融合タンパク質、オキシトシン受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、及びスクリーニング用組成物
【課題】オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供する。
【解決手段】オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質が提供される。分子シャペロン活性を有するタンパク質の例として、シャペロニン、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。当該融合タンパク質を用いるオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法、並びに、当該スクリーニング方法に用いられるスクリーニング用組成物も提供される。
【解決手段】オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質が提供される。分子シャペロン活性を有するタンパク質の例として、シャペロニン、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。当該融合タンパク質を用いるオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法、並びに、当該スクリーニング方法に用いられるスクリーニング用組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質、オキシトシン受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、及びスクリーニング用組成物に関する。本発明は、オキシトシン受容体を標的とする新規医薬の開発等に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
神経ペプチドホルモンに分類されるオキシトシン（oxytocin）は、哺乳類の関脳視床下部領域の室傍核といわれる領域の大細胞性神経細胞で主に合成される。視床下部でつくられるオキシトシンは、全長１２５アミノ酸のニューロフィジンと呼ばれる前駆体として合成翻訳された後、プロテアーゼによりプロセスされ、Ｓ−Ｓ結合を有する９アミノ酸からなるペプチドホルモンとして下垂体後葉に運ばれて分泌される。また、オキシトシンは視床下部以外の様々な組織、器官（例えば、子宮上皮、卵巣、精巣、血管内皮、心臓など）で合成分泌されることも知られている（非特許文献１）。オキシトシンは、脊椎動物に広く保存されているメソトシンやバソプレシンなどと呼ばれるホルモン類と近縁で、これらのホルモンファミリーはサメや貝類、タコ、昆虫やミミズなどの下等動物に至る広範囲な動物種に広く保存されている（非特許文献１）。
【０００３】
オキシトシンに対する受容体（オキシトシン受容体）は、Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に属する３８８アミノ酸からなる膜受容体であり、Ｎ末端付近の約４０アミノ酸から成る細胞外領域と、膜貫通部分を含む７カ所の疎水性領域を持つ（非特許文献２）。オキシトシン受容体へのオキシトシンの結合によって、細胞内シグナル伝達経路下流における様々なシグナル因子の活性化などの生体反応が生じることが知られている。オキシトシン受容体は、乳腺胞、子宮平滑筋、脂肪細胞、脊髄、心筋、血管内皮細胞、胎児組織など、様々な組織に分布している。そのため、オキシトシン／オキシトシン受容体系の機能については、分娩時の子宮平滑筋収縮や授乳時の乳腺胞の平滑筋の収縮による乳汁射出をもたらすことが知られている（非特許文献１）。さらにオキシトシンは脳内の特定の受容体発現細胞に働きかけ、それらの下流ニューロンへシグナルを伝搬することで、行動、記憶や脳の生理作用制御に関する様々な反応をもたらすことも知られている（非特許文献１）。
【０００４】
このように、オキシトシン／オキシトシン受容体の関係は、生理的活動と病態のさまざまな局面で重要な役割を演じているため、創薬研究において極めて重要視されている受容体の一つである。すなわち、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物はアンタゴニスト又はアゴニストとしての薬理活性が期待できる。なお、オキシトシン受容体に対するアゴニストとアンタゴニストの結合する位置は同じであるということが報告されている（非特許文献３、４）。
【０００５】
オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法としては、オキシトシン受容体を発現しているラットなどの動物組織をホモジネートし、そのミクロソームを材料とし、ラジオアイソトープでラベルした既知の化合物をトレーサーとして結合実験を行うのが常法である。しかしながら、この方法は非ヒト動物の受容体を用いた評価結果を指標とするものであり、ヒトへの薬理効果を正しく反映しているとは限らない。むしろ近年、非ヒト動物由来の材料を用いたアッセイ法が、必ずしもヒトへの薬理効果を正しく外挿しないことが明らかになりつつある。このため、ヒト由来のオキシトシン受容体を用いたスクリーニングのニーズが高まっている。ところが、ヒト組織を用いて同様の実験を行うことには倫理上の問題があり、実施は事実上困難である。
【０００６】
一方、オキシトシン受容体を遺伝子工学的に発現させ、創薬活動に利用する試みもある。一般には、受容体の遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入・発現させ、パッチクランプ法による細胞内の電位の変化により、受容体に結合するアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングを実施する方法が知られている。しかしながら、これらの方法はハイスループット性に欠けるため、化合物ライブラリーから大規模にスクリーニングすることには不向きである。また、発現量も極めて微量であるため、受容体を精製・回収し、ラジオアイソトープ標識化合物を用いた結合実験に供することもハイスループット性に欠け、実用的ではない。
【０００７】
オキシトシン受容体は、膜タンパク質であるため、他の膜タンパク質と同様に大量に強制発現させた例はこれまでほとんど報告されていない。オキシトシン受容体を、大腸菌を用いてＧＳＴ（glutathione-S-transferase）融合タンパク質として発現させた例はあるが、封入体を形成してしまうためにリガンド結合活性を失っている（非特許文献５）。そのため、ヒト由来のオキシトシン受容体をリガンド結合活性を保持した状態で大量に得るという課題の根本的な解決には至っていない。
【０００８】
膜タンパク質等の難溶性のタンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で発現させる技術として、「タンパク質折り畳み因子」と呼ばれるタンパク質の作用を利用する方法が提案されている。タンパク質折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、酵素的に働く「フォールダーゼ」と非酵素的に働く「分子シャペロン」とに分類することができる。例えば、難溶性の目的タンパク質をタンパク質折り畳み因子との融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で取得する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、この方法の有効性は目的タンパク質の種類によって異なり、オキシトシン受容体のような７箇所の疎水性領域を持つ受容体に対して有効であるか否かは定かでない。
【０００９】
組織などの細胞に発現する膜タンパク質を、界面活性剤などを用いて細胞膜から取り出し、細胞膜類似構造体である脂質二重膜に再構成する方法が提案されている。例えば、KLEINらは、モルモットのオキシトシン受容体を発現している子宮筋組織より、界面活性剤も用いてオキシトシン受容体を可溶化した後に、脂質二重膜に再構成している（非特許文献６）。しかし、膜タンパク質等の難溶性タンパク質が融合タンパク質の一部となっている場合や、分子シャペロンとの共存状態にある場合において、同様の手法で脂質二重膜に再構成できるか否かは定かでない。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット
【非特許文献１】化学と生物，２００７年，第４５巻，第１２号，ｐ８２６−８３３
【非特許文献２】ネイチャー（Nature），２００７年，第３５６巻，ｐ５２６−５２９
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.），２００１年，第２７６巻，ｐ２６９３１−２６９４１
【非特許文献４】ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.），２０００年，第２６７巻，ｐ４２５３−４２６３
【非特許文献５】プログレス・イン・ブレイン・リサーチ（Progress in Brain Research），２００２年，第１３９巻，ｐ１６３−１７７
【非特許文献６】ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.），１９９４年，第２２０巻，ｐ５５９−５６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質である。
【００１３】
また請求項２に記載の発明は、オキシトシン受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質である。
【００１４】
本発明の融合タンパク質は、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなるものである。そして、本発明の融合タンパク質は、受容体としての本質的な活性である「リガンド結合活性」を保持している。本発明の融合タンパク質はリガンド結合活性を有するので、単独分子としてのオキシトシン受容体の代替物質として利用できる。例えば、オキシトシン受容体としてヒト由来のものを採用した融合タンパク質（請求項２）を使用すれば、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質は遺伝子工学的に大量取得が可能であるので、オキシトシン受容体の部分を切り出すことによりオキシトシン受容体を高純度で高収率、かつ、容易に製造することができる。
【００１５】
ここで「リガンド結合活性」とは、天然（native）のオキシトシン受容体が本質的に有する活性を表現したものであり、具体的には「オキシトシンに特異的な結合活性」、「バソトシンに特異的な結合活性」、「オキシトシン受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性」、及び「オキシトシン受容体に対するアンタゴニストに特異的な結合活性」等が例示される。
【００１６】
ここで「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指すものとする。「分子シャペロン活性を有するタンパク質」の代表例はシャペロニン、スモールヒートショックプロテイン、Ｈｓｐ９０等の「分子シャペロン」に属する一群のタンパク質である。ただし、分子シャペロン以外のタンパク質であっても、上記した「分子シャペロン活性」を有するタンパク質であれば、本発明における「分子シャペロン活性を有するタンパク質」に含まれる。
【００１７】
本発明においてオキシトシン受容体に連結されるタンパク質は、「分子シャペロン活性を有するタンパク質」と「そのサブユニット」のいずれかである。前者は分子シャペロン活性を有するタンパク質が単量体である場合、後者は複数のサブユニットからなる複合タンパク質の場合に該当する。
【００１８】
請求項３に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１９】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンを採用したものである。
【００２０】
請求項４に記載の発明は、シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質である。
【００２１】
２個以上のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された人工タンパク質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する。）が知られており、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている（古谷ら，Protein Science, 2005, 14, 341）。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンサブユニット連結体を採用したものである。なお、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、以下、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００２２】
請求項５に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００２３】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と略記する。）はフォールダーゼの一種であり、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。一部のＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性に加えて「分子シャペロン活性」を有することが知られており、本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質として当該ＰＰＩａｓｅを採用したものである。
【００２４】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼがトリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものである構成が推奨される（請求項６）。
【００２５】
請求項７に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してオキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である。
【００２６】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットとオキシトシン受容体とがペプチドリンカーを介して間接的に連結されている。本発明によれば、ペプチドリンカー部分を利用して融合タンパク質に所望の機能を容易に付与することができる。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質である。
【００２８】
かかる構成により、融合タンパク質からオキシトシン受容体を容易に切り出すことができる。
【００２９】
請求項９に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出してオキシトシン受容体を取得することを特徴とするオキシトシン受容体の製造方法である。
【００３０】
本発明はオキシトシン受容体の製造方法に係るものであり、上記した本発明の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出すことを特徴とする。本発明のオキシトシン受容体の製造方法では、遺伝子工学的に大量取得が可能な融合タンパク質を用いるので、オキシトシン受容体を高収率で取得することができる。さらに、融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出す構成を採用したので、製造が容易に行える。
【００３１】
請求項１０に記載の発明は、融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってオキシトシン受容体を切り出すことを特徴とする請求項９に記載のオキシトシン受容体の製造方法である。
【００３２】
かかる構成により、融合タンパク質からオキシトシン受容体をきわめて容易に切り出すことができる。
【００３３】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３４】
本発明は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法にかかるものである。本発明のスクリーニング方法では、オキシトシン受容体ではなく、本発明の融合タンパク質を用いる。上記したように、本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのオキシトシン受容体の代替物質として利用できるものである。本発明のスクリーニング方法では、融合タンパク質としてヒト由来オキシトシン受容体を含むものを使用することができるので、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。その結果、ヒト由来オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３５】
請求項１２に記載の発明は、下記工程：
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したオキシトシン受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法では、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させる。そして、分子シャペロン活性を有するタンパク質とオキシトシン受容体として、本発明の融合タンパク質を切断して遊離させたものを使用する。ここで、被検化合物と接触する遊離のオキシトシン受容体は、溶液中において分子シャペロン活性を有するタンパク質の作用によって正しく折り畳まれた可溶性の状態で存在できる。したがって本発明のスクリーニング方法によれば、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３７】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する構成が推奨される（請求項１３）。
【００３８】
請求項１４に記載の発明は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物である。
【００３９】
本発明はオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング用組成物に係るものであり、本発明の融合タンパク質を含有することを特徴とする。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００４０】
請求項１５に記載の発明は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物である。
【００４１】
本発明のスクリーニング用組成物は、本発明の融合タンパク質を溶液中で切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものであり、分子シャペロン活性を有するタンパク質とオキシトシン受容体とを含有する。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００４２】
請求項１６に記載の発明は、さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のスクリーニング用組成物である。
【００４３】
オキシトシン受容体は生体内において脂質二重膜からなる細胞膜を貫通する形で存在している。したがって、より正確なスクリーニングを行うためには、用いるオキシトシン受容体が細胞膜上に発現している状態により近いものであることが好ましい。そして、本発明のスクリーニング用組成物は、さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有する。かかる構成により、融合タンパク質中または遊離のオキシトシン受容体が、界面活性剤や脂質二重膜との複合体を形成して細胞膜類似構造体として再構成され、細胞膜上に発現している状態により近いものとなる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのオキシトシン受容体の代替物質として利用でき、例えば、オキシトシン受容体としてヒト由来のものを採用することで、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質からオキシトシン受容体の部分を切り出し、界面活性剤や脂質物質で構成される細胞膜類似構造体との複合体とすることで、オキシトシン受容体を高収率かつ容易に製造することができる。
【００４５】
本発明のオキシトシン受容体の製造方法によれば、オキシトシン受容体を高収率かつ容易に取得することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法によれば、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング用組成物によれば、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の融合タンパク質は、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有する。好ましくは、オキシトシン受容体がヒト由来のものである。
【００４９】
分子シャペロン活性を有するタンパク質の例としては、シャペロニン（Ｈｓｐ６０）、スモールヒートショックプロテイン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ９０、等の分子シャペロンに属するタンパク質が挙げられる。好ましくは、シャペロニンが採用される。
【００５０】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。１型シャペロニンの例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明の融合タンパク質に含まれるシャペロニンは、グループ１型及びグループ２型のいずれでもよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニットの少なくとも２個がペプチド結合を介して連結されている。換言すれば、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に「シャペロニンサブユニット連結体」が連結されている。上記したように、シャペロニンサブユニット連結体においても、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンの場合には７個、グループ２型シャペロニンの場合には８又は９個が好ましい。Ｎがこれらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでリング状構造体を形成することができ、単独分子のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００５２】
本発明の融合タンパク質においては、リング構造への自己集合能が維持されている限り、天然型のシャペロニンと同様にアミノ酸変異体等の変異型のシャペロニンも採用することができる。
【００５３】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロンには分類されない「分子シャペロン活性を有するタンパク質」を採用することもできる。好ましくは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを採用する。すなわち、一部のＰＰＩａｓｅは、本来のＰＰＩａｓｅ活性に加えて分子シャペロン活性を有する。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ；トリガーファクター（ＴＦ）タイプＰＰＩａｓｅ（Huang, Protein Sci., 9, 1254-, 2000年）；ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2000年）；ＳｌｙＤタイプＰＰＩａｓｅ（Scholz, Biochemistry, 45, 20-, 2006年）；ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Bose, Science, 274, 1715-, 1996年）；ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Pirkl, J. Mol. Biol., 308, 795-, 2001年）；ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Behrens, EMBO J. 20, 285-, 2001年）、が挙げられる。
【００５４】
このうち、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の融合タンパク質においては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでも採用できるが、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを採用することがより好ましい。
【００５５】
さらに、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸残基を改変したポリペプチドや、これらのＰＰＩａｓｅの一部分を含むポリペプチド等であって、ＰＰＩａｓｅ活性と分子シャペロン活性とを有するポリペプチドも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして採用できる。
【００５６】
上記したように、本発明において「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指す。分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田，バイオサイエンスとインダストリー,５６,５９３−,１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率をもって、検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Horowitz, Methods Mol. Biol., 40, 361-, 1995年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Taguchi, J. Biol. Chem., 269, 8529-, 1994年）等が挙げられる。
【００５７】
好ましい実施形態では、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してオキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されている。特に、ペプチドリンカーがプロテアーゼ認識切断部位を有する実施形態によれば、融合タンパク質に当該のプロテアーゼを作用させることにより、オキシトシン受容体を容易に切り出すことができる。当該プロテアーゼの例としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００５８】
本発明の融合タンパク質は、例えば、分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とオキシトシン受容体をコードする遺伝子とを連結させた融合遺伝子を発現させることにより製造することができる。好ましくは、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で融合遺伝子を発現させる。このときに用いる宿主としては特に限定はないが、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点からバクテリア等の微生物が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００５９】
本発明のオキシトシン受容体の製造方法は、本発明の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出して取得するものである。好ましくは、プロテアーゼ認識切断部位を有するペプチドリンカーを介して分子シャペロン活性を有するタンパク質とオキシトシン受容体とが連結されている融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて、オキシトシン受容体を切り出す。例えば、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーを採用した場合には、融合タンパク質にトロンビンを作用させてトロンビン認識切断部位を切断し、オキシトシン受容体を切り出すことができる。
【００６０】
本発明の化合物のスクリーニング方法の１つの様相では、本発明の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。例えば、非ヒト動物の組織ホモジネートを使用する従来のスクリーニング方法において、組織ホモジネートの代わりに本発明の融合タンパク質を使用することにより、本様相のスクリーニング方法を実施することができる。特に、ヒト由来オキシトシン受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができ、好適である。なお、本様相のスクリーニング方法においては複数種の融合タンパク質を併用してもよく、例えば、「オキシトシン受容体とシャペロニンとの融合タンパク質」と「オキシトシンとＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質」の２種を併用することができる。
【００６１】
本発明のスクリーニング用組成物の１つの様相では、本発明の融合タンパク質を含有する。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、融合タンパク質と被検化合物との結合性を容易に調べることができる。本様相のスクリーニング用組成物は本発明の融合タンパク質を含有しておればよく、その他の成分については特に限定はない。例えば、適宜の緩衝成分や安定化剤を含有していてもよい。組成物の形状についても特に限定はなく、溶液状でもよいし、凍結乾燥品でもよい。
【００６２】
本発明の化合物のスクリーニング方法の他の様相は、２つの工程（１）及び（２）を包含する。工程（１）では、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させる。これにより、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物が得られる。この段階で、遊離したオキシトシン受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる。接触させるための具体的手順としては、例えば、融合タンパク質の切断処理が終了した溶液に被検化合物を添加することが挙げられる。すなわち、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物に被検化合物を添加する。他の例としては、工程（１）開始時の溶液に予め被検化合物を含有させておき、その後、融合タンパク質の切断処理を行うことが挙げられる。すなわち、融合タンパク質と被検化合物とを混合した状態で当該融合タンパク質を切断し、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させる。
【００６３】
そして工程（２）において、工程（１）でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。本様相の化合物のスクリーニング方法においても、ヒト由来オキシトシン受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。なお、本様相のスクリーニング方法においても複数種の融合タンパク質を併用することができる。
【００６４】
好ましい実施形態では、融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する。当該プロテアーゼの例としては、上記したトロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００６５】
本発明のスクリーニング用組成物の他の様相は、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものである。連結部の切断は、例えば、連結部にプロテアーゼ認識切断部位を設けておき、融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させることにより行うことができる。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下における被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を容易に調べることができる。なお、本様相のスクリーニング用組成物は、適宜の緩衝成分や安定化剤をさらに含有していてもよいし、組成物の形状は溶液状でも凍結乾燥品でもよい。
【００６６】
本発明のスクリーニング用組成物の好ましい実施形態では、さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有する。界面活性剤としては特に限定はなく、イオン性、非イオン性のいずれでもよい。脂質二重膜の例としては、人工的に作成したリン脂質二重膜が挙げられる。また、本発明で用いられる脂質二重膜の形態としては平面構造を有する二重膜の他、ベシクル化したリポソームなどが挙げられる。脂質二重膜を作製する際の具体的な成分としては、天然脂質、リン脂質、コレステロール等のステロール類、並びに、これらに官能基を付加した化学合成脂質、等が挙げられる。
【００６７】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６８】
（１）超好熱性古細菌Thermococcus sp. KS-1由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの１つであるＴｃＦＫＢＰ１８（Ideno, Biochem. J., 357, 465-, 2001年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Iida, Gene, 222, 249-, 1998年）を鋳型とし、ＴｃＦｕ―Ｆ１（配列番号１）とＴｃＦｕ―Ｒ２（配列番号２）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。
【００６９】
さらに、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡ（ペプチドリンカーサイト）、並びに、外来遺伝子を挿入するための種々の制限酵素サイト（クローニングサイト）を含むオリゴＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片とをｐＥＴ２１ｄベクター（メルク社）の制限酵素サイトに導入した。この際、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片が上流、ペプチドリンカーサイトとクローニングサイトが下流に位置するように導入した。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３とした（図１）。図１中、「Ｐ」はプロモーター、「Ｌａｃ」はラックオペレーター、「ＲＢＳ」はリボゾーム結合部位、「ＴｃＦＫＢＰ１８」はＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子、「Ｔｈｒｂｉｎ」はトロンビン認識切断部位をコードする配列、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列、「Ｔ」はターミネーターを表す。そして、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のクローニングサイトにオキシトシン受容体遺伝子を挿入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７０】
（２）大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
ＮＣＢＩコード：NP_414970に登録されている塩基配列情報を元に、プライマーＴＦ−Ｆ１（配列番号４）とＴＦ−Ｒ１（配列番号５）を設計した。大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＴＦ−Ｆ１とＴＦ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号６）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。
【００７１】
ＴＦ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片が挿入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターを制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社）と制限酵素ＳｐｅＩ(タカラバイオ社)で処理し、ＴＦ遺伝子を得た。上記（１）で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３をＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理してＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子の部分を除いた後、得られたＴＦ遺伝子を挿入し、ＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドＴＦｆ３を構築した。ＴＦｆ３は、（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった構成を有する。すなわち、ＴＦｆ３のクローニングサイトにオキシトシン受容体遺伝子を挿入することにより、ＴＦとオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７２】
（３）大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬの７回連結体と融合するための発現ベクター構築
大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣＰＮ−Ｆ１（配列番号７）とＣＰＮ−Ｒ１（配列番号８）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号９）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入された。このＤＮＡ断片７個を直列に連結し、ＧｒｏＥＬ７回連結体遺伝子（（ＧｒｏＥ）７遺伝子）を作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、（ＧｒｏＥ）７遺伝子と他の必要な配列を導入し、発現ベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈを構築した（図２）。図２中、「Ｐ」はｔｒｃプロモーター、「ｇｒｏＥＬ」はＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「（ＧｒｏＥ）７」は（ＧｒｏＥ）７遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーをコードする配列（ペプチドリンカーサイト）、「ＣＳ」はクローニングサイト、「Ｅｋ」はエンテロキナーゼ翻訳サイト、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列（Ｈｉｓペプチドサイト）、「Ｔ」はターミネーターを示す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈは、ｔｒｃプロモーターの下流に（ＧｒｏＥ）７遺伝子、ペプチドリンカーサイト（トロンビン切断認識部位をコードする配列を有する）、クローニングサイト、エンテロキナーゼ翻訳サイト、Ｈｉｓペプチドサイト、終止コドン、及びターミネーターが配置された構成を有している。そして、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈのクローニングサイトにオキシトシン受容体遺伝子を挿入することにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体とオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７３】
（４）ヒトオキシトシン受容体遺伝子の調製
ヒト由来オキシトシン受容体のクローン（Missouri S&T cDNA Resource Center, Clone ID OXTR000000）を鋳型とし、ＯＴＲ-Ｆ１（配列番号１０）とＯＴＲ-Ｒ１（配列番号１１）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトオキシトシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１２）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。得られたベクターをｐＴ７−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２３とした。
【００７４】
（５）融合タンパク質発現ベクターの構築
上記（４）で構築したｐＴ７−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２３をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理し、ヒトオキシトシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴｃＦＫＢＰ１８とヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現するベクターｐＴＦＫ−Ｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃３を構築した。同様に、このＤＮＡ断片を（２）で構築したＴＦｆ３のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴＦとヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現するベクターＴＦｆ３−ＴＦｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃１を構築した。
【００７５】
上記（４）で構築したｐＴ７−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）と制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ社）で処理し、ヒトオキシトシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（３）で構築したｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２ＨのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、（ＧｒｏＥＬ）７とヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃８を構築した。
【００７６】
（６）融合タンパク質の製造
上記（５）で構築した４種のベクターを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＲＡＲＥ株に導入し、４種の形質転換体を得た。２リットル容の三角フラスコに７００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、６ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７．５）を仕込み、各形質転換体を２〜３白金耳接種した。ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２を導入された形質転換体については、さらに培地に０．２％グルコースを添加して用いた。２５℃で４０時間、１１０ｒｐｍで回転培養した後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を回収した。得られた菌体を１％プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）及び１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０ｍＬに懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。凍結した菌体懸濁液を融解して、超音波破砕後、超遠心分離に供し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。
【００７７】
ｐＴＦＫ−Ｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃３、ＴＦｆ３−ＴＦｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃１、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃８が導入された形質転換体由来の各上清（可溶性画分）をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードした。５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより各融合タンパク質を溶出し、融合タンパク質を含む各画分を濃縮した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質が２．７ｍｇ、ＴＦとの融合タンパク質が３．１ｍｇ、シャペロニン７連結体との融合タンパク質が５．２ｍｇそれぞれ回収することができた。
【００７８】
表１に本実施例で用いた各プライマーの塩基配列と制限酵素サイトを示した。
【表１】
【実施例２】
【００７９】
オキシトシン受容体の製造とスクリーニング用組成物の調製
実施例１の（６）で精製したｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈとヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質をトロンビンにて２２℃で一昼夜処理し、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈとヒトオキシトシン受容体との間のトロンビン認識切断部位を切断した。これにより、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈとヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質からヒトオキシトシン受容体を切り出し、取得することができた。
【００８０】
さらに、トロンビンにて一昼夜処理した上記反応液を、そのままＴｃＦＫＢＰ１８とヒトオキシトシン受容体とを含有するスクリーニング用組成物とした。
【実施例３】
【００８１】
脂質二重膜をさらに含有するスクリーニング用組成物の調製
（１）脂質二重膜構造粒子（リポソーム）溶液の作製
混合脂質６ｍｇ（卵黄レシチン（日本油脂社）：cholesterol（ナカライテスク社）：cholesteryl hemisuccinate（シグマ社）＝６５：１５：２０（質量比））をナス型フラスコに秤量し、クロロホルム（和光純薬工業社）で溶解した。エバポレーターを用いてクロロホルムを除いた後、水を３７５μＬ添加し、激しく混和した。その溶液を超音波装置で超音波処理した後、孔径０．２μｍ、０．１μｍ、０.０８μｍの各ポリカーボネートフィルター（ワットマン）に通した。
【００８２】
（２）オキシトシン受容体の脂質二重膜への再構成
（１）で調製した脂質二重膜構造粒子（リポソーム）溶液３７５μＬに、１０％のＣＨＡＰＳＯ（同仁化学社）溶液を１０４μＬ添加して混合し、室温にて５分程度放置した。溶液を４℃に冷却したのち、水を３５１μＬ添加した。この溶液に対して、ＣＨＡＰＳＯ濃度が終濃度０．８％となるように調製した実施例２の組成物２００μＬを加えた。そして、Bio-Beads SM Adsorbents（Bio-Rad Laboratories, Inc）を、０．１８ｇ添加した。４℃にて２時間混合した後、再度０．１８ｇのBio-Beads SM Adsorbentsを加えて４℃にて１時間混合し、さらに、０．１８ｇのBio-Beads SM Adsorbentsを加え１時間混合した。Bio-Beads SM Adsorbentsと溶液を分離し、脂質二重膜に再構成されたオキシトシン受容体を含有する組成物を得た。
【実施例４】
【００８３】
ヒトオキシトシン受容体のリガンド結合特異性評価
実施例１の（６）で調製した融合タンパク質を含む各画分（３種）、並びに、実施例３で調製した脂質二重膜に再構成したヒトオキシトシン受容体とＧｒｏＥＬの７回連結体とを含む溶液（スクリーニング用組成物）の計４種の試料を、以下の手順によるヒトオキシトシン受容体のリガンド結合特異性評価に供した。２ ｍＭＣａＣｌ2、及び、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にヒトオキシトシン受容体約５０μｇ相当分の試料を添加し、オキシトシン受容体に対するアンタゴニスト[125I]-Ornithine Vasotocin (d(CH2)5[Tyr(Me)2,Thr4,Tyr-NH2(9)]OVT)（Perkinelmer, Inc）をホットトレーサー、オキシトシン受容体に対するアゴニストであるコールドのoxytocinを置換体とするリガンド結合特異性評価を行った。反応条件は２５℃、６０分間とした。反応終了後、セルハーベスターにより膜受容体をあらかじめポリエチレンｓイミン処理しておいたガラスフィルター上に吸着させ、フィルターを３ｍＬの上記緩衝液で３回洗浄した。フィルターを測定用バイアルに移し、液体シンチレーター（Atomlight、登録商標）５ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンターにて測定（２分間）した。その結果、ＴＦと融合させた受容体では１１２ｄｐｍ、ＴｃＦＫＢＰ１８と融合させた受容体では８３７ｄｐｍ、（ＧｒｏＥＬ）７と融合させたヒトオキシトシン受容体では４３３３ｄｐｍ、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈよりオキシトシン受容体を切り出して脂質二重膜に再構成した受容体では３４８ｄｐｍとそれぞれ特異的な結合活性が確認された。
【００８４】
以上より、ＴｃＦＫＢＰ１８、ＴＦ、（ＧｒｏＥＬ）７とヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質、および脂質二重膜構造に再構成したオキシトシン受容体は、オキシトシン受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性（リガンド結合活性）を有していた。これにより、これらの融合タンパク質を用いてヒトオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３の主要部の構成を示す説明図である。
【図２】ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈの主要部の構成を示す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質、オキシトシン受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、及びスクリーニング用組成物に関する。本発明は、オキシトシン受容体を標的とする新規医薬の開発等に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
神経ペプチドホルモンに分類されるオキシトシン（oxytocin）は、哺乳類の関脳視床下部領域の室傍核といわれる領域の大細胞性神経細胞で主に合成される。視床下部でつくられるオキシトシンは、全長１２５アミノ酸のニューロフィジンと呼ばれる前駆体として合成翻訳された後、プロテアーゼによりプロセスされ、Ｓ−Ｓ結合を有する９アミノ酸からなるペプチドホルモンとして下垂体後葉に運ばれて分泌される。また、オキシトシンは視床下部以外の様々な組織、器官（例えば、子宮上皮、卵巣、精巣、血管内皮、心臓など）で合成分泌されることも知られている（非特許文献１）。オキシトシンは、脊椎動物に広く保存されているメソトシンやバソプレシンなどと呼ばれるホルモン類と近縁で、これらのホルモンファミリーはサメや貝類、タコ、昆虫やミミズなどの下等動物に至る広範囲な動物種に広く保存されている（非特許文献１）。
【０００３】
オキシトシンに対する受容体（オキシトシン受容体）は、Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に属する３８８アミノ酸からなる膜受容体であり、Ｎ末端付近の約４０アミノ酸から成る細胞外領域と、膜貫通部分を含む７カ所の疎水性領域を持つ（非特許文献２）。オキシトシン受容体へのオキシトシンの結合によって、細胞内シグナル伝達経路下流における様々なシグナル因子の活性化などの生体反応が生じることが知られている。オキシトシン受容体は、乳腺胞、子宮平滑筋、脂肪細胞、脊髄、心筋、血管内皮細胞、胎児組織など、様々な組織に分布している。そのため、オキシトシン／オキシトシン受容体系の機能については、分娩時の子宮平滑筋収縮や授乳時の乳腺胞の平滑筋の収縮による乳汁射出をもたらすことが知られている（非特許文献１）。さらにオキシトシンは脳内の特定の受容体発現細胞に働きかけ、それらの下流ニューロンへシグナルを伝搬することで、行動、記憶や脳の生理作用制御に関する様々な反応をもたらすことも知られている（非特許文献１）。
【０００４】
このように、オキシトシン／オキシトシン受容体の関係は、生理的活動と病態のさまざまな局面で重要な役割を演じているため、創薬研究において極めて重要視されている受容体の一つである。すなわち、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物はアンタゴニスト又はアゴニストとしての薬理活性が期待できる。なお、オキシトシン受容体に対するアゴニストとアンタゴニストの結合する位置は同じであるということが報告されている（非特許文献３、４）。
【０００５】
オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法としては、オキシトシン受容体を発現しているラットなどの動物組織をホモジネートし、そのミクロソームを材料とし、ラジオアイソトープでラベルした既知の化合物をトレーサーとして結合実験を行うのが常法である。しかしながら、この方法は非ヒト動物の受容体を用いた評価結果を指標とするものであり、ヒトへの薬理効果を正しく反映しているとは限らない。むしろ近年、非ヒト動物由来の材料を用いたアッセイ法が、必ずしもヒトへの薬理効果を正しく外挿しないことが明らかになりつつある。このため、ヒト由来のオキシトシン受容体を用いたスクリーニングのニーズが高まっている。ところが、ヒト組織を用いて同様の実験を行うことには倫理上の問題があり、実施は事実上困難である。
【０００６】
一方、オキシトシン受容体を遺伝子工学的に発現させ、創薬活動に利用する試みもある。一般には、受容体の遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入・発現させ、パッチクランプ法による細胞内の電位の変化により、受容体に結合するアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングを実施する方法が知られている。しかしながら、これらの方法はハイスループット性に欠けるため、化合物ライブラリーから大規模にスクリーニングすることには不向きである。また、発現量も極めて微量であるため、受容体を精製・回収し、ラジオアイソトープ標識化合物を用いた結合実験に供することもハイスループット性に欠け、実用的ではない。
【０００７】
オキシトシン受容体は、膜タンパク質であるため、他の膜タンパク質と同様に大量に強制発現させた例はこれまでほとんど報告されていない。オキシトシン受容体を、大腸菌を用いてＧＳＴ（glutathione-S-transferase）融合タンパク質として発現させた例はあるが、封入体を形成してしまうためにリガンド結合活性を失っている（非特許文献５）。そのため、ヒト由来のオキシトシン受容体をリガンド結合活性を保持した状態で大量に得るという課題の根本的な解決には至っていない。
【０００８】
膜タンパク質等の難溶性のタンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で発現させる技術として、「タンパク質折り畳み因子」と呼ばれるタンパク質の作用を利用する方法が提案されている。タンパク質折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、酵素的に働く「フォールダーゼ」と非酵素的に働く「分子シャペロン」とに分類することができる。例えば、難溶性の目的タンパク質をタンパク質折り畳み因子との融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で取得する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、この方法の有効性は目的タンパク質の種類によって異なり、オキシトシン受容体のような７箇所の疎水性領域を持つ受容体に対して有効であるか否かは定かでない。
【０００９】
組織などの細胞に発現する膜タンパク質を、界面活性剤などを用いて細胞膜から取り出し、細胞膜類似構造体である脂質二重膜に再構成する方法が提案されている。例えば、KLEINらは、モルモットのオキシトシン受容体を発現している子宮筋組織より、界面活性剤も用いてオキシトシン受容体を可溶化した後に、脂質二重膜に再構成している（非特許文献６）。しかし、膜タンパク質等の難溶性タンパク質が融合タンパク質の一部となっている場合や、分子シャペロンとの共存状態にある場合において、同様の手法で脂質二重膜に再構成できるか否かは定かでない。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット
【非特許文献１】化学と生物，２００７年，第４５巻，第１２号，ｐ８２６−８３３
【非特許文献２】ネイチャー（Nature），２００７年，第３５６巻，ｐ５２６−５２９
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.），２００１年，第２７６巻，ｐ２６９３１−２６９４１
【非特許文献４】ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.），２０００年，第２６７巻，ｐ４２５３−４２６３
【非特許文献５】プログレス・イン・ブレイン・リサーチ（Progress in Brain Research），２００２年，第１３９巻，ｐ１６３−１７７
【非特許文献６】ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.），１９９４年，第２２０巻，ｐ５５９−５６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質である。
【００１３】
また請求項２に記載の発明は、オキシトシン受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質である。
【００１４】
本発明の融合タンパク質は、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなるものである。そして、本発明の融合タンパク質は、受容体としての本質的な活性である「リガンド結合活性」を保持している。本発明の融合タンパク質はリガンド結合活性を有するので、単独分子としてのオキシトシン受容体の代替物質として利用できる。例えば、オキシトシン受容体としてヒト由来のものを採用した融合タンパク質（請求項２）を使用すれば、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質は遺伝子工学的に大量取得が可能であるので、オキシトシン受容体の部分を切り出すことによりオキシトシン受容体を高純度で高収率、かつ、容易に製造することができる。
【００１５】
ここで「リガンド結合活性」とは、天然（native）のオキシトシン受容体が本質的に有する活性を表現したものであり、具体的には「オキシトシンに特異的な結合活性」、「バソトシンに特異的な結合活性」、「オキシトシン受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性」、及び「オキシトシン受容体に対するアンタゴニストに特異的な結合活性」等が例示される。
【００１６】
ここで「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指すものとする。「分子シャペロン活性を有するタンパク質」の代表例はシャペロニン、スモールヒートショックプロテイン、Ｈｓｐ９０等の「分子シャペロン」に属する一群のタンパク質である。ただし、分子シャペロン以外のタンパク質であっても、上記した「分子シャペロン活性」を有するタンパク質であれば、本発明における「分子シャペロン活性を有するタンパク質」に含まれる。
【００１７】
本発明においてオキシトシン受容体に連結されるタンパク質は、「分子シャペロン活性を有するタンパク質」と「そのサブユニット」のいずれかである。前者は分子シャペロン活性を有するタンパク質が単量体である場合、後者は複数のサブユニットからなる複合タンパク質の場合に該当する。
【００１８】
請求項３に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１９】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンを採用したものである。
【００２０】
請求項４に記載の発明は、シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質である。
【００２１】
２個以上のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された人工タンパク質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する。）が知られており、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている（古谷ら，Protein Science, 2005, 14, 341）。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンサブユニット連結体を採用したものである。なお、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、以下、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００２２】
請求項５に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００２３】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と略記する。）はフォールダーゼの一種であり、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。一部のＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性に加えて「分子シャペロン活性」を有することが知られており、本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質として当該ＰＰＩａｓｅを採用したものである。
【００２４】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼがトリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものである構成が推奨される（請求項６）。
【００２５】
請求項７に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してオキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である。
【００２６】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットとオキシトシン受容体とがペプチドリンカーを介して間接的に連結されている。本発明によれば、ペプチドリンカー部分を利用して融合タンパク質に所望の機能を容易に付与することができる。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質である。
【００２８】
かかる構成により、融合タンパク質からオキシトシン受容体を容易に切り出すことができる。
【００２９】
請求項９に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出してオキシトシン受容体を取得することを特徴とするオキシトシン受容体の製造方法である。
【００３０】
本発明はオキシトシン受容体の製造方法に係るものであり、上記した本発明の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出すことを特徴とする。本発明のオキシトシン受容体の製造方法では、遺伝子工学的に大量取得が可能な融合タンパク質を用いるので、オキシトシン受容体を高収率で取得することができる。さらに、融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出す構成を採用したので、製造が容易に行える。
【００３１】
請求項１０に記載の発明は、融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってオキシトシン受容体を切り出すことを特徴とする請求項９に記載のオキシトシン受容体の製造方法である。
【００３２】
かかる構成により、融合タンパク質からオキシトシン受容体をきわめて容易に切り出すことができる。
【００３３】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３４】
本発明は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法にかかるものである。本発明のスクリーニング方法では、オキシトシン受容体ではなく、本発明の融合タンパク質を用いる。上記したように、本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのオキシトシン受容体の代替物質として利用できるものである。本発明のスクリーニング方法では、融合タンパク質としてヒト由来オキシトシン受容体を含むものを使用することができるので、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。その結果、ヒト由来オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３５】
請求項１２に記載の発明は、下記工程：
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したオキシトシン受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法では、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させる。そして、分子シャペロン活性を有するタンパク質とオキシトシン受容体として、本発明の融合タンパク質を切断して遊離させたものを使用する。ここで、被検化合物と接触する遊離のオキシトシン受容体は、溶液中において分子シャペロン活性を有するタンパク質の作用によって正しく折り畳まれた可溶性の状態で存在できる。したがって本発明のスクリーニング方法によれば、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３７】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する構成が推奨される（請求項１３）。
【００３８】
請求項１４に記載の発明は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物である。
【００３９】
本発明はオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング用組成物に係るものであり、本発明の融合タンパク質を含有することを特徴とする。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００４０】
請求項１５に記載の発明は、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物である。
【００４１】
本発明のスクリーニング用組成物は、本発明の融合タンパク質を溶液中で切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものであり、分子シャペロン活性を有するタンパク質とオキシトシン受容体とを含有する。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００４２】
請求項１６に記載の発明は、さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のスクリーニング用組成物である。
【００４３】
オキシトシン受容体は生体内において脂質二重膜からなる細胞膜を貫通する形で存在している。したがって、より正確なスクリーニングを行うためには、用いるオキシトシン受容体が細胞膜上に発現している状態により近いものであることが好ましい。そして、本発明のスクリーニング用組成物は、さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有する。かかる構成により、融合タンパク質中または遊離のオキシトシン受容体が、界面活性剤や脂質二重膜との複合体を形成して細胞膜類似構造体として再構成され、細胞膜上に発現している状態により近いものとなる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのオキシトシン受容体の代替物質として利用でき、例えば、オキシトシン受容体としてヒト由来のものを採用することで、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質からオキシトシン受容体の部分を切り出し、界面活性剤や脂質物質で構成される細胞膜類似構造体との複合体とすることで、オキシトシン受容体を高収率かつ容易に製造することができる。
【００４５】
本発明のオキシトシン受容体の製造方法によれば、オキシトシン受容体を高収率かつ容易に取得することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法によれば、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング用組成物によれば、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の融合タンパク質は、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有する。好ましくは、オキシトシン受容体がヒト由来のものである。
【００４９】
分子シャペロン活性を有するタンパク質の例としては、シャペロニン（Ｈｓｐ６０）、スモールヒートショックプロテイン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ９０、等の分子シャペロンに属するタンパク質が挙げられる。好ましくは、シャペロニンが採用される。
【００５０】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。１型シャペロニンの例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明の融合タンパク質に含まれるシャペロニンは、グループ１型及びグループ２型のいずれでもよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニットの少なくとも２個がペプチド結合を介して連結されている。換言すれば、オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に「シャペロニンサブユニット連結体」が連結されている。上記したように、シャペロニンサブユニット連結体においても、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンの場合には７個、グループ２型シャペロニンの場合には８又は９個が好ましい。Ｎがこれらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでリング状構造体を形成することができ、単独分子のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００５２】
本発明の融合タンパク質においては、リング構造への自己集合能が維持されている限り、天然型のシャペロニンと同様にアミノ酸変異体等の変異型のシャペロニンも採用することができる。
【００５３】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロンには分類されない「分子シャペロン活性を有するタンパク質」を採用することもできる。好ましくは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを採用する。すなわち、一部のＰＰＩａｓｅは、本来のＰＰＩａｓｅ活性に加えて分子シャペロン活性を有する。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ；トリガーファクター（ＴＦ）タイプＰＰＩａｓｅ（Huang, Protein Sci., 9, 1254-, 2000年）；ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2000年）；ＳｌｙＤタイプＰＰＩａｓｅ（Scholz, Biochemistry, 45, 20-, 2006年）；ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Bose, Science, 274, 1715-, 1996年）；ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Pirkl, J. Mol. Biol., 308, 795-, 2001年）；ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Behrens, EMBO J. 20, 285-, 2001年）、が挙げられる。
【００５４】
このうち、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の融合タンパク質においては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでも採用できるが、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを採用することがより好ましい。
【００５５】
さらに、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸残基を改変したポリペプチドや、これらのＰＰＩａｓｅの一部分を含むポリペプチド等であって、ＰＰＩａｓｅ活性と分子シャペロン活性とを有するポリペプチドも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして採用できる。
【００５６】
上記したように、本発明において「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指す。分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田，バイオサイエンスとインダストリー,５６,５９３−,１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率をもって、検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Horowitz, Methods Mol. Biol., 40, 361-, 1995年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Taguchi, J. Biol. Chem., 269, 8529-, 1994年）等が挙げられる。
【００５７】
好ましい実施形態では、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してオキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されている。特に、ペプチドリンカーがプロテアーゼ認識切断部位を有する実施形態によれば、融合タンパク質に当該のプロテアーゼを作用させることにより、オキシトシン受容体を容易に切り出すことができる。当該プロテアーゼの例としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００５８】
本発明の融合タンパク質は、例えば、分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とオキシトシン受容体をコードする遺伝子とを連結させた融合遺伝子を発現させることにより製造することができる。好ましくは、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で融合遺伝子を発現させる。このときに用いる宿主としては特に限定はないが、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点からバクテリア等の微生物が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００５９】
本発明のオキシトシン受容体の製造方法は、本発明の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出して取得するものである。好ましくは、プロテアーゼ認識切断部位を有するペプチドリンカーを介して分子シャペロン活性を有するタンパク質とオキシトシン受容体とが連結されている融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて、オキシトシン受容体を切り出す。例えば、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーを採用した場合には、融合タンパク質にトロンビンを作用させてトロンビン認識切断部位を切断し、オキシトシン受容体を切り出すことができる。
【００６０】
本発明の化合物のスクリーニング方法の１つの様相では、本発明の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。例えば、非ヒト動物の組織ホモジネートを使用する従来のスクリーニング方法において、組織ホモジネートの代わりに本発明の融合タンパク質を使用することにより、本様相のスクリーニング方法を実施することができる。特に、ヒト由来オキシトシン受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができ、好適である。なお、本様相のスクリーニング方法においては複数種の融合タンパク質を併用してもよく、例えば、「オキシトシン受容体とシャペロニンとの融合タンパク質」と「オキシトシンとＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質」の２種を併用することができる。
【００６１】
本発明のスクリーニング用組成物の１つの様相では、本発明の融合タンパク質を含有する。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、融合タンパク質と被検化合物との結合性を容易に調べることができる。本様相のスクリーニング用組成物は本発明の融合タンパク質を含有しておればよく、その他の成分については特に限定はない。例えば、適宜の緩衝成分や安定化剤を含有していてもよい。組成物の形状についても特に限定はなく、溶液状でもよいし、凍結乾燥品でもよい。
【００６２】
本発明の化合物のスクリーニング方法の他の様相は、２つの工程（１）及び（２）を包含する。工程（１）では、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させる。これにより、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物が得られる。この段階で、遊離したオキシトシン受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる。接触させるための具体的手順としては、例えば、融合タンパク質の切断処理が終了した溶液に被検化合物を添加することが挙げられる。すなわち、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物に被検化合物を添加する。他の例としては、工程（１）開始時の溶液に予め被検化合物を含有させておき、その後、融合タンパク質の切断処理を行うことが挙げられる。すなわち、融合タンパク質と被検化合物とを混合した状態で当該融合タンパク質を切断し、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させる。
【００６３】
そして工程（２）において、工程（１）でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。本様相の化合物のスクリーニング方法においても、ヒト由来オキシトシン受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来オキシトシン受容体に対するスクリーニングを行うことができる。なお、本様相のスクリーニング方法においても複数種の融合タンパク質を併用することができる。
【００６４】
好ましい実施形態では、融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する。当該プロテアーゼの例としては、上記したトロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００６５】
本発明のスクリーニング用組成物の他の様相は、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものである。連結部の切断は、例えば、連結部にプロテアーゼ認識切断部位を設けておき、融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させることにより行うことができる。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下における被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を容易に調べることができる。なお、本様相のスクリーニング用組成物は、適宜の緩衝成分や安定化剤をさらに含有していてもよいし、組成物の形状は溶液状でも凍結乾燥品でもよい。
【００６６】
本発明のスクリーニング用組成物の好ましい実施形態では、さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有する。界面活性剤としては特に限定はなく、イオン性、非イオン性のいずれでもよい。脂質二重膜の例としては、人工的に作成したリン脂質二重膜が挙げられる。また、本発明で用いられる脂質二重膜の形態としては平面構造を有する二重膜の他、ベシクル化したリポソームなどが挙げられる。脂質二重膜を作製する際の具体的な成分としては、天然脂質、リン脂質、コレステロール等のステロール類、並びに、これらに官能基を付加した化学合成脂質、等が挙げられる。
【００６７】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６８】
（１）超好熱性古細菌Thermococcus sp. KS-1由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの１つであるＴｃＦＫＢＰ１８（Ideno, Biochem. J., 357, 465-, 2001年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Iida, Gene, 222, 249-, 1998年）を鋳型とし、ＴｃＦｕ―Ｆ１（配列番号１）とＴｃＦｕ―Ｒ２（配列番号２）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。
【００６９】
さらに、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡ（ペプチドリンカーサイト）、並びに、外来遺伝子を挿入するための種々の制限酵素サイト（クローニングサイト）を含むオリゴＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片とをｐＥＴ２１ｄベクター（メルク社）の制限酵素サイトに導入した。この際、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片が上流、ペプチドリンカーサイトとクローニングサイトが下流に位置するように導入した。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３とした（図１）。図１中、「Ｐ」はプロモーター、「Ｌａｃ」はラックオペレーター、「ＲＢＳ」はリボゾーム結合部位、「ＴｃＦＫＢＰ１８」はＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子、「Ｔｈｒｂｉｎ」はトロンビン認識切断部位をコードする配列、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列、「Ｔ」はターミネーターを表す。そして、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のクローニングサイトにオキシトシン受容体遺伝子を挿入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７０】
（２）大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
ＮＣＢＩコード：NP_414970に登録されている塩基配列情報を元に、プライマーＴＦ−Ｆ１（配列番号４）とＴＦ−Ｒ１（配列番号５）を設計した。大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＴＦ−Ｆ１とＴＦ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号６）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。
【００７１】
ＴＦ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片が挿入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターを制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社）と制限酵素ＳｐｅＩ(タカラバイオ社)で処理し、ＴＦ遺伝子を得た。上記（１）で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３をＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理してＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子の部分を除いた後、得られたＴＦ遺伝子を挿入し、ＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドＴＦｆ３を構築した。ＴＦｆ３は、（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった構成を有する。すなわち、ＴＦｆ３のクローニングサイトにオキシトシン受容体遺伝子を挿入することにより、ＴＦとオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７２】
（３）大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬの７回連結体と融合するための発現ベクター構築
大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣＰＮ−Ｆ１（配列番号７）とＣＰＮ−Ｒ１（配列番号８）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号９）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入された。このＤＮＡ断片７個を直列に連結し、ＧｒｏＥＬ７回連結体遺伝子（（ＧｒｏＥ）７遺伝子）を作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、（ＧｒｏＥ）７遺伝子と他の必要な配列を導入し、発現ベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈを構築した（図２）。図２中、「Ｐ」はｔｒｃプロモーター、「ｇｒｏＥＬ」はＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「（ＧｒｏＥ）７」は（ＧｒｏＥ）７遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーをコードする配列（ペプチドリンカーサイト）、「ＣＳ」はクローニングサイト、「Ｅｋ」はエンテロキナーゼ翻訳サイト、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列（Ｈｉｓペプチドサイト）、「Ｔ」はターミネーターを示す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈは、ｔｒｃプロモーターの下流に（ＧｒｏＥ）７遺伝子、ペプチドリンカーサイト（トロンビン切断認識部位をコードする配列を有する）、クローニングサイト、エンテロキナーゼ翻訳サイト、Ｈｉｓペプチドサイト、終止コドン、及びターミネーターが配置された構成を有している。そして、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈのクローニングサイトにオキシトシン受容体遺伝子を挿入することにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体とオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７３】
（４）ヒトオキシトシン受容体遺伝子の調製
ヒト由来オキシトシン受容体のクローン（Missouri S&T cDNA Resource Center, Clone ID OXTR000000）を鋳型とし、ＯＴＲ-Ｆ１（配列番号１０）とＯＴＲ-Ｒ１（配列番号１１）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトオキシトシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１２）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。得られたベクターをｐＴ７−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２３とした。
【００７４】
（５）融合タンパク質発現ベクターの構築
上記（４）で構築したｐＴ７−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２３をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理し、ヒトオキシトシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴｃＦＫＢＰ１８とヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現するベクターｐＴＦＫ−Ｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃３を構築した。同様に、このＤＮＡ断片を（２）で構築したＴＦｆ３のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴＦとヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現するベクターＴＦｆ３−ＴＦｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃１を構築した。
【００７５】
上記（４）で構築したｐＴ７−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）と制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ社）で処理し、ヒトオキシトシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（３）で構築したｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２ＨのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、（ＧｒｏＥＬ）７とヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃８を構築した。
【００７６】
（６）融合タンパク質の製造
上記（５）で構築した４種のベクターを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＲＡＲＥ株に導入し、４種の形質転換体を得た。２リットル容の三角フラスコに７００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、６ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７．５）を仕込み、各形質転換体を２〜３白金耳接種した。ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃２を導入された形質転換体については、さらに培地に０．２％グルコースを添加して用いた。２５℃で４０時間、１１０ｒｐｍで回転培養した後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を回収した。得られた菌体を１％プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）及び１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０ｍＬに懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。凍結した菌体懸濁液を融解して、超音波破砕後、超遠心分離に供し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。
【００７７】
ｐＴＦＫ−Ｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃３、ＴＦｆ３−ＴＦｆ３−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃１、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ＃８が導入された形質転換体由来の各上清（可溶性画分）をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードした。５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより各融合タンパク質を溶出し、融合タンパク質を含む各画分を濃縮した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質が２．７ｍｇ、ＴＦとの融合タンパク質が３．１ｍｇ、シャペロニン７連結体との融合タンパク質が５．２ｍｇそれぞれ回収することができた。
【００７８】
表１に本実施例で用いた各プライマーの塩基配列と制限酵素サイトを示した。
【表１】
【実施例２】
【００７９】
オキシトシン受容体の製造とスクリーニング用組成物の調製
実施例１の（６）で精製したｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈとヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質をトロンビンにて２２℃で一昼夜処理し、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈとヒトオキシトシン受容体との間のトロンビン認識切断部位を切断した。これにより、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈとヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質からヒトオキシトシン受容体を切り出し、取得することができた。
【００８０】
さらに、トロンビンにて一昼夜処理した上記反応液を、そのままＴｃＦＫＢＰ１８とヒトオキシトシン受容体とを含有するスクリーニング用組成物とした。
【実施例３】
【００８１】
脂質二重膜をさらに含有するスクリーニング用組成物の調製
（１）脂質二重膜構造粒子（リポソーム）溶液の作製
混合脂質６ｍｇ（卵黄レシチン（日本油脂社）：cholesterol（ナカライテスク社）：cholesteryl hemisuccinate（シグマ社）＝６５：１５：２０（質量比））をナス型フラスコに秤量し、クロロホルム（和光純薬工業社）で溶解した。エバポレーターを用いてクロロホルムを除いた後、水を３７５μＬ添加し、激しく混和した。その溶液を超音波装置で超音波処理した後、孔径０．２μｍ、０．１μｍ、０.０８μｍの各ポリカーボネートフィルター（ワットマン）に通した。
【００８２】
（２）オキシトシン受容体の脂質二重膜への再構成
（１）で調製した脂質二重膜構造粒子（リポソーム）溶液３７５μＬに、１０％のＣＨＡＰＳＯ（同仁化学社）溶液を１０４μＬ添加して混合し、室温にて５分程度放置した。溶液を４℃に冷却したのち、水を３５１μＬ添加した。この溶液に対して、ＣＨＡＰＳＯ濃度が終濃度０．８％となるように調製した実施例２の組成物２００μＬを加えた。そして、Bio-Beads SM Adsorbents（Bio-Rad Laboratories, Inc）を、０．１８ｇ添加した。４℃にて２時間混合した後、再度０．１８ｇのBio-Beads SM Adsorbentsを加えて４℃にて１時間混合し、さらに、０．１８ｇのBio-Beads SM Adsorbentsを加え１時間混合した。Bio-Beads SM Adsorbentsと溶液を分離し、脂質二重膜に再構成されたオキシトシン受容体を含有する組成物を得た。
【実施例４】
【００８３】
ヒトオキシトシン受容体のリガンド結合特異性評価
実施例１の（６）で調製した融合タンパク質を含む各画分（３種）、並びに、実施例３で調製した脂質二重膜に再構成したヒトオキシトシン受容体とＧｒｏＥＬの７回連結体とを含む溶液（スクリーニング用組成物）の計４種の試料を、以下の手順によるヒトオキシトシン受容体のリガンド結合特異性評価に供した。２ ｍＭＣａＣｌ2、及び、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にヒトオキシトシン受容体約５０μｇ相当分の試料を添加し、オキシトシン受容体に対するアンタゴニスト[125I]-Ornithine Vasotocin (d(CH2)5[Tyr(Me)2,Thr4,Tyr-NH2(9)]OVT)（Perkinelmer, Inc）をホットトレーサー、オキシトシン受容体に対するアゴニストであるコールドのoxytocinを置換体とするリガンド結合特異性評価を行った。反応条件は２５℃、６０分間とした。反応終了後、セルハーベスターにより膜受容体をあらかじめポリエチレンｓイミン処理しておいたガラスフィルター上に吸着させ、フィルターを３ｍＬの上記緩衝液で３回洗浄した。フィルターを測定用バイアルに移し、液体シンチレーター（Atomlight、登録商標）５ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンターにて測定（２分間）した。その結果、ＴＦと融合させた受容体では１１２ｄｐｍ、ＴｃＦＫＢＰ１８と融合させた受容体では８３７ｄｐｍ、（ＧｒｏＥＬ）７と融合させたヒトオキシトシン受容体では４３３３ｄｐｍ、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈよりオキシトシン受容体を切り出して脂質二重膜に再構成した受容体では３４８ｄｐｍとそれぞれ特異的な結合活性が確認された。
【００８４】
以上より、ＴｃＦＫＢＰ１８、ＴＦ、（ＧｒｏＥＬ）７とヒトオキシトシン受容体との融合タンパク質、および脂質二重膜構造に再構成したオキシトシン受容体は、オキシトシン受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性（リガンド結合活性）を有していた。これにより、これらの融合タンパク質を用いてヒトオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３の主要部の構成を示す説明図である。
【図２】ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈの主要部の構成を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
オキシトシン受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼは、トリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものであることを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してオキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出してオキシトシン受容体を取得することを特徴とするオキシトシン受容体の製造方法。
【請求項１０】
融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってオキシトシン受容体を切り出すことを特徴とする請求項９に記載のオキシトシン受容体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
下記工程：
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したオキシトシン受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断することを特徴とする請求項１２に記載の化合物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物。
【請求項１５】
オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物。
【請求項１６】
さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のスクリーニング用組成物。
【請求項１】
オキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
オキシトシン受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼは、トリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものであることを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してオキシトシン受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質からオキシトシン受容体を切り出してオキシトシン受容体を取得することを特徴とするオキシトシン受容体の製造方法。
【請求項１０】
融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってオキシトシン受容体を切り出すことを特徴とする請求項９に記載のオキシトシン受容体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
下記工程：
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したオキシトシン受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でオキシトシン受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のオキシトシン受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてオキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断することを特徴とする請求項１２に記載の化合物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物。
【請求項１５】
オキシトシン受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるオキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、オキシトシン受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物。
【請求項１６】
さらに界面活性剤又は脂質二重膜を含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のスクリーニング用組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２１５２１１（Ｐ２００９−２１５２１１Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５９９４０（Ｐ２００８−５９９４０）
【出願日】平成２０年３月１０日（２００８．３．１０）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１０日（２００８．３．１０）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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