをアルキル化する場合がある。
【０１１６】
【化３７】
【０１１７】
ヨードアセトアミドはアミンの遊離塩基と反応し得るが、ほとんどの脂肪族アミン（タンパク質のＮ末端を除く）はプロトン化され、ｐＨ８未満では比較的反応性が低く、このため、標識反応の選択性は、反応ｐＨを制御することによって影響を受ける場合がある。ヨードアセトアミドは、固有に光に、特に溶液中で不安定であり；及びこれらの試薬との標識反応は、光を減らした条件下で行なうべきである。システイン、グルタチオン、又はメルカプトコハク酸を反応混合物に添加して、チオール反応性標識試薬の反応を止め、非常に水溶性の付加物を得て、これは容易に除去された。本発明のいくつかのヨードアセトアミド及びブロモアセトアミド標識試薬と被分析物分子のアミン及びチオールとの標識反応を以下に示す。
【０１１８】
【化３８】
【０１１９】
マレイミド。Ψがマレイミドである場合、反応性標識試薬（式ＸＶＩＩＩ及びＸＶＩＩＩａにおけるような）は、チオール含有基質にコンジュゲート形成するのに特に有用である。チオール基は、二重結合に付加することによって、マレイミドと反応して、式ＸＩＸに示されるようなチオエーテルを形成する。マレイミドは、メチオニン、ヒスチジン、又はチロシンよりもシステインのチオールに対して選択的である。マレイミドとアミンとの反応は、通常、マレイミドとチオールとの反応よりも高いｐＨを必要とする。マレイミドの加水分解は、特にｐＨ８より高いｐＨでは、チオール修飾と顕著に競争する。さらに、マレイミド付加物は、求核性反応（隣接アミンとの）によって加水分解又は開環し得る。
【０１２０】
【化３９】
【０１２１】
アルキル化試薬及びジスルフィド。アルキルハライド及びアリール化薬剤及びジスルフィド（典型的には対称のもの）は、チオール−ジスルフィド交換反応を受け、新しい非対称ジスルフィドを形成し、この反応は自由に不可逆であり、チオール特異的である。これらのチオール反応性標識試薬からの共有結合付加物は、概して、ヨードアセトアミド又はマレイミドからの付加物よりも加水分解に耐性がある。
【０１２２】
ホウ酸。ホウ酸標識試薬（式ＸＸ及びＸＸａにおけるような）は、隣接ジオール及び特定のアミノアルコールと反応して、それぞれ式ＸＸＩ及びＸＸＩＩに示されるような環状錯体を形成する。
【０１２３】
【化４０】
【０１２４】
ヒドラジン及びアミン。ヒドラジン及びアミンは、アルデヒド及びケトンと容易に反応するが、これらの官能基は生体サンプル中ではアミンとして一般的ではない（遊離の還元糖を含有する多糖類を除く）。にもかかわらず、アルデヒド及びケトンを分子内に導入するためのいくつかの方法が公知であり、例えば、過ヨウ素酸塩で媒介される隣接ジオールの酸化、またはアルケンの四酸化オスミウム酸化、及び過ヨウ素酸塩によるアルデヒドに対する酸化が公知である。過ヨウ素酸塩はさらに、特定のアミノアルコール及びチオールを酸化するが、隣接するジオールの酸化よりは速度が低い。従って、形成されるアルデヒド及びケトンは、式ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＶ、及びＸＩＶａのアミン又はヒドラジン標識試薬で標識されてもよい。
【０１２５】
【化４１】
【０１２６】
グルタルアルデヒドは、固定化された組織サンプルの調製において一般的に使用され、残りのアルデヒド基（式ＸＸＶ）は、ヒドラジン及びアミンと結合させて式ＸＸＶＩの生成物を得てもよい。
【０１２７】
【化４２】
【０１２８】
ヒドラジン誘導体、例えば、ヒドラジド、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドは、アルデヒド及びケトンの安定なコンジュゲートを形成するための反応性標識試薬である。ヒドラジンは、ケトン及びアルデヒドと反応して、安定なヒドラゾンとなる。これらのヒドラゾンは、水素化ホウ素ナトリウムで還元して、さらに結合安定性を増し得る。一級脂肪族及び芳香族アミンは、アルデヒド及びケトンと可逆的に反応してＳｃｈｉｆｆ塩基を形成する。この反応が可逆性であるため、ヒドラゾン誘導体は、通常、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムによって還元される。水溶性化合物のカルボン酸はさらに、カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含む水溶液中でヒドラジン及びアミンに結合し得る。
【０１２９】
４．標識試薬の合成
本発明の標識試薬及び化合物は、提供される特定の手順において記載されるように、本明細書中に記載されるスキーム及びプロトコルに従って容易に調製し得る。しかし、本発明の化合物を形成するための他の合成経路を使用してもよく、以下は単に例として提供されており、本発明を限定するものではないことを当業者は認識する。例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋによる「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）を参照。当該技術分野で標準的な種々の保護及び脱保護ストラテジーが使用されることがさらに認識される（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓを参照）。任意の特定の保護基（例えば、アミン及びカルボキシル保護基）が、続く反応条件に関して、保護される部分の安定性に依存することを関連技術の当業者は認識し、適切な選択が理解される。
【０１３０】
標識試薬は、脱離基Ｌが求核置換してアルキル化トリアリールホスホニウム化合物を得ることを示す以下のスキームに示されるように、トリアリールホスフィンのアルキル化によって簡便に合成し得る。
【０１３１】
【化４３】
【０１３２】
反応性官能基Ψそれ自体は、ホスフィンの直接アルキル化に干渉し、従って、これらの合成前駆体（Ψ＊）が好ましいことを当業者は理解する。例えば、前駆体は、反応性官能基が保護基でマスクされている反応性官能基であってもよい。アルキル化の後に、保護基は、種々の当該技術分野で認識される技術のいずれかに従って除去される。
【０１３３】
句「保護基」は、本明細書中で使用される場合、所望でない化学変換から潜在的に反応性の官能基を保護する、一時的な置換基を意味する。このような保護基の例としては、それぞれ、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、及びアルデヒド及びケトンのアセタール及びケタールが挙げられる。Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第３編；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照。
【０１３４】
トリアリールホスフィンは、合成してもよいし、又は市販の供給源から獲得してもよい。トリアリールホスフィンは、遷移金属の周知のリガンドであり、広く市販されている。トリアリールホスフィンは、いくつかの方法によって一般に合成される。ハロホスフィンとアリールグリニャール試薬又は有機リチウム試薬との反応、ジアリールホスフィンの金属化、続くアリールハライド又はアリールスルホネートエステルとの反応、ハロホスフィンと活性化芳香族環とのＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応、及びアリールハライド又はアリールトリフラートとジアリールホスフィンとのクロスカップリング。金属化アレンとハロホスフィンとの反応及びＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応は、非反応性のアリール置換基を有する化合物を調製するのに適切である。トリアリールホスフィンを得るためのアリールハライド又はトリフラートとジアリールホスフィンとのクロスカップリングも公知である。トリアリールホスフィンはさらに、パラジウム触媒によるアリールハライド及び（トリメチルシリル）ジフェニルホスフィン又は（トリメチルスタニル）ジフェニル−ホスフィンのクロスカップリングによって調製してもよい。別のクロスカップリング反応は、ニッケル触媒を使用して、１，１’−ビ−２−ナフトールジスルホネートエステルとジフェニルホスフィンとをクロスカップリングして、２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチルを得る。例えば、米国特許第４，９４７０００号；第４，０３６，８８９号；及び第５，９０２，９０４号を参照。
【０１３５】
市販の（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）トリアリールホスフィンとしては、ビス（ペンタフルオロフェニル）フェニルホスフィン、（４−ブロモフェニル）ジフェニルホスフィン、４−（ジメチルアミノ）フェニルジフェニルホスフィン、ジフェニル（２−メトキシフェニル）ホスフィン、ジフェニル（ペンタフルオロフェニル）ホスフィン、２−（ジフェニルホスフィノ）ベンズアルデヒドジフェニル−２−ピリジルホスフィン、ジフェニル（ｐ−トリル）ホスフィン、トリ−２−フリルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリス（４−クロロフェニル）ホスフィン、トリス（２，６−ジメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（４−フルオロフェニル）−ホスフィン、トリス（３−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（４−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（ペンタフルオロ−フェニル）ホスフィン、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（２，４，６−トリメチルフェニル）ホスフィン、２−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸、４−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸、４，４’−（フェニル−ホスフィニデン）ビス（ベンゼンスルホン酸）、３，３’，３”−ホスフィニジントリス（ベンゼンスルホン酸）、トリ−ｍ−トリルホスフィン、トリ−ｏ−トリルホスフィン、及びトリ−ｐ−トリルホスフィンを含み、並びに（１，２−ビス（ジフェニル−ホスフィノ）ベンゼン）、及び（２，２’−ビス（ジフェニルスフィノ）−１，１’−ビナフチル（Ｓ−及びＲ−立体異性体）も含む。
【０１３６】
本発明の標識試薬の合成は、溶媒中で行われる。好適な溶媒は、常温常圧で液体であるか、又は反応中に使用される温度条件及び圧力条件下で液体状態を維持するものである。有用な溶媒は、特に制限はないが、但し、反応自体を妨害しないものであり（すなわち、これらは好ましくは不活性溶媒である）、反応物の特定の量を溶解するものである。状況に依存して、溶媒は、蒸留されるか又は脱気されてもよい。非求核性溶媒は、溶媒アルキル化がホスフィンアルキル化と競合しないため、好ましい。この溶媒は、例えば、脂肪族炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、リグロイン、石油エーテル、シクロヘキサン、又はメチルシクロヘキサン）及びハロゲン化炭化水素（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、又はジクロロベンゼン）；芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロナフタレン、エチルベンゼン、又はキシレン）；エーテル（例えば、ジグリム、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−アミルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン又はメチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、又はジエチレングリコールジメチルエーテル）；ニトリル（例えば、アセトニトリル）；ケトン（例えば、アセトン）；エステル（例えば、酢酸メチル又は酢酸エチル）；及びこれらの混合物である。
【０１３７】
一般に、反応の終了後、標識試薬は、標準的な技術に従って反応混合物から単離される。例えば、溶媒は、生成物が固体である場合、場合により減圧下で、エバポレーション又はろ過によって除去される。反応の終了後、水を残渣に添加して、水層を酸性又は塩基性にし、沈殿した化合物をろ過するが、水に感受性の化合物を取り扱う場合には注意深く行うべきである。同様に、水を疎水性溶媒とともに反応混合物に添加して、標的化合物を抽出する。有機層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム又は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させて標的化合物を得てもよい。このようにして得られた標的化合物は、必要な場合、例えば、再結晶、再沈殿、クロマトグラフィーによって、又は酸又は塩基を添加することによって塩に変換することによって精製してもよい。
【０１３８】
いくつかの好ましい標識試薬の合成は、同位体標識されたトリス（トリメトキシフェニル）ホスフィンのアルキル化を示す以下のスキームにおいて示される。
【０１３９】
【化４４】
【０１４０】
一般に、本発明の化合物は、例えば、以下に記載されるような一般的な反応スキームにおいて示される方法によって調製し得、又は容易に入手可能な出発物質、試薬及び従来の合成手順を用いてこれらを修飾することによって調製し得る。これらの反応において、それ自身が公知の改変体を利用することも可能であるが、ここでは述べない。機能的等価体及び構造的等価体は、本明細書中で記載され、同じ一般的な特性（例えば、トリアリールホスホニウム標識試薬として機能する）を有し、１つまたはそれ以上の置換基の単純な改変は、本化合物の本質的な性質又は有用性に悪影響を与えずになされる。
【０１４１】
本明細書中の化学構造は、当該技術分野で公知の従来の標準にしたがって記載される。従って、原子、例えば炭素原子が不満足な価数を有するように記載されている場合、水素原子が明示的に記載されていなくても、この価数は水素原子によって満足されるとみなされる。これに加えて、本発明の化合物は、受容可能な溶媒、例えば、水、ＴＨＦ、エタノール等とともに可溶化しない形態及び可溶化した形態で存在してもよい。一般に、可溶化した形態は、本発明の目的のために、可溶化していない形態と等価であるとみなされる。
【０１４２】
本発明の化合物は、適切な溶媒とともに、又は溶媒を含まない（例えば、凍結乾燥された）形態で溶液中に供給し得る。本発明の別の側面では、本発明の方法を実行するために必要な標識試薬及びバッファは、キットとしてひとまとめにし得る。このキットは、本明細書中に記載される方法に従って被分析物を標識するために一般に使用してよく、本発明の方法において使用するための使用説明書を含み得る。さらなるキット成分として、酸、塩基、緩衝薬剤、無機塩、溶媒、酸化防止剤、防腐剤、又は金属キレート化剤を含み得る。さらなるキット成分は、純粋な組成物として、又は１つまたはそれ以上のさらなるキット成分を組み込んだ水溶液又は有機溶液として存在する。任意の又は全てのキット成分は、場合によりさらにバッファを含む。
【０１４３】
５．マススペクトロメトリー法
本発明において使用するための好ましい質量分析計フォーマットは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。しかし、他の実施態様において、他のフォーマット、例えば、エレクトロスプレー（「ＥＳ」）ＭＳを使用してもよい。ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーにおいて、種々の質量分析器、例えば、一重又は三重の四重極モード（ＭＳ／ＭＳ）における磁気センサー／磁気偏向装置、フーリエ変換、及び飛行時間型（ＴＯＦ）構成を使用することができる。脱離／イオン化プロセスのために、多くのマトリックス／レーザーの組み合わせを使用し得る。イオントラップ及び反射構造も使用し得る。
【０１４４】
飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計は、生成したイオンが検出器まで移動するのにかかる時間を測定することによって、これらの［質量］対［電荷］比に従って分離する。ＴＯＦ質量分析計は、仮想的に限定されない［質量］対［電荷］比範囲を有する、比較的単純で、安価な装置であるため、有利である。ＴＯＦ質量分析計は、各イオン化事象から生成した全てのイオンを記録することができるため、スキャニング装置よりも潜在的に高い感度を有する。ＴＯＦ質量分析計は、従来の磁場質量分析計では感度が低すぎる、大きな有機分子の［質量］対［電荷］比を測定するのに特に有用である。米国特許第５，０４５，６９４号及び第５，１６０，８４０号を参照。
【０１４５】
ＴＯＦ質量分析計は、サンプル物質のイオンを生成するためのイオン化源を含む。イオン化源は、イオンビームを収束させ、適切に方向付けるための１つまたはそれ以上の電極又は静電レンズを含有する。所与の電気ポテンシャルによって収束したイオンの飛行時間は、［質量］対［電荷］比に比例する。従って、イオンの飛行時間は、この［質量］対［電荷］比の関数であり、［質量］対［電荷］比の二乗にほぼ比例する。単に１個の電荷を有するイオンの存在を推定し、イオンの最も軽いグループが検出器に最初に到着し、続けて、さらに思い質量グループのグループが到着する。
【０１４６】
ＭＡＬＤＩは、無傷のままに保持しつつ、１００，０００Ｄａを超える大きな生体分子の脱離及びイオン化を可能にするため、特に生物学的適用において有利に適用される。本発明はさらに、ＭＡＬＤＩ実験においてマトリックス成分によってさもなければ不明瞭になる、標識された低分子の同時分析も可能にする。
【０１４７】
エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＦ」）は、上に記載される方法に加えて、イオン化の別の方法である。エレクトロスプレーイオン化において、シリンジ針は、質量分析計の入り口のオリフィスに密接して配置されたオリフィスを有する。目的の分子を含有する希釈溶液は、シリンジ針を介して押し出される。シリンジ針オリフィスと質量分析計に導くオリフィスとの間の強力な電子ポテンシャル、典型的には３ｋＶから６ｋＶは、溶液のスプレーを形成する。エレクトロスプレーは、常圧で行われ、溶液の高度に荷電した液滴を提供する。目的の分子のイオンは、荷電された液滴から直接形成される。エレクトロスプレーイオン化は、常圧で溶液から直接生じ、このプロセスにおいて形成されたイオンは強く溶媒和される傾向がある。有用な質量測定を行うために、イオンに結合した任意の溶媒分子が効果的に除去されることが必要である。脱溶媒和は、イオンが質量分析計の真空内に入る前に、加熱ガスの強い向流によって達成し得る。エレクトロスプレーイオン化は、熱的に不安定又は不揮発性の生化学物質から高分子量のフラグメント化しないイオンを生成することができる。Ｄｏｌｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．４９，２２４０（１９６８）を参照。イオン化されたサンプルを含有する溶液が、ほぼ常圧で、質量分析計の減圧システム内に生じるプレート中の小さなオリフィスに対して、キャピラリー管から不活性ガスを含有する領域にスプレーされる。スプレーするキャピラリーと不活性ガスを含有するチャンバの壁（小さなオリフィスとプレートを含む）との間に、高い電気ポテンシャルが適用される。また、米国特許第４，５４２，２９３号及び第４，５３１，０５６号を参照。
【０１４８】
飛行時間検出器は、分離してイオン化された被分析物を測定するための好ましい検出器であり；さらに好ましくは、飛行時間質量分析器は、同じ質量のイオン間の運動エネルギーの差を較正するためのイオン反射器の後に置かれる。飛行時間質量分析器の別の任意の増強は、被分析物の分離及びイオン化と質量分析器による初期促進電圧の適用との間が短く、制御され、遅延する場合に理解される。本発明の別の任意の実施態様は、分離し、イオン化し、反射した被分析物のポストソースディケイ測定を行うためのイオン反射器を有していない。磁気イオンシクロトロン共鳴装置及び四重極質量分析器を含む他の質量分析計は、本発明の範囲内にある。
【０１４９】
本発明のトリアリールホスホニウム基は、被分析物が標識された場合に固定された陽電荷を与え、特定のマススペクトロメトリー方法の使用にかかわらず、これによりマススペクトロメトリーによる分析の感度が増す。本発明の１つの適用において、異なる検出感度を有することが知られているか、疑われる分子は、これらのＭＳ応答を正規化するために、本発明の標識試薬を用いてすべて誘導体化される。
【０１５０】
６．被分析物及びサンプル調製
本発明は、種々の被分析物をアッセイ、検出、定量、位置決定、又は分析するための方法に関する。「被分析物」は、本明細書中で使用される場合、検出され、サンプル中に存在し得る物質である。被分析物は、タンパク質又はペプチド；酵素；免疫グロブリン（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む）；ハプテン又はバクテリア、ウイルス、寄生虫、又は真菌の抗原；アミノ酸；ホルモン；レセプター；核酸；ホルモン；化学物質；生体起源又は人類起源のポリマー；病原体；毒素；糖類又は多糖類；ステロイド；ビタミン；治療薬物又は乱用薬物；細菌又はウイルス；又は上述の任意の組み合わせ又はフラグメント；及びこれらの代謝物及びこれらに対する抗体であり得る。
【０１５１】
本発明は、低分子である被分析物に有利に適用される。「低分子」は、それ自身が遺伝子転写物又翻訳物ではない化合物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、又はＤＮＡ）を指し、好ましくは低分子量、例えば約１０００未満を有する化合物を指す。
【０１５２】
検出可能な被分析物としては、例えば、食物、産業薬剤、又は化学製品の製造によって作成されるものが挙げられる。このような被分析物の例としては、食品添加物（例えば、増量剤、ビタミン、着色剤又は香味剤）、農薬（例えば、殺虫剤、防虫剤、除草剤、及び化学肥料）、界面活性剤（例えば、ナトリウムドデシルサルフェート）、接着剤（例えば、イソシアネートグルー）、樹脂（例えば、木材樹脂及びエポキシ樹脂）、有機汚染物質、及びプロセス薬品（例えば、水システムにおいて使用される化学物質）、例えば、フロックポリマー、殺虫剤、腐食防止剤、及びシーラント防止剤が挙げられる。これに加えて、被分析物は、生成物又はプロセスのマーキング又はトレーシングに使用される物質であり得る。
【０１５３】
「治療薬物」被分析物は、典型的には、適法とされ、医学的に認証され、治療目的又は診断目的のために投与される薬剤又は医薬である。治療薬物は、カウンター越し又は処方箋により入手してもよい。治療薬物の例としては、アドレナリン作用性薬剤、抗寄生虫薬剤、抗座瘡薬剤、抗アドレナリン作用性薬剤、抗アレルギー性薬剤、抗アメーバー薬剤、抗アンドロゲン薬剤、抗貧血薬剤、抗狭心症薬剤、抗不安薬剤、抗関節炎薬剤、抗喘息薬剤、抗アテローム硬化症薬剤、抗バクテリア薬剤、抗胆石剤、抗胆石源剤、抗コリン作用薬剤、凝固防止剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、下痢止め剤、抗利尿剤、解毒剤、吐き気止め剤、抗てんかん剤、抗エストロゲン剤、抗線維素溶解薬、抗真菌剤、抗緑内障薬剤、抗血友病剤、抗出血剤、抗ヒスタミン剤、抗高脂質血症剤、抗高リポタンパク質症剤、抗高血圧剤、抗感染剤、抗炎症剤、抗マラリア剤、抗菌剤、抗偏頭痛剤、抗有糸分裂剤、抗カビ剤、制吐剤、抗腫瘍剤、抗好中球減少症剤、抗肥満剤、駆虫剤、抗パーキンソン病剤、抗ぜん動剤、抗ニューモシステイス剤、抗増殖剤、抗原生動物剤、止痒剤、抗精神病剤、抗リウマチ剤、抗住血吸虫剤、抗脂漏剤、抗分泌剤、鎮痙剤、抗血栓剤、鎮咳剤、抗潰瘍剤、抗尿結石剤、及び抗ウイルス薬剤が挙げられる。
【０１５４】
治療薬物のさらなる例としては、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルコール抑止剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アンモニア解毒剤；同化促進ステロイド；覚醒剤；鎮痛剤；アンドロゲン；麻酔薬；食欲抑制薬；食欲抑制剤；良性前立腺肥大治療薬剤；血中グルコース調整剤；骨吸収インヒビター；気管支拡張剤；炭酸脱水酵素インヒビター；心臓減圧剤；心臓保護剤；強心剤；心臓血管薬剤；コリン作動性アゴニスト及びアンタゴニスト；コリンエステラーゼ不活性化剤又は阻害剤；コクシジウム抑制薬；認識アジュバント及びエンハンサー；抑制剤；診断助剤及びコントラスト薬剤；利尿剤；ドーパミン性薬剤；外部奇生生物撲滅剤；催吐剤；酵素インヒビター；及びエストロゲンが挙げられる。
【０１５５】
治療薬物のさらなる例としては、線維素溶解薬剤；蛍光薬剤；遊離酸素基捕捉剤；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタメートアンタゴニスト；胃腸移動性作動体；グルココルチコイド；毛髪増殖刺激剤；止血薬剤；ヒスタミンＨ２レセプターアンタゴニスト；ホルモン；低コレステリン血症薬剤；低血糖症薬剤；低脂血症剤；低血圧薬剤：造影薬剤；免疫化薬剤；免疫調整剤；免疫制御剤；免疫刺激剤；免疫抑制剤；インポテンス治療補助剤；角質溶解薬剤；ＬＮＲＨアゴニスト；モノアミンオキシダーゼインヒビタームコリチック薬剤；粘膜保護薬剤；鼻の鬱血除去剤；神経筋ブロッキング薬剤；神経保護薬剤；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競争的及び非競争的ＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウムチャネルオープナー；非ホルモン性ステロール誘導体；プラスミノーゲン活性剤；血小板活性因子アンタゴニスト；血小板凝集インヒビター；発作後の処置及び頭部外傷後の処置；プロスタグランジン；前立腺増殖インヒビター；向精神剤；肺表面薬剤；放射性薬剤；弛緩剤；殺疥癬虫薬；硬化剤；鎮静剤；鎮静−催眠剤；選択的アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択的セロトニン取り込みインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ナトリウム及びカルシウムチャネルブロッカー；ステロイド；興奮薬；甲状腺ホルモン及びインヒビター；甲状腺模倣物；精神安定薬；血管収縮薬；血管拡張薬；創傷治癒薬剤；及び起算地のキシダーゼインヒビターが挙げられる。
【０１５６】
「乱用薬物」又は「ストリートドラッグ（ｓｔｒｅｅｔ ｄｒｕｇ）」は、不法で違法な薬物を含む。乱用薬物は、主に娯楽目的で使用されるか、又は依存症を満足させるために使用され、資格のあるヘルスケア提供者の監督なく、しばしば自己投与されるか、又は投与される。乱用薬物はさらに、依存症又は乱用について高い潜在性を有する治療薬物、例えば、ステロイド、鎮静剤、抗うつ剤、及び他の向精神薬を含む。乱用薬物は、処方によって入手可能な場合もあるが、乱用又は依存症になりやすい。
【０１５７】
乱用薬物の例としては、利尿剤（例えば、アセタゾールアミド、アミロンデ、ベンドロフルメキアジド、ブメタニド、カンレノ、クロロメロドリン、クロロタリドン、ジクロフェンアミド、エタクリン酸、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、メルサリル、スピロノラクトン、及びトリアムテレン）、鎮痛剤（例えば、アルファプロジン、アニレリジン、スプレノルフィン、コデイン、デキストロモラミド、デキストロプロポキシフェン、ジアモルフィン、ジヒドロコデイン、ジピパノン、エトヘプタジン、エチルモルフィネ、レボルファノール、メタドン、モルフィネ、ナルブフィン、ペンタゾシン、ペチジン、フェナゾシン、及びトリメペリジン）、及びβ−ブロッカー（例えば、アセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オキシプレノロール、プロパノロール、及びソタロール）が挙げられる。
【０１５８】
乱用薬物の例としてはさらに、刺激剤（例えば、アムフェプラモン、アムフェタミン、アムフェタミニル、アミフェナゾール、ベンズフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、カフェイン、カチン、コロイフェンターミン、クロベンゾレックス、クロルプレナリン、コカイン、コチニン、クロプロパイニド、クロテタミド、ジメタムフェタミン、エフェドリン、エタフェドリン、エタミバン、エチルアムフェタミン、フェンカムファミン、フェネチリン、フェンプロポレックス、フィルレノレックス、メフェノレックス、メタムフェタミン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、メチレンジオキシメタムフェタミン、メチルフェニデート、モラゾン、ニコチンニケタミド、ペモリン、ペントラゾール、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンターミン、フェニルプロパノールアミン、ピプラドロール、プロリンタン、プロピルヘキセドリン、ピロバレロン、スチリキニン、及びテオフィリン）が挙げられる。
【０１５９】
乱用薬物のさらなる例としては、幻覚剤（例えば、リセルグ酸ジエチルアミド、メスカリン、フェンシクリジン、ケタミン、ジメトキシメチルアムフェタミン、テトラヒドロカンナビノール、マリジュアナ、メチレンジオキシメタムフェタミン）、鎮静剤、催眠剤（例えば、クロラル水和物、グルテチミド、メプロバメート、及びメタクワロン）、及び同化促進ステロイド（例えば、ボラステロン、ボルデノン、クロステボール、デヒドロメチルテストステロン、フルオキシメステロン、メステロロン、メタンジエノン、メタアンドロステノロン、メテノロン、メチルテストステロン、ナンドロロン、ノルエタンドロロン、オキサンドロロン、オキシメステロン、オキシメトロン、スタノゾロール、及びテストステロン）が挙げられる。
【０１６０】
乱用薬物のさらなる例としては、アヘン剤（例えば、ヘロイン、モルフィネ、メタンドロン、メペリジン、プロポキシフェン、及びアセチルモルフィネ）、バルビタール（例えば、アモバルビタール、ペントバルビタール、セコバルビタール、フェノバルビタール、ブタビルビタール、及びブタバルチアール）、ベンゾジアゼピン（例えば、ジアゼパム、クロラゼペート、クロロジアゼポキシド、オキサゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、アルプラゾラム、及びトリアゾラム）、抗精神病−抗うつ薬（例えば、クロロプロマジンク、トラゾドン、ハロペリドール、アモキサピン、炭酸リチウム、ドキセピン、イミプラミン、及びアミトリプチリン）、及び鎮痛剤（例えば、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ジフルニサール、及びフェニルブタゾン）が挙げられる。
【０１６１】
薬剤である被分析物の引用として、体内での薬物の迅速な代謝に起因して、しばしば検出される一次物質である元々の薬物の種々の代謝物及び誘導体をさらに含むことが意図される。例えば、親油性の精神活性化合物であるマリファナの１１−ノル−Δ−９−テトラヒドロカンナビノールは、身体組織中に蓄積するが、この主な代謝物、１１−ノル−Ａ−９−テトラヒドロカンナビノールカルボン酸は、検出可能なレベルのグルクロン酸コンジュゲートとして尿中に排出される。
【０１６２】
同様に、コカインは、体内で迅速に代謝され、ベンゾイルエクゴニン、エクゴニンメチルエステル、及び他の少量の代謝物になる。ベンゾイルエクゴニンは、エクゴニンメチルエステルよりも長い期間、尿中に検出されるので、コカイン使用の検定のための好ましい被分析物である。モルフィネは、コデインの主な代謝物である。ヘロインは、６−アセチルモルフィネに代謝され、これはさらにモルフィネ及びモルフィネ−３−グルコロニドに代謝され、これら全ては、本発明による好適な被分析物である。三環式の抗うつ薬であるドキセピン、イミプラミン、又はアミトリプチリンは、被分析物ノルドキセピン、デシプラミン、及びノルトリプチリンに代謝される。
【０１６３】
本発明による被分析物はさらに、環境上の毒素、産業汚染物質、産業化学物質、又は他の汚染物質（例えば、アミン、窒素ヘテロ環等）であり得る。被分析物はさらに、化学戦争の薬剤（例えば、有機リン及び有機ヒ素化合物）であり得る。本発明のなお別の適用は、埋め立て地域、産業起源、商業起源、及び軍事起源の危険な廃棄物を監視することである。
【０１６４】
特定の被分析物を含有することが疑われる任意の液体をサンプルとして使用することができる。本発明はさらに、固体相サンプル内に当初含有されていた被分析物を検出するために使用し得る。これらの被分析物は、分析前に、単に抽出し、溶液中に懸濁又は溶解される。固体サンプルは、生体組織（例えば、生検を行うプロセス中で得られるもの）、土、又は群葉を含んでもよい。
【０１６５】
本発明の別の側面において、サンプルは、液体源から直接的に得られる水性サンプル又は水混和性の溶液であるか、又は、固体又は半固体の水性懸濁液であるか、又は被分析物を含有することが知られているか又は疑われている固体又は半固体物質からの水性洗浄物である。サンプルは、産業起源からの物を含む、泥、水、又は空気のような環境的な供給源、例えば、荒れた小川、水源、供給ライン、又は生産用地から得られ得る。産業供給源はさらに、発酵培地、例えば、生物学的リアクター又は食物発酵プロセスの発酵培地を含む。又、産業供給源は、化学リアクター及びバイオリアクターを含む。雨水、又は海岸、河川、湖、池、又は小川由来の水もまたサンプルであってもよい。
【０１６６】
生物学的起源のサンプルは、生理学的流体、例えば、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹水液、汗、リンパ液、又は他の体液であってもよい。又、サンプルは、血液細胞、培養細胞、筋肉組織、神経細胞等の細胞溶解液である流体；細胞のすぐ外側の領域における細胞外流体；ベシクル中の液体；又は植物及び動物の血管組織中の流体を含んでもよい。
【０１６７】
サンプルは、標識及び分析の前に、必要な場合加工されてもよい。例えば、サンプルは、被分析物のさらに有効な標識を可能にするために、粒子状物質を除去するために遠心分離又はろ過してもよく、又は緩衝化してもよい。分析科学及び法医学の通常の方法に従って、サンプルは、可能な干渉成分を除去するために、最適な抽出のためのサンプルのｐＨ及びイオン強度を調整するために、又は単純にサンプルを希釈するために、前処理を受けてもよい。このような前処理方法は、当該技術分野で周知である。例えば、サンプルは、例えば、ろ過又は遠心分離によって使用前に分け得る。血液生成物サンプル及び尿は、典型的にはバッファ溶液で希釈され、タンパク質又は粒子を除去するためにろ過し得る。血液サンプルのために、音波処理を使用して細胞をフラグメント化し得る。タンパク質は、例えば、有機溶媒、過塩素酸又はトリクロロ酢酸、又は金属イオンを添加することによって生物学的サンプルから沈殿してもよい。しかし、このような沈殿は、共沈殿を介して被分析物をロスする場合がある。サンプルは、さらなる化学的改変に付されてもよい。例えば、アヘン剤を含有するサンプルは、しばしば酸水溶液で加水分解される。
【０１６８】
典型的には、標識試薬のストック溶液は、公知の量の純粋な試薬を秤量し、溶媒中に試薬を溶解することによって調製される。溶媒は、標識試薬を溶解し、反応しないものが選択されるべきである。溶媒のいくつかの例としては、緩衝化水溶液、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、又はテトラヒドロフラン）、及びこれらの混合物が挙げられる。バッファが使用される場合、標識試薬と反応しないように選択されるべきである。好適なバッファとしては、当業者に公知の任意のもの、例えば、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）が挙げられる。他のバッファとしては、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸バッファ、又は炭酸水素塩バッファが挙げられ、これらのバッファは、ＨＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＥＧＴＡ、及びクエン酸バッファからなる群から選択されるメンバーである。光感受性の標識試薬のために、ストック溶液は、常に光から保護されるべきである。標識溶液は、所望の標識濃度までストック溶液のアリコートを水性バッファで希釈することによって調製される。一般に、標識溶液中の標識試薬の量及び濃度は、顕著なバックグラウンド反応を起こさずに、被分析物を標識するのに十分なものである。使用される標識試薬の実際の量は、実験条件及び所望の結果に依存する。実験条件の最適化は、当業者によって容易に把握できる、所与の適用において使用される最適のパラメーターを決定するために望ましいであろう。
【０１６９】
標識反応条件は、温度、ｐＨ、及び媒体中の組成変化によって影響を受ける場合があるが、当該分野で周知の方法を用いて容易に決定される。一般に、サンプル（所望な場合、前処理後のサンプル）は、標識反応を起こさせるのに必要な時間、反応媒体中で標識試薬とともにインキュベートされる。最も好ましい条件下で、この時間は１時間未満であり、数秒から１０分までであることもある。
【０１７０】
本方法の感度により、本明細書中に記載されるアッセイを用いて少ない容積の反応混合物で行うことを可能にする。このことは、一般的に高スループットスクリーニングとして公知の方法で特に有用である。１つの実施態様では、反応混合物は、マイクロプレートのウェル中に存在する。別の実施態様では、反応混合物は、マイクロ流体チップ上に存在する。本発明の１つの側面では、反応混合物は、２００μＬ以下の体積を有する。
【０１７１】
アミノ基の反応性。アミン反応性の標識試薬として、アミンとの反応でカルボキサミド、スルホンアミド、ウレア、又はチオウレアを形成するアシル化試薬が挙げられる。アシル化反応の特異性及び速度論は、アシル化試薬及びアミンの両方の反応性及び濃度に依存する。遊離アミン、例えば、トリス及びグリシンを含有するバッファは、あらゆるアミン反応性標識試薬を用いるときは避けるべきである。タンパク質サンプル調製物からの残りの硫酸アンモニウム又はウレアは、標識試薬を導入する前に除去されるべきである。求核性チオールは、標識試薬と競合し得るので、濃度を制限するべきである。
【０１７２】
アミンの反応性は、主にその塩基性によって説明される。ほとんどのタンパク質はリシン残基を有し、ほとんどのタンパク質は、Ｎ−末端に遊離アミンを有する。リシンのアミン基などの脂肪族アミンは、中程度に塩基性であり、ほとんどのアシル化試薬と反応性であるが、ｐＨ８未満での脂肪族アミンの遊離形態の塩基の濃度は非常に低い。従って、アミンとイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、及び他のアシル化剤との反応はｐＨ依存性である。８．５から９．５のｐＨは、リシン残基の修飾に通常好ましい。一方、中性に近いｐＨは、Ｎ−末端アミノ基の修飾に好ましい（ｐＫａ〜７）が、約ｐＨ８．５をかなり超えると、水の存在下ではアシル化試薬の分解が起こる。スクシンイミジルエステルによるタンパク質修飾は、典型的にはｐＨ８．５で行うことができ、一方、イソチオシアネートは、最適条件のためには通常ｐＨ＞９を必要とする。
【０１７３】
芳香族アミンは、典型的に非常に弱い塩基であり、ｐＨ７でプロトン化しなく、芳香族アミンの改変は、さらに反応性の標識試薬、例えばイソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド又は酸ハライド、又はｐＨ≧４を必要としよう。アシル化試薬は、水性媒体中において、グルタミン及びアスパラギン残基の側鎖アミド、アルギニンのグアニジニウム基、ヒスチジンのイミダゾリウム基、及び非塩基性アミン、例えば、アデノシン又はグアノシン（例えば、核酸中の）とほとんど反応しない。
【０１７４】
チオール基の反応性。チオール（又はメルカプタン又はスルフヒドリル）は、天然状態中に、又はジチオスレイトール又はメルカプトエタノールを用いたシステインジスルフィドの還元において、システインを含むタンパク質中によく見られる。このようなジスルフィド還元試薬は、チオール反応性の標識試薬との反応前に除去されるべきであり、チオールの空気酸化から保護されたサンプルはジスルフィドに戻る。チオール反応性の官能基としては、アルキル化試薬、例えば、ヨードアセトアミド、マレイミド、及びブロモメチルケトンが挙げられ、これらの試薬とチオールとの反応は、通常、生理学的ｐＨ範囲（ｐＨ６．５から８．０）において室温以下で迅速に起こり、化学的に安定なチオエーテルを生じる。チオールはさらに、イソチオシアネート及びスクシンイミジルエステルを含むアミン反応性試薬と反応するが、最初の生成物は通常は不安定である。
【０１７５】
ヒドロキシ基の反応性。タンパク質（例えば、セリン、スレオニン、及びチロシン）、ステロール、及び炭水化物中のアルコールは、生体分子中に豊富であるが、水性媒体中では反応しない。ある種のアルコールは、酸化（例えば過ヨウ素酸塩を用いて）されてアミン又はヒドラジン標識試薬により容易に修飾されるアルデヒドになる。
【実施例】
【０１７６】
当業者は、過剰なルーチン実験を用いずに、本明細書中に記載される特定の手順、実施態様、特許請求の範囲、及び実施例の多くの等価体を認識するか、又は把握することができる。このような等価体は、本発明の範囲内であるとみなされ、添付の特許請求の範囲によってカバーされる。本明細書全体で引用される全ての参考文献、登録特許、及び公開された特許出願の内容は、本明細書中に参照により組込まれる。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらはさらなる限定とみなされるべきではない。
【０１７７】
上にさらに充分に説明されたように、低分子（ｍ／Ｚ＜６００Ｄａ）の被分析物の定性及び定量ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、課題があるままである。低分子を分析する目的で、大量に荷電されたタグと誘導体化合物との単純で有効なカップリング反応を開発した。軽い同位体及び重い同位体の標識試薬（式ＸＸ、ここで、Ｒ＝−ＯＣ１Ｈ３及び−ＯＣ２Ｈ３）の対を、各誘導体についてそれぞれ５７３及び５００Ｄａを加えて、開発した。原則的に、メトキシ炭素原子の同位体標識も可能である。種々の低分子被分析物を標識し、低フェトモル範囲でＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。タグ化被分析物は、マトリックス及び反応混合物のクリーンアップなしで検出し、低分子、アミノ酸、合成ペプチド、刺激物（すなわち、アムフェタミン、メタムフェタミン、及びペンテルミン）及び他の化合物（添付の図面を参照）の系統だった定量分析を可能にした。
【０１７８】
【化４５】
【０１７９】
方法及び装置：トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ、式ＸＸ）を、ペプチド配列決定に使用した。Ｗａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３０５−１７（１９９９）。本発明は、重水素化ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ｄ２７）標識試薬を開示し、ここで、各メトキシ基は重水素化されている（Ｒ＝Ｃ２Ｈ３）。固定された正電荷を含有する活性化されたエステルＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ、及び重水素化ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ｄ２７）を白色結晶性粉末として調製し、１Ｈ、１３Ｃ、３１Ｐ ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによって特徴決定した。標識試薬の無水アセトニトリル溶液（１０ｎｍｏｌ／μＬ）を、感知できるほどの分解もなく、室温で数ヶ月、デシケーター中で保存した。
【０１８０】
【化４６】
【０１８１】
種々の低分子一級アミン及び二級アミン、アミノ酸、合成ペプチド、及び制御された物質（例えば、アムフェタミン、メタムフェタミン及びペンテルミン）を試験した。トリエチルアンモニウムビカーボネートバッファ中の１００から０．１ｐｍｏｌ／μＬの範囲の被分析物を、同じ条件下で誘導体化し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって首尾よく分析した。被分析物（例えば、アミノメチルナフタレン）を２０％ＣＨ３ＣＮを含むトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファに溶解した。ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕストック溶液を無水ＣＨ３ＣＮを用いて調製した（１０ｎｍｏｌ／μＬ）。プラスチック管中で被分析物１８０μＬと標識試薬２０μＬとを約１０秒間攪拌することによって、典型的な標識反応を行い、室温で約３０分インキュベートした後、１０％ＴＦＡ（５０／５０％ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ）を添加し、例えば、式ＸＸにおけるような標識されたアミノメチルナフタレンを得た。
【０１８２】
【化４７】
【０１８３】
２０から１００ｍＭの濃度を有するトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファは、本適用において使用するのに許容し得た。３から１０モル過剰の標識試薬は、約３０分以内にカップリング反応を完了させるのに十分であった。反応混合物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析と適合性であり、標識された被分析物は、１０，０００倍過剰の試薬が使用された場合であっても、反応混合物のクリーンアップなしに直接的に分析することができた。ＴＭＰＰ−Ａｃタグ化分子の適合性のさらなる証拠が、マトリックスをもちいることのない直接的なＬＤＩ−ＭＳ分析からも観察された。反応混合物は、レーザー分離イオン化マススペクトロメトリー（ＩＤＩ−ＭＳ）のためのステンレススチールプレート上に置かれた（１μＬ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳのために、反応混合物１０μＬ及びマトリックス３０μＬ（５０／５０％ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ中の１０ｍｇ／ｍＬのシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を混合し、この１μＬを、ＭＳ分析のためにプレート上に置いた。
【０１８４】
覚醒剤の定量的分析のために、ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ｄ２７）を標準溶液とあわせ、ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕを覚醒剤を入れた溶液と反応させた。次いで、２つの等量の溶液を混合し、この１μＬをＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。ＴＭＰＰ−Ａｃ標識された被分析物を１フェトモルの低いレベルでＭＡＬＤＩ−ＭＳによって検出した。ＴＭＰＰ−Ａｃ−標識された覚醒剤を、軽い化合物及び重い化合物の両方のピーク強度と比較することによって、定量的に分析した。
【０１８５】
【化４８】
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１Ａ】図１は、ＣＩＤスペクトルを示す。図１Ａは、１個の電荷を有するペプチドＧＭＤＳＬＡＦＳＧＧＬのＣＩＤスペクトル（ｍ／Ｚ １０５３．５）を示す。図１Ｂは、ＴＭＰＰ−Ａｃ誘導体のＣＩＤスペクトルを示す（ｍ／Ｚ １６２６．５）。この結果は、ペプチドのＭＳシーケンスにおける本発明のＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ標識試薬の有用性を示す。「Ａ Ｐｉｃｏｍｏｌｅ−Ｓｃａｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｗａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９，１３７−４４（１９９７）；「Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｉｆｙ Ｔｈｅｉｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」，Ａｄａｍｃｚｙｋら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１３，１４１３−２２（１９９９）を参照。標識試薬は、ここにおいて配列の効力範囲（直接的なフラグメント化）及びイオン化効率（固定された電荷）を増すために使用し得る。
【図１Ｂ】図１は、ＣＩＤスペクトルを示す。図１Ａは、１個の電荷を有するペプチドＧＭＤＳＬＡＦＳＧＧＬのＣＩＤスペクトル（ｍ／Ｚ １０５３．５）を示す。図１Ｂは、ＴＭＰＰ−Ａｃ誘導体のＣＩＤスペクトルを示す（ｍ／Ｚ １６２６．５）。この結果は、ペプチドのＭＳシーケンスにおける本発明のＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ標識試薬の有用性を示す。「Ａ Ｐｉｃｏｍｏｌｅ−Ｓｃａｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｗａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９，１３７−４４（１９９７）；「Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｉｆｙ Ｔｈｅｉｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」，Ａｄａｍｃｚｙｋら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１３，１４１３−２２（１９９９）を参照。標識試薬は、ここにおいて配列の効力範囲（直接的なフラグメント化）及びイオン化効率（固定された電荷）を増すために使用し得る。
【図２】図２は、トリプシン消化の直接的な誘導体化の結果の概要である（Ｈｖｉａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３０５（１９９９））。本発明の方法及び試薬は、トリプシン消化の配列決定を容易にし得る。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ−ＭＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｔｒｉｓ（２，４，６−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｓ」，Ｊ．Ｔ．Ｗａｔｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３０５−１７（１９９９）（（β−Ｅｎｄｏｒｐｎｉｎ，Ｈｕｍａｎ ＧＩＰ，Ｂｏｖｉｎｅ ＧＨＲＦ，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ，Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，Ｒａｂｂｉｔ Ｇ−３ＰＤ，ＢＳＡ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ，Ｅ．Ｃｏｌｉ，ａｎｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）；及び「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉ−ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＳ／ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒａ」，Ｊ．Ｃ．Ｇｅｂｌｅｒ，Ｊ．ｈｕｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６０，２３５−４９（２００２）を参照。図２は、ペプチドの高い配列効力範囲及び直接的な配列決定に対する本発明の適用を示す。疎水性ペプチドの増加した配列効力範囲、増加したイオン化、及び単純化したサンプル調製（脱塩は必要ではない）は、本発明の有利な特徴である。固定された電荷を有するＴＭＰＰ誘導体化された分子はさらに、より高いイオン収率のために、質量分析のための改良された有効性を示し、検出感度の増加をもたらす。
【図３】図３は、実施例において議論される標識反応の生成物のＭＡＬＤＩマススペクトルを示す。
【図４】図４は、ＴＭＰＰ標識されたナフタレンメチルアミンのマススペクトルである（２００ｆｍｏｌ、マトリックスなし）。
【図５】図５は、以下の混合物の誘導体化反応を示す：２ｎｍｏｌｅ／μＬ Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン、Ｌ−カルノシン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ナフタレンメチルアミン（８０％／２０％の５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート／ＣＨ３ＣＮ中）２０μＬ及び１３０ｎｍｏｌｅ／μＬ ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ＣＨ３ＣＮ中）２μＬを混合し、５０℃で９０分放置し、次いで、０．１％ＴＦＡ水溶液１．２ｍＬを添加した。次いで、この反応混合物５μＬを１０μＬマトリックス（１０ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡ）と混合し、この１μＬで標準的なＭＡＬＤＩプレートにスポット形成し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。標的分子約１０ｐｍｏｌｅをこのプレートにスポット形成した。サンプルを洗浄することも脱塩することも必要ではなかった。
【図６】図６は、図５において記載されたサンプル１０ｐｍｏｌｅのＭＡＬＤＩマススペクトルである。
【図７Ａ】図７Ａは、標識されていない化合物のＭＡＬＤＩマススペクトルの比較である（図７Ａ−フルレンジ）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、標識した化合物のＭＡＬＤＩマススペクトルの比較である（図７Ｂ−フルレンジ）。
【図８】図８は、標識した化合物のＭＡＬＤＩマススペクトルの比較である（ズーム）。
【図９】図９は、誘導体化された混合物１００ｆｍｏｌのマススペクトルである。この図は、本方法の感度を示す。
【図１０】図１０は、マトリックスなしの混合物の誘導体化のマススペクトルである。
【図１１】図１１は、疎水性ペプチドのイオン化に対するＴＭＰＰラベルの肯定的効果を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは、トリプシン消化Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（トリエチルアンモニウムビカーボネート２０ｍＭ中）８１ｐｍｏｌｅ／μＬの４００μＬ及びＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ ３３．８ｎｍｏｌｅ／μＬ（ＣＨｓＣＮ中）の１００μＬを混合し、混合物を室温で３時間放置し、次いで、この反応混合物１０μＬと０．１％ＴＦＡ水溶液９９０μＬとを混合し、この２μＬをＭａｓｓＰｒｅｐ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｌａｔｅ上にスポット形成し、乾燥することによって調製した、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃトリプシン消化物２００ｆｍｏｌのマススペクトルを示す。ペプチドについての配列効力範囲の比較を誘導体化されていない（図１２Ａ）サンプルを用いて同定した。誘導体化されていないサンプル＝ＧＤＶＥＫＧＫＫＩ−ＦＶＱＫＣＡＱＣＨＴＶＥＫＧＧＫＨＫＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲＫＴＧＱＡＰＧＦＴＹＴＤＡＮＫＮＫＧＩＴＷＫＥＥＴＬ−ＭＥＹＬＥＮＰＫＫＹＩＰＧＴＫＭＩＦＡＧＩＫＫＫＴＥＲＥＤＬＩＡＹＬＫＫＡＴＮＥ（効力範囲：５４／１０４＝５２％）。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、トリプシン消化Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（トリエチルアンモニウムビカーボネート２０ｍＭ中）８１ｐｍｏｌｅ／μＬの４００μＬ及びＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ ３３．８ｎｍｏｌｅ／μＬ（ＣＨｓＣＮ中）の１００μＬを混合し、混合物を室温で３時間放置し、次いで、この反応混合物１０μＬと０．１％ＴＦＡ水溶液９９０μＬとを混合し、この２μＬをＭａｓｓＰｒｅｐ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｌａｔｅ上にスポット形成し、乾燥することによって調製した、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃトリプシン消化物２００ｆｍｏｌのマススペクトルを示す。ペプチドについての配列効力範囲の比較を誘導体化された（図１２Ｂ）サンプルを用いて同定した。誘導体化されたサンプル＝ＧＤＶＥＫＧＫＫＩＦＶＱＫＣＡＱＣＨＴＶＥＫＧＧＫＨＫＴ−ＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲＫＴＧＱＡＰＧＦＴＹＴＤＡＮＫＮＫＧＩＴＷＫＥＥＴＬＭＥＹＬＥＮＰＫＫＹＩＰＧＴＫＭＩ−ＦＡＧＩＫＫＫＴＥＲＥＤＬＩＡＹＬＫＫＡＴＮＥ（配列効力範囲：８１／１０４＝７９％）。
【図１３】図１３は、以下に議論されるいくつかのアミンの構造を示す。
【図１４】図１４は、図１３の誘導体化されていないアミン（２ｐｍｏｌｅ）のＭＡＬＤＩマススペクトルである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、異なるｐＨ値で誘導体化された６アミンの比較である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、異なるｐＨ値で誘導体化された６アミンの比較である。
【図１６】図１６は、種々のアミンの標識反応のｐＨ試験の結果である。
【図１７】図１７は、種々のアミンの標識反応のｐＨ試験の結果である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＭＡＬＤＩマススペクトルにおけるいくつかの特徴的なピークを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＭＡＬＤＩマススペクトルにおけるいくつかの特徴的なピークを示す。
【図１９】図１９は、いくつかの抗生物質の標識反応を示す。
【図２０】図２０は、抗生物質の定量分析において使用される典型的なマススペクトルを示す。
【図２１】図２１は、抗生物質のＭＳデータの較正曲線である。
【図２２】図２２は、図１９における標識反応の変換比の試験の結果を示す。
【図２３】図２３は、図１９における標識反応の変換比の試験の結果を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＭＡＬＤＩ方法の非常に低い検出限界を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＭＡＬＤＩ方法の非常に低い検出限界を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ウシ腎臓抽出刺激における抗生物質の試験の結果を示す。簡単に言うと、新鮮なウシ腎臓１グラム及びＥｔＯＨ（２％ＣＨ３ＣＯＯＨを含む）１０ｍＬをプラスチック管に入れ、粉砕し、遠心分離にかけて沈殿物を除去した。この溶液を新しい管に移し、５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液３０ｍｌを添加した。腎臓抽出物２ｍＬと５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液１０ｍＬとを混合することによってブランクの腎臓抽出コントロールを調製した。ノルフロキサシン５９ｐｍｏｌｅ／μＬ、シプロフロキサシン９７．５ｐｍｏｌｅ／μＬ、及びロメフロキサシン１０８．３ｐｍｏｌｅ／μＬを添加することによって、薬物添加腎臓抽出物を調製した。結果は、低フェトモルからピコモル濃度までの範囲の望ましい較正曲線により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる抗生物質の定量分析を示した（３０フェトモル以下での検出を含む）。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ウシ腎臓抽出刺激における抗生物質の試験の結果を示す。簡単に言うと、新鮮なウシ腎臓１グラム及びＥｔＯＨ（２％ＣＨ３ＣＯＯＨを含む）１０ｍＬをプラスチック管に入れ、粉砕し、遠心分離にかけて沈殿物を除去した。この溶液を新しい管に移し、５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液３０ｍｌを添加した。腎臓抽出物２ｍＬと５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液１０ｍＬ とを混合することによってブランクの腎臓抽出コントロールを調製した。ノルフロキサシン５９ｐｍｏｌｅ／μＬ、シプロフロキサシン９７．５ｐｍｏｌｅ／μＬ、及びロメフロキサシン１０８．３ｐｍｏｌｅ／μＬを添加することによって、薬物添加腎臓抽出物を調製した。結果は、低フェトモルからピコモル濃度までの範囲の望ましい較正曲線により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる抗生物質の定量分析を示した（３０フェトモル以下での検出を含む）。
【技術分野】
【０００１】
マススペクトロメトリー（「ＭＳ」）は例えば高エネルギーの電子を用いた衝撃によって目的の被分析物を含有するサンプルがイオン化される、分析技術である。得られたイオン及び親物質の荷電したフラグメントを電場及び磁場によって収束させ、荷電したフラグメントのスペクトルを得る。ＭＳはサンプル分子の分子量及びこのフラグメント化特性を測定するために、日常的に使用される。ＭＳは、典型的には、サンプルが低圧で電子線中を通る気相中で行われる。電子線は、典型的には電気的に中性のサンプル分子に衝突し、１つまたはそれ以上の電子が飛び出し、陽電荷を持つイオンが生じる。次いで、イオン化されたサンプルは磁場を通り、この磁場を通るイオン化されたサンプルの経路に依存して、イオンの電荷に対する分子の質量が測定される。
【０００２】
マススペクトロメトリーは、イオンの電荷に対する分子の質量比を測定する。この質量は、通常は、原子質量単位（Ｄａｌｔｏｎと呼ばれる）の用語で表される。荷電又はイオン化は、通常は複数の電荷の用語で表される。この２つの比率は、「ｍ／Ｚ」値（質量／電荷又は質量／イオン化比）として表される。このイオンは通常は１個の電荷を有するため、ｍ／Ｚ比は通常は「分子イオン」の質量、すなわちこの分子量（「ＭＷ」）である。サンプルの質量を測定する１つの方法は、荷電した分子、すなわちイオンを磁場中で促進することである。このサンプルイオンは、磁場の影響によって移動する。検出器は、磁場を通る経路の末端に配置することができ、分子のｍ／Ｚは磁場を通る経路及び磁場の強度の関数として計算することができる。サンプルの質量を測定するための別の技術は、飛行時間（「ＴＯＦ」）マススペクトロメトリーである。ＴＯＦ ＭＳでは、サンプルイオンは、公知の電圧によって促進され、サンプルイオン又はこれらのフラグメントが公知の距離を移動する時間を測定する。
【０００３】
マススペクトロメトリーは、通常は、電気的に中性のサンプルが低圧でイオン化される気相中で行われる。最も単純な質量分析計は、気体の電気的に中性のサンプルを、通常は約１０−６ｔｏｒｒ以下の減圧中に導入する。次いで、イオン化されたサンプルは磁場を通り、イオン化されたサンプルが磁場を通る経路に依存して、イオンの電荷に対する分子の質量が測定される。容易に気体状態にならない分子、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリマー、及び他の高分子化合物は、ＭＳによって分析することはさらに困難である。しかし、脱離イオン化技術を含む、高分子量サンプルを揮発するためのいくつかの技術が存在する。
【背景技術】
【０００４】
気体状態のサンプルで出発する代わりに、基本的なＭＳにおけるように、脱離ＭＳは、基質に吸着したサンプルに適用されてもよい。サンプル分子が基質に付着する場合、サンプルはこの基質に吸着していると言われる。脱離は、基質に吸着した分子が基質から離れるときに起こる。１つの脱離ＭＳ技術は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）である。この技術において、サンプルは、適切な基質上に付着し、次いで、蒸発プロセスの一部分として、有機マトリックスからサンプルにプロトンが移動することによってイオン化される。サンプルのイオン化は、電子線イオン化またはプロトン移動イオン化によって達成されてもよい。例えば、Ｍ．Ｋａｒａｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｒｏｃ．７８，５３−６８（１９８７）；Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２，１５１−５３（１９８８）を参照。
【０００５】
典型的なＭＡＬＤＩ実験において、サンプルは、パルスレーザー照射によって気化する固体の光吸収有機マトリックスに溶解され、気化したマトリックスとともにサンプルが移動する。この様式で、高分子量サンプルは、マススペクトロメトリー分析によって揮発されてもよい。現代のＭＡＬＤＩ質量分析計、例えばＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）は、高い感受性及び再現性を有して、１つの基質上のいくつかのサンプルの連続的な高スループット分析を可能にする。この技術は広範囲に使用され、強力な技術であるが、ＭＡＬＤＩは、マトリックスがｍ／Ｚ未満、すなわち、約５００から７００の電荷に対する質量の測定を阻害するため、一般的に低分子の試験には適していない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、各物質がカチオン性トリアリールホスホニウム基で標識されるサンプル中で、目的の複数の物質（「被分析物」）のそれぞれをアッセイ、検出、定量、位置決定、又は分析するための方法及び試薬に関する。本発明はさらに、低分子量の被分析物を含有するサンプルの分析がマトリックス成分によって妨害されないＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー技術を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、ＭＳ分析の前に被分析物の標識において使用するための、標識された被分析物がＭＡＬＤＩ技術の有用な検出閾値よりも大きな分子量を有する、標識試薬を提供する。本発明の標識試薬は、式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−で表されてよく、ここで、各Ａｒはアリール基であり（これら全ては同じであっても異なっていてよい。）、Ｐはリン原子であり、Ｒは「反応基」であり、Ｘ−は負に荷電した対イオンである。
【０００８】
いくつかの側面において、本発明は、サンプルの成分の定量的ＭＳ分析の方法を提供する。本発明の方法は、ピコモル量、フェトモル量、及びアトモル量で分子の分離／イオン化のための感受性の高い技術を含む。本発明の別の利点は、ｍ／Ｚ値の測定が、低分子干渉によって複雑化せず、マトリックスが正常に提供されることであり、従って、本発明は、低分子サンプル、及び高分子サンプル及び低分子サンプルの混合物のＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、トリアリールホスホニウム標識試薬を有するサンプルにおいて、被分析物を標識又はタグ化することによって、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法に関する。
【００１０】
１．標識試薬
本発明の標識試薬は、式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−で表されてよく、ここで、各Ａｒはアリール基であり（これら全ては同じであっても異なっていてよい。）、Ｐはリン原子であり、Ｒは「反応基」であり、Ｘ−は負に荷電した対イオンである。この反応基は、被分析物の露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって被分析物が標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する反応性官能基を有する。反応基Ｒは、−Ｚ−Ψによって表されてよく、ここで、Ｚは結合基であり、Ψは反応性官能基であり、特に、被分析物の露出した官能基と反応する官能基である。従って、本発明の標識試薬は、式Ｉによって表されてよい：
【００１１】
【化１７】
【００１２】
反応性官能基（Ψ）の性質は、標識される被分析物の化学的特徴に依存する。一般的に、本発明の標識試薬は、被分析物の露出した官能基と反応する。本明細書中で使用される場合、「露出した」官能基は、本発明の標識試薬に共有結合するようになる化学反応に参加するために利用可能な官能基である。最も単純な用語において、被分析物が求核性の露出した官能基を有する場合、求電子性Ψ基を有する標識試薬を使用してよく、この逆もよい。
【００１３】
一般に、用語「求核性試薬」は、例えば、１分子反応（「ＳＮ１」として公知である）又は２分子反応（「ＳＮ２」）のような脂肪族化学において通常生じるような、脱離基（通常は別の求核性試薬）と置き換わることによって化合物と反応する反応性電子対を有する化学基を意味すると当該技術分野で理解される。求核性試薬の例としては、電荷を有さない化合物、例えば、アミン、メルカプタン、及びアルコール、及び電荷を有する基、例えば、アルコキシド、チオレート、カルボアニオン、及び種々の有機アニオン及び無機アニオンが挙げられる。例示的なアニオン性求核性試薬としては、とりわけ、単純アニオン、例えば、アジド、シアニド、チオシアネート、アセテート、ホルメート、又はクロロホルメート、及びビスルファイトが挙げられる。適切な反応条件下では、有機金属試薬、例えば、有機銅、有機亜鉛、有機リチウム、グリニャール試薬、エノレート、及びアセチリドが好適な求核性試薬である。
【００１４】
同様に、「求電子性試薬」は、例えば、典型的に求電子置換反応中に生じるような、電子対を、特に求核性試薬から受け取ることが可能な原子、分子、又はイオンを意味する。求電子置換反応において、求電子性試薬は、例えば、別の求電子性試薬、例えば、芳香族基質（例えばベンゼン）上のニトロニウムイオンによるプロトン置換によって、別の求電子試薬を排除して基質に結合する。求電子性試薬としては、環状化合物、例えば、エポキシド、アジリジン、エピスルフィド、環状サルフェート、カーボネート、ラクトン、及びラクタム；及びサルフェート、スルホネート（例えばトシレート）、クロリド、ブロミド、及びヨージドを含む非環状求電子性試薬が挙げられる。一般的に、求電子性試薬は、脱離基二結合した飽和炭素原子（例えば、メチレン基）であり得るが、求電子性試薬はさらに、求核性試薬との反応で付加物を形成する、不飽和基、例えば、アルデヒド、ケトン、エステル、又はこれらの共役した（α，β−不飽和）アナログであり得る。
【００１５】
用語「脱離基」は、一般的に、求核性試薬（例えば、アミン、チオール、アルコール、又はシアニド）によって容易に交換され、置換される基を指す。このような脱離基は周知であり、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素）、アルコキシド、チオアルコキシドが挙げられる。種々の硫黄ベースの脱離基は、通常合成化学で使用され、アルカンスルホニルオキシ基（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルカン、例えば、メタンスルホニルオキシ、エタンスルホニルオキシ、プロパンスルホニルオキシ、及びブタンスルホニルオキシ基）及びハロゲン化アナログ（例えば、ハロゲノ（Ｃ１−Ｃ４アルカン）スルホニルオキシ基、例えば、トリフルオロメタンスルホニルオキシ（すなわち、トリフレート）、２，２，２−トリクロロエタンスルホニルオキシ、３，３，３−トリブロモプロパンスルホニルオキシ、及び４，４，４−トリフルオロブタンスルホニルオキシ基）、及びアリールスルホニルオキシ基（例えば、場合により１から３個のＣ１−Ｃ４アルキル基によって置換されたＣ６−Ｃ１０アリール、例えば、ベンゼンスルホニルオキシ、α−ナフチルスルホニルオキシ、β−ナフチルスルホニルオキシ、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（すなわち、トシレート）、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルホニルオキシ、メシチレンスルホニルオキシ、及び６−エチル−α−ナフチルスルホニルオキシ基）を含む。
【００１６】
「活性化されたエステル」は、式−ＣＯＬで表し得、ここで、Ｌは脱離基であり、この典型例としては、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基；電子吸引基（例えば、ｐ−ニトロ、ペンタフルオロ、ペンタクロロ、ｐ−シアノ、ｐ−トリフルオロメチル）で置換されたアリールオキシ基；及びカルボジイミドで活性化され、酸無水物又は混合酸無水物を形成するカルボン酸、例えば、−ＯＣＯＲａまたは−ＯＣＮＲａＮＨＲｂ、ここで、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ５−Ｃ８アルキル（例えば、シクロヘキシル）、Ｃ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、又はＣ１−Ｃ６アルコキシ基である。活性化されたエステルは、系中で形成されるか、又は単離可能な試薬であり得る。
【００１７】
用語「電子吸引基」は、当該技術分野で認識され、置換基が隣の原子から価電子（例えば、π電子）を吸引する、例えば、置換基が隣の原子よりもより電子的に陰性であるか、又は置換基が同じ位置で水素原子よりも置換基自身に対して電子をひきつける能力を記載する。Ｈａｍｍｅｔｔのシグマ値（σ）は、基の電子供与能力及び電子吸引能力の受容された測定値であり、特に、シグマパラ値（σｐ）である。例えば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３６８−７５（２００１）を参照。Ｈａｍｍｅｔｔ定数値は、一般的に、電子供与基でマイナスであり（ＮＨ２でσｐ＝−０．６６）、電子吸引基でプラスである（ニトロ基でσｐ＝０．７８）、σｐはパラ置換を示す。例となる電子吸引基としては、中でも、ニトロ、アシル（ケトン）、ホルミル（アルデヒド）、スルホニル、トリフルオロメチル、ハロゲノ（例えば、クロロ及びフルオロ）、及びシアノ基が挙げられる。逆に、「電子供与基」は、分子中の同じ位置に占められる場合、水素よりも電子を与える置換基を示す。例としては、中でも、アミノ（アルキルアミノ及びジアルキルアミノを含む）、アリール、アルコキシ（アラルコキシを含む）、アリールオキシ、メルカプト及びアルキルチオ、及びヒドロキシル基が挙げられる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、アルキル基としては、１つまたはそれ以上の炭素原子を有し、直鎖アルキル基を含有する飽和炭化水素（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等）、環状アルキル基（すなわち「シクロアルキル」又は「脂環式」又は「炭素環式環」基）（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル等）、及びアルキル置換されたアルキル基（例えば、アルキル置換されたシクロアルキル基及びシクロアルキル置換されたアルキル基）が挙げられる。用語「脂肪族基」は、直鎖又は分枝鎖によって特徴付けられる有機部分を含み、典型的には、１から２２個の炭素原子を有する。複雑な構造において、この鎖は、分枝、架橋（ｂｒｉｄｇｅ）、又は架橋（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）されていてよい。脂肪族基としては、アルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基が挙げられる。
【００１９】
特定の実施態様では、直鎖又は分枝鎖アルキル基は、この骨格中に３０以下の炭素原子、例えば、直鎖についてＣ１−Ｃ３０、又は分枝鎖についてＣ３−Ｃ３０を有していてよい。特定の実施態様では、直鎖又は分枝鎖アルキル基は、この骨格中に２０以下の炭素原子、例えば、直鎖についてＣ１−Ｃ２０、又は分枝鎖についてＣ３−Ｃ２０、さらに好ましくは１８以下の炭素原子を有していてよい。同様に、好ましいシクロアルキル基は、この環構造中に４から１０個の炭素原子、さらに好ましくは、この環構造中に４から７個の炭素原子を有する。用語「低級アルキル」は、鎖中に１から６個の炭素を有するアルキル基、及び環構造中に３から６個の炭素を有するシクロアルキル基を指す。
【００２０】
炭素数が他に特定されない限り、「低級脂肪族」、「低級アルキル」、「低級アルケニル」等におけるような「低級」は、本明細書中で使用される場合、この部分が少なくとも１個の炭素原子を有し、約８個未満の炭素原子を有することを意味する。特定の実施態様では、直鎖又は分枝鎖の低級アルキル基は、この骨格中に６個以下の炭素原子を有し（例えば、直鎖についてＣ１−Ｃ６、分枝鎖についてＣ３−Ｃ６）、さらに好ましくは４以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキル基は、この環構造中に３から８個の炭素原子、好ましくはこの環構造中に５又は６個の炭素を有する。「Ｃ１−Ｃ６アルキル」におけるような用語「Ｃ１−Ｃ６」は、１から６個の炭素原子を含有するアルキル基を意味する。
【００２１】
さらに、他に特定されなければ、アルキルとの用語は、「置換されていないアルキル」及び「置換されたアルキル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１つまたはそれ以上の炭素上で１つまたはそれ以上の水素を交換する置換基を有するアルキル基を指す。このような置換基としては、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲノ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族（ヘテロ芳香族基を含む。）が挙げ得る。
【００２２】
「アリールアルキル」基は、アリール基で置換されたアルキル基（例えば、フェニルメチル（すなわち、ベンジル））である。「アルキルアリール」部分は、アルキル基で置換されたアリール基（例えば、ｐ−メチルフェニル（すなわち、ｐ−トリル））である。用語「ｎ−アルキル」は、直鎖（すなわち、分岐していない。）置換されていないアルキル基を意味する。「アルキレン」基は、対応するアルキル基の二価アナログである。用語「アルケニル」及び「アルキニル」は、アルキルに類似であるが、少なくとも１つの二重結合又は三重結合の炭素−炭素結合をそれぞれ含有する不飽和脂肪族基を指す。好適なアルケニル及びアルキニル基としては、２から約１２個の炭素原子、好ましくは２から約６個の炭素原子を有する基を含む。
【００２３】
用語「芳香族基」又は「アリール基」は、１以上の環を含有する、不飽和及び芳香族の環状炭化水素、及び不飽和及び芳香族のヘテロ環を含む。アリール基はさらに、芳香族ではない脂環式環又はヘテロ環式環と融合又は架橋して多環式環（例えば、テトラリン）を形成し得る。「アリーレン」基は、アリール基の二価アナログである。
【００２４】
用語「ヘテロ環式基」は、環中の１つまたはそれ以上の炭素原子が炭素以外の元素、例えば、窒素、硫黄、又は酸素である、炭素環式基に類似の閉環構造を含む。ヘテロ環式基は、飽和であっても不飽和であってもよい。さらに、ヘテロ環式基（例えば、ピロリル、ピリジル、イソキノリル、キノリル、プリニル、及びフリル）は、芳香族性を有していてもよく、この場合、これらのヘテロ環式基は、「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」基と称され得る。
【００２５】
他に定められない限り、アリール及びヘテロ環式（ヘテロアリールを含む）基はさらに、１つまたはそれ以上の構成原子で置換されてもよい。ヘテロ芳香族及びヘテロ環式基の例は、１つの環あたり３から約８個の原子及び１つまたはそれ以上のＮ、Ｏ又はＳヘテロ原子を含む１から３の別個の環又は縮合環を有し得る。概して、用語「ヘテロ原子」は、炭素又は水素以外の任意の元素の原子を含み、これらの好ましい例としては、窒素、酸素、硫黄、及びリンが挙げられる。ヘテロ環基は、飽和又は不飽和の芳香族であり得る。
【００２６】
通常の炭化水素アリール基は、１個の環を有するフェニル基である。２環の炭化水素アリール基としては、ナフチル、インデニル、ベンゾシクロオクテニル、ベンゾシクロヘプテニル、ペンタレニル及びアズレニル基、並びにこれらの部分的に水素化されたアナログ（インダニル及びテトラヒドロナフチルなど）が挙げられる。例示的な３環の炭化水素アリール基としては、アセフチレニル、フルオレニル、フェナレニル、フェナントレニル、及びアントラセニル基が挙げられる。
【００２７】
アリール基はさらに、ヘテロ一環式アリール基、すなわち、１個の環のヘテロアリール基、例えば、チエニル、フリル、ピラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、及びピリダジニル基；及びこれらの酸化されたアナログ、例えば、ピリドニル、オキサゾロニル、ピラゾロニル、イソキサゾロニル、及びチアゾロニル基を含む。対応する水素化された（すなわち、非芳香族の）ヘテロ一環式基としては、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル及びピペリジノ、ピペラジニル、及びモルホリノ及びモルホリニル基が挙げられる。
【００２８】
アリール基はさらに、縮合した２環のヘテロアリール、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、クロメニル、イソクロメニル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノロニル、キノロニル、ナフチリジニル、及びプテリジニル基、及び部分的に水素化されたアナログ、例えば、クロマニル、イソクロマニル、インドリニル、イソインドリニル、及びテトラヒドロインドリル基を含む。アリール基はさらに、縮合した３環の基、例えば、フェノキサチイニル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、及びジベンゾフラニル基を含む。
【００２９】
用語「アミノ」は、本明細書中で使用される場合、式−ＮＲａＲｂの非置換又は置換の部分を指し、ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して水素、アルキル、アリール、又はヘテロシクリルであるか、又はＲａ及びＲｂは、これらが結合する窒素原子とともに、環中に３から８個の原子を有する環状部分を形成する。従って、用語「アミノ」は、他に言及されない限り、環状アミノ部分、例えば、ピペリジニル又はピロリジニル基を含む。従って、用語「アルキルアミノ」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基に結合したアミノ基を有するアルキル基を意味する。好適なアルキルアミノ基としては、１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられる。
【００３０】
用語「アルキルチオ」は、アルキル基に結合したスルフヒドリル基を有するアルキル基を指す。好適なアルキルチオ基としては、１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられる。
【００３１】
用語「アルキルカルボキシル」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基に結合したカルボキシル基を有するアルキル基を意味する。
【００３２】
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基に結合した酸素原子を有するアルキル基を意味する。代表的なアルコキシ基としては、１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。
【００３３】
用語「ニトロ」は−ＮＯ２を意味し；用語「ハロゲン」又は「ハロゲノ」又は「ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを示し；用語「チオール」、「チオ」、又は「メルカプト」はＳＨを意味し；用語「ヒドロキシル」又は「ヒドロキシ」は−ＯＨを意味する。
【００３４】
他に特定されない限り、上述の基を含む本発明の化合物の化学部分は、置換されていても置換されていなくてもよい。いくつかの実施態様において、用語「置換」は、上記部分が、水素以外の部分に配置され（すなわち、ほとんどの場合、水素を交換して）、この分子が目的の機能を行うことができるような置換基を有することを意味する。置換基の例としては、直鎖又は分枝のアルキル（好ましくはＣ１−Ｃ５）、シクロアルキル（好ましくはＣ３−Ｃ８）、アルコキシ（好ましくはＣ１−Ｃ６）、チオアルキル（好ましくはＣ１−Ｃ６）、アルケニル（好ましくはＣ２−Ｃ６）、アルキニル（好ましくはＣ２−Ｃ６）、ヘテロ環、炭素環のアリール（例えばフェニル）、アリールオキシ（例えばフェノキシ）、アラルキル（例えばベンジル）、アリールオキシアルキル（例えばフェニルオキシアルキル）、アリールアセトアミドイル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル、アルキルカルボニル及びアリールカルボニル又は他のこのようなアシル基、ヘテロアリールカルボニル、及びヘテロアリール基、及び（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＮＲ’Ｒ”（例えば、−ＮＨ２）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＮ（例えば、−ＣＮ）、−ＮＯ２、ハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉ）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｃ（ハロゲン）３（例えば、−ＣＦ３）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３（ＣＮＨ）ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（Ｏ）１−２ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（Ｏ）０−３Ｒ’（例えば、−ＳＯ３Ｈ）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ（例えば、−ＣＨ２ＯＣＨ３及び−ＯＣＨ３）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ（例えば、−ＳＨ及び−ＳＣＨ３）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＯＨ（例えば、−ＯＨ）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ”）０−３（置換又は非置換フェニル）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３（Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯ２Ｒ’（例えば、−ＣＯ２Ｈ）、及び（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＯＲ’基（ここで、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である。）；又は天然に生じる任意のアミノ酸の側鎖から選択される部分が挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施態様では、「置換基」は、例えば、ハロゲノ、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロシクリル、アラルキル、及びアリール（ヘテロアリールを含む）基からなる群から選択されてよい。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明の標識試薬は、活性化されたエステル反応性官能基（Ψ）を有し、従って式ＩＩによって表されてよく、ここで、Ｌは脱離基である。このような標識試薬は、求核性の露出した官能基（例えばアミン）を有する被分析物の標識に有用である。本発明の類似の実施態様において、活性化されたエステルは、式ＩＩａにおけるように、メチレン基（すなわち、Ｚ＝ＣＨ２）によってトリアリールホスホニウム基に接続される。
【００３７】
【化１８】
【００３８】
スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロチオフェノールエステル、及びスルホテトラフルオロフェノールは、式ＩＩの好ましい実施態様である。しかし、式ＩＩのエステル脱離基は、例えば、置換又は非置換のＣ１−Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、又はヘキシル）、又は置換又は非置換のＣ６−Ｃ１４アリール又はヘテロ環式基、例えば、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、２，２−ジブロモエチル、２，２，２−トリクロロエチル、３−フルオロプロピル、４−クロロブチル、メトキシメチル、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル、エトキシメチル、Ｎ−プロポキシメチル、イソプロポキシメチル、Ｎ−ブトキシメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、１−エトキシエチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−（イソプロポキシ）エチル、３−メトキシプロピル−４−メトキシブチル、フルオロメトキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル）、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、３−フルオロプロポキシメチル、４−クロロブトキシエチル、ジブロモメトキシエチル、２−クロロエトキシプロピル、フルオロメトキシブチル、２−メトキシエトキシメチル、エトキシメトキシエチル、メトキシエトキシプロピル、メトキシエトキシブチル、ベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、９−アントリルメチル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、３，４，５−トリメチルベンジル、４−メトキシベンジル、４−メトキシフェニルジフェニルメチル、２−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、４−クロロベンジル、４−ブロモベンジル、４−シアノベンジル、４−シアノベンジルジフェニルメチル、又はビス（２−ニトロフェニル）メチル基であってもよい。
【００３９】
１つの側面では、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、最初に被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（この反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）の標識試薬と反応させる工程を含む。
【００４０】
別の実施態様では、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；露出した基を含有し、上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる被分析物を含有するサンプルを得る工程；及び上記標識試薬と上記被分析物とを反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物が形成させる工程を含む。このような方法によれば、標識試薬は、構造［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（この反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）を有し得る。
【００４１】
別の側面では、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、最初に被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、前記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物と少なくとも２つの標識試薬（又は複数の試薬）とを反応させる工程（標識試薬のそれぞれは［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；各標識試薬のＡｒ３Ｐ基の分子量は、他の標識試薬のＡｒ３Ｐ基の分子量に対して固有である。）を有する。）を含む。
【００４２】
また、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法である。この方法は、それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程（ここで、上記標識試薬の反応基は全て同じであり、上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）；被分析物（上記被分析物は、露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び上記標識試薬を上記被分析物と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる、工程を含む。
【００４３】
本発明の方法において、トリアリールホスホニウム基の分子量における上述の差がマススペクトロメトリーで識別可能であることが好ましい。同様に、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の分子量における差がマススペクトロメトリーで識別可能であることが好ましい。分子量は、これらのＭＳシグナルが有意に重ならないか、又は各分子イオンのピークエリアが互いに干渉しない場合、マススペクトロメトリーで識別可能である。
【００４４】
別の代表例において、本発明は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法であって、この方法は、被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−、［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−、［Ａｒ＊＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−等（式中、各Ａｒ基（すなわち、Ａｒ、Ａｒ＊、及びＡｒ＊＊等）はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、各標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は固有であり；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。）の少なくとも２つの標識試薬と反応させる工程を含む。
【００４５】
本発明はさらに、サンプルを分析する方法であって、この方法は、被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。）と反応させることによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程を含む。
【００４６】
なお別の実施態様において、本発明は、サンプルを分析する方法であって、この方法は、反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；被分析物（上記被分析物は、露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；上記標識試薬を上記被分析物と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程を含む。このような方法において、本発明の標識試薬は、構造［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）を有し得る。
【００４７】
従って、本発明は、サンプルを分析する方法を含み、この方法は、被分析物を含むサンプルを得る工程（ここで、上記被分析物は露出した基を含む。）；及び上記被分析物を式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−及び［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒ及びＡｒ＊はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、Ａｒ３Ｐの分子量はＡｒ＊３Ｐの分子量とは異なっており；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。）の少なくとも２つの標識試薬と反応させる工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程を含む。
【００４８】
なお別の側面において、本発明は、サンプルを分析する方法であって、この方法は、それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程（ここで、上記標識試薬の反応基は全て同じであり、上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）；被分析物（上記被分析物は露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び上記標識試薬を上記被分析物と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程を含む。このような方法によれば、各標識試薬は、構造［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；Ｘ−は負に荷電した対イオンである。）を有し得る。
【００４９】
本発明の方法によれば、分析する工程は、典型的にはマススペクトロメトリー技術である。マススペクトロメトリー技術は、好ましくは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化マススペクトロメトリー又はエレクトロスプレーマススペクトロメトリーである。さらに、マススペクトロメトリー技術は好ましくは定量的である。
【００５０】
本発明の定量的方法の例として、それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程（ここで、上記標識試薬の反応基は全て同じであり、上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）；被分析物（上記被分析物は露出した基を含有し、上記露出した基は上記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；第１容器中で、上記の第１標識試薬を上記サンプルの第１部分と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び第２容器中で、上記の第２標識試薬を上記サンプルの第２部分と反応させて上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程を含む。反応が終了した後、上記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物と上記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物とを併せて混合物を形成し；次いで、上記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する。
【００５１】
このような定量的方法は、場合により、上記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を上記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物に対して定量的に比較する工程をさらに含んでよい。いくつかの場合において、定量的な比較は、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の相対量と相関関係にある。例えば、サンプルの第２部分に対する前記サンプルの前記第１部分の比率が予め決定され、明確であり、これにより定量化が可能である。この比率は、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物のＭＳシグナルと相関関係にあってよい。また、上記第１標識試薬で標識された被分析物のシグナルと、上記第２標識試薬で標識された同じ被分析物のシグナルにおける違いが、上記混合物中のこれらの濃度の違いに対して直線的に関連し得る。
【００５２】
本発明の標識試薬において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のアリール基からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のヘテロアリール基からなる群から選択される。他の実施態様において、各Ａｒ基は、置換又は非置換の芳香族炭化水素からなる群から選択される。
【００５３】
なおさらなる実施態様において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリル基からなる群から選択される。
【００５４】
さらに、各Ａｒ基は、置換又は非置換の５−及び６−員環単環基からなる群から選択される。別の側面において、各Ａｒ基は、置換又は非置換のフェニル、ピロリル、フリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、及びピリミジニル基からなる群から選択される。
【００５５】
各Ａｒ基はさらに、置換又は非置換の多環式アリール基からなる群から選択されてもよい。各Ａｒ基はさらに、置換又は非置換のナフチル、テトラヒドロナフチル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、メチレンジオキシフェニル、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、インドリル、ベンゾフラニル、プリニル、デアザプリニル、及びインドリジニル基からなる群から選択されてもよい。１つの側面において、２つのＡｒ基はともに１つの二価芳香族基を形成し、例えば、二価芳香族基は、置換又は非置換の１，１’−ビナフタ−２，２’−ジイル、フェニレン、及びキシリレン基からなる群から選択される。さらに、各Ａｒ基は、非置換フェニル、非置換ナフチル、非置換インデニル、非置換アントラセニル、置換フェニル、置換ナフチル、置換インデニル、及び置換アントラセニル基からなる群から選択されてもよい。
【００５６】
１つの実施態様では、Ａｒ３Ｐ基は、置換又は非置換のトリフェニルホスフィン、ナフチルジフェニルホスフィン、ジナフチルフェニルホスフィン、トリナフチルホスフィン、９−アントリルジフェニルホスフィン、９−アントリルジナフチルホスフィン、ジフェニルピレニルホスフィン、ジナフチルピレニルホスフィンからなる群から選択される。さらに特定的な実施態様では、ナフチルは１−ナフチル又は２−ナフチルである。
【００５７】
上記アリール基は置換されていてよい。上記置換基は、例えば、アルキル又はアルコキシ基であってよい。上記置換基はさらに、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択されてよい。いくつかの場合において、上記置換基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はＣ１−Ｃ４アルキルアルコキシ基である。
【００５８】
上記アリール置換基はさらに、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択し得る。
【００５９】
上記Ａｒ３Ｐ基は、置換トリフェニルホスフィン、例えば、トリ（ｐ−メトキシフェニル）−ホスフィンであり得る。
【００６０】
別の代表例において、本発明の標識試薬は、式Ｉ
【００６１】
【化１９】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（上記反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及び
ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、上記Ｙ基はいずれも上記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する。より特定的には、上記標識試薬は、下式
【００６２】
【化２０】
の構造を有してよい。いずれかの場合において、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択されてよい。
【００６３】
同様に、標識試薬は、下式
【００６４】
【化２１】
の構造を有してよく、又は標識試薬は、下式
【００６５】
【化２２】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（上記反応基は、上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；
ｎは０から５の整数であり；
Ｙは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、上記Ｙ基はいずれも上記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有してもよい。
【００６６】
いくつかの場合において、Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択される。
【００６７】
本発明の標識試薬はさらに、下式
【００６８】
【化２３】
〔式中、Ｙ、ｎ及びＸは上のいずれかの実施態様において定義されたとおりである。〕
の構造を有してもよい。
【００６９】
１つの実施態様による本発明の標識試薬において、トリアリールホスホニウム標識試薬はそれぞれ同じ化学構造を有し、各トリアリールホスホニウム標識試薬は、他のトリアリールホスホニウム標識試薬と比較して同位体が豊富である。トリアリールホスホニウム標識試薬は、１２Ｃ、１２Ｃ、１Ｈ、又は２Ｈの同位体が豊富である。例えば、上に記載される構造において、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、Ｏ１２Ｃ１Ｈ３、Ｏ１２Ｃ２Ｈ３、Ｏ１３Ｃ１Ｈ３、及びＯ１３Ｃ２Ｈ３からなる群から選択されてもよい。
【００７０】
対イオンＸ−は、ハライド、トリフレート、サルフェート、ニトレート、ヒドロキシド、カーボネート、ビカーボネート、アセテート、ホスフェート、オギザレート、シアニド、アルキルカルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、アルコキシド、チオアルコキシド、アルカンスルホニルオキシ、ハロゲン化アルカンスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ、ビサルフェート、オギザレート、バレレート、オレエート、パルミテート、ステアレート、ラウレート、ボレート、ベンゾエート、ラクテート、シトレート、マレエート、フマレート、スクシネート、タートレート、ナフチルレートメシレート、グルコヘプトネート、又はラクトビオネートであってよい。いくつかの場合において、対イオンＸ−はアニオン性Ｙ基であり、標識試薬は両性イオン性である。
【００７１】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるような標識試薬を含む組成物であってよい。さらに、本発明は、本明細書中に記載される新規な任意の化学化合物に関する。
【００７２】
例えば、本発明は、それぞれが式［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−（式中、各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。〕の少なくとも２つの異なる標識試薬を含む組成物であり得る。
【００７３】
同様に、本発明は、少なくとも２つの異なる標識試薬を含み、それぞれが、下式
【００７４】
【化２４】
〔式中、Ｐはリン原子であり；Ｒは、反応基（上記反応基は上記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって上記被分析物が上記標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ；スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、上記Ｙ基はいずれも上記Ｒ基と反応しなく；及びＸ−は負に荷電した対イオンである。〕
の異なる分子量を有する、組成物を含む。
【００７５】
本発明の標識試薬は、標識される被分析物に対して求電子性又は求核性であってよい。標識試薬の電気的特性は、これらのアリール基の選択、及びこれらに結合する置換基の選択によって少なくとも部分的に制御されてよい。標識試薬の溶解性及び反応性は、アリール基又はこれらの置換基を選択する場合にさらに考慮して設計される。
【００７６】
２．反応性官能基（Ψ）及び結合基（Ｚ）
本発明の標識試薬は、多種類の基質を標識するが、但し、標識される基質は、少なくとも１つの反応性官能基（Ψ）との適切な反応性を有する官能基を含有する。本発明の、標識試薬において、Ｒ基は、結合基（Ｚ）を介してトリアリールホスホニウムのリン原子と結合する少なくとも１つの反応性官能基（Ψ）を含有する。
【００７７】
反応性官能基は、被分析物の露出した官能基の反応性を補完するように選択される。典型的には、反応基Ψは、適切な反応性を保持している反応基の最も単純なバージョンである。官能基の種類は、典型的には、接合される有機被分析物又は無機被分析物上に存在し、例としては、限定されないが、アミン、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、イミダゾール、ヒドラゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、カルボン酸、又はこれらの基の組み合わせが挙げられる。アミン、チオール、及びアルコールは、特に生体分子中で、他の官能基よりも反応性が高く、利用しやすいため、コンジュゲート形成のための露出した基として好ましい。
【００７８】
遊離アミン基（すなわち、−ＮＨ２）は、Ψが、カルボン酸、カルボン酸の誘導体、又はカルボン酸の活性化されたエステル、好ましくは、スクシンイミジル又はスルホスクシンイミジルエステルである標識試薬と簡便に反応する。アミン反応性の標識試薬は、特に、遊離アミン基を保有するタンパク質及びポリペプチドの標識において有用である。アミン反応性標識試薬はさらに、遊離アミン基で置換された物質、例えば、アミノ−デキストラン、又はアミン含有ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び核酸を標識するために使用し得る。
【００７９】
遊離のチオール基を有する被分析物を標識するために使用される標識試薬は、好ましくは、Ψが、ハロアルキル、ハロアセトアミド、ハロメチルベンズアミド、マレイミド基、又はスルホネートエステルであり、ここで、スルホン酸は、アルキルスルホン酸、ペルフルオロアルキルスルホン酸、又はアリールスルホン酸である。いくつかの実施態様において、Ψ基は、ヨードアセトアミド、マレイミド、又はハロメチルベンズアミドであり得る。好ましいアルコール反応性及びフェノール反応性標識試薬は、Ψ基がイソシアネート又はアシルニトリルである、本発明の標識試薬である。
【００８０】
典型的には、Ψ基は、アミン、チオール、又はアルコールと共有結合を形成する反応性官能基である。１つの実施態様では、反応基Ψは、カルボン酸、カルボン酸の活性化されたエステル、アシルアジド、アシルハライド、対称又は非対称酸無水物、アクリルアミド、アルコール、チオール、アルデヒド、アミン、アジド、イミドエステル、スルホネートエステル、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、又はマレイミド基である。別の実施態様では、Ψは、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、アミン、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、イソチオシアネート、又はマレイミド基である。
【００８１】
典型的には、Ψがカルボン酸の活性化されたエステルである場合、Ψはスクシンイミジルエステルである。なお別の実施態様において、Ψは、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、アミン、酸無水物、アニリン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホニルハライド、又はチオール基である反応性官能基である。
【００８２】
特定の実施態様において、反応基Ψは、得られる標識された物質をトリアリールホスホニウム自身から分離するためのスペーサーとして役立つ、複数の介在する原子（本明細書中で「結合基」と称される）を介して、トリアリールホスホニウムに結合している。この結合基は、式Ｉにおいて「Ｚ」によって表される。この結合基は、典型的には、安定な化学結合（典型的には炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、及び炭素−硫黄結合を含む。）を用いて、反応性官能基Ψにトリアリールホスホニウムが結合するように選択される。結合基Ｚは、炭素−炭素の単結合、二重結合、酸重結合又は芳香族の結合に加えて、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、尿素、又はウレタン官能部分であり得る。好ましいＺ部分は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１から２０個の非水素原子を有する。結合Ｚの最も長い直鎖セグメントは、好ましくは、１から６個の非水素原子を含有する。結合基は、任意の目的とする標識反応に対して不活性であるべきである。
【００８３】
結合基Ｚは、１個のメチレン基（すなわち、ＣＨ２）であり得る。別の実施態様において、結合基は、ポリメチレン、−（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−であり、ここで、ｎは１から１０、又は１から６、又は１から４、又は１から２であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である。
【００８４】
１つの好ましい実施態様において、トリアリールホスホニウム基のリン原子は、メチレン基に結合し、この場合、結合基は、式−（ＣＨ２）（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−によって表わし得、ここで、ｎは０から９、又は０から５、又は０から３、又は０であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である。従って、本発明の標識試薬は、式ＩＩＩ及びＩＩＩａ（ここで、Ｒ’及びＲ”は水素である。）によって表わし得る。
【００８５】
【化２５】
【００８６】
典型的には、この反応基は、標識される物質上にすでにある官能基と適切な反応性を有するように選択される。標識試薬の反応性官能基及び被分析物の露出した官能基は、典型的には、容易に反応して共有結合を生成する求電子性試薬及び求核性試薬である。典型的には（そうでなければならないのでないが）、標識試薬上の反応性官能基は求電子性試薬であり、標識される基質上の露出した官能基は求核性試薬である。一般に、アミン、チオール、及びアルコールは、生体分子の修飾のために反応性が高く、利用しやすいので、コンジュゲート形成のための好ましい求核性の露出した官能基である。しかし、多種類の他の官能基（カルボン酸、アルデヒド及びケトンを含む。）が当業者によって十分に理解されている条件下で反応する。官能基及び結合の選択された例が以下の表１に示され、ここで、求電子性基及び求核性基の反応により、共有結合が生じる。
【００８７】
【表１】
【００８８】
被分析物にトリアリールホスホニウム基が結合する特定の共有結合は、典型的には、被分析物自身に天然に存在する官能基、又は当該技術分野で一般的に公知の方法に従う被分析物の誘導体化の結果として存在する官能基に依存する。本発明の好ましい側面では、反応性官能基（Ψ）は、イソチオシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、アシルニトリル、スクシンイミジル及びチオスクシンイミジルエステル、活性化されたカルボン酸、スルホニルクロリド、酸クロリド、アルデヒド、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、マレイミド、アルキル化試薬、ジスルフィド、ホウ酸、ヒドラジン、及びアミンからなる群から選択される。
【００８９】
イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、及びアシルニトリル。イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）は、長期保存中に劣化する場合がある。しかし、いくつかのアシルアジドは、８０℃に加熱するとイソシアネートに容易に変換される（以下に示すＣｕｒｔｉｕｓ転移による）。イソシアネートは、アミンと反応して尿素を形成する。
【００９０】
【化２６】
【００９１】
アルコールは、水溶液中よりも無水有機溶媒中で、かなり容易に修飾される。アシルアジド及びアシルニトライトは、脂肪族アミンと直接反応して、対応するスクシンイミジルエステルが反応するのと同じ生成物になる。しかし、有機溶媒中で反応させる場合、これらの試薬はさらに、アルコール及びフェノールの誘導体を形成する場合がある。本発明のイソシアネート標識試薬及びアシルアジド標識試薬は、以下の式ＩＶ及びＶのものを含む。
【００９２】
【化２７】
【００９３】
イソシアネートは、イソチオシアネートよりも、アルコール（及びアミン）との反応性がかなり高い。典型的なプロトコルにおいて、アシルアジド及びアルコールは、有機溶媒中でともに加熱され、イソシアネートはすぐにアルコールと反応して、以下に示すように、安定なウレタンを形成する。
【００９４】
【化２８】
【００９５】
アシルニトリルは、有機溶媒中のアルコールと反応して、カルボン酸エステルを与える。本発明のアシルニトリル標識試薬は、以下の式ＶＩ及びＶＩａ（ここで、Ｚはメチレン基である。）のものを含む。
【００９６】
【化２９】
【００９７】
イソシアネートに対する代替物は、イソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）であり、これは、水及び他の溶媒中で中程度に反応性であるが、より安定である。イソチオシアネートは、以下に示されるように、アミンと反応してチオウレアを形成する。
【００９８】
【化３０】
【００９９】
チオウレア生成物は、適度に安定であるが、一般に、スクシンイミジルエステル及びスルホニルハライドの生成物と同程度には安定でない。
【０１００】
スクシンイミジル及びチオスクシンイミジルエステル、活性化されたカルボン酸。スクシンイミジル（「ＮＨＳ」）エステルは、得られたアミド結合がペプチド結合と同等に安定であるため、アミン修飾のための好ましい反応基である。本発明のＮＨＳエステル標識試薬は、式ＶＩＩの構造を有する。
【０１０１】
【化３１】
【０１０２】
Ψがカルボン酸のスクシンイミジルエステルである場合、反応性標識試薬は、特に、標識されたタンパク質又はオリゴヌクレオチドを調製するために有用である。この試薬は、乾燥していれば長期間安定であり、以下に示されるように、芳香族アミン、アルコール及びフェノールよりも、脂肪族アミンと選択的に反応する。
【０１０３】
【化３２】
【０１０４】
スクシンイミジルエステルはさらに、チオールと反応してチオエステルを生成するが、このようなチオアシル基は、付近のアミンに移動する（例えば、タンパク質中のＣｙｓ→Ｌｙｓ）。スクシンイミジルエステルの加水分解は、標識反応と競争するが、この副反応はｐＨ＜９に維持することによって制限し得る。以下に示される式ＶＩＩＩ及びＶＩＩＩａのスルホスクシンイミジル（「ＮＨＳＳ」）エステル、式ＩＸのペンタフルオロチオフェノールエステル、及び式Ｘ及びＸａのスルホテトラフルオロフェノール（「ＳＩＰ」）エステルは、異なる溶解性を有するＮＨＳエステルの代わりとなるものである。
【０１０５】
【化３３】
【０１０６】
これらのスルホネート化試薬は、ＮＨＳエステルよりも高い水溶性を有し、有機溶媒の存在しない媒体中で使用されてよい。スルホスクシンイミジルエステル及びＳＴＰエステルは、カルボン酸標識試薬、カルボジイミド、及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド又は４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノールからそれぞれインサイチューで調製し得る。
【０１０７】
カルボン酸はさらに、酸クロリド及び酸無水物を調製するために有用であり得、スクシンイミジルエステルとは異なり、芳香族アミン及びアルコールを標識するためにさらに有用である。ヒドラジン誘導体はさらに、アミンとよく似た反応性を有し、ある場合には、水溶性のカルボジイミド活性化されたカルボン酸基に結合させることができる。
【０１０８】
【化３４】
【０１０９】
式ＸＩ、ＸＩａ、ＸＩＩ、及びＸＩＩａの標識試薬のアミン及びカルボキシレート反応性官能基は、ペプチド合成における通常の種々のアミド結合形成方法において使用してもよい。このような方法は、典型的には、カルボジイミド、活性化された酸無水物及びエステル、及びアシルハライド、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド、ＤＰＰＡ、ＰＰＡ、ＢＯＰ試薬、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、オキサリルクロリド、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＨＢＰｙＵ、ＨＢＰｉｐＵ、ＰｙＢｒｏＰ、ＴＤＢＴＵ、ＴＯＴＵ、ＢｒｏＰ、ＰｙＣｌｏＰ、ＰｙＣＩＵ、ＰｉｐＣＩＵ、クロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−フォルムアミジニウムテトラフルオロボレート、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムテトラフルオロボレート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−エチルオキシカルボニル−２−エチルオキシ−１，２−ジヒドロキノン、及びプロパンホスホン酸、酸無水物を含む、カップリング試薬を使用する。例えば、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１１０６５−１３３（１９９３）；Ｍ．Ａ．Ｇａｌｌｏｐら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３−５１（１９９４）；Ｒ．Ｓｃｈｗｙｚｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｓｉｅｂｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４９，１３４（１９６６）；Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１９６３）；Ｂ．Ｇｕｔｔｅ及びＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｉｂｉｄ．９１，５０１（１９６９）；及び米国特許第４，５０７，２３０号；第５，２５８，４５４号；及び第６，２０４，３６１号を参照。
【０１１０】
典型的には、アミン又はアニリンは、その遊離アミノ基を介して、好適なカルボジイミドカップリング薬剤、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（「ＤＣＣ」）を用いて、場合により触媒、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（「ＨＯＢｔ」）、及びジメチルアミノピリジン（「ＤＭＡＰ」）の存在下で、適切なカルボン基質に結合する。他の方法としては、活性化エステル及び酸無水物の形成後、場合により塩基の存在下で、遊離アミンとの反応によるものが挙げられる。例えば、保護されたＢｏｃ−アミノ酸又はＣｂｚ−アミジノ安息香酸は、塩基（例えば、Ｎ−メチルモルホリン、ＤＭＡＰ、又はトリアルキルアミン）の存在下で、イソブチルクロロホルメートを用いて無水溶媒中で処理され、「活性化された酸無水物」を形成し、これは、次いで、アミンと反応する。
【０１１１】
スルホニルクロリド及び酸クロリド。式ＸＩＩＩ及びＸＩＩＩａのスルホニルクロリド及び式ＸＩＶ及びＸＩＶａの酸クロリドは、水中で、特に脂肪族アミンとの反応に必要とされるさらに高いｐＨで高反応性であり、不安定であり、これらは、ｐＨ８．３の水溶液で室温で２から３分で加水分解される。従って、このような試薬は、好ましくは、低温で使用される。得られたスルホンアミドは、通常は非常に安定である。スルホニルクロリドは、フェノール（チロシンを含む）、脂肪族アルコール（多糖類を含む）、チオール（例えばシステイン）、及びイミダゾール（例えばヒスチジン）と反応するが、生成物は一般的に不安定であり、特に、脂肪族アルコールとの生成物は、求核置換を受けやすい。これらの反応性のために、非求核性溶媒が好ましい。
【０１１２】
【化３５】
【０１１３】
アルデヒド。式ＸＶ及びＸＶａのアルデヒド標識試薬は、アミンと反応してＳｃｈｉｆｆ塩基（たとえば、式ＸＶＩ）を形成し、これは、水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元アミノ化によってさらに安定化されてもよい。
【０１１４】
【化３６】
【０１１５】
ヨードアセトアミド及びブロモアセトアミド。ヨードアセトアミド標識試薬（式ＸＶＩＩ、ここでＸはヨウ素原子である）は、全てのチオール（ペプチド及びタンパク質中に見出されるものを含む）と容易に反応し、チオエーテルを形成する。これらは、対応するブロモアセトアミド（式ＸＶＩＩ、ここでＸは臭素原子である）よりもいくらか反応性が高い。ヨードアセトアミド及びブロモアセトアミドはさらに、ヒスチジン又はチロシンと反応し得るが、一般的に、遊離のチオールのみが存在する場合、これらはカルボキシレート又はアルコールをアルキル化する場合がある。
【０１１６】
【化３７】
【０１１７】
ヨードアセトアミドはアミンの遊離塩基と反応し得るが、ほとんどの脂肪族アミン（タンパク質のＮ末端を除く）はプロトン化され、ｐＨ８未満では比較的反応性が低く、このため、標識反応の選択性は、反応ｐＨを制御することによって影響を受ける場合がある。ヨードアセトアミドは、固有に光に、特に溶液中で不安定であり；及びこれらの試薬との標識反応は、光を減らした条件下で行なうべきである。システイン、グルタチオン、又はメルカプトコハク酸を反応混合物に添加して、チオール反応性標識試薬の反応を止め、非常に水溶性の付加物を得て、これは容易に除去された。本発明のいくつかのヨードアセトアミド及びブロモアセトアミド標識試薬と被分析物分子のアミン及びチオールとの標識反応を以下に示す。
【０１１８】
【化３８】
【０１１９】
マレイミド。Ψがマレイミドである場合、反応性標識試薬（式ＸＶＩＩＩ及びＸＶＩＩＩａにおけるような）は、チオール含有基質にコンジュゲート形成するのに特に有用である。チオール基は、二重結合に付加することによって、マレイミドと反応して、式ＸＩＸに示されるようなチオエーテルを形成する。マレイミドは、メチオニン、ヒスチジン、又はチロシンよりもシステインのチオールに対して選択的である。マレイミドとアミンとの反応は、通常、マレイミドとチオールとの反応よりも高いｐＨを必要とする。マレイミドの加水分解は、特にｐＨ８より高いｐＨでは、チオール修飾と顕著に競争する。さらに、マレイミド付加物は、求核性反応（隣接アミンとの）によって加水分解又は開環し得る。
【０１２０】
【化３９】
【０１２１】
アルキル化試薬及びジスルフィド。アルキルハライド及びアリール化薬剤及びジスルフィド（典型的には対称のもの）は、チオール−ジスルフィド交換反応を受け、新しい非対称ジスルフィドを形成し、この反応は自由に不可逆であり、チオール特異的である。これらのチオール反応性標識試薬からの共有結合付加物は、概して、ヨードアセトアミド又はマレイミドからの付加物よりも加水分解に耐性がある。
【０１２２】
ホウ酸。ホウ酸標識試薬（式ＸＸ及びＸＸａにおけるような）は、隣接ジオール及び特定のアミノアルコールと反応して、それぞれ式ＸＸＩ及びＸＸＩＩに示されるような環状錯体を形成する。
【０１２３】
【化４０】
【０１２４】
ヒドラジン及びアミン。ヒドラジン及びアミンは、アルデヒド及びケトンと容易に反応するが、これらの官能基は生体サンプル中ではアミンとして一般的ではない（遊離の還元糖を含有する多糖類を除く）。にもかかわらず、アルデヒド及びケトンを分子内に導入するためのいくつかの方法が公知であり、例えば、過ヨウ素酸塩で媒介される隣接ジオールの酸化、またはアルケンの四酸化オスミウム酸化、及び過ヨウ素酸塩によるアルデヒドに対する酸化が公知である。過ヨウ素酸塩はさらに、特定のアミノアルコール及びチオールを酸化するが、隣接するジオールの酸化よりは速度が低い。従って、形成されるアルデヒド及びケトンは、式ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＶ、及びＸＩＶａのアミン又はヒドラジン標識試薬で標識されてもよい。
【０１２５】
【化４１】
【０１２６】
グルタルアルデヒドは、固定化された組織サンプルの調製において一般的に使用され、残りのアルデヒド基（式ＸＸＶ）は、ヒドラジン及びアミンと結合させて式ＸＸＶＩの生成物を得てもよい。
【０１２７】
【化４２】
【０１２８】
ヒドラジン誘導体、例えば、ヒドラジド、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドは、アルデヒド及びケトンの安定なコンジュゲートを形成するための反応性標識試薬である。ヒドラジンは、ケトン及びアルデヒドと反応して、安定なヒドラゾンとなる。これらのヒドラゾンは、水素化ホウ素ナトリウムで還元して、さらに結合安定性を増し得る。一級脂肪族及び芳香族アミンは、アルデヒド及びケトンと可逆的に反応してＳｃｈｉｆｆ塩基を形成する。この反応が可逆性であるため、ヒドラゾン誘導体は、通常、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムによって還元される。水溶性化合物のカルボン酸はさらに、カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含む水溶液中でヒドラジン及びアミンに結合し得る。
【０１２９】
４．標識試薬の合成
本発明の標識試薬及び化合物は、提供される特定の手順において記載されるように、本明細書中に記載されるスキーム及びプロトコルに従って容易に調製し得る。しかし、本発明の化合物を形成するための他の合成経路を使用してもよく、以下は単に例として提供されており、本発明を限定するものではないことを当業者は認識する。例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋによる「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）を参照。当該技術分野で標準的な種々の保護及び脱保護ストラテジーが使用されることがさらに認識される（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓを参照）。任意の特定の保護基（例えば、アミン及びカルボキシル保護基）が、続く反応条件に関して、保護される部分の安定性に依存することを関連技術の当業者は認識し、適切な選択が理解される。
【０１３０】
標識試薬は、脱離基Ｌが求核置換してアルキル化トリアリールホスホニウム化合物を得ることを示す以下のスキームに示されるように、トリアリールホスフィンのアルキル化によって簡便に合成し得る。
【０１３１】
【化４３】
【０１３２】
反応性官能基Ψそれ自体は、ホスフィンの直接アルキル化に干渉し、従って、これらの合成前駆体（Ψ＊）が好ましいことを当業者は理解する。例えば、前駆体は、反応性官能基が保護基でマスクされている反応性官能基であってもよい。アルキル化の後に、保護基は、種々の当該技術分野で認識される技術のいずれかに従って除去される。
【０１３３】
句「保護基」は、本明細書中で使用される場合、所望でない化学変換から潜在的に反応性の官能基を保護する、一時的な置換基を意味する。このような保護基の例としては、それぞれ、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、及びアルデヒド及びケトンのアセタール及びケタールが挙げられる。Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第３編；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照。
【０１３４】
トリアリールホスフィンは、合成してもよいし、又は市販の供給源から獲得してもよい。トリアリールホスフィンは、遷移金属の周知のリガンドであり、広く市販されている。トリアリールホスフィンは、いくつかの方法によって一般に合成される。ハロホスフィンとアリールグリニャール試薬又は有機リチウム試薬との反応、ジアリールホスフィンの金属化、続くアリールハライド又はアリールスルホネートエステルとの反応、ハロホスフィンと活性化芳香族環とのＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応、及びアリールハライド又はアリールトリフラートとジアリールホスフィンとのクロスカップリング。金属化アレンとハロホスフィンとの反応及びＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応は、非反応性のアリール置換基を有する化合物を調製するのに適切である。トリアリールホスフィンを得るためのアリールハライド又はトリフラートとジアリールホスフィンとのクロスカップリングも公知である。トリアリールホスフィンはさらに、パラジウム触媒によるアリールハライド及び（トリメチルシリル）ジフェニルホスフィン又は（トリメチルスタニル）ジフェニル−ホスフィンのクロスカップリングによって調製してもよい。別のクロスカップリング反応は、ニッケル触媒を使用して、１，１’−ビ−２−ナフトールジスルホネートエステルとジフェニルホスフィンとをクロスカップリングして、２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチルを得る。例えば、米国特許第４，９４７０００号；第４，０３６，８８９号；及び第５，９０２，９０４号を参照。
【０１３５】
市販の（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）トリアリールホスフィンとしては、ビス（ペンタフルオロフェニル）フェニルホスフィン、（４−ブロモフェニル）ジフェニルホスフィン、４−（ジメチルアミノ）フェニルジフェニルホスフィン、ジフェニル（２−メトキシフェニル）ホスフィン、ジフェニル（ペンタフルオロフェニル）ホスフィン、２−（ジフェニルホスフィノ）ベンズアルデヒドジフェニル−２−ピリジルホスフィン、ジフェニル（ｐ−トリル）ホスフィン、トリ−２−フリルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリス（４−クロロフェニル）ホスフィン、トリス（２，６−ジメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（４−フルオロフェニル）−ホスフィン、トリス（３−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（４−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（ペンタフルオロ−フェニル）ホスフィン、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（２，４，６−トリメチルフェニル）ホスフィン、２−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸、４−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸、４，４’−（フェニル−ホスフィニデン）ビス（ベンゼンスルホン酸）、３，３’，３”−ホスフィニジントリス（ベンゼンスルホン酸）、トリ−ｍ−トリルホスフィン、トリ−ｏ−トリルホスフィン、及びトリ−ｐ−トリルホスフィンを含み、並びに（１，２−ビス（ジフェニル−ホスフィノ）ベンゼン）、及び（２，２’−ビス（ジフェニルスフィノ）−１，１’−ビナフチル（Ｓ−及びＲ−立体異性体）も含む。
【０１３６】
本発明の標識試薬の合成は、溶媒中で行われる。好適な溶媒は、常温常圧で液体であるか、又は反応中に使用される温度条件及び圧力条件下で液体状態を維持するものである。有用な溶媒は、特に制限はないが、但し、反応自体を妨害しないものであり（すなわち、これらは好ましくは不活性溶媒である）、反応物の特定の量を溶解するものである。状況に依存して、溶媒は、蒸留されるか又は脱気されてもよい。非求核性溶媒は、溶媒アルキル化がホスフィンアルキル化と競合しないため、好ましい。この溶媒は、例えば、脂肪族炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、リグロイン、石油エーテル、シクロヘキサン、又はメチルシクロヘキサン）及びハロゲン化炭化水素（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、又はジクロロベンゼン）；芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロナフタレン、エチルベンゼン、又はキシレン）；エーテル（例えば、ジグリム、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−アミルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン又はメチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、又はジエチレングリコールジメチルエーテル）；ニトリル（例えば、アセトニトリル）；ケトン（例えば、アセトン）；エステル（例えば、酢酸メチル又は酢酸エチル）；及びこれらの混合物である。
【０１３７】
一般に、反応の終了後、標識試薬は、標準的な技術に従って反応混合物から単離される。例えば、溶媒は、生成物が固体である場合、場合により減圧下で、エバポレーション又はろ過によって除去される。反応の終了後、水を残渣に添加して、水層を酸性又は塩基性にし、沈殿した化合物をろ過するが、水に感受性の化合物を取り扱う場合には注意深く行うべきである。同様に、水を疎水性溶媒とともに反応混合物に添加して、標的化合物を抽出する。有機層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム又は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させて標的化合物を得てもよい。このようにして得られた標的化合物は、必要な場合、例えば、再結晶、再沈殿、クロマトグラフィーによって、又は酸又は塩基を添加することによって塩に変換することによって精製してもよい。
【０１３８】
いくつかの好ましい標識試薬の合成は、同位体標識されたトリス（トリメトキシフェニル）ホスフィンのアルキル化を示す以下のスキームにおいて示される。
【０１３９】
【化４４】
【０１４０】
一般に、本発明の化合物は、例えば、以下に記載されるような一般的な反応スキームにおいて示される方法によって調製し得、又は容易に入手可能な出発物質、試薬及び従来の合成手順を用いてこれらを修飾することによって調製し得る。これらの反応において、それ自身が公知の改変体を利用することも可能であるが、ここでは述べない。機能的等価体及び構造的等価体は、本明細書中で記載され、同じ一般的な特性（例えば、トリアリールホスホニウム標識試薬として機能する）を有し、１つまたはそれ以上の置換基の単純な改変は、本化合物の本質的な性質又は有用性に悪影響を与えずになされる。
【０１４１】
本明細書中の化学構造は、当該技術分野で公知の従来の標準にしたがって記載される。従って、原子、例えば炭素原子が不満足な価数を有するように記載されている場合、水素原子が明示的に記載されていなくても、この価数は水素原子によって満足されるとみなされる。これに加えて、本発明の化合物は、受容可能な溶媒、例えば、水、ＴＨＦ、エタノール等とともに可溶化しない形態及び可溶化した形態で存在してもよい。一般に、可溶化した形態は、本発明の目的のために、可溶化していない形態と等価であるとみなされる。
【０１４２】
本発明の化合物は、適切な溶媒とともに、又は溶媒を含まない（例えば、凍結乾燥された）形態で溶液中に供給し得る。本発明の別の側面では、本発明の方法を実行するために必要な標識試薬及びバッファは、キットとしてひとまとめにし得る。このキットは、本明細書中に記載される方法に従って被分析物を標識するために一般に使用してよく、本発明の方法において使用するための使用説明書を含み得る。さらなるキット成分として、酸、塩基、緩衝薬剤、無機塩、溶媒、酸化防止剤、防腐剤、又は金属キレート化剤を含み得る。さらなるキット成分は、純粋な組成物として、又は１つまたはそれ以上のさらなるキット成分を組み込んだ水溶液又は有機溶液として存在する。任意の又は全てのキット成分は、場合によりさらにバッファを含む。
【０１４３】
５．マススペクトロメトリー法
本発明において使用するための好ましい質量分析計フォーマットは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。しかし、他の実施態様において、他のフォーマット、例えば、エレクトロスプレー（「ＥＳ」）ＭＳを使用してもよい。ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーにおいて、種々の質量分析器、例えば、一重又は三重の四重極モード（ＭＳ／ＭＳ）における磁気センサー／磁気偏向装置、フーリエ変換、及び飛行時間型（ＴＯＦ）構成を使用することができる。脱離／イオン化プロセスのために、多くのマトリックス／レーザーの組み合わせを使用し得る。イオントラップ及び反射構造も使用し得る。
【０１４４】
飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計は、生成したイオンが検出器まで移動するのにかかる時間を測定することによって、これらの［質量］対［電荷］比に従って分離する。ＴＯＦ質量分析計は、仮想的に限定されない［質量］対［電荷］比範囲を有する、比較的単純で、安価な装置であるため、有利である。ＴＯＦ質量分析計は、各イオン化事象から生成した全てのイオンを記録することができるため、スキャニング装置よりも潜在的に高い感度を有する。ＴＯＦ質量分析計は、従来の磁場質量分析計では感度が低すぎる、大きな有機分子の［質量］対［電荷］比を測定するのに特に有用である。米国特許第５，０４５，６９４号及び第５，１６０，８４０号を参照。
【０１４５】
ＴＯＦ質量分析計は、サンプル物質のイオンを生成するためのイオン化源を含む。イオン化源は、イオンビームを収束させ、適切に方向付けるための１つまたはそれ以上の電極又は静電レンズを含有する。所与の電気ポテンシャルによって収束したイオンの飛行時間は、［質量］対［電荷］比に比例する。従って、イオンの飛行時間は、この［質量］対［電荷］比の関数であり、［質量］対［電荷］比の二乗にほぼ比例する。単に１個の電荷を有するイオンの存在を推定し、イオンの最も軽いグループが検出器に最初に到着し、続けて、さらに思い質量グループのグループが到着する。
【０１４６】
ＭＡＬＤＩは、無傷のままに保持しつつ、１００，０００Ｄａを超える大きな生体分子の脱離及びイオン化を可能にするため、特に生物学的適用において有利に適用される。本発明はさらに、ＭＡＬＤＩ実験においてマトリックス成分によってさもなければ不明瞭になる、標識された低分子の同時分析も可能にする。
【０１４７】
エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＦ」）は、上に記載される方法に加えて、イオン化の別の方法である。エレクトロスプレーイオン化において、シリンジ針は、質量分析計の入り口のオリフィスに密接して配置されたオリフィスを有する。目的の分子を含有する希釈溶液は、シリンジ針を介して押し出される。シリンジ針オリフィスと質量分析計に導くオリフィスとの間の強力な電子ポテンシャル、典型的には３ｋＶから６ｋＶは、溶液のスプレーを形成する。エレクトロスプレーは、常圧で行われ、溶液の高度に荷電した液滴を提供する。目的の分子のイオンは、荷電された液滴から直接形成される。エレクトロスプレーイオン化は、常圧で溶液から直接生じ、このプロセスにおいて形成されたイオンは強く溶媒和される傾向がある。有用な質量測定を行うために、イオンに結合した任意の溶媒分子が効果的に除去されることが必要である。脱溶媒和は、イオンが質量分析計の真空内に入る前に、加熱ガスの強い向流によって達成し得る。エレクトロスプレーイオン化は、熱的に不安定又は不揮発性の生化学物質から高分子量のフラグメント化しないイオンを生成することができる。Ｄｏｌｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．４９，２２４０（１９６８）を参照。イオン化されたサンプルを含有する溶液が、ほぼ常圧で、質量分析計の減圧システム内に生じるプレート中の小さなオリフィスに対して、キャピラリー管から不活性ガスを含有する領域にスプレーされる。スプレーするキャピラリーと不活性ガスを含有するチャンバの壁（小さなオリフィスとプレートを含む）との間に、高い電気ポテンシャルが適用される。また、米国特許第４，５４２，２９３号及び第４，５３１，０５６号を参照。
【０１４８】
飛行時間検出器は、分離してイオン化された被分析物を測定するための好ましい検出器であり；さらに好ましくは、飛行時間質量分析器は、同じ質量のイオン間の運動エネルギーの差を較正するためのイオン反射器の後に置かれる。飛行時間質量分析器の別の任意の増強は、被分析物の分離及びイオン化と質量分析器による初期促進電圧の適用との間が短く、制御され、遅延する場合に理解される。本発明の別の任意の実施態様は、分離し、イオン化し、反射した被分析物のポストソースディケイ測定を行うためのイオン反射器を有していない。磁気イオンシクロトロン共鳴装置及び四重極質量分析器を含む他の質量分析計は、本発明の範囲内にある。
【０１４９】
本発明のトリアリールホスホニウム基は、被分析物が標識された場合に固定された陽電荷を与え、特定のマススペクトロメトリー方法の使用にかかわらず、これによりマススペクトロメトリーによる分析の感度が増す。本発明の１つの適用において、異なる検出感度を有することが知られているか、疑われる分子は、これらのＭＳ応答を正規化するために、本発明の標識試薬を用いてすべて誘導体化される。
【０１５０】
６．被分析物及びサンプル調製
本発明は、種々の被分析物をアッセイ、検出、定量、位置決定、又は分析するための方法に関する。「被分析物」は、本明細書中で使用される場合、検出され、サンプル中に存在し得る物質である。被分析物は、タンパク質又はペプチド；酵素；免疫グロブリン（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む）；ハプテン又はバクテリア、ウイルス、寄生虫、又は真菌の抗原；アミノ酸；ホルモン；レセプター；核酸；ホルモン；化学物質；生体起源又は人類起源のポリマー；病原体；毒素；糖類又は多糖類；ステロイド；ビタミン；治療薬物又は乱用薬物；細菌又はウイルス；又は上述の任意の組み合わせ又はフラグメント；及びこれらの代謝物及びこれらに対する抗体であり得る。
【０１５１】
本発明は、低分子である被分析物に有利に適用される。「低分子」は、それ自身が遺伝子転写物又翻訳物ではない化合物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、又はＤＮＡ）を指し、好ましくは低分子量、例えば約１０００未満を有する化合物を指す。
【０１５２】
検出可能な被分析物としては、例えば、食物、産業薬剤、又は化学製品の製造によって作成されるものが挙げられる。このような被分析物の例としては、食品添加物（例えば、増量剤、ビタミン、着色剤又は香味剤）、農薬（例えば、殺虫剤、防虫剤、除草剤、及び化学肥料）、界面活性剤（例えば、ナトリウムドデシルサルフェート）、接着剤（例えば、イソシアネートグルー）、樹脂（例えば、木材樹脂及びエポキシ樹脂）、有機汚染物質、及びプロセス薬品（例えば、水システムにおいて使用される化学物質）、例えば、フロックポリマー、殺虫剤、腐食防止剤、及びシーラント防止剤が挙げられる。これに加えて、被分析物は、生成物又はプロセスのマーキング又はトレーシングに使用される物質であり得る。
【０１５３】
「治療薬物」被分析物は、典型的には、適法とされ、医学的に認証され、治療目的又は診断目的のために投与される薬剤又は医薬である。治療薬物は、カウンター越し又は処方箋により入手してもよい。治療薬物の例としては、アドレナリン作用性薬剤、抗寄生虫薬剤、抗座瘡薬剤、抗アドレナリン作用性薬剤、抗アレルギー性薬剤、抗アメーバー薬剤、抗アンドロゲン薬剤、抗貧血薬剤、抗狭心症薬剤、抗不安薬剤、抗関節炎薬剤、抗喘息薬剤、抗アテローム硬化症薬剤、抗バクテリア薬剤、抗胆石剤、抗胆石源剤、抗コリン作用薬剤、凝固防止剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、下痢止め剤、抗利尿剤、解毒剤、吐き気止め剤、抗てんかん剤、抗エストロゲン剤、抗線維素溶解薬、抗真菌剤、抗緑内障薬剤、抗血友病剤、抗出血剤、抗ヒスタミン剤、抗高脂質血症剤、抗高リポタンパク質症剤、抗高血圧剤、抗感染剤、抗炎症剤、抗マラリア剤、抗菌剤、抗偏頭痛剤、抗有糸分裂剤、抗カビ剤、制吐剤、抗腫瘍剤、抗好中球減少症剤、抗肥満剤、駆虫剤、抗パーキンソン病剤、抗ぜん動剤、抗ニューモシステイス剤、抗増殖剤、抗原生動物剤、止痒剤、抗精神病剤、抗リウマチ剤、抗住血吸虫剤、抗脂漏剤、抗分泌剤、鎮痙剤、抗血栓剤、鎮咳剤、抗潰瘍剤、抗尿結石剤、及び抗ウイルス薬剤が挙げられる。
【０１５４】
治療薬物のさらなる例としては、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルコール抑止剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アンモニア解毒剤；同化促進ステロイド；覚醒剤；鎮痛剤；アンドロゲン；麻酔薬；食欲抑制薬；食欲抑制剤；良性前立腺肥大治療薬剤；血中グルコース調整剤；骨吸収インヒビター；気管支拡張剤；炭酸脱水酵素インヒビター；心臓減圧剤；心臓保護剤；強心剤；心臓血管薬剤；コリン作動性アゴニスト及びアンタゴニスト；コリンエステラーゼ不活性化剤又は阻害剤；コクシジウム抑制薬；認識アジュバント及びエンハンサー；抑制剤；診断助剤及びコントラスト薬剤；利尿剤；ドーパミン性薬剤；外部奇生生物撲滅剤；催吐剤；酵素インヒビター；及びエストロゲンが挙げられる。
【０１５５】
治療薬物のさらなる例としては、線維素溶解薬剤；蛍光薬剤；遊離酸素基捕捉剤；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタメートアンタゴニスト；胃腸移動性作動体；グルココルチコイド；毛髪増殖刺激剤；止血薬剤；ヒスタミンＨ２レセプターアンタゴニスト；ホルモン；低コレステリン血症薬剤；低血糖症薬剤；低脂血症剤；低血圧薬剤：造影薬剤；免疫化薬剤；免疫調整剤；免疫制御剤；免疫刺激剤；免疫抑制剤；インポテンス治療補助剤；角質溶解薬剤；ＬＮＲＨアゴニスト；モノアミンオキシダーゼインヒビタームコリチック薬剤；粘膜保護薬剤；鼻の鬱血除去剤；神経筋ブロッキング薬剤；神経保護薬剤；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競争的及び非競争的ＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウムチャネルオープナー；非ホルモン性ステロール誘導体；プラスミノーゲン活性剤；血小板活性因子アンタゴニスト；血小板凝集インヒビター；発作後の処置及び頭部外傷後の処置；プロスタグランジン；前立腺増殖インヒビター；向精神剤；肺表面薬剤；放射性薬剤；弛緩剤；殺疥癬虫薬；硬化剤；鎮静剤；鎮静−催眠剤；選択的アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択的セロトニン取り込みインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ナトリウム及びカルシウムチャネルブロッカー；ステロイド；興奮薬；甲状腺ホルモン及びインヒビター；甲状腺模倣物；精神安定薬；血管収縮薬；血管拡張薬；創傷治癒薬剤；及び起算地のキシダーゼインヒビターが挙げられる。
【０１５６】
「乱用薬物」又は「ストリートドラッグ（ｓｔｒｅｅｔ ｄｒｕｇ）」は、不法で違法な薬物を含む。乱用薬物は、主に娯楽目的で使用されるか、又は依存症を満足させるために使用され、資格のあるヘルスケア提供者の監督なく、しばしば自己投与されるか、又は投与される。乱用薬物はさらに、依存症又は乱用について高い潜在性を有する治療薬物、例えば、ステロイド、鎮静剤、抗うつ剤、及び他の向精神薬を含む。乱用薬物は、処方によって入手可能な場合もあるが、乱用又は依存症になりやすい。
【０１５７】
乱用薬物の例としては、利尿剤（例えば、アセタゾールアミド、アミロンデ、ベンドロフルメキアジド、ブメタニド、カンレノ、クロロメロドリン、クロロタリドン、ジクロフェンアミド、エタクリン酸、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、メルサリル、スピロノラクトン、及びトリアムテレン）、鎮痛剤（例えば、アルファプロジン、アニレリジン、スプレノルフィン、コデイン、デキストロモラミド、デキストロプロポキシフェン、ジアモルフィン、ジヒドロコデイン、ジピパノン、エトヘプタジン、エチルモルフィネ、レボルファノール、メタドン、モルフィネ、ナルブフィン、ペンタゾシン、ペチジン、フェナゾシン、及びトリメペリジン）、及びβ−ブロッカー（例えば、アセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オキシプレノロール、プロパノロール、及びソタロール）が挙げられる。
【０１５８】
乱用薬物の例としてはさらに、刺激剤（例えば、アムフェプラモン、アムフェタミン、アムフェタミニル、アミフェナゾール、ベンズフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、カフェイン、カチン、コロイフェンターミン、クロベンゾレックス、クロルプレナリン、コカイン、コチニン、クロプロパイニド、クロテタミド、ジメタムフェタミン、エフェドリン、エタフェドリン、エタミバン、エチルアムフェタミン、フェンカムファミン、フェネチリン、フェンプロポレックス、フィルレノレックス、メフェノレックス、メタムフェタミン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、メチレンジオキシメタムフェタミン、メチルフェニデート、モラゾン、ニコチンニケタミド、ペモリン、ペントラゾール、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンターミン、フェニルプロパノールアミン、ピプラドロール、プロリンタン、プロピルヘキセドリン、ピロバレロン、スチリキニン、及びテオフィリン）が挙げられる。
【０１５９】
乱用薬物のさらなる例としては、幻覚剤（例えば、リセルグ酸ジエチルアミド、メスカリン、フェンシクリジン、ケタミン、ジメトキシメチルアムフェタミン、テトラヒドロカンナビノール、マリジュアナ、メチレンジオキシメタムフェタミン）、鎮静剤、催眠剤（例えば、クロラル水和物、グルテチミド、メプロバメート、及びメタクワロン）、及び同化促進ステロイド（例えば、ボラステロン、ボルデノン、クロステボール、デヒドロメチルテストステロン、フルオキシメステロン、メステロロン、メタンジエノン、メタアンドロステノロン、メテノロン、メチルテストステロン、ナンドロロン、ノルエタンドロロン、オキサンドロロン、オキシメステロン、オキシメトロン、スタノゾロール、及びテストステロン）が挙げられる。
【０１６０】
乱用薬物のさらなる例としては、アヘン剤（例えば、ヘロイン、モルフィネ、メタンドロン、メペリジン、プロポキシフェン、及びアセチルモルフィネ）、バルビタール（例えば、アモバルビタール、ペントバルビタール、セコバルビタール、フェノバルビタール、ブタビルビタール、及びブタバルチアール）、ベンゾジアゼピン（例えば、ジアゼパム、クロラゼペート、クロロジアゼポキシド、オキサゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、アルプラゾラム、及びトリアゾラム）、抗精神病−抗うつ薬（例えば、クロロプロマジンク、トラゾドン、ハロペリドール、アモキサピン、炭酸リチウム、ドキセピン、イミプラミン、及びアミトリプチリン）、及び鎮痛剤（例えば、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ジフルニサール、及びフェニルブタゾン）が挙げられる。
【０１６１】
薬剤である被分析物の引用として、体内での薬物の迅速な代謝に起因して、しばしば検出される一次物質である元々の薬物の種々の代謝物及び誘導体をさらに含むことが意図される。例えば、親油性の精神活性化合物であるマリファナの１１−ノル−Δ−９−テトラヒドロカンナビノールは、身体組織中に蓄積するが、この主な代謝物、１１−ノル−Ａ−９−テトラヒドロカンナビノールカルボン酸は、検出可能なレベルのグルクロン酸コンジュゲートとして尿中に排出される。
【０１６２】
同様に、コカインは、体内で迅速に代謝され、ベンゾイルエクゴニン、エクゴニンメチルエステル、及び他の少量の代謝物になる。ベンゾイルエクゴニンは、エクゴニンメチルエステルよりも長い期間、尿中に検出されるので、コカイン使用の検定のための好ましい被分析物である。モルフィネは、コデインの主な代謝物である。ヘロインは、６−アセチルモルフィネに代謝され、これはさらにモルフィネ及びモルフィネ−３−グルコロニドに代謝され、これら全ては、本発明による好適な被分析物である。三環式の抗うつ薬であるドキセピン、イミプラミン、又はアミトリプチリンは、被分析物ノルドキセピン、デシプラミン、及びノルトリプチリンに代謝される。
【０１６３】
本発明による被分析物はさらに、環境上の毒素、産業汚染物質、産業化学物質、又は他の汚染物質（例えば、アミン、窒素ヘテロ環等）であり得る。被分析物はさらに、化学戦争の薬剤（例えば、有機リン及び有機ヒ素化合物）であり得る。本発明のなお別の適用は、埋め立て地域、産業起源、商業起源、及び軍事起源の危険な廃棄物を監視することである。
【０１６４】
特定の被分析物を含有することが疑われる任意の液体をサンプルとして使用することができる。本発明はさらに、固体相サンプル内に当初含有されていた被分析物を検出するために使用し得る。これらの被分析物は、分析前に、単に抽出し、溶液中に懸濁又は溶解される。固体サンプルは、生体組織（例えば、生検を行うプロセス中で得られるもの）、土、又は群葉を含んでもよい。
【０１６５】
本発明の別の側面において、サンプルは、液体源から直接的に得られる水性サンプル又は水混和性の溶液であるか、又は、固体又は半固体の水性懸濁液であるか、又は被分析物を含有することが知られているか又は疑われている固体又は半固体物質からの水性洗浄物である。サンプルは、産業起源からの物を含む、泥、水、又は空気のような環境的な供給源、例えば、荒れた小川、水源、供給ライン、又は生産用地から得られ得る。産業供給源はさらに、発酵培地、例えば、生物学的リアクター又は食物発酵プロセスの発酵培地を含む。又、産業供給源は、化学リアクター及びバイオリアクターを含む。雨水、又は海岸、河川、湖、池、又は小川由来の水もまたサンプルであってもよい。
【０１６６】
生物学的起源のサンプルは、生理学的流体、例えば、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹水液、汗、リンパ液、又は他の体液であってもよい。又、サンプルは、血液細胞、培養細胞、筋肉組織、神経細胞等の細胞溶解液である流体；細胞のすぐ外側の領域における細胞外流体；ベシクル中の液体；又は植物及び動物の血管組織中の流体を含んでもよい。
【０１６７】
サンプルは、標識及び分析の前に、必要な場合加工されてもよい。例えば、サンプルは、被分析物のさらに有効な標識を可能にするために、粒子状物質を除去するために遠心分離又はろ過してもよく、又は緩衝化してもよい。分析科学及び法医学の通常の方法に従って、サンプルは、可能な干渉成分を除去するために、最適な抽出のためのサンプルのｐＨ及びイオン強度を調整するために、又は単純にサンプルを希釈するために、前処理を受けてもよい。このような前処理方法は、当該技術分野で周知である。例えば、サンプルは、例えば、ろ過又は遠心分離によって使用前に分け得る。血液生成物サンプル及び尿は、典型的にはバッファ溶液で希釈され、タンパク質又は粒子を除去するためにろ過し得る。血液サンプルのために、音波処理を使用して細胞をフラグメント化し得る。タンパク質は、例えば、有機溶媒、過塩素酸又はトリクロロ酢酸、又は金属イオンを添加することによって生物学的サンプルから沈殿してもよい。しかし、このような沈殿は、共沈殿を介して被分析物をロスする場合がある。サンプルは、さらなる化学的改変に付されてもよい。例えば、アヘン剤を含有するサンプルは、しばしば酸水溶液で加水分解される。
【０１６８】
典型的には、標識試薬のストック溶液は、公知の量の純粋な試薬を秤量し、溶媒中に試薬を溶解することによって調製される。溶媒は、標識試薬を溶解し、反応しないものが選択されるべきである。溶媒のいくつかの例としては、緩衝化水溶液、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、又はテトラヒドロフラン）、及びこれらの混合物が挙げられる。バッファが使用される場合、標識試薬と反応しないように選択されるべきである。好適なバッファとしては、当業者に公知の任意のもの、例えば、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）が挙げられる。他のバッファとしては、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸バッファ、又は炭酸水素塩バッファが挙げられ、これらのバッファは、ＨＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＥＧＴＡ、及びクエン酸バッファからなる群から選択されるメンバーである。光感受性の標識試薬のために、ストック溶液は、常に光から保護されるべきである。標識溶液は、所望の標識濃度までストック溶液のアリコートを水性バッファで希釈することによって調製される。一般に、標識溶液中の標識試薬の量及び濃度は、顕著なバックグラウンド反応を起こさずに、被分析物を標識するのに十分なものである。使用される標識試薬の実際の量は、実験条件及び所望の結果に依存する。実験条件の最適化は、当業者によって容易に把握できる、所与の適用において使用される最適のパラメーターを決定するために望ましいであろう。
【０１６９】
標識反応条件は、温度、ｐＨ、及び媒体中の組成変化によって影響を受ける場合があるが、当該分野で周知の方法を用いて容易に決定される。一般に、サンプル（所望な場合、前処理後のサンプル）は、標識反応を起こさせるのに必要な時間、反応媒体中で標識試薬とともにインキュベートされる。最も好ましい条件下で、この時間は１時間未満であり、数秒から１０分までであることもある。
【０１７０】
本方法の感度により、本明細書中に記載されるアッセイを用いて少ない容積の反応混合物で行うことを可能にする。このことは、一般的に高スループットスクリーニングとして公知の方法で特に有用である。１つの実施態様では、反応混合物は、マイクロプレートのウェル中に存在する。別の実施態様では、反応混合物は、マイクロ流体チップ上に存在する。本発明の１つの側面では、反応混合物は、２００μＬ以下の体積を有する。
【０１７１】
アミノ基の反応性。アミン反応性の標識試薬として、アミンとの反応でカルボキサミド、スルホンアミド、ウレア、又はチオウレアを形成するアシル化試薬が挙げられる。アシル化反応の特異性及び速度論は、アシル化試薬及びアミンの両方の反応性及び濃度に依存する。遊離アミン、例えば、トリス及びグリシンを含有するバッファは、あらゆるアミン反応性標識試薬を用いるときは避けるべきである。タンパク質サンプル調製物からの残りの硫酸アンモニウム又はウレアは、標識試薬を導入する前に除去されるべきである。求核性チオールは、標識試薬と競合し得るので、濃度を制限するべきである。
【０１７２】
アミンの反応性は、主にその塩基性によって説明される。ほとんどのタンパク質はリシン残基を有し、ほとんどのタンパク質は、Ｎ−末端に遊離アミンを有する。リシンのアミン基などの脂肪族アミンは、中程度に塩基性であり、ほとんどのアシル化試薬と反応性であるが、ｐＨ８未満での脂肪族アミンの遊離形態の塩基の濃度は非常に低い。従って、アミンとイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、及び他のアシル化剤との反応はｐＨ依存性である。８．５から９．５のｐＨは、リシン残基の修飾に通常好ましい。一方、中性に近いｐＨは、Ｎ−末端アミノ基の修飾に好ましい（ｐＫａ〜７）が、約ｐＨ８．５をかなり超えると、水の存在下ではアシル化試薬の分解が起こる。スクシンイミジルエステルによるタンパク質修飾は、典型的にはｐＨ８．５で行うことができ、一方、イソチオシアネートは、最適条件のためには通常ｐＨ＞９を必要とする。
【０１７３】
芳香族アミンは、典型的に非常に弱い塩基であり、ｐＨ７でプロトン化しなく、芳香族アミンの改変は、さらに反応性の標識試薬、例えばイソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド又は酸ハライド、又はｐＨ≧４を必要としよう。アシル化試薬は、水性媒体中において、グルタミン及びアスパラギン残基の側鎖アミド、アルギニンのグアニジニウム基、ヒスチジンのイミダゾリウム基、及び非塩基性アミン、例えば、アデノシン又はグアノシン（例えば、核酸中の）とほとんど反応しない。
【０１７４】
チオール基の反応性。チオール（又はメルカプタン又はスルフヒドリル）は、天然状態中に、又はジチオスレイトール又はメルカプトエタノールを用いたシステインジスルフィドの還元において、システインを含むタンパク質中によく見られる。このようなジスルフィド還元試薬は、チオール反応性の標識試薬との反応前に除去されるべきであり、チオールの空気酸化から保護されたサンプルはジスルフィドに戻る。チオール反応性の官能基としては、アルキル化試薬、例えば、ヨードアセトアミド、マレイミド、及びブロモメチルケトンが挙げられ、これらの試薬とチオールとの反応は、通常、生理学的ｐＨ範囲（ｐＨ６．５から８．０）において室温以下で迅速に起こり、化学的に安定なチオエーテルを生じる。チオールはさらに、イソチオシアネート及びスクシンイミジルエステルを含むアミン反応性試薬と反応するが、最初の生成物は通常は不安定である。
【０１７５】
ヒドロキシ基の反応性。タンパク質（例えば、セリン、スレオニン、及びチロシン）、ステロール、及び炭水化物中のアルコールは、生体分子中に豊富であるが、水性媒体中では反応しない。ある種のアルコールは、酸化（例えば過ヨウ素酸塩を用いて）されてアミン又はヒドラジン標識試薬により容易に修飾されるアルデヒドになる。
【実施例】
【０１７６】
当業者は、過剰なルーチン実験を用いずに、本明細書中に記載される特定の手順、実施態様、特許請求の範囲、及び実施例の多くの等価体を認識するか、又は把握することができる。このような等価体は、本発明の範囲内であるとみなされ、添付の特許請求の範囲によってカバーされる。本明細書全体で引用される全ての参考文献、登録特許、及び公開された特許出願の内容は、本明細書中に参照により組込まれる。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらはさらなる限定とみなされるべきではない。
【０１７７】
上にさらに充分に説明されたように、低分子（ｍ／Ｚ＜６００Ｄａ）の被分析物の定性及び定量ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、課題があるままである。低分子を分析する目的で、大量に荷電されたタグと誘導体化合物との単純で有効なカップリング反応を開発した。軽い同位体及び重い同位体の標識試薬（式ＸＸ、ここで、Ｒ＝−ＯＣ１Ｈ３及び−ＯＣ２Ｈ３）の対を、各誘導体についてそれぞれ５７３及び５００Ｄａを加えて、開発した。原則的に、メトキシ炭素原子の同位体標識も可能である。種々の低分子被分析物を標識し、低フェトモル範囲でＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。タグ化被分析物は、マトリックス及び反応混合物のクリーンアップなしで検出し、低分子、アミノ酸、合成ペプチド、刺激物（すなわち、アムフェタミン、メタムフェタミン、及びペンテルミン）及び他の化合物（添付の図面を参照）の系統だった定量分析を可能にした。
【０１７８】
【化４５】
【０１７９】
方法及び装置：トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ、式ＸＸ）を、ペプチド配列決定に使用した。Ｗａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３０５−１７（１９９９）。本発明は、重水素化ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ｄ２７）標識試薬を開示し、ここで、各メトキシ基は重水素化されている（Ｒ＝Ｃ２Ｈ３）。固定された正電荷を含有する活性化されたエステルＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ、及び重水素化ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ｄ２７）を白色結晶性粉末として調製し、１Ｈ、１３Ｃ、３１Ｐ ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによって特徴決定した。標識試薬の無水アセトニトリル溶液（１０ｎｍｏｌ／μＬ）を、感知できるほどの分解もなく、室温で数ヶ月、デシケーター中で保存した。
【０１８０】
【化４６】
【０１８１】
種々の低分子一級アミン及び二級アミン、アミノ酸、合成ペプチド、及び制御された物質（例えば、アムフェタミン、メタムフェタミン及びペンテルミン）を試験した。トリエチルアンモニウムビカーボネートバッファ中の１００から０．１ｐｍｏｌ／μＬの範囲の被分析物を、同じ条件下で誘導体化し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって首尾よく分析した。被分析物（例えば、アミノメチルナフタレン）を２０％ＣＨ３ＣＮを含むトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファに溶解した。ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕストック溶液を無水ＣＨ３ＣＮを用いて調製した（１０ｎｍｏｌ／μＬ）。プラスチック管中で被分析物１８０μＬと標識試薬２０μＬとを約１０秒間攪拌することによって、典型的な標識反応を行い、室温で約３０分インキュベートした後、１０％ＴＦＡ（５０／５０％ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ）を添加し、例えば、式ＸＸにおけるような標識されたアミノメチルナフタレンを得た。
【０１８２】
【化４７】
【０１８３】
２０から１００ｍＭの濃度を有するトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファは、本適用において使用するのに許容し得た。３から１０モル過剰の標識試薬は、約３０分以内にカップリング反応を完了させるのに十分であった。反応混合物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析と適合性であり、標識された被分析物は、１０，０００倍過剰の試薬が使用された場合であっても、反応混合物のクリーンアップなしに直接的に分析することができた。ＴＭＰＰ−Ａｃタグ化分子の適合性のさらなる証拠が、マトリックスをもちいることのない直接的なＬＤＩ−ＭＳ分析からも観察された。反応混合物は、レーザー分離イオン化マススペクトロメトリー（ＩＤＩ−ＭＳ）のためのステンレススチールプレート上に置かれた（１μＬ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳのために、反応混合物１０μＬ及びマトリックス３０μＬ（５０／５０％ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ中の１０ｍｇ／ｍＬのシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を混合し、この１μＬを、ＭＳ分析のためにプレート上に置いた。
【０１８４】
覚醒剤の定量的分析のために、ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ｄ２７）を標準溶液とあわせ、ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕを覚醒剤を入れた溶液と反応させた。次いで、２つの等量の溶液を混合し、この１μＬをＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。ＴＭＰＰ−Ａｃ標識された被分析物を１フェトモルの低いレベルでＭＡＬＤＩ−ＭＳによって検出した。ＴＭＰＰ−Ａｃ−標識された覚醒剤を、軽い化合物及び重い化合物の両方のピーク強度と比較することによって、定量的に分析した。
【０１８５】
【化４８】
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１Ａ】図１は、ＣＩＤスペクトルを示す。図１Ａは、１個の電荷を有するペプチドＧＭＤＳＬＡＦＳＧＧＬのＣＩＤスペクトル（ｍ／Ｚ １０５３．５）を示す。図１Ｂは、ＴＭＰＰ−Ａｃ誘導体のＣＩＤスペクトルを示す（ｍ／Ｚ １６２６．５）。この結果は、ペプチドのＭＳシーケンスにおける本発明のＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ標識試薬の有用性を示す。「Ａ Ｐｉｃｏｍｏｌｅ−Ｓｃａｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｗａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９，１３７−４４（１９９７）；「Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｉｆｙ Ｔｈｅｉｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」，Ａｄａｍｃｚｙｋら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１３，１４１３−２２（１９９９）を参照。標識試薬は、ここにおいて配列の効力範囲（直接的なフラグメント化）及びイオン化効率（固定された電荷）を増すために使用し得る。
【図１Ｂ】図１は、ＣＩＤスペクトルを示す。図１Ａは、１個の電荷を有するペプチドＧＭＤＳＬＡＦＳＧＧＬのＣＩＤスペクトル（ｍ／Ｚ １０５３．５）を示す。図１Ｂは、ＴＭＰＰ−Ａｃ誘導体のＣＩＤスペクトルを示す（ｍ／Ｚ １６２６．５）。この結果は、ペプチドのＭＳシーケンスにおける本発明のＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ標識試薬の有用性を示す。「Ａ Ｐｉｃｏｍｏｌｅ−Ｓｃａｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｗａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９，１３７−４４（１９９７）；「Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｉｆｙ Ｔｈｅｉｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」，Ａｄａｍｃｚｙｋら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１３，１４１３−２２（１９９９）を参照。標識試薬は、ここにおいて配列の効力範囲（直接的なフラグメント化）及びイオン化効率（固定された電荷）を増すために使用し得る。
【図２】図２は、トリプシン消化の直接的な誘導体化の結果の概要である（Ｈｖｉａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３０５（１９９９））。本発明の方法及び試薬は、トリプシン消化の配列決定を容易にし得る。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ−ＭＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｔｒｉｓ（２，４，６−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｓ」，Ｊ．Ｔ．Ｗａｔｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３０５−１７（１９９９）（（β−Ｅｎｄｏｒｐｎｉｎ，Ｈｕｍａｎ ＧＩＰ，Ｂｏｖｉｎｅ ＧＨＲＦ，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ，Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，Ｒａｂｂｉｔ Ｇ−３ＰＤ，ＢＳＡ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ，Ｅ．Ｃｏｌｉ，ａｎｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）；及び「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉ−ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＳ／ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒａ」，Ｊ．Ｃ．Ｇｅｂｌｅｒ，Ｊ．ｈｕｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６０，２３５−４９（２００２）を参照。図２は、ペプチドの高い配列効力範囲及び直接的な配列決定に対する本発明の適用を示す。疎水性ペプチドの増加した配列効力範囲、増加したイオン化、及び単純化したサンプル調製（脱塩は必要ではない）は、本発明の有利な特徴である。固定された電荷を有するＴＭＰＰ誘導体化された分子はさらに、より高いイオン収率のために、質量分析のための改良された有効性を示し、検出感度の増加をもたらす。
【図３】図３は、実施例において議論される標識反応の生成物のＭＡＬＤＩマススペクトルを示す。
【図４】図４は、ＴＭＰＰ標識されたナフタレンメチルアミンのマススペクトルである（２００ｆｍｏｌ、マトリックスなし）。
【図５】図５は、以下の混合物の誘導体化反応を示す：２ｎｍｏｌｅ／μＬ Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン、Ｌ−カルノシン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ナフタレンメチルアミン（８０％／２０％の５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート／ＣＨ３ＣＮ中）２０μＬ及び１３０ｎｍｏｌｅ／μＬ ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（ＣＨ３ＣＮ中）２μＬを混合し、５０℃で９０分放置し、次いで、０．１％ＴＦＡ水溶液１．２ｍＬを添加した。次いで、この反応混合物５μＬを１０μＬマトリックス（１０ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡ）と混合し、この１μＬで標準的なＭＡＬＤＩプレートにスポット形成し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。標的分子約１０ｐｍｏｌｅをこのプレートにスポット形成した。サンプルを洗浄することも脱塩することも必要ではなかった。
【図６】図６は、図５において記載されたサンプル１０ｐｍｏｌｅのＭＡＬＤＩマススペクトルである。
【図７Ａ】図７Ａは、標識されていない化合物のＭＡＬＤＩマススペクトルの比較である（図７Ａ−フルレンジ）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、標識した化合物のＭＡＬＤＩマススペクトルの比較である（図７Ｂ−フルレンジ）。
【図８】図８は、標識した化合物のＭＡＬＤＩマススペクトルの比較である（ズーム）。
【図９】図９は、誘導体化された混合物１００ｆｍｏｌのマススペクトルである。この図は、本方法の感度を示す。
【図１０】図１０は、マトリックスなしの混合物の誘導体化のマススペクトルである。
【図１１】図１１は、疎水性ペプチドのイオン化に対するＴＭＰＰラベルの肯定的効果を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは、トリプシン消化Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（トリエチルアンモニウムビカーボネート２０ｍＭ中）８１ｐｍｏｌｅ／μＬの４００μＬ及びＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ ３３．８ｎｍｏｌｅ／μＬ（ＣＨｓＣＮ中）の１００μＬを混合し、混合物を室温で３時間放置し、次いで、この反応混合物１０μＬと０．１％ＴＦＡ水溶液９９０μＬとを混合し、この２μＬをＭａｓｓＰｒｅｐ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｌａｔｅ上にスポット形成し、乾燥することによって調製した、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃトリプシン消化物２００ｆｍｏｌのマススペクトルを示す。ペプチドについての配列効力範囲の比較を誘導体化されていない（図１２Ａ）サンプルを用いて同定した。誘導体化されていないサンプル＝ＧＤＶＥＫＧＫＫＩ−ＦＶＱＫＣＡＱＣＨＴＶＥＫＧＧＫＨＫＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲＫＴＧＱＡＰＧＦＴＹＴＤＡＮＫＮＫＧＩＴＷＫＥＥＴＬ−ＭＥＹＬＥＮＰＫＫＹＩＰＧＴＫＭＩＦＡＧＩＫＫＫＴＥＲＥＤＬＩＡＹＬＫＫＡＴＮＥ（効力範囲：５４／１０４＝５２％）。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、トリプシン消化Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（トリエチルアンモニウムビカーボネート２０ｍＭ中）８１ｐｍｏｌｅ／μＬの４００μＬ及びＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ ３３．８ｎｍｏｌｅ／μＬ（ＣＨｓＣＮ中）の１００μＬを混合し、混合物を室温で３時間放置し、次いで、この反応混合物１０μＬと０．１％ＴＦＡ水溶液９９０μＬとを混合し、この２μＬをＭａｓｓＰｒｅｐ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｌａｔｅ上にスポット形成し、乾燥することによって調製した、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃトリプシン消化物２００ｆｍｏｌのマススペクトルを示す。ペプチドについての配列効力範囲の比較を誘導体化された（図１２Ｂ）サンプルを用いて同定した。誘導体化されたサンプル＝ＧＤＶＥＫＧＫＫＩＦＶＱＫＣＡＱＣＨＴＶＥＫＧＧＫＨＫＴ−ＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲＫＴＧＱＡＰＧＦＴＹＴＤＡＮＫＮＫＧＩＴＷＫＥＥＴＬＭＥＹＬＥＮＰＫＫＹＩＰＧＴＫＭＩ−ＦＡＧＩＫＫＫＴＥＲＥＤＬＩＡＹＬＫＫＡＴＮＥ（配列効力範囲：８１／１０４＝７９％）。
【図１３】図１３は、以下に議論されるいくつかのアミンの構造を示す。
【図１４】図１４は、図１３の誘導体化されていないアミン（２ｐｍｏｌｅ）のＭＡＬＤＩマススペクトルである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、異なるｐＨ値で誘導体化された６アミンの比較である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、異なるｐＨ値で誘導体化された６アミンの比較である。
【図１６】図１６は、種々のアミンの標識反応のｐＨ試験の結果である。
【図１７】図１７は、種々のアミンの標識反応のｐＨ試験の結果である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＭＡＬＤＩマススペクトルにおけるいくつかの特徴的なピークを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＭＡＬＤＩマススペクトルにおけるいくつかの特徴的なピークを示す。
【図１９】図１９は、いくつかの抗生物質の標識反応を示す。
【図２０】図２０は、抗生物質の定量分析において使用される典型的なマススペクトルを示す。
【図２１】図２１は、抗生物質のＭＳデータの較正曲線である。
【図２２】図２２は、図１９における標識反応の変換比の試験の結果を示す。
【図２３】図２３は、図１９における標識反応の変換比の試験の結果を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＭＡＬＤＩ方法の非常に低い検出限界を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＭＡＬＤＩ方法の非常に低い検出限界を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ウシ腎臓抽出刺激における抗生物質の試験の結果を示す。簡単に言うと、新鮮なウシ腎臓１グラム及びＥｔＯＨ（２％ＣＨ３ＣＯＯＨを含む）１０ｍＬをプラスチック管に入れ、粉砕し、遠心分離にかけて沈殿物を除去した。この溶液を新しい管に移し、５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液３０ｍｌを添加した。腎臓抽出物２ｍＬと５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液１０ｍＬとを混合することによってブランクの腎臓抽出コントロールを調製した。ノルフロキサシン５９ｐｍｏｌｅ／μＬ、シプロフロキサシン９７．５ｐｍｏｌｅ／μＬ、及びロメフロキサシン１０８．３ｐｍｏｌｅ／μＬを添加することによって、薬物添加腎臓抽出物を調製した。結果は、低フェトモルからピコモル濃度までの範囲の望ましい較正曲線により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる抗生物質の定量分析を示した（３０フェトモル以下での検出を含む）。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ウシ腎臓抽出刺激における抗生物質の試験の結果を示す。簡単に言うと、新鮮なウシ腎臓１グラム及びＥｔＯＨ（２％ＣＨ３ＣＯＯＨを含む）１０ｍＬをプラスチック管に入れ、粉砕し、遠心分離にかけて沈殿物を除去した。この溶液を新しい管に移し、５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液３０ｍｌを添加した。腎臓抽出物２ｍＬと５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカーボネート溶液１０ｍＬ とを混合することによってブランクの腎臓抽出コントロールを調製した。ノルフロキサシン５９ｐｍｏｌｅ／μＬ、シプロフロキサシン９７．５ｐｍｏｌｅ／μＬ、及びロメフロキサシン１０８．３ｐｍｏｌｅ／μＬを添加することによって、薬物添加腎臓抽出物を調製した。結果は、低フェトモルからピコモル濃度までの範囲の望ましい較正曲線により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる抗生物質の定量分析を示した（３０フェトモル以下での検出を含む）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって前記被分析物が標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の標識試薬と反応させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項２】
（ａ）反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；
（ｂ）露出した基を含有し、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる被分析物を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて、前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる、工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項３】
前記標識試薬が、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
及び
［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒ及びＡｒ＊はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、Ａｒ３Ｐの分子量はＡｒ＊３Ｐの分子量とは異なっており；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の少なくとも２つの標識試薬と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項５】
（ａ）それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬（前記標識試薬の反応基は全て同じであり、前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量が互いに異なっている。）を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項６】
前記トリアリールホスホニウム基の分子量における違いがマススペクトロメトリーで識別可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の分子量における違いがマススペクトロメトリーで識別可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
［Ａｒ＊＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒ基（すなわち、Ａｒ、Ａｒ＊、及びＡｒ＊＊等）はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、各標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は固有であり；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の少なくとも２つの標識試薬と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項９】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の標識試薬と反応させることによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び
（ｃ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１０】
（ａ）反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる、工程；及び
（ｄ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１１】
前記標識試薬が、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
及び
［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒ及びＡｒ＊はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、Ａｒ３Ｐの分子量はＡｒ＊３Ｐの分子量とは異なっており；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の少なくとも２つの標識試薬と前記被分析物と反応させる工程；及び
（ｃ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１３】
（ａ）それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬（前記標識試薬の反応基は全て同じであり、前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物が形成させる工程；及び
（ｄ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１４】
前記各標識試薬が、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、各標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は固有であり；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マススペクトロメトリー技術が、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化マススペクトロメトリー又はエレクトロスプレーマススペクトロメトリーである、請求項１から１４に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記技術が定量的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬（前記標識試薬の反応基は全て同じであり、前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）第１容器中で、第１標識試薬を前記サンプルの第１部分と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び
（ｄ）第２容器中で、第２標識試薬を前記サンプルの第２部分と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び
（ｅ）前記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物と前記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物とを併せて混合物を形成する工程；及び
（ｆ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１８】
前記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を前記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物に対して定量的に比較する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記定量的な比較が、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の相対量と相関関係にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルの第２部分に対する前記サンプルの前記第１部分の比率が予め決定され、明確である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記比率が、前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物のＭＳシグナルに対して相関関係にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１標識試薬で標識された被分析物のシグナルと、前記第２標識試薬で標識された同じ被分析物のシグナルにおける違いが、前記混合物中のこれらの濃度の違いに対して直線的に関連する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
各Ａｒ基が、置換又は非置換のアリール基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
各Ａｒ基が、置換又は非置換のヘテロアリール基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の芳香族炭化水素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の５−及び６−員環単環基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の、フェニル、ピロリル、フリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、及びピリミジニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の多環式アリール基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の、ナフチル、テトラヒドロナフチル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、メチレンジオキシフェニル、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、インドリル、ベンゾフラニル、プリニル、デアザプリニル、及びインドリジニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
２つのＡｒ基が一緒になって１つの二価芳香族基を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記二価芳香族基が、置換又は非置換の１，１’−ビナフタ−２，２’−ジイル、フェニレン、及びキシリレン基からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
各Ａｒ基が、非置換フェニル、非置換ナフチル、非置換インデニル、非置換アントラセニル、置換フェニル、置換ナフチル、置換インデニル、及び置換アントラセニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記置換基がアルキル又はアルコキシ基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記置換基が、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記置換基が、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はＣ１−Ｃ４アルキルアルコキシ基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ａｒ３Ｐ基が、置換又は非置換の、トリフェニルホスフィン、ナフチルジフェニルホスフィン、ジナフチルフェニルホスフィン、トリナフチルホスフィン、９−アントリルジフェニルホスフィン、９−アントリルジナフチルホスフィン、ジフェニルピレニルホスフィン、ジナフチルピレニルホスフィンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ナフチルが１−ナフチル又は２−ナフチルである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記置換基が、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記置換トリフェニルホスフィンがトリ（ｐ−メトキシフェニル）ホスフィンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記標識試薬が下式
【化１】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、前記Ｙ基はいずれも前記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記標識試薬が下式
【化２】
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識試薬が下式
【化３】
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記標識試薬が下式
【化４】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；
ｎは０から５の整数であり；
Ｙは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、前記Ｙ基はいずれも前記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識試薬が下式
【化５】
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記トリアリールホスホニウム標識試薬がそれぞれ同じ化学構造を有し、各トリアリールホスホニウム標識試薬は、他のトリアリールホスホニウム標識試薬と比較して、同位体が豊富である、請求項２に記載の方法。
【請求項４９】
トリアリールホスホニウム標識が、１２Ｃ、１２Ｃ、１Ｈ、又は２Ｈの同位体が豊富である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、Ｏ１２Ｃ１Ｈ３、Ｏ１２Ｃ２Ｈ３、Ｏ１３Ｃ１Ｈ３、及びＯ１３Ｃ２Ｈ３からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記被分析物の露出した基が求電子性であり、前記反応性官能基が求核性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記被分析物の露出した基が求核性であり、前記反応性官能基が求電子性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被分析物の露出した基がアミンであり、前記反応基がイソチオシアナート、スクシンイミジルエステル、又はアルデヒドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被分析物の露出した基がアルコール又はチオールであり、前記反応基がアルキル化する基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルキル化する基が、ヨードアセトアミド、マレイミド、又はハロゲン化アルキルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｘ−が、ハライド、トリフレート、サルフェート、ニトレート、ヒドロキシド、カーボネート、ビカーボネート、アセテート、ホスフェート、オギザレート、シアニド、アルキルカルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、アルコキシド、チオアルコキシド、アルカンスルホニルオキシ、ハロゲン化アルカンスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ、ビサルフェート、オギザレート、バレレート、オレエート、パルミテート、ステアレート、ラウレート、ボレート、ベンゾエート、ラクテート、シトレート、マレエート、フマレート、スクシネート、タートレート、ナフチルレートメシレート、グルコヘプトネート、又はラクトビオネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
Ｘ−がアニオン性Ｙ基であり、前記標識試薬が両性イオン性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも２つの異なる標識試薬を含み、それぞれの標識試薬は、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の異なる分子量を有する、組成物。
【請求項５９】
少なくとも２つの異なる標識試薬を含み、それぞれの標識試薬は、下式
【化６】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；
ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ；スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、前記Ｙ基はいずれも前記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の異なる分子量を有する、組成物。
【請求項６０】
各標識試薬が同じ化学構造を有し、各標識試薬は他のトリアリールホスホニウム標識試薬と比較して同位体が豊富である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
標識試薬が、１２Ｃ、１２Ｃ、１Ｈ、又は２Ｈの同位体が豊富である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、Ｏ１２Ｃ１Ｈ３、Ｏ１２Ｃ２Ｈ３、Ｏ１３Ｃ１Ｈ３、及びＯ１３Ｃ２Ｈ３からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記標識試薬が以下の構造：
【化７】
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記標識試薬が以下の構造：
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記標識試薬が以下の構造：
【化８】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；及び
Ψは反応性官能基である
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
前記反応性官能基が式−ＣＯＬ（Ｌは脱離基である。）の活性化エステルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＬがＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、又は置換アリールオキシ基である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記標識試薬が以下の構造：
【化９】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；及び
Ψは反応性官能基である。〕
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
前記アリール基が、置換されていないか、又はハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロシクリル、アラルキル、及び芳香族及びヘテロ芳香族基からなる群から選択される置換基で置換されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記基が、カルボン酸、カルボン酸の誘導体、又はカルボン酸の活性化エステルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ψ基が、ハロアルキル、ハロアセトアミド、ハロメチルベンズアミド、マレイミド基、又はスルホネートエステルであり、前記スルホン酸が、アルキルスルホン酸、ペルフルオロアルキルスルホン酸、又はアリールスルホン酸である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ψ基が、ヨードアセトアミド、マレイミド、又はハロメチルベンズアミドである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ψ基が、イソシアネート又はアシルニトリルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ψ基が、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルハライド、対称又は非対称酸無水物、アクリルアミド、アルコール、チオール、アルデヒド、アミン、アジド、イミドエステル、スルホネートエステル、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、ヒドラジン、イソチアネート、イソチオシアネート、又はマレイミド基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ψ基が、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、アミン、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、イソチオシアネート、又はマレイミド基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７６】
前記Ψ基がスクシンイミジルエステルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ψ基が、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、アミン、酸無水物、アニリン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホニルハライド、又はチオール基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７８】
前記標識試薬が以下の構造：
【化１０】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは結合基であり；及び
Ｘは脱離基であり；及び
Ｌは脱離基である。〕
を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７９】
Ｚが、Ｃ、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１から２０個の水素ではない原子を有し、最も長い直鎖セグメントが１から６個の水素ではない原子を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８０】
Ｚが１個のメチレン基である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
Ｚが式−（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−のポリメチレンであり、ｎが１から１０であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
Ｚが式−（ＣＨ２）（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−のポリメチレンであり、ｎが１から９であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記被分析物が、タンパク質、ペプチド、酵素、免疫グロブリン、ハプテン、抗原、アミノ酸、ホルモン、レセプター、核酸、ホルモン、化学物質、ポリマー、病原体、毒素、糖類又は多糖類、ステロイド、ビタミン、治療薬物、乱用薬物、細菌又はウイルス、上述のいずれかの組み合わせ又はフラグメント、又はこれらの代謝物、又はこれらに対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８４】
前記被分析物が、食物添加物、農薬、界面活性剤、接着剤、樹脂、有機汚染物質、又はプロセス薬品である、請求項１に記載の方法。
【請求項８５】
前記被分析物が治療薬物又はこれらの代謝物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８６】
前記被分析物が乱用薬物又はこれらの代謝物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
前記サンプルが、雨水、又は海洋、河川、湖、池、又は小川からの水である、請求項１に記載の方法。
【請求項８８】
前記サンプルが生体組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
前記サンプルが、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹水液、汗、リンパ液、又は他の体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項９０】
請求項１の標識試薬と、本発明の方法において使用するための使用説明書とを含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルの調製において使用するためのキット。
【請求項９１】
請求項１の標識試薬と、バッファ化学物質とを含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルの調製において使用するためのキット。
【請求項９２】
酸、塩基、緩衝薬剤、無機塩、溶媒、酸化防止剤、防腐剤、金属キレート化剤、これらの水溶液又は有機溶液をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項９３】
【化１１】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；及び
Ｘは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９４】
【化１２】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９５】
【化１３】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９６】
【化１４】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；
Ｌは脱離基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９７】
【化１５】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；
Ｘは脱離基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９８】
【化１６】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項１】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによって前記被分析物が標識試薬のトリアリールホスホニウム基に結合する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の標識試薬と反応させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項２】
（ａ）反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；
（ｂ）露出した基を含有し、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる被分析物を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて、前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる、工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項３】
前記標識試薬が、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
及び
［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒ及びＡｒ＊はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、Ａｒ３Ｐの分子量はＡｒ＊３Ｐの分子量とは異なっており；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の少なくとも２つの標識試薬と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項５】
（ａ）それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬（前記標識試薬の反応基は全て同じであり、前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量が互いに異なっている。）を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項６】
前記トリアリールホスホニウム基の分子量における違いがマススペクトロメトリーで識別可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の分子量における違いがマススペクトロメトリーで識別可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
［Ａｒ＊＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒ基（すなわち、Ａｒ、Ａｒ＊、及びＡｒ＊＊等）はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、各標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は固有であり；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の少なくとも２つの標識試薬と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程
を含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを調製する方法。
【請求項９】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の標識試薬と反応させることによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び
（ｃ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１０】
（ａ）反応基を有するトリアリールホスホニウム標識試薬を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる、工程；及び
（ｄ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリーによって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１１】
前記標識試薬が、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）被分析物（前記被分析物は露出した基を含む。）を含むサンプルを得る工程；及び
（ｂ）前記被分析物を、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
及び
［Ａｒ＊３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒ及びＡｒ＊はアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、Ａｒ３Ｐの分子量はＡｒ＊３Ｐの分子量とは異なっており；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の少なくとも２つの標識試薬と前記被分析物と反応させる工程；及び
（ｃ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１３】
（ａ）それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬（前記標識試薬の反応基は全て同じであり、前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）前記標識試薬を前記被分析物と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物が形成させる工程；及び
（ｄ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１４】
前記各標識試薬が、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく、各標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は固有であり；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マススペクトロメトリー技術が、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化マススペクトロメトリー又はエレクトロスプレーマススペクトロメトリーである、請求項１から１４に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記技術が定量的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）それぞれ反応基を有する少なくとも２つのトリアリールホスホニウム標識試薬（前記標識試薬の反応基は全て同じであり、前記標識試薬のトリアリールホスホニウム基の分子量は互いに異なっている。）を得る工程；
（ｂ）被分析物（前記被分析物は、露出した基を含有し、前記露出した基は、前記反応基と反応してトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成することができる。）を含有するサンプルを得る工程；及び
（ｃ）第１容器中で、第１標識試薬を前記サンプルの第１部分と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び
（ｄ）第２容器中で、第２標識試薬を前記サンプルの第２部分と反応させて前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成させる工程；及び
（ｅ）前記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物と前記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物とを併せて混合物を形成する工程；及び
（ｆ）前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物をマススペクトロメトリー技術によって分析する工程
を含む、サンプルを分析する方法。
【請求項１８】
前記第１容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を前記第２容器からのトリアリールホスホニウムに結合した被分析物に対して定量的に比較する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記定量的な比較が、トリアリールホスホニウムに結合した被分析物の相対量と相関関係にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルの第２部分に対する前記サンプルの前記第１部分の比率が予め決定され、明確である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記比率が、前記トリアリールホスホニウムに結合した被分析物のＭＳシグナルに対して相関関係にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１標識試薬で標識された被分析物のシグナルと、前記第２標識試薬で標識された同じ被分析物のシグナルにおける違いが、前記混合物中のこれらの濃度の違いに対して直線的に関連する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
各Ａｒ基が、置換又は非置換のアリール基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
各Ａｒ基が、置換又は非置換のヘテロアリール基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の芳香族炭化水素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の５−及び６−員環単環基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の、フェニル、ピロリル、フリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、及びピリミジニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の多環式アリール基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
各Ａｒ基が、置換又は非置換の、ナフチル、テトラヒドロナフチル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、メチレンジオキシフェニル、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、インドリル、ベンゾフラニル、プリニル、デアザプリニル、及びインドリジニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
２つのＡｒ基が一緒になって１つの二価芳香族基を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記二価芳香族基が、置換又は非置換の１，１’−ビナフタ−２，２’−ジイル、フェニレン、及びキシリレン基からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
各Ａｒ基が、非置換フェニル、非置換ナフチル、非置換インデニル、非置換アントラセニル、置換フェニル、置換ナフチル、置換インデニル、及び置換アントラセニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記置換基がアルキル又はアルコキシ基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記置換基が、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記置換基が、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はＣ１−Ｃ４アルキルアルコキシ基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ａｒ３Ｐ基が、置換又は非置換の、トリフェニルホスフィン、ナフチルジフェニルホスフィン、ジナフチルフェニルホスフィン、トリナフチルホスフィン、９−アントリルジフェニルホスフィン、９−アントリルジナフチルホスフィン、ジフェニルピレニルホスフィン、ジナフチルピレニルホスフィンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ナフチルが１−ナフチル又は２−ナフチルである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記置換基が、ハロゲン；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基；Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシ基；及びＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記置換トリフェニルホスフィンがトリ（ｐ−メトキシフェニル）ホスフィンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記標識試薬が下式
【化１】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、前記Ｙ基はいずれも前記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記標識試薬が下式
【化２】
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識試薬が下式
【化３】
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記標識試薬が下式
【化４】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；
ｎは０から５の整数であり；
Ｙは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、前記Ｙ基はいずれも前記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、及びヘプチルオキシからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識試薬が下式
【化５】
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記トリアリールホスホニウム標識試薬がそれぞれ同じ化学構造を有し、各トリアリールホスホニウム標識試薬は、他のトリアリールホスホニウム標識試薬と比較して、同位体が豊富である、請求項２に記載の方法。
【請求項４９】
トリアリールホスホニウム標識が、１２Ｃ、１２Ｃ、１Ｈ、又は２Ｈの同位体が豊富である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、Ｏ１２Ｃ１Ｈ３、Ｏ１２Ｃ２Ｈ３、Ｏ１３Ｃ１Ｈ３、及びＯ１３Ｃ２Ｈ３からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記被分析物の露出した基が求電子性であり、前記反応性官能基が求核性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記被分析物の露出した基が求核性であり、前記反応性官能基が求電子性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被分析物の露出した基がアミンであり、前記反応基がイソチオシアナート、スクシンイミジルエステル、又はアルデヒドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被分析物の露出した基がアルコール又はチオールであり、前記反応基がアルキル化する基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルキル化する基が、ヨードアセトアミド、マレイミド、又はハロゲン化アルキルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｘ−が、ハライド、トリフレート、サルフェート、ニトレート、ヒドロキシド、カーボネート、ビカーボネート、アセテート、ホスフェート、オギザレート、シアニド、アルキルカルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、アルコキシド、チオアルコキシド、アルカンスルホニルオキシ、ハロゲン化アルカンスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ、ビサルフェート、オギザレート、バレレート、オレエート、パルミテート、ステアレート、ラウレート、ボレート、ベンゾエート、ラクテート、シトレート、マレエート、フマレート、スクシネート、タートレート、ナフチルレートメシレート、グルコヘプトネート、又はラクトビオネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
Ｘ−がアニオン性Ｙ基であり、前記標識試薬が両性イオン性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも２つの異なる標識試薬を含み、それぞれの標識試薬は、下式
［Ａｒ３Ｐ＋Ｒ］Ｘ−
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の異なる分子量を有する、組成物。
【請求項５９】
少なくとも２つの異なる標識試薬を含み、それぞれの標識試薬は、下式
【化６】
〔式中、
Ｐはリン原子であり；
Ｒは、反応基（前記反応基は、前記露出した官能基と反応して共有結合を形成し、これによってトリアリールホスホニウムに結合した被分析物を形成する官能基を含む。）であり；
ａ、ｂ、及びｃは独立して０から５の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じであっても異なっていてもよく、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ；スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、及びヘテロイル基からなる群から選択され、但し、前記Ｙ基はいずれも前記Ｒ基と反応しなく；及び
Ｘ−は負に荷電した対イオンである。〕
の異なる分子量を有する、組成物。
【請求項６０】
各標識試薬が同じ化学構造を有し、各標識試薬は他のトリアリールホスホニウム標識試薬と比較して同位体が豊富である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
標識試薬が、１２Ｃ、１２Ｃ、１Ｈ、又は２Ｈの同位体が豊富である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３が、Ｏ１２Ｃ１Ｈ３、Ｏ１２Ｃ２Ｈ３、Ｏ１３Ｃ１Ｈ３、及びＯ１３Ｃ２Ｈ３からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記標識試薬が以下の構造：
【化７】
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記標識試薬が以下の構造：
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記標識試薬が以下の構造：
【化８】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；及び
Ψは反応性官能基である
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
前記反応性官能基が式−ＣＯＬ（Ｌは脱離基である。）の活性化エステルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＬがＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、又は置換アリールオキシ基である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記標識試薬が以下の構造：
【化９】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；及び
Ψは反応性官能基である。〕
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
前記アリール基が、置換されていないか、又はハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロシクリル、アラルキル、及び芳香族及びヘテロ芳香族基からなる群から選択される置換基で置換されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記基が、カルボン酸、カルボン酸の誘導体、又はカルボン酸の活性化エステルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ψ基が、ハロアルキル、ハロアセトアミド、ハロメチルベンズアミド、マレイミド基、又はスルホネートエステルであり、前記スルホン酸が、アルキルスルホン酸、ペルフルオロアルキルスルホン酸、又はアリールスルホン酸である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ψ基が、ヨードアセトアミド、マレイミド、又はハロメチルベンズアミドである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ψ基が、イソシアネート又はアシルニトリルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ψ基が、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルハライド、対称又は非対称酸無水物、アクリルアミド、アルコール、チオール、アルデヒド、アミン、アジド、イミドエステル、スルホネートエステル、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、ヒドラジン、イソチアネート、イソチオシアネート、又はマレイミド基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ψ基が、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、アミン、ハロアセトアミド、アルキルハライド、スルホニルハライド、イソチオシアネート、又はマレイミド基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７６】
前記Ψ基がスクシンイミジルエステルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ψ基が、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、アミン、酸無水物、アニリン、アリールハライド、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホニルハライド、又はチオール基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７８】
前記標識試薬が以下の構造：
【化１０】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｒは結合基であり；及び
Ｘは脱離基であり；及び
Ｌは脱離基である。〕
を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７９】
Ｚが、Ｃ、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１から２０個の水素ではない原子を有し、最も長い直鎖セグメントが１から６個の水素ではない原子を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８０】
Ｚが１個のメチレン基である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
Ｚが式−（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−のポリメチレンであり、ｎが１から１０であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
Ｚが式−（ＣＨ２）（ＣＲ’Ｒ”２）ｎ−のポリメチレンであり、ｎが１から９であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、又はアリール基である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記被分析物が、タンパク質、ペプチド、酵素、免疫グロブリン、ハプテン、抗原、アミノ酸、ホルモン、レセプター、核酸、ホルモン、化学物質、ポリマー、病原体、毒素、糖類又は多糖類、ステロイド、ビタミン、治療薬物、乱用薬物、細菌又はウイルス、上述のいずれかの組み合わせ又はフラグメント、又はこれらの代謝物、又はこれらに対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８４】
前記被分析物が、食物添加物、農薬、界面活性剤、接着剤、樹脂、有機汚染物質、又はプロセス薬品である、請求項１に記載の方法。
【請求項８５】
前記被分析物が治療薬物又はこれらの代謝物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８６】
前記被分析物が乱用薬物又はこれらの代謝物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
前記サンプルが、雨水、又は海洋、河川、湖、池、又は小川からの水である、請求項１に記載の方法。
【請求項８８】
前記サンプルが生体組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
前記サンプルが、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹水液、汗、リンパ液、又は他の体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項９０】
請求項１の標識試薬と、本発明の方法において使用するための使用説明書とを含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルの調製において使用するためのキット。
【請求項９１】
請求項１の標識試薬と、バッファ化学物質とを含む、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルの調製において使用するためのキット。
【請求項９２】
酸、塩基、緩衝薬剤、無機塩、溶媒、酸化防止剤、防腐剤、金属キレート化剤、これらの水溶液又は有機溶液をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項９３】
【化１１】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；及び
Ｘは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９４】
【化１２】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９５】
【化１３】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９６】
【化１４】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；
Ｌは脱離基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９７】
【化１５】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基であり；
Ｘは脱離基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【請求項９８】
【化１６】
〔式中、
各Ａｒはアリール基であり、これら全ては同じであっても異なっていてもよく；
Ｐはリン原子であり；
Ｚは結合基である。〕
からなる群から選択される構造を有する標識試薬。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【公表番号】特表２００６−５２３８４５（Ｐ２００６−５２３８４５Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１０００２（Ｐ２００６−５１０００２）
【出願日】平成１６年４月１４日（２００４．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１４２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２７０７
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１４日（２００４．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１４２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２７０７
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
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