表面上に固定化した細胞質性付属タンパク質の配列体及び関連方法
【解決手段】細胞質性付属(アクセサリ)タンパク質の配列体を、スクリーニングの方法、かかる配列体の使用とともに提供する。かかる配列体は、表面を含み、それに付着する少なくとも１種の細胞質性付属タンパク質を持ち、通常複合化されるその膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列体及び方法、一定のタンパク質の配列体及びスクリーニング方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の細胞性情報伝達及び恒常性プロセスは、イオンチャネル、受容体及び輸送体のような貫膜タンパク質によって媒介される。これらのタンパク質クラスのすべては、細胞質のドメインを包含するタンパク質-タンパク質相互作用を介し、情報伝達性、調節性、足場材料性、及びアダプタ性のタンパク質と相互接続する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
イオンチャネル、G-タンパク質-共役(coupled)受容体のような膜結合受容体及び多くの細胞表面の輸送体は、タンパク質サブユニット複合体で構成され、膜の細胞質表面上のサブユニット〔本明細書において付属(accessory、アクセサリ)タンパク質と称する。〕のホモマの又はヘテロマの構築物からなる。これらのタンパク質の群が組合せの様式において複合体を形成する能力は、必要な生物物理学的特性又は修飾因子感受性を有する貫膜タンパク質複合体の組織特異的発現のための機構を提供する。ますます、サブユニット相互作用の決定要因は、これらのサブユニットの構造内の定義されたドメインに位置されている。これらのドメインの相互作用を理解することは、自然の系における膜タンパク質構築物の解明を助け、及び細胞内のタンパク質機能のために重要な修飾性タンパク質を識別する。さらに、これらの研究分野内で気付かれた知識は、貫膜タンパク質の付属の細胞質サブユニット及び膜結合部分の間の相互作用を混乱させることが、それが一旦識別されたら、高度の組織選択的で、従って、膜結合分子の活性を調節する特定の方法を表す場合があることを認める。したがって、付属タンパク質相互作用の外因性抑制剤、及びそれゆえ、サブユニット又は修飾性タンパク質構築物は、新しい、組織−特異的な治療上の標的を提供することができる。
【０００４】
電位作動型の(Voltage gated)カリウム(Kv)チャネル及びカルシウム(Ca2+)チャネルは、多くの障害であって、CNS、心臓、肺及び膀胱のそれらを含む障害において重要な治療上の標的として認められる。双方のチャネルの種類は、主たる孔形成(pore-forming)、電位−感知(voltage-sensing)α-サブユニットを持つ。Kvチャネルは、４種の同様のα-サブユニットで、それぞれが６種の貫膜セグメントを含んでいる構築物を必要とするが、カルシウムチャネルは、24種の貫膜セグメントを有する単一のα-サブユニットを持ち、６種の貫膜セグメントの４種の‘仮性サブユニット(pseudosubunits)’中に詰められる[1]。双方のKv及びCa2+チャネルは、構造的に類似の細胞質のβ-サブユニットと、α-サブユニット内の詳細に明らかにされた(well-defined)ドメインを介して共に組み立てられる(co-assemble)。これらは、種々の範囲に対し、チャネルのゲート開閉(gating)に影響を与えることができ、及び膜タンパク質の確実な分子シャペロンとの相互作用と似ているか、又は擬態され得る機構により、α-サブユニットの表面発現の効率を劇的に変えることができる[2]。今日まで、２種のチャンネルの種類のそれぞれについて識別される６種のβ-サブユニットがあった。Ca2+チャネルβ-サブユニットの６種のα-サブユニットと組み立てられる能力が決定されているが[3]、Kvチャネルβ-サブユニットと20種類又はそれくらいのα-サブユニットとの相互作用はほとんどあまり確立されておらず、及びまだ、目下の用いることができる分析方法が比較的雑であるために、β-及びα-サブユニットの組合せが本当に生物学的に関係があるかは詳細には知られていない(以下参照)。
【０００５】
受容体、特に、G-タンパク質共役受容体は、細胞表面タンパク質の極めて重要な群として認められており、及びそれらは多くの系において多種多様な機能を遂行する[4]。これらの7〜12種の貫膜タンパク質は、３種の系列(families)、Ａ、Ｂ及びＣに分類され、それらの中には、多くのサブタイプがある。各GPCRは、少なくとも１種のG-タンパク質と、その細胞質表面で相互作用するが、これらの相互作用の性質及び正体はあまり理解されておらず、及び目下、生物情報学から予測するのは困難である。また、G-タンパク質、並びにGPCR’ｓとの複合化も、また、K+及びCa2+チャネルサブユニットと顕著な結果を伴う特定の様式で相互作用する[5]。
【０００６】
嵩高い(bulky)分子の侵入を可能にする細胞表面でのタンパク質は、第３のクラスの膜タンパク質、輸送体で、機能するための多数の細胞質性(cytosolic)タンパク質サブユニットと複合化するものを表すが、本明細書で、再度、これらの相互作用の厳密な性質及び正体は、目下の分析方法論における制限のために、現在においてあまり特徴付けられていない。
【０００７】
新しい方法論は、種々の推定上のサブユニットの相手間のタンパク質サブユニットの結合相互作用の平衡状態及び動力学的結合パラメータの決定を含む、高度に平行なインビトロでの特徴付けを可能にし、この分野で、特に、それらがまた、治療上の可能性のある化合物がかかる相互作用を修飾する能力の評価を可能にさせる場合には、大いに有用である。これらの相互作用を調査するための目下の方法は、電気生理学的な分析のような、厄介な細胞に基づく技術、又はプル-ダウン/免疫沈降アッセイのような、低い処理量のインビトロ結合系に依存する。対照的に、本発明は、配列体(array)に基づく方法を記述し、これによって、イオンチャネル、細胞表面受容体及び輸送体のような膜-結合タンパク質の、可溶性の、機能的なドメインが、固定化した細胞質の付属タンパク質の配列体にインビトロで結合することを詳細に特徴付けることができる。本発明は、タンパク質-タンパク質相互作用の結合親和性及び特異性が決定されるのを可能にし、及びまた、相互作用の抑制剤/競合物(competitors)の作用が高度な並行系において探求されるのを可能にする。
【０００８】
酵母の２重雑種系を用いて、例えば、イオンチャネルタンパク質ドメインの間の相互作用が検出されている。この手法は、結合ドメインの識別において及び相互作用上のアミノ酸置換の効果の決定において適度に好首尾である。しかし、この方法は、結合親和性についての量的な情報を提供することができず、及び外因性物質が相互作用を修飾する潜在性に接近することができない。代わりに、細胞を基とする系、例えば、アフリカツメガエル(Xenopus)の卵母細胞又は哺乳類の細胞系におけるサブユニット発現に従う細胞全体の電気生理学が、イオンチャネル構築物を調査するのに用いられている。この手法は、技術的に困難で、固有に時間のかかるもので、及び下流の効果(downstream effect)の測定、すなわち、細胞全体の電流のために、実際の結合事象についての限られた情報を提供する。
【０００９】
生化学的な方法を用い、自然の及び組換え系におけるイオンチャネル構築物の個々の成分が分離されている。チャネルサブユニットの免疫共沈降実験及び親和性の精製を用い、イオンチャネルの複合体の成分が識別されている。しかし、どちらの方法も、結合親和性についての詳細な情報を提供しないか、又はサブユニットの相互作用の可能性のある修飾因子をスクリーニングするのに適していない。Ca2+チャネルの場合には、１種の特定のα-サブユニットの断片が、GSTへの融合としてアガロースビーズ上に固定され、及びインビトロで翻訳されたβ-サブユニットの結合を用い、相互作用中に包含されるα-サブユニットの特定領域がより一層に密接に定義された[6]。結合親和性上の詳細な情報は、この調査において入手できず、及びアルファサブユニットがこの調査で正しく折り畳まれたことは明確でない。
【００１０】
タンパク質の上敷の結合(protein overlay binding)は、可溶性のペプチド/タンパク質と膜支持体上に固定化された標的タンパク質と間の結合の相互作用を直接的に検査する[7]。この手順の間に、タンパク質は、最初に解離し、及びSDS-PAGEによって分けられ、及びウエスタンブロット法に関してニトロセルロースフィルタに移る。しかし、この方法における暗黙の変性工程は、この技術でアッセイされたタンパク質が機能的で(すなわち、折り畳まれ)、及び従って、生物学的に活性ではあり得ないことを示唆する。試みに、可溶性の、標識化された(labelled)タンパク質の結合を研究する前に、タンパク質を再生させることができるが、しかし、そこでは成功率は低い。
【００１１】
膜タンパク質と付属タンパク質との間の自然な相互作用の同定は、及び結合ドメインが包含され、種々の細胞を基とする方法を用いて研究されている。例えば、複合体内のα及びβKvチャネルのサブタイプの自然な組合せが、抗体又はサブタイプ-特異毒素での同時精製を用いて探索されている[9,10]。酵母の２重雑種実験が広範に用いられ、タンパク質-タンパク質相互作用ドメインが識別され、及び例えば、これが用いられ、細胞質のβサブユニットと相互作用するKvチャネルのN-末端T1ドメインの領域が識別されている[11]。タンパク質がモデル細胞において相互作用する能力が、組換え発現技術を用いて研究されている。例には、電気生理学を用いる電位作動型のイオンチャネルの同時発現及び機能的特徴付け[3,11,12]、及びキメラの及び変異体のGPCRsの発現[13,14における検討]が含まれる。かかる実験から導かれる気付かれた知識は、α及びβサブユニットがその後解離しないER中で安定な複合体を形成することである。
【００１２】
膜タンパク質のドメインと他のサブユニット又は細胞質の相手との間の結合相互作用、それに続く別個の発現は、１種ずつに基づくプル-ダウン式のアッセイを用いて調査されている。K+チャネルの貫膜サブユニットの四量体化ドメインは、このような方法で検査されている[15]。Ca2+チャネルの細胞内ドメインで、βサブユニット[6]又はSNARE(スネア)タンパク質[16]に結合するもの、アレスチンに結合する5-HT2A GPCR[17]及びアダプタタンパク質AP-2に結合するCFTRの輸送体[18]は、ビーズ上の膜タンパク質ドメインを固定化することによって検査されている。代わりに、細胞質のホーマータンパク質がビーズ上で固定化され、細胞可溶化物中に発現する代謝調節型のグルタミン酸塩受容体との相互作用が示されている[19]。架橋結合の実験がマイクロタイタプレート中のCFTR及びAP-2の間で遂行されている[18]が、この場合のタンパク質は固定化されなかった。タンパク質の上敷の実験は、多数の結合の相互作用が同時に識別されるようにする。この技術を用い、標識化されたショウジョウバエINADが固定化されたTRP Ca2+チャネルに結合することが示された[20]。この技術は、多数のタンパク質が、SDS-PAGEのゲルの異なるレーン中に分画されるようにし、及び次いでニトロセルロースフィルタ上に固体化され、結合について探索されるのを可能にする。
【００１３】
上述の技術の性質は、タンパク質の分析には、通常、可能性のある相互作用する相手の同時発現が包含されるか、又は結合アッセイに先立って、１種又はそれより多い種類の可能性のある相手の変性が包含されるかのいずれかであることを意味する。常に、それらは低い処理量であり、結合の特異性又は親和性上の詳細な情報をもたらさず、小さい分子の抑制剤の調査に一般的に適合しない。かかる問題を克服するために、本発明者は、別個の、及び重要なことには、機能的な、付属タンパク質の配列体を案出し、それらのタンパク質は膜タンパク質の成分と最初に同時発現されなかった。かかる配列体は、初めて、高度に平行な様式において相互作用の量的な決定を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このように、第１の局面において、本発明は、配列体であって、表面を含み、それに付着する少なくとも１種の細胞質性付属タンパク質を持ち、通常複合化されるその膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まない配列体を提供する。好ましくは、細胞質性付属タンパク質は相同的な膜タンパク質の系列の一員(members)である膜タンパク質の細胞質性付属タンパク質である。１具体例において、相同的な膜タンパク質の系列は、イオン-チャネル、Ｇタンパク質共役受容体及び貫膜輸送体タンパク質からなる群より選ばれる。
【００１５】
配列体上の付属タンパク質は、相同的な付属タンパク質の系列の一員、例えば、イオン-チャネルサブユニット(例えば、β-サブユニット)、受容体相互作用(receptor interacting)タンパク質(例えば、Ｇタンパク質、アレスチン及びＧタンパク質受容体キナーゼ)又は輸送体のための付属タンパク質(例えば、輸送体タンパク質相互作用タンパク質)であることができる。特に、想定されるものは、付属タンパク質が、K+-チャネルβ-サブユニット、Ca2+-チャネルβ-サブユニット、Ｇタンパク質サブタイプ、例えば、Ｇα、Ｇβ/γ又は輸送体のための付属タンパク質である配列体である。例には、Kvβ-サブユニットチャネル、例えば、β1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、3.1、3.2、４、カルシウムチャネルβ-サブユニット、例えば、β1a、β1b、β1c、β2a、β2b、β2c、β3a、β3b、β4、Ｇタンパク質系列、例えば、Gs系列(αs及びα01f)、Gt系列、Gi系列(α0、αi1〜αi13、αz)、Gi-0系列、Gq-11系列(αｑ、α11、α14、α15、α16、α12、α13)及びGα-sensory(Gα-感覚)系列〔αt-rod(αt-ロッド)、αgust(αガスト)〕及びβγ系列(γt、γ1、γ2、γ3等)、又は輸送体タンパク質に対する付属タンパク質が包含される。
【００１６】
本発明の配列体に付着するタンパク質の数は、少なくとも一定の範囲に対して、自然に発生するか、又は十分に、実験的、商業的又は臨床的に興味のあるタンパク質の数によって決定される。１種又は２種のタンパク質を運ぶ配列体は、研究者のために用いられる。しかし、実際には、及び高い処理量のアッセイにとってのかかる配列体の適合性をうまく利用するために、1〜10000、1〜1000、1〜500、1〜400、1〜300、1〜200、1〜100、1〜75、1〜50、1〜25、1〜10又は1〜5種のかかるタンパク質が、配列体上に存在すると予想される。
【００１７】
第２の局面において、本発明は、細胞質性付属タンパク質が、所定の膜タンパク質と相互作用するか又はその反対であるかを定める方法を提供し、前記方法は次の工程：
(i)候補の細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性付属タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
(ii)配列体を、前記膜タンパク質の細胞質性断片及び／又は他の関連する膜タンパク質系列の一員の細胞質性断片と接触させる工程；及び
(iii)相互作用する相手を検出し、及び同定する工程
を含む。
【００１８】
第３の局面において、本発明は、細胞質性付属タンパク質と選択的に相互作用する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は次の工程：
(i)細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
(ii)配列体を化合物又はペプチド又はタンパク質と接触させる工程；及び
(iii)相互作用する相手を同定する工程
を含む。
【００１９】
この方法は、随意に、相互作用する相手の相互作用を定量化する追加の工程(iv)を含む。
【００２０】
また、細胞質性付属タンパク質及び膜タンパク質の間の相互作用を選択的に修飾する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法をも提供し、前記方法は次の工程：
(i)細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
(ii)配列体を、化合物又はペプチド又はタンパク質と、及び対象の１種又はそれより多い種類の膜タンパク質又はその細胞質性断片と、同時にか、又は順にかのいずれかで接触させる工程；及び
(iii)前記相互作用が前記化合物又はペプチド又はタンパク質の存在によって修飾されるかどうかを定める工程
を含む。
【００２１】
この方法は、随意に、相互作用の調節の程度を定量化する追加の工程(iv)を含む。
【００２２】
本発明は、また、付属タンパク質の系列の異なる一員の相対的触媒活性を測定するために、本発明の細胞質性付属タンパク質の配列体の使用を提供する。
【００２３】
本発明は、また、表現型-遺伝子型-結合抗体(例えば、ファージ提示抗体)のライブラリから抗体を選ぶために、本発明の細胞質性付属タンパク質の配列体を、その上の親和性表面として用いる使用を提供する。
【００２４】
本発明は、また、付属タンパク質と膜タンパク質との相互作用上に、及び／又は前記膜タンパク質又は付属タンパク質の特性上に及ぼす翻訳後修飾の効果を定めるための、本発明の細胞質性付属タンパク質の配列体の使用を提供する。
【００２５】
本発明にかかるサブユニットの配列体は、空間的に画成された形式において、機能的な様式で、各々が発現し及び固定化される標識(tagged)タンパク質構成物を含むことができる。標識タンパク質構成物は、電位-作動型K+又はCa2+イオン-チャネルの細胞質の補助的なβ-サブユニット、Gタンパク質、又は嵩高い(bulk)輸送体と相互作用する球状付属タンパク質のような付属タンパク質サブユニットの群から引き出すことができる。標識化プローブの結合は、これは、別のチャネルサブユニット、関連タンパク質、相互作用のドメイン、ペプチド又は他の潜在的なリガンドであることができ、高い処理量の様式において技術的に簡単なプロトコルを用いて研究され得る。複雑な混合物又は組換え系又は細胞可溶化物からの標識化されたか又は標識化されていないタンパク質の結合も検査される場合がある。同じサブユニットの配列体は、数多くの潜在的な結合相手を選別し、及び詳細な結合情報を得るのに適している。代わりに、異なるタンパク質の配列体は、異なるサブタイプ及び種のサブユニットを表し、リガンド結合の特異性の検査に最も適する。
【００２６】
かかる配列体は、受容体、これは、多(multi)-サブユニット複合体として存在し、チャネル-形成サブユニット、修飾性タンパク質及びチャネルの細胞内位置に関与するタンパク質からなり、それのリガンド-作動型イオンチャネルのクラスを包含する、イオンチャネルを調査するために用いることができる。チャネルサブユニット間の相互作用は規定されたドメインによって媒介される場合がある。電位作動型K+及びCa2+チャネルは、α-サブユニット内の詳細に明らかにされたドメインを介する構造的に似た細胞質β-サブユニットと共に組み立てられる[7、21、22]。これらは、種々の範囲に対し、チャネルのゲート開閉に影響を与えることができ、及び膜タンパク質の確実な分子シャペロンとの相互作用と似ているか、又は擬態され得る機構により、α-サブユニットの表面発現の効率を劇的に変えることができる[2]。
【００２７】
本発明の配列体の別の適用は、受容体、例えば、G-タンパク質-共役受容体(GPCRs)の調査におけるものである。これらは、ヒトゲノムにおいて識別される1000種を超えるヘプタ螺旋の(heptahelical)タンパク質との、信号伝送に関与する細胞表面分子の最も大きな系列を構成する。GPCRsは三量体のG-タンパク質のサブセットを活性化することによって細胞外シグナルを変換する。結合部位は、ロドプシン及び網膜のG-タンパク質トランスデューシンのような、特異的なGPCR-G-タンパク質の相手のために決定することができる[23]。しかし、GPCRsの結合決定要因は、別個のドメインを形成せず、及び受容体が結合するG-タンパク質のサブセットを予測するのは困難である[24]。目下の研究下の数多くの希少な(orphan)GPCRsとのかかる相互作用を定めるための配列体に基づく方法は、高度に有利である。GPCRsの効果は、例えば、G-タンパク質-共役受容体キナーゼ(GRKs)及びアレスチンの相互作用及び結合によって修飾され、受容体の脱感作及び内部移行(internalisation)をもたらす[25]。アレスチンとの相互作用が、免疫共沈降によって検出されるのに十分に頑強であること[17]、及び合成ペプチドにより抑制され得ること[26]が例証されている。そのようなものとして、それは、インビトロ結合法を用いる研究のための潜在的な標的である。
【００２８】
本発明の配列体の更なる適用は、貫膜輸送体タンパク質の調査におけるものである。これらのタンパク質は、栄養素の選択的な取り込み及び代謝産物の搬出を制御し、細胞の外部と内部との間のイオン及び溶質のバランスを調節し、及びシナプス間隙からの神経伝達物質の除去によってシナプス伝送を修飾する。これらのタンパク質のための主要な調節性機構には、細胞膜への及び細胞膜からの転位(translocation)が包含される。しかし、細胞膜に位置する輸送体とのタンパク質-タンパク質相互作用による調節もまた起こることが証拠によって明らかにされている。例えば、膜結合大腸菌(E. coli)輸送体酵素IICBGlcと全体的な(global)リプレッサーMlcとの間のリン酸化-依存性のインビトロ結合は、転写制御の機構を示した[27]。貫膜調節性タンパク質、ストマチン(stomatin)へのグルコース輸送体GLUT-1のC-末端ドメインの結合はまた、アフィニティ・カラムクロマトグラフィによって例証された[28]。
【００２９】
本明細書に定義するような用語“配列体”は、表面上のパターン中に１種又はそれよりも多い種類のタンパク質部分の空間的に規定された配列を参照する。好ましくは、タンパク質部分を、表面に、直接的にか、又は間接的に付着させる。付着は非特異的であることができる(例えば、表面上への物理的な吸着によるか、又は非特異的な共有結合性相互作用の形成による)。好適例では、タンパク質部分は、例えば、国際公開第01/57198号で記述されているように、各タンパク質に連結する共通のマーカ部分によって表面に付着する。
【００３０】
このようにして、例えば、パターン中の各位置には、次の：
a) 単一タンパク質種類の試料(単量体、二量体、三量体、四量体又はより一層大きな多量体)；
b) 相互作用分子に結合した単一タンパク質種類の試料(例えば、DNA、抗体、他のタンパク質)；
c) 合成分子に結合した単一タンパク質種類の試料(例えば、ペプチド、化学的化合物)；又は
d) 所定の付属タンパク質系列からの２種又はそれよりも多い種類のヘテロマの混合物
の１種又はそれよりも多い種類のコピーを含むことができる。
【００３１】
配列体を支持する表面は、例として、化学的処置によって被覆するか/誘導体化することができる。適切な表面の例には、スライドガラス、ポリプロピレン又はポリスチレン、シリカ、金又は金属支持体、又は例えば、ニトロセルロース、PVDF、ナイロン又はホスホセルロースから作製された膜が包含される。配列体の形式はマイクロウェルプレート又はマイクロアレイのものであることができる。
【００３２】
本発明に従うタンパク質の配列体の形式の使用には、多くの利点がある。例えば、補助的なサブユニット、関連タンパク質及びチャネルサブユニットドメインのような、膜タンパク質構築物の成分の配列体は、溶液層中の結合相手との相互作用が検査されるのを可能にする。結合パラメータを正確に定めることができ、及び結合の修飾因子又は抑制剤の効果を高度に平行な様式において調査することができる。
【００３３】
いくつかの最近の出版物[例えば、参考文献8]は、機能的なタンパク質の配列体が配列体の個々の一員を同じ条件の下で同時に選別させるのを可能にすることを示している。これは、他の技術と比較される高度に平行で及び迅速な実験を可能にし、多くのタンパク質にわたって直接的に比較できる結果を導く。これらの質は、タンパク質の配列体を、Y2H及び免疫沈降/プル-ダウンのような、タンパク質機能のための他のアッセイから区別し、そこでは、これらの他の方法で潜在する細胞の区分化(compartmentalisation)が、各タンパク質収集物を、個々のタンパク質に、及び従って個々のアッセイに効率的に分ける。
【００３４】
本発明に従うタンパク質の配列体は、それらを特に固定化するとき、タンパク質の機能的な活性を保存することができ、生物学的活性を直接測定されるようにする。加えて、それらは、免疫沈降及びプル-ダウンアッセイを用いる比較できる様式においては不可能な観察される相互作用上での潜在的な抑制剤の実体の効果を定めるための直接的な方法を提供する。
【００３５】
本発明に従うタンパク質の配列体は、観察された相互作用のための結合定数(Kd)を定量化するために用いることができ、及びまた、所定の相互作用を抑制するのに必要な化合物の濃度をIC50値の決定により測定可能にする。
【００３６】
本発明の配列体の取調べから得られる結果は、定量的(例えば、結合定数又は触媒作用の定数KD及びKMの測定)、半定量的(例えば、タンパク質量に対する結合量の標準化)又は定性的(例えば、非機能的対機能的)であることができる。リガンドがいくつかの(例えば、２種又はそれよりも多くの種類の)濃度で添加される反復配列体のためのシグナルを定量化することによって、スポットにおけるタンパク質の結合親和性及び活性な濃度の双方を決定することができる。例えば、定量的な結果、KD及びBmaxは、リガンドとタンパク質との間の相互作用の親和性及びそのリガンドのための結合部位の数のそれぞれを記述し、タンパク質の配列体のデータから導くことができる。簡潔には、各々の個々のタンパク質のスポットに結合するリガンドの定量化されたか、又は相対的な量のいずれかを、リガンドの異なる濃度でアッセイ溶液において測定することができる。タンパク質の量と結合するリガンドとの間の直線的な関係を仮定すれば、アッセイにおいて用いられるリガンドの濃度の範囲にわたって各スポットに結合するリガンドの(相対的な)量を、式１、再配列又は誘導に適合させることができる。
結合リガンド＝Bmax/((KD/[L])+1) (式１)
[L]=アッセイ中に用いるリガンドの濃度
【００３７】
本発明者は、膜タンパク質の付属タンパク質の機能的な配列体を生産し、リガンドの結合パラメータ及び特異性の迅速な研究のためのツールを提供した。リガンドは、他の膜タンパク質のサブユニット、ペプチド又は複雑な構築物を修飾するための潜在的な治療上の化合物の結合ドメインのような、他のタンパク質であることができる。この方法論は高度に平行な形式における正確な結合定数の決定を提供する。
【００３８】
ここから、本発明を、次の図面を参照し、次の例により更に説明するが、図面において：
図１はβサブユニットの粗可溶化物のウエスタンブロットを示す。それぞれのβサブユニット発現クローンからの粗可溶化物及び清澄な可溶化物の10μLを、SDS PAGEを用いて動かした。ゲルを移し、及び膜をストレプトアビジン(A)及び抗His抗体(B)で探索した。レーンに負荷されたものは：１及び２ヒトβ１、３及び４ヒトβ２、５及び６ヒトβ３、７及び８ラットβ１、９及び10ラットβ２、11及び12ラットβ３。奇数のレーン−粗可溶化物、偶数のレーン−清澄な可溶化物。
【００３９】
図２は精製したKvβサブユニットのSDS PAGEを示す。レーン１及び８Mrマーカ、２ヒトβ１、３ヒトβ２、４ヒトβ３、５ラットβ１、６ラットβ２、７ラットβ３。
図３は精製したヒト及びラットKvβサブユニットの紫外-可視光吸収スペクトルを示す。凡例：青色；ヒトβ１、ピンク色；ヒトβ２、黄色；ヒトβ３、青緑色；ラットβ１、紫色；ラットβ２、茶色；ラットβ３。挿入図は360nmでのピークをより一層詳細に示す。
【００４０】
図４はKvβサブユニットの共沈アッセイを示す。A;Kvβサブユニット可溶化物をKvαサブユニット被覆の抗FLAGビーズに(レーン７〜12)及び未被覆抗FLAGビーズに(レーン１〜６)に添加した。１時間のインキュベーションの後、ビーズを洗浄し、及びSDS PAGE上での駆動前にSDSの試料緩衝液中で煮沸した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、及びビオチン化KvβサブユニットをストレプトアビジンHRP複合物の使用によって視覚化した。B；ウエスタンブロットからのバンドを定量化し、及びプロットした。
【００４１】
図５はストレプトアビジン被覆のマイクロタイタプレートにおけるKyβサブユニットの固定化を示す。Kyβサブユニットの可溶化物(元の濃度およそ3.5mg/mL)を連続的に希釈し、及びストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートのウェルに添加した。未結合タンパク質を除くための洗浄の後、Kyβサブユニットを、Cy3標識化抗His抗体の使用によって定量化した。結合抗体を、550nm及び570nmの励起及び放出フィルタをそれそれ備えるパッカード(Packard社)の融合マイクロタイタプレート読取機において蛍光定量的に定量化した。
【００４２】
図６はKvαサブユニットT1ドメインのKyβサブユニットマイクロタイタプレート配列体への結合を示す。希釈した粗αサブユニットT1ドメイン可溶化物を、Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体の各ウェルに添加した。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、未結合のKvαサブユニットT1ドメインを除去した。残っている結合KvαサブユニットT1ドメインを、FLAGタグ及び抗FLAG抗体の使用によって測定し、及びHRPの共役(conjugate)二次抗体及び比色分析基質の使用によって視覚化した。
【００４３】
図７はSPL2ペプチドについてのKvβサブユニット配列体への結合曲線を示す。ペプチドSPL2をKvβサブユニット配列体に結合させた。洗浄後、配列体に結合した残りの量を蛍光定量的に定量化した。データは結合曲線に適合した。青色三角；ラットKvβ１、黒色四角；ラットKvβ２、オープンのピンク色四角；ラットKvβ３、赤色星印；ヒトKvβ１、緑色円；ヒトKvβ２、オープンの青緑色円；ヒトKvβ３。
【００４４】
図８はKyβサブユニット配列体に対するペプチド結合のKvαサブユニットT1ドメインによる抑制を示す。およそのKdでSPL2ペプチドを、精製されたKvαサブユニットT1ドメインの存在下及び欠損下にKyβサブユニット配列体のウェルに添加した。洗浄後、結合したSPL2ペプチドを蛍光定量的に定量化した。
【００４５】
図９はマイクロアレイした(microarrayed)Kvβサブユニットの抗体検出を示す。すべてのKvβサブユニットを、Cy3標識化抗His抗体の使用によって検出することができた。
図10はマイクロアレイしたKyβサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを示す。KyβサブユニットのマイクロアレイをKvαサブユニットT1ドメイン可溶化物と共にインキュベートした。洗浄後、βサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを、抗FLAG抗体及びCy3標識化抗マウスIgGを用いて検出することができた。
【００４６】
例１
電位作動型カリウム(Kv)チャネルを、治療上の標的として、障害であって、CNS、心臓、肺及び膀胱のそれらを含む障害において認識する。したがって、それらは重要な治療上及び商業上の標的である。それらは、６種の貫膜橋架け(spanning)ドメインを持ち、及び細胞質調節性β-サブユニットの構築物に繋がる(coupled)α-サブユニットの四量体構築物からなる。
【００４７】
今日までに、分子クローニングは、Kvチャネルαサブユニットを暗号化する少なくとも23種の遺伝子産物を同定している。代わりのスプライシングから生じる更なる多様化はまた、多くのαサブユニットについて例証されている。４種の系列のチャネル-形成Kvサブユニット、Kv1〜4が、ショウジョウバエ(Drosophila)のカリウムチャネル、シェイカー(Shaker)、シャブ(Shab)、ショウ(Shaw)及びシャル(Shal)から、それぞれ導かれる。これらのチャネル種類のそれぞれは複数の(multiple)亜系列の一員を持つ。更なる４種の系列のKvチャネル、Kv5、Kv6、Kv8及びKv9が識別されており、それは単独で機能的なチャネルを形成しない。しかし、それらは、チャネル-形成サブユニットと組み合され、変化した生物物理学的特性を有する機能的チャネルを形成することができる。少なくとも２種のこれらの系列の補助的なαサブユニット(Kv6及びKv9)は、複数の亜系列の一員を持つ。
【００４８】
Kvチャネルαサブユニットのホモマの及びヘテロマの四量体化によって与えられる分子の多様性に加え、細胞質βサブユニットは、チャネル複合体に結合し、及びチャネルの動力学又は細胞の表面発現を修飾することができる。３種の系列、Kvβ１〜Kvβ３は、今までに識別されており、Kvβ１遺伝子から観察される３種のスプライス変異体を有する。β-サブユニット複合体はT1ドメインとして知られるα-サブユニットのN-末端の領域に結合し、及びサブユニットの存在は、機能的なイオンチャネルの細胞-表面の発現を増加させる。チャネルゲート開閉動力学の修飾におけるKvβ１サブユニットについての追加の役割もまた、確立されている。
【００４９】
Kvβサブユニット配列体
Kvβサブユニット配列体の構成体のための材料及び方法
His及びビオチン標識KyβサブユニットcDNAsのクローン化
ラット及びヒトのKvβ１、β２及びβ３サブユニットのコアドメインcDNAを、ポリ・ヒスチジン-標識及び大腸菌AccB遺伝子からのBCCPドメインのためのコード配列の下流の大腸菌発現ベクタにライゲートした。連結混合物を、化学的に形質転換受容性の(competent)XL10-Gold cells〔ゴールド細胞、Stratagene(ストラタジーン社)〕中に入れ、製造者の指示に従って形質転換させた。KyβサブユニットcDNA配列を、配列決定によって点検し、及び期待されたタンパク質に対応することが見出された-添付物参照。
【００５０】
大腸菌中でのKyβサブユニットの発現
Kyβサブユニットプラスミドを含むXL10-Gold細胞のコロニーを、20ml試験管中にアンピシリンを含有する5mLのLB培地中に接種し、及び37℃で振盪培養器中一昼夜増殖させた。2mLの一昼夜培養物を用い、500 mLのフラスコ中の200mLの他のLB/アンピシリンに接種し、及び〜1.0のOD600に達するまで37℃で増殖させた。次いで、IPTG及びビオチンをそれぞれ１mM及び50μMの終濃度まで添加し、及び誘導を23℃で４時間続けた。次いで、細胞を遠心分離によって収穫し、細胞のペレットをPBS×３中で洗浄し、及び一定分量中-80℃で貯えた。
【００５１】
Kyβサブユニット含有大腸菌の溶解
細胞ペレットを氷上で解かし、及び400μLの溶解緩衝液〔1%のTween(トゥイーン)20、1mg/mLのリゾチーム及び１μg/mLのDNAse Iを含有するPBS〕を添加し、及び細胞をピペッティングによって再懸濁させた。細胞細片を遠心分離、13000rpm10分間４℃によって収集する前に、溶解をロッカー上で室温の30分間のインキュベーションにより助けた。清澄な上清の可溶性タンパク質を除去し、及び直ちに用いた。
【００５２】
Kyβサブユニットの精製
Kyβサブユニットをヘキサヒスチジン標識の使用によって精製した。50mMのイミダゾールを含有するPBS中で希釈した清澄な溶解物を、Talon Cobalt(タロンコバルト)アフィニティ樹脂〔Clontech(クローンテック社)〕を含むカラムに添加した。カラムを10倍のカラム容量で洗浄し、及び300mMのイミダゾールを含有するPBSの２倍のカラム容量中でタンパク質を溶離した。
【００５３】
SDS PAGE
タンパク質試料を4〜20%のTris-グリシンのゲル〔NOVEX(ノベックス社)〕上への負荷及び200Vでの45分間の駆動に先立ち、SDS含有緩衝液中で煮沸した。次いで、ゲルをウエスタンブロット法用に用いるか、又はタンパク質をクーマシーブリリアントブルー染料で直接的に染色した。
【００５４】
ウエスタンブロット法
タンパク質をPVDF膜〔Hybond(ハイボンド)-P、Amersham(アマシャム社)〕上に移し、及び標準的な技術を用いて種々のエピトープの存在について探索した。ヒスチジン-標識の検出のために、膜を5% Marvel(マーベル)/PBST中でブロックし、及び抗-RGSHis抗体〔QIAGEN(キアゲン社)〕を一次抗体として1/1000希釈で用いた。ビオチン標識の検出のために、膜を、Superblock(スーパーブロック)/TBS(ピアス社)中でブロックし、及びSuperblock/TBS/0.1%Tween20中で1/2000希釈のストレプトアビジン/HRP複合物(Amersham)で探索した。RGSHis抗体のための二次抗体は、Marvel/PBST中1/2000希釈で用いた抗-マウスIgG(Fc特異的)HRP複合物〔Sigma(シグマ社)〕であった。大規模な洗浄の後、結合したHRP複合物を、ECLPlus(プラス)(Amersham)及びHyperfilm(ハイパーフィルム)ECL(Amersham)を用いてか、又はDAB染色(Pierce)によって検出した。
【００５５】
スペクトラ
精製したKyβサブユニットの紫外-可視スペクトル(250〜500nm)を、Thermo(サーモ)スペクトロニック走査分光光度計を用いて記録した。タンパク質を溶出緩衝液中で希釈し、及び溶出緩衝液の単独を用い、すべての試料から控除される基線を取った。
【００５６】
αサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
αサブユニットT1ドメイン(アミノ酸33〜135)のためのcDNAを、大腸菌発現ベクタ中のHis-標識及びFLAG-標識をコードする配列の下流でクローン化した。プラスミドを正しい配列についての配列決定によって点検し、及び大腸菌培養物の誘導は期待された寸法のHis及びFLAG標識の可溶性タンパク質の発現を示した。αサブユニットT1ドメインとKyβサブユニットとの間の相互作用を試験するために、10μLのαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物の存在下で、及び欠損下で、300mMのNaCl含有の500μLのリン酸緩衝食塩水、0.1%Tween20及び1%(w/v)ウシ血清アルブミンにおいて、結合反応を、10μLのKyβサブユニットの清澄な溶解物、10μLの抗-FLAGアガロースを含めて構築した。反応をロッカー上で室温１時間インキュベートし、及びFLAG結合複合体を5000rpmで２分間遠心分離することによって収穫した。PBST中での大規模な洗浄の後、FLAG結合複合体をSDS試料緩衝液中で変性させ、及びウエスタンブロッティングした。ビオチン化Kyβサブユニットの存在をストレプトアビジン/HRP複合物によって検出した。
【００５７】
Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体の製造
96個のウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートに、100μLの最適化した濃度のKyβサブユニット清澄溶解物(典型的にPBS-Tween中で16中の１の希釈)を各ウェルに添加した。各ウェルを３回300μLのPBS-Tweenで洗浄する前に、プレートを室温で振とうさせながら45分間インキュベートした。しかる後、プレートをアッセイにおいて用いるか、又は-20℃でPBS-Tween中50%(v/v)のグリセリン存在下に貯蔵した。
【００５８】
Kyβサブユニット配列体のペプチド結合アッセイ
αサブユニットドメインの部分に基づくKyβサブユニット相互作用ペプチド(SPL2)を設計し、合成し、及びフルオレセイン標識化した。0.1%w/vBSAを含有するPBS-Tween中で適切に希釈したSPL2ペプチドを100μL/ウェルでKyβサブユニット被覆マイクロタイタプレートに添加した。未結合ペプチドを３回300μLのPBS-Tweenでの洗浄によって除去する前に、ペプチドを、１時間室温で振とうさせながら、インキュベートした。各ウェル中のフルオレセイン標識化SPL2ペプチド濃度を評価する前に、100μLの６MグアニジンHC1を各ウェルに添加した。96ウェルのマイクロタイタプレートの各ウェルの蛍光を、485nm及び520nmの励起及び放出フィルタをそれそれ備えるPackardの融合マイクロタイタプレート読取機において読取った。
【００５９】
Kyβサブユニット配列体KvαサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
KvαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物を0.1%w/vBSA含有PBS-Tween中で10中の１で希釈し、100μL/ウェルでKyβサブユニット被覆マイクロタイタプレートに添加した。未結合のαサブユニットT1ドメインを３回の300μLのPBS-Tweenでの洗浄によって除去する前に、ペプチドを１時間室温で振とうさせながらインキュベートした。結合αサブユニットT1ドメインを、適切に希釈したマウス抗FLAG抗体及び標準的なELISA法を用いる抗マウスIgG二次抗体HRP複合物の使用によって評価した。HRPを比色分析のHRP基質2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)の添加によって検出し、及びマイクロタイタプレートを、405nmの吸光度フィルタを備えるPackardの融合マイクロタイタプレート読取機において読取った。
【００６０】
Kyβサブユニットマイクロ配列体の製造
Kyβサブユニットの清澄な溶解物を384個のウェルプレート中に負荷し、及び４種のピンのマイクロアレイイングヘッドを備えるQarray(キアレイ)のマイクロアレイイングロボット〔Genetix(ゲネティックス社)、英国〕を用いてデキストラン被膜〔Xantec(キサンテック)〕上に固定化されたニュートラビジン(neutravidin)を有するガラスの顕微鏡用スライド上に印刷した。各溶解物を各配列体上に16回スポットした。印刷後、PBS-Tween中での洗浄の前に、配列体を４℃の湿気のあるチャンバ中で１時間インキュベートした。洗浄後、配列体をアッセイのために用意した。
【００６１】
マイクロアレイKyβサブユニットの抗体検出
Cy3標識化抗His抗体をPBS-Tween+0.1%(w/v)BSA中で１μg/mLに希釈し、及びおよそ500μLをスライド上にピペットで取った。スライドをPBS-Tweenの大容量中での２回×２分の洗浄の前に、室温で極わずかに振とうさせながら１時間インキュベートした。スライドを、Cy3フルオロフォア検出のために適切な励起レーザ及び放出フィルタを備えるマイクロアレイ走査装置〔Affymetrix(アフィメトリクス)428アレイスキャナ〕において走査する前に、スライドを簡潔に2000gで遠心分離し、液体を除いた。
【００６２】
マイクロアレイしたKyβサブユニットへのKvαサブユニットT1ドメインの結合
KvαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物を1%w/vBSA含有PBS-Tween中で50中の１で希釈し、及びおよそ500μLをスライド上にピペットで取った。スライドをPBS-Tweenの大容量中での２回×２分の洗浄の前に、室温で極わずかに振とうさせながら１時間インキュベートした。次いで、適切に希釈した抗FLAG抗体を配列体上にピペットで取り、及びインキュベートし、及びCy3標識化抗マウスIgGの添加前に、上述のようにインキュベートし、及び洗浄した。スライドをインキュベートし、及び簡潔な2000gでの遠心分離の前に上述のように洗浄し、Cy3フルオロフォア検出のために適切な励起レーザ及び放出フィルタを備えるマイクロアレイ走査装置(Affymetrix428アレイスキャナ)において走査する前に、液体を除いた。
【００６３】
結果
大腸菌中でのKyβサブユニットの発現
Kyβサブユニットのコアドメインを、大腸菌遺伝子ACCBからのBCCPドメインが既にクローン化されているベクタpQE80中のtacプロモータの下流でクローン化した。次いで、得られるタンパク質を、そのN-端でHis及びビオチン標識する。図１は誘導された大腸菌培養物からの全体の及び可溶性タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。すべてのβサブユニットについて、およそ50kDaの分子量を有するHis-標識された及びビオチン化されたタンパク質についての明確なバンドがある。同じ寸法のバンドは、用いたすべてのβサブユニットと交差反応するヒトのKvβ２〔Biosource(バイオソース)〕に対して生じる多クローン抗体によって検出される(データを示していない)。
【００６４】
His及びビオチン標識がこの配列体で用いられたが、他の親和性標識(例えば、FLAG、myc、 VSV)を用い、クローン化タンパク質の精製、検出及び固定化を可能にすることができる。また、必要があれば、大腸菌以外の発現宿主も用いることができる(例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞)。
【００６５】
Kyβサブユニットの精製
親和性標識の使用により配列化する前に、タンパク質を精製することができる。本明細書では、Talon樹脂上でのタンパク質の精製によってhis標識を用いた。図２はこの方法で精製したKvβサブユニットが、Kvβサブユニット、又はタンパク分解産物に対応するSDS-PAGE上のバンドのみを示すことを示す。
【００６６】
紫外-可視吸光度スペクトラ
紫外-可視スペクトルをすべてのヒト及びラットのKvβサブユニットについて得た。図３は、ヒト及びラットの双方のKvβ２サブユニットが360nmでのそれらの吸光度ピークによって立証されるようにNAD(P)Hの補助因子を含んでいることを示す。
【００６７】
αサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
発現したKvβサブユニットが自然な機能を保持していることを確認するため、アッセイを考案し、ここではKvβサブユニットがαサブユニットT1ドメイン被覆ビーズに結合することによって沈降する。抗FLAGビーズに対し、FLAG標識KvαサブユニットT1ドメイン溶解物を添加した。次いで、これらを、Kvβサブユニットを含有する溶解物と混合した。図４は、Kvβサブユニットの抗FLAGビーズに対する非特異的結合が高いが、KvαサブユニットT1ドメインの存在下の結合が増加することを示す。また、ラットKvβ３サブユニットが、KvαサブユニットT1ドメイン被覆ビーズに、任意の他のKvβサブユニットよりも多い量で結合していることが分かる。
【００６８】
Kyβサブユニットマイクロタイタプレート配列体の製造
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートがKvβサブユニットで被覆され得ることを確認するために、溶解物を連続的に希釈し、及びプレートのウェルに添加した。図５は、ウェル当りの特異的に固定化されたタンパク質の同様のレベルを達成することができることを示す。
【００６９】
Kyβサブユニット配列体αサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
図６はKvαサブユニットT1ドメインのすべてのKyβサブユニットへの特異的結合を示す。また、ラットのKvβ３サブユニットがより一層多くのKvαサブユニットT1ドメインを明らかに結合しており、共沈アッセイの結果を映していることは注目され得る。
【００７０】
Kyβサブユニット配列体ペプチド結合アッセイ
SPL2ペプチドを、Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体に、100から1600μMまでの濃度の範囲で添加した。１時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、未結合のペプチドを除去した。残っているペプチドを蛍光定量的に定量化した。結果(図７に示す)は、それぞれのKyβサブユニットについてのKd及びBmaxの評価を可能にするデータへの適合を提供する(表１)。
【００７１】
【表１】
表１．それぞれのKyβサブユニットについてのKd及びBmaxの評価。図７中のデータを、曲線適合(curve-fitting)ソフトウェアを用いて結合曲線に適合させた。
【００７２】
Kyβサブユニットに対するペプチド結合のKvαサブユニットT1ドメインによる抑制
SPL2ペプチドのKyβサブユニット配列体への結合を、KvαサブユニットT1ドメインの存在下に抑制した。図８では、ラットKyβ１及び２サブユニットについて、ペプチド結合が減少することが見られる。
【００７３】
マイクロアレイKyβサブユニットの抗体検出
マイクロアレイしたKyβサブユニットは、ストレプトアビジンを被覆したガラスの顕微鏡用スライド上に特異的に固体化されることが示される。図９では、スポットされる溶液中の遊離のビオチンの包含がKvβ３の固体化を完全に抑制することが見られる。すべてのKvβサブユニットが配列体上に存在し、また、固定化BCCP標識が配列体上に存在する。
【００７４】
マイクロアレイKyβサブユニットへのKvαサブユニットT1ドメイン結合
配列体上に固定化されたKvβサブユニットは、まだKvαサブユニットT1ドメインに結合することができる。図10では、KvαサブユニットT1ドメインが固定化したKvβサブユニットへの結合の後に検出することができる。また、図10から、固定化した親和性標識がKvαサブユニットT1ドメインのわずかな結合しか持たないことも見られる。
【００７５】
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【００７６】
添付物１
タンパク質配列ヒトKvβ１サブユニットコアドメイン(残基87-419)：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQISDEVAERLMTIAYESG
VNLFDTAEVYAAGKAEVILGSIIKKKGWRRSSLVITTKLYWGGKAETE
RGLSRKHIIEGLKGSLQRLQLEYVDVVFANRPDSNTPMEEIVRAMTHVI
NQGMAMYWGTSRWSAMEIMEAYSVARQFNMIPPVCEQAEYHLFQRE
KVEVQLPELYHKIGVGAMTWSPLACGIISGKYGNGVPESSRASLKCYQ
WLKERIVSEEGRKQQNKLKDLSPIAERLGCTLPQLAVAWCLRNEGVSS
VLLGSSTPEQLIENLGAIQVLPKMTSHVVNEIDNILRNKPYSKKDYRS
【００７７】
タンパク質配列ヒトKvβ２サブユニットコアドメイン(残基36-364)：
GLQFYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQITDEMAEQLMTLAYDNGI
NLFDTAEVYAAGKAEVVLGNIIKKKGWRRSSLVITTKIFWGGKAETER
GLSRKHIIEGLKASLERLQLEYVDWFANRPDPNTPMEETVRAMTHVIN
QGMAMYWGTSRWSSMEIMEAYSVARQFNLTPPICEQAEYHMFQREK
VEVQLPELFHKIGVGAMTWSPLACGIVSGKYDSGIPPYSRASLKGYQW
LKDKILSEEGRRQQAKLKELQAIAERLGCTLPQLAIAWCLRNEGVSSVL
LGASNADQLMENIGAIQVLPKLSSSIIHEIDSILGNKPYSKKDYRS
【００７８】
タンパク質配列ヒトKvβ３サブユニットコアドメイン(残基75-404)：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGSQISDETAEDVLTVAYEHG
VNLFDTAEVYAAGKAERTLGNILKSKGWRRSSYVITTKIFWGGQAETE
RGLSRKHIIEGLRGSLERLQLGYVDIVFANRSDPNCPMEEIVRAMTYVI
NQGLALYWGTSRWGAAEIMEAYSMARQFNLIPPVCEQAEHHLFQREK
VEMQLPELYHKIGVGSVTWYPLACGLITSKYDGRVPDTCRASIKGYQW
LKDKVQSEDGKKQQAKVMDLLPVAHQLGCTVAQLAIAWCLRSEGVSS
VLLGVSSAEQLIEHLGALQVLSQLTPQTVMEIDGLLGNKPHSKK
【００７９】
タンパク質配列ラットKvβ１サブユニットコアドメイン：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQISDEVAERLMTIAYESG
VNLFDTAEVYAAGKAEVILGSIIKKKGWRRSSLVITTKLYWGGKAETE
RGLSRKHIIEGLKGSLQRLQLEYVDVVFANRPDSNTPMEEIVRAMTHVI
NQGMAMYWGTSRWSAMEIMEAYSVARQFNMIPPVCEQAEYHLFQRE
KVEVQLPELYHKIGVGAMTWSPLACGIISGKYGNGVPESSRASLKCYQ
WLKERIVSEEGRKQQNKLKDLSPIAERLGCTLPQLAVAWCLRNEGVSS
VLLGSSTPEQLIENLGAIQVLPKMTSHWNEIDNILRNKPYSKKDYRS
【００８０】
タンパク質配列ラットKvβ２サブユニットコアドメイン：
GLQFYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQITDEMAEHLMTLAYDNGI
NLFDTAEVYAAGKAEVVLGNIIKKKGWRRSSLVITTKIFWGGKAETER
GLSRKHIIEGLKASLERLQLEYVDVVFANRPDPNTPMEETVRAMTHVIN
QGMAMYWGTSRWSSMEIMEAYSVARQFNLIPPICEQAEYHMFQREKV
EVQLPELFHKIGVGAMTWSPLACGIVSGKYDSGIPPYSRASLKGYQWL
KDKILSEEGRRQQAKLKELQAIAERLGCTLPQLAIAWCLRNEGVSSVLL
GASNAEQLMENIGAIQVLPKLSSSIVHEIDSILGNKPYSKKDYRS
【００８１】
タンパク質配列ラットKvβ３サブユニットコアドメイン(残基75-404)：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGSQISDETAEDLLTVAYEHG
VNLFDTAEVYAAGKAERTLGNILKSKGWRRSSYVITTKIFWGGQAETE
RGLSRKHIIEGLQGSLDRLQLEYVDIVFANRSDPSSPMEEIVRAMTYVIN
QGLALYWGTSRWSAAEIMEAYSMARQFNLIPPVCEQAENHFFQREKV
EMQLPELYHKIGVGSVTWSPLACSLITSKYDGQVPDACKATVKGYQW
LKEKVQSEDGKKQQARVTDLLPIAHQLGCTVAQLAIAWCLRSEGVSSV
LLGVSSAEQLMEHLGSLQVLGQLTPQTVMEIDALLGNKSHSKK
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】(A)及び(B)はβサブユニットの粗可溶化物のウエスタンブロットを示す図である。
【図２】精製したKvβサブユニットのSDS PAGEを示す図である。
【図３】精製したヒト及びラットKvβサブユニットの紫外-可視光吸収スペクトルを示す図である。
【図４】(A)及び(B)はKvβサブユニットの共沈アッセイを示す図である。
【図５】ストレプトアビジン被覆のマイクロタイタプレートにおけるKyβサブユニットの固定化を示す図である。
【図６】KvαサブユニットT1ドメインのKyβサブユニットマイクロタイタプレート配列体への結合を示す図である。
【図７】SPL2ペプチドについてのKvβサブユニット配列体への結合曲線を示す図である。
【図８】Kyβサブユニット配列体に対するペプチド結合のKvαサブユニットT1ドメインによる抑制を示す図である。
【図９】マイクロアレイKvβサブユニットの抗体検出を示す図である。
【図１０】マイクロアレイKyβサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列体及び方法、一定のタンパク質の配列体及びスクリーニング方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の細胞性情報伝達及び恒常性プロセスは、イオンチャネル、受容体及び輸送体のような貫膜タンパク質によって媒介される。これらのタンパク質クラスのすべては、細胞質のドメインを包含するタンパク質-タンパク質相互作用を介し、情報伝達性、調節性、足場材料性、及びアダプタ性のタンパク質と相互接続する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
イオンチャネル、G-タンパク質-共役(coupled)受容体のような膜結合受容体及び多くの細胞表面の輸送体は、タンパク質サブユニット複合体で構成され、膜の細胞質表面上のサブユニット〔本明細書において付属(accessory、アクセサリ)タンパク質と称する。〕のホモマの又はヘテロマの構築物からなる。これらのタンパク質の群が組合せの様式において複合体を形成する能力は、必要な生物物理学的特性又は修飾因子感受性を有する貫膜タンパク質複合体の組織特異的発現のための機構を提供する。ますます、サブユニット相互作用の決定要因は、これらのサブユニットの構造内の定義されたドメインに位置されている。これらのドメインの相互作用を理解することは、自然の系における膜タンパク質構築物の解明を助け、及び細胞内のタンパク質機能のために重要な修飾性タンパク質を識別する。さらに、これらの研究分野内で気付かれた知識は、貫膜タンパク質の付属の細胞質サブユニット及び膜結合部分の間の相互作用を混乱させることが、それが一旦識別されたら、高度の組織選択的で、従って、膜結合分子の活性を調節する特定の方法を表す場合があることを認める。したがって、付属タンパク質相互作用の外因性抑制剤、及びそれゆえ、サブユニット又は修飾性タンパク質構築物は、新しい、組織−特異的な治療上の標的を提供することができる。
【０００４】
電位作動型の(Voltage gated)カリウム(Kv)チャネル及びカルシウム(Ca2+)チャネルは、多くの障害であって、CNS、心臓、肺及び膀胱のそれらを含む障害において重要な治療上の標的として認められる。双方のチャネルの種類は、主たる孔形成(pore-forming)、電位−感知(voltage-sensing)α-サブユニットを持つ。Kvチャネルは、４種の同様のα-サブユニットで、それぞれが６種の貫膜セグメントを含んでいる構築物を必要とするが、カルシウムチャネルは、24種の貫膜セグメントを有する単一のα-サブユニットを持ち、６種の貫膜セグメントの４種の‘仮性サブユニット(pseudosubunits)’中に詰められる[1]。双方のKv及びCa2+チャネルは、構造的に類似の細胞質のβ-サブユニットと、α-サブユニット内の詳細に明らかにされた(well-defined)ドメインを介して共に組み立てられる(co-assemble)。これらは、種々の範囲に対し、チャネルのゲート開閉(gating)に影響を与えることができ、及び膜タンパク質の確実な分子シャペロンとの相互作用と似ているか、又は擬態され得る機構により、α-サブユニットの表面発現の効率を劇的に変えることができる[2]。今日まで、２種のチャンネルの種類のそれぞれについて識別される６種のβ-サブユニットがあった。Ca2+チャネルβ-サブユニットの６種のα-サブユニットと組み立てられる能力が決定されているが[3]、Kvチャネルβ-サブユニットと20種類又はそれくらいのα-サブユニットとの相互作用はほとんどあまり確立されておらず、及びまだ、目下の用いることができる分析方法が比較的雑であるために、β-及びα-サブユニットの組合せが本当に生物学的に関係があるかは詳細には知られていない(以下参照)。
【０００５】
受容体、特に、G-タンパク質共役受容体は、細胞表面タンパク質の極めて重要な群として認められており、及びそれらは多くの系において多種多様な機能を遂行する[4]。これらの7〜12種の貫膜タンパク質は、３種の系列(families)、Ａ、Ｂ及びＣに分類され、それらの中には、多くのサブタイプがある。各GPCRは、少なくとも１種のG-タンパク質と、その細胞質表面で相互作用するが、これらの相互作用の性質及び正体はあまり理解されておらず、及び目下、生物情報学から予測するのは困難である。また、G-タンパク質、並びにGPCR’ｓとの複合化も、また、K+及びCa2+チャネルサブユニットと顕著な結果を伴う特定の様式で相互作用する[5]。
【０００６】
嵩高い(bulky)分子の侵入を可能にする細胞表面でのタンパク質は、第３のクラスの膜タンパク質、輸送体で、機能するための多数の細胞質性(cytosolic)タンパク質サブユニットと複合化するものを表すが、本明細書で、再度、これらの相互作用の厳密な性質及び正体は、目下の分析方法論における制限のために、現在においてあまり特徴付けられていない。
【０００７】
新しい方法論は、種々の推定上のサブユニットの相手間のタンパク質サブユニットの結合相互作用の平衡状態及び動力学的結合パラメータの決定を含む、高度に平行なインビトロでの特徴付けを可能にし、この分野で、特に、それらがまた、治療上の可能性のある化合物がかかる相互作用を修飾する能力の評価を可能にさせる場合には、大いに有用である。これらの相互作用を調査するための目下の方法は、電気生理学的な分析のような、厄介な細胞に基づく技術、又はプル-ダウン/免疫沈降アッセイのような、低い処理量のインビトロ結合系に依存する。対照的に、本発明は、配列体(array)に基づく方法を記述し、これによって、イオンチャネル、細胞表面受容体及び輸送体のような膜-結合タンパク質の、可溶性の、機能的なドメインが、固定化した細胞質の付属タンパク質の配列体にインビトロで結合することを詳細に特徴付けることができる。本発明は、タンパク質-タンパク質相互作用の結合親和性及び特異性が決定されるのを可能にし、及びまた、相互作用の抑制剤/競合物(competitors)の作用が高度な並行系において探求されるのを可能にする。
【０００８】
酵母の２重雑種系を用いて、例えば、イオンチャネルタンパク質ドメインの間の相互作用が検出されている。この手法は、結合ドメインの識別において及び相互作用上のアミノ酸置換の効果の決定において適度に好首尾である。しかし、この方法は、結合親和性についての量的な情報を提供することができず、及び外因性物質が相互作用を修飾する潜在性に接近することができない。代わりに、細胞を基とする系、例えば、アフリカツメガエル(Xenopus)の卵母細胞又は哺乳類の細胞系におけるサブユニット発現に従う細胞全体の電気生理学が、イオンチャネル構築物を調査するのに用いられている。この手法は、技術的に困難で、固有に時間のかかるもので、及び下流の効果(downstream effect)の測定、すなわち、細胞全体の電流のために、実際の結合事象についての限られた情報を提供する。
【０００９】
生化学的な方法を用い、自然の及び組換え系におけるイオンチャネル構築物の個々の成分が分離されている。チャネルサブユニットの免疫共沈降実験及び親和性の精製を用い、イオンチャネルの複合体の成分が識別されている。しかし、どちらの方法も、結合親和性についての詳細な情報を提供しないか、又はサブユニットの相互作用の可能性のある修飾因子をスクリーニングするのに適していない。Ca2+チャネルの場合には、１種の特定のα-サブユニットの断片が、GSTへの融合としてアガロースビーズ上に固定され、及びインビトロで翻訳されたβ-サブユニットの結合を用い、相互作用中に包含されるα-サブユニットの特定領域がより一層に密接に定義された[6]。結合親和性上の詳細な情報は、この調査において入手できず、及びアルファサブユニットがこの調査で正しく折り畳まれたことは明確でない。
【００１０】
タンパク質の上敷の結合(protein overlay binding)は、可溶性のペプチド/タンパク質と膜支持体上に固定化された標的タンパク質と間の結合の相互作用を直接的に検査する[7]。この手順の間に、タンパク質は、最初に解離し、及びSDS-PAGEによって分けられ、及びウエスタンブロット法に関してニトロセルロースフィルタに移る。しかし、この方法における暗黙の変性工程は、この技術でアッセイされたタンパク質が機能的で(すなわち、折り畳まれ)、及び従って、生物学的に活性ではあり得ないことを示唆する。試みに、可溶性の、標識化された(labelled)タンパク質の結合を研究する前に、タンパク質を再生させることができるが、しかし、そこでは成功率は低い。
【００１１】
膜タンパク質と付属タンパク質との間の自然な相互作用の同定は、及び結合ドメインが包含され、種々の細胞を基とする方法を用いて研究されている。例えば、複合体内のα及びβKvチャネルのサブタイプの自然な組合せが、抗体又はサブタイプ-特異毒素での同時精製を用いて探索されている[9,10]。酵母の２重雑種実験が広範に用いられ、タンパク質-タンパク質相互作用ドメインが識別され、及び例えば、これが用いられ、細胞質のβサブユニットと相互作用するKvチャネルのN-末端T1ドメインの領域が識別されている[11]。タンパク質がモデル細胞において相互作用する能力が、組換え発現技術を用いて研究されている。例には、電気生理学を用いる電位作動型のイオンチャネルの同時発現及び機能的特徴付け[3,11,12]、及びキメラの及び変異体のGPCRsの発現[13,14における検討]が含まれる。かかる実験から導かれる気付かれた知識は、α及びβサブユニットがその後解離しないER中で安定な複合体を形成することである。
【００１２】
膜タンパク質のドメインと他のサブユニット又は細胞質の相手との間の結合相互作用、それに続く別個の発現は、１種ずつに基づくプル-ダウン式のアッセイを用いて調査されている。K+チャネルの貫膜サブユニットの四量体化ドメインは、このような方法で検査されている[15]。Ca2+チャネルの細胞内ドメインで、βサブユニット[6]又はSNARE(スネア)タンパク質[16]に結合するもの、アレスチンに結合する5-HT2A GPCR[17]及びアダプタタンパク質AP-2に結合するCFTRの輸送体[18]は、ビーズ上の膜タンパク質ドメインを固定化することによって検査されている。代わりに、細胞質のホーマータンパク質がビーズ上で固定化され、細胞可溶化物中に発現する代謝調節型のグルタミン酸塩受容体との相互作用が示されている[19]。架橋結合の実験がマイクロタイタプレート中のCFTR及びAP-2の間で遂行されている[18]が、この場合のタンパク質は固定化されなかった。タンパク質の上敷の実験は、多数の結合の相互作用が同時に識別されるようにする。この技術を用い、標識化されたショウジョウバエINADが固定化されたTRP Ca2+チャネルに結合することが示された[20]。この技術は、多数のタンパク質が、SDS-PAGEのゲルの異なるレーン中に分画されるようにし、及び次いでニトロセルロースフィルタ上に固体化され、結合について探索されるのを可能にする。
【００１３】
上述の技術の性質は、タンパク質の分析には、通常、可能性のある相互作用する相手の同時発現が包含されるか、又は結合アッセイに先立って、１種又はそれより多い種類の可能性のある相手の変性が包含されるかのいずれかであることを意味する。常に、それらは低い処理量であり、結合の特異性又は親和性上の詳細な情報をもたらさず、小さい分子の抑制剤の調査に一般的に適合しない。かかる問題を克服するために、本発明者は、別個の、及び重要なことには、機能的な、付属タンパク質の配列体を案出し、それらのタンパク質は膜タンパク質の成分と最初に同時発現されなかった。かかる配列体は、初めて、高度に平行な様式において相互作用の量的な決定を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このように、第１の局面において、本発明は、配列体であって、表面を含み、それに付着する少なくとも１種の細胞質性付属タンパク質を持ち、通常複合化されるその膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まない配列体を提供する。好ましくは、細胞質性付属タンパク質は相同的な膜タンパク質の系列の一員(members)である膜タンパク質の細胞質性付属タンパク質である。１具体例において、相同的な膜タンパク質の系列は、イオン-チャネル、Ｇタンパク質共役受容体及び貫膜輸送体タンパク質からなる群より選ばれる。
【００１５】
配列体上の付属タンパク質は、相同的な付属タンパク質の系列の一員、例えば、イオン-チャネルサブユニット(例えば、β-サブユニット)、受容体相互作用(receptor interacting)タンパク質(例えば、Ｇタンパク質、アレスチン及びＧタンパク質受容体キナーゼ)又は輸送体のための付属タンパク質(例えば、輸送体タンパク質相互作用タンパク質)であることができる。特に、想定されるものは、付属タンパク質が、K+-チャネルβ-サブユニット、Ca2+-チャネルβ-サブユニット、Ｇタンパク質サブタイプ、例えば、Ｇα、Ｇβ/γ又は輸送体のための付属タンパク質である配列体である。例には、Kvβ-サブユニットチャネル、例えば、β1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、3.1、3.2、４、カルシウムチャネルβ-サブユニット、例えば、β1a、β1b、β1c、β2a、β2b、β2c、β3a、β3b、β4、Ｇタンパク質系列、例えば、Gs系列(αs及びα01f)、Gt系列、Gi系列(α0、αi1〜αi13、αz)、Gi-0系列、Gq-11系列(αｑ、α11、α14、α15、α16、α12、α13)及びGα-sensory(Gα-感覚)系列〔αt-rod(αt-ロッド)、αgust(αガスト)〕及びβγ系列(γt、γ1、γ2、γ3等)、又は輸送体タンパク質に対する付属タンパク質が包含される。
【００１６】
本発明の配列体に付着するタンパク質の数は、少なくとも一定の範囲に対して、自然に発生するか、又は十分に、実験的、商業的又は臨床的に興味のあるタンパク質の数によって決定される。１種又は２種のタンパク質を運ぶ配列体は、研究者のために用いられる。しかし、実際には、及び高い処理量のアッセイにとってのかかる配列体の適合性をうまく利用するために、1〜10000、1〜1000、1〜500、1〜400、1〜300、1〜200、1〜100、1〜75、1〜50、1〜25、1〜10又は1〜5種のかかるタンパク質が、配列体上に存在すると予想される。
【００１７】
第２の局面において、本発明は、細胞質性付属タンパク質が、所定の膜タンパク質と相互作用するか又はその反対であるかを定める方法を提供し、前記方法は次の工程：
(i)候補の細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性付属タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
(ii)配列体を、前記膜タンパク質の細胞質性断片及び／又は他の関連する膜タンパク質系列の一員の細胞質性断片と接触させる工程；及び
(iii)相互作用する相手を検出し、及び同定する工程
を含む。
【００１８】
第３の局面において、本発明は、細胞質性付属タンパク質と選択的に相互作用する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は次の工程：
(i)細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
(ii)配列体を化合物又はペプチド又はタンパク質と接触させる工程；及び
(iii)相互作用する相手を同定する工程
を含む。
【００１９】
この方法は、随意に、相互作用する相手の相互作用を定量化する追加の工程(iv)を含む。
【００２０】
また、細胞質性付属タンパク質及び膜タンパク質の間の相互作用を選択的に修飾する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法をも提供し、前記方法は次の工程：
(i)細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
(ii)配列体を、化合物又はペプチド又はタンパク質と、及び対象の１種又はそれより多い種類の膜タンパク質又はその細胞質性断片と、同時にか、又は順にかのいずれかで接触させる工程；及び
(iii)前記相互作用が前記化合物又はペプチド又はタンパク質の存在によって修飾されるかどうかを定める工程
を含む。
【００２１】
この方法は、随意に、相互作用の調節の程度を定量化する追加の工程(iv)を含む。
【００２２】
本発明は、また、付属タンパク質の系列の異なる一員の相対的触媒活性を測定するために、本発明の細胞質性付属タンパク質の配列体の使用を提供する。
【００２３】
本発明は、また、表現型-遺伝子型-結合抗体(例えば、ファージ提示抗体)のライブラリから抗体を選ぶために、本発明の細胞質性付属タンパク質の配列体を、その上の親和性表面として用いる使用を提供する。
【００２４】
本発明は、また、付属タンパク質と膜タンパク質との相互作用上に、及び／又は前記膜タンパク質又は付属タンパク質の特性上に及ぼす翻訳後修飾の効果を定めるための、本発明の細胞質性付属タンパク質の配列体の使用を提供する。
【００２５】
本発明にかかるサブユニットの配列体は、空間的に画成された形式において、機能的な様式で、各々が発現し及び固定化される標識(tagged)タンパク質構成物を含むことができる。標識タンパク質構成物は、電位-作動型K+又はCa2+イオン-チャネルの細胞質の補助的なβ-サブユニット、Gタンパク質、又は嵩高い(bulk)輸送体と相互作用する球状付属タンパク質のような付属タンパク質サブユニットの群から引き出すことができる。標識化プローブの結合は、これは、別のチャネルサブユニット、関連タンパク質、相互作用のドメイン、ペプチド又は他の潜在的なリガンドであることができ、高い処理量の様式において技術的に簡単なプロトコルを用いて研究され得る。複雑な混合物又は組換え系又は細胞可溶化物からの標識化されたか又は標識化されていないタンパク質の結合も検査される場合がある。同じサブユニットの配列体は、数多くの潜在的な結合相手を選別し、及び詳細な結合情報を得るのに適している。代わりに、異なるタンパク質の配列体は、異なるサブタイプ及び種のサブユニットを表し、リガンド結合の特異性の検査に最も適する。
【００２６】
かかる配列体は、受容体、これは、多(multi)-サブユニット複合体として存在し、チャネル-形成サブユニット、修飾性タンパク質及びチャネルの細胞内位置に関与するタンパク質からなり、それのリガンド-作動型イオンチャネルのクラスを包含する、イオンチャネルを調査するために用いることができる。チャネルサブユニット間の相互作用は規定されたドメインによって媒介される場合がある。電位作動型K+及びCa2+チャネルは、α-サブユニット内の詳細に明らかにされたドメインを介する構造的に似た細胞質β-サブユニットと共に組み立てられる[7、21、22]。これらは、種々の範囲に対し、チャネルのゲート開閉に影響を与えることができ、及び膜タンパク質の確実な分子シャペロンとの相互作用と似ているか、又は擬態され得る機構により、α-サブユニットの表面発現の効率を劇的に変えることができる[2]。
【００２７】
本発明の配列体の別の適用は、受容体、例えば、G-タンパク質-共役受容体(GPCRs)の調査におけるものである。これらは、ヒトゲノムにおいて識別される1000種を超えるヘプタ螺旋の(heptahelical)タンパク質との、信号伝送に関与する細胞表面分子の最も大きな系列を構成する。GPCRsは三量体のG-タンパク質のサブセットを活性化することによって細胞外シグナルを変換する。結合部位は、ロドプシン及び網膜のG-タンパク質トランスデューシンのような、特異的なGPCR-G-タンパク質の相手のために決定することができる[23]。しかし、GPCRsの結合決定要因は、別個のドメインを形成せず、及び受容体が結合するG-タンパク質のサブセットを予測するのは困難である[24]。目下の研究下の数多くの希少な(orphan)GPCRsとのかかる相互作用を定めるための配列体に基づく方法は、高度に有利である。GPCRsの効果は、例えば、G-タンパク質-共役受容体キナーゼ(GRKs)及びアレスチンの相互作用及び結合によって修飾され、受容体の脱感作及び内部移行(internalisation)をもたらす[25]。アレスチンとの相互作用が、免疫共沈降によって検出されるのに十分に頑強であること[17]、及び合成ペプチドにより抑制され得ること[26]が例証されている。そのようなものとして、それは、インビトロ結合法を用いる研究のための潜在的な標的である。
【００２８】
本発明の配列体の更なる適用は、貫膜輸送体タンパク質の調査におけるものである。これらのタンパク質は、栄養素の選択的な取り込み及び代謝産物の搬出を制御し、細胞の外部と内部との間のイオン及び溶質のバランスを調節し、及びシナプス間隙からの神経伝達物質の除去によってシナプス伝送を修飾する。これらのタンパク質のための主要な調節性機構には、細胞膜への及び細胞膜からの転位(translocation)が包含される。しかし、細胞膜に位置する輸送体とのタンパク質-タンパク質相互作用による調節もまた起こることが証拠によって明らかにされている。例えば、膜結合大腸菌(E. coli)輸送体酵素IICBGlcと全体的な(global)リプレッサーMlcとの間のリン酸化-依存性のインビトロ結合は、転写制御の機構を示した[27]。貫膜調節性タンパク質、ストマチン(stomatin)へのグルコース輸送体GLUT-1のC-末端ドメインの結合はまた、アフィニティ・カラムクロマトグラフィによって例証された[28]。
【００２９】
本明細書に定義するような用語“配列体”は、表面上のパターン中に１種又はそれよりも多い種類のタンパク質部分の空間的に規定された配列を参照する。好ましくは、タンパク質部分を、表面に、直接的にか、又は間接的に付着させる。付着は非特異的であることができる(例えば、表面上への物理的な吸着によるか、又は非特異的な共有結合性相互作用の形成による)。好適例では、タンパク質部分は、例えば、国際公開第01/57198号で記述されているように、各タンパク質に連結する共通のマーカ部分によって表面に付着する。
【００３０】
このようにして、例えば、パターン中の各位置には、次の：
a) 単一タンパク質種類の試料(単量体、二量体、三量体、四量体又はより一層大きな多量体)；
b) 相互作用分子に結合した単一タンパク質種類の試料(例えば、DNA、抗体、他のタンパク質)；
c) 合成分子に結合した単一タンパク質種類の試料(例えば、ペプチド、化学的化合物)；又は
d) 所定の付属タンパク質系列からの２種又はそれよりも多い種類のヘテロマの混合物
の１種又はそれよりも多い種類のコピーを含むことができる。
【００３１】
配列体を支持する表面は、例として、化学的処置によって被覆するか/誘導体化することができる。適切な表面の例には、スライドガラス、ポリプロピレン又はポリスチレン、シリカ、金又は金属支持体、又は例えば、ニトロセルロース、PVDF、ナイロン又はホスホセルロースから作製された膜が包含される。配列体の形式はマイクロウェルプレート又はマイクロアレイのものであることができる。
【００３２】
本発明に従うタンパク質の配列体の形式の使用には、多くの利点がある。例えば、補助的なサブユニット、関連タンパク質及びチャネルサブユニットドメインのような、膜タンパク質構築物の成分の配列体は、溶液層中の結合相手との相互作用が検査されるのを可能にする。結合パラメータを正確に定めることができ、及び結合の修飾因子又は抑制剤の効果を高度に平行な様式において調査することができる。
【００３３】
いくつかの最近の出版物[例えば、参考文献8]は、機能的なタンパク質の配列体が配列体の個々の一員を同じ条件の下で同時に選別させるのを可能にすることを示している。これは、他の技術と比較される高度に平行で及び迅速な実験を可能にし、多くのタンパク質にわたって直接的に比較できる結果を導く。これらの質は、タンパク質の配列体を、Y2H及び免疫沈降/プル-ダウンのような、タンパク質機能のための他のアッセイから区別し、そこでは、これらの他の方法で潜在する細胞の区分化(compartmentalisation)が、各タンパク質収集物を、個々のタンパク質に、及び従って個々のアッセイに効率的に分ける。
【００３４】
本発明に従うタンパク質の配列体は、それらを特に固定化するとき、タンパク質の機能的な活性を保存することができ、生物学的活性を直接測定されるようにする。加えて、それらは、免疫沈降及びプル-ダウンアッセイを用いる比較できる様式においては不可能な観察される相互作用上での潜在的な抑制剤の実体の効果を定めるための直接的な方法を提供する。
【００３５】
本発明に従うタンパク質の配列体は、観察された相互作用のための結合定数(Kd)を定量化するために用いることができ、及びまた、所定の相互作用を抑制するのに必要な化合物の濃度をIC50値の決定により測定可能にする。
【００３６】
本発明の配列体の取調べから得られる結果は、定量的(例えば、結合定数又は触媒作用の定数KD及びKMの測定)、半定量的(例えば、タンパク質量に対する結合量の標準化)又は定性的(例えば、非機能的対機能的)であることができる。リガンドがいくつかの(例えば、２種又はそれよりも多くの種類の)濃度で添加される反復配列体のためのシグナルを定量化することによって、スポットにおけるタンパク質の結合親和性及び活性な濃度の双方を決定することができる。例えば、定量的な結果、KD及びBmaxは、リガンドとタンパク質との間の相互作用の親和性及びそのリガンドのための結合部位の数のそれぞれを記述し、タンパク質の配列体のデータから導くことができる。簡潔には、各々の個々のタンパク質のスポットに結合するリガンドの定量化されたか、又は相対的な量のいずれかを、リガンドの異なる濃度でアッセイ溶液において測定することができる。タンパク質の量と結合するリガンドとの間の直線的な関係を仮定すれば、アッセイにおいて用いられるリガンドの濃度の範囲にわたって各スポットに結合するリガンドの(相対的な)量を、式１、再配列又は誘導に適合させることができる。
結合リガンド＝Bmax/((KD/[L])+1) (式１)
[L]=アッセイ中に用いるリガンドの濃度
【００３７】
本発明者は、膜タンパク質の付属タンパク質の機能的な配列体を生産し、リガンドの結合パラメータ及び特異性の迅速な研究のためのツールを提供した。リガンドは、他の膜タンパク質のサブユニット、ペプチド又は複雑な構築物を修飾するための潜在的な治療上の化合物の結合ドメインのような、他のタンパク質であることができる。この方法論は高度に平行な形式における正確な結合定数の決定を提供する。
【００３８】
ここから、本発明を、次の図面を参照し、次の例により更に説明するが、図面において：
図１はβサブユニットの粗可溶化物のウエスタンブロットを示す。それぞれのβサブユニット発現クローンからの粗可溶化物及び清澄な可溶化物の10μLを、SDS PAGEを用いて動かした。ゲルを移し、及び膜をストレプトアビジン(A)及び抗His抗体(B)で探索した。レーンに負荷されたものは：１及び２ヒトβ１、３及び４ヒトβ２、５及び６ヒトβ３、７及び８ラットβ１、９及び10ラットβ２、11及び12ラットβ３。奇数のレーン−粗可溶化物、偶数のレーン−清澄な可溶化物。
【００３９】
図２は精製したKvβサブユニットのSDS PAGEを示す。レーン１及び８Mrマーカ、２ヒトβ１、３ヒトβ２、４ヒトβ３、５ラットβ１、６ラットβ２、７ラットβ３。
図３は精製したヒト及びラットKvβサブユニットの紫外-可視光吸収スペクトルを示す。凡例：青色；ヒトβ１、ピンク色；ヒトβ２、黄色；ヒトβ３、青緑色；ラットβ１、紫色；ラットβ２、茶色；ラットβ３。挿入図は360nmでのピークをより一層詳細に示す。
【００４０】
図４はKvβサブユニットの共沈アッセイを示す。A;Kvβサブユニット可溶化物をKvαサブユニット被覆の抗FLAGビーズに(レーン７〜12)及び未被覆抗FLAGビーズに(レーン１〜６)に添加した。１時間のインキュベーションの後、ビーズを洗浄し、及びSDS PAGE上での駆動前にSDSの試料緩衝液中で煮沸した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、及びビオチン化KvβサブユニットをストレプトアビジンHRP複合物の使用によって視覚化した。B；ウエスタンブロットからのバンドを定量化し、及びプロットした。
【００４１】
図５はストレプトアビジン被覆のマイクロタイタプレートにおけるKyβサブユニットの固定化を示す。Kyβサブユニットの可溶化物(元の濃度およそ3.5mg/mL)を連続的に希釈し、及びストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートのウェルに添加した。未結合タンパク質を除くための洗浄の後、Kyβサブユニットを、Cy3標識化抗His抗体の使用によって定量化した。結合抗体を、550nm及び570nmの励起及び放出フィルタをそれそれ備えるパッカード(Packard社)の融合マイクロタイタプレート読取機において蛍光定量的に定量化した。
【００４２】
図６はKvαサブユニットT1ドメインのKyβサブユニットマイクロタイタプレート配列体への結合を示す。希釈した粗αサブユニットT1ドメイン可溶化物を、Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体の各ウェルに添加した。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、未結合のKvαサブユニットT1ドメインを除去した。残っている結合KvαサブユニットT1ドメインを、FLAGタグ及び抗FLAG抗体の使用によって測定し、及びHRPの共役(conjugate)二次抗体及び比色分析基質の使用によって視覚化した。
【００４３】
図７はSPL2ペプチドについてのKvβサブユニット配列体への結合曲線を示す。ペプチドSPL2をKvβサブユニット配列体に結合させた。洗浄後、配列体に結合した残りの量を蛍光定量的に定量化した。データは結合曲線に適合した。青色三角；ラットKvβ１、黒色四角；ラットKvβ２、オープンのピンク色四角；ラットKvβ３、赤色星印；ヒトKvβ１、緑色円；ヒトKvβ２、オープンの青緑色円；ヒトKvβ３。
【００４４】
図８はKyβサブユニット配列体に対するペプチド結合のKvαサブユニットT1ドメインによる抑制を示す。およそのKdでSPL2ペプチドを、精製されたKvαサブユニットT1ドメインの存在下及び欠損下にKyβサブユニット配列体のウェルに添加した。洗浄後、結合したSPL2ペプチドを蛍光定量的に定量化した。
【００４５】
図９はマイクロアレイした(microarrayed)Kvβサブユニットの抗体検出を示す。すべてのKvβサブユニットを、Cy3標識化抗His抗体の使用によって検出することができた。
図10はマイクロアレイしたKyβサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを示す。KyβサブユニットのマイクロアレイをKvαサブユニットT1ドメイン可溶化物と共にインキュベートした。洗浄後、βサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを、抗FLAG抗体及びCy3標識化抗マウスIgGを用いて検出することができた。
【００４６】
例１
電位作動型カリウム(Kv)チャネルを、治療上の標的として、障害であって、CNS、心臓、肺及び膀胱のそれらを含む障害において認識する。したがって、それらは重要な治療上及び商業上の標的である。それらは、６種の貫膜橋架け(spanning)ドメインを持ち、及び細胞質調節性β-サブユニットの構築物に繋がる(coupled)α-サブユニットの四量体構築物からなる。
【００４７】
今日までに、分子クローニングは、Kvチャネルαサブユニットを暗号化する少なくとも23種の遺伝子産物を同定している。代わりのスプライシングから生じる更なる多様化はまた、多くのαサブユニットについて例証されている。４種の系列のチャネル-形成Kvサブユニット、Kv1〜4が、ショウジョウバエ(Drosophila)のカリウムチャネル、シェイカー(Shaker)、シャブ(Shab)、ショウ(Shaw)及びシャル(Shal)から、それぞれ導かれる。これらのチャネル種類のそれぞれは複数の(multiple)亜系列の一員を持つ。更なる４種の系列のKvチャネル、Kv5、Kv6、Kv8及びKv9が識別されており、それは単独で機能的なチャネルを形成しない。しかし、それらは、チャネル-形成サブユニットと組み合され、変化した生物物理学的特性を有する機能的チャネルを形成することができる。少なくとも２種のこれらの系列の補助的なαサブユニット(Kv6及びKv9)は、複数の亜系列の一員を持つ。
【００４８】
Kvチャネルαサブユニットのホモマの及びヘテロマの四量体化によって与えられる分子の多様性に加え、細胞質βサブユニットは、チャネル複合体に結合し、及びチャネルの動力学又は細胞の表面発現を修飾することができる。３種の系列、Kvβ１〜Kvβ３は、今までに識別されており、Kvβ１遺伝子から観察される３種のスプライス変異体を有する。β-サブユニット複合体はT1ドメインとして知られるα-サブユニットのN-末端の領域に結合し、及びサブユニットの存在は、機能的なイオンチャネルの細胞-表面の発現を増加させる。チャネルゲート開閉動力学の修飾におけるKvβ１サブユニットについての追加の役割もまた、確立されている。
【００４９】
Kvβサブユニット配列体
Kvβサブユニット配列体の構成体のための材料及び方法
His及びビオチン標識KyβサブユニットcDNAsのクローン化
ラット及びヒトのKvβ１、β２及びβ３サブユニットのコアドメインcDNAを、ポリ・ヒスチジン-標識及び大腸菌AccB遺伝子からのBCCPドメインのためのコード配列の下流の大腸菌発現ベクタにライゲートした。連結混合物を、化学的に形質転換受容性の(competent)XL10-Gold cells〔ゴールド細胞、Stratagene(ストラタジーン社)〕中に入れ、製造者の指示に従って形質転換させた。KyβサブユニットcDNA配列を、配列決定によって点検し、及び期待されたタンパク質に対応することが見出された-添付物参照。
【００５０】
大腸菌中でのKyβサブユニットの発現
Kyβサブユニットプラスミドを含むXL10-Gold細胞のコロニーを、20ml試験管中にアンピシリンを含有する5mLのLB培地中に接種し、及び37℃で振盪培養器中一昼夜増殖させた。2mLの一昼夜培養物を用い、500 mLのフラスコ中の200mLの他のLB/アンピシリンに接種し、及び〜1.0のOD600に達するまで37℃で増殖させた。次いで、IPTG及びビオチンをそれぞれ１mM及び50μMの終濃度まで添加し、及び誘導を23℃で４時間続けた。次いで、細胞を遠心分離によって収穫し、細胞のペレットをPBS×３中で洗浄し、及び一定分量中-80℃で貯えた。
【００５１】
Kyβサブユニット含有大腸菌の溶解
細胞ペレットを氷上で解かし、及び400μLの溶解緩衝液〔1%のTween(トゥイーン)20、1mg/mLのリゾチーム及び１μg/mLのDNAse Iを含有するPBS〕を添加し、及び細胞をピペッティングによって再懸濁させた。細胞細片を遠心分離、13000rpm10分間４℃によって収集する前に、溶解をロッカー上で室温の30分間のインキュベーションにより助けた。清澄な上清の可溶性タンパク質を除去し、及び直ちに用いた。
【００５２】
Kyβサブユニットの精製
Kyβサブユニットをヘキサヒスチジン標識の使用によって精製した。50mMのイミダゾールを含有するPBS中で希釈した清澄な溶解物を、Talon Cobalt(タロンコバルト)アフィニティ樹脂〔Clontech(クローンテック社)〕を含むカラムに添加した。カラムを10倍のカラム容量で洗浄し、及び300mMのイミダゾールを含有するPBSの２倍のカラム容量中でタンパク質を溶離した。
【００５３】
SDS PAGE
タンパク質試料を4〜20%のTris-グリシンのゲル〔NOVEX(ノベックス社)〕上への負荷及び200Vでの45分間の駆動に先立ち、SDS含有緩衝液中で煮沸した。次いで、ゲルをウエスタンブロット法用に用いるか、又はタンパク質をクーマシーブリリアントブルー染料で直接的に染色した。
【００５４】
ウエスタンブロット法
タンパク質をPVDF膜〔Hybond(ハイボンド)-P、Amersham(アマシャム社)〕上に移し、及び標準的な技術を用いて種々のエピトープの存在について探索した。ヒスチジン-標識の検出のために、膜を5% Marvel(マーベル)/PBST中でブロックし、及び抗-RGSHis抗体〔QIAGEN(キアゲン社)〕を一次抗体として1/1000希釈で用いた。ビオチン標識の検出のために、膜を、Superblock(スーパーブロック)/TBS(ピアス社)中でブロックし、及びSuperblock/TBS/0.1%Tween20中で1/2000希釈のストレプトアビジン/HRP複合物(Amersham)で探索した。RGSHis抗体のための二次抗体は、Marvel/PBST中1/2000希釈で用いた抗-マウスIgG(Fc特異的)HRP複合物〔Sigma(シグマ社)〕であった。大規模な洗浄の後、結合したHRP複合物を、ECLPlus(プラス)(Amersham)及びHyperfilm(ハイパーフィルム)ECL(Amersham)を用いてか、又はDAB染色(Pierce)によって検出した。
【００５５】
スペクトラ
精製したKyβサブユニットの紫外-可視スペクトル(250〜500nm)を、Thermo(サーモ)スペクトロニック走査分光光度計を用いて記録した。タンパク質を溶出緩衝液中で希釈し、及び溶出緩衝液の単独を用い、すべての試料から控除される基線を取った。
【００５６】
αサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
αサブユニットT1ドメイン(アミノ酸33〜135)のためのcDNAを、大腸菌発現ベクタ中のHis-標識及びFLAG-標識をコードする配列の下流でクローン化した。プラスミドを正しい配列についての配列決定によって点検し、及び大腸菌培養物の誘導は期待された寸法のHis及びFLAG標識の可溶性タンパク質の発現を示した。αサブユニットT1ドメインとKyβサブユニットとの間の相互作用を試験するために、10μLのαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物の存在下で、及び欠損下で、300mMのNaCl含有の500μLのリン酸緩衝食塩水、0.1%Tween20及び1%(w/v)ウシ血清アルブミンにおいて、結合反応を、10μLのKyβサブユニットの清澄な溶解物、10μLの抗-FLAGアガロースを含めて構築した。反応をロッカー上で室温１時間インキュベートし、及びFLAG結合複合体を5000rpmで２分間遠心分離することによって収穫した。PBST中での大規模な洗浄の後、FLAG結合複合体をSDS試料緩衝液中で変性させ、及びウエスタンブロッティングした。ビオチン化Kyβサブユニットの存在をストレプトアビジン/HRP複合物によって検出した。
【００５７】
Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体の製造
96個のウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートに、100μLの最適化した濃度のKyβサブユニット清澄溶解物(典型的にPBS-Tween中で16中の１の希釈)を各ウェルに添加した。各ウェルを３回300μLのPBS-Tweenで洗浄する前に、プレートを室温で振とうさせながら45分間インキュベートした。しかる後、プレートをアッセイにおいて用いるか、又は-20℃でPBS-Tween中50%(v/v)のグリセリン存在下に貯蔵した。
【００５８】
Kyβサブユニット配列体のペプチド結合アッセイ
αサブユニットドメインの部分に基づくKyβサブユニット相互作用ペプチド(SPL2)を設計し、合成し、及びフルオレセイン標識化した。0.1%w/vBSAを含有するPBS-Tween中で適切に希釈したSPL2ペプチドを100μL/ウェルでKyβサブユニット被覆マイクロタイタプレートに添加した。未結合ペプチドを３回300μLのPBS-Tweenでの洗浄によって除去する前に、ペプチドを、１時間室温で振とうさせながら、インキュベートした。各ウェル中のフルオレセイン標識化SPL2ペプチド濃度を評価する前に、100μLの６MグアニジンHC1を各ウェルに添加した。96ウェルのマイクロタイタプレートの各ウェルの蛍光を、485nm及び520nmの励起及び放出フィルタをそれそれ備えるPackardの融合マイクロタイタプレート読取機において読取った。
【００５９】
Kyβサブユニット配列体KvαサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
KvαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物を0.1%w/vBSA含有PBS-Tween中で10中の１で希釈し、100μL/ウェルでKyβサブユニット被覆マイクロタイタプレートに添加した。未結合のαサブユニットT1ドメインを３回の300μLのPBS-Tweenでの洗浄によって除去する前に、ペプチドを１時間室温で振とうさせながらインキュベートした。結合αサブユニットT1ドメインを、適切に希釈したマウス抗FLAG抗体及び標準的なELISA法を用いる抗マウスIgG二次抗体HRP複合物の使用によって評価した。HRPを比色分析のHRP基質2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)の添加によって検出し、及びマイクロタイタプレートを、405nmの吸光度フィルタを備えるPackardの融合マイクロタイタプレート読取機において読取った。
【００６０】
Kyβサブユニットマイクロ配列体の製造
Kyβサブユニットの清澄な溶解物を384個のウェルプレート中に負荷し、及び４種のピンのマイクロアレイイングヘッドを備えるQarray(キアレイ)のマイクロアレイイングロボット〔Genetix(ゲネティックス社)、英国〕を用いてデキストラン被膜〔Xantec(キサンテック)〕上に固定化されたニュートラビジン(neutravidin)を有するガラスの顕微鏡用スライド上に印刷した。各溶解物を各配列体上に16回スポットした。印刷後、PBS-Tween中での洗浄の前に、配列体を４℃の湿気のあるチャンバ中で１時間インキュベートした。洗浄後、配列体をアッセイのために用意した。
【００６１】
マイクロアレイKyβサブユニットの抗体検出
Cy3標識化抗His抗体をPBS-Tween+0.1%(w/v)BSA中で１μg/mLに希釈し、及びおよそ500μLをスライド上にピペットで取った。スライドをPBS-Tweenの大容量中での２回×２分の洗浄の前に、室温で極わずかに振とうさせながら１時間インキュベートした。スライドを、Cy3フルオロフォア検出のために適切な励起レーザ及び放出フィルタを備えるマイクロアレイ走査装置〔Affymetrix(アフィメトリクス)428アレイスキャナ〕において走査する前に、スライドを簡潔に2000gで遠心分離し、液体を除いた。
【００６２】
マイクロアレイしたKyβサブユニットへのKvαサブユニットT1ドメインの結合
KvαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物を1%w/vBSA含有PBS-Tween中で50中の１で希釈し、及びおよそ500μLをスライド上にピペットで取った。スライドをPBS-Tweenの大容量中での２回×２分の洗浄の前に、室温で極わずかに振とうさせながら１時間インキュベートした。次いで、適切に希釈した抗FLAG抗体を配列体上にピペットで取り、及びインキュベートし、及びCy3標識化抗マウスIgGの添加前に、上述のようにインキュベートし、及び洗浄した。スライドをインキュベートし、及び簡潔な2000gでの遠心分離の前に上述のように洗浄し、Cy3フルオロフォア検出のために適切な励起レーザ及び放出フィルタを備えるマイクロアレイ走査装置(Affymetrix428アレイスキャナ)において走査する前に、液体を除いた。
【００６３】
結果
大腸菌中でのKyβサブユニットの発現
Kyβサブユニットのコアドメインを、大腸菌遺伝子ACCBからのBCCPドメインが既にクローン化されているベクタpQE80中のtacプロモータの下流でクローン化した。次いで、得られるタンパク質を、そのN-端でHis及びビオチン標識する。図１は誘導された大腸菌培養物からの全体の及び可溶性タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。すべてのβサブユニットについて、およそ50kDaの分子量を有するHis-標識された及びビオチン化されたタンパク質についての明確なバンドがある。同じ寸法のバンドは、用いたすべてのβサブユニットと交差反応するヒトのKvβ２〔Biosource(バイオソース)〕に対して生じる多クローン抗体によって検出される(データを示していない)。
【００６４】
His及びビオチン標識がこの配列体で用いられたが、他の親和性標識(例えば、FLAG、myc、 VSV)を用い、クローン化タンパク質の精製、検出及び固定化を可能にすることができる。また、必要があれば、大腸菌以外の発現宿主も用いることができる(例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞)。
【００６５】
Kyβサブユニットの精製
親和性標識の使用により配列化する前に、タンパク質を精製することができる。本明細書では、Talon樹脂上でのタンパク質の精製によってhis標識を用いた。図２はこの方法で精製したKvβサブユニットが、Kvβサブユニット、又はタンパク分解産物に対応するSDS-PAGE上のバンドのみを示すことを示す。
【００６６】
紫外-可視吸光度スペクトラ
紫外-可視スペクトルをすべてのヒト及びラットのKvβサブユニットについて得た。図３は、ヒト及びラットの双方のKvβ２サブユニットが360nmでのそれらの吸光度ピークによって立証されるようにNAD(P)Hの補助因子を含んでいることを示す。
【００６７】
αサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
発現したKvβサブユニットが自然な機能を保持していることを確認するため、アッセイを考案し、ここではKvβサブユニットがαサブユニットT1ドメイン被覆ビーズに結合することによって沈降する。抗FLAGビーズに対し、FLAG標識KvαサブユニットT1ドメイン溶解物を添加した。次いで、これらを、Kvβサブユニットを含有する溶解物と混合した。図４は、Kvβサブユニットの抗FLAGビーズに対する非特異的結合が高いが、KvαサブユニットT1ドメインの存在下の結合が増加することを示す。また、ラットKvβ３サブユニットが、KvαサブユニットT1ドメイン被覆ビーズに、任意の他のKvβサブユニットよりも多い量で結合していることが分かる。
【００６８】
Kyβサブユニットマイクロタイタプレート配列体の製造
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートがKvβサブユニットで被覆され得ることを確認するために、溶解物を連続的に希釈し、及びプレートのウェルに添加した。図５は、ウェル当りの特異的に固定化されたタンパク質の同様のレベルを達成することができることを示す。
【００６９】
Kyβサブユニット配列体αサブユニットT1ドメイン相互作用アッセイ
図６はKvαサブユニットT1ドメインのすべてのKyβサブユニットへの特異的結合を示す。また、ラットのKvβ３サブユニットがより一層多くのKvαサブユニットT1ドメインを明らかに結合しており、共沈アッセイの結果を映していることは注目され得る。
【００７０】
Kyβサブユニット配列体ペプチド結合アッセイ
SPL2ペプチドを、Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体に、100から1600μMまでの濃度の範囲で添加した。１時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、未結合のペプチドを除去した。残っているペプチドを蛍光定量的に定量化した。結果(図７に示す)は、それぞれのKyβサブユニットについてのKd及びBmaxの評価を可能にするデータへの適合を提供する(表１)。
【００７１】
【表１】
表１．それぞれのKyβサブユニットについてのKd及びBmaxの評価。図７中のデータを、曲線適合(curve-fitting)ソフトウェアを用いて結合曲線に適合させた。
【００７２】
Kyβサブユニットに対するペプチド結合のKvαサブユニットT1ドメインによる抑制
SPL2ペプチドのKyβサブユニット配列体への結合を、KvαサブユニットT1ドメインの存在下に抑制した。図８では、ラットKyβ１及び２サブユニットについて、ペプチド結合が減少することが見られる。
【００７３】
マイクロアレイKyβサブユニットの抗体検出
マイクロアレイしたKyβサブユニットは、ストレプトアビジンを被覆したガラスの顕微鏡用スライド上に特異的に固体化されることが示される。図９では、スポットされる溶液中の遊離のビオチンの包含がKvβ３の固体化を完全に抑制することが見られる。すべてのKvβサブユニットが配列体上に存在し、また、固定化BCCP標識が配列体上に存在する。
【００７４】
マイクロアレイKyβサブユニットへのKvαサブユニットT1ドメイン結合
配列体上に固定化されたKvβサブユニットは、まだKvαサブユニットT1ドメインに結合することができる。図10では、KvαサブユニットT1ドメインが固定化したKvβサブユニットへの結合の後に検出することができる。また、図10から、固定化した親和性標識がKvαサブユニットT1ドメインのわずかな結合しか持たないことも見られる。
【００７５】
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18. Weixel(ワイクセル), KM及びBradbury(ブラッドベリー), NA(2001年) μ2 Binding directs the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the clathrin-mediated endocytic pathway(μ２結合はクラスリン-媒介エンドサイトーシス経路に対する嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子に指向する). J. Biol. Chem., 49, 46251-46259.
19. Tu(トゥー), JC等(1998年) Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors(ホーマーは新しいプロリンに富むモティーフに結合し、及び代謝調節型のグルタミン酸受容体をIP3受容体と連結させる). Neuron(ニューロン), 21, 717-726.
20. Shieh(シー), B-H及びZhu, M-Y(1996年) Regulation of the TRP Ca+ channel by INAD in Drosophila photoreceptors(ショウジョウバエ光受容体におけるINADによるTRP Ca+チャネルの調節). Neuron, 16, 991-998.
21. Pongs(ポングス), O., Leicher(ライヒャー), T. , Berger(バーガー), M.等(1999年) Functional and molecular aspects of voltage-gated K+ channel β subunits(電位-作動型K+チャネルβサブユニットの機能的及び分子的局面).
22. Walker, D. and Waard(ワード), M:(1998年) Subunit interaction sites in voltage- dependent Ca2+ channels: role in channel function(電位-依存性Ca2+チャネルにおけるサブユニット相互作用部位：チャネル機能における役割).
23. Onrust(オンルスト), R, Herzmark(ヘルツマーク), P等(1997年) Receptor and βγ binding sites in the α subunit of the retinal G-protein transcducin(網膜のG-タンパク質トランスデューシンのαサブユニットにおける受容体及びβγ結合部位). Science(サイエンス), 275, 381-384
24. Bourne(ボーン), HR(1997年) How receptors talk to trimeric G proteins(受容体はどのようにして三量体Gタンパク質と通信する). Curr. Opin. Cell. Biol.(細胞生物学における現代の見解), 9, 134-142.
25. Ferguson(ファーガスン), SSG(2001年) Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis(Gタンパク質-共役受容体エンドサイトーシスにおける発展的理念): The role in receptor desensitization and signaling(受容体脱感作及び情報伝達における役割). Pharmacol. Rev.(薬理学的総説), 53, 1-24.
26. Krupnick(クルプニック), JG等,(1994年) Arrestin-rhodopsin interaction(アレスチン-ロドプシン相互作用). Multi-site binding delineated by peptide inhibition(ペプチド抑制によって描かれる多-部位結合). J. Biol. Chem. 269, 3226-3232.
27. Nam(ナン), T-W等,(2001年) The Escherichia coli glucose transporter enzyme IICBGlc recruits the global repressor Mlc(大腸菌輸送体酵素IICBGlcは全体的なリプレッサーMlcを漸加する). EMBO J. 20, 491-498.
28. Zhang(チャン), J-Z等,(2001年) Overexpression of stomatin depresses GLUT-1 glucose transporter activity(ストマチンの高発現はGLUT-1グルコース輸送体活性を抑制する). Am. J. Physiol. Cell. Physiol.(アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー-セル・フィジオロジー), 280, C1277-C1283.
【００７６】
添付物１
タンパク質配列ヒトKvβ１サブユニットコアドメイン(残基87-419)：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQISDEVAERLMTIAYESG
VNLFDTAEVYAAGKAEVILGSIIKKKGWRRSSLVITTKLYWGGKAETE
RGLSRKHIIEGLKGSLQRLQLEYVDVVFANRPDSNTPMEEIVRAMTHVI
NQGMAMYWGTSRWSAMEIMEAYSVARQFNMIPPVCEQAEYHLFQRE
KVEVQLPELYHKIGVGAMTWSPLACGIISGKYGNGVPESSRASLKCYQ
WLKERIVSEEGRKQQNKLKDLSPIAERLGCTLPQLAVAWCLRNEGVSS
VLLGSSTPEQLIENLGAIQVLPKMTSHVVNEIDNILRNKPYSKKDYRS
【００７７】
タンパク質配列ヒトKvβ２サブユニットコアドメイン(残基36-364)：
GLQFYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQITDEMAEQLMTLAYDNGI
NLFDTAEVYAAGKAEVVLGNIIKKKGWRRSSLVITTKIFWGGKAETER
GLSRKHIIEGLKASLERLQLEYVDWFANRPDPNTPMEETVRAMTHVIN
QGMAMYWGTSRWSSMEIMEAYSVARQFNLTPPICEQAEYHMFQREK
VEVQLPELFHKIGVGAMTWSPLACGIVSGKYDSGIPPYSRASLKGYQW
LKDKILSEEGRRQQAKLKELQAIAERLGCTLPQLAIAWCLRNEGVSSVL
LGASNADQLMENIGAIQVLPKLSSSIIHEIDSILGNKPYSKKDYRS
【００７８】
タンパク質配列ヒトKvβ３サブユニットコアドメイン(残基75-404)：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGSQISDETAEDVLTVAYEHG
VNLFDTAEVYAAGKAERTLGNILKSKGWRRSSYVITTKIFWGGQAETE
RGLSRKHIIEGLRGSLERLQLGYVDIVFANRSDPNCPMEEIVRAMTYVI
NQGLALYWGTSRWGAAEIMEAYSMARQFNLIPPVCEQAEHHLFQREK
VEMQLPELYHKIGVGSVTWYPLACGLITSKYDGRVPDTCRASIKGYQW
LKDKVQSEDGKKQQAKVMDLLPVAHQLGCTVAQLAIAWCLRSEGVSS
VLLGVSSAEQLIEHLGALQVLSQLTPQTVMEIDGLLGNKPHSKK
【００７９】
タンパク質配列ラットKvβ１サブユニットコアドメイン：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQISDEVAERLMTIAYESG
VNLFDTAEVYAAGKAEVILGSIIKKKGWRRSSLVITTKLYWGGKAETE
RGLSRKHIIEGLKGSLQRLQLEYVDVVFANRPDSNTPMEEIVRAMTHVI
NQGMAMYWGTSRWSAMEIMEAYSVARQFNMIPPVCEQAEYHLFQRE
KVEVQLPELYHKIGVGAMTWSPLACGIISGKYGNGVPESSRASLKCYQ
WLKERIVSEEGRKQQNKLKDLSPIAERLGCTLPQLAVAWCLRNEGVSS
VLLGSSTPEQLIENLGAIQVLPKMTSHWNEIDNILRNKPYSKKDYRS
【００８０】
タンパク質配列ラットKvβ２サブユニットコアドメイン：
GLQFYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQITDEMAEHLMTLAYDNGI
NLFDTAEVYAAGKAEVVLGNIIKKKGWRRSSLVITTKIFWGGKAETER
GLSRKHIIEGLKASLERLQLEYVDVVFANRPDPNTPMEETVRAMTHVIN
QGMAMYWGTSRWSSMEIMEAYSVARQFNLIPPICEQAEYHMFQREKV
EVQLPELFHKIGVGAMTWSPLACGIVSGKYDSGIPPYSRASLKGYQWL
KDKILSEEGRRQQAKLKELQAIAERLGCTLPQLAIAWCLRNEGVSSVLL
GASNAEQLMENIGAIQVLPKLSSSIVHEIDSILGNKPYSKKDYRS
【００８１】
タンパク質配列ラットKvβ３サブユニットコアドメイン(残基75-404)：
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGSQISDETAEDLLTVAYEHG
VNLFDTAEVYAAGKAERTLGNILKSKGWRRSSYVITTKIFWGGQAETE
RGLSRKHIIEGLQGSLDRLQLEYVDIVFANRSDPSSPMEEIVRAMTYVIN
QGLALYWGTSRWSAAEIMEAYSMARQFNLIPPVCEQAENHFFQREKV
EMQLPELYHKIGVGSVTWSPLACSLITSKYDGQVPDACKATVKGYQW
LKEKVQSEDGKKQQARVTDLLPIAHQLGCTVAQLAIAWCLRSEGVSSV
LLGVSSAEQLMEHLGSLQVLGQLTPQTVMEIDALLGNKSHSKK
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】(A)及び(B)はβサブユニットの粗可溶化物のウエスタンブロットを示す図である。
【図２】精製したKvβサブユニットのSDS PAGEを示す図である。
【図３】精製したヒト及びラットKvβサブユニットの紫外-可視光吸収スペクトルを示す図である。
【図４】(A)及び(B)はKvβサブユニットの共沈アッセイを示す図である。
【図５】ストレプトアビジン被覆のマイクロタイタプレートにおけるKyβサブユニットの固定化を示す図である。
【図６】KvαサブユニットT1ドメインのKyβサブユニットマイクロタイタプレート配列体への結合を示す図である。
【図７】SPL2ペプチドについてのKvβサブユニット配列体への結合曲線を示す図である。
【図８】Kyβサブユニット配列体に対するペプチド結合のKvαサブユニットT1ドメインによる抑制を示す図である。
【図９】マイクロアレイKvβサブユニットの抗体検出を示す図である。
【図１０】マイクロアレイKyβサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列体であって、表面を含み、それに付着する少なくとも１種の細胞質性付属タンパク質を持ち、通常複合化されるその膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まない配列体。
【請求項２】
前記細胞質性付属タンパク質が、相同的な膜タンパク質の系列の一員である膜タンパク質の細胞質性付属タンパク質である請求項１記載の配列体。
【請求項３】
相同的な膜タンパク質の系列が、イオン−チャネル、Ｇタンパク質共役受容体及び貫膜輸送体タンパク質からなる群より選ばれる請求項２記載の配列体。
【請求項４】
前記細胞質性付属タンパク質が相同的な付属タンパク質の系列の一員である請求項１記載の配列体。
【請求項５】
前記系列が、イオン−チャネルサブユニット、受容体相互作用タンパク質及び膜輸送体タンパク質に対する付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項４記載の配列体。
【請求項６】
前記系列が、Ｋ＋−チャネルβ−サブユニット、Ｃａ２＋−チャネルβ−サブユニット、Ｇタンパク質サブタイプ及び輸送体のための付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項４記載の配列体。
【請求項７】
前記系列が、Ｋｖチャネルβ−サブユニット、カルシウムチャネルβ−サブユニット、Ｇｓ系列、Ｇｔ系列、Ｇｉ系列、Ｇｉ−０系列、Ｇｑ−１１系列、Ｇα−感覚系列、βγ系列及び輸送体のための付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項４記載の配列体。
【請求項８】
細胞質性付属タンパク質が、所定の膜タンパク質と相互作用するか、又はその反対であるかを定める方法であって、前記方法が次の工程：
（ｉ）候補の細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性付属タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
（ｉｉ）配列体を、前記膜タンパク質の細胞質性断片及び／又は他の関連する膜タンパク質系列の一員の細胞質性断片と接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）相互作用する相手を検出し、及び同定する工程
を含む方法。
【請求項９】
細胞質性付属タンパク質と選択的に相互作用する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が次の工程：
（ｉ）細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
（ｉｉ）配列体を化合物又はペプチド又はタンパク質と接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）相互作用する相手を同定する工程
を含む方法。
【請求項１０】
方法が、追加の工程（ｉｖ）であって、相互作用する相手の相互作用を定量化する工程を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞質性付属タンパク質及び膜タンパク質の間の相互作用を選択的に修飾する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が次の工程、
（ｉ）細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
（ｉｉ）配列体を、化合物又はペプチド又はタンパク質と、及び対象の１種又はそれより多い種類の膜タンパク質又はその細胞質性断片と、同時にか、又は順にかのいずれかで接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）前記相互作用が前記化合物又はペプチド又はタンパク質の存在によって修飾されるかどうかを定める工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記方法が、追加の工程（ｉｖ）であって、相互作用の修飾の程度を定量化する工程を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列体の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、付属タンパク質の系列の異なる一員の相対的触媒活性を測定するのに用いる使用。
【請求項１４】
配列体の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、表現型−遺伝子型−結合抗体（例えば、ファージ提示抗体）のライブラリから抗体を選ぶための親和性表面として用いる使用。
【請求項１５】
配列体の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、付属タンパク質と膜タンパク質との相互作用上に、及び／又は前記膜タンパク質の特性上に及ぼす翻訳後修飾の効果を定めるために用いる使用。
【請求項１】
配列体であって、表面を含み、それに付着する少なくとも１種の細胞質性付属タンパク質を持ち、通常複合化されるその膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まない配列体。
【請求項２】
前記細胞質性付属タンパク質が、相同的な膜タンパク質の系列の一員である膜タンパク質の細胞質性付属タンパク質である請求項１記載の配列体。
【請求項３】
相同的な膜タンパク質の系列が、イオン−チャネル、Ｇタンパク質共役受容体及び貫膜輸送体タンパク質からなる群より選ばれる請求項２記載の配列体。
【請求項４】
前記細胞質性付属タンパク質が相同的な付属タンパク質の系列の一員である請求項１記載の配列体。
【請求項５】
前記系列が、イオン−チャネルサブユニット、受容体相互作用タンパク質及び膜輸送体タンパク質に対する付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項４記載の配列体。
【請求項６】
前記系列が、Ｋ＋−チャネルβ−サブユニット、Ｃａ２＋−チャネルβ−サブユニット、Ｇタンパク質サブタイプ及び輸送体のための付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項４記載の配列体。
【請求項７】
前記系列が、Ｋｖチャネルβ−サブユニット、カルシウムチャネルβ−サブユニット、Ｇｓ系列、Ｇｔ系列、Ｇｉ系列、Ｇｉ−０系列、Ｇｑ−１１系列、Ｇα−感覚系列、βγ系列及び輸送体のための付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項４記載の配列体。
【請求項８】
細胞質性付属タンパク質が、所定の膜タンパク質と相互作用するか、又はその反対であるかを定める方法であって、前記方法が次の工程：
（ｉ）候補の細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性付属タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
（ｉｉ）配列体を、前記膜タンパク質の細胞質性断片及び／又は他の関連する膜タンパク質系列の一員の細胞質性断片と接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）相互作用する相手を検出し、及び同定する工程
を含む方法。
【請求項９】
細胞質性付属タンパク質と選択的に相互作用する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が次の工程：
（ｉ）細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
（ｉｉ）配列体を化合物又はペプチド又はタンパク質と接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）相互作用する相手を同定する工程
を含む方法。
【請求項１０】
方法が、追加の工程（ｉｖ）であって、相互作用する相手の相互作用を定量化する工程を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞質性付属タンパク質及び膜タンパク質の間の相互作用を選択的に修飾する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が次の工程、
（ｉ）細胞質性付属タンパク質で、１種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程；
（ｉｉ）配列体を、化合物又はペプチド又はタンパク質と、及び対象の１種又はそれより多い種類の膜タンパク質又はその細胞質性断片と、同時にか、又は順にかのいずれかで接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）前記相互作用が前記化合物又はペプチド又はタンパク質の存在によって修飾されるかどうかを定める工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記方法が、追加の工程（ｉｖ）であって、相互作用の修飾の程度を定量化する工程を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列体の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、付属タンパク質の系列の異なる一員の相対的触媒活性を測定するのに用いる使用。
【請求項１４】
配列体の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、表現型−遺伝子型−結合抗体（例えば、ファージ提示抗体）のライブラリから抗体を選ぶための親和性表面として用いる使用。
【請求項１５】
配列体の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、付属タンパク質と膜タンパク質との相互作用上に、及び／又は前記膜タンパク質の特性上に及ぼす翻訳後修飾の効果を定めるために用いる使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００６−５０１１４１（Ｐ２００６−５０１１４１Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５７６４６８（Ｐ２００３−５７６４６８）
【出願日】平成１５年３月１３日（２００３．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１０４９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７８４６４
【国際公開日】平成１５年９月２５日（２００３．９．２５）
【出願人】（５０４２１６３７６）センス プロテオミック リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月１３日（２００３．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１０４９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７８４６４
【国際公開日】平成１５年９月２５日（２００３．９．２５）
【出願人】（５０４２１６３７６）センス プロテオミック リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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