血糖値低下剤、糖尿病治療・予防剤及びその製造方法
本発明は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤、並びにその製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を有効成分とする血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において、特に先進各国においては、食事によるカロリー摂取の過多等により生活習慣病、成人病の一つである糖尿病が蔓延するに至っている。糖尿病の患者数は、日本国内だけでも６５０万人を超えると言われている。さらに、耐糖能障害を患う糖尿病患者の予備軍は人口の１０人に１人、つまり、１０００万人を超えていると言われている。
【０００３】
現在においては、多くの種類の血糖値低下剤や糖尿病治療剤が実用に供されている。しかし、これらの多くは、薬理効果及び副作用等の点において必ずしも満足し得るものとは云い難く、より効果的な薬剤の希求が高まるに至っている。
【０００４】
安全性の高い血糖値低下剤としては、乳酸桿菌菌体の水抽出物が知られている（特開平06-116156号公報）。しかし安全性が高く効果のより優れた薬剤はなおも求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性が高く効果の優れた血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の発明者は、エンテロコッカス属に属する各種微生物（乳酸菌）が血糖値を極めて効果的に低下せしめる作用を有することを見出した。さらに本発明者は、その起源が所謂腸内細菌であるそれら微生物が、経口的には実質的に無毒性であること、且つ薬理活性も極めて高いことを見出した。その結果、本発明者は、エンテロコッカス属に属する微生物を、これまでの種々の血糖値低下剤や糖尿病の各種症状を軽減する糖尿病薬剤が有していたような種々の副作用を生じさせることなく、他の薬剤と重複して服用しても飲み合わせによる問題が生じない、血糖値低下効果と糖尿病の治療及び予防効果を有する薬剤として有効に使用できることを見出し、以下の通り本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤に関する。
【０００８】
本発明はまた、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、糖尿病治療・予防剤にも関する。
【０００９】
ここで上記の微生物（エンテロコッカス属に属する細菌）は、その微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物のいずれの形態であってもよい。また菌体又は菌体処理物は、生菌体でも死菌体でもよく、その混合物であってもよいが、死菌体であることがなお好ましい。
【００１０】
また本発明は、エンテロコッカス属に属する微生物をロゴサ液体培地にて培養することにより培養物を調製することを含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法にも関する。
【００１１】
この製造方法では、限定するものではないが、上記微生物をロゴサ液体培地にてｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に培養（例えば静置培養）することが好ましい。
【００１２】
本発明ではまた、上記製造方法において、上記のように調製した培養物から菌体を回収し、それを洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄した菌体は、生理食塩水等の溶媒中に懸濁して菌懸濁液として調製してもよい。
【００１３】
さらに本発明では、上記製造方法において、洗浄した菌体（又は菌懸濁液）を加熱し、洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄した菌体は、さらに懸濁液として調製してもよい。ここで上記の洗浄した菌体（又は菌懸濁液）の加熱は、１１０〜１２０℃で５〜１０分間にわたって行うことが好ましい。
【００１４】
本発明においては、下記（ａ）〜（ｅ）のステップを含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法が特に好ましい：
（ａ）エンテロコッカス属に属する微生物の生菌体をロゴサ液体培地に接種するステップ、
（ｂ）接種した培地を、ｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に静置培養することにより培養物を調製するステップ、
（ｃ）調製した培養物を遠心分離することにより菌体を回収するステップ、
（ｄ）回収した菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
（ｅ）洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁することにより菌懸濁液を得るステップ。
【００１５】
さらにこの製造方法では、下記（ｆ）〜（ｈ）のステップをさらに含んでもよい：
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた菌懸濁液を１１０〜１２０℃で５〜１０分間加熱するステップ、
（ｇ）加熱した菌液中の菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
（ｈ）洗浄された菌体を生理食塩水に懸濁させることにより前記エンテロコッカス属に属する微生物の死菌体を含有する菌懸濁液を調製するステップ。
【００１６】
上記製造方法において、前記エンテロコッカス属に属する微生物とは、好ましくは、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る血糖値低下剤、糖尿病治療・予防剤は、その薬効成分が腸内細菌であることから、副作用を生じさせることがなく、他の薬剤と重複して服用しても飲み合わせによる問題が生じさせることがなく、血糖値低下に、そして糖尿病の治療及び予防に極めて有効である。
【００１８】
本明細書は、本願の優先権の基礎となる日本国特願２００２−１９０６１６号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に用いる微生物（乳酸菌）、菌体処理方法、薬理効果等についてそれぞれ詳しく説明する。
【００２０】
１．微生物
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造には、エンテロコッカス属に属する微生物（乳酸菌）のうち１種又は２種以上の微生物を用いることが好ましい。エンテロコッカス属に属する微生物とは、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌス等に分類されるエンテロコッカス属細菌群に含まれる微生物を意味する。
【００２１】
これらのエンテロコッカス属に属する微生物は、市販品として入手できるだけでなく、様々な生物寄託機関から分与を受けることもできる。そのような生物寄託機関としては、例えば、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本）やＡＴＣＣ（American Type Culture Collection；米国）等が挙げられる。例えば、エンテロコッカス・フェカリス菌としては、後述の表１に挙げたエンテロコッカス・フェカリス菌ＫＲＩ−６８株が、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection；米国）に受託番号「ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ７００８０２」として寄託されている。本発明においては、この受託番号に基いてエンテロコッカス・フェカリス菌ＫＲＩ−６８株をＡＴＣＣから入手し、好適に使用することができる。
【００２２】
本発明において特に有用である具体的な菌株を表１に例示する。
【００２３】
尚、表中において、「ＫＲＩ」を付した番号は、菌株を特定するための整理番号である。これらの菌株は、株式会社 河合乳酸球菌研究所（日本、東京都）から入手することができる。
【表１】
【００２４】
表１に例示された菌株の菌学的性質を表２に示す。
【表２】
【００２５】
２．培養方法及び菌体処理方法
本発明において用いるエンテロコッカス属に属する微生物は、限定するものではないが、下記のようなロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地にて培養することが好ましい。
【表３】
【００２６】
本発明においては、上記エンテロコッカス属に属する微生物を用いて、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤を製造することができる。本発明では、好ましくはロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地にて、培養した（増殖させた）エンテロコッカス属に属する微生物を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いることができる。本発明では、そのようにして得たエンテロコッカス属に属する微生物の培養物を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に直接用いてもよい。本発明では、培養物から分離した培養上清（少量の菌体、菌体の一部、菌体からの分泌物等を含む）も、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いることができる。
【００２７】
また本発明では、該培養物から単離した菌体を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いることがより好ましい。特に好ましくは、上記エンテロコッカス属に属する微生物を、例えばロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地にて培養（例えば、ｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に静置培養）し、得られた培養物を遠心分離し、沈殿物を回収することによって得られる菌体を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いる。こうして得られた菌体（主として生菌体）を、直接薬剤の製造に使用してもよいが、生理食塩水等の等張液で洗浄し、次いで生理食塩水等の等張液中に懸濁してから使用してもよい。
【００２８】
さらに本発明では、得られた菌体に、例えば加熱処理、超音波処理、凍結解凍処理などの細胞破壊処理を含む任意の処理を施して、菌体処理物を調製し、それを血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造に用いてもよい。菌体処理物は、生菌体を含んでいてもよいが、実質的に死菌体（例えば、死菌体懸濁液などの、死菌体を含む組成物）であることが好ましい。死菌体としては、例えば、上記で得られた菌体を超音波処理等によって破壊した破壊菌体や、上記で得られた菌体を加熱処理した加熱処理菌体などが挙げられる。血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いる菌体処理物に含まれる死菌体は、全菌体であっても菌体の一部分であってもよい。
【００２９】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いる上記エンテロコッカス属に属する微生物は、例えば以下のようにしての菌体又は菌体処理物として調製してもよい。
【００３０】
１）生菌体（生菌体懸濁液）の調製例
エンテロコッカス属に属する微生物を前述のロゴサ液体培地５リットルに接種し、ＰＨ６．５〜８．０の範囲で温度条件を中心値３７℃（３６〜３８℃）として、５時間にわたり好気的に静置培養し、生菌数１０9／ｍｌの培養物を調製する。得られた培養物を１２０００ｒｐｍの連続遠心分離に付し、生菌を集菌し、それを生理食塩水で二度洗浄した後、生理食塩水に懸濁して菌懸濁液５０ｍｌ（１０11個／ｍｌ）を得る。
【００３１】
２）死菌体（加熱処理菌体）の調製例
上記１）の調製例に従って得られた菌懸濁液５０ｍｌ（１０11個／ｍｌ）を１１５℃で１０分間加熱する。こうして加熱処理した菌体８０ｍｇを０．５ｍｌの生理食塩水で洗浄後、生理食塩水に懸濁して死菌体懸濁液を得る。
【００３２】
３．エンテロコッカス属に属する微生物の血糖値低下作用並びに血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤における使用
以上のようにして調製したエンテロコッカス属に属する微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）は、良好な血糖値低下作用を示す。これらの微生物（好ましくはその培養物、菌体又は菌体処理物）のもつ血糖値低下作用は、例えば後述の実施例に記載されているような、当業者に公知の血糖値測定法を利用して確認することができる。本発明において用いるエンテロコッカス属に属する微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）は、効果的に血糖値を低下させることができ、限定するものではないが、例えば未投与群と比較して血糖値を１０％〜４０％低下させることができる。
【００３３】
また本発明の微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）のもつ急性毒性は非常に低い。例えば後述の実施例に示されているＬＤ50値（５０％致死量）は、生菌体懸濁液の場合、９．９×１０8〜１．３×１０10個／マウス（腹腔内投与）、死菌体懸濁液の場合はいずれの菌にあっても５４００ｍｇ／ｋｇ体重（経口投与）、９２０ｍｇ／ｋｇ体重（腹腔内）である。特に経口投与の場合、生菌体懸濁液でも死菌体懸濁液でも、実質的に急性毒性が認められない。
【００３４】
従って、本願発明に係る微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）を有効成分として含有する薬剤は、血糖値低下剤として非常に有効であり、さらに、血糖値低下効果と密接に関連する糖尿病治療剤及び糖尿病予防剤として有効に用いることができる。
【００３５】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、薬学上許容される担体又は添加物を含有していてもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学上許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、薬剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、その他の薬学上一般に使用される増量剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤などの添加剤をさらに含有してもよい。
【００３６】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、限定するものではないが、経口的に、又は静脈注射により、投与することができる。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、錠剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、凍結乾燥粉末などを含む粉剤をはじめとする固形製剤、ジェル剤、あるいは生理食塩水等に溶解した液剤、懸濁剤、シロップ剤をはじめとする液体製剤などの通常の剤形であってよい。
【００３７】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤を投与する対象は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物である。特に、血糖値が高めのヒトなどの哺乳動物、又は糖尿病に罹り易い素因を有するヒトなどの哺乳動物が、投与対象として好ましい。
【００３８】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の投与量は、投与対象の動物種、年齢及び体重、投与経路、投与回数などにより異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、有効成分である微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）の経口投与量は、好ましくは１日あたり８０〜９００ｍｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、限定するものではないが、１日１回以上、継続的に（例えば１ヶ月以上）投与することが好ましい。
【００３９】
本発明は、上記のエンテロコッカス属に属する微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）又はそれを含有する医薬組成物を上記のようにして投与することを含む、血糖値を低下させる方法、並びに糖尿病を治療及び／又は予防する方法にも関する。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００４１】
[実施例１]
１．実験動物の飼育、並びに血糖値及び尿糖値の測定
後述の全ての実施例において、実験動物を用いた実験は以下のように行った。
【００４２】
実験動物は、糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄）を日本クレア社より４週令で入手し、２週間の予備飼育の後、実験に使用した。
【００４３】
（１）飼育条件
室温２２±１℃、湿度５５．０±１０％、照明周期１２時間にして、１ケージに７匹ずつ飼育した。飼料は、固形飼料を通した水道水を給水瓶に入れ、自由摂取させた。
【００４４】
（２）採血方法
採血は５日間に１回ずつ行い、マウスの尾動脈より採血した。
【００４５】
（３）血糖値の測定
血糖値の測定については、ロシュ・ダイアクッスティック株式会社より市販されているアドバンテージIIにアドバンテージテストストリップＳをセットし、採血した血液を流し込んで血糖値を測定した。
【００４６】
（４）採尿及び尿糖値の測定
採尿は５日に１回行った。棒瓶と透明カップの間に網をセットし、棒瓶側の方にはマウスを入れ、透明カップの方に尿を回収した。栄研化学株式会社より購入したウロペーパーIIＧ、ｐＨに、回収した尿をしみ込ませ、−、±、＋、＋＋、＋＋＋及び＋＋＋＋の６段階で判定した。＋以上と判定された尿について糖尿病の発症と判断した。
【００４７】
２．生菌体懸濁液の調製及びマウスへの投与結果
上述の生菌体の調製例に従い、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＫＲＩ−６２２株をロゴサ液体培地に接種し、ＰＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃にて好気的に静置培養し、次いで生理食塩水中に菌懸濁液（生菌体）を調製した。またこの菌懸濁液から、上述の死菌体の調製例に従って加熱処理死菌体（死菌体懸濁液）を調製した。
【００４８】
次に、調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表４に示す。
【表４】
【００４９】
表４に示すように、微生物エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２は、死菌体では８０日目で３７．４％、８５日目で３７．５％の血糖値の著しい低下率を示した。生菌体でも８０日目、８５日目でそれぞれ１６．６％、１７．１％の低下が見られた。
【００５０】
[実施例２]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりにエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＫＲＩ−６８株を用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表５に示す。
【表５】
【００５１】
表５に示すように、微生物エンテロコッカス・フェカリスＫＲＩ−６８は、死菌体では８０日目で３９％、８５日目で３６％の血糖値の著しい低下率を示した。生菌体でも８０日目、８５日目でそれぞれ１６％、１７％の低下が見られた。
【００５２】
[実施例３]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりにエンテロコッカス・エビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｉｕｍ）ＫＲＩ−１２２３株を用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表６に示す。
【表６】
【００５３】
表６に示すように、微生物エンテロコッカス・エビウムＫＲＩ−１２２３は、死菌体では８０日目で１１％、８５日目で１２％の血糖値の低下率を示した。生菌体では８０日目で１．８％、８５日目で８％の低下率であった。
【００５４】
[実施例４]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりに、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）ＫＲＩ−６１４株を用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表７に示す。
【表７】
【００５５】
表７に示すように、微生物エンテロコッカス・デュランスＫＲＩ−６１４は、死菌体では８０日目、８５日目でそれぞれ１４％の血糖値の低下率を示した。生菌体では８０日目、８５日目でそれぞれ９％の低下率を示した。
【００５６】
[実施例５]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりに、エンテロコッカス・ミティス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＫＲＩ−８１４株、エンテロコッカス・サリバリウス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＫＲＩ−１２１６株、及びエンテロコッカス・イクイヌス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ）ＫＲＩ−１２０株をそれぞれ個別に用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表８に示す。
【表８】
【００５７】
表８に示すように、微生物エンテロコッカス・ミティスＫＲＩ−８１４、及びエンテロコッカス・イクイヌスＫＲＩ−１２０は、死菌体では８５日目に８．１％の血糖値の低下率を示した。
【００５８】
[実施例６]
ＩＣＲ系マウス（雄６週令、平均体重３０ｇ±０．７ｇ）を使用して、本発明に係る菌体又は菌体処理物の急性毒性を調べた。
【００５９】
実施例１と同様に、上記の生菌体の調製例に従って各菌株の生菌体懸濁液を調製した。得られた生菌体懸濁液から、マウス１匹当り９×１０9個、９×１０8個、９×１０7個の３段階の生菌投与量を含むように生理食塩水懸濁液を調製し、その生理食塩水懸濁液０．５ｍｌを、ＩＣＲ系マウスに腹腔内投与し、１４日間マウスの生死を観察した（各群１０匹）。ＢＥＨＲＥＮＳ−ＫＡＲＢＥＲ法に従って測定したＬＤ50値を表９に示す。
【表９】
【００６０】
尚、死菌体の場合はいずれの菌にあっても、ＬＤ50値は、６×１０13個／マウス以上（腹腔内投与）であった。また経口投与ではいずれの菌も実質的に無毒性であった。
【００６１】
[製剤例]
実施例１に従って得られたエンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２の凍結乾燥物８０ｍｇ（死菌体数３×１０11個に相当）を精製でんぷん末９２０ｍｇと均一に混合し、打錠して経口投与用錠剤とした。この錠剤は、体重６０ｋｇの成人における死菌体用量６×１０9個／ｋｇ体重に相当する。
【００６２】
また、上記凍結乾燥物５００ｍｇを精製でんぷん末５００ｍｇと混合し、打錠して経口投与用錠剤としたものは、同様に体重６０ｋｇの成人における死菌体用量３．３×１０10個／ｋｇに相当する。
【００６３】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病予防剤は、このようにして、上記標準用量等に基づいて菌体と薬学的に許容され得る担体とを混合して、上記薬効を有する所望の剤形とすることができる。
【００６４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のエンテロコッカス属細菌（好ましくは該細菌の培養物、菌体又は菌体処理物）を有効成分とする血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、高い血糖値低下作用及び高い安全性のために、例えば糖尿病患者に投与する上で好適に使用できる。またそれらの製造方法は、高い血糖値低下作用を有する薬剤を製造するために有利に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を有効成分とする血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において、特に先進各国においては、食事によるカロリー摂取の過多等により生活習慣病、成人病の一つである糖尿病が蔓延するに至っている。糖尿病の患者数は、日本国内だけでも６５０万人を超えると言われている。さらに、耐糖能障害を患う糖尿病患者の予備軍は人口の１０人に１人、つまり、１０００万人を超えていると言われている。
【０００３】
現在においては、多くの種類の血糖値低下剤や糖尿病治療剤が実用に供されている。しかし、これらの多くは、薬理効果及び副作用等の点において必ずしも満足し得るものとは云い難く、より効果的な薬剤の希求が高まるに至っている。
【０００４】
安全性の高い血糖値低下剤としては、乳酸桿菌菌体の水抽出物が知られている（特開平06-116156号公報）。しかし安全性が高く効果のより優れた薬剤はなおも求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性が高く効果の優れた血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の発明者は、エンテロコッカス属に属する各種微生物（乳酸菌）が血糖値を極めて効果的に低下せしめる作用を有することを見出した。さらに本発明者は、その起源が所謂腸内細菌であるそれら微生物が、経口的には実質的に無毒性であること、且つ薬理活性も極めて高いことを見出した。その結果、本発明者は、エンテロコッカス属に属する微生物を、これまでの種々の血糖値低下剤や糖尿病の各種症状を軽減する糖尿病薬剤が有していたような種々の副作用を生じさせることなく、他の薬剤と重複して服用しても飲み合わせによる問題が生じない、血糖値低下効果と糖尿病の治療及び予防効果を有する薬剤として有効に使用できることを見出し、以下の通り本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤に関する。
【０００８】
本発明はまた、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、糖尿病治療・予防剤にも関する。
【０００９】
ここで上記の微生物（エンテロコッカス属に属する細菌）は、その微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物のいずれの形態であってもよい。また菌体又は菌体処理物は、生菌体でも死菌体でもよく、その混合物であってもよいが、死菌体であることがなお好ましい。
【００１０】
また本発明は、エンテロコッカス属に属する微生物をロゴサ液体培地にて培養することにより培養物を調製することを含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法にも関する。
【００１１】
この製造方法では、限定するものではないが、上記微生物をロゴサ液体培地にてｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に培養（例えば静置培養）することが好ましい。
【００１２】
本発明ではまた、上記製造方法において、上記のように調製した培養物から菌体を回収し、それを洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄した菌体は、生理食塩水等の溶媒中に懸濁して菌懸濁液として調製してもよい。
【００１３】
さらに本発明では、上記製造方法において、洗浄した菌体（又は菌懸濁液）を加熱し、洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄した菌体は、さらに懸濁液として調製してもよい。ここで上記の洗浄した菌体（又は菌懸濁液）の加熱は、１１０〜１２０℃で５〜１０分間にわたって行うことが好ましい。
【００１４】
本発明においては、下記（ａ）〜（ｅ）のステップを含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法が特に好ましい：
（ａ）エンテロコッカス属に属する微生物の生菌体をロゴサ液体培地に接種するステップ、
（ｂ）接種した培地を、ｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に静置培養することにより培養物を調製するステップ、
（ｃ）調製した培養物を遠心分離することにより菌体を回収するステップ、
（ｄ）回収した菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
（ｅ）洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁することにより菌懸濁液を得るステップ。
【００１５】
さらにこの製造方法では、下記（ｆ）〜（ｈ）のステップをさらに含んでもよい：
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた菌懸濁液を１１０〜１２０℃で５〜１０分間加熱するステップ、
（ｇ）加熱した菌液中の菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
（ｈ）洗浄された菌体を生理食塩水に懸濁させることにより前記エンテロコッカス属に属する微生物の死菌体を含有する菌懸濁液を調製するステップ。
【００１６】
上記製造方法において、前記エンテロコッカス属に属する微生物とは、好ましくは、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る血糖値低下剤、糖尿病治療・予防剤は、その薬効成分が腸内細菌であることから、副作用を生じさせることがなく、他の薬剤と重複して服用しても飲み合わせによる問題が生じさせることがなく、血糖値低下に、そして糖尿病の治療及び予防に極めて有効である。
【００１８】
本明細書は、本願の優先権の基礎となる日本国特願２００２−１９０６１６号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に用いる微生物（乳酸菌）、菌体処理方法、薬理効果等についてそれぞれ詳しく説明する。
【００２０】
１．微生物
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造には、エンテロコッカス属に属する微生物（乳酸菌）のうち１種又は２種以上の微生物を用いることが好ましい。エンテロコッカス属に属する微生物とは、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌス等に分類されるエンテロコッカス属細菌群に含まれる微生物を意味する。
【００２１】
これらのエンテロコッカス属に属する微生物は、市販品として入手できるだけでなく、様々な生物寄託機関から分与を受けることもできる。そのような生物寄託機関としては、例えば、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本）やＡＴＣＣ（American Type Culture Collection；米国）等が挙げられる。例えば、エンテロコッカス・フェカリス菌としては、後述の表１に挙げたエンテロコッカス・フェカリス菌ＫＲＩ−６８株が、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection；米国）に受託番号「ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ７００８０２」として寄託されている。本発明においては、この受託番号に基いてエンテロコッカス・フェカリス菌ＫＲＩ−６８株をＡＴＣＣから入手し、好適に使用することができる。
【００２２】
本発明において特に有用である具体的な菌株を表１に例示する。
【００２３】
尚、表中において、「ＫＲＩ」を付した番号は、菌株を特定するための整理番号である。これらの菌株は、株式会社 河合乳酸球菌研究所（日本、東京都）から入手することができる。
【表１】
【００２４】
表１に例示された菌株の菌学的性質を表２に示す。
【表２】
【００２５】
２．培養方法及び菌体処理方法
本発明において用いるエンテロコッカス属に属する微生物は、限定するものではないが、下記のようなロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地にて培養することが好ましい。
【表３】
【００２６】
本発明においては、上記エンテロコッカス属に属する微生物を用いて、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤を製造することができる。本発明では、好ましくはロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地にて、培養した（増殖させた）エンテロコッカス属に属する微生物を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いることができる。本発明では、そのようにして得たエンテロコッカス属に属する微生物の培養物を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に直接用いてもよい。本発明では、培養物から分離した培養上清（少量の菌体、菌体の一部、菌体からの分泌物等を含む）も、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いることができる。
【００２７】
また本発明では、該培養物から単離した菌体を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いることがより好ましい。特に好ましくは、上記エンテロコッカス属に属する微生物を、例えばロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地にて培養（例えば、ｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に静置培養）し、得られた培養物を遠心分離し、沈殿物を回収することによって得られる菌体を、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いる。こうして得られた菌体（主として生菌体）を、直接薬剤の製造に使用してもよいが、生理食塩水等の等張液で洗浄し、次いで生理食塩水等の等張液中に懸濁してから使用してもよい。
【００２８】
さらに本発明では、得られた菌体に、例えば加熱処理、超音波処理、凍結解凍処理などの細胞破壊処理を含む任意の処理を施して、菌体処理物を調製し、それを血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造に用いてもよい。菌体処理物は、生菌体を含んでいてもよいが、実質的に死菌体（例えば、死菌体懸濁液などの、死菌体を含む組成物）であることが好ましい。死菌体としては、例えば、上記で得られた菌体を超音波処理等によって破壊した破壊菌体や、上記で得られた菌体を加熱処理した加熱処理菌体などが挙げられる。血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いる菌体処理物に含まれる死菌体は、全菌体であっても菌体の一部分であってもよい。
【００２９】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の製造に用いる上記エンテロコッカス属に属する微生物は、例えば以下のようにしての菌体又は菌体処理物として調製してもよい。
【００３０】
１）生菌体（生菌体懸濁液）の調製例
エンテロコッカス属に属する微生物を前述のロゴサ液体培地５リットルに接種し、ＰＨ６．５〜８．０の範囲で温度条件を中心値３７℃（３６〜３８℃）として、５時間にわたり好気的に静置培養し、生菌数１０9／ｍｌの培養物を調製する。得られた培養物を１２０００ｒｐｍの連続遠心分離に付し、生菌を集菌し、それを生理食塩水で二度洗浄した後、生理食塩水に懸濁して菌懸濁液５０ｍｌ（１０11個／ｍｌ）を得る。
【００３１】
２）死菌体（加熱処理菌体）の調製例
上記１）の調製例に従って得られた菌懸濁液５０ｍｌ（１０11個／ｍｌ）を１１５℃で１０分間加熱する。こうして加熱処理した菌体８０ｍｇを０．５ｍｌの生理食塩水で洗浄後、生理食塩水に懸濁して死菌体懸濁液を得る。
【００３２】
３．エンテロコッカス属に属する微生物の血糖値低下作用並びに血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤における使用
以上のようにして調製したエンテロコッカス属に属する微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）は、良好な血糖値低下作用を示す。これらの微生物（好ましくはその培養物、菌体又は菌体処理物）のもつ血糖値低下作用は、例えば後述の実施例に記載されているような、当業者に公知の血糖値測定法を利用して確認することができる。本発明において用いるエンテロコッカス属に属する微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）は、効果的に血糖値を低下させることができ、限定するものではないが、例えば未投与群と比較して血糖値を１０％〜４０％低下させることができる。
【００３３】
また本発明の微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）のもつ急性毒性は非常に低い。例えば後述の実施例に示されているＬＤ50値（５０％致死量）は、生菌体懸濁液の場合、９．９×１０8〜１．３×１０10個／マウス（腹腔内投与）、死菌体懸濁液の場合はいずれの菌にあっても５４００ｍｇ／ｋｇ体重（経口投与）、９２０ｍｇ／ｋｇ体重（腹腔内）である。特に経口投与の場合、生菌体懸濁液でも死菌体懸濁液でも、実質的に急性毒性が認められない。
【００３４】
従って、本願発明に係る微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）を有効成分として含有する薬剤は、血糖値低下剤として非常に有効であり、さらに、血糖値低下効果と密接に関連する糖尿病治療剤及び糖尿病予防剤として有効に用いることができる。
【００３５】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、薬学上許容される担体又は添加物を含有していてもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学上許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、薬剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、その他の薬学上一般に使用される増量剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤などの添加剤をさらに含有してもよい。
【００３６】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、限定するものではないが、経口的に、又は静脈注射により、投与することができる。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、錠剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、凍結乾燥粉末などを含む粉剤をはじめとする固形製剤、ジェル剤、あるいは生理食塩水等に溶解した液剤、懸濁剤、シロップ剤をはじめとする液体製剤などの通常の剤形であってよい。
【００３７】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤を投与する対象は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物である。特に、血糖値が高めのヒトなどの哺乳動物、又は糖尿病に罹り易い素因を有するヒトなどの哺乳動物が、投与対象として好ましい。
【００３８】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤の投与量は、投与対象の動物種、年齢及び体重、投与経路、投与回数などにより異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、有効成分である微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）の経口投与量は、好ましくは１日あたり８０〜９００ｍｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、限定するものではないが、１日１回以上、継続的に（例えば１ヶ月以上）投与することが好ましい。
【００３９】
本発明は、上記のエンテロコッカス属に属する微生物（好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）又はそれを含有する医薬組成物を上記のようにして投与することを含む、血糖値を低下させる方法、並びに糖尿病を治療及び／又は予防する方法にも関する。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００４１】
[実施例１]
１．実験動物の飼育、並びに血糖値及び尿糖値の測定
後述の全ての実施例において、実験動物を用いた実験は以下のように行った。
【００４２】
実験動物は、糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄）を日本クレア社より４週令で入手し、２週間の予備飼育の後、実験に使用した。
【００４３】
（１）飼育条件
室温２２±１℃、湿度５５．０±１０％、照明周期１２時間にして、１ケージに７匹ずつ飼育した。飼料は、固形飼料を通した水道水を給水瓶に入れ、自由摂取させた。
【００４４】
（２）採血方法
採血は５日間に１回ずつ行い、マウスの尾動脈より採血した。
【００４５】
（３）血糖値の測定
血糖値の測定については、ロシュ・ダイアクッスティック株式会社より市販されているアドバンテージIIにアドバンテージテストストリップＳをセットし、採血した血液を流し込んで血糖値を測定した。
【００４６】
（４）採尿及び尿糖値の測定
採尿は５日に１回行った。棒瓶と透明カップの間に網をセットし、棒瓶側の方にはマウスを入れ、透明カップの方に尿を回収した。栄研化学株式会社より購入したウロペーパーIIＧ、ｐＨに、回収した尿をしみ込ませ、−、±、＋、＋＋、＋＋＋及び＋＋＋＋の６段階で判定した。＋以上と判定された尿について糖尿病の発症と判断した。
【００４７】
２．生菌体懸濁液の調製及びマウスへの投与結果
上述の生菌体の調製例に従い、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＫＲＩ−６２２株をロゴサ液体培地に接種し、ＰＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃にて好気的に静置培養し、次いで生理食塩水中に菌懸濁液（生菌体）を調製した。またこの菌懸濁液から、上述の死菌体の調製例に従って加熱処理死菌体（死菌体懸濁液）を調製した。
【００４８】
次に、調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表４に示す。
【表４】
【００４９】
表４に示すように、微生物エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２は、死菌体では８０日目で３７．４％、８５日目で３７．５％の血糖値の著しい低下率を示した。生菌体でも８０日目、８５日目でそれぞれ１６．６％、１７．１％の低下が見られた。
【００５０】
[実施例２]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりにエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＫＲＩ−６８株を用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表５に示す。
【表５】
【００５１】
表５に示すように、微生物エンテロコッカス・フェカリスＫＲＩ−６８は、死菌体では８０日目で３９％、８５日目で３６％の血糖値の著しい低下率を示した。生菌体でも８０日目、８５日目でそれぞれ１６％、１７％の低下が見られた。
【００５２】
[実施例３]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりにエンテロコッカス・エビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｉｕｍ）ＫＲＩ−１２２３株を用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表６に示す。
【表６】
【００５３】
表６に示すように、微生物エンテロコッカス・エビウムＫＲＩ−１２２３は、死菌体では８０日目で１１％、８５日目で１２％の血糖値の低下率を示した。生菌体では８０日目で１．８％、８５日目で８％の低下率であった。
【００５４】
[実施例４]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりに、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）ＫＲＩ−６１４株を用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表７に示す。
【表７】
【００５５】
表７に示すように、微生物エンテロコッカス・デュランスＫＲＩ−６１４は、死菌体では８０日目、８５日目でそれぞれ１４％の血糖値の低下率を示した。生菌体では８０日目、８５日目でそれぞれ９％の低下率を示した。
【００５６】
[実施例５]
エンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２株の代わりに、エンテロコッカス・ミティス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＫＲＩ−８１４株、エンテロコッカス・サリバリウス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＫＲＩ−１２１６株、及びエンテロコッカス・イクイヌス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ）ＫＲＩ−１２０株をそれぞれ個別に用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。調製した生菌体懸濁液（菌体：１０1１個／日）、又は加熱処理死菌体（８０ｍｇ／０．５ｍｌ／日）を、上記の糖尿病マウスＫＫ−Ａｙ（雄性６週令飼育、平均体重３１ｇ、各群７匹）に経口的に毎日投与し、８５日間飼育を続けた。飼育期間中、５日に１回、マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表８に示す。
【表８】
【００５７】
表８に示すように、微生物エンテロコッカス・ミティスＫＲＩ−８１４、及びエンテロコッカス・イクイヌスＫＲＩ−１２０は、死菌体では８５日目に８．１％の血糖値の低下率を示した。
【００５８】
[実施例６]
ＩＣＲ系マウス（雄６週令、平均体重３０ｇ±０．７ｇ）を使用して、本発明に係る菌体又は菌体処理物の急性毒性を調べた。
【００５９】
実施例１と同様に、上記の生菌体の調製例に従って各菌株の生菌体懸濁液を調製した。得られた生菌体懸濁液から、マウス１匹当り９×１０9個、９×１０8個、９×１０7個の３段階の生菌投与量を含むように生理食塩水懸濁液を調製し、その生理食塩水懸濁液０．５ｍｌを、ＩＣＲ系マウスに腹腔内投与し、１４日間マウスの生死を観察した（各群１０匹）。ＢＥＨＲＥＮＳ−ＫＡＲＢＥＲ法に従って測定したＬＤ50値を表９に示す。
【表９】
【００６０】
尚、死菌体の場合はいずれの菌にあっても、ＬＤ50値は、６×１０13個／マウス以上（腹腔内投与）であった。また経口投与ではいずれの菌も実質的に無毒性であった。
【００６１】
[製剤例]
実施例１に従って得られたエンテロコッカス・フェシウムＫＲＩ−６２２の凍結乾燥物８０ｍｇ（死菌体数３×１０11個に相当）を精製でんぷん末９２０ｍｇと均一に混合し、打錠して経口投与用錠剤とした。この錠剤は、体重６０ｋｇの成人における死菌体用量６×１０9個／ｋｇ体重に相当する。
【００６２】
また、上記凍結乾燥物５００ｍｇを精製でんぷん末５００ｍｇと混合し、打錠して経口投与用錠剤としたものは、同様に体重６０ｋｇの成人における死菌体用量３．３×１０10個／ｋｇに相当する。
【００６３】
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病予防剤は、このようにして、上記標準用量等に基づいて菌体と薬学的に許容され得る担体とを混合して、上記薬効を有する所望の剤形とすることができる。
【００６４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のエンテロコッカス属細菌（好ましくは該細菌の培養物、菌体又は菌体処理物）を有効成分とする血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤は、高い血糖値低下作用及び高い安全性のために、例えば糖尿病患者に投与する上で好適に使用できる。またそれらの製造方法は、高い血糖値低下作用を有する薬剤を製造するために有利に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤。
【請求項２】
前記微生物が、前記微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物である、請求項１に記載の血糖値低下剤。
【請求項３】
前記菌体又は菌体処理物が、生菌体及び／又は死菌体である、請求項２に記載の血糖値低下剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、糖尿病治療・予防剤。
【請求項５】
前記微生物が、前記微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物である、請求項４に記載の糖尿病治療・予防剤。
【請求項６】
前記菌体又は菌体処理物が、生菌体及び／又は死菌体である、請求項５に記載の糖尿病治療・予防剤。
【請求項７】
エンテロコッカス属に属する微生物をロゴサ液体培地にて培養することにより培養物を調製することを含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法。
【請求項８】
前記培養をｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養物から菌体を回収し、洗浄することをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の洗浄した菌体を加熱し、洗浄することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記ステップ（ａ）〜（ｈ）を含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法：
（ａ）エンテロコッカス属に属する微生物の生菌体をロゴサ液体培地に接種するステップ、
（ｂ）接種した培地を、ｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に静置培養することにより培養物を調製するステップ、
（ｃ）調製した培養物を遠心分離することにより菌体を回収するステップ、
（ｄ）回収した菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、
（ｅ）洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁することにより菌懸濁液を得るステップ。
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた菌懸濁液を１１０〜１２０℃で５〜１０分間加熱するステップ、
（ｇ）加熱した菌懸濁液中の菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
（ｈ）洗浄された菌体を生理食塩水に懸濁させることにより前記微生物の死菌体を含有する菌懸濁液を調製するステップ。
【請求項１２】
前記エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤。
【請求項２】
前記微生物が、前記微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物である、請求項１に記載の血糖値低下剤。
【請求項３】
前記菌体又は菌体処理物が、生菌体及び／又は死菌体である、請求項２に記載の血糖値低下剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、糖尿病治療・予防剤。
【請求項５】
前記微生物が、前記微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物である、請求項４に記載の糖尿病治療・予防剤。
【請求項６】
前記菌体又は菌体処理物が、生菌体及び／又は死菌体である、請求項５に記載の糖尿病治療・予防剤。
【請求項７】
エンテロコッカス属に属する微生物をロゴサ液体培地にて培養することにより培養物を調製することを含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法。
【請求項８】
前記培養をｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養物から菌体を回収し、洗浄することをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の洗浄した菌体を加熱し、洗浄することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記ステップ（ａ）〜（ｈ）を含む、エンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療・予防剤の製造方法：
（ａ）エンテロコッカス属に属する微生物の生菌体をロゴサ液体培地に接種するステップ、
（ｂ）接種した培地を、ｐＨ６．５〜８．０、温度３６〜３８℃の条件下で好気的に静置培養することにより培養物を調製するステップ、
（ｃ）調製した培養物を遠心分離することにより菌体を回収するステップ、
（ｄ）回収した菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、
（ｅ）洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁することにより菌懸濁液を得るステップ。
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた菌懸濁液を１１０〜１２０℃で５〜１０分間加熱するステップ、
（ｇ）加熱した菌懸濁液中の菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
（ｈ）洗浄された菌体を生理食塩水に懸濁させることにより前記微生物の死菌体を含有する菌懸濁液を調製するステップ。
【請求項１２】
前記エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７３９０
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【発行日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１８０２６（Ｐ２００５−５１８０２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２３０９
【国際出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【出願人】（５０３０１７５３０）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【発行日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２３０９
【国際出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【出願人】（５０３０１７５３０）
【Ｆターム（参考）】
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