蛍光ビーズを用いた免疫複合体検出による抗体解析法
【課題】血清中の複数抗体を同時にかつ高感度に検出するための方法の提供。
【解決手段】種々の抗原に特異的な抗体を結合させた多色の蛍光ビーズを用いて多種類の免疫複合体を同時に検出することにより、血清中の白血球や血小板上の抗原に対する複数抗体を検出することを特徴とする方法。
【解決手段】種々の抗原に特異的な抗体を結合させた多色の蛍光ビーズを用いて多種類の免疫複合体を同時に検出することにより、血清中の白血球や血小板上の抗原に対する複数抗体を検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血清中の白血球抗体および／または血小板抗体を同時に正確かつ迅速に検出する方法に関する。
【０００２】
背景技術
近年、様々な臨床状況で白血球（ＨＬＡ）抗体および血小板（ＨＰＡ）抗体が関与している疾患が報告されている。同種抗体が関与する疾患として、同種免疫性新生児血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、血小板輸血不応、輸血関連肺障害などがあり、また、自己抗体が関与する疾患として、特発性血小板減少性紫斑病などがある。これらの疾患では白血球抗体と血小板抗体とが混在している場合もあることから、両者を正確かつ迅速に検出する検査方法が求められている。特に、交差適合試験については、輸血の際の輸血副作用の防止のため、受血者血清中の供血者白血球および血小板に対する抗体の存在の有無を正確かつ迅速に検出する検査方法が求められている。よって、これらの検査方法については、（１）検出感度が高いこと、（２）バックグラウンドが低いこと、（３）簡便に、迅速に測定できること、（４）複数の特異性の血小板抗体が混在している場合や白血球抗体と血小板抗体が混在する場合でも、正確に判定することができること、（５）交差適合試験に用いることができること、が重要である。
【０００３】
これまでに、ＨＬＡ抗体検査としては、精製したＨＬＡ抗原を付加させたビーズを用いたＦｌｏｗＰＲＡ法（非特許文献１）やＬＡＢＳｃｒｅｅｎ法（非特許文献２）などがあり、良好な検査成績が得られているが、これらの方法は交差適合試験法として用いることができない。一方、交差適合試験法に関しては、血中のリンパ球をパネルとし、抗体の存在について補体依存性細胞傷害を指標とする方法（ＡＨＧ−ＬＣＴ法）やフローサイトメーターを用いて抗体の存在を測定する方法（ＬＩＦＴ法）などがあるが、安定して良好な検査成績を得るまでに至っていない。その原因としては、交差適合試験法は細胞（白血球または血小板）を用いる方法であるため、ヒト血清に対するバックグラウンドが高く、非特異的な反応が起こりやすいこと、また、抗原に対して精製や濃縮などを行わないため、十分な検出感度が得られないことが挙げられる。
【０００４】
血小板抗体検査としては、Ｕ型マイクロタイタープレートに固相した血小板と抗ヒトＩｇＧ感作血球を用いて抗体の存在を測定する方法（ＭＰＨＡ法）（非特許文献３）や、この方法を応用した、抗ヒトＩｇＧ感作磁性粒子を用いて迅速に抗体の存在を測定するＭ−ＭＰＨＡ法がある(非特許文献４）。Ｍ−ＭＰＨＡ法は迅速な測定が可能であるが、バックグラウンドが高く、複数の血小板抗体が混在している場合やＨＬＡ抗体と血小板抗体が混在する場合はその特異性の判別は困難である。また、抗体と血小板と血小板膜糖タンパクに対するマウスモノクローナル抗体を結合させた後、抗マウスＩｇＧ抗体を固相したマイクロタイタープレートを用いて捕捉し、酵素標識抗ヒトＩｇＧにて抗体を検出する方法（ＭＡＩＰＡ法）（非特許文献５）があるが、バックグラウンドが高いため安定して良好な検査成績が得られておらず、また、手技が煩雑で日常検査には不向きであり、検査に要する時間が長いため迅速に検査することが出来ない。この方法を応用した、ビーズ担体にアイソタイプの異なる抗マウスＩｇＧ抗体を結合して３種類の血小板膜糖タンパクに対するマウスモノクローナル抗体を識別可能し、フローサイトメーターにて測定するＳＡＳＰＡ法は（非特許文献６）、検出感度、操作の簡便性、迅速性に改善が認められたが、Ｍ−ＭＰＨＡ法と比較すると不十分である。
【０００５】
以上のことから、ＨＬＡ抗体検査に関しては、ＦｌｏｗＰＲＡ法やＬＡＢＳｃｒｅｅｎ法は（１）、（３）、（４）の条件は満たしているが、（２）の条件に関しては必ずしも十分とは言えず、また、（５）の条件は満たしていない。血小板抗体検査に関しては、ＭＰＨＡ法は（１）、（５）の条件は満たしているが、（２）、（３）、（４）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。Ｍ−ＭＰＨＡ法は（１）、（３）、（５）の条件は満たしているが、（２）、（４）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。ＭＡＩＰＡ法は、（４）、（５）の条件は満たしているが、（１）、（２）、（３）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。ＳＡＳＰＡ法は（２）、（４）、（５）の条件は満たしているが、（１）、（３）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。
従って、ＨＬＡ抗体および血小板抗体が混在している場合でも両者を正確かつ迅速に検出し、さらに交差適合試験法としても用いることができる検査方法、すなわち（１）〜（５）の条件をすべて満たす検査方法についてはこれまでに報告されていない。
【非特許文献１】Human Immunology, 59, 1998:pp313-322
【非特許文献２】Human Immunology, 75, 2003:pp43-49
【非特許文献３】Vox Sang, vol.41, 1981: pp25-31
【非特許文献４】血液事業, Vol.25, 2002 : pp33-40
【非特許文献５】Blood, vol.70, 1987: pp1722-1726
【非特許文献６】Br J Haematol, vol.127, 2004: pp552-560
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、種々の抗原に特異的なモノクローナル抗体を結合させた多色の蛍光ビーズを用いて多種類の免疫複合体の蛍光強度を測定することにより、血清中の白血球や血小板上の抗原に対する抗体を同時に検出することができることを見出した。本発明は、この知見に基づくものである。
【０００７】
本発明は、血清中の複数抗体を同時にかつ高感度に検出するための方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明によれば、被検血清中の１種またはそれ以上の抗体を検出する方法であって、
（ｉ）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させ、抗原抗体複合体を得る工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた抗原抗体複合体と、前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合体の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させ、検出用複合体を得る工程
を含んでなる方法が提供される。
【０００９】
本発明による方法は、検出感度、迅速性（検査所要時間が約２時間３０分）、全ての行程をプレートで行う操作性、交差適合試験に用いることができる汎用性などの点で有利である。また、複数の特異性やＨＬＡ抗体がある場合でも容易に特異性を同定することが可能であり、複数（多色）の蛍光ビーズを同時に反応させる点から、従来法と比較すると操作が簡便であり、検体量も約１／５で検査を行うことが可能である点で有利である。
【００１０】
本発明による方法は、また、１次反応においてＥＬＩＳＡプレートなどに固相されている白血球、血小板、セルライン、臓器細胞、動物細胞などを抗原パネルとして用いることが可能であり、２次反応では蛍光ビーズにて抗原抗体複合物をそれぞれ選択的に捕捉して精製することから、バックグラウンドの原因となるパネル細胞に非特異的に結合した抗体は蛍光ビーズに結合せず、１次反応における非特異的な反応の影響を受けにくい。また、抗原パネル上の複数のエピトープに対する抗体を同時に検出することが可能であることから、交差適合試験以外にも、幅広い応用（例えば、ＰＡＩｇＧ検査、顆粒球や単球に対する抗体検出、抗原やエピトープの発現検査等）が可能である。
【発明の具体的説明】
【００１１】
抗原抗体複合体を得る工程
抗原抗体複合体（免疫複合体）は、（ｉ）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させ、抗原抗体複合体を得る工程、を実施することにより得ることができる。
【００１２】
具体的には、（ｉ−１）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させる工程；および（ｉ−２）生体試料中の細胞を可溶化し、可溶層から抗原抗体複合体を分離する工程、を実施することにより得ることができる。
【００１３】
本発明において用いられる「被検血清」とは、検出対象となる抗体が含まれると考えられる血清であって、検出しようとする対象者、すなわち、輸血における受血者、臓器移植における移植患者、または白血球抗体および血小板抗体が関与している疾患が疑われる患者、から採血して得ることができる。
【００１４】
ここで、輸血における受血者としては、輸血が必要となるあらゆる状況（例えば、手術等）における受血者（特に、血小板輸血不応が疑われる患者）が挙げられる。
【００１５】
また、臓器移植における移植患者としては、例えば、白血病等で幹細胞移植が必要な患者、腎不全等で腎移植が必要な患者等が挙げられる。
【００１６】
さらに、白血球抗体が関与している疾患としては、白血球抗体に起因する血小板輸血不応、輸血関連肺障害白血病、同種免疫性新生児血小板減少症等が挙げられ、血小板抗体が関与している疾患のうち、同種抗体が関与している疾患としては、血小板抗体に起因する同種免疫性新生児血小板減少症および血小板減少性紫斑病、血小板輸血不応、輸血後紫斑病等が挙げられ、自己抗体が関与している疾患としては、特発性血小板減少性紫斑病等が挙げられる。
本発明において用いられる「検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料」とは、検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する細胞を含んでいればよく、好ましくは、血液中から精製される細胞であり、より好ましくは、血小板細胞や白血球細胞である。
【００１７】
ここで、「検出対象となる複数種の抗体」は、特に限定されないが、好ましくは、同時検出を行う意義の高い、ＨＬＡ抗体群、ＨＰＡ抗体群、またはＨＬＡ抗体およびＨＰＡ抗体を含んでなる抗体群である。
【００１８】
本発明において、細胞の可溶化は、界面活性剤、塩、キレート化合物、有機溶媒、カオトロピックイオン、酵素等を用いることによって行うことができる。
【００１９】
本発明において用いられる界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｂｒｉｊ、ＮＰ−４０等が挙げられるが、好ましくは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【００２０】
抗原抗体複合体の分離方法は、遠心分離法、ろ過法等が挙げられるが、好ましくは、遠心分離法である。遠心分離法によれば、可溶化された細胞を、不溶物と可溶層とに分けることができ、可溶化層から複数の抗原抗体複合体を回収することができる。
【００２１】
検出用複合体を得る工程
上記の工程で得られた抗原抗体複合物と、該抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合物の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させることにより、これら抗原抗体複合体、蛍光ビーズ、および蛍光標識抗体からなる複合体（以下、「検出用複合体」という）を得ることができる。
【００２２】
検出用複合体は、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた抗原抗体複合体と、前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合体の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させ、検出用複合体を得る工程、具体的には、（ｉｉ−１）前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズにて抗原抗体複合物を捕捉する工程；および（ｉｉ−２）蛍光標識抗体を用いて、抗原抗体複合体の抗体を２次的に標識する工程、を実施することにより得ることができる。
（ｉｉ−１）の工程によれば、非特異的な反応をなくすための精製、ＨＰＡ−５やＮａｋａ等の発現量の少ない抗原に対する抗体を検出するための濃縮を行うことができる。
（ｉｉ−１）の工程および（ｉｉ−２）の工程は、順序は特に制限されないが、操作の簡便性、迅速性、および過洗浄による検出感度の低下抑制の観点から、同時に行うことが好ましい。
【００２３】
本発明において用いられる「抗体が固定された蛍光ビーズ」は、検出対象となる複数の抗体が認識する抗原に特異的な抗体を選択し、選択された抗体を蛍光ビーズに固定化することで得ることができる。
【００２４】
本発明において用いられる、検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原に特異的な抗体は、検出対象となる抗体が認識する抗原が定まれば、公知の方法（Nature, 256, 1975: pp495-497、Nature,348,1990:pp552-554等）に従って、該抗原に対する抗体を作製することができる。
【００２５】
ここで、蛍光ビーズに固定される抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等が挙げられるが、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００２６】
本発明において用いられる「蛍光ビーズ」としては、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製の蛍光ビーズ（例えば、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＣＯＯＨ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ＮＩＰＰＮ Ｔｅｃｈｎｏ Ｃｌｕｓｔｅｒ社製の蛍光ビーズ（例えば、蛍光染色カルボキシル基修飾マイクロスフィア）、Ｓｐｅｒｏｔｅｃｈ社製の蛍光ビーズ（ＳＰＨＥＲＯ Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）が挙げられるが、好ましくは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製の蛍光ビーズ、より好ましくは、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＣＯＯＨ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓである。
【００２７】
抗体の蛍光ビーズへの固定化方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができるが、好ましくは、共有結合法である。共有結合法によれば、具体的には、表面上にカルボキシル基が付加された蛍光ビーズと抗体の１級のアミノ基とを、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とＳ−ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を用いて共有結合させることにより固定化することができる。
【００２８】
本発明において用いられる「蛍光標識抗体」としては、蛍光標識された抗ヒト抗体等が挙げられるが、好ましくは、蛍光標識された抗ヒト抗体である。抗ヒト抗体としては、抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩｇＭ等が挙げられるが、好ましくは、抗ヒトＩｇＧである。
【００２９】
ここで、「蛍光標識」としては、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２等が挙げられるが、好ましくは、ＰＥである。
【００３０】
ここで、「蛍光標識抗体」は、公知の方法（Anal.Biochem.Vol.173.1988: pp59-63）に従って作製することができる。これらの抗体を産生する免疫動物は、公知の方法に従って選択することができ、例えば、ヤギ、マウス、ラット、ラビット、ロバ等が挙げられるが、好ましくは、ヤギである。
【００３１】
本発明によれば、検出用複合体を得る方法としては、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程、を更に含んでいてもよい。
ここで、「得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程」は、蛍光ビーズへの非特異的な反応物、蛍光標識抗体への特異的な反応物、未反応物等を除去することができればよい。
【００３２】
ここで、除去方法としては、遠心分離法、ろ過法等が挙げられるが、好ましくは、遠心分離法である。さらに、ＰＢＳ等の溶液を用いて洗浄を行うこともできる。
【００３３】
蛍光測定装置による測定工程
上記の工程で得られた検出用複合体を、蛍光測定装置を用いて、ビーズの蛍光と標識抗体の蛍光を同時に測定することにより、検出対象である複数の抗体の存在の有無を同時にかつ高感度に検出することができる。
【００３４】
本発明において用いられる蛍光測定装置は、ビーズの蛍光と標識抗体の蛍光を同時に測定することができればよく、具体的には、２種以上の波長のレーザーによりビーズ自体の情報およびビーズ表面（すなわち、標識抗体の蛍光）の蛍光のシグナルを同時に測定することができればよい。例えば、６５７ｎｍと７２０ｎｍの波長のレーザーにより測定された電流値の差からビーズの蛍光値を、５８０ｎｍの波長のレーザーで標識抗体の蛍光のシグナルを蛍光強度（ｍｅｄｉａｎ値）としてそれぞれ同時に測定することができる。
【００３５】
ここで、蛍光測定装置としては、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製のＬｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍ、ベクトン・ディッキンソン社製のフローサイトメーター、ベックマン・コールター社製のフローサイトメーター等が挙げられるが、好ましくは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製のＬｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍである。
【００３６】
例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製のＬｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍは、二色のレーザー（赤色レーザー（波長６５７ｎｍ、７２０ｎｍ）と緑色レーザー（波長５８０ｎｍ））を用いる装置であり、まず、赤色レーザーでビーズの直径と色を測定して目的の蛍光ビーズを認識し、次に、緑色レーザーで該蛍光ビーズ上の標識抗体の蛍光のシグナルをｍｅｄｉａｎ値としてそれぞれ測定することができる。
蛍光測定装置により得られたｍｅｄｉａｎ値を用いて下記の式により算出されたＩｎｄｅｘ値を抗体の存在の指標とする。
【数１】
【００３７】
Ｉｎｄｅｘ値が２以上になった場合を陽性とし、Ｉｎｄｅｘ値が陽性の場合に、検出対象である抗体が存在すると判定することができる。
本発明による好ましい態様としては、被検血清中の１種またはそれ以上の抗体を検出する方法であって、
（ｉ−１）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させる工程；
（ｉ−２）生体試料中の細胞を可溶化し、可溶層から抗原抗体複合体を分離する工程；
（ｉｉ−１）前記抗原に対するモノクローナル抗体が固定された蛍光ビーズにて抗原抗体複合物をそれぞれ捕捉した後、蛍光標識抗体を用いて、抗原抗体複合体における抗体を２次的に標識する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ−１）により得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程
を含んでなる方法である。
【００３８】
この方法によれば、（１）検出感度が高く、（２）バックグラウンドが低く、（３）簡便に、迅速に測定することができ、（４）複数の特異性の血小板抗体が混在している場合やＨＬＡ抗体と血小板抗体が混在する場合でも、正確に判定することができ、かつ、（５）交差適合試験に用いることができる
具体的な態様として、本発明は、「検出対象となる複数種の抗体」が輸血における受血者由来であり、「生体試料」が輸血における供血者由来である場合に、交差適合試験として用いることができる。
【００３９】
本発明は、また、「検出対象となる複数種の抗体」が臓器移植における移植患者由来であり、「生体試料」が臓器移植における臓器提供者由来である場合に、交差適合試験の判定方法として用いることができる。
【００４０】
本発明は、さらに、「検出対象となる複数種の抗体」が白血球抗体および血小板抗体が関与している疾患が疑われる被検者由来であり、「生体試料」が被検者由来である場合に、白血球抗体および血小板抗体が関与している疾患またはその発症リスクの判定方法として用いることができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１：モノクローナル抗体が固定された蛍光ビーズの作製
ＨＰＡ−２、ＨＰＡ−１，３，４，６、ＨＰＡ−５、Ｎａｋａ、およびＨＬＡ ｃｌａｓｓＩの各抗原に特異的なモノクローナル抗体として、ＳＺ２（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、Ｐ２（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、ＳＺ２１（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、Ｇｉ９（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、ＦＡ６−１５２（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、ｗ６／３２（ｗ６／３２は、ｗ６／３２産生ハイブリドーマ細胞を用いてマウスを腹水化し、その腹水から硫安沈殿、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーにより精製し得られたものを使用）をそれぞれ選択した（表１）。ＨＰＡ−１，３，４，６に関しては、ＣＤ４１（ＧＰＩＩｂ）に特異的なモノクローナル抗体のクローンＰ２がＨＰＡ−３に対して反応性が悪いことから、ＣＤ６１（ＧＰＩＩＩａ）に特異的なモノクローナル抗体のクローンＳＺ２１も併せて選択した。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社製）とＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ社製）を選択した。
【表１】
【００４２】
これら選択したモノクローナル抗体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社が推奨する方法（Ｌｕｍｉｎｅｘ社のプロトコール（http://www.luminexcorp.com/uploads/data/Protein Coupling Protocol-June.pdf）参照）に従って、蛍光ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）に固定した。具体的には、８種類の各蛍光ビーズ溶液４００μｌ（５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０）に対して各モノクローナル抗体を８μｇを加えて、Ｌｕｍｉｎｅｘ社の方法により固定を行った。
【００４３】
実施例２：ＭＰＨＡ法の検出限界に希釈したサンプルを用いた検討
ＨＰＡ抗体を含む抗血清６検体、ＨＬＡ抗体を含む抗血清１検体、ＨＰＡ抗体とＨＬＡ抗体の両方を含む１検体について以下のアッセイを行った。
【００４４】
まず、パネル血小板としてＥＤＴＡ採血の血液を３０００ｒｐｍ、５分間遠心して得られた多血小板血漿（ＰＲＰ） ５０μＬを９６プレートに加え、０．５％ ＥＤＴＡ−ＰＢＳにて２回洗浄後、各抗血清（８検体）を２５μＬずつ加えて３７℃、３０分反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄後、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ０．９％ ＮａＣｌ， ０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００； ｐＨ７．４）にて可溶化し、実施例１で作製した８種類の蛍光ビーズおよびＰＥ−抗ヒトＩｇＧ（ワンラムダ社製）を加えて３７℃、３０分反応後、室温（振盪）で１０分間反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳを加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍにて蛍光強度を測定して抗原抗体複合物を検出した。
【００４５】
蛍光強度（Ｍｅｄｉａｎ値）を用いてＩｎｄｅｘ値を下記の式により算出することができる。
【数２】
【００４６】
Ｉｎｄｅｘ値が２以上になった場合を陽性と判定することができる。その結果は、表２に示される通りであった。
【表２】
【００４７】
表２に示すように、いずれのビーズにおいても非特異的なシグナルは得られず、特異的にＨＰＡ抗体及びＨＬＡ抗体を検出することができた。
【００４８】
実施例３：ＭＰＨＡ法の検出限界よりさらに４倍希釈したサンプルを用いた検討
抗ＨＰＡ−５ｂ抗体および抗Ｎａｋａ抗体について、従来法のＭＰＨＡ法における検出限界よりもさらに４倍希釈したものを使用した２検体について、実施例２と同様の方法を用いて、アッセイを行った。その結果を表３に示す。
【表３】
【００４９】
表３に示すように、いずれのビーズにおいても非特異的なシグナルは得られず、特異的にＨＰＡ抗体を検出することができた。また、ＭＰＨＡ法の検出限界より４倍希釈したものにおいても検出が可能であることから最低でも４倍の検出感度を持つことが明らかとなった。
【００５０】
実施例４：ＡＨＧ−ＬＣＴ法の検出限界以下に希釈したサンプルを用いた検討
ＨＬＡ抗体を含む抗３検体（ｓａｍｐｌｅＡはＡ２６、ｓａｍｐｌｅＢはＡ２４、ｓａｍｐｌｅＣはＢ７＋Ｂ２２抗原に対する抗体をそれぞれ含んでいる）について、従来法のＡＨＧ−ＬＣＴ法における検出限界よりもさらに８倍希釈したものを使用して、以下のアッセイを行った。
【００５１】
まず、９６プレートにＴｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌを２００μｌ分注し、ＥＤＴＡ加全血５０μｌを加え、３７℃にて１０分間溶血させた後、１３００ｇ、３分間遠心して得た白血球をパネルとし、０．５％ ＥＤＴＡ−ＰＢＳにて２回洗浄後、各抗血清を２５μＬずつ加えて３７℃、３０分反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄後、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ０．９％ ＮａＣｌ， ０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００； ｐＨ７．４）にて可溶化し、実施例１で作製した３種類の蛍光ビーズおよびＰＥ−抗ヒトＩｇＧを加えて３７℃、３０分反応後、室温（振盪）で１０分間反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳを加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍにて蛍光強度を測定して抗原抗体複合物を検出した。
【００５２】
判定は、実施例２と同様に行った。その結果は表４に示される通りであった。
【表４】
【００５３】
表４に示すように、いずれのビーズにおいても非特異的なシグナルは得られず、特異的にＨＬＡ抗体を検出することができた。また、ＡＨＧ−ＬＣＴ法の検出限界より８倍希釈したものにおいても検出が可能であることから最低でも８倍の検出感度を持つことが明らかとなった。
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血清中の白血球抗体および／または血小板抗体を同時に正確かつ迅速に検出する方法に関する。
【０００２】
背景技術
近年、様々な臨床状況で白血球（ＨＬＡ）抗体および血小板（ＨＰＡ）抗体が関与している疾患が報告されている。同種抗体が関与する疾患として、同種免疫性新生児血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、血小板輸血不応、輸血関連肺障害などがあり、また、自己抗体が関与する疾患として、特発性血小板減少性紫斑病などがある。これらの疾患では白血球抗体と血小板抗体とが混在している場合もあることから、両者を正確かつ迅速に検出する検査方法が求められている。特に、交差適合試験については、輸血の際の輸血副作用の防止のため、受血者血清中の供血者白血球および血小板に対する抗体の存在の有無を正確かつ迅速に検出する検査方法が求められている。よって、これらの検査方法については、（１）検出感度が高いこと、（２）バックグラウンドが低いこと、（３）簡便に、迅速に測定できること、（４）複数の特異性の血小板抗体が混在している場合や白血球抗体と血小板抗体が混在する場合でも、正確に判定することができること、（５）交差適合試験に用いることができること、が重要である。
【０００３】
これまでに、ＨＬＡ抗体検査としては、精製したＨＬＡ抗原を付加させたビーズを用いたＦｌｏｗＰＲＡ法（非特許文献１）やＬＡＢＳｃｒｅｅｎ法（非特許文献２）などがあり、良好な検査成績が得られているが、これらの方法は交差適合試験法として用いることができない。一方、交差適合試験法に関しては、血中のリンパ球をパネルとし、抗体の存在について補体依存性細胞傷害を指標とする方法（ＡＨＧ−ＬＣＴ法）やフローサイトメーターを用いて抗体の存在を測定する方法（ＬＩＦＴ法）などがあるが、安定して良好な検査成績を得るまでに至っていない。その原因としては、交差適合試験法は細胞（白血球または血小板）を用いる方法であるため、ヒト血清に対するバックグラウンドが高く、非特異的な反応が起こりやすいこと、また、抗原に対して精製や濃縮などを行わないため、十分な検出感度が得られないことが挙げられる。
【０００４】
血小板抗体検査としては、Ｕ型マイクロタイタープレートに固相した血小板と抗ヒトＩｇＧ感作血球を用いて抗体の存在を測定する方法（ＭＰＨＡ法）（非特許文献３）や、この方法を応用した、抗ヒトＩｇＧ感作磁性粒子を用いて迅速に抗体の存在を測定するＭ−ＭＰＨＡ法がある(非特許文献４）。Ｍ−ＭＰＨＡ法は迅速な測定が可能であるが、バックグラウンドが高く、複数の血小板抗体が混在している場合やＨＬＡ抗体と血小板抗体が混在する場合はその特異性の判別は困難である。また、抗体と血小板と血小板膜糖タンパクに対するマウスモノクローナル抗体を結合させた後、抗マウスＩｇＧ抗体を固相したマイクロタイタープレートを用いて捕捉し、酵素標識抗ヒトＩｇＧにて抗体を検出する方法（ＭＡＩＰＡ法）（非特許文献５）があるが、バックグラウンドが高いため安定して良好な検査成績が得られておらず、また、手技が煩雑で日常検査には不向きであり、検査に要する時間が長いため迅速に検査することが出来ない。この方法を応用した、ビーズ担体にアイソタイプの異なる抗マウスＩｇＧ抗体を結合して３種類の血小板膜糖タンパクに対するマウスモノクローナル抗体を識別可能し、フローサイトメーターにて測定するＳＡＳＰＡ法は（非特許文献６）、検出感度、操作の簡便性、迅速性に改善が認められたが、Ｍ−ＭＰＨＡ法と比較すると不十分である。
【０００５】
以上のことから、ＨＬＡ抗体検査に関しては、ＦｌｏｗＰＲＡ法やＬＡＢＳｃｒｅｅｎ法は（１）、（３）、（４）の条件は満たしているが、（２）の条件に関しては必ずしも十分とは言えず、また、（５）の条件は満たしていない。血小板抗体検査に関しては、ＭＰＨＡ法は（１）、（５）の条件は満たしているが、（２）、（３）、（４）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。Ｍ−ＭＰＨＡ法は（１）、（３）、（５）の条件は満たしているが、（２）、（４）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。ＭＡＩＰＡ法は、（４）、（５）の条件は満たしているが、（１）、（２）、（３）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。ＳＡＳＰＡ法は（２）、（４）、（５）の条件は満たしているが、（１）、（３）の条件に関しては必ずしも十分とは言えない。
従って、ＨＬＡ抗体および血小板抗体が混在している場合でも両者を正確かつ迅速に検出し、さらに交差適合試験法としても用いることができる検査方法、すなわち（１）〜（５）の条件をすべて満たす検査方法についてはこれまでに報告されていない。
【非特許文献１】Human Immunology, 59, 1998:pp313-322
【非特許文献２】Human Immunology, 75, 2003:pp43-49
【非特許文献３】Vox Sang, vol.41, 1981: pp25-31
【非特許文献４】血液事業, Vol.25, 2002 : pp33-40
【非特許文献５】Blood, vol.70, 1987: pp1722-1726
【非特許文献６】Br J Haematol, vol.127, 2004: pp552-560
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、種々の抗原に特異的なモノクローナル抗体を結合させた多色の蛍光ビーズを用いて多種類の免疫複合体の蛍光強度を測定することにより、血清中の白血球や血小板上の抗原に対する抗体を同時に検出することができることを見出した。本発明は、この知見に基づくものである。
【０００７】
本発明は、血清中の複数抗体を同時にかつ高感度に検出するための方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明によれば、被検血清中の１種またはそれ以上の抗体を検出する方法であって、
（ｉ）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させ、抗原抗体複合体を得る工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた抗原抗体複合体と、前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合体の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させ、検出用複合体を得る工程
を含んでなる方法が提供される。
【０００９】
本発明による方法は、検出感度、迅速性（検査所要時間が約２時間３０分）、全ての行程をプレートで行う操作性、交差適合試験に用いることができる汎用性などの点で有利である。また、複数の特異性やＨＬＡ抗体がある場合でも容易に特異性を同定することが可能であり、複数（多色）の蛍光ビーズを同時に反応させる点から、従来法と比較すると操作が簡便であり、検体量も約１／５で検査を行うことが可能である点で有利である。
【００１０】
本発明による方法は、また、１次反応においてＥＬＩＳＡプレートなどに固相されている白血球、血小板、セルライン、臓器細胞、動物細胞などを抗原パネルとして用いることが可能であり、２次反応では蛍光ビーズにて抗原抗体複合物をそれぞれ選択的に捕捉して精製することから、バックグラウンドの原因となるパネル細胞に非特異的に結合した抗体は蛍光ビーズに結合せず、１次反応における非特異的な反応の影響を受けにくい。また、抗原パネル上の複数のエピトープに対する抗体を同時に検出することが可能であることから、交差適合試験以外にも、幅広い応用（例えば、ＰＡＩｇＧ検査、顆粒球や単球に対する抗体検出、抗原やエピトープの発現検査等）が可能である。
【発明の具体的説明】
【００１１】
抗原抗体複合体を得る工程
抗原抗体複合体（免疫複合体）は、（ｉ）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させ、抗原抗体複合体を得る工程、を実施することにより得ることができる。
【００１２】
具体的には、（ｉ−１）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させる工程；および（ｉ−２）生体試料中の細胞を可溶化し、可溶層から抗原抗体複合体を分離する工程、を実施することにより得ることができる。
【００１３】
本発明において用いられる「被検血清」とは、検出対象となる抗体が含まれると考えられる血清であって、検出しようとする対象者、すなわち、輸血における受血者、臓器移植における移植患者、または白血球抗体および血小板抗体が関与している疾患が疑われる患者、から採血して得ることができる。
【００１４】
ここで、輸血における受血者としては、輸血が必要となるあらゆる状況（例えば、手術等）における受血者（特に、血小板輸血不応が疑われる患者）が挙げられる。
【００１５】
また、臓器移植における移植患者としては、例えば、白血病等で幹細胞移植が必要な患者、腎不全等で腎移植が必要な患者等が挙げられる。
【００１６】
さらに、白血球抗体が関与している疾患としては、白血球抗体に起因する血小板輸血不応、輸血関連肺障害白血病、同種免疫性新生児血小板減少症等が挙げられ、血小板抗体が関与している疾患のうち、同種抗体が関与している疾患としては、血小板抗体に起因する同種免疫性新生児血小板減少症および血小板減少性紫斑病、血小板輸血不応、輸血後紫斑病等が挙げられ、自己抗体が関与している疾患としては、特発性血小板減少性紫斑病等が挙げられる。
本発明において用いられる「検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料」とは、検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する細胞を含んでいればよく、好ましくは、血液中から精製される細胞であり、より好ましくは、血小板細胞や白血球細胞である。
【００１７】
ここで、「検出対象となる複数種の抗体」は、特に限定されないが、好ましくは、同時検出を行う意義の高い、ＨＬＡ抗体群、ＨＰＡ抗体群、またはＨＬＡ抗体およびＨＰＡ抗体を含んでなる抗体群である。
【００１８】
本発明において、細胞の可溶化は、界面活性剤、塩、キレート化合物、有機溶媒、カオトロピックイオン、酵素等を用いることによって行うことができる。
【００１９】
本発明において用いられる界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｂｒｉｊ、ＮＰ−４０等が挙げられるが、好ましくは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【００２０】
抗原抗体複合体の分離方法は、遠心分離法、ろ過法等が挙げられるが、好ましくは、遠心分離法である。遠心分離法によれば、可溶化された細胞を、不溶物と可溶層とに分けることができ、可溶化層から複数の抗原抗体複合体を回収することができる。
【００２１】
検出用複合体を得る工程
上記の工程で得られた抗原抗体複合物と、該抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合物の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させることにより、これら抗原抗体複合体、蛍光ビーズ、および蛍光標識抗体からなる複合体（以下、「検出用複合体」という）を得ることができる。
【００２２】
検出用複合体は、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた抗原抗体複合体と、前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合体の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させ、検出用複合体を得る工程、具体的には、（ｉｉ−１）前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズにて抗原抗体複合物を捕捉する工程；および（ｉｉ−２）蛍光標識抗体を用いて、抗原抗体複合体の抗体を２次的に標識する工程、を実施することにより得ることができる。
（ｉｉ−１）の工程によれば、非特異的な反応をなくすための精製、ＨＰＡ−５やＮａｋａ等の発現量の少ない抗原に対する抗体を検出するための濃縮を行うことができる。
（ｉｉ−１）の工程および（ｉｉ−２）の工程は、順序は特に制限されないが、操作の簡便性、迅速性、および過洗浄による検出感度の低下抑制の観点から、同時に行うことが好ましい。
【００２３】
本発明において用いられる「抗体が固定された蛍光ビーズ」は、検出対象となる複数の抗体が認識する抗原に特異的な抗体を選択し、選択された抗体を蛍光ビーズに固定化することで得ることができる。
【００２４】
本発明において用いられる、検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原に特異的な抗体は、検出対象となる抗体が認識する抗原が定まれば、公知の方法（Nature, 256, 1975: pp495-497、Nature,348,1990:pp552-554等）に従って、該抗原に対する抗体を作製することができる。
【００２５】
ここで、蛍光ビーズに固定される抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等が挙げられるが、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００２６】
本発明において用いられる「蛍光ビーズ」としては、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製の蛍光ビーズ（例えば、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＣＯＯＨ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ＮＩＰＰＮ Ｔｅｃｈｎｏ Ｃｌｕｓｔｅｒ社製の蛍光ビーズ（例えば、蛍光染色カルボキシル基修飾マイクロスフィア）、Ｓｐｅｒｏｔｅｃｈ社製の蛍光ビーズ（ＳＰＨＥＲＯ Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）が挙げられるが、好ましくは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製の蛍光ビーズ、より好ましくは、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＣＯＯＨ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓである。
【００２７】
抗体の蛍光ビーズへの固定化方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができるが、好ましくは、共有結合法である。共有結合法によれば、具体的には、表面上にカルボキシル基が付加された蛍光ビーズと抗体の１級のアミノ基とを、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とＳ−ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を用いて共有結合させることにより固定化することができる。
【００２８】
本発明において用いられる「蛍光標識抗体」としては、蛍光標識された抗ヒト抗体等が挙げられるが、好ましくは、蛍光標識された抗ヒト抗体である。抗ヒト抗体としては、抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩｇＭ等が挙げられるが、好ましくは、抗ヒトＩｇＧである。
【００２９】
ここで、「蛍光標識」としては、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２等が挙げられるが、好ましくは、ＰＥである。
【００３０】
ここで、「蛍光標識抗体」は、公知の方法（Anal.Biochem.Vol.173.1988: pp59-63）に従って作製することができる。これらの抗体を産生する免疫動物は、公知の方法に従って選択することができ、例えば、ヤギ、マウス、ラット、ラビット、ロバ等が挙げられるが、好ましくは、ヤギである。
【００３１】
本発明によれば、検出用複合体を得る方法としては、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程、を更に含んでいてもよい。
ここで、「得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程」は、蛍光ビーズへの非特異的な反応物、蛍光標識抗体への特異的な反応物、未反応物等を除去することができればよい。
【００３２】
ここで、除去方法としては、遠心分離法、ろ過法等が挙げられるが、好ましくは、遠心分離法である。さらに、ＰＢＳ等の溶液を用いて洗浄を行うこともできる。
【００３３】
蛍光測定装置による測定工程
上記の工程で得られた検出用複合体を、蛍光測定装置を用いて、ビーズの蛍光と標識抗体の蛍光を同時に測定することにより、検出対象である複数の抗体の存在の有無を同時にかつ高感度に検出することができる。
【００３４】
本発明において用いられる蛍光測定装置は、ビーズの蛍光と標識抗体の蛍光を同時に測定することができればよく、具体的には、２種以上の波長のレーザーによりビーズ自体の情報およびビーズ表面（すなわち、標識抗体の蛍光）の蛍光のシグナルを同時に測定することができればよい。例えば、６５７ｎｍと７２０ｎｍの波長のレーザーにより測定された電流値の差からビーズの蛍光値を、５８０ｎｍの波長のレーザーで標識抗体の蛍光のシグナルを蛍光強度（ｍｅｄｉａｎ値）としてそれぞれ同時に測定することができる。
【００３５】
ここで、蛍光測定装置としては、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製のＬｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍ、ベクトン・ディッキンソン社製のフローサイトメーター、ベックマン・コールター社製のフローサイトメーター等が挙げられるが、好ましくは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製のＬｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍである。
【００３６】
例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製のＬｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍは、二色のレーザー（赤色レーザー（波長６５７ｎｍ、７２０ｎｍ）と緑色レーザー（波長５８０ｎｍ））を用いる装置であり、まず、赤色レーザーでビーズの直径と色を測定して目的の蛍光ビーズを認識し、次に、緑色レーザーで該蛍光ビーズ上の標識抗体の蛍光のシグナルをｍｅｄｉａｎ値としてそれぞれ測定することができる。
蛍光測定装置により得られたｍｅｄｉａｎ値を用いて下記の式により算出されたＩｎｄｅｘ値を抗体の存在の指標とする。
【数１】
【００３７】
Ｉｎｄｅｘ値が２以上になった場合を陽性とし、Ｉｎｄｅｘ値が陽性の場合に、検出対象である抗体が存在すると判定することができる。
本発明による好ましい態様としては、被検血清中の１種またはそれ以上の抗体を検出する方法であって、
（ｉ−１）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させる工程；
（ｉ−２）生体試料中の細胞を可溶化し、可溶層から抗原抗体複合体を分離する工程；
（ｉｉ−１）前記抗原に対するモノクローナル抗体が固定された蛍光ビーズにて抗原抗体複合物をそれぞれ捕捉した後、蛍光標識抗体を用いて、抗原抗体複合体における抗体を２次的に標識する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ−１）により得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程
を含んでなる方法である。
【００３８】
この方法によれば、（１）検出感度が高く、（２）バックグラウンドが低く、（３）簡便に、迅速に測定することができ、（４）複数の特異性の血小板抗体が混在している場合やＨＬＡ抗体と血小板抗体が混在する場合でも、正確に判定することができ、かつ、（５）交差適合試験に用いることができる
具体的な態様として、本発明は、「検出対象となる複数種の抗体」が輸血における受血者由来であり、「生体試料」が輸血における供血者由来である場合に、交差適合試験として用いることができる。
【００３９】
本発明は、また、「検出対象となる複数種の抗体」が臓器移植における移植患者由来であり、「生体試料」が臓器移植における臓器提供者由来である場合に、交差適合試験の判定方法として用いることができる。
【００４０】
本発明は、さらに、「検出対象となる複数種の抗体」が白血球抗体および血小板抗体が関与している疾患が疑われる被検者由来であり、「生体試料」が被検者由来である場合に、白血球抗体および血小板抗体が関与している疾患またはその発症リスクの判定方法として用いることができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１：モノクローナル抗体が固定された蛍光ビーズの作製
ＨＰＡ−２、ＨＰＡ−１，３，４，６、ＨＰＡ−５、Ｎａｋａ、およびＨＬＡ ｃｌａｓｓＩの各抗原に特異的なモノクローナル抗体として、ＳＺ２（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、Ｐ２（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、ＳＺ２１（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、Ｇｉ９（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、ＦＡ６−１５２（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）、ｗ６／３２（ｗ６／３２は、ｗ６／３２産生ハイブリドーマ細胞を用いてマウスを腹水化し、その腹水から硫安沈殿、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーにより精製し得られたものを使用）をそれぞれ選択した（表１）。ＨＰＡ−１，３，４，６に関しては、ＣＤ４１（ＧＰＩＩｂ）に特異的なモノクローナル抗体のクローンＰ２がＨＰＡ−３に対して反応性が悪いことから、ＣＤ６１（ＧＰＩＩＩａ）に特異的なモノクローナル抗体のクローンＳＺ２１も併せて選択した。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社製）とＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ社製）を選択した。
【表１】
【００４２】
これら選択したモノクローナル抗体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社が推奨する方法（Ｌｕｍｉｎｅｘ社のプロトコール（http://www.luminexcorp.com/uploads/data/Protein Coupling Protocol-June.pdf）参照）に従って、蛍光ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）に固定した。具体的には、８種類の各蛍光ビーズ溶液４００μｌ（５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０）に対して各モノクローナル抗体を８μｇを加えて、Ｌｕｍｉｎｅｘ社の方法により固定を行った。
【００４３】
実施例２：ＭＰＨＡ法の検出限界に希釈したサンプルを用いた検討
ＨＰＡ抗体を含む抗血清６検体、ＨＬＡ抗体を含む抗血清１検体、ＨＰＡ抗体とＨＬＡ抗体の両方を含む１検体について以下のアッセイを行った。
【００４４】
まず、パネル血小板としてＥＤＴＡ採血の血液を３０００ｒｐｍ、５分間遠心して得られた多血小板血漿（ＰＲＰ） ５０μＬを９６プレートに加え、０．５％ ＥＤＴＡ−ＰＢＳにて２回洗浄後、各抗血清（８検体）を２５μＬずつ加えて３７℃、３０分反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄後、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ０．９％ ＮａＣｌ， ０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００； ｐＨ７．４）にて可溶化し、実施例１で作製した８種類の蛍光ビーズおよびＰＥ−抗ヒトＩｇＧ（ワンラムダ社製）を加えて３７℃、３０分反応後、室温（振盪）で１０分間反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳを加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍにて蛍光強度を測定して抗原抗体複合物を検出した。
【００４５】
蛍光強度（Ｍｅｄｉａｎ値）を用いてＩｎｄｅｘ値を下記の式により算出することができる。
【数２】
【００４６】
Ｉｎｄｅｘ値が２以上になった場合を陽性と判定することができる。その結果は、表２に示される通りであった。
【表２】
【００４７】
表２に示すように、いずれのビーズにおいても非特異的なシグナルは得られず、特異的にＨＰＡ抗体及びＨＬＡ抗体を検出することができた。
【００４８】
実施例３：ＭＰＨＡ法の検出限界よりさらに４倍希釈したサンプルを用いた検討
抗ＨＰＡ−５ｂ抗体および抗Ｎａｋａ抗体について、従来法のＭＰＨＡ法における検出限界よりもさらに４倍希釈したものを使用した２検体について、実施例２と同様の方法を用いて、アッセイを行った。その結果を表３に示す。
【表３】
【００４９】
表３に示すように、いずれのビーズにおいても非特異的なシグナルは得られず、特異的にＨＰＡ抗体を検出することができた。また、ＭＰＨＡ法の検出限界より４倍希釈したものにおいても検出が可能であることから最低でも４倍の検出感度を持つことが明らかとなった。
【００５０】
実施例４：ＡＨＧ−ＬＣＴ法の検出限界以下に希釈したサンプルを用いた検討
ＨＬＡ抗体を含む抗３検体（ｓａｍｐｌｅＡはＡ２６、ｓａｍｐｌｅＢはＡ２４、ｓａｍｐｌｅＣはＢ７＋Ｂ２２抗原に対する抗体をそれぞれ含んでいる）について、従来法のＡＨＧ−ＬＣＴ法における検出限界よりもさらに８倍希釈したものを使用して、以下のアッセイを行った。
【００５１】
まず、９６プレートにＴｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌを２００μｌ分注し、ＥＤＴＡ加全血５０μｌを加え、３７℃にて１０分間溶血させた後、１３００ｇ、３分間遠心して得た白血球をパネルとし、０．５％ ＥＤＴＡ−ＰＢＳにて２回洗浄後、各抗血清を２５μＬずつ加えて３７℃、３０分反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄後、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ０．９％ ＮａＣｌ， ０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００； ｐＨ７．４）にて可溶化し、実施例１で作製した３種類の蛍光ビーズおよびＰＥ−抗ヒトＩｇＧを加えて３７℃、３０分反応後、室温（振盪）で１０分間反応させた。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳを加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｓｙｓｔｅｍにて蛍光強度を測定して抗原抗体複合物を検出した。
【００５２】
判定は、実施例２と同様に行った。その結果は表４に示される通りであった。
【表４】
【００５３】
表４に示すように、いずれのビーズにおいても非特異的なシグナルは得られず、特異的にＨＬＡ抗体を検出することができた。また、ＡＨＧ−ＬＣＴ法の検出限界より８倍希釈したものにおいても検出が可能であることから最低でも８倍の検出感度を持つことが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検血清中の１種またはそれ以上の抗体を検出する方法であって、
（ｉ）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させ、抗原抗体複合体を得る工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた抗原抗体複合体と、前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合体の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させ、検出用複合体を得る工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、下記工程を含んでなる、請求項１に記載の方法：
（ｉ−１）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させる工程；および
（ｉ−２）生体試料中の細胞を可溶化し、可溶層から抗原抗体複合体を分離する工程。
【請求項３】
工程（ｉｉ）が、下記工程を含んでなる、請求項１または２に記載の方法：
（ｉｉ−１）前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズにて抗原抗体複合物を捕捉する工程；および
（ｉｉ−２）蛍光標識抗体を用いて、抗原抗体複合体の抗体を２次的に標識する工程。
【請求項４】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程
を更に含んでなる、請求項１〜３項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検出対象となる複数種の抗体が、白血球抗体および／または血小板抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が、血小板細胞または白血球細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血小板輸血または臓器移植に伴う適正の判定に用いられる、請求項１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
白血球抗体または血小板抗体が関与している疾患またはその発症リスクの判定に用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
白血球抗体が関与している疾患が、白血球抗体に起因する血小板輸血不応、輸血関連肺障害白血病、および同種免疫性新生児血小板減少症からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血小板抗体が関与している疾患が、血小板抗体に起因する同種免疫性新生児血小板減少症および血小板減少性紫斑病、血小板輸血不応、輸血後紫斑病、並びに特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
被検血清中の１種またはそれ以上の抗体を検出する方法であって、
（ｉ）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させ、抗原抗体複合体を得る工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた抗原抗体複合体と、前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズと、抗原抗体複合体の抗体と結合可能な蛍光標識抗体とを反応させ、検出用複合体を得る工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、下記工程を含んでなる、請求項１に記載の方法：
（ｉ−１）被検血清と検出対象となる複数種の抗体が認識する抗原を有する生体試料とを反応させる工程；および
（ｉ−２）生体試料中の細胞を可溶化し、可溶層から抗原抗体複合体を分離する工程。
【請求項３】
工程（ｉｉ）が、下記工程を含んでなる、請求項１または２に記載の方法：
（ｉｉ−１）前記抗原に対する抗体が固定された蛍光ビーズにて抗原抗体複合物を捕捉する工程；および
（ｉｉ−２）蛍光標識抗体を用いて、抗原抗体複合体の抗体を２次的に標識する工程。
【請求項４】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により得られた検出用複合体を濃縮、精製する工程
を更に含んでなる、請求項１〜３項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検出対象となる複数種の抗体が、白血球抗体および／または血小板抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が、血小板細胞または白血球細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血小板輸血または臓器移植に伴う適正の判定に用いられる、請求項１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
白血球抗体または血小板抗体が関与している疾患またはその発症リスクの判定に用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
白血球抗体が関与している疾患が、白血球抗体に起因する血小板輸血不応、輸血関連肺障害白血病、および同種免疫性新生児血小板減少症からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血小板抗体が関与している疾患が、血小板抗体に起因する同種免疫性新生児血小板減少症および血小板減少性紫斑病、血小板輸血不応、輸血後紫斑病、並びに特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【公開番号】特開２００９−８００１９（Ｐ２００９−８００１９Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４９７７２（Ｐ２００７−２４９７７２）
【出願日】平成１９年９月２６日（２００７．９．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．研究集会名 第５５回 日本輸血・細胞治療学会総会（２００７年） ２．主催者名 有限責任中間法人日本輸血・細胞治療学会 ３．開催日 平成１９年５月３１日〜６月２日 ４．講演予稿集発刊日 平成１９年４月２５日
【出願人】（０００２３１７２９）日本赤十字社 (7)
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２６日（２００７．９．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．研究集会名 第５５回 日本輸血・細胞治療学会総会（２００７年） ２．主催者名 有限責任中間法人日本輸血・細胞治療学会 ３．開催日 平成１９年５月３１日〜６月２日 ４．講演予稿集発刊日 平成１９年４月２５日
【出願人】（０００２３１７２９）日本赤十字社 (7)
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
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