融合担体として種子貯蔵蛋白を利用する植物種子中の融合ポリペプチドの高水準発現
【解決手段】単子葉植物の種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現は、単子葉植物種子貯蔵蛋白が非相同ペプチドまたはポリペプチドのための融合蛋白担体として使用される融合蛋白コンストラクトの形成により最適化される。非相同ペプチドまたはポリペプチドは好ましくは小型であり約１０ｋＤａ以下であり、そして５〜１００アミノ酸長である。これ等の小型非相同ペプチドまたはポリペプチドはヒト及び動物の栄養学的及び治療組成物中において使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【関連出願のクロスリファレンス】
【０００１】
本発明は２００３年１２月９日出願の米国仮出願６０／５２７，７５３及び２００４年１０月１日出願の米国仮出願６０／６１４，５４６の優先権を主張する。両出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明はヒト及び動物の栄養及び治療用の組成物を作成する場合に使用する、コメ植物のような単子葉植物の種子における非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現に関する。発現は単子葉植物種子貯蔵蛋白が非相同ペプチドまたはポリペプチドのための融合蛋白担体として使用される融合蛋白コンストラクトの形成により最適化される。非相同ペプチドまたはポリペプチドは小型で即ち約１０ｋＤａ以下であり、好ましくは５〜１００アミノ酸長である。
【背景技術】
【０００３】
多くの非相同ペプチド及びポリペプチドは栄養または治療用途に多くの量が必要であることにより、または、世界人口によるこれ等の非相同ペプチドの需要が高いことにより、供給不足となっている。２００アミノ酸未満、好ましくは５〜１００までのアミノ酸長の非相同ペプチドまたはポリペプチドが多くの用途、例えば抗体結合エピトープ、抗微生物剤、ＡＩＤＳ及び癌の治療及び／または種々の疾患の診断試験のために有用である。更に、特定の非相同ペプチドまたはポリペプチドはその生化学的及び生物学的機能を付与するために大量に必要となる。単子葉植物中に非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現することは高まる需要を満たす１つの方法である。
【０００４】
化学合成法は通常非相同ペプチドまたはポリペプチド分子の生成のために使用される。しかしながら一部の非相同ペプチドの特定のアミノ酸配列は化学合成法により非相同ペプチドを製造することを困難または不可能とする場合がある。例えば、連続するイソロイシン及びバリン残基を含む配列は、その側鎖が嵩高なため、標的非相同ペプチドが樹脂系マトリックス上に化学的に構築される場合に、所定の非相同ペプチド鎖の凝集をもたらす疎水性βシートを形成することが可能である。化学合成法のこの複雑さにより所定の非相同ペプチドのコスト構造は多大に増大し、これにより商業上の障壁となる。
【０００５】
代替法として、商業的な量で非相同ペプチドまたはポリペプチドを生成する手段に相当する低コストの組み換え発現プラットホームの開発がある。標的非相同ペプチドまたはポリペプチドをより大型の蛋白相手に結合させたキメラ融合蛋白の作成は生物学的系におけるこれ等の化合物の生成を改善するための１つの手法である。融合相手は蛋白の全体の大きさを増大させることにより、標的非相同ペプチドまたはポリペプチドの質量ベースの発現水準及び潜在的安定性を向上させる。
【０００６】
融合の手法は種々の系、例えば細菌、コウボ及びカビ、昆虫及び哺乳類細胞において良好に使用されている。各宿主発現系はその関連する利点及び難点を有する。
歴史的には、高等植物における蛋白融合系は細胞内小器官内に外来蛋白を効率的に移入するための内因性植物蛋白のトランジット及び／またはシグナルペプチド及びＮ末端成熟領域を使用することに限定されていたか、または、選択的植物遺伝子発現をモニタリング、安定化及び／または増量するために利用されているＧＵＳまたはＧＦＰのようなマーカー蛋白のために使用されていた。
【０００７】
上記した通り、非相同ペプチドまたはポリペプチドの生成に直面している重大な問題点は製造コストである。トランスジェニック植物は期待される需要を満たすために大量の生成物が必要とされる化合物の発現系のための宿主として魅力的である。トランスジェニック作物の利点は、トランスジェニック植物が動物ウィルス及び場合により微生物宿主に伴う毒素を含有しないことから、資本投資が低いこと、スケールアップがより容易であること、そして病原汚染が低リスクであることである。しかしながら非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現の水準は低く、そして精製工程は高コストであり、このような発現系を商業的に実施不可能にしている。
【０００８】
即ち、融合法を利用することにより非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を増大可能である。本発明以前に、融合蛋白は例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる以下に記載する参考文献に開示されている通り植物において発現されているものの、単子葉植物種子貯蔵蛋白は非相同ペプチドまたはポリペプチドのための融合担体として利用されてはいなかった。
【０００９】
米国特許第５，２９２，６４６号は宿主細胞を培養して切断部位を与えるリンカーペプチドを場合により含有する選択された非相同ペプチドまたは蛋白に融合したチオレドキシン様蛋白配列を含む融合蛋白を製造することによる、可溶性組み換え蛋白の発現を開示している。
【００１０】
米国特許第６，０８０，５５９号は組み換えプラスミドを含有する形質転換されたアスペルギルスのカビ細胞を培養することによる、アスペルギルス中の融合蛋白からのプロセシングされたリコラクトフェリン及びラクトフェリンポリペプチドフラグメントの発現を開示している。
【００１１】
ＷＯ９７／２８２７２はヒンジ領域、親水性スペーサー及び２塩基性のアミノ酸エンドプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドにより目的蛋白に融合したＦｃフラグメントのような別のドメイン及び／またはエレメントを有する融合蛋白から真正の組み換え蛋白の発現を開示しており、ここではスペーサーが切断され、次にカルボキシペプチダーゼＢで消化されて真正の蛋白が形成される。
【００１２】
米国特許第５，５９５，８８７号は融合担体としてのヒト炭酸アンヒドラーゼ及び小分子ペプチドのための親和性タグの使用を開示している。
【００１３】
米国特許第５，６８６，０７９号は細菌βガラクトシダーゼ（ｌａｃ）蛋白及び細菌ＳｐＡ蛋白の小区分よりなる融合蛋白のトランスジェニック植物、特にトランスジェニックタバコ植物葉中の発現を開示している。融合蛋白の発現水準は葉組織の新鮮重量で０．００２％であった。
【００１４】
米国特許第５，７６７，３７２号は細菌ｎｐｔＩＩ蛋白のＮ末端部分及びＢｔ毒素ポリペプチドの毒性部分よりなる融合蛋白の植物、特にトランスジェニックタバコカルス及びトランスジェニックタバコ葉中の発現を開示している。発現水準は融合蛋白については非常に低値であり、２５〜５０ｎｇ／ｇ植物組織新鮮重量（０．００００５％）であった。
【００１５】
米国特許第５，８６１，２７７号はアラビドプシスＰＡＴ１蛋白のＮ末端部分及び細菌ＧＵＳ蛋白よりなる融合蛋白のトランスジェニックアラビドプシス植物中の発現を開示している。融合産物の発現水準は詳述されていない。
【００１６】
米国特許第５，９２９，３０４号は精製を容易にするためにＦＬＡＧ（登録商標）融合蛋白と共に融合蛋白コンストラクト内に取り込まれたヒトリソソーム酵素のトランスジェニックタバコ植物中の発現を開示している。ｈＧＣ（ヒトグルコセレブリオシダーゼ）に関する融合産物の発現は約２．５ｍｇ／１．６ｋｇ（０．００１５％）タバコ葉組織新鮮重量であった。
【００１７】
米国特許第５，９７７，４３８号は細菌マラリア表面抗原の１２アミノ酸ペプチド部分にカップリングした融合担体としてのタバコモザイクウィルス被覆蛋白の部分を包含する融合蛋白の感染タバコ植物中の発現を開示している。この融合蛋白はウィルスベクター系を用いてタバコ中で発現されており、タバコ葉中の１２アミノ酸ペプチドの発現は２５μｇ／ｇ（０．０００４％）葉組織新鮮重量で得られている。
【００１８】
米国特許第６，０１８，１０２号は植物ユビキチン蛋白部分を種々の小型溶解ペプチドのための担体分子として利用しているトランスジェニックバレイショ葉及び塊茎における発現のための融合蛋白の予測的構築を開示している。
【００１９】
米国特許第６，２８８，３０４号が融合担体としてのブラシカ油脂体蛋白オレオシンのＮ末端領域よりなる融合蛋白を用いた脂肪種子作物セイヨウナタネの種子中のソマトトロピン（成長ホルモン）の発現を開示している。
【００２０】
米国特許第６，３３１，４１６号はトランスジェニックバレイショ塊茎における種々の融合ポリペプチドの発現のための予測的コンストラクトを開示している。提案されているＮ末端融合担体は安定な植物発現を達成するための何れかの非植物蛋白に融合された細菌セルロース結合ドメインイン（ＣＢＤ）である。
【００２１】
米国特許第６，４４８，０７０号は融合蛋白がアルファルファモザイクウィルスカプシド蛋白及びＨＩＶ−１及び狂犬病の哺乳類ウィルスエピトープのＮ末端部分よりなる、植物、特に単離されたタバコプロトプラストまたはウィルス感染タバコ植物中の融合蛋白の構築及び発現を開示している。融合蛋白発現の水準は詳述されていない。
【００２２】
米国特許第６，４５５，７５９号は植物ユビキチン連結ドメインにより連結された２種の蛋白、例えばマーカー蛋白ルシフェラーゼ及びベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）よりなる融合手法のタバコ等のトランスジェニック被子植物中の発現を開示している。この融合蛋白の発現水準は記載されていない。
【００２３】
米国特許出願第２００２／０１４６７７９号は細菌、コウボ、動物及び植物を包含する種々のトランスジェニック系におけるオーセンティックアミノ末端アミノ酸を有する組み換えポリペプチドの高生産のための融合蛋白の使用を開示している。植物または植物細胞における如何なる融合蛋白の発現に関するデータも提示されておらず、また植物における如何なるキメラ遺伝子融合蛋白コンストラクトの例も記載されていない。
【００２４】
米国特許出願第２００３／０１５９１８２号はコメを包含するトランスジェニック穀物の種子中のヘルペスウィルスエピトープの生産のためのシグナルペプチド融合蛋白の使用を開示している。ヘルペス表面抗原をターゲティングするためのシグナルペプチドを含有するプラスミドコンストラクトが詳述されている。コメ種子中において０．５％総蛋白の発現水準が得られている。融合担体としての単子葉植物種子貯蔵蛋白の利用に関する予測的な例またはデータは記載されていない。
【００２５】
シラーら（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）（ＥＭＢＯ Ｊ４，２５−３２，１９８５）はインビトロのタバコクロロプラスト内への細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）蛋白の輸送がｎｐｔに融合したタバコ小型サブユニット成熟蛋白の部分を用いて増強されることを開示している。
【００２６】
コマイら（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３１５１０４−１５１０９，１９８６）はインビトロ及びインビボのタバコクロロプラスト内への細菌５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート（ＥＳＰ）シンターゼの効率的な輸送がタバコ小型サブユニット蛋白の成熟部分と細菌ＥＳＰシンターゼとの間の融合を必要とすることを開示している。
【００２７】
これ等の特許または刊行物の何れも融合担体として単子葉植物種子貯蔵蛋白を用いた単子葉植物中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの高水準発現を開示していない。
生産系としてのトランスジェニック植物の使用は期待される需要を満たすために大量の生産を必要とする化合物にとって理想的であると考えられる。トランスジェニック作物の利点には低資本投資、スケールアップの容易性及び病原体汚染の低い危険性が包含される。コメ系の高水準発現系が開発されており、種々の蛋白を良好に生産している。
【００２８】
このような蛋白の１つは「トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメイン」１つ以上を含有する３小型ペプチドよりなる三つ葉因子ファミリー（ＴＦＦ）である。各トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインは約４０アミノ酸残基よりなる。各トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインは３つの高度な安定性を有するループに折り畳まれており、各ループは３つのシステイン媒介ジスルフィド結合中の１つにより形成されている。これ等の内部鎖ジスルフィド結合はその主要アミノ酸配列の順序に応じて１−５、２−４及び３−６配置において形成される。
【００２９】
全ての腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）ペプチドは高度に相同である。ヒトＩＴＦは７５アミノ酸ポリペプチドよりなる。Ｎ末端シグナルペプチドを切断した後、得られる成熟ヒトＩＴＦは６０アミノ酸を含有する。ヒトＩＴＦは胃腸組織内で単量体及び２量体の両方において存在する。
トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）モチーフのコンパクトな構造は蛋白分解性の消化に対するトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドの顕著な耐性の原因と考えられ、トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドを胃腸管の苛酷な環境において生存させ続けている。単一ドメインのヒトＩＴＦは７システイン残基を有し、そのうち６個はトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインの構造を維持することに関与している。７番目のシステイン残基はトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインの部分ではなく、Ｃ末端の３残基上流に位置する。
【００３０】
ＩＴＦの幾つかの生物学的活性が発見されており、創傷治癒の促進、表皮細胞遊走の刺激及び小腸表皮障壁の保護も含まれる。即ちＩＴＦは種々の疾患状態の防止及び治療において使用できる。ＩＴＦの天然原料は結腸及び小腸の粘膜から調製されるが、収率は極めて低値であり、種々の疾患状態の防止及び治療における臨床使用に必要な大量のＩＴＦを提供することは不可能である。
【００３１】
ＩＴＦはまたハイブリッドのリーダー配列及び成熟ＩＴＦ配列よりなる融合蛋白をコードするように構築されているコウボ及び組み換えプラスミド中でも生成される。リーダー配列はコウボ細胞の分泌（及びプロセシング）経路内に融合蛋白を指向させる。発現水準は約１００ｍｇ／Ｌであるため、これ等の系からのＩＴＦの全体的な量はなお制限されている。
【００３２】
別の適切な蛋白はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に関与するものである。ｈＧＨはインビボで脂質分解／抗脂質形成作用を有し、これにより脂肪量の低減、非脂肪量の増大及び体重減少をもたらす。インビトロ及びインビボの試験によれば、この応答は部分的にはβアドレナリン受容体カップリング効率の増大、ホルモン感受性リパーゼの増大した活性及びインスリンの作用に対する抑制作用により媒介される。ｈＧＨ分子のカルボキシ末端（ｈＧＨ１７７−１９１｛ＡＯＤ９６０１｝）は未損傷ホルモンの脂質移動化ドメインとして発見されている。このフラグメントは脂肪細胞及び肝細胞内のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性を抑制し、そして単離された細胞及び組織の両方において脂質へのグルコースの取り込みを低減するように作用する。ｈＧＨの合成Ｃ末端フラグメント（ＡＯＤ９６０４）はｈＧＨの脂質分解作用の原因である脂質分解ドメインを含有する。親分子であるＡＯＤ９６０１はインビトロの死亡組織における脂質分解及び脂肪酸化を誘導する。インビボにおいては、ＡＯＤ９６０１は食物摂取に影響することなく体重減少をもたらし、脂質分解感受性を増大させ、そして、インスリン感受性の悪影響を及ぼすことなく脂肪酸化を増大させる。
【００３３】
ｈＧＨ及びＡＯＤ９６０４の両方に対する応答の性質は殆ど解明されていない。両方の分子は脂肪組織における主要な脂質分解組織であるＢ３−アドレナリン作用性受容体（Ｂ３−ＡＲｓ）の発現に影響するという仮説がある。ＡＯＤ９６０４及びｈＧＨは共にインビトロのマウス及びヒトの細胞系統においてＢ３−ＡＲｍＲＮＡ発現及び蛋白の濃度と機能を増大させることができる。このペプチドの高水準生産の機序は何れかの脂肪低減療法において将来の用途のために重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
本発明の１つの態様では、単子葉植物種子における非相同ペプチド又はポリペプチドを発現する方法であって、単子葉植物成熟種子発現系において非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白に融合させる工程、及び、成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程からなる方法を包含する。
【００３５】
本発明の別の態様によると、トランスジェニック単子葉植物種子中における少なくとも１５〜２０μg／穀物の濃度での融合コンストラクトの発現、即ち何れかの種子貯蔵蛋白融合手法の非存在下における非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現よりも実質的（約２０倍）に向上している発現を包含する。融合コンストラクトの発現は好ましくは穀物中の総可溶性蛋白の少なくとも３．０％、より好ましくは少なくとも５．０％である。
【００３６】
本発明の別の態様によると、成熟単子葉植物種子発現系における小型ポリペプチドと発現のための種子貯蔵蛋白とを融合させることによる非相同オリゴペプチド分子の高水準発現のための高度に良好な融合方法を含む。
【００３７】
本発明の別の態様では種子貯蔵蛋白と小型ポリペプチドの間に「フレームの中に入るように」操作された化学切断部位を与える戦略的トリプトファン残基を使用する。この部位は融合担体から成熟小型ポリペプチドを遊離させるために使用することもできる。
【００３８】
本発明の別の態様は、単子葉植物成熟種子発現系において小型非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白に融合させること、及び、成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現すること、を含む単子葉植物種子中における小型（約１０ｋＤａ以下及び／または５〜１００アミノ酸長）の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現のための方法を包含する。
【００３９】
本発明の別の態様によると、単子葉植物種子貯蔵蛋白及び小型非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナルペプチドを含む融合蛋白を含む。単子葉植物種子貯蔵蛋白は融合蛋白の小型非相同ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端側にあってよい。単子葉植物種子貯蔵蛋白は小型非相同ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端側に位置しているのが好ましい。
【００４０】
本発明の別の態様によると、小型非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間にフレームの中に入るように操作されたメチオニンまたはトリプトファンの残基を含む融合蛋白を含む。
【００４１】
本発明の別の態様によると、非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合された単子葉植物種子貯蔵蛋白担体からの非相同ペプチドまたはポリペプチドの最終的放出のための少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む。好ましくは、特異的プロテアーゼ切断部位はエンテロキナーゼ（ｅｋ）、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを含んでよい。
【００４２】
本発明の別の態様によると、臭化シアンのような化学切断剤を介した融合蛋白の切断を含む。
【００４３】
以上及びその他の本発明の特徴及び側面は以下の本発明の詳細な説明を添付図面と関連させて読むことにより更に十分明確化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての用語は以下に示す意味を有するか、または、本発明の技術分野の当業者に対してその用語が有する同じ意味と一般的に合致するものである。
【００４５】
本明細書においては、「種子」という用語は全ての種子要素、例えば種子の成熟中及び種子の発芽中における子葉鞘及び葉、幼根及び根鞘、菌甲、澱粉性内乳、アリューロン層、果皮及び／または外殻を包含する。本発明の意味においては、「種子」及び「穀粒」という用語は互換的に使用する。
「生物学的活性」という用語は当業者によりその蛋白に典型的に帰属させられる何れかの生物学的活性を指す。
「融合担体」及び「融合相手」という用語は当業者により理解されるとおり互換的に使用される。
【００４６】
「非相同ペプチドまたはポリペプチド」は目的の非相同ペプチドまたはポリペプチドに関するコーディング配列を含む。目的の非相同ペプチドまたはポリペプチドは好ましくは２００アミノ酸長未満である。好ましくは約１０ｋＤａ以下及び／または５〜１００アミノ酸を含むような小型非相同ペプチドまたはポリペプチドを本発明に従って使用する。例えば６０アミノ酸の腸ｔｒｅｆｏｉｌ因子を小型非相同ペプチドまたはポリペプチドとして利用してよい。
【００４７】
他の目的の非相同ペプチド及びポリペプチドは哺乳類起源のものである。このような非相同ペプチド及びポリペプチドはこれらには限らないが、例えば乳蛋白、血液蛋白（例えば血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または修飾第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン因子、Ｃ蛋白、フォンウイルブランド因子、抗トロンビンＩＩＩ及びエリスロポエチン）、コロニー刺激因子（例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、サイトカイン（例えばインターロイキン）、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、表面膜蛋白（例えば表面膜蛋白受容体）、Ｔ細胞受容体単位、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合性複合体抗原、構造蛋白（例えばコラーゲン、フィブロイン、エラスチン、チュブリン、アクチン及びミオシン）、成長因子受容体、哺乳類成長因子、成長ホルモン、細胞周期蛋白、ワクチン、フィブリノーゲン、トロンビン、サイトカイン、ヒアルロン酸及び抗体を包含する。
【００４８】
「哺乳類成長因子」という用語は、これらに限らないが、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、例えばＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−β及び−β−３、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、例えばＮＧＦ−β及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１−１９及び−１２β、及びこれ等の蛋白の生物学的に活性なフラグメントを包含する蛋白または生物学的に活性なそのフラグメントを指す。これ等及び他のヒト成長因子の配列は当業者のよく知る通りである。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳類成長因子はＩＴＦである。ＩＴＦの単子葉植物種子中の発現水準は１５〜２０μｇ／穀粒であることがより好ましい。
【００４９】
「乳蛋白」という用語は、これらに限らないが、例えばラクトフェリン、リソザイム、ラクトフェリシン、表皮成長因子、インスリン様成長因子−１、ラクトヘドリン、カッパ−カゼイン、ヘパトコリン、ラクトパーオキシダーゼ、免疫グロブリン及びアルファ−１−抗トリプシンを包含する蛋白またはその生物学的に活性なフラグメントを指す。好ましくは、乳蛋白はリソザイムまたはラクトフェリンである。
【００５０】
ペプチド性の産物が一般的に生じるが、細胞により生成された非ペプチド性の産物を改変する作用を有する遺伝子を導入してよい。その配列が天然のペプチドまたはポリペプチドに関連している限り、ペプチドまたはポリペプチドが全体として、または部分的に合成されたものであるかに関わらず、通常は少なくとも１０アミノ酸の、融合複合物、突然変異体及び合成のペプチドまたはポリペプチドの上記非相同ペプチドまたはポリペプチド及びそのフラグメントも生成してよい。
【００５１】
更にまた、単子葉植物種子の非相同ペプチドまたはポリペプチドの高水準発現を達成するためのこの良好な方法は栄養または治療上重要な種々の他の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を可能にする。それらには、これらには限らないが、例えば肥満を治療するためのペプチド、例えばＡＯＤ９６０４及びＰＹＹ、潜在的ペプチド抗生物質、例えばイセガナン及びβ−デフェンシン、成熟ペプチド成長因子、例えばＥＧＦ、ＩＧＦ及びＦＧＦ、抗ＨＩＶペプチド、例えばＦｕｚｅｏｎ及びその誘導体、ペプチドホルモン及びペプチドホルモンフラグメント、例えば副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、アデノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）及び高血圧を治療するためのペプチド、例えば血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）及び血管内皮生育抑制剤（ＶＥＧＩ）が包含される。
【００５２】
更にまた、ヒトまたは獣医科用途の非相同ペプチド及びポリペプチド、例えばワクチン及び成長ホルモンを生産してよい。目的のポリペプチドを含有する単子葉植物種子はマッシュ製品またはヒトまたは家畜用の適用に直接有用である種子製品に調製できる。
【００５３】
しかしながら遺伝子コードの固有の縮重により、実質的に同じか機能的に等価なアミノ酸配列をコード化する多くの核酸配列を形成し、そして所定の非相同ペプチドまたはポリペプチドをクローニング及び発現するために使用してよい。即ち、核酸配列をコードする所定の非相同ペプチドまたはポリペプチドについて、遺伝子コードの縮重の結果として同じ蛋白アミノ酸配列をコードする多くのコーディング配列が形成される場合がある。コーディング領域内のこのような置換は本発明の対象となる配列変異体の範囲内に属するものとする。これ等の配列変異体の全ては核酸配列をコード化する例示される非相同ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書に記載したものと同様の方法で利用できる。
【００５４】
当業者の知る通り、一部の場合においては、天然に存在しないコドンを保有するヌクレオチド配列をコード化する非相同ペプチドまたはポリペプチドを使用することが有利な場合がある。特定の真核生物の宿主により好まれるコドンを選択することにより、例えば発現率を上昇させたり、又は、天然に存在する配列から生成した転写物よりも望ましい特性、例えばより長い半減期を有する組み換えＲＮＡ転写物を生成することができる。例としては、コメにおいて発現される遺伝子に関するコドンは第３のコドン位置においてグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）リッチであることが示されてきた。低Ｇ＋Ｃ含量を高Ｇ＋Ｃ含量に変化させることは大麦穀粒中の外来性蛋白遺伝子の発現濃度を上昇させることがわかっている。本発明において使用されるＤＮＡ配列は遺伝子クローニングのための適切な制限部位に伴ったコメ遺伝子コドンの偏りに基づいていてよい。
【００５５】
「種子成熟」とは、穀粒の大型化及び穀粒の充填をもたらす、種子（穀粒）、例えば内乳、外殻、アリューロン層及び鱗性表皮における種々の組織に対する小胞ターゲティングの有無に関わらず、代謝可能な温存物、例えば糖類、オリゴ糖類、澱粉、フェノール類、アミノ酸及び蛋白が蓄積する受精と共に開始され、穀粒乾燥で終了する期間を指す。
【００５６】
本発明において有用となるプロモーターは植物細胞において活性である何れかのプロモーターである。使用されるプロモーターの型は重要ではなく、そして本発明の新しい特徴を構成しない。好ましい型のプロモーターは成熟特異的単子葉植物種子貯蔵蛋白（「成熟特異的蛋白プロモーター」として知られている）の遺伝子に由来するプロモーターである。「成熟特異的蛋白プロモーター」とは種子成熟の間に実質的にアップレギュレートされた活性（２５％超）を示すプロモーターを指す。
【００５７】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」（互換的に使用）とは種子内乳のような選択された細胞内または細胞外の領域に自身が結合しているペプチドまたは蛋白を位置決めするため、または、細胞からペプチドまたは蛋白を輸送するために有効であるＮ末端またはＣ末端のポリペプチド配列である。使用するシグナル配列は重要ではなく本発明の新しい特徴を構成しない。好ましくは、シグナル配列は、宿主細胞からの分泌の後、内乳細胞、より好ましくは内乳細胞の非細胞のコンパートメントまたは組織、例えば細胞内小胞または他の蛋白貯蔵体、クロロプラスト、ミトコンドリアまたは小胞体または細胞外空間のような位置に結合ペプチドまたは蛋白をターゲティングする。
【００５８】
本明細書においては、所定の細胞、ポリペプチド、核酸、形質または表現型に関連して「ネイティブ」または「野生型」という用語は、自然界に典型的に存在する形態を指す。
【００５９】
本明細書においては、「精製する」という用語は「単離する」という用語と互換的に使用し、そして一般的にそれが存在する、または生成される環境の他の成分からの特定の成分のいかなる分離をも指す。例えば、組み換え蛋白をそれが生成された植物細胞から精製することは、典型的には、トランスジェニック蛋白含有植物材料を沈降、遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィーのような分離手法に付すことを意味する。このような精製または単離何れかの工程による結果物は、それがその精製または単離の工程の前よりも他の成分（「不純物成分」）が少ない限り、他の成分をなお含有していてもよい。
【００６０】
本明細書においては、宿主細胞に言及した場合の「形質転換された」または「トランスジェニック」という用語はネイティブの宿主細胞には存在しない非ネイティブまたは非相同または導入された核酸配列を宿主細胞が含有することを意味する。
【００６１】
「操作可能に連結された」という用語は、本明細書においては、核酸が他の核酸配列と機能的関連を有するように位置づけられていることを意味する。例えばプロモーターはそれが配列の転写に影響する場合にコーディング配列に作動可能に連結されている。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００６２】
「単子葉植物種子貯蔵蛋白」または「成熟特異的単子葉植物種子貯蔵蛋白」（互換的に使用）という用語は、これらに限らないが、グロブリン、コメグルテリン、オリジン、プロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン及びグルテニン、トウモロコシゼイン及びグルテリン、エンバクグルテリン、モロコシカフィリン、アワペニセチンまたはライムギセカリンのような蛋白またはその生物学的に活性なフラグメントを指す。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態においては単子葉植物種子貯蔵蛋白はコメ由来の１９キロダルトン（ｋＤａ）のグロブリンである。グロブリン遺伝子を単離し、特性化し、そしてＤＮＡ配列を決定した。コメ種子貯蔵蛋白抽出液の２次元ゲル電気泳動によれば、１９キロダルトン（ｋＤａ）のグロブリン蛋白は完全ではないが大部分は単一成分であり、蛋白のファミリーとして存在するとは考えられない。１９ｋＤａグロブリン蛋白のコメ内乳中の含有量はグルテン蛋白含有量の概ね１０％であるが、１９ｋＤａグロブリン蛋白はコメ内乳における単一の遺伝子の最も大量の産物であり、そして、この観点において、コメ内乳における非相同ペプチドの発現のための融合担体として操作するために最も優れた選択肢である。
【００６４】
別の実施形態においては、本発明は種々の細菌及びウィルス性疾患の経口免疫化のために使用できるこれ等の疾患に特異的な非相同抗原性ポリペプチドエピトープの高水準発現を可能にする。
【００６５】
即ち、本発明は単子葉植物成熟種子発現系において単子葉植物種子貯蔵蛋白に非相同ペプチドまたはポリペプチドを融合することによる、非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を最適化するための高度に良好な融合方法を提供する。１つの好ましい実施形態においては、本発明はコメ成熟種子発現系におけるコメ種子貯蔵蛋白、例えばグロブリン（Ｇｌｂ）との小型ポリペプチド、例えば腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）の融合を可能にする。
【００６６】
場合により、少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または特異的ペプチド切断部位を単子葉植物種子貯蔵蛋白と非相同ペプチドまたはポリペプチドとの間の翻訳フレーム内となるよう操作することができる。好ましい実施形態においてはヒトエンテロキナーゼ（ｅｋ）のペプチド切断部位をコードする合成オリゴヌクレオチドをグロブリンとＩＴＦ蛋白ドメインの間に「インフレーム」に操作する。この部位はグロブリン融合担体からの成熟ＩＴＦ蛋白の潜在的放出のために利用できる。
【００６７】
本発明において使用するための発現ベクターは適切に会合した上流及び下流の配列を含む植物内の操作のために設計されたキメラ核酸コンストラクト（または発現ベクターまたはカセット）である。
【００６８】
一般的に本発明の実施において使用するための発現ベクターは、キメラ遺伝子を構成する以下の作動可能に連結した成分、即ち（ａ）成熟特異的単子葉植物種子貯蔵蛋白の遺伝子由来のプロモーター、（ｃ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードする第２のＤＮＡ配列、（ｄ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列、及び／または（ｂ）単子葉植物種子貯蔵体への自身に連結した非相同ペプチドまたはポリペプチドのターゲティングが可能である単子葉植物種子特異的シグナル配列をコードする該プロモーターに作動可能に連結した第１のＤＮＡ配列を包含してよく、ここで第１、第２及び第３のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードしている。
【００６９】
キメラ遺伝子は（ｉ）プラスミドまたはウィルス起源であり、そして、１つの宿主から別の宿主へ、例えば細菌から所望の植物宿主へのＤＮＡの移動がベクターにとって可能となるようにベクターに必要な特性を与えるキメラ遺伝子の上流及び／または下流のコンパニオン配列、（ｉｉ）選択可能なマーカー配列、及び（ｉｉｉ）ｐｏｌｙＡテール存在下または非存在下の転写終了領域を有する適切な植物形質転換（「発現」）ベクター内に入れてよい。
【００７０】
キメラ遺伝子及びキメラ遺伝子を担持する形質転換ベクターを構築するための例示される方法は以下の実施例に記載する。
【００７１】
本発明においては、非相同ポリヌクレオチドは植物種子組織において優先的に発現される転写開始領域由来のプロモーターの制御下に発現できる。例示される好ましいプロモーターは内乳の外層において遺伝子発現を起こすグルテリン（Ｇｔ１）プロモーター及び内乳の中心部において遺伝子発現を起こすグロブリン（Ｇｌｂ）プロモーターを包含する。自身に作動可能に連結した遺伝子コーディング配列の転写を調節するためのプロモーター配列は天然に存在するプロモーターまたは種子特異的転写を指向することができるその領域、及び１プロモーターより多くのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターを包含する。このようなハイブリッドプロモーターの構築のための方法は当該分野で知られている。
【００７２】
一部の場合において、プロモーターはキメラ核酸コンストラクトを導入すべき植物細胞と同じ植物種から取り出す。本発明において使用するプロモーターは典型的にはコメ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシのような穀物から取り出される。或いは、１つの型の植物に由来する種子特異的プロモーターを使用して異なる植物に由来する核酸コーディング配列の転写を調節してもよい。
【００７３】
本発明において有用であるプロモーターの別の例は、これには限らないが、上記した以下の成熟特異的単子葉植物貯蔵蛋白の１つに関連する成熟特異的プロモーターを包含する。更に包含されるものはアエウロン及びコメ、コムギ及びオオムギ遺伝子に関連する胚特異的プロモーター、例えば脂質転移蛋白Ｌｔｐ１、キチナーゼＣｈｉ２６及びＥｍ蛋白Ｅｍｐ１である。
【００７４】
成熟種子中の発現に適する他のプロモーターはオオムギ内乳特異的Ｂ１ホルデインプロモーター、ＧｌｕＢ−２プロモーター、Ｂｘ７プロモーター、Ｇｔ３プロモーター、ＧｌｕＢ−１プロモーター及びＲｐ−６プロモーターを包含する。好ましくは、これ等のプロモーターは転写因子と組み合わせて使用する。
【００７５】
目的の蛋白をコード化することに加えて、発現カセットまたは非相同核酸コンストラクトは適宜蛋白のプロセシング及び転座を可能にするシグナルペプチドをコード化してよい。上記定義した例示されるシグナル配列は、単子葉植物成熟特異的遺伝子に関連するシグナル配列、即ち、グルテリン、プロラミン、ホルデイン、グリアジン、グルテニン、ゼイン、アルブミン、グロブリン、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、澱粉シンターゼ、分枝鎖形成酵素、Ｅｍ及びｌｅａである。
【００７６】
更にまた、多くの単子葉植物種子貯蔵蛋白は成熟特異的プロモーターの制御下にあり、そしてこのプロモーターは蛋白本体をターゲティングするためのリーダー配列に作動可能に連結しているため、プロモーター及びリーダー配列はキメラ遺伝子コンストラクトにおける非相同ペプチドまたはポリペプチドに作動可能に連結した単一の蛋白貯蔵遺伝子から単離できる。１つの例示されるプロモーター−リーダー配列はコメＧｔ１遺伝子由来のものである。或いは、プロモーター及びリーダー配列は異なる遺伝子から取り出してよく、例えばコメＧｔ１リーダー配列に連結したコメＧｌｂプロモーターが挙げられる。
【００７７】
非相同ペプチドまたはポリペプチドの製造は遺伝子のコドン最適化により増強できる。コドン最適化の意図は、ＧまたはＣのコドンの第３の位置においてＡまたはＴを変更することであった。この配置は典型的なコメ遺伝子におけるコドンの使用とより緊密に整合する。このようなコドンの最適化は本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００７８】
単子葉植物細胞における選択のための適切な選択可能なマーカーは、これらには限らないが、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリン等を包含する。別の選択可能なマーカーはバイアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子、グリホサート耐性をコードする突然変異体ＥＰＳＰシンセターゼ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を与える突然変異体アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）を包含する。使用される特定のマーカー遺伝子は導入されているＤＮＡを欠いた細胞と比較して形質転換細胞の選択を可能にする。好ましくは選択可能なマーカー遺伝子は組織培養段階における選択を容易にするもの、例えばｎｐｔＩＩ、ハイグロマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子である。即ち使用される特定のマーカーは本発明に必須ではない。
【００７９】
一般的に、選択された核酸配列はベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。当業者に公知の切断、ライゲーション及びＥ．ｃｏｌｉ形質転換のための標準的方法を本発明で使用するベクターの構築において使用する。
植物細胞または組織は種々の標準的手法を用いて上記発現コンストラクトを用いて形質転換される。ベクター配列は宿主ゲノム内に安定して組み込まれることが好ましい。
【００８０】
本発明の意味においては、「安定的に形質転換される」とは、導入された核酸配列が宿主の２世代以上に通じて維持されることを意味し、これは好ましくは（必然ではない）宿主ゲノム内への導入配列の組み込みによるものである。宿主植物細胞を形質転換するために使用する方法は本発明では重要ではない。本発明に従って発現される非相同ペプチドまたはポリペプチドの商業化のためには、植物の形質転換は好ましくは永久的なもの、即ち宿主植物ゲノム内への導入発現コンストラクトの組み込みによるものであり、これにより、導入されたコンストラクトは連続する植物の世代に受け継がれる。当業者の知る通り、広範な種類の形質転換技術が当該分野に存在しており、新しい技術が持続的に使用可能となっている。
【００８１】
標的宿主植物のために適しているいかなる手法をも、本発明の範囲内で使用してよい。例えばコンストラクトは、これらに限らないが種々の形態、例えばＤＮＡ鎖において、プラスミドまたは人工染色体に導入できる。標的植物細胞内へのコンストラクトの導入はこれらに限らないが種々の手法、例えば燐酸カルシウムＤＮＡ同時沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト融合または、マイクロプロジェクタイルボンバードメントにより達成できる。当業者は詳細については文献を参照して本発明の方法において使用するための適切な手法を選択できる。
【００８２】
形質転換された植物細胞は選択試薬の閾値濃度を有する選択培地中で培養され得る能力があるかどうかスクリーニングされる。選択培地上または培地中で生育する植物細胞は典型的には同じ培地を新しく用意したものに移して再度培養する。次に外植片を再生条件下で培養することにより再生植物の新芽を生産する。新芽形成後、新芽を選択定着培地に移し、完全な幼植物体とする。次に幼植物体を生育させて形質転換植物の増殖のための種子、切片等を得る。方法は非相同の起源の遺伝子の発現及びトランスジェニック植物の再生による植物の効率的な形質転換を可能とし、これにより非相同ペプチドまたはポリペプチドが生成できる。
【００８３】
非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現は発現されている特定の蛋白に特異的な生物活性に関する試験と組み合わせたウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、ＨＰＬＣ、ＮＭＲまたは質量スペクトル分析のような標準的な分析手法を用いて確認してよい。
後述する実施例に記載されている発現系は特異的な配列系に基づいている。しかしながら、当業者の知る通り、本発明は特定の系に限定されない。即ち、別の実施形態においては、他のプロモーター及び他のシグナル配列を使用して単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現してよい。
【００８４】
以下、本発明の融合担体として種子貯蔵蛋白を利用する植物種子中の融合ポリペプチドの高水準発現の一実施形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【実施例１】
【００８５】
ヒトＩＴＦ配列及びプラスミドの構築
ヒトＩＴＦＤＮＡ配列はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｌ０８０４４に基づくものとした。この配列は７５アミノ酸のＩＴＦペプチドのオープンリーディングフレームをコードする。コメ穀粒中の成熟ＩＴＦの発現のために、６０アミノ酸の成熟ＩＴＦペプチドをコードするＤＮＡ配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化した（ＩＴＦ、図１）。
【００８６】
図１はコメ穀粒中の腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）の６０アミノ酸成熟部分の発現のためのコドン最適化ＤＮＡの比較を示す。「ネイティブ遺伝子」とは正常ヒトＩＴＦＤＮＡ配列を指し、「トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）」とはコドン最適化ＩＴＦＤＮＡ配列を指す。相当するアミノ酸配列はＤＮＡ配列の下に記載する。
【００８７】
図２は融合担体としての１９ｋＤａグロブリン蛋白（Ｇｌｂ）、エンテロキナーゼ（ｅｋ）切断部位及び成熟ＩＴＦ蛋白と融合させた構築されたＧｔ１シグナルペプチドに関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示し、全ては同じ翻訳リーディングフレーム内に融合されている。
【００８８】
成熟ＩＴＦをコードするコドン最適化ＩＴＦ遺伝子は化学合成により誘導し、そして、１本鎖ＤＮＡ増幅及びＡ／Ｔオーバーハング法を介したストラータジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のユニバーサルクローニングベクターｐＣＲ２．１内にクローニングした。このようにして得られたプラスミドをｐＡＰＩ４３１と命名した。
【００８９】
プラスミドｐＡＰＩ４７１は３種の中間体プラスミド、即ちコメグロブリン融合相手（ｐＡＰＩ４６９）、ｅｋ（エンテロキナーゼ）リンカー−ＩＴＦ（ｐＡＰＩ４６５）及び上記したコメコドン最適化ＩＴＦ遺伝子（ｐＡＰＩ４３１）を利用して最終的に構築した。融合相手の１９ｋＤａのコメグロブリン遺伝子はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｘ６３９９０から設計したプライマー対を用いて増幅し、ストラータジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。１９ｋＤグロブリンをコード化する増幅しクローニングしたＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析により確認した。このようにして得られたプラスミドをｐＡＰＩ４６９と命名した。次に、１５塩基対エンテロキナーゼ（ｅｋ）リンカーＤＮＡセグメントを成熟コドン最適化ＩＴＦのＮ末端コーディング領域上の部位指向性突然変異誘発によりｐＡＰＩ４３１内に導入した。このようにして得られたプラスミドｐＡＰＩ４６５はｅｋ−ＩＴＦ遺伝子融合を含んでいる。
【００９０】
プラスミドｐＡＰＩ４６９は酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｎａＢＩで消化し、次にＭｆｅＩ（Ｍｕｎｇマメヌクレアーゼにより平滑末端化）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されているｐＡＰＩ４６５内にクローニングした。２つのＤＮＡセグメントを１％アガロースゲル上で単離し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出プロトコルを用いて精製した。２つのフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、そして、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。得られたプラスミドは１９ｋＤのグロブリン−ｅｋ−コドン最適化ＩＴＦ融合をコードする遺伝子を含有していた。この中間体プラスミドをｐＡＰＩ４７０と命名した。
【００９１】
ｐＡＰＩ４７０から得られたＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦを含有するＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ（Ｍｕｎｇマメヌクレアーゼにより平滑末端化）及びＸｈｏＩで消化し、ｐＡＰＩ４０５のＮａｅｌ及びＸｈｏＩ部位にクローニングした。ｐＡＰＩ４０５及びｐＡＰＩ４７０消化物の両ＤＮＡセグメントを１％アガロースゲルから精製し、ライゲーションした。プラスミドｐＡＰＩ４０５はコメＧｔ１プロモーターカセットベクターｐＡＰＩ１４１の誘導体であり、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド及びｎｏｓターミネーター領域を含有している。ｐＡＰＩ４０５のＧｔ１プロモーターとｎｏｓターミネーターの間のリンカー領域は１．８ＫｂのＧｕｓ遺伝子ｓｔｕｆｆｅｒフラグメントを含有している。得られたｐＡＰＩ４７１プラスミドはコメＧｔ１プロモーター、コメＧｔ１シグナルペプチド、融合担体としてのコメグロブリン蛋白、コドン最適化ＩＴＦ遺伝子にインフレームに融合したエンテロキナーゼ切断部位（Ｇｔ１プロモーター／Ｇｔ１ｓｇ−Ｇｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ）及びｎｏｓターミネーター領域を含有している。
【００９２】
図３は成熟コメ穀粒中のＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現のためのキメラ遺伝子コンストラクトを含有するプラスミドｐＡＰＩ４７１を示す。融合蛋白の発現は記載されている通りコメＧｔ１プロモーターの制御下にある。カナマイシンはプラスミド上の細菌選択マーカーを示す。該当する制限酵素部位を示す。
【実施例２】
【００９３】
コメ形質転換及び植物再生
Ｇｎｓ９プロモーターにより駆動されるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ）遺伝子よりなり、ＮＯＳターミネーターが後続する選択可能なマーカープラスミドｐＡＰＩ１７６は全ての植物形質転換のための選択可能なマーカーＤＮＡセグメントを与えた。プラスミドＤＮＡを適切な酵素で消化することによりＤＮＡを線状化し、次に１％低融点アガロースゲルにより分離した。分離後、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルスライスから溶離させ、アガロースをアガラーゼ（Ａｇａｒａｓｅ）で消化することにより除去した。
【００９４】
ＤＮＡを沈殿させ、ゲル上で泳動させることにより、未損傷プラスミドＤＮＡに関して線状ＤＮＡの純度を確認した。合計５０μｌの金粒子を０．６５μｇのＤＮＡでコーティングし、そして選択されたマーカーフラグメント及び標的遺伝子フラグメントのＤＮＡ量を１：１のモル比で計算した。未成熟コメ胚から得られたコメカルスをファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）（Ｍｏｌｅｃ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ １０，８３−９４，２００１）に記載の通り形質転換のために調製した。コメのマイクロプロジェクタイル媒介の形質転換はファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）の記載した操作法に従って実施した。トランスジェニックコメ植物を温室において成熟時まで生育させ、種子を収穫した。
【実施例３】
【００９５】
成熟コメ穀粒中のＩＴＦ含有融合蛋白発現の分析
蛋白抽出のためにＩＴＦ融合蛋白のコンストラクトを含有するトランスジェニック植物に由来する個々の脱穀したコメ穀粒を粉砕プレートのウェル中に入れた。各ウェルに抽出緩衝液であるトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）＋０．３５ＭＮａＣｌ０．２ｍｌを添加した。穀粒をゲノムグラインダー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ）を用いて１２分間１３００ストローク／分で粉砕した。得られた種子抽出液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、種子上澄みを新しいプレートに移した。
或いは、１０脱穀コメ穀粒を合わせ、抽出緩衝液であるＴＢＳ＋０．３５ＭＮａＣｌ２ｍｌ中において乳鉢で粉砕し、次に３７℃で１．５時間混合した。混合スラリーを１２０００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、上澄みを２ｍｌエッペンドルフ試験管に移し、後の分析のために−２０℃で保存した。
【００９６】
発現水準の分析のために、合計３２μｌ（約５０〜６０μｇ総蛋白）の個々の種子上澄みを４〜２０％プレキャストポリアクリルアミドゲル上で分割した（カリフォルニア州カールスバッドのノーベックス（Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。ゲルを染色溶液である０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、次に脱色して蛋白バンドを可視化した。ウエスタンブロット分析のためにゲルを０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロットし、３時間リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中５％のノンファットドライミルクでブロッキングし、次にＰＢＳ中ですすいだ。一時抗体と共にインキュベートするために、ＩＴＦに対するマウスモノクローナル抗体（ジーアイラボラトリーズ（ＧＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を一次抗体溶液である０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中５％ＢＳＡ中１：１０００希釈で使用した。ブロットは一夜溶液中でインキュベートした。
【００９７】
得られたブロットを各々１０分間ＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（カリフォルニア州バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ））をブロッキング緩衝液中１：４０００に希釈した。次にメンブレンを二次抗体溶液中で２時間インキュベートし、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。発色は基質ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（シグマ社、ミズーリ州セントルイス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を添加することにより開始させ、そして所望の強度のバンドが達成された後に水でブロットをすすぐことにより操作を終了した。
【００９８】
図４はクーマシー染色ＰＡＧＥにより分割したＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現を示す。個々のＲ１世代の種子蛋白抽出液約５０〜６０μｇをトランスジェニックライスイベント４７１−７０から調製し、４〜２０％ＰＡＧＥ上で分割した。レーン１は非トランスジェニックコメ種Ｔａｐｅｉ３０９（ＴＰ３０９）由来の対照抽出液を指す。４７１−７０形質転換イベントの７種の分割された個々の種子の抽出液をレーン２〜４及び６〜９に示す。分子量マーカーはレーン５に示す。存在する融合蛋白の量を推定するために、約５μｇのマーカー蛋白である２３ｋＤａの炭酸アンヒドラーゼ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を発現水準の比較参照物質としてゲル（レーン１０）にロードした。レーン４７１−７０−２、４７１−７０−４及び４７１−７０−５は約１０μｇのＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白のバンドを含有すると推定される。内因性またはネイティブの１９ｋＤａのグロブリン蛋白及び約２８ｋＤａのＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の位置は矢印で示す。矢印で示すＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白に相当するこのバンドは対照ＴＰ３０９には存在していない。
種子抽出液の容量の六分の一をゲルにロードしたため、総融合蛋白は約６０μｇ／穀粒または総穀粒重量の０．３％と推定される。穀粒当たり総蛋白の約３００〜４００μｇが一般的に抽出緩衝液で抽出され、従って組み換え融合蛋白は総可溶性蛋白の約１５〜２０％である。ＩＴＦは重量において融合蛋白の約四分の一であり、従って、ＩＴＦは約１５μｇ／穀粒または０．０７５％穀粒重量である。
【００９９】
図５はウエスタンブロット分析によるＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白のＩＴＦ部分の検出を示す。２つのトランスジェニック試料（合わせた種子試料）及びＴＰ３０９非トランスジェニック試料を２つの同一ゲル上で泳動させた。１つのゲルはクーマシー染色して全蛋白を可視化し、他方のゲルは特異的抗ＩＴＦ抗体を用いてプロービングした。クーマシー染色ゲルで可視化した融合蛋白バンドはウエスタンブロットにおいて抗体により検出することにより、組み換えコメ穀粒中の融合蛋白として成熟ＩＴＦの発現を確認した。
【０１００】
本発明は小型非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間にインフレームに操作されたメチオニンまたはトリプトファン残基を場合により含む小型非相同ペプチドまたはポリペプチド及び単子葉植物種子貯蔵蛋白を含む融合コンストラクトの発現を可能にする。このような融合コンストラクトの発現はトランスジェニックコメ種子中で＞１００μｇ／穀粒の水準まで達している。ＡＯＤの外に、本発明の良好な方法は栄養学的、薬理学的及び医療上重要な種々のペプチドの発現を可能とする。これ等には、これには限らないが、肥満治療用ペプチド、例えばＰＹＹ、ペプチド抗生物質、例えばイセガナン及びβ−デフェンシン、成熟ペプチド成長因子、例えばＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ及びＩＴＦ、抗ＨＩＶペプチド、例えばＦｕｚｅｏｎ及び誘導体、ペプチドホルモン及びペプチドホルモンフラグメント、例えば副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、アデノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）及び高血圧を治療するためのペプチド、例えば血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）及び血管内皮生育抑制剤（ＶＥＧＩ）が包含される。この特定の融合手法はまた、種々の細菌及びウィルス性疾患の経口免疫化のために使用できるこれ等の疾患に特異的な抗原性ポリペプチドエピトープの高水準発現のために利用してよい。
【０１０１】
種子保存蛋白融合相手としてのコメグロブリン
コメ種子貯蔵蛋白抽出液の２次元ゲル電気泳動によれば、１９ｋＤａのグロブリン蛋白は完全ではないが大部分は単一成分であり、蛋白のファミリーとして存在するとは考えられない。１９ｋＤａグロブリン蛋白のコメ内乳中の含有量はグルテン蛋白含有量の概ね１０％であるが、１９ｋＤａグロブリン蛋白はコメ内乳における単一の遺伝子の最も大量の産物であり、そして、この観点において、コメ内乳における非相同ペプチドの発現のための融合担体として操作するために最も優れた選択肢である。グロブリン遺伝子を予め単離し、特性化し、ＤＮＡ配列を決定した。非相同ペプチドの高水準発現のために潜在的融合相手として使用してよい別の単子葉植物種子蛋白は、コメグルテリン、オリジン及びプロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン及びグルテニン、トウモロコシゼイン及びグルテリン、エンバクグルテリン、モロコシカフィリン、アワペニセチン及びライムギセカリンを包含する。
【実施例４】
【０１０２】
ヒトＡＯＤ９６０４配列及びプラスミド構築
ヒトＡＯＤ９６０４ＤＮＡ配列はヒト成長ホルモンのＣ末端フラグメントに基づくものとした（Ｎａｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３，１０１１−１０２１，１９９４）。配列は１６アミノ酸のＡＯＤペプチドに対するオープンリーディングフレームをコードし、オーストラリアメルボルンのメタボリックスリミテッド（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓ Ｌｔｄ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，ＡＵＳ）により提供されたものである。コメ穀粒中におけるＡＯＤの発現のために、１６アミノ酸ＡＯＤペプチドをコードするＤＮＡ配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化（図６）した。
【０１０３】
３組み換えＤＮＡをコメ穀粒中でＡＯＤを発現するために調製した。第１に、グロブリン貯蔵蛋白の成熟部分（ＧＬＢ）、トリプトファン残基及びＡＯＤ９６０４ペプチドを含有する完全合成遺伝子を合成した（コメ好適コドン使用）。この合成遺伝子はＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白をコードしている。更に、ネイティブの成熟グロブリン中の唯一のトリプトファン残基をこのＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白中でプロリン残基（アミノ酸１２７位）に変換する（図８）ことにより、最終的に成熟グロブリン蛋白のＣ末端に新しく導入されたトリプトファン残基においてＮ−クロロスクシンイミドによるグロブリン融合担体からのＡＯＤペプチドの化学的放出を促進させた（図８）。
【０１０４】
ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ遺伝子フラグメントを制限酵素ＰｍＩ及びＸｈｏで切り出し、ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ遺伝子を含有するこの平滑末端／ＸｈｏＤＮＡセグメントを１％アガロースゲルから単離し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出プロトコルを用いて精製した。プラスミドｐＡＰＩ４０５を含有するＧｔ１プロモーター／シグナルペプチド発現カセットをＮａｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、ベクターＤＮＡもまた１％アガロースゲル上で単離し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出プロトコルを用いて精製した。２つのＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、そしてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。得られたプラスミド（ｐＡＰＩ５０６）はコメＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白コーディング領域及びｎｏｓターミネーター３’領域を含有していた。全発現カセット（Ｇｔ１プロモーター／Ｇｔ１ｓｐ：ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白／ｎｏｓターミネーター領域）を酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてプラスミドｐＡＰＩ５０６から切り出し、これ等と同じ制限部位においてバイナリベクタープラスミドｐＪＨ２６００（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，１９１４−１９１９，２０００）内にクローニングすることにより、全発現カセット（図８）を含有するバイナリプラスミドｐＡＰＩ５０７を形成した。
【０１０５】
グロブリン遺伝子のＮ末端の第２の融合物はコメ好適コドンを用いて合成した。トリプトファンを化学的切断により融合物からＡＯＤを放出させるために融合物とＡＯＤとの間に操作した（図１０）。合成した遺伝子フラグメントをＳｃｈＩ／ＸｈｏＩで消化し、次にＮａｅｌ／ＸｈｏＩにより消化したｐＡＰＩ４０５に直接クローニングすることにより中間体プラスミドｐＡＰＩ５００を作成した。全発現カセット及びｐＡＰＩ５００由来融合／ＡＯＤを含有するフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、これ等と同じ制限部位においてバイナリベクタープラスミドｐＪＨ２６００内にクローニングすることにより、全発現カセット（図１１）を含有するバイナリプラスミドｐＡＰＩ５０２を形成した。
【０１０６】
第３の融合担体は突然変異したグロブリン遺伝子である。全メチオニンをセリンに突然変異させることにより臭化シアンの切断部位を排除し、全てのシステインをグリシンに突然変異させることによりジスルフィド結合を排除し、そして後の精製目的のためにＨｉｓ６タグを融合相手のＮ末端に連結した。別のメチオニンを臭化シアンによる切断部位を形成するために融合部とＡＯＤとの間に入れた。フラグメントはブルーへロンテクノロジーズ（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した（図１１）。合成フラグメントを制限酵素ＰｍＩ及びＸｈｏＩで切り出し、Ｇｔ１プロモーター／シグナル発現カセット（ｐＡＰＩ４０５）内にクローニングすることにより中間体プラスミドｐＡＰＩ４９４を形成した。全発現カセット及びｐＡＰＩ４９４由来融合／ＡＯＤを含有するフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、これ等と同じ制限部位においてバイナリベクタープラスミドｐＪＨ２６００内にクローニングすることにより、全発現カセット（図１２）を含有するバイナリプラスミドｐＡＰＩ４９９を形成した。
【実施例５】
【０１０７】
コメ形質転換及び植物再生
バイナリベクターＪＨ２６００中のＴ−ＤＮＡの右及び左の境界によりフランキングされているＧｎｓ９プロモーターにより駆動されｎｏｓターミネーターが後続するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｂａｒ）遺伝子よりなる選択可能なマーカープラスミドｐＡＰＩ４１２は、全植物形質転換のための選択可能なマーカーＤＮＡセグメントを提供した。プラスミドｐＡＰＩ４１２及びｐＡＰＩ５０７、ｐＡＰＩ４９９及びｐＡＰＩ５０２をアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株内に独立して形質転換し、そして個々のプラスミドを含有するアグロバクテリウム株を選択培地上一夜生育後に１：１比で混合した。コメのアグロバクテリウム媒介形質転換は本質的には米国特許第５，５９１，６１６号に記載の操作法に従って実施した。成熟コメ胚より得たコメカルスをファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）の記載に従って形質転換用に調製した。コメ品種ＴＰ３０９から誘導したコメカルスにプラスミドｐＡＰＩ４１２及びＡＯＤプラスミドを含有するアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４を接種した。３日間の共インキュベーションの後、８〜９週間、カルスを５ｍｇ／ｌのビアラホスを含有する選択培地中に移した。生存カルスを再生培地上、次いで定着培地上で完全植物となるまで再生させた。トランスジェニック植物（以下の表１）は温室内で成熟するまで育成し、そしてＲ１種子を採取して発現の分析に付した。
【表１】
【実施例６】
【０１０８】
成熟コメ穀粒中のＡＯＤ含有融合蛋白発現の分析
蛋白抽出のためにＡＯＤ融合蛋白のコンストラクトを含有するトランスジェニック植物に由来する個々の脱穀したＲ１コメ穀粒を粉砕プレートのウェル中に入れた。各ウェルに抽出緩衝液であるトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）＋０．３５ＭＮａＣｌ０．２ｍｌを添加した。穀粒をゲノムグラインダー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ）を用いて１２分間３００ストローク／分で粉砕した。得られた種子抽出液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、種子上澄みを新しいプレートに移した。
或いは、１０脱穀コメ穀粒を合わせ、抽出緩衝液であるＴＢＳ＋０．３５ＭＮａＣｌ２ｍｌ中において乳鉢で粉砕し、次に３７℃で１．５時間混合した。混合スラリーを１２０００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、上澄みを２ｍｌエッペンドルフ試験管に移し、後の分析のために−２０℃で保存した。
【０１０９】
発現水準の分析のために、合計３２μｌ（約５０〜６０μｇ総蛋白）の個々の種子上澄みを４〜２０％プレキャストポリアクリルアミドゲル上（カリフォルニア州カールスバッドのノーベックス（Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で分割し、そして、ゲルを染色溶液である０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、次に脱色して蛋白バンドを可視化した。ウエスタンブロット分析のためにゲルを０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロットし、３時間ＰＢＳ中５％のノンファットドライミルクでブロッキングし、次にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ですすいだ。一次抗体と共にインキュベートするために、ＡＯＤ及びグロブリンに対するマウスモノクローナル抗体を一次抗体溶液である０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中５％ＢＳＡ中１：１０００希釈で使用し、そしてブロットは一夜溶液中でインキュベートした。
【０１１０】
得られたブロットを各々１０分間ＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（カリフォルニア州バイオラッド社(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ))をブロッキング緩衝液中１：４０００に希釈した。次にメンブレンを二次抗体溶液中で２時間インキュベートし、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。発色は基質ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（シグマ社、ミズーリ州セントルイス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を添加することにより開始させ、そして所望の強度のバンドが達成された後に水でブロットをすすぐことにより操作を終了した。
【０１１１】
図１３（ゲルＢ）はクーマシー染色ＰＡＧＥにより分割したＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白の発現を示す。レーンＴＰ３０９は全ゲルにおける非トランスジェニック対照である。トランスジェニックイベント５０７−１３及び５０７−１７に由来する２つの独立した種子の試料の抽出液を示す。ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白は全ゲル中矢印で示す（融合）。このバンドは対照のＴＰ３０９レーンには存在しない。図１３（ゲルＣ）はまたウエスタン分析によるＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白としてのＡＯＤ部分の検出を示す。２つのトランスジェニックの合わせた種子試料（５０７−１３及び５０７−１７）をＴＰ３０９非トランスジェニック試料と共に泳動させ、ウエスタンブロットに付し、そして融合蛋白を抗ＡＯＤ抗血清で可視化した。融合蛋白のバンドはまた、ウエスタンブロットにおいてグロブリン特異的抗体を用いたウエスタンブロット（ゲルＡ）により可視化することにより組み換えコメ穀粒中のＧＬＢ融合蛋白としてのＡＯＤペプチドの発現を確認した。コメ穀粒中の融合蛋白の初期の発現推定値は１００〜１５０μｇ／種子である。これは穀粒重量の０．５〜０．７５％に相当する。融合蛋白は成熟グロブリンＣＡの約１／１０の大きさであるため、ＡＯＤ９６０４ペプチドの発現は総穀粒重量の概ね０．０５〜０．０７５％である。
【０１１２】
本発明者等は同じ方法を用いてコンストラクトｐＡＰＩ４４９から作成したトランスジェニック植物をスクリーニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを使用し、このコンストラクトについて合計７０植物がＨｉｓ６−ｍＧＬＢ−ＡＯＤ融合物を発現することが検出された。このコンストラクト由来のＡＯＤ９６０４融合蛋白の最高発現を示した上位７植物系統を図１４に示す。このコンストラクトについて植物の最高の系統である４９９−１０５の発現水準は５．６ｍｇ／ｇ粉体または穀粒重量の０．５６％であった。このコンストラクトにおけるＡＯＤ９６０４融合蛋白はＨｉｓタグを含有しているため、分子質量はｐＡＰＩ５０７コンストラクトのＡＯＤ９６０４融合物よりも僅かに高値となる。融合蛋白は同じ分子質量を有するネイティブの蛋白と重複している（図１４）。即ち、発現水準はこの系統に対しては、陰性対照親系統（ＴＰ３０９）がＫｏｄａｋゲルドキュメンテーションソフトウエアを用いて差し引かれているとはいえ、過大評価される可能性がある。
【０１１３】
コンストラクトｐＡＰＩ５０２については、１６４のトランスジェニック植物中１１８がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによりスクリーニングされた。クーマシー染色ゲルではｎＧＬＢ−ＡＯＤ融合物を観察することが困難であったがウエスタンブロット分析によればｎＧＬＢ−ＡＯＤ融合物が検出された。ウエスタンブロットを用いて分析した場合、４８のトランスジェニック植物が陽性シグナルを有していた（図１４）。このコンストラクトからの最良の植物系統におけるｎＧＬＢ−ＡＯＤ９６０４融合物の発現水準は１５μｇ／ｇ粉体と推定される。これは、この融合方法が他の２つの融合相手と比較してＡＯＤ９６０４の高発現水準をもたらさないことを示している。
【実施例７】
【０１１４】
ヒトインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）配列及びプラスミド構築
ヒトＩＧＦ−１ＤＮＡ配列はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｍ１１５６８のゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）蛋白配列に基づいたものとした。配列は７０アミノ酸ペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。コメ穀粒中のＩＧＦ−１の発現のために、７０アミノ酸ＩＧＦ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化した（図１６）。２組み換えＤＮＡをコメ穀粒中でＩＧＦ−１を発現するために調製した。第１に、グロブリン貯蔵蛋白の成熟部分（ＧＬＢ）、トリプトファン残基及びＩＧＦ−１ペプチドを含有する完全合成遺伝子を合成した（コメ好適コドン使用）。この合成遺伝子はＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１融合蛋白をコードしている。更に、ネイティブの成熟グロブリン中の唯一のトリプトファン残基をこのＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１融合蛋白中でプロリン残基（アミノ酸１２７位）に変換する（図１８）ことにより、最終的に成熟グロブリン蛋白のＣ末端に新しく導入されたトリプトファン残基においてＮ−クロロスクシンイミドによるグロブリン融合担体からのＩＧＦ−１ペプチドの化学的放出を促進させた（図１８）。
【０１１５】
ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１遺伝子フラグメントを制限酵素ＰｍＩ及びＸｈｏで切り出し、ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１遺伝子を含有するこの平滑末端／ＸｈｏＤＮＡセグメントを１％アガロースゲルから単離し、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出プロトコルを用いて精製した。プラスミドｐＡＰＩ４０５を含有するＧｔ１プロモーター／シグナルペプチド発現カセットをＮａｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、ベクターＤＮＡもまた１％アガロースゲル上で単離し、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出プロトコルを用いて精製した。２つのＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、そしてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。得られたプラスミドはコメＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１融合蛋白コーディング領域及びｎｏｓターミネーター３’領域を含有していた（図１９）。
【０１１６】
第２の融合相手はグルテリンの塩基性サブユニットである。融合相手とＩＧＦの間にトリプトファン残基を有するこのフラグメントはコメ好適コドンを用いてブルーへロンテクノロジーズ（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した（図１８）。フラグメントをＰｍＩ及びＸｈｏＩで切り出し、ｐＡＰＩ４０５内にクローニングすることによりプラスミドｐＡＰＩ５２１を形成した（図２０）。
【実施例８】
【０１１７】
コメ形質転換及び植物再生
約２００個のＴＰ３０９種子を脱穀し、５０％ｖ／ｖの市販脱色剤で２５分間滅菌し、各々５分間３回滅菌水で洗浄した。滅菌した種子を１０日間２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加したＮ６培地の入ったプレート７枚上に置き、カルス形成を誘導した。一次カルスを切り出し、３週間新鮮Ｎ６培地上に置いた。二次カルスを一次カルスから分離し、同じＮ６培地上において３次カルスを形成させた。３次カルスをボンバードメントに使用するか、２週おきに４〜５回継代培養した。各継代培養のカルスをボンバードメントに用いることができる。
【０１１８】
直径１〜４ｍｍのカルスを選択し、ボンバードメントの前５〜２４時間０．３Ｍマンニトール及び０．３Ｍソルビトールを含有するＮ６培地上に４ｃｍの円形に置いた。バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ボンバードメントをバイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ） ＰＤＣ−１０００／Ｈｅシステム（バイオラッド社(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)）を用いて実施した。操作には２．５μｇの選択可能なマーカーＤＮＡ及び共転移プラスミドＤＮＡ（ｐＡＰＩ５２０またはｐＡＰＩ５２１）を１対３の比でコーティングした金粒子１．５ｍｇ（６０μｇ／μｌ）を要した。ＤＮＡコーティング金粒子を１１００ｐｓｉのヘリウム圧でコメカルス内へのボンバードメントに付した。ボンバードメントの後、カルスを４８時間同じプレート上で回復させ、次に５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを含有するＮ６培地に移した。
【０１１９】
ボンバードメントに付したカルスを４５日間２６℃で暗所、選択培地上でインキュベートした。この時点で、白色不透明緻密であり、黄色または茶色であり軟質で含水性の非形質転換対と容易に識別できる形質転換体を今度はハイグロマイシンＢ非含有のＮ６（２，４−Ｄ非含有）３ｍｇ／ｌＢＡＰ及び１ｍｇ／ｌのＮＡＡよりなる再生培地に移し、約２〜３週間連続照明条件下において培養した。
【０１２０】
再生された植物が１〜３ｃｍの丈になった時点で、幼植物体をＭＳ培地の半分の濃度で有り０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡを含有する定着培地に移した。２週間以内に、定着培地中の幼植物体は発根し、その新芽は１０ｃｍ超の長さとなった。次に植物を５０％市販土壌Ｓｕｎｓｈｉｎｅ＃１（ワシントン州サングロホルティカルチャー有限会社（Ｓａｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ，ＷＡ））及び５０％水田由来自然土壌の入った２．５インチのポットに移した。ポットをプラスチック容器に入れ、これを別の透明プラスチック容器で覆うことにより高湿度を維持した。植物は継続照明下に１週間培養した。次に透明プラスチックカバーを一日の期間に渡ってゆっくり移動させることにより湿度を徐々に低下させた。その後、プラスチックカバーを完全に取り外し、水及び肥料を必要に応じて添加した。植物が約１２ｃｍの丈となった時点で温室に移し、そこで生育させ成熟させた。
【０１２１】
本発明は特定の実施形態を用いて上記の通り説明したが説明及び実施例は本発明の構造的及び機能的原理を説明することを意図しており、本発明の範囲を限定する意図はない。むしろ本発明はその精神及び添付請求項の範囲内における全ての変更、改変及び置き換えを包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】コメ穀粒中の腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）の６０アミノ酸成熟部分の発現のためのコドン最適化ＤＮＡ配列の比較を示す。
【図２】融合担体としての１９ｋＤａグロブリン蛋白（Ｇｌｂ）、エンテロキナーゼ（ｅｋ）切断部位及び成熟ＩＴＦ蛋白と融合させた構築されたＧｔ１シグナルペプチドに関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示し、全ては同じ翻訳リーディングフレーム内に融合されている。
【図３】成熟コメ穀粒中のＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現のためのキメラ遺伝子コンストラクトを含有するプラスミドｐＡＰＩ４７１を示す。
【図４】成熟コメ穀粒中のＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現水準を示す。
【図５】Ｇｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の部分としてのＩＴＦ発現のウエスタンブロット分析を示す。
【図６】コメ穀粒中の１６アミノ酸ＡＯＤ９６０４（ＡＯＤ）ペプチドの発現に関するコドン最適化ＤＮＡ配列の比較を示す。
【図７】同じ翻訳リーディングフレーム内に全て融合された融合担体としての１９ｋＤａグロブリン蛋白（Ｇｌｂ）、アミノ酸トリプトファンの化学切断に基づいた切断部位（＃で示す）及びＡＯＤペプチドに融合させた構築されたＧｔ１シグナルペプチドに関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す。
【図８】成熟コメ穀粒におけるＧｌｂ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白の発現を特定するキメラ遺伝子コンストラクトを含有するプラスミドｐＡＰＩ５０７を示す。
【図９】グロブリン−Ｍ−ＡＯＤ９６０４融合ポリペプチドのＮ末端領域のＤＮＡ及びアミノ酸の配列を示す。
【図１０】Ｈｉｓ６−突然変異グロブリン−Ｍ−ＡＯＤ９６０４ポリペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１】プラスミドｐＰＡＩ５０２を示す。
【図１２】プラスミドｐＡＰＩ４９９を示す。
【図１３】融合相手−及びＡＯＤ９６０４−特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるＡＯＤ９６０４融合同一性を確認したものである。総蛋白は６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ及び２％βメルカプトエタノールで抽出した。パネルＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。パネルＢ及びＣはそれぞれＡＯＤ９６０４及びグロブリンに対する抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。レーン１は陰性対照であるＴＰ３０９であり、レーン２及び３はトランスジェニック系統５０７−１３を示す。レーン４はトランスジェニック系統５０７−１７である。総蛋白抽出緩衝液２０ミリリットルを用いて１グラムトランスジェニックコムギを抽出し、そして抽出液１５μｌをロードした。
【図１４】ｐＡＰＩ４９９コンストラクト由来のＡＯＤ９６０４融合蛋白を発現する上位７系統のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。ブラウン種子の第１世代由来のコメ粉１グラムをＴＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌ２５ｍｌで２時間抽出した。スラリーを５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを１５ｍｌの２％ＳＤＳ及び０．２％ベータ−メルカプトエタノールで抽出した。抽出液１ミリリットルを取り出し、１２分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み３５ｍｌをロードし、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルをクーマシーブルー染色溶液で染色した。
【図１５】ｎＧＬＢ−ＡＯＤ融合蛋白のウエスタンブロットを示す。第１世代の種子由来のコメ粉１グラムをＴＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌ２５ｍｌで２時間抽出した。スラリーを５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを１５ｍｌの２％ＳＤＳ及び２％ベータ−メルカプトエタノールで抽出した。抽出液１ミリリットルを取り出し、１２分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み４０μｌをロードした。
【図１６】ネイティブのＩＧＦ−１へのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１ｏｐｔ）のコドン最適化の比較を示す。
【図１７】ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１８】グルテリン−Ｗ−ＩＧＦの塩基性サブユニットのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１９】プラスミドｐＡＰＩ５２０を示す。
【図２０】プラスミドｐＡＰＩ５２１を示す。
【関連出願のクロスリファレンス】
【０００１】
本発明は２００３年１２月９日出願の米国仮出願６０／５２７，７５３及び２００４年１０月１日出願の米国仮出願６０／６１４，５４６の優先権を主張する。両出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明はヒト及び動物の栄養及び治療用の組成物を作成する場合に使用する、コメ植物のような単子葉植物の種子における非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現に関する。発現は単子葉植物種子貯蔵蛋白が非相同ペプチドまたはポリペプチドのための融合蛋白担体として使用される融合蛋白コンストラクトの形成により最適化される。非相同ペプチドまたはポリペプチドは小型で即ち約１０ｋＤａ以下であり、好ましくは５〜１００アミノ酸長である。
【背景技術】
【０００３】
多くの非相同ペプチド及びポリペプチドは栄養または治療用途に多くの量が必要であることにより、または、世界人口によるこれ等の非相同ペプチドの需要が高いことにより、供給不足となっている。２００アミノ酸未満、好ましくは５〜１００までのアミノ酸長の非相同ペプチドまたはポリペプチドが多くの用途、例えば抗体結合エピトープ、抗微生物剤、ＡＩＤＳ及び癌の治療及び／または種々の疾患の診断試験のために有用である。更に、特定の非相同ペプチドまたはポリペプチドはその生化学的及び生物学的機能を付与するために大量に必要となる。単子葉植物中に非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現することは高まる需要を満たす１つの方法である。
【０００４】
化学合成法は通常非相同ペプチドまたはポリペプチド分子の生成のために使用される。しかしながら一部の非相同ペプチドの特定のアミノ酸配列は化学合成法により非相同ペプチドを製造することを困難または不可能とする場合がある。例えば、連続するイソロイシン及びバリン残基を含む配列は、その側鎖が嵩高なため、標的非相同ペプチドが樹脂系マトリックス上に化学的に構築される場合に、所定の非相同ペプチド鎖の凝集をもたらす疎水性βシートを形成することが可能である。化学合成法のこの複雑さにより所定の非相同ペプチドのコスト構造は多大に増大し、これにより商業上の障壁となる。
【０００５】
代替法として、商業的な量で非相同ペプチドまたはポリペプチドを生成する手段に相当する低コストの組み換え発現プラットホームの開発がある。標的非相同ペプチドまたはポリペプチドをより大型の蛋白相手に結合させたキメラ融合蛋白の作成は生物学的系におけるこれ等の化合物の生成を改善するための１つの手法である。融合相手は蛋白の全体の大きさを増大させることにより、標的非相同ペプチドまたはポリペプチドの質量ベースの発現水準及び潜在的安定性を向上させる。
【０００６】
融合の手法は種々の系、例えば細菌、コウボ及びカビ、昆虫及び哺乳類細胞において良好に使用されている。各宿主発現系はその関連する利点及び難点を有する。
歴史的には、高等植物における蛋白融合系は細胞内小器官内に外来蛋白を効率的に移入するための内因性植物蛋白のトランジット及び／またはシグナルペプチド及びＮ末端成熟領域を使用することに限定されていたか、または、選択的植物遺伝子発現をモニタリング、安定化及び／または増量するために利用されているＧＵＳまたはＧＦＰのようなマーカー蛋白のために使用されていた。
【０００７】
上記した通り、非相同ペプチドまたはポリペプチドの生成に直面している重大な問題点は製造コストである。トランスジェニック植物は期待される需要を満たすために大量の生成物が必要とされる化合物の発現系のための宿主として魅力的である。トランスジェニック作物の利点は、トランスジェニック植物が動物ウィルス及び場合により微生物宿主に伴う毒素を含有しないことから、資本投資が低いこと、スケールアップがより容易であること、そして病原汚染が低リスクであることである。しかしながら非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現の水準は低く、そして精製工程は高コストであり、このような発現系を商業的に実施不可能にしている。
【０００８】
即ち、融合法を利用することにより非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を増大可能である。本発明以前に、融合蛋白は例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる以下に記載する参考文献に開示されている通り植物において発現されているものの、単子葉植物種子貯蔵蛋白は非相同ペプチドまたはポリペプチドのための融合担体として利用されてはいなかった。
【０００９】
米国特許第５，２９２，６４６号は宿主細胞を培養して切断部位を与えるリンカーペプチドを場合により含有する選択された非相同ペプチドまたは蛋白に融合したチオレドキシン様蛋白配列を含む融合蛋白を製造することによる、可溶性組み換え蛋白の発現を開示している。
【００１０】
米国特許第６，０８０，５５９号は組み換えプラスミドを含有する形質転換されたアスペルギルスのカビ細胞を培養することによる、アスペルギルス中の融合蛋白からのプロセシングされたリコラクトフェリン及びラクトフェリンポリペプチドフラグメントの発現を開示している。
【００１１】
ＷＯ９７／２８２７２はヒンジ領域、親水性スペーサー及び２塩基性のアミノ酸エンドプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドにより目的蛋白に融合したＦｃフラグメントのような別のドメイン及び／またはエレメントを有する融合蛋白から真正の組み換え蛋白の発現を開示しており、ここではスペーサーが切断され、次にカルボキシペプチダーゼＢで消化されて真正の蛋白が形成される。
【００１２】
米国特許第５，５９５，８８７号は融合担体としてのヒト炭酸アンヒドラーゼ及び小分子ペプチドのための親和性タグの使用を開示している。
【００１３】
米国特許第５，６８６，０７９号は細菌βガラクトシダーゼ（ｌａｃ）蛋白及び細菌ＳｐＡ蛋白の小区分よりなる融合蛋白のトランスジェニック植物、特にトランスジェニックタバコ植物葉中の発現を開示している。融合蛋白の発現水準は葉組織の新鮮重量で０．００２％であった。
【００１４】
米国特許第５，７６７，３７２号は細菌ｎｐｔＩＩ蛋白のＮ末端部分及びＢｔ毒素ポリペプチドの毒性部分よりなる融合蛋白の植物、特にトランスジェニックタバコカルス及びトランスジェニックタバコ葉中の発現を開示している。発現水準は融合蛋白については非常に低値であり、２５〜５０ｎｇ／ｇ植物組織新鮮重量（０．００００５％）であった。
【００１５】
米国特許第５，８６１，２７７号はアラビドプシスＰＡＴ１蛋白のＮ末端部分及び細菌ＧＵＳ蛋白よりなる融合蛋白のトランスジェニックアラビドプシス植物中の発現を開示している。融合産物の発現水準は詳述されていない。
【００１６】
米国特許第５，９２９，３０４号は精製を容易にするためにＦＬＡＧ（登録商標）融合蛋白と共に融合蛋白コンストラクト内に取り込まれたヒトリソソーム酵素のトランスジェニックタバコ植物中の発現を開示している。ｈＧＣ（ヒトグルコセレブリオシダーゼ）に関する融合産物の発現は約２．５ｍｇ／１．６ｋｇ（０．００１５％）タバコ葉組織新鮮重量であった。
【００１７】
米国特許第５，９７７，４３８号は細菌マラリア表面抗原の１２アミノ酸ペプチド部分にカップリングした融合担体としてのタバコモザイクウィルス被覆蛋白の部分を包含する融合蛋白の感染タバコ植物中の発現を開示している。この融合蛋白はウィルスベクター系を用いてタバコ中で発現されており、タバコ葉中の１２アミノ酸ペプチドの発現は２５μｇ／ｇ（０．０００４％）葉組織新鮮重量で得られている。
【００１８】
米国特許第６，０１８，１０２号は植物ユビキチン蛋白部分を種々の小型溶解ペプチドのための担体分子として利用しているトランスジェニックバレイショ葉及び塊茎における発現のための融合蛋白の予測的構築を開示している。
【００１９】
米国特許第６，２８８，３０４号が融合担体としてのブラシカ油脂体蛋白オレオシンのＮ末端領域よりなる融合蛋白を用いた脂肪種子作物セイヨウナタネの種子中のソマトトロピン（成長ホルモン）の発現を開示している。
【００２０】
米国特許第６，３３１，４１６号はトランスジェニックバレイショ塊茎における種々の融合ポリペプチドの発現のための予測的コンストラクトを開示している。提案されているＮ末端融合担体は安定な植物発現を達成するための何れかの非植物蛋白に融合された細菌セルロース結合ドメインイン（ＣＢＤ）である。
【００２１】
米国特許第６，４４８，０７０号は融合蛋白がアルファルファモザイクウィルスカプシド蛋白及びＨＩＶ−１及び狂犬病の哺乳類ウィルスエピトープのＮ末端部分よりなる、植物、特に単離されたタバコプロトプラストまたはウィルス感染タバコ植物中の融合蛋白の構築及び発現を開示している。融合蛋白発現の水準は詳述されていない。
【００２２】
米国特許第６，４５５，７５９号は植物ユビキチン連結ドメインにより連結された２種の蛋白、例えばマーカー蛋白ルシフェラーゼ及びベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）よりなる融合手法のタバコ等のトランスジェニック被子植物中の発現を開示している。この融合蛋白の発現水準は記載されていない。
【００２３】
米国特許出願第２００２／０１４６７７９号は細菌、コウボ、動物及び植物を包含する種々のトランスジェニック系におけるオーセンティックアミノ末端アミノ酸を有する組み換えポリペプチドの高生産のための融合蛋白の使用を開示している。植物または植物細胞における如何なる融合蛋白の発現に関するデータも提示されておらず、また植物における如何なるキメラ遺伝子融合蛋白コンストラクトの例も記載されていない。
【００２４】
米国特許出願第２００３／０１５９１８２号はコメを包含するトランスジェニック穀物の種子中のヘルペスウィルスエピトープの生産のためのシグナルペプチド融合蛋白の使用を開示している。ヘルペス表面抗原をターゲティングするためのシグナルペプチドを含有するプラスミドコンストラクトが詳述されている。コメ種子中において０．５％総蛋白の発現水準が得られている。融合担体としての単子葉植物種子貯蔵蛋白の利用に関する予測的な例またはデータは記載されていない。
【００２５】
シラーら（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）（ＥＭＢＯ Ｊ４，２５−３２，１９８５）はインビトロのタバコクロロプラスト内への細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）蛋白の輸送がｎｐｔに融合したタバコ小型サブユニット成熟蛋白の部分を用いて増強されることを開示している。
【００２６】
コマイら（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３１５１０４−１５１０９，１９８６）はインビトロ及びインビボのタバコクロロプラスト内への細菌５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート（ＥＳＰ）シンターゼの効率的な輸送がタバコ小型サブユニット蛋白の成熟部分と細菌ＥＳＰシンターゼとの間の融合を必要とすることを開示している。
【００２７】
これ等の特許または刊行物の何れも融合担体として単子葉植物種子貯蔵蛋白を用いた単子葉植物中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの高水準発現を開示していない。
生産系としてのトランスジェニック植物の使用は期待される需要を満たすために大量の生産を必要とする化合物にとって理想的であると考えられる。トランスジェニック作物の利点には低資本投資、スケールアップの容易性及び病原体汚染の低い危険性が包含される。コメ系の高水準発現系が開発されており、種々の蛋白を良好に生産している。
【００２８】
このような蛋白の１つは「トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメイン」１つ以上を含有する３小型ペプチドよりなる三つ葉因子ファミリー（ＴＦＦ）である。各トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインは約４０アミノ酸残基よりなる。各トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインは３つの高度な安定性を有するループに折り畳まれており、各ループは３つのシステイン媒介ジスルフィド結合中の１つにより形成されている。これ等の内部鎖ジスルフィド結合はその主要アミノ酸配列の順序に応じて１−５、２−４及び３−６配置において形成される。
【００２９】
全ての腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）ペプチドは高度に相同である。ヒトＩＴＦは７５アミノ酸ポリペプチドよりなる。Ｎ末端シグナルペプチドを切断した後、得られる成熟ヒトＩＴＦは６０アミノ酸を含有する。ヒトＩＴＦは胃腸組織内で単量体及び２量体の両方において存在する。
トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）モチーフのコンパクトな構造は蛋白分解性の消化に対するトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドの顕著な耐性の原因と考えられ、トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドを胃腸管の苛酷な環境において生存させ続けている。単一ドメインのヒトＩＴＦは７システイン残基を有し、そのうち６個はトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインの構造を維持することに関与している。７番目のシステイン残基はトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ドメインの部分ではなく、Ｃ末端の３残基上流に位置する。
【００３０】
ＩＴＦの幾つかの生物学的活性が発見されており、創傷治癒の促進、表皮細胞遊走の刺激及び小腸表皮障壁の保護も含まれる。即ちＩＴＦは種々の疾患状態の防止及び治療において使用できる。ＩＴＦの天然原料は結腸及び小腸の粘膜から調製されるが、収率は極めて低値であり、種々の疾患状態の防止及び治療における臨床使用に必要な大量のＩＴＦを提供することは不可能である。
【００３１】
ＩＴＦはまたハイブリッドのリーダー配列及び成熟ＩＴＦ配列よりなる融合蛋白をコードするように構築されているコウボ及び組み換えプラスミド中でも生成される。リーダー配列はコウボ細胞の分泌（及びプロセシング）経路内に融合蛋白を指向させる。発現水準は約１００ｍｇ／Ｌであるため、これ等の系からのＩＴＦの全体的な量はなお制限されている。
【００３２】
別の適切な蛋白はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に関与するものである。ｈＧＨはインビボで脂質分解／抗脂質形成作用を有し、これにより脂肪量の低減、非脂肪量の増大及び体重減少をもたらす。インビトロ及びインビボの試験によれば、この応答は部分的にはβアドレナリン受容体カップリング効率の増大、ホルモン感受性リパーゼの増大した活性及びインスリンの作用に対する抑制作用により媒介される。ｈＧＨ分子のカルボキシ末端（ｈＧＨ１７７−１９１｛ＡＯＤ９６０１｝）は未損傷ホルモンの脂質移動化ドメインとして発見されている。このフラグメントは脂肪細胞及び肝細胞内のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性を抑制し、そして単離された細胞及び組織の両方において脂質へのグルコースの取り込みを低減するように作用する。ｈＧＨの合成Ｃ末端フラグメント（ＡＯＤ９６０４）はｈＧＨの脂質分解作用の原因である脂質分解ドメインを含有する。親分子であるＡＯＤ９６０１はインビトロの死亡組織における脂質分解及び脂肪酸化を誘導する。インビボにおいては、ＡＯＤ９６０１は食物摂取に影響することなく体重減少をもたらし、脂質分解感受性を増大させ、そして、インスリン感受性の悪影響を及ぼすことなく脂肪酸化を増大させる。
【００３３】
ｈＧＨ及びＡＯＤ９６０４の両方に対する応答の性質は殆ど解明されていない。両方の分子は脂肪組織における主要な脂質分解組織であるＢ３−アドレナリン作用性受容体（Ｂ３−ＡＲｓ）の発現に影響するという仮説がある。ＡＯＤ９６０４及びｈＧＨは共にインビトロのマウス及びヒトの細胞系統においてＢ３−ＡＲｍＲＮＡ発現及び蛋白の濃度と機能を増大させることができる。このペプチドの高水準生産の機序は何れかの脂肪低減療法において将来の用途のために重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
本発明の１つの態様では、単子葉植物種子における非相同ペプチド又はポリペプチドを発現する方法であって、単子葉植物成熟種子発現系において非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白に融合させる工程、及び、成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程からなる方法を包含する。
【００３５】
本発明の別の態様によると、トランスジェニック単子葉植物種子中における少なくとも１５〜２０μg／穀物の濃度での融合コンストラクトの発現、即ち何れかの種子貯蔵蛋白融合手法の非存在下における非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現よりも実質的（約２０倍）に向上している発現を包含する。融合コンストラクトの発現は好ましくは穀物中の総可溶性蛋白の少なくとも３．０％、より好ましくは少なくとも５．０％である。
【００３６】
本発明の別の態様によると、成熟単子葉植物種子発現系における小型ポリペプチドと発現のための種子貯蔵蛋白とを融合させることによる非相同オリゴペプチド分子の高水準発現のための高度に良好な融合方法を含む。
【００３７】
本発明の別の態様では種子貯蔵蛋白と小型ポリペプチドの間に「フレームの中に入るように」操作された化学切断部位を与える戦略的トリプトファン残基を使用する。この部位は融合担体から成熟小型ポリペプチドを遊離させるために使用することもできる。
【００３８】
本発明の別の態様は、単子葉植物成熟種子発現系において小型非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白に融合させること、及び、成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現すること、を含む単子葉植物種子中における小型（約１０ｋＤａ以下及び／または５〜１００アミノ酸長）の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現のための方法を包含する。
【００３９】
本発明の別の態様によると、単子葉植物種子貯蔵蛋白及び小型非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナルペプチドを含む融合蛋白を含む。単子葉植物種子貯蔵蛋白は融合蛋白の小型非相同ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端側にあってよい。単子葉植物種子貯蔵蛋白は小型非相同ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端側に位置しているのが好ましい。
【００４０】
本発明の別の態様によると、小型非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間にフレームの中に入るように操作されたメチオニンまたはトリプトファンの残基を含む融合蛋白を含む。
【００４１】
本発明の別の態様によると、非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合された単子葉植物種子貯蔵蛋白担体からの非相同ペプチドまたはポリペプチドの最終的放出のための少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む。好ましくは、特異的プロテアーゼ切断部位はエンテロキナーゼ（ｅｋ）、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを含んでよい。
【００４２】
本発明の別の態様によると、臭化シアンのような化学切断剤を介した融合蛋白の切断を含む。
【００４３】
以上及びその他の本発明の特徴及び側面は以下の本発明の詳細な説明を添付図面と関連させて読むことにより更に十分明確化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての用語は以下に示す意味を有するか、または、本発明の技術分野の当業者に対してその用語が有する同じ意味と一般的に合致するものである。
【００４５】
本明細書においては、「種子」という用語は全ての種子要素、例えば種子の成熟中及び種子の発芽中における子葉鞘及び葉、幼根及び根鞘、菌甲、澱粉性内乳、アリューロン層、果皮及び／または外殻を包含する。本発明の意味においては、「種子」及び「穀粒」という用語は互換的に使用する。
「生物学的活性」という用語は当業者によりその蛋白に典型的に帰属させられる何れかの生物学的活性を指す。
「融合担体」及び「融合相手」という用語は当業者により理解されるとおり互換的に使用される。
【００４６】
「非相同ペプチドまたはポリペプチド」は目的の非相同ペプチドまたはポリペプチドに関するコーディング配列を含む。目的の非相同ペプチドまたはポリペプチドは好ましくは２００アミノ酸長未満である。好ましくは約１０ｋＤａ以下及び／または５〜１００アミノ酸を含むような小型非相同ペプチドまたはポリペプチドを本発明に従って使用する。例えば６０アミノ酸の腸ｔｒｅｆｏｉｌ因子を小型非相同ペプチドまたはポリペプチドとして利用してよい。
【００４７】
他の目的の非相同ペプチド及びポリペプチドは哺乳類起源のものである。このような非相同ペプチド及びポリペプチドはこれらには限らないが、例えば乳蛋白、血液蛋白（例えば血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または修飾第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン因子、Ｃ蛋白、フォンウイルブランド因子、抗トロンビンＩＩＩ及びエリスロポエチン）、コロニー刺激因子（例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、サイトカイン（例えばインターロイキン）、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、表面膜蛋白（例えば表面膜蛋白受容体）、Ｔ細胞受容体単位、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合性複合体抗原、構造蛋白（例えばコラーゲン、フィブロイン、エラスチン、チュブリン、アクチン及びミオシン）、成長因子受容体、哺乳類成長因子、成長ホルモン、細胞周期蛋白、ワクチン、フィブリノーゲン、トロンビン、サイトカイン、ヒアルロン酸及び抗体を包含する。
【００４８】
「哺乳類成長因子」という用語は、これらに限らないが、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、例えばＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−β及び−β−３、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、例えばＮＧＦ−β及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１−１９及び−１２β、及びこれ等の蛋白の生物学的に活性なフラグメントを包含する蛋白または生物学的に活性なそのフラグメントを指す。これ等及び他のヒト成長因子の配列は当業者のよく知る通りである。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳類成長因子はＩＴＦである。ＩＴＦの単子葉植物種子中の発現水準は１５〜２０μｇ／穀粒であることがより好ましい。
【００４９】
「乳蛋白」という用語は、これらに限らないが、例えばラクトフェリン、リソザイム、ラクトフェリシン、表皮成長因子、インスリン様成長因子−１、ラクトヘドリン、カッパ−カゼイン、ヘパトコリン、ラクトパーオキシダーゼ、免疫グロブリン及びアルファ−１−抗トリプシンを包含する蛋白またはその生物学的に活性なフラグメントを指す。好ましくは、乳蛋白はリソザイムまたはラクトフェリンである。
【００５０】
ペプチド性の産物が一般的に生じるが、細胞により生成された非ペプチド性の産物を改変する作用を有する遺伝子を導入してよい。その配列が天然のペプチドまたはポリペプチドに関連している限り、ペプチドまたはポリペプチドが全体として、または部分的に合成されたものであるかに関わらず、通常は少なくとも１０アミノ酸の、融合複合物、突然変異体及び合成のペプチドまたはポリペプチドの上記非相同ペプチドまたはポリペプチド及びそのフラグメントも生成してよい。
【００５１】
更にまた、単子葉植物種子の非相同ペプチドまたはポリペプチドの高水準発現を達成するためのこの良好な方法は栄養または治療上重要な種々の他の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を可能にする。それらには、これらには限らないが、例えば肥満を治療するためのペプチド、例えばＡＯＤ９６０４及びＰＹＹ、潜在的ペプチド抗生物質、例えばイセガナン及びβ−デフェンシン、成熟ペプチド成長因子、例えばＥＧＦ、ＩＧＦ及びＦＧＦ、抗ＨＩＶペプチド、例えばＦｕｚｅｏｎ及びその誘導体、ペプチドホルモン及びペプチドホルモンフラグメント、例えば副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、アデノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）及び高血圧を治療するためのペプチド、例えば血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）及び血管内皮生育抑制剤（ＶＥＧＩ）が包含される。
【００５２】
更にまた、ヒトまたは獣医科用途の非相同ペプチド及びポリペプチド、例えばワクチン及び成長ホルモンを生産してよい。目的のポリペプチドを含有する単子葉植物種子はマッシュ製品またはヒトまたは家畜用の適用に直接有用である種子製品に調製できる。
【００５３】
しかしながら遺伝子コードの固有の縮重により、実質的に同じか機能的に等価なアミノ酸配列をコード化する多くの核酸配列を形成し、そして所定の非相同ペプチドまたはポリペプチドをクローニング及び発現するために使用してよい。即ち、核酸配列をコードする所定の非相同ペプチドまたはポリペプチドについて、遺伝子コードの縮重の結果として同じ蛋白アミノ酸配列をコードする多くのコーディング配列が形成される場合がある。コーディング領域内のこのような置換は本発明の対象となる配列変異体の範囲内に属するものとする。これ等の配列変異体の全ては核酸配列をコード化する例示される非相同ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書に記載したものと同様の方法で利用できる。
【００５４】
当業者の知る通り、一部の場合においては、天然に存在しないコドンを保有するヌクレオチド配列をコード化する非相同ペプチドまたはポリペプチドを使用することが有利な場合がある。特定の真核生物の宿主により好まれるコドンを選択することにより、例えば発現率を上昇させたり、又は、天然に存在する配列から生成した転写物よりも望ましい特性、例えばより長い半減期を有する組み換えＲＮＡ転写物を生成することができる。例としては、コメにおいて発現される遺伝子に関するコドンは第３のコドン位置においてグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）リッチであることが示されてきた。低Ｇ＋Ｃ含量を高Ｇ＋Ｃ含量に変化させることは大麦穀粒中の外来性蛋白遺伝子の発現濃度を上昇させることがわかっている。本発明において使用されるＤＮＡ配列は遺伝子クローニングのための適切な制限部位に伴ったコメ遺伝子コドンの偏りに基づいていてよい。
【００５５】
「種子成熟」とは、穀粒の大型化及び穀粒の充填をもたらす、種子（穀粒）、例えば内乳、外殻、アリューロン層及び鱗性表皮における種々の組織に対する小胞ターゲティングの有無に関わらず、代謝可能な温存物、例えば糖類、オリゴ糖類、澱粉、フェノール類、アミノ酸及び蛋白が蓄積する受精と共に開始され、穀粒乾燥で終了する期間を指す。
【００５６】
本発明において有用となるプロモーターは植物細胞において活性である何れかのプロモーターである。使用されるプロモーターの型は重要ではなく、そして本発明の新しい特徴を構成しない。好ましい型のプロモーターは成熟特異的単子葉植物種子貯蔵蛋白（「成熟特異的蛋白プロモーター」として知られている）の遺伝子に由来するプロモーターである。「成熟特異的蛋白プロモーター」とは種子成熟の間に実質的にアップレギュレートされた活性（２５％超）を示すプロモーターを指す。
【００５７】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」（互換的に使用）とは種子内乳のような選択された細胞内または細胞外の領域に自身が結合しているペプチドまたは蛋白を位置決めするため、または、細胞からペプチドまたは蛋白を輸送するために有効であるＮ末端またはＣ末端のポリペプチド配列である。使用するシグナル配列は重要ではなく本発明の新しい特徴を構成しない。好ましくは、シグナル配列は、宿主細胞からの分泌の後、内乳細胞、より好ましくは内乳細胞の非細胞のコンパートメントまたは組織、例えば細胞内小胞または他の蛋白貯蔵体、クロロプラスト、ミトコンドリアまたは小胞体または細胞外空間のような位置に結合ペプチドまたは蛋白をターゲティングする。
【００５８】
本明細書においては、所定の細胞、ポリペプチド、核酸、形質または表現型に関連して「ネイティブ」または「野生型」という用語は、自然界に典型的に存在する形態を指す。
【００５９】
本明細書においては、「精製する」という用語は「単離する」という用語と互換的に使用し、そして一般的にそれが存在する、または生成される環境の他の成分からの特定の成分のいかなる分離をも指す。例えば、組み換え蛋白をそれが生成された植物細胞から精製することは、典型的には、トランスジェニック蛋白含有植物材料を沈降、遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィーのような分離手法に付すことを意味する。このような精製または単離何れかの工程による結果物は、それがその精製または単離の工程の前よりも他の成分（「不純物成分」）が少ない限り、他の成分をなお含有していてもよい。
【００６０】
本明細書においては、宿主細胞に言及した場合の「形質転換された」または「トランスジェニック」という用語はネイティブの宿主細胞には存在しない非ネイティブまたは非相同または導入された核酸配列を宿主細胞が含有することを意味する。
【００６１】
「操作可能に連結された」という用語は、本明細書においては、核酸が他の核酸配列と機能的関連を有するように位置づけられていることを意味する。例えばプロモーターはそれが配列の転写に影響する場合にコーディング配列に作動可能に連結されている。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００６２】
「単子葉植物種子貯蔵蛋白」または「成熟特異的単子葉植物種子貯蔵蛋白」（互換的に使用）という用語は、これらに限らないが、グロブリン、コメグルテリン、オリジン、プロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン及びグルテニン、トウモロコシゼイン及びグルテリン、エンバクグルテリン、モロコシカフィリン、アワペニセチンまたはライムギセカリンのような蛋白またはその生物学的に活性なフラグメントを指す。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態においては単子葉植物種子貯蔵蛋白はコメ由来の１９キロダルトン（ｋＤａ）のグロブリンである。グロブリン遺伝子を単離し、特性化し、そしてＤＮＡ配列を決定した。コメ種子貯蔵蛋白抽出液の２次元ゲル電気泳動によれば、１９キロダルトン（ｋＤａ）のグロブリン蛋白は完全ではないが大部分は単一成分であり、蛋白のファミリーとして存在するとは考えられない。１９ｋＤａグロブリン蛋白のコメ内乳中の含有量はグルテン蛋白含有量の概ね１０％であるが、１９ｋＤａグロブリン蛋白はコメ内乳における単一の遺伝子の最も大量の産物であり、そして、この観点において、コメ内乳における非相同ペプチドの発現のための融合担体として操作するために最も優れた選択肢である。
【００６４】
別の実施形態においては、本発明は種々の細菌及びウィルス性疾患の経口免疫化のために使用できるこれ等の疾患に特異的な非相同抗原性ポリペプチドエピトープの高水準発現を可能にする。
【００６５】
即ち、本発明は単子葉植物成熟種子発現系において単子葉植物種子貯蔵蛋白に非相同ペプチドまたはポリペプチドを融合することによる、非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を最適化するための高度に良好な融合方法を提供する。１つの好ましい実施形態においては、本発明はコメ成熟種子発現系におけるコメ種子貯蔵蛋白、例えばグロブリン（Ｇｌｂ）との小型ポリペプチド、例えば腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）の融合を可能にする。
【００６６】
場合により、少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または特異的ペプチド切断部位を単子葉植物種子貯蔵蛋白と非相同ペプチドまたはポリペプチドとの間の翻訳フレーム内となるよう操作することができる。好ましい実施形態においてはヒトエンテロキナーゼ（ｅｋ）のペプチド切断部位をコードする合成オリゴヌクレオチドをグロブリンとＩＴＦ蛋白ドメインの間に「インフレーム」に操作する。この部位はグロブリン融合担体からの成熟ＩＴＦ蛋白の潜在的放出のために利用できる。
【００６７】
本発明において使用するための発現ベクターは適切に会合した上流及び下流の配列を含む植物内の操作のために設計されたキメラ核酸コンストラクト（または発現ベクターまたはカセット）である。
【００６８】
一般的に本発明の実施において使用するための発現ベクターは、キメラ遺伝子を構成する以下の作動可能に連結した成分、即ち（ａ）成熟特異的単子葉植物種子貯蔵蛋白の遺伝子由来のプロモーター、（ｃ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードする第２のＤＮＡ配列、（ｄ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列、及び／または（ｂ）単子葉植物種子貯蔵体への自身に連結した非相同ペプチドまたはポリペプチドのターゲティングが可能である単子葉植物種子特異的シグナル配列をコードする該プロモーターに作動可能に連結した第１のＤＮＡ配列を包含してよく、ここで第１、第２及び第３のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードしている。
【００６９】
キメラ遺伝子は（ｉ）プラスミドまたはウィルス起源であり、そして、１つの宿主から別の宿主へ、例えば細菌から所望の植物宿主へのＤＮＡの移動がベクターにとって可能となるようにベクターに必要な特性を与えるキメラ遺伝子の上流及び／または下流のコンパニオン配列、（ｉｉ）選択可能なマーカー配列、及び（ｉｉｉ）ｐｏｌｙＡテール存在下または非存在下の転写終了領域を有する適切な植物形質転換（「発現」）ベクター内に入れてよい。
【００７０】
キメラ遺伝子及びキメラ遺伝子を担持する形質転換ベクターを構築するための例示される方法は以下の実施例に記載する。
【００７１】
本発明においては、非相同ポリヌクレオチドは植物種子組織において優先的に発現される転写開始領域由来のプロモーターの制御下に発現できる。例示される好ましいプロモーターは内乳の外層において遺伝子発現を起こすグルテリン（Ｇｔ１）プロモーター及び内乳の中心部において遺伝子発現を起こすグロブリン（Ｇｌｂ）プロモーターを包含する。自身に作動可能に連結した遺伝子コーディング配列の転写を調節するためのプロモーター配列は天然に存在するプロモーターまたは種子特異的転写を指向することができるその領域、及び１プロモーターより多くのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターを包含する。このようなハイブリッドプロモーターの構築のための方法は当該分野で知られている。
【００７２】
一部の場合において、プロモーターはキメラ核酸コンストラクトを導入すべき植物細胞と同じ植物種から取り出す。本発明において使用するプロモーターは典型的にはコメ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシのような穀物から取り出される。或いは、１つの型の植物に由来する種子特異的プロモーターを使用して異なる植物に由来する核酸コーディング配列の転写を調節してもよい。
【００７３】
本発明において有用であるプロモーターの別の例は、これには限らないが、上記した以下の成熟特異的単子葉植物貯蔵蛋白の１つに関連する成熟特異的プロモーターを包含する。更に包含されるものはアエウロン及びコメ、コムギ及びオオムギ遺伝子に関連する胚特異的プロモーター、例えば脂質転移蛋白Ｌｔｐ１、キチナーゼＣｈｉ２６及びＥｍ蛋白Ｅｍｐ１である。
【００７４】
成熟種子中の発現に適する他のプロモーターはオオムギ内乳特異的Ｂ１ホルデインプロモーター、ＧｌｕＢ−２プロモーター、Ｂｘ７プロモーター、Ｇｔ３プロモーター、ＧｌｕＢ−１プロモーター及びＲｐ−６プロモーターを包含する。好ましくは、これ等のプロモーターは転写因子と組み合わせて使用する。
【００７５】
目的の蛋白をコード化することに加えて、発現カセットまたは非相同核酸コンストラクトは適宜蛋白のプロセシング及び転座を可能にするシグナルペプチドをコード化してよい。上記定義した例示されるシグナル配列は、単子葉植物成熟特異的遺伝子に関連するシグナル配列、即ち、グルテリン、プロラミン、ホルデイン、グリアジン、グルテニン、ゼイン、アルブミン、グロブリン、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、澱粉シンターゼ、分枝鎖形成酵素、Ｅｍ及びｌｅａである。
【００７６】
更にまた、多くの単子葉植物種子貯蔵蛋白は成熟特異的プロモーターの制御下にあり、そしてこのプロモーターは蛋白本体をターゲティングするためのリーダー配列に作動可能に連結しているため、プロモーター及びリーダー配列はキメラ遺伝子コンストラクトにおける非相同ペプチドまたはポリペプチドに作動可能に連結した単一の蛋白貯蔵遺伝子から単離できる。１つの例示されるプロモーター−リーダー配列はコメＧｔ１遺伝子由来のものである。或いは、プロモーター及びリーダー配列は異なる遺伝子から取り出してよく、例えばコメＧｔ１リーダー配列に連結したコメＧｌｂプロモーターが挙げられる。
【００７７】
非相同ペプチドまたはポリペプチドの製造は遺伝子のコドン最適化により増強できる。コドン最適化の意図は、ＧまたはＣのコドンの第３の位置においてＡまたはＴを変更することであった。この配置は典型的なコメ遺伝子におけるコドンの使用とより緊密に整合する。このようなコドンの最適化は本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００７８】
単子葉植物細胞における選択のための適切な選択可能なマーカーは、これらには限らないが、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリン等を包含する。別の選択可能なマーカーはバイアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子、グリホサート耐性をコードする突然変異体ＥＰＳＰシンセターゼ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を与える突然変異体アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）を包含する。使用される特定のマーカー遺伝子は導入されているＤＮＡを欠いた細胞と比較して形質転換細胞の選択を可能にする。好ましくは選択可能なマーカー遺伝子は組織培養段階における選択を容易にするもの、例えばｎｐｔＩＩ、ハイグロマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子である。即ち使用される特定のマーカーは本発明に必須ではない。
【００７９】
一般的に、選択された核酸配列はベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。当業者に公知の切断、ライゲーション及びＥ．ｃｏｌｉ形質転換のための標準的方法を本発明で使用するベクターの構築において使用する。
植物細胞または組織は種々の標準的手法を用いて上記発現コンストラクトを用いて形質転換される。ベクター配列は宿主ゲノム内に安定して組み込まれることが好ましい。
【００８０】
本発明の意味においては、「安定的に形質転換される」とは、導入された核酸配列が宿主の２世代以上に通じて維持されることを意味し、これは好ましくは（必然ではない）宿主ゲノム内への導入配列の組み込みによるものである。宿主植物細胞を形質転換するために使用する方法は本発明では重要ではない。本発明に従って発現される非相同ペプチドまたはポリペプチドの商業化のためには、植物の形質転換は好ましくは永久的なもの、即ち宿主植物ゲノム内への導入発現コンストラクトの組み込みによるものであり、これにより、導入されたコンストラクトは連続する植物の世代に受け継がれる。当業者の知る通り、広範な種類の形質転換技術が当該分野に存在しており、新しい技術が持続的に使用可能となっている。
【００８１】
標的宿主植物のために適しているいかなる手法をも、本発明の範囲内で使用してよい。例えばコンストラクトは、これらに限らないが種々の形態、例えばＤＮＡ鎖において、プラスミドまたは人工染色体に導入できる。標的植物細胞内へのコンストラクトの導入はこれらに限らないが種々の手法、例えば燐酸カルシウムＤＮＡ同時沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト融合または、マイクロプロジェクタイルボンバードメントにより達成できる。当業者は詳細については文献を参照して本発明の方法において使用するための適切な手法を選択できる。
【００８２】
形質転換された植物細胞は選択試薬の閾値濃度を有する選択培地中で培養され得る能力があるかどうかスクリーニングされる。選択培地上または培地中で生育する植物細胞は典型的には同じ培地を新しく用意したものに移して再度培養する。次に外植片を再生条件下で培養することにより再生植物の新芽を生産する。新芽形成後、新芽を選択定着培地に移し、完全な幼植物体とする。次に幼植物体を生育させて形質転換植物の増殖のための種子、切片等を得る。方法は非相同の起源の遺伝子の発現及びトランスジェニック植物の再生による植物の効率的な形質転換を可能とし、これにより非相同ペプチドまたはポリペプチドが生成できる。
【００８３】
非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現は発現されている特定の蛋白に特異的な生物活性に関する試験と組み合わせたウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、ＨＰＬＣ、ＮＭＲまたは質量スペクトル分析のような標準的な分析手法を用いて確認してよい。
後述する実施例に記載されている発現系は特異的な配列系に基づいている。しかしながら、当業者の知る通り、本発明は特定の系に限定されない。即ち、別の実施形態においては、他のプロモーター及び他のシグナル配列を使用して単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現してよい。
【００８４】
以下、本発明の融合担体として種子貯蔵蛋白を利用する植物種子中の融合ポリペプチドの高水準発現の一実施形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【実施例１】
【００８５】
ヒトＩＴＦ配列及びプラスミドの構築
ヒトＩＴＦＤＮＡ配列はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｌ０８０４４に基づくものとした。この配列は７５アミノ酸のＩＴＦペプチドのオープンリーディングフレームをコードする。コメ穀粒中の成熟ＩＴＦの発現のために、６０アミノ酸の成熟ＩＴＦペプチドをコードするＤＮＡ配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化した（ＩＴＦ、図１）。
【００８６】
図１はコメ穀粒中の腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）の６０アミノ酸成熟部分の発現のためのコドン最適化ＤＮＡの比較を示す。「ネイティブ遺伝子」とは正常ヒトＩＴＦＤＮＡ配列を指し、「トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）」とはコドン最適化ＩＴＦＤＮＡ配列を指す。相当するアミノ酸配列はＤＮＡ配列の下に記載する。
【００８７】
図２は融合担体としての１９ｋＤａグロブリン蛋白（Ｇｌｂ）、エンテロキナーゼ（ｅｋ）切断部位及び成熟ＩＴＦ蛋白と融合させた構築されたＧｔ１シグナルペプチドに関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示し、全ては同じ翻訳リーディングフレーム内に融合されている。
【００８８】
成熟ＩＴＦをコードするコドン最適化ＩＴＦ遺伝子は化学合成により誘導し、そして、１本鎖ＤＮＡ増幅及びＡ／Ｔオーバーハング法を介したストラータジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のユニバーサルクローニングベクターｐＣＲ２．１内にクローニングした。このようにして得られたプラスミドをｐＡＰＩ４３１と命名した。
【００８９】
プラスミドｐＡＰＩ４７１は３種の中間体プラスミド、即ちコメグロブリン融合相手（ｐＡＰＩ４６９）、ｅｋ（エンテロキナーゼ）リンカー−ＩＴＦ（ｐＡＰＩ４６５）及び上記したコメコドン最適化ＩＴＦ遺伝子（ｐＡＰＩ４３１）を利用して最終的に構築した。融合相手の１９ｋＤａのコメグロブリン遺伝子はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｘ６３９９０から設計したプライマー対を用いて増幅し、ストラータジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。１９ｋＤグロブリンをコード化する増幅しクローニングしたＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析により確認した。このようにして得られたプラスミドをｐＡＰＩ４６９と命名した。次に、１５塩基対エンテロキナーゼ（ｅｋ）リンカーＤＮＡセグメントを成熟コドン最適化ＩＴＦのＮ末端コーディング領域上の部位指向性突然変異誘発によりｐＡＰＩ４３１内に導入した。このようにして得られたプラスミドｐＡＰＩ４６５はｅｋ−ＩＴＦ遺伝子融合を含んでいる。
【００９０】
プラスミドｐＡＰＩ４６９は酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｎａＢＩで消化し、次にＭｆｅＩ（Ｍｕｎｇマメヌクレアーゼにより平滑末端化）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されているｐＡＰＩ４６５内にクローニングした。２つのＤＮＡセグメントを１％アガロースゲル上で単離し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出プロトコルを用いて精製した。２つのフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、そして、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。得られたプラスミドは１９ｋＤのグロブリン−ｅｋ−コドン最適化ＩＴＦ融合をコードする遺伝子を含有していた。この中間体プラスミドをｐＡＰＩ４７０と命名した。
【００９１】
ｐＡＰＩ４７０から得られたＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦを含有するＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ（Ｍｕｎｇマメヌクレアーゼにより平滑末端化）及びＸｈｏＩで消化し、ｐＡＰＩ４０５のＮａｅｌ及びＸｈｏＩ部位にクローニングした。ｐＡＰＩ４０５及びｐＡＰＩ４７０消化物の両ＤＮＡセグメントを１％アガロースゲルから精製し、ライゲーションした。プラスミドｐＡＰＩ４０５はコメＧｔ１プロモーターカセットベクターｐＡＰＩ１４１の誘導体であり、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド及びｎｏｓターミネーター領域を含有している。ｐＡＰＩ４０５のＧｔ１プロモーターとｎｏｓターミネーターの間のリンカー領域は１．８ＫｂのＧｕｓ遺伝子ｓｔｕｆｆｅｒフラグメントを含有している。得られたｐＡＰＩ４７１プラスミドはコメＧｔ１プロモーター、コメＧｔ１シグナルペプチド、融合担体としてのコメグロブリン蛋白、コドン最適化ＩＴＦ遺伝子にインフレームに融合したエンテロキナーゼ切断部位（Ｇｔ１プロモーター／Ｇｔ１ｓｇ−Ｇｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ）及びｎｏｓターミネーター領域を含有している。
【００９２】
図３は成熟コメ穀粒中のＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現のためのキメラ遺伝子コンストラクトを含有するプラスミドｐＡＰＩ４７１を示す。融合蛋白の発現は記載されている通りコメＧｔ１プロモーターの制御下にある。カナマイシンはプラスミド上の細菌選択マーカーを示す。該当する制限酵素部位を示す。
【実施例２】
【００９３】
コメ形質転換及び植物再生
Ｇｎｓ９プロモーターにより駆動されるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ）遺伝子よりなり、ＮＯＳターミネーターが後続する選択可能なマーカープラスミドｐＡＰＩ１７６は全ての植物形質転換のための選択可能なマーカーＤＮＡセグメントを与えた。プラスミドＤＮＡを適切な酵素で消化することによりＤＮＡを線状化し、次に１％低融点アガロースゲルにより分離した。分離後、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルスライスから溶離させ、アガロースをアガラーゼ（Ａｇａｒａｓｅ）で消化することにより除去した。
【００９４】
ＤＮＡを沈殿させ、ゲル上で泳動させることにより、未損傷プラスミドＤＮＡに関して線状ＤＮＡの純度を確認した。合計５０μｌの金粒子を０．６５μｇのＤＮＡでコーティングし、そして選択されたマーカーフラグメント及び標的遺伝子フラグメントのＤＮＡ量を１：１のモル比で計算した。未成熟コメ胚から得られたコメカルスをファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）（Ｍｏｌｅｃ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ １０，８３−９４，２００１）に記載の通り形質転換のために調製した。コメのマイクロプロジェクタイル媒介の形質転換はファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）の記載した操作法に従って実施した。トランスジェニックコメ植物を温室において成熟時まで生育させ、種子を収穫した。
【実施例３】
【００９５】
成熟コメ穀粒中のＩＴＦ含有融合蛋白発現の分析
蛋白抽出のためにＩＴＦ融合蛋白のコンストラクトを含有するトランスジェニック植物に由来する個々の脱穀したコメ穀粒を粉砕プレートのウェル中に入れた。各ウェルに抽出緩衝液であるトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）＋０．３５ＭＮａＣｌ０．２ｍｌを添加した。穀粒をゲノムグラインダー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ）を用いて１２分間１３００ストローク／分で粉砕した。得られた種子抽出液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、種子上澄みを新しいプレートに移した。
或いは、１０脱穀コメ穀粒を合わせ、抽出緩衝液であるＴＢＳ＋０．３５ＭＮａＣｌ２ｍｌ中において乳鉢で粉砕し、次に３７℃で１．５時間混合した。混合スラリーを１２０００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、上澄みを２ｍｌエッペンドルフ試験管に移し、後の分析のために−２０℃で保存した。
【００９６】
発現水準の分析のために、合計３２μｌ（約５０〜６０μｇ総蛋白）の個々の種子上澄みを４〜２０％プレキャストポリアクリルアミドゲル上で分割した（カリフォルニア州カールスバッドのノーベックス（Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。ゲルを染色溶液である０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、次に脱色して蛋白バンドを可視化した。ウエスタンブロット分析のためにゲルを０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロットし、３時間リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中５％のノンファットドライミルクでブロッキングし、次にＰＢＳ中ですすいだ。一時抗体と共にインキュベートするために、ＩＴＦに対するマウスモノクローナル抗体（ジーアイラボラトリーズ（ＧＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を一次抗体溶液である０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中５％ＢＳＡ中１：１０００希釈で使用した。ブロットは一夜溶液中でインキュベートした。
【００９７】
得られたブロットを各々１０分間ＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（カリフォルニア州バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ））をブロッキング緩衝液中１：４０００に希釈した。次にメンブレンを二次抗体溶液中で２時間インキュベートし、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。発色は基質ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（シグマ社、ミズーリ州セントルイス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を添加することにより開始させ、そして所望の強度のバンドが達成された後に水でブロットをすすぐことにより操作を終了した。
【００９８】
図４はクーマシー染色ＰＡＧＥにより分割したＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現を示す。個々のＲ１世代の種子蛋白抽出液約５０〜６０μｇをトランスジェニックライスイベント４７１−７０から調製し、４〜２０％ＰＡＧＥ上で分割した。レーン１は非トランスジェニックコメ種Ｔａｐｅｉ３０９（ＴＰ３０９）由来の対照抽出液を指す。４７１−７０形質転換イベントの７種の分割された個々の種子の抽出液をレーン２〜４及び６〜９に示す。分子量マーカーはレーン５に示す。存在する融合蛋白の量を推定するために、約５μｇのマーカー蛋白である２３ｋＤａの炭酸アンヒドラーゼ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を発現水準の比較参照物質としてゲル（レーン１０）にロードした。レーン４７１−７０−２、４７１−７０−４及び４７１−７０−５は約１０μｇのＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白のバンドを含有すると推定される。内因性またはネイティブの１９ｋＤａのグロブリン蛋白及び約２８ｋＤａのＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の位置は矢印で示す。矢印で示すＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白に相当するこのバンドは対照ＴＰ３０９には存在していない。
種子抽出液の容量の六分の一をゲルにロードしたため、総融合蛋白は約６０μｇ／穀粒または総穀粒重量の０．３％と推定される。穀粒当たり総蛋白の約３００〜４００μｇが一般的に抽出緩衝液で抽出され、従って組み換え融合蛋白は総可溶性蛋白の約１５〜２０％である。ＩＴＦは重量において融合蛋白の約四分の一であり、従って、ＩＴＦは約１５μｇ／穀粒または０．０７５％穀粒重量である。
【００９９】
図５はウエスタンブロット分析によるＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白のＩＴＦ部分の検出を示す。２つのトランスジェニック試料（合わせた種子試料）及びＴＰ３０９非トランスジェニック試料を２つの同一ゲル上で泳動させた。１つのゲルはクーマシー染色して全蛋白を可視化し、他方のゲルは特異的抗ＩＴＦ抗体を用いてプロービングした。クーマシー染色ゲルで可視化した融合蛋白バンドはウエスタンブロットにおいて抗体により検出することにより、組み換えコメ穀粒中の融合蛋白として成熟ＩＴＦの発現を確認した。
【０１００】
本発明は小型非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間にインフレームに操作されたメチオニンまたはトリプトファン残基を場合により含む小型非相同ペプチドまたはポリペプチド及び単子葉植物種子貯蔵蛋白を含む融合コンストラクトの発現を可能にする。このような融合コンストラクトの発現はトランスジェニックコメ種子中で＞１００μｇ／穀粒の水準まで達している。ＡＯＤの外に、本発明の良好な方法は栄養学的、薬理学的及び医療上重要な種々のペプチドの発現を可能とする。これ等には、これには限らないが、肥満治療用ペプチド、例えばＰＹＹ、ペプチド抗生物質、例えばイセガナン及びβ−デフェンシン、成熟ペプチド成長因子、例えばＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ及びＩＴＦ、抗ＨＩＶペプチド、例えばＦｕｚｅｏｎ及び誘導体、ペプチドホルモン及びペプチドホルモンフラグメント、例えば副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、アデノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）及び高血圧を治療するためのペプチド、例えば血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）及び血管内皮生育抑制剤（ＶＥＧＩ）が包含される。この特定の融合手法はまた、種々の細菌及びウィルス性疾患の経口免疫化のために使用できるこれ等の疾患に特異的な抗原性ポリペプチドエピトープの高水準発現のために利用してよい。
【０１０１】
種子保存蛋白融合相手としてのコメグロブリン
コメ種子貯蔵蛋白抽出液の２次元ゲル電気泳動によれば、１９ｋＤａのグロブリン蛋白は完全ではないが大部分は単一成分であり、蛋白のファミリーとして存在するとは考えられない。１９ｋＤａグロブリン蛋白のコメ内乳中の含有量はグルテン蛋白含有量の概ね１０％であるが、１９ｋＤａグロブリン蛋白はコメ内乳における単一の遺伝子の最も大量の産物であり、そして、この観点において、コメ内乳における非相同ペプチドの発現のための融合担体として操作するために最も優れた選択肢である。グロブリン遺伝子を予め単離し、特性化し、ＤＮＡ配列を決定した。非相同ペプチドの高水準発現のために潜在的融合相手として使用してよい別の単子葉植物種子蛋白は、コメグルテリン、オリジン及びプロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン及びグルテニン、トウモロコシゼイン及びグルテリン、エンバクグルテリン、モロコシカフィリン、アワペニセチン及びライムギセカリンを包含する。
【実施例４】
【０１０２】
ヒトＡＯＤ９６０４配列及びプラスミド構築
ヒトＡＯＤ９６０４ＤＮＡ配列はヒト成長ホルモンのＣ末端フラグメントに基づくものとした（Ｎａｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３，１０１１−１０２１，１９９４）。配列は１６アミノ酸のＡＯＤペプチドに対するオープンリーディングフレームをコードし、オーストラリアメルボルンのメタボリックスリミテッド（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓ Ｌｔｄ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，ＡＵＳ）により提供されたものである。コメ穀粒中におけるＡＯＤの発現のために、１６アミノ酸ＡＯＤペプチドをコードするＤＮＡ配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化（図６）した。
【０１０３】
３組み換えＤＮＡをコメ穀粒中でＡＯＤを発現するために調製した。第１に、グロブリン貯蔵蛋白の成熟部分（ＧＬＢ）、トリプトファン残基及びＡＯＤ９６０４ペプチドを含有する完全合成遺伝子を合成した（コメ好適コドン使用）。この合成遺伝子はＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白をコードしている。更に、ネイティブの成熟グロブリン中の唯一のトリプトファン残基をこのＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白中でプロリン残基（アミノ酸１２７位）に変換する（図８）ことにより、最終的に成熟グロブリン蛋白のＣ末端に新しく導入されたトリプトファン残基においてＮ−クロロスクシンイミドによるグロブリン融合担体からのＡＯＤペプチドの化学的放出を促進させた（図８）。
【０１０４】
ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ遺伝子フラグメントを制限酵素ＰｍＩ及びＸｈｏで切り出し、ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ遺伝子を含有するこの平滑末端／ＸｈｏＤＮＡセグメントを１％アガロースゲルから単離し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出プロトコルを用いて精製した。プラスミドｐＡＰＩ４０５を含有するＧｔ１プロモーター／シグナルペプチド発現カセットをＮａｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、ベクターＤＮＡもまた１％アガロースゲル上で単離し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出プロトコルを用いて精製した。２つのＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、そしてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。得られたプラスミド（ｐＡＰＩ５０６）はコメＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白コーディング領域及びｎｏｓターミネーター３’領域を含有していた。全発現カセット（Ｇｔ１プロモーター／Ｇｔ１ｓｐ：ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白／ｎｏｓターミネーター領域）を酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてプラスミドｐＡＰＩ５０６から切り出し、これ等と同じ制限部位においてバイナリベクタープラスミドｐＪＨ２６００（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，１９１４−１９１９，２０００）内にクローニングすることにより、全発現カセット（図８）を含有するバイナリプラスミドｐＡＰＩ５０７を形成した。
【０１０５】
グロブリン遺伝子のＮ末端の第２の融合物はコメ好適コドンを用いて合成した。トリプトファンを化学的切断により融合物からＡＯＤを放出させるために融合物とＡＯＤとの間に操作した（図１０）。合成した遺伝子フラグメントをＳｃｈＩ／ＸｈｏＩで消化し、次にＮａｅｌ／ＸｈｏＩにより消化したｐＡＰＩ４０５に直接クローニングすることにより中間体プラスミドｐＡＰＩ５００を作成した。全発現カセット及びｐＡＰＩ５００由来融合／ＡＯＤを含有するフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、これ等と同じ制限部位においてバイナリベクタープラスミドｐＪＨ２６００内にクローニングすることにより、全発現カセット（図１１）を含有するバイナリプラスミドｐＡＰＩ５０２を形成した。
【０１０６】
第３の融合担体は突然変異したグロブリン遺伝子である。全メチオニンをセリンに突然変異させることにより臭化シアンの切断部位を排除し、全てのシステインをグリシンに突然変異させることによりジスルフィド結合を排除し、そして後の精製目的のためにＨｉｓ６タグを融合相手のＮ末端に連結した。別のメチオニンを臭化シアンによる切断部位を形成するために融合部とＡＯＤとの間に入れた。フラグメントはブルーへロンテクノロジーズ（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した（図１１）。合成フラグメントを制限酵素ＰｍＩ及びＸｈｏＩで切り出し、Ｇｔ１プロモーター／シグナル発現カセット（ｐＡＰＩ４０５）内にクローニングすることにより中間体プラスミドｐＡＰＩ４９４を形成した。全発現カセット及びｐＡＰＩ４９４由来融合／ＡＯＤを含有するフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、これ等と同じ制限部位においてバイナリベクタープラスミドｐＪＨ２６００内にクローニングすることにより、全発現カセット（図１２）を含有するバイナリプラスミドｐＡＰＩ４９９を形成した。
【実施例５】
【０１０７】
コメ形質転換及び植物再生
バイナリベクターＪＨ２６００中のＴ−ＤＮＡの右及び左の境界によりフランキングされているＧｎｓ９プロモーターにより駆動されｎｏｓターミネーターが後続するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｂａｒ）遺伝子よりなる選択可能なマーカープラスミドｐＡＰＩ４１２は、全植物形質転換のための選択可能なマーカーＤＮＡセグメントを提供した。プラスミドｐＡＰＩ４１２及びｐＡＰＩ５０７、ｐＡＰＩ４９９及びｐＡＰＩ５０２をアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株内に独立して形質転換し、そして個々のプラスミドを含有するアグロバクテリウム株を選択培地上一夜生育後に１：１比で混合した。コメのアグロバクテリウム媒介形質転換は本質的には米国特許第５，５９１，６１６号に記載の操作法に従って実施した。成熟コメ胚より得たコメカルスをファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）の記載に従って形質転換用に調製した。コメ品種ＴＰ３０９から誘導したコメカルスにプラスミドｐＡＰＩ４１２及びＡＯＤプラスミドを含有するアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４を接種した。３日間の共インキュベーションの後、８〜９週間、カルスを５ｍｇ／ｌのビアラホスを含有する選択培地中に移した。生存カルスを再生培地上、次いで定着培地上で完全植物となるまで再生させた。トランスジェニック植物（以下の表１）は温室内で成熟するまで育成し、そしてＲ１種子を採取して発現の分析に付した。
【表１】
【実施例６】
【０１０８】
成熟コメ穀粒中のＡＯＤ含有融合蛋白発現の分析
蛋白抽出のためにＡＯＤ融合蛋白のコンストラクトを含有するトランスジェニック植物に由来する個々の脱穀したＲ１コメ穀粒を粉砕プレートのウェル中に入れた。各ウェルに抽出緩衝液であるトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）＋０．３５ＭＮａＣｌ０．２ｍｌを添加した。穀粒をゲノムグラインダー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ）を用いて１２分間３００ストローク／分で粉砕した。得られた種子抽出液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、種子上澄みを新しいプレートに移した。
或いは、１０脱穀コメ穀粒を合わせ、抽出緩衝液であるＴＢＳ＋０．３５ＭＮａＣｌ２ｍｌ中において乳鉢で粉砕し、次に３７℃で１．５時間混合した。混合スラリーを１２０００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、上澄みを２ｍｌエッペンドルフ試験管に移し、後の分析のために−２０℃で保存した。
【０１０９】
発現水準の分析のために、合計３２μｌ（約５０〜６０μｇ総蛋白）の個々の種子上澄みを４〜２０％プレキャストポリアクリルアミドゲル上（カリフォルニア州カールスバッドのノーベックス（Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で分割し、そして、ゲルを染色溶液である０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、次に脱色して蛋白バンドを可視化した。ウエスタンブロット分析のためにゲルを０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロットし、３時間ＰＢＳ中５％のノンファットドライミルクでブロッキングし、次にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ですすいだ。一次抗体と共にインキュベートするために、ＡＯＤ及びグロブリンに対するマウスモノクローナル抗体を一次抗体溶液である０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中５％ＢＳＡ中１：１０００希釈で使用し、そしてブロットは一夜溶液中でインキュベートした。
【０１１０】
得られたブロットを各々１０分間ＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（カリフォルニア州バイオラッド社(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ))をブロッキング緩衝液中１：４０００に希釈した。次にメンブレンを二次抗体溶液中で２時間インキュベートし、次にＰＢＳ中で３回洗浄した。発色は基質ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（シグマ社、ミズーリ州セントルイス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を添加することにより開始させ、そして所望の強度のバンドが達成された後に水でブロットをすすぐことにより操作を終了した。
【０１１１】
図１３（ゲルＢ）はクーマシー染色ＰＡＧＥにより分割したＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白の発現を示す。レーンＴＰ３０９は全ゲルにおける非トランスジェニック対照である。トランスジェニックイベント５０７−１３及び５０７−１７に由来する２つの独立した種子の試料の抽出液を示す。ＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白は全ゲル中矢印で示す（融合）。このバンドは対照のＴＰ３０９レーンには存在しない。図１３（ゲルＣ）はまたウエスタン分析によるＧＬＢ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白としてのＡＯＤ部分の検出を示す。２つのトランスジェニックの合わせた種子試料（５０７−１３及び５０７−１７）をＴＰ３０９非トランスジェニック試料と共に泳動させ、ウエスタンブロットに付し、そして融合蛋白を抗ＡＯＤ抗血清で可視化した。融合蛋白のバンドはまた、ウエスタンブロットにおいてグロブリン特異的抗体を用いたウエスタンブロット（ゲルＡ）により可視化することにより組み換えコメ穀粒中のＧＬＢ融合蛋白としてのＡＯＤペプチドの発現を確認した。コメ穀粒中の融合蛋白の初期の発現推定値は１００〜１５０μｇ／種子である。これは穀粒重量の０．５〜０．７５％に相当する。融合蛋白は成熟グロブリンＣＡの約１／１０の大きさであるため、ＡＯＤ９６０４ペプチドの発現は総穀粒重量の概ね０．０５〜０．０７５％である。
【０１１２】
本発明者等は同じ方法を用いてコンストラクトｐＡＰＩ４４９から作成したトランスジェニック植物をスクリーニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを使用し、このコンストラクトについて合計７０植物がＨｉｓ６−ｍＧＬＢ−ＡＯＤ融合物を発現することが検出された。このコンストラクト由来のＡＯＤ９６０４融合蛋白の最高発現を示した上位７植物系統を図１４に示す。このコンストラクトについて植物の最高の系統である４９９−１０５の発現水準は５．６ｍｇ／ｇ粉体または穀粒重量の０．５６％であった。このコンストラクトにおけるＡＯＤ９６０４融合蛋白はＨｉｓタグを含有しているため、分子質量はｐＡＰＩ５０７コンストラクトのＡＯＤ９６０４融合物よりも僅かに高値となる。融合蛋白は同じ分子質量を有するネイティブの蛋白と重複している（図１４）。即ち、発現水準はこの系統に対しては、陰性対照親系統（ＴＰ３０９）がＫｏｄａｋゲルドキュメンテーションソフトウエアを用いて差し引かれているとはいえ、過大評価される可能性がある。
【０１１３】
コンストラクトｐＡＰＩ５０２については、１６４のトランスジェニック植物中１１８がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによりスクリーニングされた。クーマシー染色ゲルではｎＧＬＢ−ＡＯＤ融合物を観察することが困難であったがウエスタンブロット分析によればｎＧＬＢ−ＡＯＤ融合物が検出された。ウエスタンブロットを用いて分析した場合、４８のトランスジェニック植物が陽性シグナルを有していた（図１４）。このコンストラクトからの最良の植物系統におけるｎＧＬＢ−ＡＯＤ９６０４融合物の発現水準は１５μｇ／ｇ粉体と推定される。これは、この融合方法が他の２つの融合相手と比較してＡＯＤ９６０４の高発現水準をもたらさないことを示している。
【実施例７】
【０１１４】
ヒトインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）配列及びプラスミド構築
ヒトＩＧＦ−１ＤＮＡ配列はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｍ１１５６８のゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）蛋白配列に基づいたものとした。配列は７０アミノ酸ペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。コメ穀粒中のＩＧＦ−１の発現のために、７０アミノ酸ＩＧＦ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化した（図１６）。２組み換えＤＮＡをコメ穀粒中でＩＧＦ−１を発現するために調製した。第１に、グロブリン貯蔵蛋白の成熟部分（ＧＬＢ）、トリプトファン残基及びＩＧＦ−１ペプチドを含有する完全合成遺伝子を合成した（コメ好適コドン使用）。この合成遺伝子はＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１融合蛋白をコードしている。更に、ネイティブの成熟グロブリン中の唯一のトリプトファン残基をこのＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１融合蛋白中でプロリン残基（アミノ酸１２７位）に変換する（図１８）ことにより、最終的に成熟グロブリン蛋白のＣ末端に新しく導入されたトリプトファン残基においてＮ−クロロスクシンイミドによるグロブリン融合担体からのＩＧＦ−１ペプチドの化学的放出を促進させた（図１８）。
【０１１５】
ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１遺伝子フラグメントを制限酵素ＰｍＩ及びＸｈｏで切り出し、ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１遺伝子を含有するこの平滑末端／ＸｈｏＤＮＡセグメントを１％アガロースゲルから単離し、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出プロトコルを用いて精製した。プラスミドｐＡＰＩ４０５を含有するＧｔ１プロモーター／シグナルペプチド発現カセットをＮａｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、ベクターＤＮＡもまた１％アガロースゲル上で単離し、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出プロトコルを用いて精製した。２つのＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、そしてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。得られたプラスミドはコメＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦ−１融合蛋白コーディング領域及びｎｏｓターミネーター３’領域を含有していた（図１９）。
【０１１６】
第２の融合相手はグルテリンの塩基性サブユニットである。融合相手とＩＧＦの間にトリプトファン残基を有するこのフラグメントはコメ好適コドンを用いてブルーへロンテクノロジーズ（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した（図１８）。フラグメントをＰｍＩ及びＸｈｏＩで切り出し、ｐＡＰＩ４０５内にクローニングすることによりプラスミドｐＡＰＩ５２１を形成した（図２０）。
【実施例８】
【０１１７】
コメ形質転換及び植物再生
約２００個のＴＰ３０９種子を脱穀し、５０％ｖ／ｖの市販脱色剤で２５分間滅菌し、各々５分間３回滅菌水で洗浄した。滅菌した種子を１０日間２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加したＮ６培地の入ったプレート７枚上に置き、カルス形成を誘導した。一次カルスを切り出し、３週間新鮮Ｎ６培地上に置いた。二次カルスを一次カルスから分離し、同じＮ６培地上において３次カルスを形成させた。３次カルスをボンバードメントに使用するか、２週おきに４〜５回継代培養した。各継代培養のカルスをボンバードメントに用いることができる。
【０１１８】
直径１〜４ｍｍのカルスを選択し、ボンバードメントの前５〜２４時間０．３Ｍマンニトール及び０．３Ｍソルビトールを含有するＮ６培地上に４ｃｍの円形に置いた。バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ボンバードメントをバイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ） ＰＤＣ−１０００／Ｈｅシステム（バイオラッド社(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)）を用いて実施した。操作には２．５μｇの選択可能なマーカーＤＮＡ及び共転移プラスミドＤＮＡ（ｐＡＰＩ５２０またはｐＡＰＩ５２１）を１対３の比でコーティングした金粒子１．５ｍｇ（６０μｇ／μｌ）を要した。ＤＮＡコーティング金粒子を１１００ｐｓｉのヘリウム圧でコメカルス内へのボンバードメントに付した。ボンバードメントの後、カルスを４８時間同じプレート上で回復させ、次に５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを含有するＮ６培地に移した。
【０１１９】
ボンバードメントに付したカルスを４５日間２６℃で暗所、選択培地上でインキュベートした。この時点で、白色不透明緻密であり、黄色または茶色であり軟質で含水性の非形質転換対と容易に識別できる形質転換体を今度はハイグロマイシンＢ非含有のＮ６（２，４−Ｄ非含有）３ｍｇ／ｌＢＡＰ及び１ｍｇ／ｌのＮＡＡよりなる再生培地に移し、約２〜３週間連続照明条件下において培養した。
【０１２０】
再生された植物が１〜３ｃｍの丈になった時点で、幼植物体をＭＳ培地の半分の濃度で有り０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡを含有する定着培地に移した。２週間以内に、定着培地中の幼植物体は発根し、その新芽は１０ｃｍ超の長さとなった。次に植物を５０％市販土壌Ｓｕｎｓｈｉｎｅ＃１（ワシントン州サングロホルティカルチャー有限会社（Ｓａｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ，ＷＡ））及び５０％水田由来自然土壌の入った２．５インチのポットに移した。ポットをプラスチック容器に入れ、これを別の透明プラスチック容器で覆うことにより高湿度を維持した。植物は継続照明下に１週間培養した。次に透明プラスチックカバーを一日の期間に渡ってゆっくり移動させることにより湿度を徐々に低下させた。その後、プラスチックカバーを完全に取り外し、水及び肥料を必要に応じて添加した。植物が約１２ｃｍの丈となった時点で温室に移し、そこで生育させ成熟させた。
【０１２１】
本発明は特定の実施形態を用いて上記の通り説明したが説明及び実施例は本発明の構造的及び機能的原理を説明することを意図しており、本発明の範囲を限定する意図はない。むしろ本発明はその精神及び添付請求項の範囲内における全ての変更、改変及び置き換えを包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】コメ穀粒中の腸トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子（ＩＴＦ）の６０アミノ酸成熟部分の発現のためのコドン最適化ＤＮＡ配列の比較を示す。
【図２】融合担体としての１９ｋＤａグロブリン蛋白（Ｇｌｂ）、エンテロキナーゼ（ｅｋ）切断部位及び成熟ＩＴＦ蛋白と融合させた構築されたＧｔ１シグナルペプチドに関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示し、全ては同じ翻訳リーディングフレーム内に融合されている。
【図３】成熟コメ穀粒中のＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現のためのキメラ遺伝子コンストラクトを含有するプラスミドｐＡＰＩ４７１を示す。
【図４】成熟コメ穀粒中のＧｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の発現水準を示す。
【図５】Ｇｌｂ−ｅｋ−ＩＴＦ融合蛋白の部分としてのＩＴＦ発現のウエスタンブロット分析を示す。
【図６】コメ穀粒中の１６アミノ酸ＡＯＤ９６０４（ＡＯＤ）ペプチドの発現に関するコドン最適化ＤＮＡ配列の比較を示す。
【図７】同じ翻訳リーディングフレーム内に全て融合された融合担体としての１９ｋＤａグロブリン蛋白（Ｇｌｂ）、アミノ酸トリプトファンの化学切断に基づいた切断部位（＃で示す）及びＡＯＤペプチドに融合させた構築されたＧｔ１シグナルペプチドに関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す。
【図８】成熟コメ穀粒におけるＧｌｂ−Ｗ−ＡＯＤ融合蛋白の発現を特定するキメラ遺伝子コンストラクトを含有するプラスミドｐＡＰＩ５０７を示す。
【図９】グロブリン−Ｍ−ＡＯＤ９６０４融合ポリペプチドのＮ末端領域のＤＮＡ及びアミノ酸の配列を示す。
【図１０】Ｈｉｓ６−突然変異グロブリン−Ｍ−ＡＯＤ９６０４ポリペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１】プラスミドｐＰＡＩ５０２を示す。
【図１２】プラスミドｐＡＰＩ４９９を示す。
【図１３】融合相手−及びＡＯＤ９６０４−特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるＡＯＤ９６０４融合同一性を確認したものである。総蛋白は６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ及び２％βメルカプトエタノールで抽出した。パネルＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。パネルＢ及びＣはそれぞれＡＯＤ９６０４及びグロブリンに対する抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。レーン１は陰性対照であるＴＰ３０９であり、レーン２及び３はトランスジェニック系統５０７−１３を示す。レーン４はトランスジェニック系統５０７−１７である。総蛋白抽出緩衝液２０ミリリットルを用いて１グラムトランスジェニックコムギを抽出し、そして抽出液１５μｌをロードした。
【図１４】ｐＡＰＩ４９９コンストラクト由来のＡＯＤ９６０４融合蛋白を発現する上位７系統のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。ブラウン種子の第１世代由来のコメ粉１グラムをＴＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌ２５ｍｌで２時間抽出した。スラリーを５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを１５ｍｌの２％ＳＤＳ及び０．２％ベータ−メルカプトエタノールで抽出した。抽出液１ミリリットルを取り出し、１２分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み３５ｍｌをロードし、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルをクーマシーブルー染色溶液で染色した。
【図１５】ｎＧＬＢ−ＡＯＤ融合蛋白のウエスタンブロットを示す。第１世代の種子由来のコメ粉１グラムをＴＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌ２５ｍｌで２時間抽出した。スラリーを５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを１５ｍｌの２％ＳＤＳ及び２％ベータ−メルカプトエタノールで抽出した。抽出液１ミリリットルを取り出し、１２分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み４０μｌをロードした。
【図１６】ネイティブのＩＧＦ−１へのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１ｏｐｔ）のコドン最適化の比較を示す。
【図１７】ＧＬＢ−Ｗ−ＩＧＦのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１８】グルテリン−Ｗ−ＩＧＦの塩基性サブユニットのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１９】プラスミドｐＡＰＩ５２０を示す。
【図２０】プラスミドｐＡＰＩ５２１を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を示す単子葉植物種子を製造する方法であって、
（ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び／または（ｉｉ）の要素を含むキメラ遺伝子で単子葉植物を形質転換する工程と、
（ｉ）植物細胞中で活性なプロモーター、
（ｉｉ）シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した第１のＤＮＡ配列、
（ｉｉｉ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列、
（ｉｖ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第３のＤＮＡ配列、
ここで第２、第３及び／または第１のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に単子葉植物種子貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードし、
（ｂ）融合蛋白を含有する種子を製造するのに十分な時間形質転換単子葉植物細胞から単子葉植物を成育させる工程と、
（ｃ）単子葉植物から種子を収穫する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
単子葉植物がコメである請求項２記載の方法。
【請求項４】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが約１０ｋＤａ以下である請求項１記載の方法。
【請求項５】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが５〜１００アミノ酸長である請求項１記載の方法。
【請求項６】
キメラ遺伝子が更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、そして、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中に入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
融合蛋白を切断して非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白から分離する工程を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
キメラ遺伝子が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、融合蛋白が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
融合蛋白を切断して単子葉植物種子貯蔵蛋白から非相同ペプチドまたはポリペプチドを分離する工程を更に含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルスプロテアーゼである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
融合蛋白が化学的切断剤により切断される請求項７記載の方法。
【請求項１３】
化学的切断剤が臭化シアンである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下のａ）、ｃ）、ｄ）及び／またはｂ）の要素を含む形質転換された単子葉植物細胞であって、
ａ）植物細胞中で活性なプロモーター、
ｂ）シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した第１のＤＮＡ配列、
ｃ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列、
ｄ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第３のＤＮＡ配列、
ここで、第２、第３及び／または第１のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白を共にコードしている単子葉植物細胞。
【請求項１５】
単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１６】
単子葉植物がコメである請求項１５記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１７】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが約１０ｋＤａ以下である請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１８】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが５〜１００アミノ酸長である請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１９】
キメラ遺伝子が更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中に入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２０】
キメラ遺伝子が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、そして、融合蛋白が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２１】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルスプロテアーゼである請求項２０記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２２】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項２１記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２３】
以下のａ）、ｃ）、ｄ）及び／またはｂ）の要素含むキメラ遺伝子であって、
ａ）植物細胞中で活性なプロモーター、
ｂ）シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した任意の第１のＤＮＡ配列、
ｃ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列、
ｄ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第３のＤＮＡ配列、
第２、第３及び／または第１のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードしているキメラ遺伝子。
【請求項２４】
単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２５】
単子葉植物がコメである請求項２４記載のキメラ遺伝子。
【請求項２６】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが約１０ｋＤａ以下である請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２７】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが５〜１００アミノ酸長である請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２８】
更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２９】
更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、そして、融合蛋白が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項３０】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルスプロテアーゼである請求項２９記載のキメラ遺伝子。
【請求項３１】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項３０記載のキメラ遺伝子。
【請求項３２】
単子葉植物種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現方法であって、
ａ）単子葉植物成熟種子発現系において単子葉植物種子貯蔵蛋白に非相同ペプチドまたはポリペプチドを融合させる工程と、
ｂ）成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程と、
を含む方法。
【請求項３３】
単子葉植物種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現が種子貯蔵蛋白の非存在下の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現より少なくとも２０倍高値である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが少なくとも１５〜２０μｇ/単子葉植物種子の水準で発現される請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが種子の全可溶性蛋白の少なくとも３．０％である請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが種子の全可溶性蛋白の少なくとも５．０％である請求項３５記載の方法。
【請求項１】
非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を示す単子葉植物種子を製造する方法であって、
（ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び／または（ｉｉ）の要素を含むキメラ遺伝子で単子葉植物を形質転換する工程と、
（ｉ）植物細胞中で活性なプロモーター、
（ｉｉ）シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した第１のＤＮＡ配列、
（ｉｉｉ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列、
（ｉｖ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第３のＤＮＡ配列、
ここで第２、第３及び／または第１のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に単子葉植物種子貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードし、
（ｂ）融合蛋白を含有する種子を製造するのに十分な時間形質転換単子葉植物細胞から単子葉植物を成育させる工程と、
（ｃ）単子葉植物から種子を収穫する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
単子葉植物がコメである請求項２記載の方法。
【請求項４】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが約１０ｋＤａ以下である請求項１記載の方法。
【請求項５】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが５〜１００アミノ酸長である請求項１記載の方法。
【請求項６】
キメラ遺伝子が更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、そして、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中に入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
融合蛋白を切断して非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白から分離する工程を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
キメラ遺伝子が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、融合蛋白が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
融合蛋白を切断して単子葉植物種子貯蔵蛋白から非相同ペプチドまたはポリペプチドを分離する工程を更に含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルスプロテアーゼである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
融合蛋白が化学的切断剤により切断される請求項７記載の方法。
【請求項１３】
化学的切断剤が臭化シアンである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下のａ）、ｃ）、ｄ）及び／またはｂ）の要素を含む形質転換された単子葉植物細胞であって、
ａ）植物細胞中で活性なプロモーター、
ｂ）シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した第１のＤＮＡ配列、
ｃ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列、
ｄ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第３のＤＮＡ配列、
ここで、第２、第３及び／または第１のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白を共にコードしている単子葉植物細胞。
【請求項１５】
単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１６】
単子葉植物がコメである請求項１５記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１７】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが約１０ｋＤａ以下である請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１８】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが５〜１００アミノ酸長である請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項１９】
キメラ遺伝子が更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中に入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２０】
キメラ遺伝子が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、そして、融合蛋白が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項１４記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２１】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルスプロテアーゼである請求項２０記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２２】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項２１記載の形質転換された単子葉植物細胞。
【請求項２３】
以下のａ）、ｃ）、ｄ）及び／またはｂ）の要素含むキメラ遺伝子であって、
ａ）植物細胞中で活性なプロモーター、
ｂ）シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した任意の第１のＤＮＡ配列、
ｃ）単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列、
ｄ）非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第３のＤＮＡ配列、
第２、第３及び／または第１のＤＮＡ配列は翻訳フレーム内に連結され、共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び／またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードしているキメラ遺伝子。
【請求項２４】
単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２５】
単子葉植物がコメである請求項２４記載のキメラ遺伝子。
【請求項２６】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが約１０ｋＤａ以下である請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２７】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが５〜１００アミノ酸長である請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２８】
更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２９】
更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第４のＤＮＡ配列を含み、そして、融合蛋白が更に少なくとも１つの選択的精製タグ及び／または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項２３記載のキメラ遺伝子。
【請求項３０】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（登録商標）、α−溶解蛋白またはタバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウィルスプロテアーゼである請求項２９記載のキメラ遺伝子。
【請求項３１】
少なくとも１つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項３０記載のキメラ遺伝子。
【請求項３２】
単子葉植物種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現方法であって、
ａ）単子葉植物成熟種子発現系において単子葉植物種子貯蔵蛋白に非相同ペプチドまたはポリペプチドを融合させる工程と、
ｂ）成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程と、
を含む方法。
【請求項３３】
単子葉植物種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現が種子貯蔵蛋白の非存在下の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現より少なくとも２０倍高値である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが少なくとも１５〜２０μｇ/単子葉植物種子の水準で発現される請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが種子の全可溶性蛋白の少なくとも３．０％である請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
非相同ペプチドまたはポリペプチドが種子の全可溶性蛋白の少なくとも５．０％である請求項３５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００７−５１７５０４（Ｐ２００７−５１７５０４Ａ）
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４３９４５（Ｐ２００６−５４３９４５）
【出願日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１０８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６５７８
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０３２９３５２５）ベントリア バイオサイエンス (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１０８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６５７８
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０３２９３５２５）ベントリア バイオサイエンス (5)
【Ｆターム（参考）】
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