蛍光に基づくＡＤＰの検出システム
溶液中のヌクレオチドを検出するか、または少なくとも二つのヌクレオチドの混合物の溶液中における一つのヌクレオチドを示差的に検出するための方法およびキットであって、溶液にキレート剤を加える、およびキレート剤の添加時に作成されるかもしくは変更される信号を分光検出システムを用いて検出する工程を含んでいる、方法およびキット。信号の検出の前に、溶液にランタニドを加えることもできる。分光検出システムは、好ましくは蛍光に基づくシステムである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヌクレオチド検出の分野に関する。特に、本発明は、ヌクレオチドの示差分光検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ二、三年、タンパク質キナーゼは、製薬会社にとって薬物開発のための標的となってきている。製薬工業における全標的の２０％までが、現在はキナーゼであると推定されている。この興味の理由は、キナーゼが基本的な細胞のプロセスにおいて重要な役割を果たしているという事実に関係があるからである。キナーゼ活性の撹乱は、ヒトにおける疾患を引き起こすかもしくは疾患の指標となることができ、そしてキナーゼの分子または受容体を薬物で標的化することにより疾患の進行を変更することができる。
【０００３】
キナーゼは、リン酸基をＡＴＰ(アデノシン三リン酸)から基質へ転移させる酵素(生化学的触媒)である。リン酸基転移の結果として、ＡＴＰは脱リン酸化されてＡＤＰ(アデノシン二リン酸)を形成する。一旦基質がインビボでリン酸化されると、生化学的経路が活性化される。単一のキナーゼは多数の基質を有し、どの基質がリン酸化されているかに依存して、異なる経路が活性化される。従って、基質の選択性は、キナーゼの重要な特性である。キナーゼが行う生化学的反応が以下に示される：
ＡＴＰ＋キナーゼ＋基質 ＋ ＡＤＰ＋キナーゼ＋基質−Ｐ (１)
【０００４】
この反応の要件の一つは、基質が、ＡＴＰの分子からキナーゼ酵素により転移されたリン酸基を受容することができる水酸基を有することである。かくして、ポリペプチドまたはタンパク質に対する基質は、一般的に、チロシン(チロシンキナーゼ)またはセリン／トレオニン(セリン／トレオニンキナーゼ)を受容体アミノ酸として含有する。
【０００５】
臨床現場におけるキナーゼ活性の検出は、人の健康の種々の状態を評価するのに重要な役割を果たしている。クレアチンキナーゼ(ＣＫ)は、例えば、ミオサイトの細胞質の中に高濃度で存在する“漏出”酵素であって、神経筋の疾患の評価のために最も広く使用される酵素である。ＣＫの検出のための現在の方法は、種々の他の酵素の使用を含む多数の工程を伴っている。
【０００６】
薬物の発見および薬物のプロファイリングの目的のためのキナーゼ活性の検出は、製薬工業にとって興味あるチャレンジを提示する。産業界で現在使用されている、多数の酵素での共役検出システムは、興味のある酵素以外の酵素に対する薬物の効果を除外するための対比スクリーニングが必要であるので実用的ではない。例えば、ＣＫ阻害剤を探索する際に、共役酵素であるヘキソキナーゼ(ＨＫ)は、ＨＫがそれ自身のＡＴＰ結合部位を有するので、ＣＫのＡＴＰ結合部位と相互作用する薬物により影響を受ける。
【０００７】
キナーゼの阻害剤を探索する研究者達が、彼らの薬物発見プログラムにおいて伝統的に使用してきている一つのアプローチは、キナーゼ活性を監視する手段として基質のリン酸化を検出することである。厄介な問題は、全てのキナーゼに対する基質が様々であり、単一のキナーゼが同一の基質内においてさえ多数のリン酸化部位を有し得ることである。どのような場合にも、アッセイの開発は、アッセイのための最適条件を見出すために為されるべきであって、これは非常に時間を浪費するものである。基質のリン酸化を検出するために現在使用されている方法は、リン酸化された基質の検出が特異的な抗体を用いて為されるＥＬＩＳＡに基づくアッセイである。ＥＬＩＳＡに基づくシステムは、高感度を示すが、多くの工程が要求され、典型的なアッセイには何時間もかかり、多くの操作を必要とし、誤差の機会を増大させている。
【０００８】
キナーゼ活性を監視するために現在使用されているもう一つの方法は、アッセイが進行するにつれて、ＡＴＰの減少の検出および定量化をすることである。この方法は、蓄積されると、キナーゼ活性を阻害する生成物−この場合にはＡＤＰ−の生産により制限されている。そのような方法論の応用が、広範なアッセイの開発を必要としている。
【０００９】
キナーゼアッセイの進行を監視するために伝統的に使用されている検出システムは、蛍光分光測定、蛍光偏光（Ｐａｎｖｅｒａ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）、時間分解蛍光（Ｃｉｓ−Ｂｉｏ）、吸光度分光測定（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｕｐｓｔａｔｅ）、発光分光測定（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような分光技法、およびシンチレーション（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはクロマトグラフィー（Ｃａｌｉｐｅｒ）のような非分光技法を利用している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者等は、アッセイでのヌクレオチド(複数を含む)の検出のための技術を開発してきた。そのような技術は、例えば、キナーゼアッセイにおけるキナーゼ活性のような、アッセイにおける生化学的活性を監視する手段として使うことができる。それは、二リン酸化ヌクレオシドの濃度が経時的に変化する、任意の活性を研究する機構を提供する分光検出システムである。このような分光検出システムを使用して、例えば、使用される基質と無関係に、二リン酸化ヌクレオシドまたは三リン酸化ヌクレオシドのモノリン酸化ヌクレオシドまたは二リン酸化ヌクレオシドへのそれぞれの変換、またはその逆の変換を監視することができる。具体的な二リン酸化ヌクレオシドはＡＤＰであって、具体的な三リン酸化ヌクレオシドはＡＴＰである。現在使用されている検出方法の替わりに、この技術を使用して、現在では利用可能な検出方法が全く無い基質に対するキナーゼ標的(複数を含む)をスクリーニングすることができる。臨床または他の状況において、この方法論を使用することにより、ＡＴＰを利用し、ＡＤＰを産生させる酵素の活性を検出および／または監視をすることができた。
【００１１】
ＡＴＰおよびＡＤＰは、どのようなキナーゼ反応においても常に存在する。かくして、ＡＴＰの消費および／またはＡＤＰの生産を監視することを基本とするシステムは、基質とは無関係に、任意のキナーゼ反応の監視をすることができる。ＡＤＰは反応が開始する前の反応液中には存在しないので、ＡＤＰ産生の監視はキナーゼの活性を監視する有効な方法となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、キレート剤の添加により増強され得るＡＴＰおよびＡＤＰの分光スペクトルに相違があることを明確にした。更に具体的には、特定の状況下では、図１で立証されているように、ＡＤＰおよびＡＴＰの分子の螢光スペクトルにおいて、約４５０〜５５０ｎｍにおける蛍光発光には可なり一貫した相違がある。本発明者等はこれに加えて、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート剤の存在下において、図２に示されるように、ＡＴＰ蛍光が対応して増加することなく、ＡＤＰ蛍光が４５０〜５５０ｎｍの範囲において相当に増加することを測定した。同様に、図３に示されるように、キレート剤のエチレングリコール−ビス(２−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ−四酢酸(ＥＧＴＡ)の存在下において、ＡＴＰ蛍光の増加を伴うことなく、ＡＤＰ蛍光は大きく増加する。
【００１３】
図４は、５００ｎｍにおける蛍光の強度が、ＥＤＴＡの溶液に加えられたＡＤＰの量に比例することを示している。
【００１４】
本明細書において使用されるように、用語“キレート剤”とは、共役的にまたは非共役的に、金属に配位することができる少なくとも一つの官能基を有する任意の分子を指す。キレート剤は多座配位であるか、または単座配位様式で配位し得る。キレート剤は、ポルフィリンのような大環状であってもよい。キレート剤は、パイ電子を供与するか、または共有することにより金属と配位することができる。分光検出を増加するようにさらに誘導体化されたキレート剤も含まれる。キレート剤の官能基は、マイナスもしくはプラスに荷電されているか、または中性であってもよい。適当な官能基の例としては、カルボキシラト、チオラト、ヒドリド、シアノ、カルボナト、チオカルカメート、チオカルボキシラト、チオホスフィナトアミノ、ホホロ、ヒドラジノ、ニトリロ、ヒドラジド、オキシム、およびチオエーテルが挙げられる。
【００１５】
キレート剤の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、エチレン、およびエチレングリコール−ビス(２−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−四酢酸(ＥＧＴＡ)が挙げられる。
【００１６】
ＡＤＰ−ＥＤＴＡ相互作用からＥＤＴＡの競合的置換が、４５０〜５００ｎｍの範囲における増加した蛍光を消滅させることを示す実験が実施された。図５に示されるように、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋が反応混合液に加えられるときには、５００ｎｍにおける蛍光の減少があり、このことは金属がＡＤＰおよびＥＤＴＡの相互作用を崩壊させることを示唆している。同じく、図６に示されるように、反応混合液に加えられる過剰のＡＴＰは、ＡＤＰ−ＥＤＴＡ相互作用を減衰させている。この結果は、ＡＴＰがＥＤＴＡとも直接に相互作用し得ること、しかし相互作用がこれらの条件下では蛍光の増加を引き起こしていないことを示唆している。
【００１７】
適当な分光測定技法には、蛍光分光測定、紫外／赤外吸収・透過分光測定、発光分光測定、ラマン分光測定、および燐光分光測定が含まれる。最も好ましいのは蛍光分光測定である。適当な蛍光分光測定技法は、試料の、例えば、キセノンランプでの励起、検出感度を増加するために蛍光寿命を用いるレーザー誘起蛍光、望まれる信号を増強しそしてバックグラウンドノイズを低下させて、感度を改良する蛍光分極、および時間分解蛍光を含んでいる。
【００１８】
必要に応じて、ランタニド（複数を含む）のような金属（複数を含む）が、ヌクレオチド−キレート剤相互作用の、分光測定特性、特に蛍光分光測定特性を変化させるために使用することができる。三次複合体が特定の有機分子、キレート剤、およびランタニドの間に形成されることが知られている［Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９０， １４：１１４９， Ａｎａｌ． Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． Ｃｈｅｍ． １９９２， ６４： ３４２（出典明示により本明細書の一部とする）］。これらの三次複合体の形成時には、強化された蛍光信号が観察された。これまでに、分光信号が強化された、そのような複合体は、ヌクレオシド類またはヌクレオチド類およびキレート剤ならびにランタニド類との間では観察されていなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下の実験的実施例は、本発明の使用を例示している。
実験
実験の詳細
分光蛍光計
蛍光信号により作成されるピークは典型的には幅広くて、励起および／または発光の波長を正確に選択する能力は、使用する機器および蛍光検出システム、または読取り装置の検定に大きく依存している。本明細書において説明される実験のためには、単一のウエル読取り装置を持つＳｐｅｘ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ分光蛍光計（認識番号２０９３、Ｓｐｅｘ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）が０．１ｎｍの通過帯域をもって使用された。或る場合には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎプレート読取り装置（認識番号ＦＸ ０１０９０、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用したが、それは１０ｎｍの通過帯域を有していて、それ故にＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ走査装置のように正確には蛍光信号を検出できない。
【００２０】
試薬
以下の試薬が、本明細書において記載された実験で使用された。
ＡＤＰ（Ａ−２７５４ Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ、ロット番号０７３ｋ７００７、アデノシン５'−二リン酸ナトリウム塩）；
ＡＴＰ（Ａ−７６９９ Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ、ロット番号０５３ｋ７０４２、アデノシン５'−三リン酸二ナトリウム塩）；
ＥＧＴＡ（Ｅ０３９６ Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸）；
ＥＤＴＡ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｅ２−６２８−２、エチレンジアミン四酢酸）；
ＨＥＰＥＳ（Ｊ８４８、ＡＭＲＥＳＣＯ、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）；
ＣａＣｌ２（Ｃ−４９０１、Ｓｉｇｍａ、脱水塩化カルシウム）；および
ＭｇＣｌ２（Ｍ８２６６、Ｓｉｇｍａ、無水塩化マグネシウム）
【００２１】
略語
ｒｆｕ＝相対蛍光単位
【００２２】
実験１：４５０〜５５０ｎｍの範囲におけるＡＴＰおよびＡＤＰの蛍光スペクトルでの相違
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中の５ｍＭのＡＤＰまたはＡＴＰのいずれかを含有する溶液を、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置を用いて４００〜６００ｎｍの範囲内で蛍光発光について分析した。この実験のために使用された励起波長は４０５ｎｍであった。この実験によれば、約５００ｎｍにおいて測定されたＡＤＰおよびＡＴＰの間には弱い蛍光発光の相違があることが示されている。
【００２３】
実験２：ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの、ＡＴＰと比較したＡＤＰとの選択的相互作用
５０ｍＭのＥＤＴＡの存在下もしくは不在下において、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中の１０ｍＭのＡＤＰまたは１０ｍＭのＡＴＰを含有する溶液について、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘを用いて蛍光走査を実施した。図２に示されるように、ＡＤＰを含有する溶液の蛍光スペクトルは、ＥＤＴＡの存在下において大きく強化されている。これとは対照的に、ＡＴＰはＥＤＴＡの存在下において蛍光の増加を示していない。同様に、図３に示されるように、ＥＧＴＡの存在下においてＡＤＰ蛍光の増加があるが、これはＡＴＰ蛍光には見られない。４７５ｎｍで見られるピークは、バックグラウンドスペクトルの部分である。
【００２４】
実験３：ＥＤＴＡの存在下におけるＡＤＰ滴定
５０ｍＭのＥＤＴＡの溶液を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中、ＡＤＰで滴定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎプレート読取り装置で５００ｎｍにおける蛍光を読み取った。図４に示されるように、ＥＤＴＡ溶液のＡＤＰでの滴定の結果得られるデータの点は、二ログ単位にわたり直線となる。１００μＭの濃度以下のＡＤＰは、使用された手法の検出限界を超えていた。
【００２５】
実験４：ＡＤＰおよびＥＤＴＡを含有する溶液へのＣａ２＋およびＭｇ２＋の添加
この実験では、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中に１ｍＭのＡＤＰおよび３０ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液へのＣａ２＋およびＭｇ２＋の添加の効果を検査した。図５に示されるように、ＥＤＴＡの存在下においてＡＤＰにより作成される蛍光発光信号は、３０ｍＭのＭｇ２＋またはＣａ２＋の添加により逆転することが判明し、このことはＭｇ２＋およびＣａ２＋がＡＤＰのＥＤＴＡとの相互作用と競合することを示している。蛍光は５００ｎｍにおいて監視された。
【００２６】
実験５：ＡＤＰおよびＥＤＴＡを含有する溶液のＡＴＰでの滴定
ＡＴＰはＥＤＴＡの存在下において蛍光発光するようには見えないが、ＡＤＰは蛍光発光するので、ＥＤＴＡ−ＡＤＰで誘発される蛍光に対するＡＴＰの存在の効果を検査した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液２００μｌ中に５ｍＭのＡＤＰおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液に、増加する濃度のＡＴＰを加えた。４１０ｎｍの励起波長を用いて５００ｎｍにおいて、蛍光を読み取った。試料をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレート読取り装置の上で読み取った。図６に示されるように、１０ｍＭのＡＴＰは、ＡＤＰおよびＥＤＴＡの間の相互作用を完全に壊している。この観察により、ＡＴＰがＥＤＴＡと直接に相互作用することができることを示唆している；しかしながら、ＡＴＰは、これらの条件下では蛍光の増加を引き起こさない。
【００２７】
実験６：ＥＤＴＡで滴定されるＡＤＰの溶液
この実験では、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中、種々の濃度におけるＡＤＰおよびＡＴＰの一連の溶液を５０ｍＭのＥＤＴＡで処理した。ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡを対照として使用した。図７は、対照の蛍光読取りをそれぞれのデータ点から差し引いたデータを示している。
【００２８】
これらの実験は、ＡＤＰ−キレート剤の検出の感度が蛍光分光法では、約１μＭであることを証明している。
【００２９】
実験７：ヌクレオチドの蛍光に対するＥＤＴＡの効果
ＡＴＰ、ＡＤＰ、グアニジン二リン酸（ＧＤＰ）、およびグアニジン三リン酸（ＧＴＰ）の各５ｍＭ溶液の蛍光スペクトルを、５０ｍＭのＥＤＴＡの不在下および存在下において測定した。蛍光発光信号を４５０〜６００ｎｍの間で解析した。図８に示されるように、ＥＤＴＡの存在下におけるＡＤＰのみが、強化された蛍光を示しており、４９０〜５００ｎｍの間で蛍光のピークを有する。
【００３０】
実験８：キレート剤の存在下においてヌクレオチドにより作成された蛍光信号を変更するためのランタニドの使用
ランタニド金属、キレート剤、およびヌクレオチドの間で形成される三次複合体の使用を確立して、キレート剤の存在下においてヌクレオチドにより作成される蛍光信号を変更するために、以下の実験を行う。
【００３１】
（ｉ）テルビウムの存在下および不在下において、および増加する濃度のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ）の存在下もしくは不在下において、ＥＤＴＡをインキュベートする。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置を使用して、蛍光発光を監視する。
【００３２】
（ｉｉ）ユーロピウムと共に、そして増加する濃度のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ）の存在下もしくは不在下において、ＥＤＴＡをインキュベートする。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置を使用して、蛍光発光を監視する。
【００３３】
（ｉｉｉ）サリチル酸のような有機分子、ＥＤＴＡ、およびユーロピウムの間で複合体を形成させて、蛍光を増大させる。増加する濃度のヌクレオチドの添加による効果を、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置の使用により監視する。
【００３４】
８（ｉ）、８（ｉｉ）、または８（ｉｉｉ）で得られた結果が与えられれば、ＡＤＰ濃度の経時変化を監視するための条件が最適化されるであろう。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様が例示されて説明されてきたが、以下の請求項により定義されるように、本発明の精神および範囲から逸脱すること無しに、種々の変更および修飾を本発明では行うことができることが理解されるであろう。
【００３６】
本発明の組み合わされた要素の種々の実施例が説明されてきたが、これらは網羅的であることを意図するものではなく、一つの実施態様の特徴が別の特徴と組み合わされ、そしてそのような他の組合せは、ここに開示されている本発明の範囲内に包含されるものと理解すべきである。
【００３７】
本明細書において言及された全ての出版物および他の文書は、あたかもそれらの全体の内容が本明細書において複製されたように、引用することにより本願明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、対照として使用されたＨＥＰＥＳと重ね合わせた、ＡＤＰおよびＡＴＰの蛍光スペクトルを示す。
【図２】図２は、対照として使用されたＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡと重ね合わせた、ＥＤＴＡの存在下におけるＡＤＰ（ＡＤＰ−ＥＤＴＡ）およびＥＤＴＡの存在下におけるＡＴＰ（ＡＴＰ−ＥＤＴＡ）の蛍光スペクトルを示す。
【図３】図３は、対照として使用されたＨＥＰＥＳ−ＥＧＴＡと重ね合わせた、ＥＧＴＡの存在下におけるＡＤＰ（ＡＤＰ−ＥＧＴＡ）およびＥＧＴＡの存在下におけるＡＴＰ（ＡＴＰ−ＥＧＴＡ）の蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４は、ＡＤＰでの滴定時の５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液の５００ｎｍにおいて読み取られた、蛍光データの結果を示す。
【図５】図５は、ＥＤＴＡの存在下におけるＣａ２＋およびＭｇ２＋での滴定時のＡＤＰを示す蛍光データの結果を示す。
【図６】図６は、ＥＤＴＡの存在下におけるＡＴＰでの滴定時のＡＤＰを示す蛍光データの結果を表す。
【図７】図７は、５０ｍＭのＥＤＴＡの添加時に異なる濃度の一連のＡＤＰおよびＡＴＰの溶液を示す蛍光データの結果を表す。
【図８】図８は、対照として使用されたＨＥＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡと重ね合わせた、ＥＤＴＡの存在下および不在下における選択されたヌクレオチドの蛍光スペクトルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヌクレオチド検出の分野に関する。特に、本発明は、ヌクレオチドの示差分光検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ二、三年、タンパク質キナーゼは、製薬会社にとって薬物開発のための標的となってきている。製薬工業における全標的の２０％までが、現在はキナーゼであると推定されている。この興味の理由は、キナーゼが基本的な細胞のプロセスにおいて重要な役割を果たしているという事実に関係があるからである。キナーゼ活性の撹乱は、ヒトにおける疾患を引き起こすかもしくは疾患の指標となることができ、そしてキナーゼの分子または受容体を薬物で標的化することにより疾患の進行を変更することができる。
【０００３】
キナーゼは、リン酸基をＡＴＰ(アデノシン三リン酸)から基質へ転移させる酵素(生化学的触媒)である。リン酸基転移の結果として、ＡＴＰは脱リン酸化されてＡＤＰ(アデノシン二リン酸)を形成する。一旦基質がインビボでリン酸化されると、生化学的経路が活性化される。単一のキナーゼは多数の基質を有し、どの基質がリン酸化されているかに依存して、異なる経路が活性化される。従って、基質の選択性は、キナーゼの重要な特性である。キナーゼが行う生化学的反応が以下に示される：
ＡＴＰ＋キナーゼ＋基質 ＋ ＡＤＰ＋キナーゼ＋基質−Ｐ (１)
【０００４】
この反応の要件の一つは、基質が、ＡＴＰの分子からキナーゼ酵素により転移されたリン酸基を受容することができる水酸基を有することである。かくして、ポリペプチドまたはタンパク質に対する基質は、一般的に、チロシン(チロシンキナーゼ)またはセリン／トレオニン(セリン／トレオニンキナーゼ)を受容体アミノ酸として含有する。
【０００５】
臨床現場におけるキナーゼ活性の検出は、人の健康の種々の状態を評価するのに重要な役割を果たしている。クレアチンキナーゼ(ＣＫ)は、例えば、ミオサイトの細胞質の中に高濃度で存在する“漏出”酵素であって、神経筋の疾患の評価のために最も広く使用される酵素である。ＣＫの検出のための現在の方法は、種々の他の酵素の使用を含む多数の工程を伴っている。
【０００６】
薬物の発見および薬物のプロファイリングの目的のためのキナーゼ活性の検出は、製薬工業にとって興味あるチャレンジを提示する。産業界で現在使用されている、多数の酵素での共役検出システムは、興味のある酵素以外の酵素に対する薬物の効果を除外するための対比スクリーニングが必要であるので実用的ではない。例えば、ＣＫ阻害剤を探索する際に、共役酵素であるヘキソキナーゼ(ＨＫ)は、ＨＫがそれ自身のＡＴＰ結合部位を有するので、ＣＫのＡＴＰ結合部位と相互作用する薬物により影響を受ける。
【０００７】
キナーゼの阻害剤を探索する研究者達が、彼らの薬物発見プログラムにおいて伝統的に使用してきている一つのアプローチは、キナーゼ活性を監視する手段として基質のリン酸化を検出することである。厄介な問題は、全てのキナーゼに対する基質が様々であり、単一のキナーゼが同一の基質内においてさえ多数のリン酸化部位を有し得ることである。どのような場合にも、アッセイの開発は、アッセイのための最適条件を見出すために為されるべきであって、これは非常に時間を浪費するものである。基質のリン酸化を検出するために現在使用されている方法は、リン酸化された基質の検出が特異的な抗体を用いて為されるＥＬＩＳＡに基づくアッセイである。ＥＬＩＳＡに基づくシステムは、高感度を示すが、多くの工程が要求され、典型的なアッセイには何時間もかかり、多くの操作を必要とし、誤差の機会を増大させている。
【０００８】
キナーゼ活性を監視するために現在使用されているもう一つの方法は、アッセイが進行するにつれて、ＡＴＰの減少の検出および定量化をすることである。この方法は、蓄積されると、キナーゼ活性を阻害する生成物−この場合にはＡＤＰ−の生産により制限されている。そのような方法論の応用が、広範なアッセイの開発を必要としている。
【０００９】
キナーゼアッセイの進行を監視するために伝統的に使用されている検出システムは、蛍光分光測定、蛍光偏光（Ｐａｎｖｅｒａ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）、時間分解蛍光（Ｃｉｓ−Ｂｉｏ）、吸光度分光測定（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｕｐｓｔａｔｅ）、発光分光測定（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような分光技法、およびシンチレーション（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはクロマトグラフィー（Ｃａｌｉｐｅｒ）のような非分光技法を利用している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者等は、アッセイでのヌクレオチド(複数を含む)の検出のための技術を開発してきた。そのような技術は、例えば、キナーゼアッセイにおけるキナーゼ活性のような、アッセイにおける生化学的活性を監視する手段として使うことができる。それは、二リン酸化ヌクレオシドの濃度が経時的に変化する、任意の活性を研究する機構を提供する分光検出システムである。このような分光検出システムを使用して、例えば、使用される基質と無関係に、二リン酸化ヌクレオシドまたは三リン酸化ヌクレオシドのモノリン酸化ヌクレオシドまたは二リン酸化ヌクレオシドへのそれぞれの変換、またはその逆の変換を監視することができる。具体的な二リン酸化ヌクレオシドはＡＤＰであって、具体的な三リン酸化ヌクレオシドはＡＴＰである。現在使用されている検出方法の替わりに、この技術を使用して、現在では利用可能な検出方法が全く無い基質に対するキナーゼ標的(複数を含む)をスクリーニングすることができる。臨床または他の状況において、この方法論を使用することにより、ＡＴＰを利用し、ＡＤＰを産生させる酵素の活性を検出および／または監視をすることができた。
【００１１】
ＡＴＰおよびＡＤＰは、どのようなキナーゼ反応においても常に存在する。かくして、ＡＴＰの消費および／またはＡＤＰの生産を監視することを基本とするシステムは、基質とは無関係に、任意のキナーゼ反応の監視をすることができる。ＡＤＰは反応が開始する前の反応液中には存在しないので、ＡＤＰ産生の監視はキナーゼの活性を監視する有効な方法となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、キレート剤の添加により増強され得るＡＴＰおよびＡＤＰの分光スペクトルに相違があることを明確にした。更に具体的には、特定の状況下では、図１で立証されているように、ＡＤＰおよびＡＴＰの分子の螢光スペクトルにおいて、約４５０〜５５０ｎｍにおける蛍光発光には可なり一貫した相違がある。本発明者等はこれに加えて、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート剤の存在下において、図２に示されるように、ＡＴＰ蛍光が対応して増加することなく、ＡＤＰ蛍光が４５０〜５５０ｎｍの範囲において相当に増加することを測定した。同様に、図３に示されるように、キレート剤のエチレングリコール−ビス(２−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ−四酢酸(ＥＧＴＡ)の存在下において、ＡＴＰ蛍光の増加を伴うことなく、ＡＤＰ蛍光は大きく増加する。
【００１３】
図４は、５００ｎｍにおける蛍光の強度が、ＥＤＴＡの溶液に加えられたＡＤＰの量に比例することを示している。
【００１４】
本明細書において使用されるように、用語“キレート剤”とは、共役的にまたは非共役的に、金属に配位することができる少なくとも一つの官能基を有する任意の分子を指す。キレート剤は多座配位であるか、または単座配位様式で配位し得る。キレート剤は、ポルフィリンのような大環状であってもよい。キレート剤は、パイ電子を供与するか、または共有することにより金属と配位することができる。分光検出を増加するようにさらに誘導体化されたキレート剤も含まれる。キレート剤の官能基は、マイナスもしくはプラスに荷電されているか、または中性であってもよい。適当な官能基の例としては、カルボキシラト、チオラト、ヒドリド、シアノ、カルボナト、チオカルカメート、チオカルボキシラト、チオホスフィナトアミノ、ホホロ、ヒドラジノ、ニトリロ、ヒドラジド、オキシム、およびチオエーテルが挙げられる。
【００１５】
キレート剤の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、エチレン、およびエチレングリコール−ビス(２−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−四酢酸(ＥＧＴＡ)が挙げられる。
【００１６】
ＡＤＰ−ＥＤＴＡ相互作用からＥＤＴＡの競合的置換が、４５０〜５００ｎｍの範囲における増加した蛍光を消滅させることを示す実験が実施された。図５に示されるように、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋が反応混合液に加えられるときには、５００ｎｍにおける蛍光の減少があり、このことは金属がＡＤＰおよびＥＤＴＡの相互作用を崩壊させることを示唆している。同じく、図６に示されるように、反応混合液に加えられる過剰のＡＴＰは、ＡＤＰ−ＥＤＴＡ相互作用を減衰させている。この結果は、ＡＴＰがＥＤＴＡとも直接に相互作用し得ること、しかし相互作用がこれらの条件下では蛍光の増加を引き起こしていないことを示唆している。
【００１７】
適当な分光測定技法には、蛍光分光測定、紫外／赤外吸収・透過分光測定、発光分光測定、ラマン分光測定、および燐光分光測定が含まれる。最も好ましいのは蛍光分光測定である。適当な蛍光分光測定技法は、試料の、例えば、キセノンランプでの励起、検出感度を増加するために蛍光寿命を用いるレーザー誘起蛍光、望まれる信号を増強しそしてバックグラウンドノイズを低下させて、感度を改良する蛍光分極、および時間分解蛍光を含んでいる。
【００１８】
必要に応じて、ランタニド（複数を含む）のような金属（複数を含む）が、ヌクレオチド−キレート剤相互作用の、分光測定特性、特に蛍光分光測定特性を変化させるために使用することができる。三次複合体が特定の有機分子、キレート剤、およびランタニドの間に形成されることが知られている［Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９０， １４：１１４９， Ａｎａｌ． Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． Ｃｈｅｍ． １９９２， ６４： ３４２（出典明示により本明細書の一部とする）］。これらの三次複合体の形成時には、強化された蛍光信号が観察された。これまでに、分光信号が強化された、そのような複合体は、ヌクレオシド類またはヌクレオチド類およびキレート剤ならびにランタニド類との間では観察されていなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下の実験的実施例は、本発明の使用を例示している。
実験
実験の詳細
分光蛍光計
蛍光信号により作成されるピークは典型的には幅広くて、励起および／または発光の波長を正確に選択する能力は、使用する機器および蛍光検出システム、または読取り装置の検定に大きく依存している。本明細書において説明される実験のためには、単一のウエル読取り装置を持つＳｐｅｘ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ分光蛍光計（認識番号２０９３、Ｓｐｅｘ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）が０．１ｎｍの通過帯域をもって使用された。或る場合には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎプレート読取り装置（認識番号ＦＸ ０１０９０、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用したが、それは１０ｎｍの通過帯域を有していて、それ故にＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ走査装置のように正確には蛍光信号を検出できない。
【００２０】
試薬
以下の試薬が、本明細書において記載された実験で使用された。
ＡＤＰ（Ａ−２７５４ Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ、ロット番号０７３ｋ７００７、アデノシン５'−二リン酸ナトリウム塩）；
ＡＴＰ（Ａ−７６９９ Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ、ロット番号０５３ｋ７０４２、アデノシン５'−三リン酸二ナトリウム塩）；
ＥＧＴＡ（Ｅ０３９６ Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸）；
ＥＤＴＡ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｅ２−６２８−２、エチレンジアミン四酢酸）；
ＨＥＰＥＳ（Ｊ８４８、ＡＭＲＥＳＣＯ、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）；
ＣａＣｌ２（Ｃ−４９０１、Ｓｉｇｍａ、脱水塩化カルシウム）；および
ＭｇＣｌ２（Ｍ８２６６、Ｓｉｇｍａ、無水塩化マグネシウム）
【００２１】
略語
ｒｆｕ＝相対蛍光単位
【００２２】
実験１：４５０〜５５０ｎｍの範囲におけるＡＴＰおよびＡＤＰの蛍光スペクトルでの相違
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中の５ｍＭのＡＤＰまたはＡＴＰのいずれかを含有する溶液を、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置を用いて４００〜６００ｎｍの範囲内で蛍光発光について分析した。この実験のために使用された励起波長は４０５ｎｍであった。この実験によれば、約５００ｎｍにおいて測定されたＡＤＰおよびＡＴＰの間には弱い蛍光発光の相違があることが示されている。
【００２３】
実験２：ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの、ＡＴＰと比較したＡＤＰとの選択的相互作用
５０ｍＭのＥＤＴＡの存在下もしくは不在下において、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中の１０ｍＭのＡＤＰまたは１０ｍＭのＡＴＰを含有する溶液について、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘを用いて蛍光走査を実施した。図２に示されるように、ＡＤＰを含有する溶液の蛍光スペクトルは、ＥＤＴＡの存在下において大きく強化されている。これとは対照的に、ＡＴＰはＥＤＴＡの存在下において蛍光の増加を示していない。同様に、図３に示されるように、ＥＧＴＡの存在下においてＡＤＰ蛍光の増加があるが、これはＡＴＰ蛍光には見られない。４７５ｎｍで見られるピークは、バックグラウンドスペクトルの部分である。
【００２４】
実験３：ＥＤＴＡの存在下におけるＡＤＰ滴定
５０ｍＭのＥＤＴＡの溶液を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中、ＡＤＰで滴定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎプレート読取り装置で５００ｎｍにおける蛍光を読み取った。図４に示されるように、ＥＤＴＡ溶液のＡＤＰでの滴定の結果得られるデータの点は、二ログ単位にわたり直線となる。１００μＭの濃度以下のＡＤＰは、使用された手法の検出限界を超えていた。
【００２５】
実験４：ＡＤＰおよびＥＤＴＡを含有する溶液へのＣａ２＋およびＭｇ２＋の添加
この実験では、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中に１ｍＭのＡＤＰおよび３０ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液へのＣａ２＋およびＭｇ２＋の添加の効果を検査した。図５に示されるように、ＥＤＴＡの存在下においてＡＤＰにより作成される蛍光発光信号は、３０ｍＭのＭｇ２＋またはＣａ２＋の添加により逆転することが判明し、このことはＭｇ２＋およびＣａ２＋がＡＤＰのＥＤＴＡとの相互作用と競合することを示している。蛍光は５００ｎｍにおいて監視された。
【００２６】
実験５：ＡＤＰおよびＥＤＴＡを含有する溶液のＡＴＰでの滴定
ＡＴＰはＥＤＴＡの存在下において蛍光発光するようには見えないが、ＡＤＰは蛍光発光するので、ＥＤＴＡ−ＡＤＰで誘発される蛍光に対するＡＴＰの存在の効果を検査した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液２００μｌ中に５ｍＭのＡＤＰおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液に、増加する濃度のＡＴＰを加えた。４１０ｎｍの励起波長を用いて５００ｎｍにおいて、蛍光を読み取った。試料をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレート読取り装置の上で読み取った。図６に示されるように、１０ｍＭのＡＴＰは、ＡＤＰおよびＥＤＴＡの間の相互作用を完全に壊している。この観察により、ＡＴＰがＥＤＴＡと直接に相互作用することができることを示唆している；しかしながら、ＡＴＰは、これらの条件下では蛍光の増加を引き起こさない。
【００２７】
実験６：ＥＤＴＡで滴定されるＡＤＰの溶液
この実験では、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０緩衝液中、種々の濃度におけるＡＤＰおよびＡＴＰの一連の溶液を５０ｍＭのＥＤＴＡで処理した。ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡを対照として使用した。図７は、対照の蛍光読取りをそれぞれのデータ点から差し引いたデータを示している。
【００２８】
これらの実験は、ＡＤＰ−キレート剤の検出の感度が蛍光分光法では、約１μＭであることを証明している。
【００２９】
実験７：ヌクレオチドの蛍光に対するＥＤＴＡの効果
ＡＴＰ、ＡＤＰ、グアニジン二リン酸（ＧＤＰ）、およびグアニジン三リン酸（ＧＴＰ）の各５ｍＭ溶液の蛍光スペクトルを、５０ｍＭのＥＤＴＡの不在下および存在下において測定した。蛍光発光信号を４５０〜６００ｎｍの間で解析した。図８に示されるように、ＥＤＴＡの存在下におけるＡＤＰのみが、強化された蛍光を示しており、４９０〜５００ｎｍの間で蛍光のピークを有する。
【００３０】
実験８：キレート剤の存在下においてヌクレオチドにより作成された蛍光信号を変更するためのランタニドの使用
ランタニド金属、キレート剤、およびヌクレオチドの間で形成される三次複合体の使用を確立して、キレート剤の存在下においてヌクレオチドにより作成される蛍光信号を変更するために、以下の実験を行う。
【００３１】
（ｉ）テルビウムの存在下および不在下において、および増加する濃度のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ）の存在下もしくは不在下において、ＥＤＴＡをインキュベートする。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置を使用して、蛍光発光を監視する。
【００３２】
（ｉｉ）ユーロピウムと共に、そして増加する濃度のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ）の存在下もしくは不在下において、ＥＤＴＡをインキュベートする。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置を使用して、蛍光発光を監視する。
【００３３】
（ｉｉｉ）サリチル酸のような有機分子、ＥＤＴＡ、およびユーロピウムの間で複合体を形成させて、蛍光を増大させる。増加する濃度のヌクレオチドの添加による効果を、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光走査装置の使用により監視する。
【００３４】
８（ｉ）、８（ｉｉ）、または８（ｉｉｉ）で得られた結果が与えられれば、ＡＤＰ濃度の経時変化を監視するための条件が最適化されるであろう。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様が例示されて説明されてきたが、以下の請求項により定義されるように、本発明の精神および範囲から逸脱すること無しに、種々の変更および修飾を本発明では行うことができることが理解されるであろう。
【００３６】
本発明の組み合わされた要素の種々の実施例が説明されてきたが、これらは網羅的であることを意図するものではなく、一つの実施態様の特徴が別の特徴と組み合わされ、そしてそのような他の組合せは、ここに開示されている本発明の範囲内に包含されるものと理解すべきである。
【００３７】
本明細書において言及された全ての出版物および他の文書は、あたかもそれらの全体の内容が本明細書において複製されたように、引用することにより本願明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、対照として使用されたＨＥＰＥＳと重ね合わせた、ＡＤＰおよびＡＴＰの蛍光スペクトルを示す。
【図２】図２は、対照として使用されたＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡと重ね合わせた、ＥＤＴＡの存在下におけるＡＤＰ（ＡＤＰ−ＥＤＴＡ）およびＥＤＴＡの存在下におけるＡＴＰ（ＡＴＰ−ＥＤＴＡ）の蛍光スペクトルを示す。
【図３】図３は、対照として使用されたＨＥＰＥＳ−ＥＧＴＡと重ね合わせた、ＥＧＴＡの存在下におけるＡＤＰ（ＡＤＰ−ＥＧＴＡ）およびＥＧＴＡの存在下におけるＡＴＰ（ＡＴＰ−ＥＧＴＡ）の蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４は、ＡＤＰでの滴定時の５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液の５００ｎｍにおいて読み取られた、蛍光データの結果を示す。
【図５】図５は、ＥＤＴＡの存在下におけるＣａ２＋およびＭｇ２＋での滴定時のＡＤＰを示す蛍光データの結果を示す。
【図６】図６は、ＥＤＴＡの存在下におけるＡＴＰでの滴定時のＡＤＰを示す蛍光データの結果を表す。
【図７】図７は、５０ｍＭのＥＤＴＡの添加時に異なる濃度の一連のＡＤＰおよびＡＴＰの溶液を示す蛍光データの結果を表す。
【図８】図８は、対照として使用されたＨＥＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡと重ね合わせた、ＥＤＴＡの存在下および不在下における選択されたヌクレオチドの蛍光スペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)溶液にキレート剤を加える工程、および(ｂ)キレート剤の添加時に作成されるか、または変更される信号を分光検出システムを用いて検出する工程を含んで成る、溶液中のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項２】
ヌクレオチドがアデノシン二リン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分光検出システムが蛍光に基づくシステムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
キレート剤がポリカルボキシレート分子である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
(ａ)溶液にキレート剤を加える工程、および(ｂ)キレート剤の添加時に作成されるか、または変更される信号を分光検出システムを用いて検出する工程を含んで成る、少なくとも二つのヌクレオチドの混合物の溶液中における一つのヌクレオチドを示差的に検出する方法。
【請求項７】
ヌクレオチドがアデノシン二リン酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アデノシン三リン酸が溶液中にある、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
キレート剤がポリカルボキシレート分子である、請求項６、７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはそれらの組合せである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
信号がアデノシン二リン酸およびＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡまたはそれらの組合せの相互作用の結果である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
分光検出システムが、蛍光に基づくシステムである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
信号が蛍光に基づく信号である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光に基づく信号が、４５０および５５０ｎｍの間で発生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１またはそれ以上のキレート剤を溶液に加える前のアデノシン二リン酸の蛍光に基づく信号と比較して、信号の強度が増加する、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
キレート剤の添加後に信号の強度が増加する、請求項１または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
キレート剤の添加後に信号のピーク強度が移動する、請求項１または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
キレート剤の添加後に信号の強度が減少する、請求項１または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
(ａ)適当な量のキレート剤、および(ｂ)請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法のいずれかを実施するための指示書を含むキット。
【請求項２０】
工程(ｂ)に先立って、溶液へのランタニドの添加をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ランタニドがテルビウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ランタニドがユーロピウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
(ａ)適当な量のキレート剤、(ｂ)適当な量の少なくとも一つのランタニド、および(ｃ)請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書を含むキット。
【請求項１】
(ａ)溶液にキレート剤を加える工程、および(ｂ)キレート剤の添加時に作成されるか、または変更される信号を分光検出システムを用いて検出する工程を含んで成る、溶液中のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項２】
ヌクレオチドがアデノシン二リン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分光検出システムが蛍光に基づくシステムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
キレート剤がポリカルボキシレート分子である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
(ａ)溶液にキレート剤を加える工程、および(ｂ)キレート剤の添加時に作成されるか、または変更される信号を分光検出システムを用いて検出する工程を含んで成る、少なくとも二つのヌクレオチドの混合物の溶液中における一つのヌクレオチドを示差的に検出する方法。
【請求項７】
ヌクレオチドがアデノシン二リン酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アデノシン三リン酸が溶液中にある、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
キレート剤がポリカルボキシレート分子である、請求項６、７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはそれらの組合せである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
信号がアデノシン二リン酸およびＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡまたはそれらの組合せの相互作用の結果である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
分光検出システムが、蛍光に基づくシステムである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
信号が蛍光に基づく信号である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光に基づく信号が、４５０および５５０ｎｍの間で発生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１またはそれ以上のキレート剤を溶液に加える前のアデノシン二リン酸の蛍光に基づく信号と比較して、信号の強度が増加する、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
キレート剤の添加後に信号の強度が増加する、請求項１または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
キレート剤の添加後に信号のピーク強度が移動する、請求項１または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
キレート剤の添加後に信号の強度が減少する、請求項１または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
(ａ)適当な量のキレート剤、および(ｂ)請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法のいずれかを実施するための指示書を含むキット。
【請求項２０】
工程(ｂ)に先立って、溶液へのランタニドの添加をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ランタニドがテルビウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ランタニドがユーロピウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
(ａ)適当な量のキレート剤、(ｂ)適当な量の少なくとも一つのランタニド、および(ｃ)請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書を含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５１８０９４（Ｐ２００７−５１８０９４Ａ）
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４８４７７（Ｐ２００６−５４８４７７）
【出願日】平成１７年１月１７日（２００５．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６９７２５
【国際公開日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０６２４０５４０）エムディエス・ファーマ・サーヴィシーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１７日（２００５．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６９７２５
【国際公開日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０６２４０５４０）エムディエス・ファーマ・サーヴィシーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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