蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置
【課題】蛍光色素毎に単染色サンプルを準備しなくても、各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができる蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置を提供する。
【解決手段】蛍光スペクトル測定装置１の検出部２において測定された複数の蛍光色素で標識された微小粒子の蛍光スペクトルを、解析部３において、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する際、参照スペクトルとして、記憶部３に記憶されているスペクトルデータのうち、単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用する。
【解決手段】蛍光スペクトル測定装置１の検出部２において測定された複数の蛍光色素で標識された微小粒子の蛍光スペクトルを、解析部３において、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する際、参照スペクトルとして、記憶部３に記憶されているスペクトルデータのうち、単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置に関する。より詳しくは、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、色素毎に分離するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を分析する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザー光（励起光）を照射して、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することにより、複数の微小粒子を１個ずつ分析する方法である。このフローサイトメトリーでは、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造などを判定することができる。
【０００３】
また、近年、基礎医学及び臨床分野において、網羅的解釈を進めるために、多くの分子プローブを同時に使用することが多くなってきており、これにより、生物学的な知見が飛躍的に蓄積し、生命現象の理解が進んでいる。このため、フローサイトメトリーにおいても、複数の蛍光色素を使用したマルチカラー分析が普及してきている（例えば、特許文献１，２参照。）。
【０００４】
一方、マルチカラー分析のように一度の測定で複数の蛍光色素を使用すると、蛍光色素に対応する数の高感度検出器が必要となる。また、それぞれの検出器に目的以外の蛍光色素からの光が漏れ込み、分析精度が低下する。そこで、従来のフローサイトメーターでは、目的の蛍光色素から、目的の光情報のみを取り出すため、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化する際に、数学的な補正、即ち、蛍光補正を行っている。
【０００５】
しかしながら、蛍光補正の多くは、目的以外の検出器にて検出した光を測定者の目で判別しているため、ヒューマンエラーが生じる原因となり、不正確になりがちである。このため、測定者には、細胞や蛍光色素、抗体などの知識のみならず、装置の理解とトレーニングが不可欠であり、高度な専門性が求められる。
【０００６】
また、従来、使用する蛍光標識の発光スペクトルを、予めコンピュータに登録しておき、そのデータを利用して測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解し、各蛍光標識の存在割合を決定するスペクトラルデコンボリューション法が提案されている（特許文献３参照）。更に、赤外分光法などの分光吸光測定においては、従来から、標準スペクトルや参照スペクトルに基づいて、測定したスペクトルの補正や解析を行っている（例えば、特許文献４，５参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２３０３３３号公報
【特許文献２】特表２００８−５００５５８号公報
【特許文献３】特開２００５−１８１２７６号公報
【特許文献４】特開２００５−１９５５８６号公報
【特許文献５】特開２００９−１６２６６７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の多数の高感度検出器を備える微小粒子分析装置は、目的とする蛍光色素分の高感度検出器を準備する必要があるばかりでなく、目的以外の検出器への蛍光の漏れ込みが大きな問題となっている。特に、スペクトルが近接している蛍光色素の場合、検出器への漏れ込みのために、蛍光補正ができないことが散見される。
【００１０】
このため、多数の高感度検出器を配しても、従来型の微小粒子分析装置においては、同時に検出可能な蛍光色素の数に限界がある。そこで、例えばスペクトル型フローサイトメーターのように、高感度検出器を多数配置しなくても、漏れ込みを気にせず使用することが可能な次世代のフローサイトメーターが求められている。
【００１１】
更に、前述したように、蛍光色素はそれぞれ特有のスペクトルを持っており、そのスペクトル情報は、蛍光色素自身の特徴を表すものとして重要なデータとなるが、各スペクトルのオーバーラップを正確に見積もり、精度良く蛍光補正するためには、単染色サンプルのデータが必要となる。
【００１２】
このため、作業者は各蛍光色素の単染色サンプルを調製しなければならず、この作業は、使用する色素の数が増えるに従い増加するため、作業者の負担が増すと共に、作業効率も低下する。また、蛍光補正すべき作業数は、用いる蛍光色素の数のおよそ２乗に比例するため、測定者にとっても煩雑である。更に、現実的な問題として、採取できる血液などの検体の容量も有限であるため、蛍光色素毎に単染色サンプルを作製することが難しい場合もある。
【００１３】
そこで、本発明は、蛍光色素毎に単染色サンプルを準備しなくても、各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができる蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る蛍光スペクトル補正方法は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する工程を有し、前記参照スペクトルとして、先に測定したスペクトルデータを使用する。
この補正方法では、前記参照スペクトルとして、単染色サンプルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用することができる。
また、前記参照スペクトルには、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類及び前記微小粒子が細胞である場合は細胞の種類のうちいずれかが異なる蛍光スペクトルデータを使用すればよい。
更に、前記微小粒子が細胞である場合、参照スペクトルには、細胞を使用して測定された蛍光スペクトルデータを使用することが望ましい。
【００１５】
本発明に係る蛍光スペクトル測定装置は、微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出する検出部と、該検出部で検出されたデータを、色素毎の蛍光スペクトルに分離する解析部と、該解析部で分離された蛍光スペクトルデータを記憶する記憶部と、を有し、前記解析部は、前記記憶部に記憶されている先に測定した蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用して、蛍光スペクトルの分離を行う。
この装置では、前記検出部に多チャンネル光電子倍増管が設けられていてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、参照スペクトルとして、先に測定した蛍光スペクトルデータを使用するため、単染色サンプルが不要であり、かつ各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができ、単染色サンプルも不要となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る蛍光スペクトル測定装置の構成を示すブロック図である。
【図２】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＦＩＴＣ：ＣＤ１４）。
【図３】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＰＥ：ＣＤ３）。
【図４】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ ＢｅａｄｓのうちＦＩＴＣに相当するスペクトル）。
【図５】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ ＢｅａｄｓのうちＰＥに相当するスペクトル）。
【図６】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、検出器の電位と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。
【図７】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＦＩＴＣ：ＣＤ４５ｖｓＦＩＴＣ：ＣＤ４５ＲＡ）。
【図８】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＰＥ：ＣＤ８ｖｓＰＥ：ＣＤ３）。
【図９】横軸を蛍光色素ＦＩＴＣ、抗体ＣＤ４５のデータ、縦軸を蛍光色素ＰＥ、抗体ＣＤ８のデータとしたときの精度管理用血液細胞の密度プロットである。
【図１０】横軸を蛍光色素ＦＩＴＣ、抗体ＣＤ４５ＲＡのデータ、縦軸を蛍光色素ＰＥ、抗体ＣＤ３のデータとしたときの解析結果である。
【図１１】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。
【図１２】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。
【図１３】横軸をＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズのデータ、縦軸をＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズのデータとしたときの解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
（単染色サンプルを使用せずに蛍光スペクトルを補正する方法の例）
２．第２の実施の形態
（単染色サンプルを使用しない蛍光スペクトル測定装置の例）
【００１９】
＜１．第１の実施の形態＞
［補正方法］
先ず、本発明の第１の実施形態に係る蛍光スペクトル補正方法（以下、単に補正方法ともいう。）について説明する。本実施形態の補正方法では、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、色素毎に分離する際の参照スペクトルとして、先に測定した蛍光スペクトルを使用する。
【００２０】
ここでいう「微小粒子」には、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。そして、生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
【００２１】
一方、工業用粒子としては、例えば有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【００２２】
本実施形態の補正方法において、参照スペクトルとして使用するスペクトルデータは、測定対象の微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下であることが好ましく、より好ましくは３％以下である。これにより、測定データとのマッチング誤差が少なくなり、精度よく蛍光補正を行うことができる。
【００２３】
具体的には、各色素の参照スペクトルには、例えば、測定日、検出器の電位、レーザー出力、微小粒子の流速、結合している抗体の種類又は微小粒子が細胞の場合はその種類が異なるもののデータ（蛍光スペクトル）を使用することができる。これらの条件は、蛍光スペクトルに大きな影響を与えないため、このようなスペクトルデータを参照スペクトルに使用して補正を行っても、オーバーラップを精度良く解消することができる。
【００２４】
ただし、微小粒子が細胞である場合は、例え同じ蛍光色素で標識されたものであっても、ビーズでの測定結果を参照スペクトルとして使用することはできず、逆の場合も同様である。なお、前述したように、細胞同士であれば、その種類が異なっていても、参照スペクトルとして使用可能である。当然ながら、ビーズ同士であれば、その種類が異なっていても、参照スペクトルとして使用可能である。
【００２５】
本実施形態の補正方法では、参照スペクトルとして、先に測定した測定対象の微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用しているため、測定の度に単染色サンプルを調製する必要がない。これにより、作業者の負担が軽減し、作業効率も向上する。また、ラットなどの小動物のように検体の量が少ない場合でも、正確性を低下させることなく、解析を行うことが可能となる。
【００２６】
なお、本実施形態の蛍光スペクトル補正方法は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルを用いて色素毎に分離する工程を有する補正方法であれば、その前後の工程にかかわらず、適用可能である。
【００２７】
＜２．第２の実施の形態＞
［装置の全体構成］
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光スペクトル測定装置について説明する。図１は本実施形態の蛍光スペクトル測定装置の構成を示すブロック図である。図１に示すように、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１は、少なくとも、検出部２と、記憶部３と、解析部４とを備え、前述した第１の実施形態の補正方法を行う。なお、図１に示す蛍光スペクトル測定装置１には、更に、送液部が設けられていてもよい。
【００２８】
［検出部２の構成］
検出部２は、分析対象の微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出可能な構成であればよい。具体的には、波長領域毎にその波長領域を検出可能な独立したセンサを複数配置した構成や、多チャンネル光電子倍増管（Photo-Multiplier Tube：ＰＭＴ）などのように複数の光を同時に検出可能な１又は複数の検出器を備えた構成とすることができる。この検出部２で検出する波長領域の数、即ち、検出部２に配設される検出器のチャンネル数又はセンサ数などは、使用する色素の数以上であればよい。
【００２９】
また、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１では、検出部２に分光器を設け、微小粒子から発せられた蛍光が、この分光器で分光された後、多チャンネルＰＭＴなどの検出器に入射する構成としてもよい。更に、検出部２には、必要に応じて、対物レンズ、集光レンズ、ピンホール、バンドカットフィルター、ダイクロックミラーなどを設けることもできる。
【００３０】
［解析部３の構成］
解析部３では、電子計算機などを用いて、検出部２で検出した各波長領域の光を、定量化し、波長領域毎の総蛍光量（強度）を求める。また、必要に応じて、参照スペクトルを使用した蛍光スペクトル補正を行う。そして、その結果（蛍光スペクトルデータ）は、記憶部４に保存される。
【００３１】
［記憶部４の構成］
記憶部４は、解析部３で処理された蛍光スペクトルデータを記憶するものである。この記憶部４には、例えば、過去に測定した蛍光スペクトルデータだけでなく、単染色サンプルの蛍光スペクトルデータを保存することもできる。
【００３２】
［蛍光スペクトル測定装置１の動作］
次に、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１の動作について説明する。本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１で分析とする微小粒子は、特に限定されるものではないが、例えば細胞やマイクロビーズなどが挙げられる。また、これら微小粒子を修飾する蛍光色素の種類及び数も、特に限定されるものではなくＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanete：Ｃ２１Ｈ１１ＮＯ５Ｓ）、ＰＥ（phycoerythrin）、ＰｅｒＣＰ（periidinin chlorophyll protein）、ＰＥ−Ｃｙ５及びＰＥ−Ｃｙ７などの公知の色素を、必要に応じて適宜選択して使用することができる。更に、各微小粒子が複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
【００３３】
そして、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１を使用して微小粒子を光学的に分析する際は、先ず、光照射部の光源から励起光を出射し、流路内を通流する微小粒子に照射する。次に、微小粒子から発せられた蛍光を、検出部２で検出する。具体的には、ダイクロックミラーやバンドパスフィルターなどを使用して、微小粒子から発せられた光から特定波長の光（目的とする蛍光）のみを分離し、それを例えば３２チャンネルＰＭＴなどの検出器で検出する。このとき、例えば分光器などを使用して蛍光を分光し、検出器の各チャンネルで異なる波長の光を検出するようにする。これにより、容易に検出光（蛍光）のスペクトラム情報を得ることができる。
【００３４】
その後、検出部２において取得された検出器のチャンネル数分の情報は、例えば変換部（図示せず）でデジタル信号に変換され、更に、解析部３において定量化される。その際、記憶部４に記憶されている過去に測定した蛍光スペクトルデータを、参照スペクトルとして使用して蛍光補正を行う。具体的には、各色素の参照スペクトルには、例えば、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類又は微小粒子が細胞の場合はその種類が異なるものなどのように、微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下の蛍光スペクトルデータを使用する。そして、補正後の蛍光スペクトルデータは、記憶部４に保存する。
【００３５】
本実施形態の蛍光スペクトル測定装置では、参照スペクトルとして、過去に測定した測定対象の微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用しているため、単染色サンプルを使用しなくても、精度良く補正することができる。また、参照スペクトルとなる蛍光スペクトルデータは、記憶部４に逐次蓄積されるため、使用実情に合ったデータベースを構築することができる。
【００３６】
特に、細胞をサンプルとして用いた場合には、しばしば検出器の電位、レーザー出力の変更を余儀なくされることがある。このような場合、従来の装置では、蛍光補正の整合性をとるため、補正を再度やり直す必要があったが、本実施形態の蛍光スペクトル装置では、その必要がない。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例により、本発明の効果について具体的に説明する。本実施例においては、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類又は微小粒子の種類を変えて蛍光スペクトルを比較し、その差を調べた。
【００３８】
本実施例においては、サンプルには、精度管理用細胞として市販されているＩｍｍｕｎｏ−ＴＲＯＬ（ベックマンコールター社製）又はＭｕｌｔｉ−Ｃｈｅｃｋ（ベクトンディッキンソン社製）を用いた。これらは、フローサイトメトリー用の陽性プロセスコントロール（全血コントロール検体）であり、リンパ球、顆粒球、単球に特異的な表面抗原の陽性率と絶対数が検定されているため、全血検体に類似した散乱光、細胞集団の分布、蛍光強度及び抗原密度を示す。また、蛍光色素が標識された抗体は、市販品（ベックマンコールター社製又はベクトンディッキンソン社製）のものを用いた。
【００３９】
一方、サンプルの染色は、定法に従い行った。具体的には、サンプルの温度を室温にした後、目的の蛍光色素がラベルされた抗体を、専用のプラスチックチューブに滴下し、そこに血液を５０μＬ滴下して穏やかに浸透させ、抗体と細胞とを反応させた。そして、２０分間、暗所、室温にて放置した後、溶血剤（ＦＡＣＳ Ｌｙｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：塩化アンモニウム溶液，ベックマンコールター社）を１ｍｌ滴下した。これにより、赤血球が溶血され、目的の細胞である顆粒球、単球及びリンパ球のみとなる。そして、これを遠心分離し、適当な溶液にて洗浄することにより、純度の高いサンプル溶液を得た。
【００４０】
測定は、前述した方法で調整された細胞溶液（サンプル溶液）を、プラスチック製の細胞分析用の特殊な測定セルに導入し、フローサイトメーター用のシース溶液により、３次元にフォーカスした後、励起光を照射した。励起源としては、波長が４８８ｎｍ及び６４０ｎｍのレーザー光を用いた。そして、各細胞から発せられた蛍光を、プリズム分光器などを用いて分光した後、３２ｃｈＰＭＴにより検出した。なお、本実施例では、検出器に３２ｃｈのＰＭＴを用いているが、励起光として２つのレーザー光を用いているため、情報量としては６４ｃｈ分のスペクトルデータが解析部及び記憶部に送られることとなる。
【００４１】
＜日間差について＞
図２（ａ）、図３（ａ）、図４（ａ）、図５（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図２（ｂ）、図３（ｂ）、図４（ｂ）、図５（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図２（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ１４を使用して測定したデータであり、図３（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３を使用して測定したデータである。いずれの日も同一ロットを用いた。
【００４２】
また、図４（ａ），（ｂ）は、ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズの蛍光スペクトルである。更に、図５（ａ），（ｂ）は、ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズの蛍光スペクトルである。なお、検出器はいずれもＰＭＴを使用し、印加電圧は６３０Ｖとした。
【００４３】
図２〜図５に示すように、異なる日に調整し、測定した細胞サンプル又はビーズのスペクトルＡは、スペクトルＢとの誤差が８％以下であり、測定日が異なるスペクトルを参照スペクトルとして使用可能であることが確認された。
【００４４】
＜検出器の電位について＞
図６（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、検出器の電位と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図６（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図６（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３、検出器にＰＭＴを使用して、測定したデータである。なお、印加電圧は、ＰＭＴＶ１５０が５２５Ｖ、ＰＭＴＶ１６０が５６０Ｖ、ＰＭＴＶ１７０が５９５Ｖ、ＰＭＴＶ１８０が６３０Ｖ、ＰＭＴＶ１９０が６６５Ｖ、ＰＭＴＶ２００が７００Ｖである。
【００４５】
図６に示すように、検出器の電位を変えても、スペクトルの誤差は３％以下であった。これにより、検出器の電位が異なる蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用可能であることが確認された。
【００４６】
＜結合している抗体の種類＞
図７（ａ）、図８（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図７（ｂ）、図８（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図７（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、Ａ：蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５、Ｂ：蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５ＲＡを使用して測定したデータである。また、図８（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、Ａ：蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ８、Ｂ：蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３を使用して測定したデータである。なお、検出器はＰＭＴを使用し、印加電圧はいずれも５２５Ｖとした。
【００４７】
そして、蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５を使用したときのデータ、及び蛍光色素にＰＥ，抗体にＣＤ８を使用したときのデータを、別のセットのシングルステインから得た参照スペクトルを用いて解析した。図９はその結果を示す密度プロットである。図９に示すように、シングルステインにより生成された参照スペクトルを用いて解析したところ、３つの細胞集団に分けることができた。また、各集団は、直交する位置にあり、蛍光補正がうまくいったことを示している。更に、ゲートをかけた領域における存在数は、ＦＩＴＣ＋ＰＥ＋：２７８個、ＦＩＣＴ＋ＰＥ−：７５０個であり、その比は、０．３７：１であった。
【００４８】
次に、蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５ＲＡを使用したときのデータ、及び蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３を使用したときのデータで、同様の解析を行った。図１０はその結果を示す密度プロットである。図１０に示すように、蛍光色素にＦＩＴＣ、ＰＥによる２次元展開プロットでは、３つの細胞集団が明瞭に分かれており、それぞれが直交する位置にあった。また、ゲートをかけた分布を比較すると、ＦＩＴＶ＋ＰＥ＋：２８０個、ＰＩＴＣ＋ＰＥ−：７５０個であり、その比は０．３７：１で、図９に示すデータと存在比が一致していた。
【００４９】
以上の結果から、参照スペクトルを用いた独自の蛍光補正方法は、図７，８に示すように、結合している抗体が異なるもの同士でも、蛍光スペクトルの差は８％以下であり、スペクトルを参照スペクトルとして使用可能であることが確認された。
【００５０】
＜微小粒子の種類＞
図１１（ａ）及び図１２（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図１１（ｂ）及び図１２（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。ここで、図１１（ａ），（ｂ）は、Ａ：色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５を使用したときの蛍光スペクトル、Ｂ：ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズを用いたときの蛍光スペクトルである。また、図１２（ａ），（ｂ）は、Ａ：蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ８を使用したときの蛍光スペクトル、Ｂ：ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズを使用したときの蛍光スペクトルである。なお、印加電圧はいずれも６３０Ｖとした。
【００５１】
そして、ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズを使用したときのデータ、及びＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズを使用したときのデータを用いて、別のセットのシングルステインから得た参照スペクトルを用いて解析した。図１３はその結果を示す密度プロットである。図１３に示すように、細胞集団は３つに分かれており、それぞれが直交する位置にあった。また、ゲートをかけた分布を比較すると、ＦＩＴＶ＋ＰＥ＋：２７２個、ＰＩＴＣ＋ＰＥ−：２１３個であり、その比は１．２８：１で、図９，１０に示すデータとは存在比が一致しなかった。
【００５２】
この結果から、参照スペクトルを用いた独自の蛍光補正方法は、図１３に示すように、細胞とビーズとでは、同じ色素を使用した場合でも、蛍光スペクトルの差が１０％を超え、そのスペクトルを参照スペクトルとして使用することはできないことが確認された。
【００５３】
以上から、本発明によれば、プローブ毎に単染色サンプルを準備しなくても、各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができることが確認された。
【符号の説明】
【００５４】
１ 蛍光スペクトル測定装置
２ 検出部
３ 解析部
４ 記憶部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置に関する。より詳しくは、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、色素毎に分離するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を分析する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザー光（励起光）を照射して、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することにより、複数の微小粒子を１個ずつ分析する方法である。このフローサイトメトリーでは、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造などを判定することができる。
【０００３】
また、近年、基礎医学及び臨床分野において、網羅的解釈を進めるために、多くの分子プローブを同時に使用することが多くなってきており、これにより、生物学的な知見が飛躍的に蓄積し、生命現象の理解が進んでいる。このため、フローサイトメトリーにおいても、複数の蛍光色素を使用したマルチカラー分析が普及してきている（例えば、特許文献１，２参照。）。
【０００４】
一方、マルチカラー分析のように一度の測定で複数の蛍光色素を使用すると、蛍光色素に対応する数の高感度検出器が必要となる。また、それぞれの検出器に目的以外の蛍光色素からの光が漏れ込み、分析精度が低下する。そこで、従来のフローサイトメーターでは、目的の蛍光色素から、目的の光情報のみを取り出すため、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化する際に、数学的な補正、即ち、蛍光補正を行っている。
【０００５】
しかしながら、蛍光補正の多くは、目的以外の検出器にて検出した光を測定者の目で判別しているため、ヒューマンエラーが生じる原因となり、不正確になりがちである。このため、測定者には、細胞や蛍光色素、抗体などの知識のみならず、装置の理解とトレーニングが不可欠であり、高度な専門性が求められる。
【０００６】
また、従来、使用する蛍光標識の発光スペクトルを、予めコンピュータに登録しておき、そのデータを利用して測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解し、各蛍光標識の存在割合を決定するスペクトラルデコンボリューション法が提案されている（特許文献３参照）。更に、赤外分光法などの分光吸光測定においては、従来から、標準スペクトルや参照スペクトルに基づいて、測定したスペクトルの補正や解析を行っている（例えば、特許文献４，５参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２３０３３３号公報
【特許文献２】特表２００８−５００５５８号公報
【特許文献３】特開２００５−１８１２７６号公報
【特許文献４】特開２００５−１９５５８６号公報
【特許文献５】特開２００９−１６２６６７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の多数の高感度検出器を備える微小粒子分析装置は、目的とする蛍光色素分の高感度検出器を準備する必要があるばかりでなく、目的以外の検出器への蛍光の漏れ込みが大きな問題となっている。特に、スペクトルが近接している蛍光色素の場合、検出器への漏れ込みのために、蛍光補正ができないことが散見される。
【００１０】
このため、多数の高感度検出器を配しても、従来型の微小粒子分析装置においては、同時に検出可能な蛍光色素の数に限界がある。そこで、例えばスペクトル型フローサイトメーターのように、高感度検出器を多数配置しなくても、漏れ込みを気にせず使用することが可能な次世代のフローサイトメーターが求められている。
【００１１】
更に、前述したように、蛍光色素はそれぞれ特有のスペクトルを持っており、そのスペクトル情報は、蛍光色素自身の特徴を表すものとして重要なデータとなるが、各スペクトルのオーバーラップを正確に見積もり、精度良く蛍光補正するためには、単染色サンプルのデータが必要となる。
【００１２】
このため、作業者は各蛍光色素の単染色サンプルを調製しなければならず、この作業は、使用する色素の数が増えるに従い増加するため、作業者の負担が増すと共に、作業効率も低下する。また、蛍光補正すべき作業数は、用いる蛍光色素の数のおよそ２乗に比例するため、測定者にとっても煩雑である。更に、現実的な問題として、採取できる血液などの検体の容量も有限であるため、蛍光色素毎に単染色サンプルを作製することが難しい場合もある。
【００１３】
そこで、本発明は、蛍光色素毎に単染色サンプルを準備しなくても、各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができる蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る蛍光スペクトル補正方法は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する工程を有し、前記参照スペクトルとして、先に測定したスペクトルデータを使用する。
この補正方法では、前記参照スペクトルとして、単染色サンプルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用することができる。
また、前記参照スペクトルには、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類及び前記微小粒子が細胞である場合は細胞の種類のうちいずれかが異なる蛍光スペクトルデータを使用すればよい。
更に、前記微小粒子が細胞である場合、参照スペクトルには、細胞を使用して測定された蛍光スペクトルデータを使用することが望ましい。
【００１５】
本発明に係る蛍光スペクトル測定装置は、微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出する検出部と、該検出部で検出されたデータを、色素毎の蛍光スペクトルに分離する解析部と、該解析部で分離された蛍光スペクトルデータを記憶する記憶部と、を有し、前記解析部は、前記記憶部に記憶されている先に測定した蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用して、蛍光スペクトルの分離を行う。
この装置では、前記検出部に多チャンネル光電子倍増管が設けられていてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、参照スペクトルとして、先に測定した蛍光スペクトルデータを使用するため、単染色サンプルが不要であり、かつ各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができ、単染色サンプルも不要となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る蛍光スペクトル測定装置の構成を示すブロック図である。
【図２】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＦＩＴＣ：ＣＤ１４）。
【図３】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＰＥ：ＣＤ３）。
【図４】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ ＢｅａｄｓのうちＦＩＴＣに相当するスペクトル）。
【図５】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルとの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ ＢｅａｄｓのうちＰＥに相当するスペクトル）。
【図６】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、検出器の電位と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。
【図７】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＦＩＴＣ：ＣＤ４５ｖｓＦＩＴＣ：ＣＤ４５ＲＡ）。
【図８】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である（ＰＥ：ＣＤ８ｖｓＰＥ：ＣＤ３）。
【図９】横軸を蛍光色素ＦＩＴＣ、抗体ＣＤ４５のデータ、縦軸を蛍光色素ＰＥ、抗体ＣＤ８のデータとしたときの精度管理用血液細胞の密度プロットである。
【図１０】横軸を蛍光色素ＦＩＴＣ、抗体ＣＤ４５ＲＡのデータ、縦軸を蛍光色素ＰＥ、抗体ＣＤ３のデータとしたときの解析結果である。
【図１１】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。
【図１２】（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。
【図１３】横軸をＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズのデータ、縦軸をＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズのデータとしたときの解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
（単染色サンプルを使用せずに蛍光スペクトルを補正する方法の例）
２．第２の実施の形態
（単染色サンプルを使用しない蛍光スペクトル測定装置の例）
【００１９】
＜１．第１の実施の形態＞
［補正方法］
先ず、本発明の第１の実施形態に係る蛍光スペクトル補正方法（以下、単に補正方法ともいう。）について説明する。本実施形態の補正方法では、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、色素毎に分離する際の参照スペクトルとして、先に測定した蛍光スペクトルを使用する。
【００２０】
ここでいう「微小粒子」には、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。そして、生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
【００２１】
一方、工業用粒子としては、例えば有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【００２２】
本実施形態の補正方法において、参照スペクトルとして使用するスペクトルデータは、測定対象の微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下であることが好ましく、より好ましくは３％以下である。これにより、測定データとのマッチング誤差が少なくなり、精度よく蛍光補正を行うことができる。
【００２３】
具体的には、各色素の参照スペクトルには、例えば、測定日、検出器の電位、レーザー出力、微小粒子の流速、結合している抗体の種類又は微小粒子が細胞の場合はその種類が異なるもののデータ（蛍光スペクトル）を使用することができる。これらの条件は、蛍光スペクトルに大きな影響を与えないため、このようなスペクトルデータを参照スペクトルに使用して補正を行っても、オーバーラップを精度良く解消することができる。
【００２４】
ただし、微小粒子が細胞である場合は、例え同じ蛍光色素で標識されたものであっても、ビーズでの測定結果を参照スペクトルとして使用することはできず、逆の場合も同様である。なお、前述したように、細胞同士であれば、その種類が異なっていても、参照スペクトルとして使用可能である。当然ながら、ビーズ同士であれば、その種類が異なっていても、参照スペクトルとして使用可能である。
【００２５】
本実施形態の補正方法では、参照スペクトルとして、先に測定した測定対象の微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用しているため、測定の度に単染色サンプルを調製する必要がない。これにより、作業者の負担が軽減し、作業効率も向上する。また、ラットなどの小動物のように検体の量が少ない場合でも、正確性を低下させることなく、解析を行うことが可能となる。
【００２６】
なお、本実施形態の蛍光スペクトル補正方法は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルを用いて色素毎に分離する工程を有する補正方法であれば、その前後の工程にかかわらず、適用可能である。
【００２７】
＜２．第２の実施の形態＞
［装置の全体構成］
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光スペクトル測定装置について説明する。図１は本実施形態の蛍光スペクトル測定装置の構成を示すブロック図である。図１に示すように、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１は、少なくとも、検出部２と、記憶部３と、解析部４とを備え、前述した第１の実施形態の補正方法を行う。なお、図１に示す蛍光スペクトル測定装置１には、更に、送液部が設けられていてもよい。
【００２８】
［検出部２の構成］
検出部２は、分析対象の微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出可能な構成であればよい。具体的には、波長領域毎にその波長領域を検出可能な独立したセンサを複数配置した構成や、多チャンネル光電子倍増管（Photo-Multiplier Tube：ＰＭＴ）などのように複数の光を同時に検出可能な１又は複数の検出器を備えた構成とすることができる。この検出部２で検出する波長領域の数、即ち、検出部２に配設される検出器のチャンネル数又はセンサ数などは、使用する色素の数以上であればよい。
【００２９】
また、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１では、検出部２に分光器を設け、微小粒子から発せられた蛍光が、この分光器で分光された後、多チャンネルＰＭＴなどの検出器に入射する構成としてもよい。更に、検出部２には、必要に応じて、対物レンズ、集光レンズ、ピンホール、バンドカットフィルター、ダイクロックミラーなどを設けることもできる。
【００３０】
［解析部３の構成］
解析部３では、電子計算機などを用いて、検出部２で検出した各波長領域の光を、定量化し、波長領域毎の総蛍光量（強度）を求める。また、必要に応じて、参照スペクトルを使用した蛍光スペクトル補正を行う。そして、その結果（蛍光スペクトルデータ）は、記憶部４に保存される。
【００３１】
［記憶部４の構成］
記憶部４は、解析部３で処理された蛍光スペクトルデータを記憶するものである。この記憶部４には、例えば、過去に測定した蛍光スペクトルデータだけでなく、単染色サンプルの蛍光スペクトルデータを保存することもできる。
【００３２】
［蛍光スペクトル測定装置１の動作］
次に、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１の動作について説明する。本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１で分析とする微小粒子は、特に限定されるものではないが、例えば細胞やマイクロビーズなどが挙げられる。また、これら微小粒子を修飾する蛍光色素の種類及び数も、特に限定されるものではなくＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanete：Ｃ２１Ｈ１１ＮＯ５Ｓ）、ＰＥ（phycoerythrin）、ＰｅｒＣＰ（periidinin chlorophyll protein）、ＰＥ−Ｃｙ５及びＰＥ−Ｃｙ７などの公知の色素を、必要に応じて適宜選択して使用することができる。更に、各微小粒子が複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
【００３３】
そして、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置１を使用して微小粒子を光学的に分析する際は、先ず、光照射部の光源から励起光を出射し、流路内を通流する微小粒子に照射する。次に、微小粒子から発せられた蛍光を、検出部２で検出する。具体的には、ダイクロックミラーやバンドパスフィルターなどを使用して、微小粒子から発せられた光から特定波長の光（目的とする蛍光）のみを分離し、それを例えば３２チャンネルＰＭＴなどの検出器で検出する。このとき、例えば分光器などを使用して蛍光を分光し、検出器の各チャンネルで異なる波長の光を検出するようにする。これにより、容易に検出光（蛍光）のスペクトラム情報を得ることができる。
【００３４】
その後、検出部２において取得された検出器のチャンネル数分の情報は、例えば変換部（図示せず）でデジタル信号に変換され、更に、解析部３において定量化される。その際、記憶部４に記憶されている過去に測定した蛍光スペクトルデータを、参照スペクトルとして使用して蛍光補正を行う。具体的には、各色素の参照スペクトルには、例えば、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類又は微小粒子が細胞の場合はその種類が異なるものなどのように、微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下の蛍光スペクトルデータを使用する。そして、補正後の蛍光スペクトルデータは、記憶部４に保存する。
【００３５】
本実施形態の蛍光スペクトル測定装置では、参照スペクトルとして、過去に測定した測定対象の微小粒子の単染色サンプルのスペクトルとの誤差が８％以下のスペクトルデータを使用しているため、単染色サンプルを使用しなくても、精度良く補正することができる。また、参照スペクトルとなる蛍光スペクトルデータは、記憶部４に逐次蓄積されるため、使用実情に合ったデータベースを構築することができる。
【００３６】
特に、細胞をサンプルとして用いた場合には、しばしば検出器の電位、レーザー出力の変更を余儀なくされることがある。このような場合、従来の装置では、蛍光補正の整合性をとるため、補正を再度やり直す必要があったが、本実施形態の蛍光スペクトル装置では、その必要がない。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例により、本発明の効果について具体的に説明する。本実施例においては、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類又は微小粒子の種類を変えて蛍光スペクトルを比較し、その差を調べた。
【００３８】
本実施例においては、サンプルには、精度管理用細胞として市販されているＩｍｍｕｎｏ−ＴＲＯＬ（ベックマンコールター社製）又はＭｕｌｔｉ−Ｃｈｅｃｋ（ベクトンディッキンソン社製）を用いた。これらは、フローサイトメトリー用の陽性プロセスコントロール（全血コントロール検体）であり、リンパ球、顆粒球、単球に特異的な表面抗原の陽性率と絶対数が検定されているため、全血検体に類似した散乱光、細胞集団の分布、蛍光強度及び抗原密度を示す。また、蛍光色素が標識された抗体は、市販品（ベックマンコールター社製又はベクトンディッキンソン社製）のものを用いた。
【００３９】
一方、サンプルの染色は、定法に従い行った。具体的には、サンプルの温度を室温にした後、目的の蛍光色素がラベルされた抗体を、専用のプラスチックチューブに滴下し、そこに血液を５０μＬ滴下して穏やかに浸透させ、抗体と細胞とを反応させた。そして、２０分間、暗所、室温にて放置した後、溶血剤（ＦＡＣＳ Ｌｙｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：塩化アンモニウム溶液，ベックマンコールター社）を１ｍｌ滴下した。これにより、赤血球が溶血され、目的の細胞である顆粒球、単球及びリンパ球のみとなる。そして、これを遠心分離し、適当な溶液にて洗浄することにより、純度の高いサンプル溶液を得た。
【００４０】
測定は、前述した方法で調整された細胞溶液（サンプル溶液）を、プラスチック製の細胞分析用の特殊な測定セルに導入し、フローサイトメーター用のシース溶液により、３次元にフォーカスした後、励起光を照射した。励起源としては、波長が４８８ｎｍ及び６４０ｎｍのレーザー光を用いた。そして、各細胞から発せられた蛍光を、プリズム分光器などを用いて分光した後、３２ｃｈＰＭＴにより検出した。なお、本実施例では、検出器に３２ｃｈのＰＭＴを用いているが、励起光として２つのレーザー光を用いているため、情報量としては６４ｃｈ分のスペクトルデータが解析部及び記憶部に送られることとなる。
【００４１】
＜日間差について＞
図２（ａ）、図３（ａ）、図４（ａ）、図５（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図２（ｂ）、図３（ｂ）、図４（ｂ）、図５（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図２（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ１４を使用して測定したデータであり、図３（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３を使用して測定したデータである。いずれの日も同一ロットを用いた。
【００４２】
また、図４（ａ），（ｂ）は、ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズの蛍光スペクトルである。更に、図５（ａ），（ｂ）は、ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズの蛍光スペクトルである。なお、検出器はいずれもＰＭＴを使用し、印加電圧は６３０Ｖとした。
【００４３】
図２〜図５に示すように、異なる日に調整し、測定した細胞サンプル又はビーズのスペクトルＡは、スペクトルＢとの誤差が８％以下であり、測定日が異なるスペクトルを参照スペクトルとして使用可能であることが確認された。
【００４４】
＜検出器の電位について＞
図６（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、検出器の電位と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図６（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図６（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３、検出器にＰＭＴを使用して、測定したデータである。なお、印加電圧は、ＰＭＴＶ１５０が５２５Ｖ、ＰＭＴＶ１６０が５６０Ｖ、ＰＭＴＶ１７０が５９５Ｖ、ＰＭＴＶ１８０が６３０Ｖ、ＰＭＴＶ１９０が６６５Ｖ、ＰＭＴＶ２００が７００Ｖである。
【００４５】
図６に示すように、検出器の電位を変えても、スペクトルの誤差は３％以下であった。これにより、検出器の電位が異なる蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用可能であることが確認された。
【００４６】
＜結合している抗体の種類＞
図７（ａ）、図８（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図７（ｂ）、図８（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図７（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、Ａ：蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５、Ｂ：蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５ＲＡを使用して測定したデータである。また、図８（ａ），（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、Ａ：蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ８、Ｂ：蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３を使用して測定したデータである。なお、検出器はＰＭＴを使用し、印加電圧はいずれも５２５Ｖとした。
【００４７】
そして、蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５を使用したときのデータ、及び蛍光色素にＰＥ，抗体にＣＤ８を使用したときのデータを、別のセットのシングルステインから得た参照スペクトルを用いて解析した。図９はその結果を示す密度プロットである。図９に示すように、シングルステインにより生成された参照スペクトルを用いて解析したところ、３つの細胞集団に分けることができた。また、各集団は、直交する位置にあり、蛍光補正がうまくいったことを示している。更に、ゲートをかけた領域における存在数は、ＦＩＴＣ＋ＰＥ＋：２７８個、ＦＩＣＴ＋ＰＥ−：７５０個であり、その比は、０．３７：１であった。
【００４８】
次に、蛍光色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５ＲＡを使用したときのデータ、及び蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ３を使用したときのデータで、同様の解析を行った。図１０はその結果を示す密度プロットである。図１０に示すように、蛍光色素にＦＩＴＣ、ＰＥによる２次元展開プロットでは、３つの細胞集団が明瞭に分かれており、それぞれが直交する位置にあった。また、ゲートをかけた分布を比較すると、ＦＩＴＶ＋ＰＥ＋：２８０個、ＰＩＴＣ＋ＰＥ−：７５０個であり、その比は０．３７：１で、図９に示すデータと存在比が一致していた。
【００４９】
以上の結果から、参照スペクトルを用いた独自の蛍光補正方法は、図７，８に示すように、結合している抗体が異なるもの同士でも、蛍光スペクトルの差は８％以下であり、スペクトルを参照スペクトルとして使用可能であることが確認された。
【００５０】
＜微小粒子の種類＞
図１１（ａ）及び図１２（ａ）は横軸に検出器のチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図１１（ｂ）及び図１２（ｂ）は各波長における誤差を示すグラフ図である。ここで、図１１（ａ），（ｂ）は、Ａ：色素にＦＩＴＣ、抗体にＣＤ４５を使用したときの蛍光スペクトル、Ｂ：ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズを用いたときの蛍光スペクトルである。また、図１２（ａ），（ｂ）は、Ａ：蛍光色素にＰＥ、抗体にＣＤ８を使用したときの蛍光スペクトル、Ｂ：ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズを使用したときの蛍光スペクトルである。なお、印加電圧はいずれも６３０Ｖとした。
【００５１】
そして、ＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＦＩＴＣを含有しているポリスチレンビーズを使用したときのデータ、及びＢＤ ７−Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｔｕｐ Ｂｅａｄｓ中の蛍光色素ＰＥを含有しているポリスチレンビーズを使用したときのデータを用いて、別のセットのシングルステインから得た参照スペクトルを用いて解析した。図１３はその結果を示す密度プロットである。図１３に示すように、細胞集団は３つに分かれており、それぞれが直交する位置にあった。また、ゲートをかけた分布を比較すると、ＦＩＴＶ＋ＰＥ＋：２７２個、ＰＩＴＣ＋ＰＥ−：２１３個であり、その比は１．２８：１で、図９，１０に示すデータとは存在比が一致しなかった。
【００５２】
この結果から、参照スペクトルを用いた独自の蛍光補正方法は、図１３に示すように、細胞とビーズとでは、同じ色素を使用した場合でも、蛍光スペクトルの差が１０％を超え、そのスペクトルを参照スペクトルとして使用することはできないことが確認された。
【００５３】
以上から、本発明によれば、プローブ毎に単染色サンプルを準備しなくても、各スペクトルのオーバーラップを精度良く解消することができることが確認された。
【符号の説明】
【００５４】
１ 蛍光スペクトル測定装置
２ 検出部
３ 解析部
４ 記憶部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する工程を有し、
前記参照スペクトルとして、先に測定したスペクトルデータを使用する蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項２】
前記参照スペクトルは、単染色サンプルとの誤差が８％以下である請求項１に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項３】
前記参照スペクトルとして、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類及び前記微小粒子が細胞である場合は細胞の種類のいずれかが異なる蛍光スペクトルデータを使用する請求項２に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項４】
前記微小粒子が細胞である場合、参照スペクトルには、細胞を使用して測定された蛍光スペクトルデータを使用する請求項３に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項５】
微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出する検出部と、
該検出部で検出されたデータを、色素毎の蛍光スペクトルに分離する解析部と、
該解析部で分離された蛍光スペクトルデータを記憶する記憶部と、を有し、
前記解析部は、前記記憶部に記憶されている先に測定した蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用して、蛍光スペクトルの分離を行う蛍光スペクトル測定装置。
【請求項６】
前記検出部には多チャンネル光電子倍増管が設けられている請求項５に記載の微小粒子分析装置。
【請求項１】
複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する工程を有し、
前記参照スペクトルとして、先に測定したスペクトルデータを使用する蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項２】
前記参照スペクトルは、単染色サンプルとの誤差が８％以下である請求項１に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項３】
前記参照スペクトルとして、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類及び前記微小粒子が細胞である場合は細胞の種類のいずれかが異なる蛍光スペクトルデータを使用する請求項２に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項４】
前記微小粒子が細胞である場合、参照スペクトルには、細胞を使用して測定された蛍光スペクトルデータを使用する請求項３に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
【請求項５】
微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出する検出部と、
該検出部で検出されたデータを、色素毎の蛍光スペクトルに分離する解析部と、
該解析部で分離された蛍光スペクトルデータを記憶する記憶部と、を有し、
前記解析部は、前記記憶部に記憶されている先に測定した蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用して、蛍光スペクトルの分離を行う蛍光スペクトル測定装置。
【請求項６】
前記検出部には多チャンネル光電子倍増管が設けられている請求項５に記載の微小粒子分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−１０３１５９（Ｐ２０１２−１０３１５９Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５２８６３（Ｐ２０１０−２５２８６３）
【出願日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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