菌体表面へのタンパク質の固定化方法
【課題】 ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)菌由来のプロテアーゼのアンカー配列を利用して、種々の任意の有用タンパク質を菌体表面に固定化し、且つ当該有用タンパク質を発現させる。
【解決手段】 ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えたもの。
【解決手段】 ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えたもの。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)の菌体表層のプロテアーゼタンパク質が有するアンカー配列を利用して、任意の有用タンパク質を、宿主菌体表面に発現させる固定化方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】グラム陽性菌の多くの菌体表層タンパク質はアンカー配列と呼ばれる共通した構造を持ち、それを介して菌体に結合している。ラクトコッカス・ラクチス菌のプロテアーゼの中で、所謂 763プロテアーゼは、ラクトコッカス・ラクチスｓｓｐ．ラクチス NCDO763株の５５Ｋｂプラスミド（ｐＬＰ 763）上に産生情報が保持されているセリンプロテアーゼであり、Ｃ末端に位置するアンカー配列により、菌体表面において菌体と結合する構造を取り、発現していることが知られている。
【０００３】このアンカー配列は、グラム陽性細菌の細胞表層タンパク質の多くが有する構造であり、(1) 細胞壁を構成するペプチドグリカン層内に位置するプロリン、グリシンに富んだ繰り返し領域、(2) アミノ酸残基よりなるコンセンサス配列（ＬＰＸＴＧモチーフ）、(3) 細胞膜内に位置する疎水性領域、(4) 細胞質内に位置すると考えられる正電荷領域からなる。
【０００４】763プロテアーゼのアンカー配列については、その、アミノ酸構造は報告されているが（文献参照；Molecular Microbiology (1989) vol.3(No.3),359-369 ）、 763プロテアーゼにおいては、上記(1) に記載のプロリン・グリシンに富んだ繰り返し領域がはっきりせず、その全てが、プロテアーゼの菌体への結合に必須であるのか、また、必須ではない場合、最小必要単位がどの部分であるのか等については、充分解明されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】菌体表層に有用タンパク質を発現させることは、微生物を育種する上で有効な手段となり得る。そこで、本発明者らは鋭意努力の結果、 763プロテアーゼに由来するアンカー配列において、プロテアーゼの菌体への結合に関与する領域を解明することにより、本発明を得るに至った。
【０００６】本発明は、ラクトコッカス・ラクチス菌由来のプロテアーゼのアンカー配列又は当該アンカー配列の部分配列を利用して、種々の任意の有用タンパク質を菌体表面に固定化し、且つ当該有用タンパク質を発現させることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された発明に係る菌体表面へのタンパク質の固定化方法では、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えたものである。
【０００８】本請求項２に記載された発明に係る菌体表面へのタンパク質の固定化方法では、前記アンカー配列が、少なくとも下記アミノ酸配列を備えているものである。
Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【０００９】本請求項３に記載された発明に係る菌体表面へのタンパク質の固定化方法では、前記アンカー配列が、請求項２に示すアミノ酸配列を残して下記アミノ酸配列の一部を切除したアミノ酸配列からなるものである。
Lys Lys Thr Ser Leu Leu Asn Gln Leu Gln Ser Val Lys Ala Ala Leu Glu Thr Asp Leu Gly Asn Gln Thr Asp Ser Ser Thr Gly Lys Thr Phe Thr Ala Ala Leu Asp Asp Leu Val Ala Gln Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asp Asp Gln Leu Gln Ala Thr Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ile Lys Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile Ala Asp Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys Leu Ala His Leu Gln Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【００１０】本発明における目的とするタンパク質とは、宿主となる乳酸菌の培養に応じてその乳酸菌表面に発現する有用なタンパク質を指す。例えば、後述する実施例で示されたスタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）等の酵素や、病原性細菌の部分タンパク質，生理活性タンパク質等も考慮される。即ち、任意のタンパク質の遺伝子が単離されており、通常の遺伝子組換え技術を用いて、該アンカー配列と結合させて、融合蛋白の遺伝子を作成できるものであれば、特に制限はない。
【００１１】また、本発明における宿主菌とは、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列により、菌体表面において菌体と結合する構造を取り、菌体表面に発現するものであればよい。具体的には、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)，ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) ，ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)，エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis) ，スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus) ，ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)，ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)等の乳酸菌が挙げられる。
【００１２】アンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列の作製、この融合遺伝子配列の宿主菌内への導入、この融合遺伝子配列が導入された宿主菌の培養は、常法により行うことができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明では、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得て、この融合遺伝子配列を宿主菌に導入し、これを培養することにより、目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する。
【００１４】これにより、例えば、酵素を宿主菌体表面に表出させて固定化したり、病原性細菌の部分タンパク質を使用して、ワクチン作用を有するものとしたり、生理活性タンパク質を使用して、医薬的用途に用いたりすることが可能である。後述する実施例においては、優れた血栓溶解作用を有する、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）タンパク質をモデルとして用いたが、目的とするタンパク質に応じて種々変更が可能である。
【００１５】アンカー配列と目的とするタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子配列の宿主菌内への導入は、通常の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。例えば、宿主菌となる乳酸菌に導入可能なプラスミドに前記遺伝子配列を保持させて、このプラスミドを宿主菌に導入することにより行うことができる。
【００１６】ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列について、本発明により初めて、配列番号１〜６に示す２４３アミノ酸残基配列〜３６アミノ酸残基配列が使用可能であることが確認された。特に、本発明では配列番号６に示す３６アミノ酸残基配列がラクトコッカス・ラクチス及びラクトバチルス・カゼイで使用可能であることが確認された。
【００１７】具体的には、(1) 配列番号１に示された２４３アミノ酸残基配列(2) 配列番号２に示された１５８アミノ酸残基配列(3) 配列番号３に示された１２５アミノ酸残基配列(4) 配列番号４に示された９６アミノ酸残基配列(5) 配列番号５に示された５５アミノ酸残基配列(6) 配列番号６に示された３６アミノ酸残基配列が使用可能であることは、確認済みであり、これらの範囲内であれば、その他の部分配列でも使用可能である。
【００１８】更に具体的には、配列番号２に示された配列は配列番号１のＮ末端側の８５アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号３に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の１１８アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号４に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の１４７アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号５に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の１９８アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号６に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の２７アミノ酸残基が切除された構成である。
【００１９】また、本発明に係る融合タンパク質とは、活性発現を目的とするタンパク質（実施例においては、ＳＡＫタンパク質）をコードする遺伝子と、アンカー配列として使用するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを、常法で結合したものである。
【００２０】この融合タンパク質を任意に選択したベクター（例えば、ｐＳＧ−ＴＥＲＭ）に組込み、プラスミドとして適当な宿主に形質転換することで、目的としたタンパク質を菌体表面に固定した微生物を得ることができる。尚、遺伝子の結合、増幅、宿主への形質転換法などは、遺伝子組換え研究分野で、周知のものを組合わせて行うことができる。
【００２１】
【実施例】食品用乳酸菌を用い、アンカー配列を介した菌体表層への発現系の作成を目指して、分泌タンパク質であるスタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）と、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)NCDO763 が産生するプロテアーゼ（ 763プロテアーゼ）のアンカー配列部分との融合タンパク質を構築し、そのアンカーとしての機能を検討した。
【００２２】１．材料大腸菌(E. coli) ＪＭ１０９株（東洋紡績株式会社）と、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) YIT2081株と、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT9029株とを宿主として用いた。大腸菌はＬ-brothで、乳酸菌はM17-glucose 培地で培養した。ベクターとして、プラスミドｐＳＧ−ＴＥＲＭを用いた。ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして、ｐＢＥ３１ＳＡＫ１及びｐＭＱ９０８０を用いた。
【００２３】２．シャトルベクターｐＳＧ−ＴＥＲＭ図１はプラスミドｐＳＧ−ＴＥＲＭの構造を模式的に示した説明図である。このプラスミドは、大腸菌、乳酸菌で機能するシャトルベクターｐＢＥ３１（特開平６−２５３８６１号公報参照）の約０．２１ｋｂのＡｃｃ−ＳｍａＩ断片を欠失させ、更に、ＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩサイトに、エリスロマイシン耐性遺伝子由来のプロモーター（Em promoter ）、 763プロテアーゼ遺伝子由来のＳＤ配列及びシグナル配列（763 protease signal seq.）、多重制限酵素認識配列（ＭＣＳ）、 763プロテアーゼ遺伝子由来のターミネータ配列（763 protease terminator ）を含む約０．４６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入し、ｐＳＧ−ＴＥＲＭとした。
【００２４】３．ｐＭＱ９０８０大腸菌のプラスミドｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩサイトに、７６３プロテアーゼのＣ末端を含むｐＬＰ763 由来の３．１ｋｂのＢｇｌII断片をクローニングし、ｐＭＱ９０８０とした。
【００２５】４．各プライマーの配列と合成次の配列のＤＮＡプライマーを、ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ ３９２、アブライド・バイオシステム社）を用いて合成した。
(1) ＳＧＳＡＫ５ATTAA GTTCG AAGGA GGAAG CGCCA TGCTC(2) ＳＡＫＳＡＬ１ＲAACTA TTTTG TCGAC TTTCT T(3) ＭＫ２４５CTCCG CGTCG ACAAG AAGAC TTCGC TGCTT AAC(4) ＭＫ１６０CTCCG CGTCG ACGCT GCAAC TGGCA AAACT TGG(5) ＭＫ１２７TTCCG CGTCG ACTTG CAAAG TCTGA AAACG AAG(6) ＭＫ０９８TTCCG CGTCG ACAAA GGCGG CGGTC AAGGT ACC(7) ＭＫ０５７TTCCG CGTCG ACACG AGCAC GGATG ATACG ACT(8) ＭＫ０３８TTCCG CGTCG ACTTA CCCAA GACAG GAGAG ACA(9) ＡＮＣＳＰＨ１AACCG TTTCT ACTGC ATGCA CTATA AGCAA
【００２６】５．ＤＮＡ断片の製造ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を用いたＰＣＲ法により、遺伝子ＤＮＡの増幅を行った。ＳＡＫ遺伝子の増幅は、ｐＢＥ３１ＳＡＫ１を鋳型とし、プライマーＳＧＳＡＫ５とＳＡＫＳＡＬ１Ｒとの間で、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７４℃６０秒を１サイクルとし、これを３０回繰返すことにより、行った。
【００２７】アンカー配列の増幅は、ｐＭＱ９０８０のＤｒａＩ断片を鋳型として、プライマーＭＫ２４５，ＭＫ１６０，ＭＫ１２７，ＭＫ０９８，ＭＫ０５７，ＭＫ０３８とＡＮＣＳＰＨ１との間で、９８℃１５秒、６０℃５秒、７４℃３０秒を１サイクルとし、これを３０回繰返す条件により行った。
【００２８】６．組換えプラスミドの製造(1) ｐＳＡＫ−ＮＳの作製ＰＣＲ法で増幅したＳＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＮｓｐＶ，ＳａｌＩで切断し、精製した後、ｐＳＧ−ＴＥＲＭのＮｓｐＶ−ＳａｌＩサイトに挿入して、ｐＳＡＫ−ＮＳを作成した。図２はＳＡＫ−アンカー配列融合タンパク質遺伝子の構造を模式的に示す説明図である。図２のａ図に示す通り、ｐＳＡＫ−ＮＳはエリスロマイシン耐性遺伝子のプロモータの下流に、ＳＡＫ遺伝子由来のＳＤ配列（ＳＤ）、ＳＡＫシグナル配列（signal seq. ）、３’側にＳａｌＩサイトが挿入されたためにＣ末端に２アミノ酸残基が付加したＳＡＫ成熟タンパク質、終止コドン、乳酸菌プロテアーゼ由来のターミネータ配列（terminator）が繋った構造をしている。
【００２９】(2) ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８の作製ＰＣＲ法で増殖したアンカー配列を含むＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ，ＳｐｈＩで切断し精製した後、ｐＳＡＫ−ＮＳのＳａｌＩ−ＳｐｈＩサイトに挿入することにより、ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８を作成した。図２のｂ図〜ｇ図に示す通り、これらのプラスミドは、ＳＡＫタンパク質のＣ末端にＳａｌＩサイトに由来する２アミノ酸残基を介して、プロテアーゼ由来のアンカー配列がＣ末端から各々、２４３，１５８，１２５，９６，５５，３６アミノ酸残基結合した融合タンパク質をコードしている。尚、得られたプラスミドについて、ｐＳＡＫ２４５は、生工研菌寄第１５９０９号として、ｐＳＡＫ０３８は生工研菌寄第１５９１０号として、各々生命工学研究所に平成０８年１０月１７日付けで寄託されている。また、他のプラスミドについては、ｐＳＡＫ２４５の所望の塩基配列を切除することにより、得られると判断したため、菌の寄託を行わなかった。
【００３０】７．宿主への形質転換作製したプラスミドＤＮＡは、先ず、大腸菌を宿主として、構造の確認を行った。その後、大腸菌より精製した各々のプラスミドＤＮＡ（ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８）をエレクトロポレーション法によりラクトコッカス・ラクチス菌 YIT2018株に導入して、ＳＡＫ−ＮＳ，ＳＡＫ２４５，ＳＡＫ１６０，ＳＡＫ１２７，ＳＡＫ０９８，ＳＡＫ０５７，ＳＡＫ０３８を得た。今回の実施例で作成し、解析を行った乳酸菌クローンを前記表１にまとめた。
【００３１】
【表１】
【００３２】８．ＳＡＫタンパク質の発現の確認(1) ＳＡＫ活性の測定一晩培養した培養液そのままを培養液画分、これを遠心分離された菌体ペレットをM17-glucose 培地に再懸濁したものを菌体画分とし、各々１０μｌを反応溶液（chromozyme PL 0.5mM, plasminogen 0.06units/ml, polysorbate 80 0.01%,0.1M Tris-HCl pH8.0）１００μｌと３７℃で反応させ、経時的に４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーモデル４５０（Bio Rad 社製）で測定した。
【００３３】図３はＳＡＫ活性を測定した結果を示す線図であり、ａ図は培養液画分、ｂ図は菌体画分を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間を示す。図３に示す通り、ＳＡＫ遺伝子を導入していないベクターでのみ活性が見られないほかは、全てのクローンで活性が検出された。
【００３４】(2) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングラクトコッカス・ラクチス菌クローンの一晩培養液１ｍｌを遠心分離して培養上清と菌体画分とを得た。培養上清はＴＣＡ沈殿後、２×ＳＤＳ sample buffer２０μｌに懸濁し加熱した。菌体画分も同様に２×ＳＤＳ sample buffer２０μｌに懸濁し加熱した。これらのサンプルをPhast System 20% Phast gel(Pharmacia社製) でＳＤＳ電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＡＫ抗血清を１次抗体として、アルカリフォスタファーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として用い、ウェスタンブロッティングを行った。
【００３５】図４はウェスタンブロッティングの結果を模式的に示す説明図であり、各クローン毎の培養上清(sup) 、菌体画分(cell)を順に示している。図に示す通り、ＳＡＫ遺伝子を導入していないベクター(Vector)では、ＳＡＫタンパク質は検出されていない。菌体画分ではＳＤＳサンプルバッファーにより菌体の表層タンパク質が抽出されていると考えられる。培養上清中にはＳＡＫ（融合）タンパク質が分解を受けたと思われる分子量の小さいバンドが多く検出された。
【００３６】(3) アルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた菌体表面のＳＡＫ（融合）タンパク質の検出各プラスミド（ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８）を同様にエレクトロポレーション法により導入して、宿主菌をラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) としたクローンを作製した。
【００３７】ラクトコッカス・ラクチス菌クローン及びラクトバチルス・カゼイ菌クローンの一晩培養液１ｍｌを遠心分離して菌体画分を得た。得られた菌体を 50mM Tris-HCl pH7.4 １ｍｌで２回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ 0.5mlに懸濁して室温で３０〜６０分保持し、抗ＳＡＫ抗血清１μｌを含むＴＢＳＴ 0.5mlに懸濁して室温で３０〜６０分保持した後、ＴＢＳＴ 0.5mlで３回洗浄した。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗体ウサギＩｇＧ抗体 0.25 μl を含むＴＢＳＴ 0.5mlに懸濁して室温で３０〜６０分保持した後、ＴＢＳＴ 0.5mlで３回洗浄後、ＯＤ660 が7.5 になるようにＴＢＳＴに懸濁し、サンプルとした。
【００３８】得られたサンプル10μl に基質溶液（1mg p-Nitrophenyl Phosphate /10ml diethanolamine buffer ） 100μｌを加え、室温で反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を経時的にマイクロプレートリーダモデル４５０（Bio Rad 社製）で測定した。
【００３９】図５はアルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた菌体表面のＳＡＫ（融合）タンパク質の検出結果を示す線図であり、ａ図はラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ｂ図はラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。
【００４０】図において、吸光度の活性は菌体に結合したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の活性が示される。即ち、菌体表面に表出したＳＡＫにウサギ抗体ＳＡＫ抗体が結合し、更にこれにアルカリフォスファターゼによって標識されたウサギＩｇＧ抗体が結合するため、アルカリフォスファターゼの活性が高ければ、菌体表面に表出したＳＡＫの数が多いこととなる。従って、図に示したグラフの傾斜が急な方がＡＰ活性が高く、菌体に結合したＡＰ標識抗兎ＩｇＧ抗体の量が多いことを示す。このことはそのクローンにおいて菌体表層のウサギ抗ＳＡＫ抗体量が多いこと、即ち、菌体表層に提示されているＳＡＫタンパク質エピトープが多いことを意味する。
【００４１】図に示されるように、ラクトコッカス・ラクチス菌、ラクトバチルス・カゼイ菌の何れでも、アミノ酸残基数の多いものは、ＡＰ活性、即ちＳＡＫの菌体表面への発現が高いことが確認された。３６アミノ酸残基は、Ｌ．ラクチス菌でコントロール（ベクター，ＮＳ）との差が確認できたが、Ｌ．カゼイでは差が確認できなかった。これは、融合タンパク質が菌体細胞壁内に埋没している可能性が考えられる。従って、好ましくは３６アミノ酸残基を超えたアンカー配列が必要である。
【００４２】
【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、ラクトコッカス・ラクチス菌由来のプロテアーゼのアンカー配列又は当該アンカー配列の部分配列を利用して、種々の任意の有用タンパク質を菌体表面に固定化し、且つ当該有用タンパク質を発現させるという効果がある。従って、本発明によれば、例えば安全性が高い乳酸菌を利用して、種々のタンパク質を固定化することが可能となるので、安全性の高い経口ワクチンなどへの利用が考えられる。
【００４３】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：243配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Lys Lys Thr Ser Leu Leu Asn Gln Leu Gln Ser Val Lys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Glu Thr Asp Leu Gly Asn Gln Thr Asp Ser Ser Thr Gly Lys Thr Phe 20 25 30 Thr Ala Ala Leu Asp Asp Leu Val Ala Gln Ala Gln Ala Gly Thr Gln 35 40 45 Thr Asp Asp Gln Leu Gln Ala Thr Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Val 50 55 60 Leu Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ile Lys Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val 65 70 75 80 Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile 85 90 95 Ala Asp Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys 100 105 110 Leu Ala His Leu Gln Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala 115 120 125 Ala Val Glu Ala Ala Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly 130 135 140 Thr Ser Asp Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ile Gly Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly 165 170 175 Gly Asn Ile Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp 180 185 190 Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly 210 215 220 Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln 225 230 235 240 Arg Glu Glu 243
【００４４】配列番号：２配列の長さ：158配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile Ala Asp Thr Leu Thr 1 5 10 15 Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys Leu Ala His Leu Gln 20 25 30 Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala 35 40 45 Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly 50 55 60 Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp 65 70 75 80 Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr 85 90 95 Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg 100 105 110 Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu 115 120 125 Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser 130 135 140 Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 145 150 155 158
【００４５】配列番号：３配列の長さ：125配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Lys 1 5 10 15 Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly Gly 20 25 30 Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp Lys 35 40 45 Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr Asn 50 55 60 Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn 65 70 75 80 Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr 85 90 95 Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu 100 105 110 Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 115 120 125
【００４６】配列番号：４配列の長さ：96配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly 1 5 10 15 Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile 20 25 30 Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr 35 40 45 Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr 50 55 60 Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val 65 70 75 80 Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 85 90 95 96
【００４７】配列番号：５配列の長さ：55配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe 20 25 30 Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu 35 40 45 Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 50 55
【００４８】配列番号：６配列の長さ：36配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu 1 5 10 15 Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys 20 25 30 Gln Arg Glu Glu 35 36
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＳＧ−ＴＥＲＭの構造を模式的に示した説明図である。
【図２】ＳＡＫ−アンカー配列融合タンパク質遺伝子の構造を模式的に示す説明図である。
【図３】ＳＡＫ活性を測定した結果を示す線図であり、ａ図は培養液画分、ｂ図は菌体画分を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間を示す。
【図４】ウェスタンブロッティングの結果を模式的に示す説明図であり、各クローン毎の培養上清(sup) 、菌体画分(cell)を順に示している。
【図５】アルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた菌体表面のＳＡＫ（融合）タンパク質の検出結果を示す線図であり、ａ図はラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ｂ図はラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)の菌体表層のプロテアーゼタンパク質が有するアンカー配列を利用して、任意の有用タンパク質を、宿主菌体表面に発現させる固定化方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】グラム陽性菌の多くの菌体表層タンパク質はアンカー配列と呼ばれる共通した構造を持ち、それを介して菌体に結合している。ラクトコッカス・ラクチス菌のプロテアーゼの中で、所謂 763プロテアーゼは、ラクトコッカス・ラクチスｓｓｐ．ラクチス NCDO763株の５５Ｋｂプラスミド（ｐＬＰ 763）上に産生情報が保持されているセリンプロテアーゼであり、Ｃ末端に位置するアンカー配列により、菌体表面において菌体と結合する構造を取り、発現していることが知られている。
【０００３】このアンカー配列は、グラム陽性細菌の細胞表層タンパク質の多くが有する構造であり、(1) 細胞壁を構成するペプチドグリカン層内に位置するプロリン、グリシンに富んだ繰り返し領域、(2) アミノ酸残基よりなるコンセンサス配列（ＬＰＸＴＧモチーフ）、(3) 細胞膜内に位置する疎水性領域、(4) 細胞質内に位置すると考えられる正電荷領域からなる。
【０００４】763プロテアーゼのアンカー配列については、その、アミノ酸構造は報告されているが（文献参照；Molecular Microbiology (1989) vol.3(No.3),359-369 ）、 763プロテアーゼにおいては、上記(1) に記載のプロリン・グリシンに富んだ繰り返し領域がはっきりせず、その全てが、プロテアーゼの菌体への結合に必須であるのか、また、必須ではない場合、最小必要単位がどの部分であるのか等については、充分解明されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】菌体表層に有用タンパク質を発現させることは、微生物を育種する上で有効な手段となり得る。そこで、本発明者らは鋭意努力の結果、 763プロテアーゼに由来するアンカー配列において、プロテアーゼの菌体への結合に関与する領域を解明することにより、本発明を得るに至った。
【０００６】本発明は、ラクトコッカス・ラクチス菌由来のプロテアーゼのアンカー配列又は当該アンカー配列の部分配列を利用して、種々の任意の有用タンパク質を菌体表面に固定化し、且つ当該有用タンパク質を発現させることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された発明に係る菌体表面へのタンパク質の固定化方法では、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えたものである。
【０００８】本請求項２に記載された発明に係る菌体表面へのタンパク質の固定化方法では、前記アンカー配列が、少なくとも下記アミノ酸配列を備えているものである。
Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【０００９】本請求項３に記載された発明に係る菌体表面へのタンパク質の固定化方法では、前記アンカー配列が、請求項２に示すアミノ酸配列を残して下記アミノ酸配列の一部を切除したアミノ酸配列からなるものである。
Lys Lys Thr Ser Leu Leu Asn Gln Leu Gln Ser Val Lys Ala Ala Leu Glu Thr Asp Leu Gly Asn Gln Thr Asp Ser Ser Thr Gly Lys Thr Phe Thr Ala Ala Leu Asp Asp Leu Val Ala Gln Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asp Asp Gln Leu Gln Ala Thr Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ile Lys Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile Ala Asp Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys Leu Ala His Leu Gln Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【００１０】本発明における目的とするタンパク質とは、宿主となる乳酸菌の培養に応じてその乳酸菌表面に発現する有用なタンパク質を指す。例えば、後述する実施例で示されたスタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）等の酵素や、病原性細菌の部分タンパク質，生理活性タンパク質等も考慮される。即ち、任意のタンパク質の遺伝子が単離されており、通常の遺伝子組換え技術を用いて、該アンカー配列と結合させて、融合蛋白の遺伝子を作成できるものであれば、特に制限はない。
【００１１】また、本発明における宿主菌とは、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列により、菌体表面において菌体と結合する構造を取り、菌体表面に発現するものであればよい。具体的には、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)，ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) ，ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)，エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis) ，スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus) ，ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)，ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)等の乳酸菌が挙げられる。
【００１２】アンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列の作製、この融合遺伝子配列の宿主菌内への導入、この融合遺伝子配列が導入された宿主菌の培養は、常法により行うことができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明では、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得て、この融合遺伝子配列を宿主菌に導入し、これを培養することにより、目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する。
【００１４】これにより、例えば、酵素を宿主菌体表面に表出させて固定化したり、病原性細菌の部分タンパク質を使用して、ワクチン作用を有するものとしたり、生理活性タンパク質を使用して、医薬的用途に用いたりすることが可能である。後述する実施例においては、優れた血栓溶解作用を有する、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）タンパク質をモデルとして用いたが、目的とするタンパク質に応じて種々変更が可能である。
【００１５】アンカー配列と目的とするタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子配列の宿主菌内への導入は、通常の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。例えば、宿主菌となる乳酸菌に導入可能なプラスミドに前記遺伝子配列を保持させて、このプラスミドを宿主菌に導入することにより行うことができる。
【００１６】ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列について、本発明により初めて、配列番号１〜６に示す２４３アミノ酸残基配列〜３６アミノ酸残基配列が使用可能であることが確認された。特に、本発明では配列番号６に示す３６アミノ酸残基配列がラクトコッカス・ラクチス及びラクトバチルス・カゼイで使用可能であることが確認された。
【００１７】具体的には、(1) 配列番号１に示された２４３アミノ酸残基配列(2) 配列番号２に示された１５８アミノ酸残基配列(3) 配列番号３に示された１２５アミノ酸残基配列(4) 配列番号４に示された９６アミノ酸残基配列(5) 配列番号５に示された５５アミノ酸残基配列(6) 配列番号６に示された３６アミノ酸残基配列が使用可能であることは、確認済みであり、これらの範囲内であれば、その他の部分配列でも使用可能である。
【００１８】更に具体的には、配列番号２に示された配列は配列番号１のＮ末端側の８５アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号３に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の１１８アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号４に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の１４７アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号５に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の１９８アミノ酸残基が切除された構成である。配列番号６に示された配列は同じく配列番号１のＮ末端側の２７アミノ酸残基が切除された構成である。
【００１９】また、本発明に係る融合タンパク質とは、活性発現を目的とするタンパク質（実施例においては、ＳＡＫタンパク質）をコードする遺伝子と、アンカー配列として使用するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを、常法で結合したものである。
【００２０】この融合タンパク質を任意に選択したベクター（例えば、ｐＳＧ−ＴＥＲＭ）に組込み、プラスミドとして適当な宿主に形質転換することで、目的としたタンパク質を菌体表面に固定した微生物を得ることができる。尚、遺伝子の結合、増幅、宿主への形質転換法などは、遺伝子組換え研究分野で、周知のものを組合わせて行うことができる。
【００２１】
【実施例】食品用乳酸菌を用い、アンカー配列を介した菌体表層への発現系の作成を目指して、分泌タンパク質であるスタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）と、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)NCDO763 が産生するプロテアーゼ（ 763プロテアーゼ）のアンカー配列部分との融合タンパク質を構築し、そのアンカーとしての機能を検討した。
【００２２】１．材料大腸菌(E. coli) ＪＭ１０９株（東洋紡績株式会社）と、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) YIT2081株と、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT9029株とを宿主として用いた。大腸菌はＬ-brothで、乳酸菌はM17-glucose 培地で培養した。ベクターとして、プラスミドｐＳＧ−ＴＥＲＭを用いた。ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして、ｐＢＥ３１ＳＡＫ１及びｐＭＱ９０８０を用いた。
【００２３】２．シャトルベクターｐＳＧ−ＴＥＲＭ図１はプラスミドｐＳＧ−ＴＥＲＭの構造を模式的に示した説明図である。このプラスミドは、大腸菌、乳酸菌で機能するシャトルベクターｐＢＥ３１（特開平６−２５３８６１号公報参照）の約０．２１ｋｂのＡｃｃ−ＳｍａＩ断片を欠失させ、更に、ＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩサイトに、エリスロマイシン耐性遺伝子由来のプロモーター（Em promoter ）、 763プロテアーゼ遺伝子由来のＳＤ配列及びシグナル配列（763 protease signal seq.）、多重制限酵素認識配列（ＭＣＳ）、 763プロテアーゼ遺伝子由来のターミネータ配列（763 protease terminator ）を含む約０．４６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入し、ｐＳＧ−ＴＥＲＭとした。
【００２４】３．ｐＭＱ９０８０大腸菌のプラスミドｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩサイトに、７６３プロテアーゼのＣ末端を含むｐＬＰ763 由来の３．１ｋｂのＢｇｌII断片をクローニングし、ｐＭＱ９０８０とした。
【００２５】４．各プライマーの配列と合成次の配列のＤＮＡプライマーを、ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ ３９２、アブライド・バイオシステム社）を用いて合成した。
(1) ＳＧＳＡＫ５ATTAA GTTCG AAGGA GGAAG CGCCA TGCTC(2) ＳＡＫＳＡＬ１ＲAACTA TTTTG TCGAC TTTCT T(3) ＭＫ２４５CTCCG CGTCG ACAAG AAGAC TTCGC TGCTT AAC(4) ＭＫ１６０CTCCG CGTCG ACGCT GCAAC TGGCA AAACT TGG(5) ＭＫ１２７TTCCG CGTCG ACTTG CAAAG TCTGA AAACG AAG(6) ＭＫ０９８TTCCG CGTCG ACAAA GGCGG CGGTC AAGGT ACC(7) ＭＫ０５７TTCCG CGTCG ACACG AGCAC GGATG ATACG ACT(8) ＭＫ０３８TTCCG CGTCG ACTTA CCCAA GACAG GAGAG ACA(9) ＡＮＣＳＰＨ１AACCG TTTCT ACTGC ATGCA CTATA AGCAA
【００２６】５．ＤＮＡ断片の製造ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を用いたＰＣＲ法により、遺伝子ＤＮＡの増幅を行った。ＳＡＫ遺伝子の増幅は、ｐＢＥ３１ＳＡＫ１を鋳型とし、プライマーＳＧＳＡＫ５とＳＡＫＳＡＬ１Ｒとの間で、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７４℃６０秒を１サイクルとし、これを３０回繰返すことにより、行った。
【００２７】アンカー配列の増幅は、ｐＭＱ９０８０のＤｒａＩ断片を鋳型として、プライマーＭＫ２４５，ＭＫ１６０，ＭＫ１２７，ＭＫ０９８，ＭＫ０５７，ＭＫ０３８とＡＮＣＳＰＨ１との間で、９８℃１５秒、６０℃５秒、７４℃３０秒を１サイクルとし、これを３０回繰返す条件により行った。
【００２８】６．組換えプラスミドの製造(1) ｐＳＡＫ−ＮＳの作製ＰＣＲ法で増幅したＳＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＮｓｐＶ，ＳａｌＩで切断し、精製した後、ｐＳＧ−ＴＥＲＭのＮｓｐＶ−ＳａｌＩサイトに挿入して、ｐＳＡＫ−ＮＳを作成した。図２はＳＡＫ−アンカー配列融合タンパク質遺伝子の構造を模式的に示す説明図である。図２のａ図に示す通り、ｐＳＡＫ−ＮＳはエリスロマイシン耐性遺伝子のプロモータの下流に、ＳＡＫ遺伝子由来のＳＤ配列（ＳＤ）、ＳＡＫシグナル配列（signal seq. ）、３’側にＳａｌＩサイトが挿入されたためにＣ末端に２アミノ酸残基が付加したＳＡＫ成熟タンパク質、終止コドン、乳酸菌プロテアーゼ由来のターミネータ配列（terminator）が繋った構造をしている。
【００２９】(2) ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８の作製ＰＣＲ法で増殖したアンカー配列を含むＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ，ＳｐｈＩで切断し精製した後、ｐＳＡＫ−ＮＳのＳａｌＩ−ＳｐｈＩサイトに挿入することにより、ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８を作成した。図２のｂ図〜ｇ図に示す通り、これらのプラスミドは、ＳＡＫタンパク質のＣ末端にＳａｌＩサイトに由来する２アミノ酸残基を介して、プロテアーゼ由来のアンカー配列がＣ末端から各々、２４３，１５８，１２５，９６，５５，３６アミノ酸残基結合した融合タンパク質をコードしている。尚、得られたプラスミドについて、ｐＳＡＫ２４５は、生工研菌寄第１５９０９号として、ｐＳＡＫ０３８は生工研菌寄第１５９１０号として、各々生命工学研究所に平成０８年１０月１７日付けで寄託されている。また、他のプラスミドについては、ｐＳＡＫ２４５の所望の塩基配列を切除することにより、得られると判断したため、菌の寄託を行わなかった。
【００３０】７．宿主への形質転換作製したプラスミドＤＮＡは、先ず、大腸菌を宿主として、構造の確認を行った。その後、大腸菌より精製した各々のプラスミドＤＮＡ（ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８）をエレクトロポレーション法によりラクトコッカス・ラクチス菌 YIT2018株に導入して、ＳＡＫ−ＮＳ，ＳＡＫ２４５，ＳＡＫ１６０，ＳＡＫ１２７，ＳＡＫ０９８，ＳＡＫ０５７，ＳＡＫ０３８を得た。今回の実施例で作成し、解析を行った乳酸菌クローンを前記表１にまとめた。
【００３１】
【表１】
【００３２】８．ＳＡＫタンパク質の発現の確認(1) ＳＡＫ活性の測定一晩培養した培養液そのままを培養液画分、これを遠心分離された菌体ペレットをM17-glucose 培地に再懸濁したものを菌体画分とし、各々１０μｌを反応溶液（chromozyme PL 0.5mM, plasminogen 0.06units/ml, polysorbate 80 0.01%,0.1M Tris-HCl pH8.0）１００μｌと３７℃で反応させ、経時的に４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーモデル４５０（Bio Rad 社製）で測定した。
【００３３】図３はＳＡＫ活性を測定した結果を示す線図であり、ａ図は培養液画分、ｂ図は菌体画分を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間を示す。図３に示す通り、ＳＡＫ遺伝子を導入していないベクターでのみ活性が見られないほかは、全てのクローンで活性が検出された。
【００３４】(2) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングラクトコッカス・ラクチス菌クローンの一晩培養液１ｍｌを遠心分離して培養上清と菌体画分とを得た。培養上清はＴＣＡ沈殿後、２×ＳＤＳ sample buffer２０μｌに懸濁し加熱した。菌体画分も同様に２×ＳＤＳ sample buffer２０μｌに懸濁し加熱した。これらのサンプルをPhast System 20% Phast gel(Pharmacia社製) でＳＤＳ電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＡＫ抗血清を１次抗体として、アルカリフォスタファーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として用い、ウェスタンブロッティングを行った。
【００３５】図４はウェスタンブロッティングの結果を模式的に示す説明図であり、各クローン毎の培養上清(sup) 、菌体画分(cell)を順に示している。図に示す通り、ＳＡＫ遺伝子を導入していないベクター(Vector)では、ＳＡＫタンパク質は検出されていない。菌体画分ではＳＤＳサンプルバッファーにより菌体の表層タンパク質が抽出されていると考えられる。培養上清中にはＳＡＫ（融合）タンパク質が分解を受けたと思われる分子量の小さいバンドが多く検出された。
【００３６】(3) アルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた菌体表面のＳＡＫ（融合）タンパク質の検出各プラスミド（ｐＳＡＫ２４５，ｐＳＡＫ１６０，ｐＳＡＫ１２７，ｐＳＡＫ０９８，ｐＳＡＫ０５７，ｐＳＡＫ０３８）を同様にエレクトロポレーション法により導入して、宿主菌をラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) としたクローンを作製した。
【００３７】ラクトコッカス・ラクチス菌クローン及びラクトバチルス・カゼイ菌クローンの一晩培養液１ｍｌを遠心分離して菌体画分を得た。得られた菌体を 50mM Tris-HCl pH7.4 １ｍｌで２回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ 0.5mlに懸濁して室温で３０〜６０分保持し、抗ＳＡＫ抗血清１μｌを含むＴＢＳＴ 0.5mlに懸濁して室温で３０〜６０分保持した後、ＴＢＳＴ 0.5mlで３回洗浄した。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗体ウサギＩｇＧ抗体 0.25 μl を含むＴＢＳＴ 0.5mlに懸濁して室温で３０〜６０分保持した後、ＴＢＳＴ 0.5mlで３回洗浄後、ＯＤ660 が7.5 になるようにＴＢＳＴに懸濁し、サンプルとした。
【００３８】得られたサンプル10μl に基質溶液（1mg p-Nitrophenyl Phosphate /10ml diethanolamine buffer ） 100μｌを加え、室温で反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を経時的にマイクロプレートリーダモデル４５０（Bio Rad 社製）で測定した。
【００３９】図５はアルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた菌体表面のＳＡＫ（融合）タンパク質の検出結果を示す線図であり、ａ図はラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ｂ図はラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。
【００４０】図において、吸光度の活性は菌体に結合したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の活性が示される。即ち、菌体表面に表出したＳＡＫにウサギ抗体ＳＡＫ抗体が結合し、更にこれにアルカリフォスファターゼによって標識されたウサギＩｇＧ抗体が結合するため、アルカリフォスファターゼの活性が高ければ、菌体表面に表出したＳＡＫの数が多いこととなる。従って、図に示したグラフの傾斜が急な方がＡＰ活性が高く、菌体に結合したＡＰ標識抗兎ＩｇＧ抗体の量が多いことを示す。このことはそのクローンにおいて菌体表層のウサギ抗ＳＡＫ抗体量が多いこと、即ち、菌体表層に提示されているＳＡＫタンパク質エピトープが多いことを意味する。
【００４１】図に示されるように、ラクトコッカス・ラクチス菌、ラクトバチルス・カゼイ菌の何れでも、アミノ酸残基数の多いものは、ＡＰ活性、即ちＳＡＫの菌体表面への発現が高いことが確認された。３６アミノ酸残基は、Ｌ．ラクチス菌でコントロール（ベクター，ＮＳ）との差が確認できたが、Ｌ．カゼイでは差が確認できなかった。これは、融合タンパク質が菌体細胞壁内に埋没している可能性が考えられる。従って、好ましくは３６アミノ酸残基を超えたアンカー配列が必要である。
【００４２】
【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、ラクトコッカス・ラクチス菌由来のプロテアーゼのアンカー配列又は当該アンカー配列の部分配列を利用して、種々の任意の有用タンパク質を菌体表面に固定化し、且つ当該有用タンパク質を発現させるという効果がある。従って、本発明によれば、例えば安全性が高い乳酸菌を利用して、種々のタンパク質を固定化することが可能となるので、安全性の高い経口ワクチンなどへの利用が考えられる。
【００４３】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：243配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Lys Lys Thr Ser Leu Leu Asn Gln Leu Gln Ser Val Lys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Glu Thr Asp Leu Gly Asn Gln Thr Asp Ser Ser Thr Gly Lys Thr Phe 20 25 30 Thr Ala Ala Leu Asp Asp Leu Val Ala Gln Ala Gln Ala Gly Thr Gln 35 40 45 Thr Asp Asp Gln Leu Gln Ala Thr Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Val 50 55 60 Leu Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ile Lys Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val 65 70 75 80 Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile 85 90 95 Ala Asp Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys 100 105 110 Leu Ala His Leu Gln Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala 115 120 125 Ala Val Glu Ala Ala Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly 130 135 140 Thr Ser Asp Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ile Gly Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly 165 170 175 Gly Asn Ile Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp 180 185 190 Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly 210 215 220 Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln 225 230 235 240 Arg Glu Glu 243
【００４４】配列番号：２配列の長さ：158配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile Ala Asp Thr Leu Thr 1 5 10 15 Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys Leu Ala His Leu Gln 20 25 30 Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala 35 40 45 Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly 50 55 60 Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp 65 70 75 80 Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr 85 90 95 Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg 100 105 110 Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu 115 120 125 Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser 130 135 140 Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 145 150 155 158
【００４５】配列番号：３配列の長さ：125配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Lys 1 5 10 15 Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly Gly 20 25 30 Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp Lys 35 40 45 Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr Asn 50 55 60 Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn 65 70 75 80 Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr 85 90 95 Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu 100 105 110 Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 115 120 125
【００４６】配列番号：４配列の長さ：96配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly 1 5 10 15 Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile 20 25 30 Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr 35 40 45 Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr 50 55 60 Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val 65 70 75 80 Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 85 90 95 96
【００４７】配列番号：５配列の長さ：55配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe 20 25 30 Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu 35 40 45 Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu 50 55
【００４８】配列番号：６配列の長さ：36配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)株名： NCDO763株配列Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu 1 5 10 15 Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys 20 25 30 Gln Arg Glu Glu 35 36
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＳＧ−ＴＥＲＭの構造を模式的に示した説明図である。
【図２】ＳＡＫ−アンカー配列融合タンパク質遺伝子の構造を模式的に示す説明図である。
【図３】ＳＡＫ活性を測定した結果を示す線図であり、ａ図は培養液画分、ｂ図は菌体画分を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間を示す。
【図４】ウェスタンブロッティングの結果を模式的に示す説明図であり、各クローン毎の培養上清(sup) 、菌体画分(cell)を順に示している。
【図５】アルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた菌体表面のＳＡＫ（融合）タンパク質の検出結果を示す線図であり、ａ図はラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ｂ図はラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) を示す。縦軸は吸光度、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えたことを特徴とする菌体表面へのタンパク質の固定化方法。
【請求項２】 前記アンカー配列が、少なくとも下記アミノ酸配列を備えていることを特徴とする請求項１に記載の菌体表面へのタンパク質の固定化方法。
Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【請求項３】 前記アンカー配列が、請求項２に示すアミノ酸配列を残して下記アミノ酸配列の一部を切除したアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２に記載の菌体表面へのタンパク質の固定化方法。
Lys Lys Thr Ser Leu Leu Asn Gln Leu Gln Ser Val Lys Ala Ala Leu Glu Thr Asp Leu Gly Asn Gln Thr Asp Ser Ser Thr Gly Lys Thr Phe Thr Ala Ala Leu Asp Asp Leu Val Ala Gln Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asp Asp Gln Leu Gln Ala Thr Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ile Lys Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile Ala Asp Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys Leu Ala His Leu Gln Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【請求項１】 ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えたことを特徴とする菌体表面へのタンパク質の固定化方法。
【請求項２】 前記アンカー配列が、少なくとも下記アミノ酸配列を備えていることを特徴とする請求項１に記載の菌体表面へのタンパク質の固定化方法。
Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【請求項３】 前記アンカー配列が、請求項２に示すアミノ酸配列を残して下記アミノ酸配列の一部を切除したアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２に記載の菌体表面へのタンパク質の固定化方法。
Lys Lys Thr Ser Leu Leu Asn Gln Leu Gln Ser Val Lys Ala Ala Leu Glu Thr Asp Leu Gly Asn Gln Thr Asp Ser Ser Thr Gly Lys Thr Phe Thr Ala Ala Leu Asp Asp Leu Val Ala Gln Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asp Asp Gln Leu Gln Ala Thr Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ile Lys Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ala Thr Gly Lys Thr Trp Tyr Ala Asp Ile Ala Asp Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Ser Ala Asp Ala Ser Asp Lys Leu Ala His Leu Gln Ala Leu Gln Ser Leu Lys Thr Lys Val Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Lys Thr Val Gly Lys Gly Asp Gly Thr Thr Gly Thr Ser Asp Lys Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ile Gly Lys Asp Lys Gly Asp Glu Gly Ser Gln Pro Ser Ser Gly Gly Asn Ile Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Asp Asp Thr Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Thr Ser Gly Lys Gly Ala Leu Pro Lys Thr Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Ala Phe Gly Phe Leu Gly Val Ile Val Val Ser Leu Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Glu Glu
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【公開番号】特開平１０−１１７７８３
【公開日】平成１０年（１９９８）５月１２日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−２９９２７３
【出願日】平成８年（１９９６）１０月２４日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成８年７月２５日 社団法人日本生化学会発行の「生化学第６８巻７号」に発表
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【公開日】平成１０年（１９９８）５月１２日
【国際特許分類】
【出願日】平成８年（１９９６）１０月２４日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成８年７月２５日 社団法人日本生化学会発行の「生化学第６８巻７号」に発表
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
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