褐色脂肪細胞分化を誘導するための方法および組成物
肥満および関連障害を治療するための方法および組成物。当該方法は、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７で処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞の使用を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援の研究または開発）
合衆国政府は、国立衛生研究所に付与された認可番号Ｒ０１ ＤＫ０７７０９７のもとにある本発明において一定の権利を有する。
（発明の属する技術分野）
本開示は、肥満ならびに体重関連の疾患および障害を治療するための方法および組成物に関する。より具体的には、本開示は、細胞もしくは細胞集団内の褐色脂肪組織の脂肪細胞分化を調節する（例えば、増加させる）ための方法および組成物、ならびに褐色脂肪組織細胞系統への分化能もしくは指向能を有する細胞を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、他の障害（糖尿病、心疾患、および癌など）の発症および病因における役割を直接的間接的に介した主要な国際的健康問題である。肥満はエネルギー摂取量がエネルギー消費量を超過した際に発症し、通常、脂肪細胞または脂肪組織の異常蓄積に関連する。
【０００３】
脂肪組織は（筋肉および骨と同様に）中胚葉に由来し、白色脂肪細胞（ｗｈｉｔｅ ｆａｔ ｃｅｌｌ）（白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ：ＷＡＴ）細胞としても知られている）および／または褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ ｆａｔ ｃｅｌｌ）（褐色脂肪組織（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ：ＢＡＴ）細胞としても知られている）を増殖かつ分化させる分裂区画を含む。ＢＡＴ細胞とＷＡＴ細胞は共に間葉系幹細胞から生じ、それらは好適な生成合図に惹起された際に脂肪細胞系統に方向付けられるようになり、前駆脂肪細胞として方向が決定される。前駆脂肪細胞は、ＢＡＴ細胞またはＷＡＴ細胞への分化能を有するＷＡＴとＢＡＴの前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）もしくは前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の両方を含む。
【０００４】
最近、筋原性遺伝子の発現形跡が褐色脂肪前駆細胞内で（ただし、白色脂肪前駆細胞内ではない）同定され（非特許文献１）、ＢＡＴ前駆細胞はＷＡＴ前駆細胞とは異なり、両者は識別できることが示唆された。加えて、褐色脂肪細胞の蓄積がマウス（特に肥満抵抗性の種）の後肢筋束間に散見され（非特許文献２）、骨格筋はＢＡＴ細胞への分化能または指向能を有する前駆細胞を含み得ることが示唆された。
【０００５】
ＷＡＴ組織はトリグリセリド蓄積および脂肪酸放出の主要部位である。ＷＡＴは皮下に見られ、断熱、緩衝作用（衝撃および不快感に対する）、およびエネルギー蓄積に供する。平均的な痩身者はおよそ２００〜４００億個のＷＡＴ細胞を有する。肥満者は平均痩身者の最大１０倍のＷＡＴを有し得る。
【０００６】
ＢＡＴ細胞は豊富かつ多数のミトコンドリアを含有し（非特許文献３）、酸化的リン酸化反応、中間代謝、適応性熱産生、活性酸素種の生成、およびアポトーシスの中心部位を担う。ＢＡＴでは、ミトコンドリア生合成が褐色脂肪細胞への分化を伴うことが長らく知られている。過去十年間において、ミトコンドリア完全性の改変は各種ヒト疾患（肥満、糖尿病、癌、神経変性、および老化など）に関与し得ることがますます明白になっている（非特許文献４−６）。
【０００７】
ＢＡＴは脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）を発現させることによって熱産生エネルギー消費に関与する。ＢＡＴ依存性エネルギー消費は寒冷下での体温維持および／または食物エネルギー消耗を担う。そのため、欠陥ＢＡＴまたはＢＡＴ不足はしばしば肥満を合併する。マウスのＢＡＴアブレーションは、しばしばインスリン抵抗性の、高血糖症、高
脂質血症、および高コレステロール血症を合併する重度の肥満に至るという観察結果によって、全体のエネルギー恒常性におけるＢＡＴの重要性が強調された（非特許文献７−９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０４：４４０１−４４０６， ２００７
【非特許文献２】Ａｌｍｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０４：２３６６−２３７１， ２００７
【非特許文献３】Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ， Ｔｒａｙｈｕｒｎ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌｓ， Ｅｄｓ． （Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８６）
【非特許文献４】Ｄｕｃｈｅｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３ （Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ９６−１０２ （２００４）
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ６：３８９−４０２ （２００５）
【非特許文献６】Ｌｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７：３８４−３８７ （２００５）
【非特許文献７】Ｌｏｗｅｌｌ ａｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６（６４５７）：７４０−２ （１９９３）
【非特許文献８】Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ４４（１１）：１２６６−７３ （１９９５）
【非特許文献９】Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（１）：２１−９ （１９９６）。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）で処理した幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞が真のＢＡＴ細胞に分化するまたは真のＢＡＴ細胞を指向するという発見に少なくともある程度基づく。これらのＢＡＴ細胞は、ＢＡＴ細胞熱産生プログラムを作動することによりカテコールアミン刺激に反応する完全な能力を有する生粋のＢＡＴ細胞である。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「ＢＭＰで処理した」とは、その細胞のＢＭＰシグナル伝達（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達）レベルが人工的に増強されていることを意味する（「および／または」は列挙されているもののうちの少なくとも一つを指す、以下同じ）。「人工的に」増強されたとは、ＢＭＰシグナル伝達レベルが直接的なヒトの介入により増加したことを意味する。ＢＭＰシグナル伝達は、本明細書に記載の任意の方法、例えば、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物（例えば、ＢＭＰポリペプチド、ＢＭＰコード核酸、低分子、および／または抗体）で細胞を処理することにより増強できる。本明細書に記載の方法により活性化したＳｃａ−１（＋）細胞集団も本発明に包含される。これらの細胞は、自己由来、同種異系由来、または異種由来であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＢＭＰシグナル伝達を増加させるのに十分な量の化合物によりＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団を処理し（例えば、接触させ）、それによりＢＭＰで処理した細胞集団を産出することを含み得る。
【００１２】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、これらのＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団の対象への移植することを含み得る。ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細
胞は、直接移植することもでき、あるいはスキャフォールド、マトリックス、または細胞を取り付けることができるその他の移植可能なデバイス（例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできている担体が挙げられる）内で投与することもできる。通常、当該方法は、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団（対象中の褐色脂肪細胞分化を促進する、例えば、対象のＢＡＴ量を少なくとも１％、例えば、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超増加させるのに十分な数の細胞を含む）の移植を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、当該方法は、精製したＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団（例えば、少なくとも６０％、例えば、７０％、８０％、９０％または９０％超の細胞がＳｃａ−１（＋）前駆細胞である細胞集団）を提供すること；ならびに本明細書に記載の１つまたは複数のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７（つまりＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の発現、量もしくは活性を増加させる能力を有する化合物とこれらの細胞との接触させ、それによりＢＭＰで処理した細胞の生成することを含む。
【００１４】
ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達を増加させる化合物は、例えば、下記のうちの１つまたは複数であり得る：
（ａ）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異型、好ましくは活性（例えば、ＢＭＰＲ−Ｉおよび／またはＢＭＰＲ−ＩＩを活性化する）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体（例えば、本明細書に記載の成熟ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド、例えば、成熟ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド）；
（ｂ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の受容体への結合を増加させるまたは安定化することにより）活性を増加させるＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のペプチドまたはタンパク質アゴニスト、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７活性を活性化するＢＭＰＲ−Ｉおよび／またはＢＭＰＲ−ＩＩ；
（ｃ）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達活性（例えば、ＢＭＰＲ−Ｉおよび／またはＢＭＰＲ−ＩＩ結合活性、またはＳＭＡＤリン酸化活性）を模倣する低分子またはタンパク模倣物；
（ｄ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子のプロモーター領域との結合により）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の発現を増加させる低分子；
（ｅ）抗体、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７と結合する、ならびに、それらのＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７結合パートナー（例えば、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７受容体）との結合を安定化もしくは補助する抗体である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７と結合する抗体はモノクローナル抗体（例えば、ヒト化キメラまたはヒトモノクローナル抗体）である；あるいは
（ｆ）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードする核酸。この核酸はゲノム配列でもあり得るし、ｃＤＮＡ配列でもあり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のポリペプチドまたは核酸である。本明細書で使用される場合、「ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のポリペプチドまたは核酸」とは、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたは核酸、例えば、成
熟ヒトＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドもしくはその活性断片、または成熟ヒトＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドをコードする核酸もしくはその活性断片である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−２ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−２、例えば、成熟ＢＭＰ−２ポリペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸２８３〜３９６を含むＢＭＰ−２ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−４ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−４、例えば、成熟ＢＭＰ−４ポリペプチド、例えば、配列番号２のアミノ酸２９３〜４０８を含むＢＭＰ−４ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−５ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−５、例えば、成熟ＢＭＰ−５ポリペプチド、例えば、配列番号３のアミノ酸３２３〜４５４を含むＢＭＰ−４ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−６ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−６、例えば、成熟ＢＭＰ−６ポリペプチド、例えば、配列番号４のアミノ酸３７４〜５１３、配列番号４のアミノ酸３８２〜５１３、配列番号４のアミノ酸３８８〜５１３、または配列番号４のアミノ酸４１２〜５１３を含むＢＭＰ−６ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−７ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−７、例えば、成熟ＢＭＰ−７ポリペプチド、例えば、配列番号５のアミノ酸２９３〜４３１を含むＢＭＰ−７ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドをコードする核酸、またはその生物学的に活性な断片もしくは類似体である。ＢＭＰ核酸は次を含み得る：ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７コード領域；プロモーター配列（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来のプロモーター配列）；エンハンサー配列；非翻訳調節配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来である５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来である３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列。別の実施形態では、内因性ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の発現レベルを増加させることにより（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の転写を増加させることによりまたはＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のｍＲＮＡの安定性を増加させることにより）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のタンパク質値は増加する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の転写は、例えば、正の制御因子（転写活性化因子のエンハンサーまたはＤＮＡ結合部位など）を添加して内因性ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の調節配列を改変することにより；負の制御因子（転写リプレッサーのＤＮＡ結合部位など）を削除することにより、および／または内因性調節配列もしくはその因子を別の遺伝子のそれと置換することにより増加させ、それによって、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子コード領域のより効
率的な転写が可能となる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、当該核酸はＢＭＰ−７をコードするか、またはＢＭＰ−７の転写を増加させる。
いくつかの実施形態では、本発明はＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）前駆集団を特徴とする。いくつかの実施形態では、これらの細胞はＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド）の発現レベルを、安定的または一時的に増加させるために遺伝子組換えされている。これらの細胞は、例えば、培養した哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、これらの細胞は少なくとも１つの他のタンパク質（例えば、非ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド、および／または第二（またはそれ以上の）ＢＭＰタンパク質）も同様に発現するように遺伝子組換えされている。発現したＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドは通常、幹細胞と同一種（例えば、ヒト細胞中で発現したヒトＢＭＰ）である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は不死化されており、例えば、培養物中で無制限に自己複製する能力を有する。
【００２３】
一態様では、本発明は、インビトロ細胞集団内における褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、本明細書に開示された細胞集団（幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））、ＣＤ４５陰性、Ｍａｃ−１陰性前駆細胞を含む）を取得すること；およびにインビトロ前駆細胞集団と、１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−４、−６、または−７の発現増加を促進する有効量の化合物とを、細胞集団中の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分な時間の間接触させること特徴を備えた細胞の数；または、細胞集団中ＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分なレベルで１つまたは複数のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を発現するよう細胞集団を遺伝子組換えすること、を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、対象中の褐色脂肪細胞分化を促進する方法を提供する。これらの方法は、治療が必要な対象を選択すること；幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））、ＣＤ４５陰性、Ｍａｃ１陰性前駆細胞を含む、本明細書に開示された細胞集団を取得すること；ならびにインビトロ前駆細胞集団と、１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−４、−６、または−７の発現増加を促進する有効量の化合物とを、これらの細胞集団中の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分な時間の間接触させること；またはこれらの細胞集団中のＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分なレベルで１つまたは複数のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を発現するよう細胞集団を遺伝子組換えすること；ならびに該細胞集団を対象へ投与することを含み、該方法は対象中のＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を効果的に増加させる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で作製された細胞集団、ならびにこれらの細胞集団と医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
さらなる一態様では、本発明は細胞送達系を提供する。これらの細胞送達系としては、本明細書に記載の方法により作製された１つまたは複数の細胞を含む貯蔵容器、医薬として許容可能な担体、ならびに送達デバイス（例えば、貯蔵容器と流体が接触する針またはカニューレ）が挙げられる。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、熱産生ＢＭＰで処理した幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））細胞集団を含む組成物を提供する。一部の場合では、これらの細胞は非ふるえ熱産生能を有する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「治療」とは任意の手段で疾患または障害の１つまたは複数の症状が緩和されるか、あるいは有益に改変されることを意味する。本明細書で使用される場合、特定の障害の症状の緩和とは、本発明の組成物および方法による治療に起因または関連し得る、永続的か一時的か、持続的か一過性かを問わない症状の任意の軽減を指す。
【００２８】
「有効量」および「治療に有効」という用語は、本明細書で使用される場合、一定期間使用される（急性もしくは慢性投与および断続的もしくは連続的投与など）１つまたは複数の本明細書に記載の組成物の、意図した効果または生理的転帰を得るための投与という脈絡において有効な量または濃度を指す。
【００２９】
本明細書全体で、「対象」という用語は、本発明の方法により治療を提供する動物、ヒトまたは非ヒト、齧歯類または非齧歯類について述べるために使用される。家畜と非家畜の適用が意図される。この用語は、哺乳類、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類（マウスおよびラットなど）、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含むが、これらに限定されない。典型的な対象としては、ヒト、家畜、および飼育ペット（ネコおよびイヌなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象（例えば、肥満のヒト対象）である。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳類、例えば、実験動物、愛玩動物、または食用動物（例えば、食用に飼育されたウシ、ブタ、またはヒツジ）である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「単離した」もしくは「精製した」ポリペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質は、タンパク質を得た細胞もしくは組織由来の細胞物質もしくはその他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成時の化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは選択されたタンパク質の調製物において、選択されないタンパク質または化学的前駆体が乾燥重量で約３０％未満（例えば、２０％、１０％、または５％未満）であることを意味する。このような選択されないタンパク質は本明細書で「汚染タンパク質」とも呼ぶ。単離した治療タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが組換え生産される場合、それらは実質的に培地を含まない、すなわち、培地成分がそのタンパク質調製物の約２０体積％未満（例えば、約１０体積％または５体積％未満）であり得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「肥満」とは、対象の体重が基準表により対象の理想体重を２０％以上（例えば、２５％、３０％、４０％、および５０％、または５０％超）超過する、対象の障害を指す。肥満は、ボディマス指数（ＢＭＩ）３０以上（例えば、３０〜３５および３５〜４０、または４０超）の個体も意味し得る。例えば、肥満（１度）と診断された対象のＢＭＩ範囲は３０〜３４．９である。肥満（２度）の対象のＢＭＩ範囲は３５．０〜３９．９である。肥満（３度）対象のＢＭＩは４０超である。
本明細書で使用される場合、「過体重」とは、ＢＭＩ範囲が２５．０〜２９．９である対象を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、自己複製能と、多くの異なる細胞系統への分化能の両方を有する（多能性である）。「前駆細胞」とは、幹細胞の表現型と類似した表現型を有する幹細胞の部分集合を指す。前駆細胞は自己複製能を有し、典型的には複能性である。
【００３３】
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発
明に用いるための方法および材料が本明細書に記載されており；他の、当該技術分野において周知である適切な方法および材料も使用できる。これらの材料、方法、および実施例は例証するためのみに用いられており、その制限を成すことは意図していない。本明細書で述べたすべての刊行物、特許出願、特許、データベースエントリー、およびその他の参考文献はそれらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】（図１Ａ）褐色前駆脂肪細胞を含むペトリ皿の一連の画像である。（図１Ｂ）白色前駆脂肪細胞の一連の画像である。示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いて細胞を処理し、オイルレッドＯを用いて染色して、脂質蓄積を評価した。対照細胞はＢＭＰに曝露しなかった。脂質蓄積は、濃く染色されて紅色がかった細胞により示されている。
【図２Ａ】定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した、示されたＢＭＰに曝露した褐色前駆脂肪細胞内の脱共役タンパク質（ＵＣＰ）と細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）の発現を示す棒グラフである。対照細胞はＢＭＰに曝露しなかった。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】ＵＣＰ−１とβ−チューブリンに特異的な抗体により調べた免疫ブロット画像である。β−チューブリンを負荷対照として示す。
【図３】オイルレッドＯ染色した、対照細胞（Ａ）とＢＭＰ−７曝露細胞（Ｂ）の写真を示す画像である。脂質蓄積は、濃く染色されて紅色がかった細胞により示されている。脂肪滴も両画像ではっきりと視認できる。
【図４】（図４Ａ）定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した、対照細胞とＢＭＰ−７曝露細胞内のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪酸結合タンパク質４（ａＰ２）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、ＣＩＤＥＡ、およびＵＣＰ−１発現を示す棒グラフである。結果を、対照細胞に対して増加した割合として表す。（図４Ｂ）対照細胞およびＢＭＰ−７曝露細胞におけるｃＡＭＰに誘導されたＵＣＰ−１発現を示す棒グラフである。ＵＣＰ−１処理単独を示す棒は、ｃＡＭＰ対照の棒として用いた。
【図５】（図５Ａ−Ｃ）骨格筋から単離し、ＢＭＰ７で処理して、脂質蓄積を評価するためにオイルレッドＯ（ＯＲＯ）で染色したＳｃａ−１（＋）細胞の画像である。対照細胞はＢＭＰに曝露しなかった。脂質蓄積は、濃く染色されて紅色がかった細胞により示されている。
【図６】（図６Ａ）ＦＡＣＳを用いて取得したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞集団を示す散布図である。（図６Ｂ〜６Ｃ）フローサイトメトリーを用いて評価したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞表面上のさまざまなマーカーの存在または不在を示す折れ線グラフである。矢印は染色された細胞を示す。
【図７】（図７Ａ−Ｎ）ＢＭＰ−７曝露細胞内で、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて経時的に検出されたマーカー値を示す折れ線グラフである。矢印はＢＭＰ７曝露細胞において観察された結果を示す。
【図８】対照細胞およびＢＭＰ−７曝露細胞においてｃＡＭＰに誘導されたＵＣＰ−１発現を示す棒グラフである。ＵＣＰ−１処理単独を示す棒は、ｃＡＭＰ対照の棒として用いた。
【図９】（図９Ａ−Ｆ）一連の６枚の顕微鏡写真である。９Ａ、９Ｃ、および９Ｅは、肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）（９Ａ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）（９Ｃ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）（９Ｅ）からそれぞれ単離したＢＭＰ７未処理のＳｃａ−１（＋）細胞を示す（対照）。９Ｂは肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）から単離した細胞を示し；９Ｄは皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）由来細胞であり、９Ｆは内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）由来細胞を示し、それぞれＢＭＰ７で処理した（ＢＭＰ７）。
【図１０Ａ】肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）から単離した細胞内の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ；Ａ）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）から単離した細胞内の脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１；Ｂ）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図１１】肥満抵抗性マウス（１２９）および肥満素因を有するマウス（Ｂ６）から単離した総Ｓｃａ−１（＋）細胞を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】肥満抵抗性マウス（１２９）および肥満素因を有するマウス（Ｂ６）から単離してＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞内のＵＣＰ−１発現レベルを示す棒グラフである。未処理細胞を対照として示す。
【図１２Ｂ】肥満抵抗性マウス（１２９）および肥満素因を有するマウス（Ｂ６）から単離してＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞内のＰＰＡＲγ発現レベルを示す棒グラフである。未処理細胞を対照として示す。
【図１３】（図１３Ａ−Ｄ）蛍光顕微鏡的画像である。１３Ａと１３Ｂは、ＢＭＰ７で処理して移植したＳｃａ−１（＋）緑色蛍光タンパク質細胞（移植後１０日間）を示す。移植細胞なしの対照画像を１３Ａと１３Ｃに示す。右図（図１３Ｂと１３Ｄ）に示した移植したＧＦＰ細胞の方が、より濃色の細胞に見える。
【図１４】（図１４Ａ−Ｆ）ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）緑色蛍光タンパク質細胞を移植した脂肪パッドの切片を示す顕微鏡的画像である。切片は非緑色蛍光タンパク質陽性レシピエントマウス由来である。緑色蛍光タンパク質陽性細胞は、注入から１０日後のレシピエントマウスにおいて落射蛍光法により検出された。元の倍率は２００倍である。
【図１５】（図１５Ａ−Ｆ）ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４またはビヒクル対照（Ｃ）で処理した筋肉由来Ｓｃａ−１（＋）細胞内のＵＣＰ−１、Ｃｉｄｅａ、ＰＰＡＲｇ、ＦＡＳ、ＭｙｏｇｅｎｉｎおよびＭｙｏＤ発現レベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、とりわけ、対象の肥満ならびに体重関連の疾患および障害（下記の病状など）を治療するために対象におけるＢＡＴ値および／または機能を増加させるのに有用な組成物および方法を提供する。これらの方法は、定義された前駆細胞（例えば、ＢＡＴ細胞への分化能を有する前駆細胞）の部分集合のＢＡＴ細胞系統への分化または指向を促進することを含む。より具体的には、本開示は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）で処理した場合に幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞がＢＡＴ細胞系統への分化能または指向能を有するという発見に少なくともある程度基づく。本明細書に記載のこれらの組成物および方法は、ＢＡＴの細胞数および／または機能を増加させ、および／またはＢＡＴ：ＷＡＴ細胞比率を増加させ、それにより、対象の肥満ならびに肥満関連の疾患および障害を治療するために使用できる。
【００３７】
本明細書に記載のいくつかの方法は、ＢＭＰシグナル伝達を増加させる薬剤で処理し、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞の移植を含む。通常、当該方法は、ＢＭＰシグナル伝達を増加させるのに十分な量の化合物による前駆細胞（例えば、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞）の処理（例えば、接触）、およびその後のＢＭＰ活性化Ｓｃａ−１（＋）細胞（例えば、少なくとも１つの細胞またはかかる細胞の集団）の対象への移植を含む。適切な薬剤としては、ＢＭＰ自体（例えば、組換えタンパク質）、またはＢＭＰをコードする核酸、および／またはＢＭＰシグナル伝達を増加させる薬剤（例えば、低分子、抗体および抗体断片、医薬品、ならびにその他の生物学的薬剤）を挙げることができる。いくつ
かの実施形態では、これらの細胞の処理として、ＢＭＰ２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドを発現するためのインビトロ細胞の遺伝子組換えが挙げられる。次いで、これらの細胞を対象に投与する。かかる遺伝子組換えされたＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団も本発明の範囲内に包含される。他の化合物は本明細書に記載されている。
【００３８】
細胞種
本明細書に記載の方法における使用に適した細胞としては、幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞（例えば、哺乳類Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞）が挙げられる。Ｓｃａ−１は１８ｋＤａグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー表面タンパク質であり、造血幹細胞と組織常在前駆細胞の両方において幹細胞マーカーとして役立つ。本開示において有用なＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、各種組織および臓器（例えば、骨格筋、前立腺、真皮、心血管系、乳腺、肝臓、新生児皮膚、頭蓋冠、骨髄、腸、および脂肪組織（例えば、脂肪組織蓄積）が挙げられるが、これらに限定されない）から単離できる。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞は骨格筋（例えば、骨格筋束）から単離する。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞は脂肪組織（例えば、脂肪蓄積）から単離する。
【００３９】
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は単能性、複能性、および多能性であり得、間葉源であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は非筋原性前駆細胞である。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は非多能性細胞から人工的に生成された（例えば、分化または部分的に分化した）多能性幹細胞であり得る。かかる細胞は当該技術分野において、誘導された多能性幹細胞として知られており、一般にｉＰＳまたはｉＰＳＣと略される（総説については、例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ９：７２５−７２９， ２００８を参照されたい）。
【００４０】
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は１つまたは複数の細胞表面発現マーカーの存在または不在を測定することにより同定できる。Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の同定に使用できる模範的な細胞表面マーカーは、Ｓｃａ−１、ＣＤ４５、Ｍａｃ−１、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、デスミン、ビメンチン、およびｃ−ｋｉｔが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）陽性細胞はＳｃａ−１を検出することにより同定できる。代替的にまたは追加で、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は追加の細胞表面マーカーを検出することにより同定できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において有用なＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４５および／またはＭａｃ−１陰性であり、例えば、細胞はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）、Ｓｃａ−１（＋）／Ｍａｃ−１、またはＳｃａ−１（＋）／Ｃｄ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ２９＋細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ２９＋／Ｃｄ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は１つまたは複数の次の細胞表面マーカー、すなわちＣＤ２９＋、ＣＤ３４＋、Ｃｄ４５（−）、Ｍａｃ−１（−）、およびＣＤ１１７（−）を有するＳｃａ−１（＋）細胞であり得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の同定後、例えば、細胞系の同一性をさらに特性化するおよび／または確認するために、追加の細胞表面マーカーをＳｃａ−１（＋）前駆細胞表面上で同定できる。例えば、Ｓｃａ−１（＋）細胞は、他のマーカー（例えば、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、デスミン、ビメンチン、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、およびｃ−ｋｉｔが挙
げられるが、これらに限定されない）の細胞表面上での発現を測定するために評価できる。
【００４３】
細胞集団を確定した細胞表面マーカー（例えば、Ｓｃａ−１）によりいったん同定後、かかる細胞集団を同定、単離、および濃縮する方法は日常的であり、当該技術分野において周知である。かかる方法としては、例えば、免疫磁気細胞選別機、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）、組織培養プレートとフラスコへの付着、もしくは所望の幹細胞の増殖に有利な条件下での培養、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。かかる方法を用いて、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞またはＳｃａ−１（＋）細胞集団を単離、精製、および／または濃縮（例えば、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞集団内の細胞の少なくとも６０％、例えば、７０％、８０％、９０％または９０％超がＳｃａ−１（＋）細胞であるように）できる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＳｃａ−１（＋）細胞を、同定、単離、および／または濃縮せずに取得できる。例えば、Ｓｃａ−１（＋）細胞は細胞寄託機関（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手できる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、単離したＳｃａ−１（＋）細胞、クローン、または集団は、より大きな細胞集団を得るために、標準的な細胞培養技術を用いて培養できる。
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞を液体窒素中で保存できる。液体窒素中で保存するための細胞調製に要される技術および液体窒素中でかかる細胞を保存する方法は、日常的であり、当該技術分野において周知である。
【００４６】
「初代細胞」という用語は、哺乳類組織源から単離した細胞懸濁液中に（プレートする前、すなわち、皿またはフラスコなどの組織増殖培養基質に取り付ける前に）存在する細胞、組織由来の外植片に存在する細胞（前者のいずれも初めてプレートした細胞）、およびこれらのプレートした細胞由来の細胞懸濁液を含む。「二次細胞」または「細胞株」という用語は、培養において続く全工程の細胞を指す。二次細胞とは、１回または複数回継代した二次細胞からなる細胞株である。
【００４７】
初代幹細胞および二次幹細胞は各種組織から取得でき、培養物中で維持および増殖できる細胞種を含む。初代細胞は好ましくはＢＭＰで処理した細胞を投与すべき個体または動物から取得する。しかしながら、初代細胞はドナー（例えば、レシピエント以外の個体、典型的には同一種、好ましくは免疫的に適合する個体）からも取得できる。かかる細胞を取得および培養する方法は当該技術分野において周知である。
【００４８】
当該方法は、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の、例えば、所望サイズのクローン細胞株か異種細胞株のいずれかを（例えば、ＢＭＰ活性化の前もしくは後に、個体に治療効果をもたらすのに十分な数、または安定した細胞系を確立するのに十分な数）産生するのに十分な二重測定期間を可能にすることを含み得る。トランスフェクトしないで代わりにＢＭＰで処理した場合、これらの細胞は対象に移植前にＢＭＰ不在下でしばらく、次いでＢＭＰ存在下でしばらく（例えば、１、２、３日、または３日超）培養できる。これらの細胞は、移植前に任意の汚染物質（ＢＭＰまたは増殖培地成分など）を除去するため、移植前に（例えば、等張ＰＢＳ中で）洗浄できる。必要な細胞数は可変であり、各種要因（トランスフェクトした細胞の使用、トランスフェクトした細胞中の外因性ＤＮＡの機能レベル、トランスフェクトした細胞の移植部位（例えば、使用できる細胞数は移植の解剖位置により制限される）、ならびに対象の年齢、表面積、および臨床病態が挙げられるが、これらに限定されない）に応じて変わる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰで処理した幹細胞集団は、少なくとも１０７、１０８、１０９、または１０９を超える細胞を含む。
【００４９】
ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞は、増強したＢＭＰシグナル伝達（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達）レベルを有するＳｃａ−１（＋）細胞であり、ここでＢＭＰシグナル伝達レベルは直接的なヒトの介入により増加している。ＢＭＰシグナル伝達は、当該技術分野において周知であるか本明細書に記載の任意の方法により（例えば、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物（例えば、ＢＭＰポリペプチドまたは核酸）によるこれらの細胞の処理により）これらの細胞内で増強できる。本明細書に記載の方法により活性化した幹細胞集団も本発明内に包含される。任意に、ＢＭＰで処理した細胞集団は、例えば、保存または移植のために、医薬として許容可能な担体中で懸濁できる。本明細書で使用される場合、「医薬として許容可能な担体」という言葉は、これらの細胞の医薬としての投与および生存性と適合する、任意かつすべての溶媒、媒体、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、などを含むことを意図している。通常、これらの細胞は無菌状態で維持される。製薬的活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は周知である。活性化合物と適合しない従来の媒体または薬剤はいずれも除いた上で、かかる媒体を本発明の組成物に使用できる。補充的活性化合物もこの組成物に組み込むことができる。
【００５０】
当該細胞は自己由来、同種異系由来、または異種由来であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象からの幹細胞集団の取得（任意に、精製された幹細胞集団を取得するためのこの幹細胞の培養および／または濃縮）、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させてこの幹細胞を活性化させる薬剤による幹細胞の処理、および除去した対象と同じ対象の細胞の移植を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの細胞は同種異系由来または異種由来であり、必要に応じて、これらの細胞の拒絶反応を予防するために免疫抑制剤を投与できる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物に使用されるＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、１つまたは複数のＢＭＰ受容体（例えば、Ｉ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体）を発現する。
【００５２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物は、完全長のまたは切断されたＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ、ポリペプチド、およびペプチド）である。
【００５３】
ＢＭＰは形質転換増殖因子βスーパーファミリーメンバーであり、胚発育における複数の重要段階ならびに生涯にわたり関与する（Ｋｉｓｈｉｇａｍｉ ａｎｄ Ｍｉｓｈｉｎａ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ．Ｒｅｖ． １６：２６５−２７８ （２００５）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． ２２：２３３−２４１ （２００４）； Ｙａｍａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ９１：５１９−５３４ （２００４））。ＢＭＰは脂肪細胞発達における異なる２段階において役割を果たすことが示されている。まず、ＢＭＰ−２と４は、好適な条件下で、複能性間葉細胞および骨髄間質細胞の脂肪細胞への分化を刺激する（Ｂｕｔｔｅｒｗｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ２４：１６３Ｓ （１９９６）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４２：２９５−３０５ （１９９８）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８２：１８７−１９９ （２００１）； Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ．Ａ． １０１：９６０７−９６１１ （２００４））。加えて、ＢＭＰは方向付けられた白色前駆脂肪細胞への分化も刺激する（Ｓｏｔｔｉｌｅ ａｎｄ Ｓｅｕｗｅｎ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４７５：２０１−２０４ （２０００）； Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２３：７２３０−７２４２
（２００３））。しかしながら、他の試験では、ＢＭＰ−２は脂肪細胞への分化を抑制
し、ホメオボックス遺伝子であるＭｓｘ２を介して複能性間葉前駆体における骨形成を促進したことが示された（Ｉｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７９：３４０１５−３４０２２ （２００４）； Ｓ．Ｌ． Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８：４５９６９−４５９７７ （２００３））。
【００５４】
ＢＭＰは、ＳＭＡＤタンパク質またはｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を介して信号を送る特異的Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体複合体であるＲＩａ、ＲＩｂ、およびＲＩＩに結合する。ＢＭＰは多くの態様の組織発達および形態形成（胚形成中の骨形成、出生後の増殖、リモデリングおよび骨格再生のプロセスなど）における重要事象の重要な制御因子である。ヒト組織とマウス組織の両方における局在試験により、脂肪、心臓、肺、小腸、下肢芽および歯におけるさまざまなＢＭＰのｍＲＮＡ高レベルの発現およびタンパク質合成が実証されている。
【００５５】
ＢＭＰは骨および軟骨の障害または創傷の治療において臨床で用いられている。組換えＢＭＰの効果的な臨床的使用はＥｉｎｈｏｒｎ， Ｊ． Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ
Ｓｕｒｇｅｒｙ ８５Ａ：８２−８８ （２００３）、およびＳａｎｄｈｕ， Ｓｐｉｎｅ ２８（１５）：Ｓ６４−７３ （２００３）にて論じられている。ＢＭＰポリペプチド（例えば、成熟ＢＭＰポリペプチド）自体が実行可能な治療化合物である。なぜならＢＭＰは、標的細胞に取り込まれてそこで活性を発揮する、分泌された低級タンパク質であるからである。本明細書ではヒトタンパク質について記載しているが、処理した細胞の意図したレシピエントが別の種である場合、その種（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギ）由来の相同タンパク質も使用できることを当業者は理解するであろう。かかる相同タンパク質は、例えば、当該技術分野において周知である方法を用いて、例えば、標的種において同定された同族体のための使用可能なデータベース（例えば、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベース）を検索して同定できる。
【００５６】
本明細書に記載の、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および−７は褐色脂肪細胞への分化に関与し、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７を有するＳｃａ−１（＋）前駆細胞の処理は褐色脂肪細胞分化を促進する。したがって、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７は、脂肪関連障害（肥満など）および関連障害（糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖症、高脂質血症、および高コレステロール血症など）の治療上、診断上および創薬上の標的である。通常、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団の対象への移植を含む。
【００５７】
本明細書に記載の方法における使用に適したＢＭＰは以下を含む。
ＢＭＰ−２
ＢＭＰ−２は長さ３９６個のアミノ酸であり、ヒト染色体の２０ｐ１２に位置する。ヒトＢＭＰ−２のヌクレオチド配列とアミノ酸配列はＷｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（４８８５）：１５２８−１５３４ （１９８８）に開示されている。ＢＭＰ２は形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する。骨形成タンパク質は骨形成を誘導し、ＢＭＰ２は進行性骨化性（筋炎）線維異形成症の常染色体優性遺伝性疾患の候補遺伝子である。骨形成タンパク質２は、前筋原性細胞内の用量依存性ＰＡＸ３を発現させることによって筋形成を調節し、ＳＯＸ９を通してＳＨＭ管理下、中胚葉内で発現する。
【００５８】
ヒトＢＭＰ−２を以下に示す。アミノ酸３８〜２６８はＴＧＦβプロペプチドドメインであり、２９１〜３９６はＴＧＦβファミリーＮ末端ドメインである。アミノ酸２８３〜３９６は成熟ペプチドである。この配列はＷｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４ （１９８８）に説明されている。
【００５９】
１ ＭＶＡＧＴＲＣＬＬＡ ＬＬＬＰＱＶＬＬＧＧ ＡＡＧＬＶＰＥＬＧＲ ＲＫＦＡＡＡＳＳＧＲ ＰＳＳＱＰＳＤＥＶＬ ＳＥＦＥＬＲＬＬＳＭ
６１ ＦＧＬＫＱＲＰＴＰＳ ＲＤＡＶＶＰＰＹＭＬ ＤＬＹＲＲＨＳＧＱＰ ＧＳＰＡＰＤＨＲＬＥ ＲＡＡＳＲＡＮＴＶＲ ＳＦＨＨＥＥＳＬＥＥ
１２１ ＬＰＥＴＳＧＫＴＴＲ ＲＦＦＦＮＬＳＳＩＰ ＴＥＥＦＩＴＳＡＥＬ ＱＶＦＲＥＱＭＱＤＡ ＬＧＮＮＳＳＦＨＨＲ ＩＮＩＹＥＩＩＫＰＡ
１８１ ＴＡＮＳＫＦＰＶＴＲ ＬＬＤＴＲＬＶＮＱＮ ＡＳＲＷＥＳＦＤＶＴ ＰＡＶＭＲＷＴＡＱＧ ＨＡＮＨＧＦＶＶＥＶ ＡＨＬＥＥＫＱＧＶＳ
２４１ ＫＲＨＶＲＩＳＲＳＬ ＨＱＤＥＨＳＷＳＱＩ ＲＰＬＬＶＴＦＧＨＤ ＧＫＧＨＰＬＨＫＲＥ ＫＲＱＡＫＨＫＱＲＫ ＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰ
３０１ ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷ ＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹ ＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰ ＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴ ＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮ ＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣ
３６１ ＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳ ＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶ ＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶ ＥＧＣＧＣＲ （配列番号１）
ＢＭＰ−２の成熟形態は、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖、および４つの潜在的なジスルフィド架橋を含む。ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１２６４３；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：９２６を参照されたい。
【００６０】
ＢＭＰ−４
ＢＭＰ−４は軟骨および骨形成を誘導し、中胚葉誘導、歯の発達、肢形成および骨折修復において重要である。ＢＭＰ−４プレプロタンパク質配列を以下に示す。アミノ酸４１〜２７６はＴＧＦβプロペプチドドメインであり、３０２〜４０８はＴＧＦβファミリーＮ末端ドメインである。アミノ酸２９３〜４０８は成熟ペプチドである。この配列はＷｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４ （１９８８）に説明されている。
【００６１】
１ ＭＩＰＧＮＲＭＬＭＶ ＶＬＬＣＱＶＬＬＧＧ ＡＳＨＡＳＬＩＰＥＴ ＧＫＫＫＶＡＥＩＱＧ ＨＡＧＧＲＲＳＧＱＳ ＨＥＬＬＲＤＦＥＡＴ
６１ ＬＬＱＭＦＧＬＲＲＲ ＰＱＰＳＫＳＡＶＩＰ ＤＹＭＲＤＬＹＲＬＱ ＳＧＥＥＥＥＥＱＩＨ ＳＴＧＬＥＹＰＥＲＰ ＡＳＲＡＮＴＶＲＳＦ
１２１ ＨＨＥＥＨＬＥＮＩＰ ＧＴＳＥＮＳＡＦＲＦ ＬＦＮＬＳＳＩＰＥＮ ＥＡＩＳＳＡＥＬＲＬ ＦＲＥＱＶＤＱＧＰＤ ＷＥＲＧＦＨＲＩＮＩ
１８１ ＹＥＶＭＫＰＰＡＥＶ ＶＰＧＨＬＩＴＲＬＬ ＤＴＲＬＶＨＨＮＶＴ ＲＷＥＴＦＤＶＳＰＡ ＶＬＲＷＴＲＥＫＱＰ ＮＹＧＬＡＩＥＶＴＨ
２４１ ＬＨＱＴＲＴＨＱＧＱ ＨＶＲＩＳＲＳＬＰＱ ＧＳＧＮＷＡＱＬＲＰ ＬＬＶＴＦＧＨＤＧＲ ＧＨＡＬＴＲＲＲＲＡ ＫＲＳＰＫＨＨＳＱＲ
３０１ ＡＲＫＫＮＫＮＣＲＲ ＨＳＬＹＶＤＦＳＤＶ ＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰ ＧＹＱＡＦＹＣＨＧＤ ＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮ ＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬ
３６１ ＶＮＳＶＮＳＳＩＰＫ ＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡ ＩＳＭＬＹＬＤＥＹＤ ＫＶＶＬＫＮＹＱＥＭ ＶＶＥＧＣＧＣＲ （配列番号２）
ＢＭＰ−４の成熟形態は、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖を含む。変異型はＶ１５２がＡである形で存在する。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１２６４４；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：７２４７を参照されたい。
【００６２】
ＢＭＰ−５
ＢＭＰ−５プレプロタンパク質は、以下に示すとおり４５４個のアミノ酸タンパク質である。ＢＭＰ−５は軟骨および骨形成を誘導する。この配列はＣｅｌｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７， ９８４３−９８４７， １９９０に説明されている。
【００６３】
１ ＭＨＬＴＶＦＬＬＫＧ ＩＶＧＦＬＷＳＣＷＶ ＬＶＧＹＡＫＧＧＬＧ ＤＮＨＶＨＳＳＦＩＹ ＲＲＬＲＮＨＥＲＲＥ ＩＱＲＥＩＬＳＩＬＧ
６１ ＬＰＨＲＰＲＰＦＳＰ ＧＫＱＡＳＳＡＰＬＦ ＭＬＤＬＹＮＡＭＴＮ ＥＥＮＰＥＥＳＥＹＳ ＶＲＡＳＬＡＥＥＴＲ ＧＡＲＫＧＹＰＡＳＰ
１２１ ＮＧＹＰＲＲＩＱＬＳ ＲＴＴＰＬＴＴＱＳＰ ＰＬＡＳＬＨＤＴＮＦ ＬＮＤＡＤＭＶＭＳＦ ＶＮＬＶＥＲＤＫＤＦ ＳＨＱＲＲＨＹＫＥＦ
１８１ ＲＦＤＬＴＱＩＰＨＧ ＥＡＶＴＡＡＥＦＲＩ ＹＫＤＲＳＮＮＲＦＥ ＮＥＴＩＫＩＳＩＹＱ ＩＩＫＥＹＴＮＲＤＡ ＤＬＦＬＬＤＴＲＫＡ
２４１ ＱＡＬＤＶＧＷＬＶＦ ＤＩＴＶＴＳＮＨＷＶ ＩＮＰＱＮＮＬＧＬＱ ＬＣＡＥＴＧＤＧＲＳ ＩＮＶＫＳＡＧＬＶＧ ＲＱＧＰＱＳＫＱＰＦ
３０１ ＭＶＡＦＦＫＡＳＥＶ ＬＬＲＳＶＲＡＡＮＫ ＲＫＮＱＮＲＮＫＳＳ ＳＨＱＤＳＳＲＭＳＳ ＶＧＤＹＮＴＳＥＱＫ ＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ
３６１ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷ ＩＩＡＰＥＧＹＡＡＦ ＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬ ＮＡＨＭＮＡＴＮＨＡ ＩＶＱＴＬＶＨＬＭＦ ＰＤＨＶＰＫＰＣＣＡ
４２１ ＰＴＫＬＮＡＩＳＶＬ ＹＦＤＤＳＳＮＶＩＬ ＫＫＹＲＮＭＶＶＲＳ ＣＧＣＨ （配列番号３）
成熟ＢＭＰ−５タンパク質は配列番号３のアミノ酸３２３〜４５４であると考えられ、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖、および４つの潜在的なジスルフィド架橋を有する。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２２００３；Ｑ９Ｈ５４７；またはＱ９ＮＴＭ５；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２２４１２を参照されたい。
【００６４】
ＢＭＰ−６
ＢＭＰ−６は軟骨細胞分化の自己分泌刺激物であり、胚神経発達、および泌尿系、ならびに肝臓およびケラチノサイトの増殖および分化に関与する。ＢＭＰ−６ノックアウトマウスは生存可能であり、胸骨の骨化においてわずかな遅延を示す。ＢＭＰ−６（前駆体）は、５７ｋＤタンパク質、長さ５１３個のアミノ酸であり、ヒトの染色体６ｐ２４に局所する。ヒトＢＭＰ−６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は米国特許第５，１８７，０７６号に開示されている。ＢＭＰ−６は、切断された、測定分子量約１５Ｋｄの１３２個のアミノ酸成熟ポリペプチドを生じる前駆体分子として合成されると予測される。ＢＭＰ−６の成熟形態は、３つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖を含む。活性ＢＭＰ−６タンパク分子は二量体と思われる。ＢＭＰ−６の成熟形態の加工は、関連タンパク質ＴＧＦβの加工と類似の方法でＮ末端領域の二量化および除去に関与する（Ｇｅｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４１６２ （１９８８）； Ｄｅｒｎｙｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７０１ （１９８５））。ヒトＢＭＰ−６前駆体を以下に示す。成熟ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸３７４〜５１３を含むと考えられる。他の活性ＢＭＰ−６ポリペプチドとしては、配列番号４のアミノ酸３８２〜５１３、３８８〜５１３および４１２〜５１３を含むポリペプチドが挙げられる。
【００６５】
ＭＰＧＬＧＲＲＡＱＷ ＬＣＷＷＷＧＬＬＣＳ ＣＣＧＰＰＰＬＲＰＰ ＬＰＡＡＡＡＡＡＡＧ ＧＱＬＬＧＤＧＧＳＰ ＧＲＴＥＱＰＰＰＳＰ ６１
ＱＳＳＳＧＦＬＹＲＲ ＬＫＴＱＥＫＲＥＭＱ ＫＥＩＬＳＶＬＧＬＰ ＨＲＰＲＰＬＨＧＬＱ ＱＰＱＰＰＡＬＲＱＱ ＥＥＱＱＱＱＱＱＬＰ １２１
ＲＧＥＰＰＰＧＲＬＫ ＳＡＰＬＦＭＬＤＬＹ ＮＡＬＳＡＤＮＤＥＤ ＧＡＳＥＧＥＲＱＱＳ ＷＰＨＥＡＡＳＳＳＱ ＲＲＱＰＰＰＧＡＡＨ １８１
ＰＬＮＲＫＳＬＬＡＰ ＧＳＧＳＧＧＡＳＰＬ ＴＳＡＱＤＳＡＦＬＮ ＤＡＤＭＶＭＳＦＶＮ ＬＶＥＹＤＫＥＦＳＰ ＲＱＲＨＨＫＥＦＫＦ ２４１
ＮＬＳＱＩＰＥＧＥＶ ＶＴＡＡＥＦＲＩＹＫ ＤＣＶＭＧＳＦＫＮＱ ＴＦＬＩＳＩＹＱＶＬ ＱＥＨＱＨＲＤＳＤＬ ＦＬＬＤＴＲＶＶＷＡ ３０１
ＳＥＥＧＷＬＥＦＤＩ ＴＡＴＳＮＬＷＶＶＴ ＰＱＨＮＭＧＬＱＬＳ ＶＶＴＲＤＧＶＨＶＨ ＰＲＡＡＧＬＶＧＲＤ ＧＰＹＤＫＱＰＦＭＶ ３６１
ＡＦＦＫＶＳＥＶＨＶ ＲＴＴＲＳＡＳＳＲＲ ＲＱＱＳＲＮＲＳＴＱ ＳＱＤＶＡＲＶＳＳＡ ＳＤＹＮＳＳＥＬＫＴ ＡＣＲＫＨＥＬＹＶＳ ４２１
ＦＱＤＬＧＷＱＤＷＩ ＩＡＰＫＧＹＡＡＮＹ ＣＤＧＥＣＳＦＰＬＮ ＡＨＭＮＡＴＮＨＡＩ ＶＱＴＬＶＨＬＭＮＰ ＥＹＶＰＫＰＣＣＡＰ ４８１
ＴＫＬＮＡＩＳＶＬＹ ＦＤＤＮＳＮＶＩＬＫ ＫＹＲＮＭＶＶＲＡＣ ＧＣＨ （配列番号４）
ヒトＢＭＰ−６プロモーターは特性化されており（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９８， １３９５（３）：２４７−５１を参照されたい）、本明細書に記載の方法に使用できる。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２２００４； ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：１３００を参照されたい。
【００６６】
ＢＭＰ−６の投与、アンチセンス処理、および定量についてはＢｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３８， Ｎｏ．７ ２８２０−２８２８）に記載されている。
【００６７】
ＢＭＰ−７
ＢＭＰ−７もＴＧＦβスーパーファミリーに属する。ＢＭＰ−７は軟骨および骨形成を誘導し、上皮骨形成の現象に関与する骨誘導因子であり得る。ＢＭＰ−７はカルシウム調節および骨恒常性、ならびに成人腸組織内の抗炎症反応の調節において役割を果たす。ＢＭＰ−７配列を以下に示す：
１ ＭＨＶＲＳＬＲＡＡＡ ＰＨＳＦＶＡＬＷＡＰ ＬＦＬＬＲＳＡＬＡＤ ＦＳＬＤＮＥＶＨＳＳ ＦＩＨＲＲＬＲＳＱＥ ＲＲＥＭＱＲＥＩＬＳ
６１ ＩＬＧＬＰＨＲＰＲＰ ＨＬＱＧＫＨＮＳＡＰ ＭＦＭＬＤＬＹＮＡＭ ＡＶＥＥＧＧＧＰＧＧ ＱＧＦＳＹＰＹＫＡＶ ＦＳＴＱＧＰＰＬＡＳ
１２１ ＬＱＤＳＨＦＬＴＤＡ ＤＭＶＭＳＦＶＮＬＶ ＥＨＤＫＥＦＦＨＰＲ ＹＨＨＲＥＦＲＦＤＬ ＳＫＩＰＥＧＥＡＶＴ ＡＡＥＦＲＩＹＫＤＹ
１８１ ＩＲＥＲＦＤＮＥＴＦ ＲＩＳＶＹＱＶＬＱＥ ＨＬＧＲＥＳＤＬＦＬ ＬＤＳＲＴＬＷＡＳＥ ＥＧＷＬＶＦＤＩＴＡ ＴＳＮＨＷＶＶＮＰＲ
２４１ ＨＮＬＧＬＱＬＳＶＥ ＴＬＤＧＱＳＩＮＰＫ ＬＡＧＬＩＧＲＨＧＰ ＱＮＫＱＰＦＭＶＡＦ ＦＫＡＴＥＶＨＦＲＳ ＩＲＳＴＧＳＫＱＲＳ
３０１ ＱＮＲＳＫＴＰＫＮＱ ＥＡＬＲＭＡＮＶＡＥ ＮＳＳＳＤＱＲＱＡＣ ＫＫＨＥＬＹＶＳＦＲ ＤＬＧＷＱＤＷＩＩＡ ＰＥＧＹＡＡＹＹＣＥ
３６１ ＧＥＣＡＦＰＬＮＳＹ ＭＮＡＴＮＨＡＩＶＱ ＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴ ＶＰＫＰＣＣＡＰＴＱ ＬＮＡＩＳＶＬＹＦＤ ＤＳＳＮＶＩＬＫＫＹ
４２１ ＲＮＭＶＶＲＡＣＧＣ Ｈ （配列番号５）
アミノ酸１〜２９は潜在的なシグナル配列である；３０〜４３１はプレプロペプチドであり、２９３〜４３１は成熟タンパク質である。ＢＭＰ−７の成熟形態は、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖、および４つの潜在的なジスルフィド架橋を含む。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１８０７５；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２０４１０を参照されたい。
【００６８】
本明細書に記載の組成物および方法は、１つまたは複数の上に示したＢＭＰ配列との同一性が少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％）であるアミノ酸配列の使用も意図する。本明細書で使用される場合、かかる配列もＢＭＰと呼ばれる。
【００６９】
２つの配列間の同一性の百分率を測定するため、これらの配列を最適比較目的で並べる（第一アミノ酸と第二アミノ酸の片方もしくは両方、または最適アライメントに要する核
酸配列にギャップを導入し、比較目的で非相同配列は無視できる）。比較目的で並べた基準配列の長さは少なくとも８０％である（いくつかの実施形態では、基準配列の長さの約８５％、９０％、９５％、または１００％を並べる）。次いで、対応位置のヌクレオチドまたは残基を比較する。第一配列の位置が、第二配列の対応位置と同じヌクレオチドまたは残基に占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の百分率は、これらの配列が共有する同一位置数の関数であり、２つの配列の最適アライメントのために導入を要するギャップ数、および各ギャップの長さが考慮される。
【００７０】
配列の比較および２つの配列間の同一性の百分率の測定は、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げることができる。例えば、２つのアミノ酸配列間の同一性の百分率はＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを用いて、ならびに１２ギャップペナルティ、４ギャップ延長ペナルティ、および５フレームシフトギャップペナルティを用いるブロッサム６２スコアリングマトリックス（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を用いて測定できる。
【００７１】
ＢＭＰは、組換え技術を用いてまたは化学合成を用いて生成できる。かかるポリペプチドを生成するための方法、およびかかるポリペプチド精製に要される方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ （ＣＳＨＬ
Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｔｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）を参照されたい。
【００７２】
ＢＭＰを修飾して、このタンパク質の薬物動態特性を改変することができる。例えば、かかる修飾は、より長い循環半減期、細胞取り込みの増大、標的組織への分布の改善、クリアランス低下および／または免疫原性低下をもたらし得る。ＢＭＰ治療活性の最適化に有用な多くのアプローチ（化学的修飾など）が当該技術分野において周知である。
【００７３】
発現系
ＢＭＰは組換えタンパク質として発現できる。組換えタンパク質において、発現系の選択は薬物動態特性に影響し得る。発現系間の翻訳後プロセスの相違により、分子サイズおよび電荷がさまざまな組換えタンパク質が生じ得、それは例えば、循環半減期、クリアランス率および免疫原性に影響し得る。このタンパク質の薬物動態特性は、好適な発現系選択（細菌性、ウイルス性、または哺乳類の発現系選択など）によって最適化される場合がある。治療タンパク質の発現系に有用な代表的な哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯＳ−１細胞系およびＣＶ−１細胞系である。
【００７４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞内でＢＭＰを発現させるために設計できる。例えば、本発明のタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳類細胞内で発現できる。適切な宿主細胞の詳細については、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ １９９０）で論じられている。あるいは、この組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写かつ翻訳できる。
【００７５】
化学的修飾
ＢＭＰは活性を維持しつつ薬物動態特性を向上させるために化学的に改変できる。このタンパク質を各種部分と共有結合させて、タンパク質の分子サイズおよび電荷を改変し、それによってこのタンパク質の薬物動態特性を改変することができる。この部分は好まし
くは非毒性および生体適合性である。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はタンパク質に共有結合できる（ペグ化）。各種ＰＥＧ分子が周知であり、および／または市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のカタログを参照されたい）。ペグ化によりタンパク質の安定性を向上でき、エピトープの立体的被覆により免疫原性を低下させることができ、および糸球体ろ過を減少することにより半減期を改善できる。（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｎｏ．６８０，
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ （１９９７）； Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ４０：４８５−５６３， ２００１）を参照されたい）。ＰＥＧ構築物として投与される治療タンパク質の例としては、Ａｄａｇｅｎ（商標登録）（ＰＥＧ−ＡＤＡ）およびＯｎｃｏｓｐａｒ（商標登録）（ペグ化アスパラギナーゼ）が挙げられる。別の実施形態では、このタンパク質はアミノ基を介して酸化デキストランに同様に結合できる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｃｕｒｒ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ． Ｈａｅｍａｔ．
Ｄｉｓ．， １：１−２２， ２００１を参照されたい）。さらに別の実施形態では、アルギニンオリゴマーのシクロスポリンＡへの共役により局所送達を促進できる（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ６：１２５３−１２５７， ２０００）。
【００７６】
さらに、このタンパク質は別のタンパク質に化学的結合して、例えば、（例えば、二機能性の架橋試薬を介して）担体タンパク質に架橋結合して長い循環半減期および改善された細胞取り込みを有する高分子量複合体を形成することが可能である。いくつかの実施形態では、この担体タンパク質は血清タンパク質（アルブミンなど）であり得る。別の実施形態では、この治療タンパク質は、（例えば、ヘテロ二機能性またはホモ二機能性の架橋試薬を介して）自身と架橋結合してホモ二量体、三量体、またはより高次の類似体を形成することが可能である（Ｓｔｙｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：１１８４−１１８８， １９９８を参照されたい）。この治療タンパク質の二量化もしくは三量化を通した分子量およびサイズの増加により、クリアランスを低下させることができる。
【００７７】
タンパク質剤形
タンパク質剤形は、最適化してもよい。例えば、ＢＭＰは担体系内で処方できる。この担体はコロイド系であり得る。このコロイド系はリポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。１つの実施形態では、この治療タンパク質は、タンパク質の完全性を維持しつつリポソームに封入される。当業者が理解するであろうように、リポソームを調製する各種方法がある。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｎａｌ．， ３３：３３７−４６２， １９８８； Ａｎｓｅｌｅｍ ｅｔ
ａｌ．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）を参照されたい）。リポソーム剤形はクリアランスを遅延化し、細胞取り込みを増大することができる（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．， ３４：９１５−９２３， ２０００を参照されたい）。
【００７８】
この担体はポリマー（例えば、生体分解性、生体適合性ポリマーマトリックス）でもあり得る。１つの実施形態では、この治療タンパク質はタンパク質の完全性を維持しつつポリマーマトリックスに埋め込むことができる。このポリマーは天然（ポリペプチド、タンパク質または多糖類など）でも、合成（ポリ（α−ヒドロキシ）酸など）でもよい。例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできている担体が挙げられる。１つの実施形態では、このポリマーはポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸／グリコ
ール酸共重合体（ＰＧＬＡ）である。この重合体マトリックスは各種形態およびサイズ（マイクロスフェアおよびナノスフェアなど）に調製および単離できる。ポリマー剤形は治療効果の持続時間を延長させることができる（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．， ３４：９１５−９２３， ２０００を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー剤形が臨床試験で用いられている（Ｋｏｚａｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｉｃｈ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２：５４８−５５２， １９９８を参照されたい）。
【００７９】
高分子マイクロスフェアの持続放出製剤の例は、ＰＣＴ国際公開特許第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号（いずれもＺａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号（Ｚａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＰＣＴ国際公開特許第００／３８６５１号（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号ならびにＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号では、塩凝集に対して安定したエリスロポエチン粒子を含有する重合体マトリックスについて述べられている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＢＭＰの細胞内への侵入を促進する細胞透過ペプチド配列（例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポルタン、またはｈＣＴ由来の細胞透過ペプチド）を含む、例えば、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ３：３１０−８， ２００１； Ｌａｎｇｅｌ， Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ ２００２）； Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｄｅｓ．， １１：３５９７−６１１， ２００５；およびＤｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ６２：１８３９−４９， ２００５を参照されたい。
【００８１】
ペプチド模倣物
いくつかの実施形態では、該ＢＭＰタンパク質はペプチド模倣物である（例えば、ペプチドまたは非ペプチドのペプチド模倣物のいずれか）。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成は当該技術分野において周知である。かかるペプチド模倣物としては、当該技術分野において周知である方法によりペプチド模倣物を産出するために修飾可能なＢＭＰが挙げられる。例えば、Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ， Ｗ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ （Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ １９９８）； Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ， Ｔｈｉｅｌｅ Ｖｅｒｌａｇ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００３）；およびＭａｙｏ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８：４５７４６， ２００３を参照されたい。一部の事例では、本明細書に開示されたペプチドおよび断片のこれらの修飾ペプチド模倣物バージョンは、非ペプチド模倣物ペプチドと比較して増強したインビボ安定性を示す。ペプチド模倣物の作製方法は、１つまたは複数（例えば、すべて）のＤ−アミノ酸エナンチオマーを有するペプチド配列中のアミノ酸の置換を含む。かかる配列は本明細書にて「レトロ」配列と呼ぶ。別の方法では、元のペプチドのアミノ酸残基のＮ末端からＣ末端までの順が修飾ペプチド模倣物におけるアミノ酸残基のＣ末端からＮ末端までの順になるように、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端の順が逆転する。かかる配列は「インベルソ」配列と呼ぶことができる。ペプチド模倣物はレトロとインベルソの両バージョン、すなわち、本明細書に開示されたペプチドの「レトロ−インベルソ」バージョンであり得る。Ｄ−アミノ酸からなる新規ペプチド模倣物はペプチド模倣物のアミノ酸残基のＮ末
端からＣ末端までの順が元のペプチドのアミノ酸残基のＣ末端からＮ末端までの順に相当するように配列できる。
【００８２】
ペプチド模倣物を作製するための他の方法としては、ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、アミノ酸の化学的に異なるが認識された機能的類似体、すなわち、人工アミノ酸類似体と置換することが挙げられる。人工アミノ酸類似体としては、β−アミノ酸、β−置換β−アミノ酸（「β３−アミノ酸」）、アミノ酸のリン類似体（α−アミノホスホン酸およびα−アミノホスフィン酸など）、および非ペプチド結合を有するアミノ酸が挙げられる。人工アミノ酸は、ペプチド模倣物（ペプトイドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドまたはエステル類似体）、β−ペプチド、環状ペプチド、オリゴウレアまたはオリゴカルバメートペプチド；または複素環分子など）の作製に使用できる。これらの配列は、例えば、アミノ末端のビオチニル化およびカルボキシ末端のアミド化により修飾できる。
【００８３】
本明細書に記載のペプチド（本明細書に記載の変異形態を含む）はいずれも、異種ポリペプチドをさらに含み得る。この異種ポリペプチドは、取り付いた（例えば、融合タンパク質として融合した）ペプチドの循環半減期を延長するポリペプチドであり得る。この異種ポリペプチドはアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたはその一部分）または免疫グロブリンの一部分（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）であり得る。この異種ポリペプチドはミトコンドリア透過性部分であり得る。
【００８４】
本開示は合成模倣化合物も意図する。当該技術分野において周知であるとおり、ペプチドは、カップリング剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）など）との反応により活性化したカルボキシル基にアミノ基を結合させることによって合成できる。活性化したカルボキシルに対する遊離アミノ基の攻撃は、ペプチド結合の形成およびジシクロヘキシル尿素の放出に至る。反応のために意図したアミノ基およびカルボキシル基以外の潜在的反応基を保護することが必要であり得る。例えば、活性化カルボキシル基を含む成分のα−アミノ基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基によりブロックできる。この保護基は続いてペプチドを希酸へ曝露することにより除去してインタクトなペプチド結合を残すことができる。この方法で、ペプチドは、不溶性マトリックス（ポリスチレンビードなど）に結合した成長ペプチド鎖にアミノ酸を段階的に添加する固体相方法によって容易に合成できる。まず、所望のペプチド配列のカルボキシル末端アミノ酸（アミノ保護基を有する）はポリスチレンビードに固定される。次いで、アミノ酸の保護基は除去される。次のアミノ酸（保護基を有する）をカップリング剤と共に添加する。この後、洗浄サイクルを行なう。このサイクルは必要に応じて反復する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示の模倣物は本明細書に記載のＢＭＰタンパク質相同配列を有するペプチドである。これらの模倣物としては、Ｌ−アミノ酸がそれらのＤ−異性体に置換されたペプチドが挙げられるが、これに限定されない。配列の相同性、およびより重要なことに統計的に有意な類似性を検討するための一般的な方法の１つは、Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎにより記載されたアルゴリズムを用いたモンテカルロ解析を用いてＺ値を得ることである。この解析によれば、６を超えるＺ値は有意である可能性を示し、１０を超えるＺ値は統計的に有意であるとみなされる（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ
Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ８５：２４４４−２４４８， １９８８； Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７：１４３５−１４４１， １９８５）。より一般的には、本明細書に記載のＢＭＰおよび上記の模倣物は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２１：５０２０−５０３１， １９８２； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ
Ｗｅｌｌｉｎｇｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ），
８２：５１３１−５１３５， １９８５； Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２８９：４４−６６， １９９７またはＧｕｙ ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２８９：６７−８３， １９９７によって記載されているティーバッグ（ｔｅａ−ｂａｇ）法またはペプチド固相合成法など、任意の周知の方法を用いて、または市販されている自動化シンセサイザーを用いて合成できる。
【００８６】
標的ペプチド
いくつかの実施形態では、ＢＭＰおよび／またはＢＭＰアゴニストはインビトロおよび／またはインビボＳｃａ−１（＋）細胞を標的とできる。具体的な細胞種および組織に対して化合物を標的とする方法は、当該技術分野において周知である。例えば、具体的な細胞もしくは組織に対するペプチドならびにその他の治療薬を標的とする組成物および方法は、意図した標的細胞もしくは組織（例えば、抗体もしくは抗体の抗原結合断片、ならびに短い親和性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）に独特もしくは特異的な抗原もしくはマーカーを標的とできる材料の使用を含む。いくつかの実施形態では、かかる材料はＳｃａ−１および／またはＣＤ２９に対して特異的であり得る。
【００８７】
一例として、ＢＭＰまたはＢＭＰアゴニストおよびＳｃａ−１標的部分（例えば、抗Ｓｃａ−１抗体またはその抗原結合断片）に結合したナノ粒子を使用できる。このＢＭＰと標的部分は、同じナノ粒子上にもあり得るし、異なるナノ粒子上にもあり得る。いくつかの実施形態では、この組成物は、ＢＭＰおよび離れている標的部分（例えば、Ｓｃａ−１標的部分に結合したナノ粒子）を含む。
【００８８】
多くの生体適合性ナノ粒子が当該技術分野において周知である（例えば、有機または無機ナノ粒子など）。リポソーム、デンドリマー、カーボンナノ材料および重合体ミセルは有機ナノ粒子の例である。量子ドットも使用できる。無機ナノ粒子としては、金属性ナノ粒子、例えば、Ａｕ、Ｎｉ、ＰｔおよびＴｉＯ２ナノ粒子が挙げられる。磁気ナノ粒子（例えば、デキストランまたはＰＥＧ分子で囲まれた１０〜２０ｎｍのＦｅ２＋および／またはＦｅ３＋核を有する球形ナノ結晶）も使用できる。いくつかの実施形態では、例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６（１）：８３−９０ （２００８）；米国特許第７０６０１２１号；同第７２３２４７４号；および米国特許公開第２００８／０１６６７０６号に記載されているようにコロイド金ナノ粒子が用いられる。適切なナノ粒子、および多機能性ナノ粒子の構築および使用方法については、例えば、Ｓａｎｖｉｃｅｎｓ ａｎｄ Ｍａｒｃｏ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２６（８）：４２５−４３３ （２００８）にて論じられている。
【００８９】
すべての実施形態において、このナノ粒子は官能基を介して本明細書に記載のＢＭＰおよび標的部分に取り付いている（結合している）。いくつかの実施形態では、このナノ粒子は官能基を含むポリマーに結合しており、また、互いに分散した金属酸化物を保つために役立つ。このポリマーは、合成ポリマー（ポリエチレングリコールまたはシランが挙げられるが、これらに限定されない）、天然ポリマー、もしくは合成ポリマーか天然ポリマーのいずれかの誘導体、またはこれらの組み合わせであり得る。有用なポリマーは親水性である。いくつかの実施形態では、ポリマー「コーティング」とは磁気金属酸化物周囲の連続的フィルムではなく、金属酸化物に取り付け、金属酸化物を囲む拡張ポリマー鎖の「メッシュ」または「曇状物」である。このポリマーは、多糖類および誘導体（デキストラン、プラナン、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、および／または還元したカルボキシメチルデキストランなど）を含有し得る。この金属酸化物は、互いに接触し、またはこのポリマーによって個々に封入または包囲される１つまたは複数の結晶集合体であり得る。
【００９０】
他の実施形態では、このナノ粒子は非重合体の官能基組成物に結合している。結合ポリ
マーなしで安定化した、機能的ナノ粒子を合成する方法は周知であり、これも本発明の範囲内である。かかる方法は、例えば、Ｈａｌｂｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ８０ （５−６）：３７９−９０， １９９８に記載されている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、このナノ粒子の全体サイズは直径約１〜１００ｎｍ未満（例えば、約２５〜７５ｎｍ、例えば、約４０〜６０ｎｍ、または約５０〜６０ｎｍ）である。いくつかの実施形態でのこのポリマー成分は、例えば、厚さ約５〜２０ｎｍ、または２０ｎｍ超のコーティング形態中にあり得る。このナノ粒子の全体サイズは約１５〜２００ｎｍ（例えば、約２０〜１００ｎｍ、約４０〜６０ｎｍ；または約６０ｎｍ）である。
【００９２】
抗体
いくつかの実施形態では、例えば、細胞を選択的に標的とするために、抗体を用いて、Ｓｃａ−１（＋）細胞またはＳｃａ−１（＋）細胞含有組織にＢＭＰを標的化できる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、このＢＭＰタンパク質は、（例えば、細胞内の）１つまたは複数のＢＭＰの発現および／または活性を増加させる抗体の代わりにまたはそれらと併せて使用できる。
【００９４】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全長の２本鎖免疫グロブリン分子ならびにその抗原結合部分および断片（合成変異型を含む）を指す。典型的な完全長の抗体は、２本の重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨと略す）、および２本の軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬと略す）を含む。抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、完全長の抗体の特異的な標的結合能を保持する１つまたは複数の断片を指す。抗原結合断片の例としては：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６ （１９８９））；ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬとＶＨは、別々の遺伝子にコードされるが、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６， １９８８；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３， １９８８を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を用いて結合できる。かかる単鎖抗体も「抗原結合断片」という用語に含まれる。
【００９５】
抗体および抗体断片の産生については、当該技術分野において詳述されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５， １９８６は、ヒト抗体ＣＤＲとマウス抗体ＣＤＲとの置換について開示している。Ｍａｒｘ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：４５５−４５６， １９８５では、マウス可変領域とヒト定常領域を有するキメラ抗体について論じられている。Ｒｏｄｗｅｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９９−１００， １９８９では、抗体ＣＤＲ情報から得られた低分子量認識素子について論じられている。Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３０５２：３６−３９， １９９１では、遺伝子組換えされたモノクローナル抗体（Ｆｖ断片誘導体、単鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体およびヒト化齧歯類抗体など
）について論じられている。Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７， １９８８はラット超可変領域が移植されたヒト抗体について開示している。Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６， １９８８はヒト抗体上へのマウス抗原結合部位の移植について教示している。
【００９６】
低分子薬物
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＭＰタンパク質の発現または活性を促進する薬物（例えば、低分子薬物）を提供する。いくつかの実施形態では、かかる低分子薬物は、本明細書に記載の薬物スクリーニング方法を用いて同定できる。好ましい実施形態では、本発明の低分子薬物は、細胞内のＢＭＰ活性および／または発現の増加を促進する。いくつかの実施形態では、低分子薬物は下記の薬物スクリーンを用いて同定される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰアゴニストは米国特許第７，４８２，３２９号に開示された分子、またはそのペプチド模倣物である。
ＢＭＰ核酸
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞由来は、（例えば、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に、あるいはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列なしでＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７、またはそのアゴニストをコードする）異種ヌクレオチド配列を含む外因性核酸とトランスフェクトして、一時的にまたは安定して、長期間にわたりコードした産物を産生することができる。異種アミノ酸は調節配列（例えば、プロモーター）でもあり得、内因性ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７配列の発現（例えば、構成的もしくは誘導可能な発現または上方制御）を惹起する。外因性核酸配列は、例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（かかる内容は参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、相同組換えによって初代細胞または二次細胞に導入できる。このトランスフェクトした細胞は、選択可能な表現型を付与してそれらの同定および単離を促進する選択可能なマーカーをコードするＤＮＡを含むこともできる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物としては、例えば、ＢＭＰ核酸（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７コード配列またはその活性断片）、および任意の：プロモーター配列、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来のプロモーター配列；エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来の５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来の３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列；またはＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の発現を増加させる別の配列が挙げられる。
【００９９】
本明細書に記載の核酸、例えば、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子構築物に組み込むことができる。本明細書に記載の方法は、特定の細胞種、例えば、幹細胞（例えば、多能性間葉系幹細胞）内の本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドのインビトロのトランスフェクションおよび発現のために、かかる発現ベクターを使用できる。ＢＭＰ核酸配列を含む発現構築物は、任意の有効な担体（例えば、成分遺伝子をインビボ細胞に効果的に送達する能力を有する任意の製剤または組成物）中に投与できる。アプローチとしては、ウイルスベクター（組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１など）、または組換え細菌もしくは真核生物プラスミドへの遺
伝子挿入が挙げられる。ウイルスベクターは細胞に直接トランスフェクトし；プラスミドＤＮＡは、裸でまたは、例えば、カチオンリポソーム（リポフェクトアミン）または誘導体化（例えば、共役抗体）、ポリリシン共役体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープもしくは他のそのような細胞内担体の補助によるか、遺伝子構築物の直接注入もしくはインビボで行なわれるＣａＰＯ４沈殿によって、送達できる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターは１つまたは複数のＢＭＰ核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有するウイルスベクターである。細胞のウイルスベクター感染には、高い割合の標的細胞が核酸を取り込むことができるという利点がある。さらに、（例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡにより）ウイルスベクター内でコードされた分子はウイルスベクター核酸を組み込む細胞内で効率よく発現する。
【０１０１】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボ外因性遺伝子移入のための組換え遺伝子送達系として、特にヒトに使用できる。これらのベクターは細胞内への遺伝子の有効な送達を提供し、この移入された核酸は安定して宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれる。複製欠陥レトロウイルスのみ産生する特殊細胞系（「パッケージング細胞」と呼ぶ）の開発は遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性を高め、欠陥レトロウイルスは遺伝子療法目的の遺伝子移入における使用のために特性化される（Ｈｕ ａｎｄ Ｐａｔｈａｋ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５２：４９３−５１１ （２０００）； Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ２０８：２２９−３１８ （２００６）で論評されている）。複製欠陥のあるレトロウイルスはウイルス粒子中にパッケージングでき、標準的な技術を用いて、ヘルパーウイルスを用いて標的細胞を感染させるために使用できる。組換えレトロウイルスを産出するため、およびかかるウイルスを用いたインビトロもしくはインビボ細胞感染のためのプロトコールは、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， （１９８９）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４、およびその他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に周知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。同種指向性レトロウイルスと両種性レトロウイルス系の両方の調製に適したパッケージングウイルス系統の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、ΨＡｍ、ｐＡ１２およびＰＡ３１７が挙げられる（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ． ａｌ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：５−１４ （１９９０）を参照されたい）。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボでの多くの異なる細胞種（上皮細胞など）への各種遺伝子導入に用いられている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８ （１９８５）； Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４ （１９８８）； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８ （１９８８）； Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５ （１９９０）； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１−８ （１９９０）； Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３ （１９９１）； Ｆｅｒｒｙ
ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１ （１９９１）； Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５４：１８０２−１８０５ （１９９１）； ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４ （１９９２）； Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７ （１９９２）； Ｄａｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５ （１９９２）；
Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５ （１９９３）； Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２ （２０００）；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ国際公開特許第８９／０７１３６号；ＰＣＴ国際公開特許第８９／０２４６８号；ＰＣＴ国際公開特許第８９／０５３４５号；およびＰＣＴ国際公開特許第９２／０７５７３号を参照されたい）。
【０１０２】
本明細書の方法に有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを用いる。複製欠陥アデノウイルスの生成は、アデノウイルスのゲノムを、該ゲノムが関心の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶解性ウイルスの生活環における複製能が不活性化されるように操作することにより成し遂げられた。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６ （１９８８）； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４ （１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５ （１９９２）を参照されたい。アデノウイルス種Ａｄタイプ５ ｄｌ３２４またはその他のアデノウイルス種（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、またはＡｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞を感染させることができず、多種多様の細胞種（上皮細胞など）を感染させるために使用できるという点で、特定の状況において有利であり得る（前述のＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２））。さらに、このウイルス粒子は比較的安定していて精製と濃度を受け入れることができ、上述したように、感染力スペクトルに影響を及ぼすように修飾できる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれず、エピソームのままである。このため、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組み込まれるインサイチュ法での挿入突然変異の結果生じ得る潜在的な問題を回避する。その上、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの収容能は、他の遺伝子送達ベクターと比較して高い（最大８キロベース（ｋｂ））（前述のＢｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．； Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ
Ｇｒａｈａｍ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７ （１９８６）。加えて、３０ｋｂ超のトランス遺伝子を含み得る特別な高容量アデノウイルス（ＨＣ−Ａｄ）ベクターが作製されている（Ｋｏｃｈａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
１０：２４５１−９ （１９９９））。
【０１０３】
核酸の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製と生殖生活環のために、ヘルパーウイルスとして別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど）を要する天然の欠陥ウイルスである（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ３８：８１９−４５ （２００４）； Ｄａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ２１：５８３−９３ （２００８）で論評されている）。アデノ随伴ウイルスは、自身のＤＮＡを非分裂細胞に組み込み得る数少ないウイルスの１つでもあり、高頻度の安定した一体化を示し、それによって長期間発現することができる（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８ （１９８９）；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３ （１９８９）； Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７：３４９−３５６ （１９９２）； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３６：７６７−７７３ （２００４）を参照されたい）。３００塩基対程の短いＡＡＶを含有するベクターをパッケージングおよび一体化することができる。外因性ＤＮＡのための空間は約４ｋｂに制限されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０ （１９８５）に記載されているようなＡＡＶベクターを、細胞へＤＮＡを導入するために使用できる。多くの異なる血清型由来のＡ
ＡＶベクターを用いて、各種核酸が異なる細胞種に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０ （１９８４）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１ （１９８５）； Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２：３２−３９ （１９８８）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９ （１９８４）；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０ （１９９３）； Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４３８−４５ （１９９８）； Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３４２８−３２ （２０００）； Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：３８５２−８ （２０００）； Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１−８０１ （２００２）； Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． １１：８７５−８８ （２００５）； Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １５：８５８−６３． （２００８）を参照されたい）。
【０１０４】
上に例証したようなウイルス移入方法の他に、非ウイルス法も、本明細書に記載の核酸化合物の発現を惹起するために使用できる（かかる方法の総説については、Ｎｉｉｄｏｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：１６４７−５２ （２００２）を参照されたい）。典型的には非ウイルス遺伝子移入方法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳類細胞によって使用されている通常の機序に基づいている。いくつかの実施形態では、非ウイルスの遺伝子送達系は、標的細胞による対象遺伝子取り込みのためのエンドサイトーシス経路に基づき得る。この種の代表的な遺伝子送達系としては、リポソーム由来系、共役ポリカチオン（ポリアミンおよびポリリシンなど）、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。他の実施形態としては、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１８９６−９０５ （２０００）； Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１８６７−７４ （２０００）； Ｍｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１６：１３１−１３５ （２００１）；またはＦｅｎｓｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３４６：３６−７１ （２００２）に記載されているようなプラスミド注入系が挙げられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰは裸ＤＮＡ構築物および／またはＤＮＡベクターに基づく構築物を用いて発現できる。
裸ＤＮＡ構築物およびかかる構築物の治療的使用は当業者に周知である（例えば、Ｃｈｉａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．，３：９３−１０１， ２００８； Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ８：９１１−９２２，
２００８； Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １７：１１６５−１１７６， ２００８を参照されたい）。典型的には、裸ＤＮＡ構築物としては、１つまたは複数の治療核酸（例えば、ＢＭＰをコードするＤＮＡ）およびプロモーター配列が挙げられる。裸ＤＮＡ構築物はＤＮＡベクター（一般にｐＤＮＡと呼ばれる）であり得る。裸ＤＮＡは典型的には染色体ＤＮＡに組み込まれない。通常、裸ＤＮＡ構築物は、脂質、ポリマー、もしくはウイルス性タンパク質の存在を必要としないか、または併用されない。かかる構築物として、１つまたは複数の本明細書に記載の非治療成分も挙げ得る。
【０１０６】
ＤＮＡベクターは当該技術分野において周知であり、典型的には環状二本鎖ＤＮＡ分子である。ＤＮＡベクターのサイズ範囲は通常３〜５キロベースペアである（例えば、挿入
された治療核酸を含む）。裸ＤＮＡのように、ＤＮＡベクターは、標的細胞中の１つまたは複数の治療タンパク質の送達および発現に使用できる。ＤＮＡベクターは染色体ＤＮＡに組み込まれない。
【０１０７】
通常、ＤＮＡベクターは、標的細胞中の複製を可能とする少なくとも１つのプロモーター配列を含む。ＤＮＡベクターの取り込みは、このＤＮＡベクターを例えば、カチオン脂質と一体化させてＤＮＡ複合体を形成することにより促進（例えば、改善）される場合がある。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介してＤＮＡベクターを標的細胞に導入できる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、標的細胞への外来核酸（例えば、ＤＮＡ）導入のために当該技術分野で認識されている各種技術（リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法など）を指すことを意図する。
【０１０９】
本明細書に記載の発現構築物を生成するために要するすべての分子生物学的技術が、当業者によって理解されるであろう標準的な技術である。詳細な方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， （１９８９）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４およびその他の標準的な実験室マニュアルにも見出し得る。改変ＢＭＰアミノ酸配列（例えば、本明細書に示された野生型ＢＭＰ配列との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、および９９％であるアミノ酸配列）をコードするＤＮＡは、例えば、部位指向突然変異誘発技術を用いて生成できる。
【０１１０】
剤形
通常、ＢＭＰポリペプチドまたは核酸が使用される場合、このポリペプチドまたは核酸は対象（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、またはヒツジ）と同種由来である。
【０１１１】
本明細書に記載のＢＭＰ化合物は、例えば、担体系内で、当該細胞集団との接触における使用に適した任意の手段で処方できる。この担体はコロイド系であり得る。このコロイド系はリポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質はタンパク質の完全性を維持しつつリポソームに封入される。当業者が理解するであろうとおり、各種のリポソーム調製方法がある。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ
ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ａｎａｌ， ３３：３３７−４６２ （１９８８）， ＬＩＰＯＳＯＭＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ａｎｓｅｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３を参照されたい）。リポソームはサイズおよび置換がさまざまな各種リン脂質から調製でき、低毒性（コレステロールなど）の追加成分も含んでよい。このリポソームは各種形状およびサイズで処方および単離できる。さらに、一部をリポソーム表面に取り付けてこの担体の薬物動態特性をさらに向上させることができる。この一部は、リン脂質またはコレステロール分子に取り付けてよく、この一部が表面上に組み込まれる割合はリポソームの安定性および薬物動態特性を最適化するために調節してよい。１つの実施形態では、表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加したリポソームが含まれる。リポソーム剤形はクリアランスを遅延化して細胞取り込みを増大できる。（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ， ３４（７／８）：９１５−９２３ （２０００）を参照されたい）。
【０１１２】
この担体はポリマー（例えば、生体分解性、生体適合性ポリマーマトリックス）でもあり得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質はタンパク質の完全性を維持しつつポ
リマーマトリックス中に埋め込むことができる。このポリマーは天然（ポリペプチド、タンパク質または多糖類など）でも、合成（ポリ（α−ヒドロキシ）酸など）でもよい。例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできている担体が挙げられる。いくつかの実施形態では、このポリマーはポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＧＬＡ）である。この重合体マトリックスは各種剤形およびサイズ（マイクロスフェアおよびナノスフェアなど）に調製および単離できる。ポリマー剤形は治療効果の持続時間を延長させることができる（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ， ３４（７／８）：９１５−９２３ （２０００）を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー剤形が臨床試験で用いられている（Ｋｏｚａｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｉｃｈ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：５４８−５５２ （１９９８）を参照されたい）。
【０１１３】
高分子マイクロスフェアの持続放出製剤の例は、ＰＣＴ国際公開特許第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号（いずれもＺａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号（Ｚａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＰＣＴ国際公開特許第００／３８６５１号（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号ならびにＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号では、塩凝集に対して安定したエリスロポエチン粒子を含有する重合体マトリックスについて述べられている。
【０１１４】
分化方法
本明細書に記載するのは、１つまたは複数のＢＭＰによるＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団の接触により成熟ＢＡＴ細胞または成熟ＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞を生成するための方法である。１つまたは複数のＢＭＰの量（例えば、濃度または用量）および処理時間は、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞集団内のＢＡＴ細胞もしくは成熟ＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞の数を増加させるのに十分である。当業者は周知の方法を用いて、ＢＭＰの量も処理時間も決定できる。いくつかの実施形態では、このＢＭＰはＢＭＰ−７である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰの量は、例えば、０．１〜５０ｎＭ／ＢＭＰを含み得る。
いくつかの実施形態では、治療期間は、例えば、１〜２日間、１〜３日間、１〜４日間、１〜５日間、および１〜５日間超であり得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞を、例えば、いずれの分化誘導段階も経ずに、１つまたは複数のＢＭＰ単独に接触させる。あるいは、Ｓｃａ−１（＋）細胞を、第一溶液（１つまたは複数のＢＭＰを含む）、および第二溶液（１つまたは複数の化学的もしくはホルモン性分化誘導物質および／またはチアゾリジンジオン類を含む）を用いて処理する。Ｓｃａ−１（＋）細胞を、これらの第一溶液と第二溶液に連続的に（例えば、第一溶液の後に第二溶液、または第二溶液の後に第一溶液）または同時に曝露することができる。第一溶液と第二溶液の両溶液の量、処理時間、および第一溶液と第二溶液の使用順について、当業者は周知の方法を用いて容易に決定できる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、第二溶液（１つまたは複数の化学的もしくはホルモン性分化誘導物質および／またはチアゾリジンジオン類を含む）は、骨原性、軟骨形成、筋原性、または脂肪細胞分化溶液である。代表的な分化溶液については、当該技術分野において記載されている（Ｋｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３４７９５−３４８０２， １９９９； Ｈａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４：１６６３−１６７０， １９８９）。本明細書に記載
の細胞のＢＡＴ系統への分化または指向を促進するため、細胞をチアゾリジンジオンを用いて処理できる。代替的にまたは追加で、本明細書に記載の細胞は脂肪細胞分化誘導カクテル（インスリン、デキサメタゾン、トリヨードチロニン、イソブチルメチルキサンチン、および０．１２５ｍＭインドメタシン含有）を用いて、例えば、既に記載されているように（Ｋｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３４７９５−３４８０２， １９９９）処理できる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、分化処理は細胞集団内の１つまたは複数のマーカーの存在および／または不在を測定することにより評価される。
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＢＭＰで処理した細胞または細胞集団内の脂肪細胞分化量の検討を含む。脂肪細胞分化は、１つまたは複数の、例えば、脂質蓄積を（例えば、オイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を用いて）測定することにより検討できる。オイルレッドＯ染色は細胞内の中性脂肪を染色するために用いられる。染色量は直接、細胞内の脂質量に比例し、分光光度法で測定できる。脂質蓄積量は分化パラメーターとして測定される。代替的にまたは追加で、脂肪細胞分化は１つまたは複数の脂肪細胞分化マーカー（例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４、ａＰ２）、および／または脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）から選択される）を測定することによって検討できる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞または細胞集団内のＢＡＴ脂肪細胞分化量の検討を含む。ＢＡＴ分化は１つまたは複数の、例えば、１つまたは複数のＢＡＴ特異的マーカー（脱共役タンパク質（ＵＣＰ）、細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＰＰＡＲγ活性化補助因子（ＰＧＣ）−１α、および／またはＰＰＡＲγ活性化補助因子（ＰＧＣ）−１βおよび／またはＰＲＤＭ−１６など）；ＢＡＴ形態（例えば、視覚的、例えば、細胞の顕微鏡検査）；またはＢＡＴ熱力学（例えば、シトクロム酸化酵素活性、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ酵素単位、またはＢＡＴ熱産生に関与するその他の酵素）を測定することによって検討できる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞内の脂肪細胞分化阻害物である前脂肪細胞因子（ｐｒｅｆ）−１値の検討を含むことができ、ここでｐｒｅｆ−１値低下（例えば、適切な未処理対照細胞または処理前の同一細胞内のｐｒｅｆ−１値と比較して）は、これらの細胞がＢＡＴに分化したことを示す。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、当該方法は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）もしくはその類似体（ジブチリルｃＡＭＰなど）、またはβ３−アドレナリンアゴニストＣＬ３１６２４９により細胞を処理して、これらの細胞の熱産生活性化能を評価することを含む。インビボ寒冷誘発性熱産生は、交感神経系およびＢＡＴ内β３アドレナリン受容体の活性化に関与するシグナル伝達カスケードに媒介される。これらの事象は、細胞質ｃＡＭＰ値の増加に至り、次いで、成熟した褐色脂肪細胞内の熱産生に関与する遺伝子の発現をトリガーする。分化した細胞が真の褐色脂肪細胞になるかどうかを決定するために、細胞浸透性ｃＡＭＰ類似体ジブチリルｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）またはβ３−アドレナリンアゴニストＣＬ３１６２４９（Ｓｉｇｍａ）で処理した分化した脂肪細胞における熱産生遺伝子（ＵＣＰ−１など）発現を測定できる。これらの方法は、成熟した褐色脂肪細胞内の熱産生に関与する１つまたは複数の遺伝子発現の評価（例えば、測定）を含む。代表的な遺伝子としては、ＵＣＰ−１、ＣＩＤＥＡ、ＰＧＣ−１、ＰＲＤＭ１６、ならびにミトコンドリアの生合成と機能に関与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子の１つまたは複数の発現を示す細胞は成熟ＢＡＴ細胞および／または成熟した褐色脂肪細胞の特徴を備える細胞として同定される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＷＡＴへの分化の検討、例えば、ＷＡＴ特異的
マーカー（１つまたは複数のレジスチンなど）、ＴＣＦ２１、レプチンおよび／または核内受容体相互作用性タンパク質１（ＲＩＰ１４０）、および／またはＷＡＴ形態の検討を含む。
【０１２３】
ＷＡＴとＢＡＴは、日常的な技術（例えば、ＷＡＴもしくはＢＡＴに特異的な形態的変化、またはＷＡＴ特異的もしくはＢＡＴ特異的マーカーの検討）により識別できる。例えば、ＢＡＴ細胞は、脱共役タンパク質（ＵＣＰ）（例えば、ＵＣＰ−１）発現により同定できる。
【０１２４】
治療方法
本明細書に記載の方法および組成物は肥満および体重関連障害の治療に有用である。通常、当該方法は、有効量のＢＭＰで処理した細胞を、かかる治療が必要な対象（例えば、かかる治療が必要であると診断されている対象）へ投与することを含む。
【０１２５】
対象の選択
いくつかの実施形態では、当該方法は、治療が必要な対象（例えば、過体重または肥満対象、例えば、ボディマス指数（ＢＭＩ）２５〜２９もしくは３０もしくは３０超または体重関連障害を有する対象）を同定することおよびＢＭＰで処理した有効量の細胞の対象への投与を含む。本明細書に記載の方法による治療が必要な対象は、対象の体重またはボディマス指数に基づいて選択できる。いくつかの実施形態では、当該方法は、対象の：体重、脂肪組織蓄積、脂肪組織形態、インスリン値、インスリン代謝、グルコース値、熱産生能、および寒冷感受性のうち１つまたは複数の検討を含む。いくつかの実施形態では、対象の選択は、対象におけるＢＡＴの量または活性の評価およびこれらの観察記録を含み得る。
【０１２６】
この検討は化合物の投与前、投与中、および／または投与後に実施できる。例えば、この検討は投与の少なくとも１日、２日、４日、７日、１４日、２１日、３０日、またはそれ以上前および／または後に実施できる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は、治療のために選択される対象から取得できる。
細胞療法
本明細書に記載の方法は、（例えば、本明細書に記載の）ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団を治療すべき対象へ移植することを含み得、ここで前記ＢＭＰで処理した幹細胞集団またはそれらの子孫（すなわち、娘細胞）は褐色脂質を生成する。いったん移植後、Ｓｃａ−１（＋）細胞は通常、対象中で脂質を生成し、ＢＡＴを生成する。
【０１２８】
これらの細胞療法の方法は、対象の、例えば、肥満およびインスリン抵抗性の治療において、またはミトコンドリア欠損関連疾患（例えば、糖尿病、癌、神経変性、および老化）を治療するために有用である。
【０１２９】
ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団（例えば、本明細書に記載の分化方法を用いて処理したＳｃａ−１（＋）細胞）を移植する方法は当該技術分野において周知である（例えば、対象へ細胞を導入できるように構成された送達系の使用など）。通常、送達系は、細胞集団（ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞など）を含む貯蔵容器、およびこの貯蔵容器と接する流体中の針を含み得る。典型的には、スキャフォールド、マトリックス、または細胞が取り付くことができるその他の移植可能なデバイスと共に、あるいはそれらなしで、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団は医薬として許容可能な担体中にある（例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできて
いる担体が挙げられる）。かかる送達系も本発明の範囲内である。通常、かかる送達系は無菌で維持する。さまざまな投与経路およびさまざまな投与部位（例えば、腎臓被膜下、皮下、中枢神経系（髄腔内など）、血管内、肝内、内臓内、腹腔内（大網内など）、筋肉内移植）を使用できる。通常、これらの細胞は対象の皮下に移植される。いくつかの実施形態では、移植する、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団は、少なくとも１０７、１０８、１０９、または１０９を超える細胞を含む。
【０１３０】
免疫的に相性がよくない細胞を用いる場合、これらの細胞の拒絶反応を阻害するのに十分な投与量の免疫抑制化合物（例えば、薬剤または抗体）をレシピエント対象に投与できる。免疫抑制剤の投与量範囲は当該技術分野において周知である。例えば、Ｆｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４９ （１９９２）； Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４１ （１９９２）； Ｗｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５５６ （１９９２）を参照されたい。投与量は要因（疾患状態、個体の年齢、性別、および体重など）に応じて変更してよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＢＭＰで処理した細胞に加えて１つまたは複数の他の化合物（例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイドＸ受容体α（ＲｘＲα）、インスリン、Ｔ３、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、レチノイン酸、別のＢＭＰタンパク質（例えば、ＢＭＰ−１またはＢＭＰ−３）、ビタミンＡ、レチノイン酸、インスリン、糖質コルチコイドもしくはそのアゴニスト、Ｗｉｎｇｌｅｓｓタイプ（Ｗｎｔ）（例えば、Ｗｎｔ−１）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、またはその他の増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））の接触、投与もしくは発現を含む。他の実施形態では、化合物は、異種ポリペプチド配列（例えば、第二ＢＭＰタンパク質）と結合してキメラ分子もしくは融合タンパク質を形成する本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７タンパク質またはその一部であり得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、第二治療、例えば、肥満または関連障害（糖尿病など）のための第二治療と併用した化合物の投与を含む。例えば、第二治療はインスリン、オルリスタット、フェンジメトラジン、および／またはフェンテルミンであり得る。
【０１３２】
インビボ療法
いくつかの実施形態では、本開示は、インビボ治療方法を提供する。かかる方法は、上記のとおり対象を選択すること、対象へのＢＭＰシグナル伝達を増加させる１つまたは複数の化合物を対象へ投与することを含み、ここで各化合物は対象中のＳｃａ−１（＋）細胞を特異的に標的とする。かかる方法に使用できる化合物としては、例えば、Ｓｃａ−１（＋）細胞を特異的に標的とするＢＭＰおよびＢＭＰアゴニストが挙げられる。かかる化合物は細胞表面上のＳｃａ−１（＋）および／またはＣＤ２９受容体に特異的に結合できる。
【０１３３】
有効量
本明細書に記載の化合物および医薬組成物の毒性および治療有効性は、培養物または実験動物における細胞のいずれかを用いてＬＤ50（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ50（集団の５０％にとって治療的に効果的な用量）を測定する標準的な製薬手順により決定できる。中毒作用と治療効果間の用量比率は治療指標であり、ＬＤ50／ＥＤ50比率として表すことができる。高い治療指標を示すポリペプチドまたはその他の化合物が好ましい。
【０１３４】
細胞培養アッセイおよびさらなる動物試験から得られるデータを、ヒトに用いる投与量範囲の策定に使用できる。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ50を含み、ヒトの聴力能に対する有害作用がほとんどまたはまったくない循環濃度範囲内である。この投与量は、使用する投与形態および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変更してよい。本明細書に記載の方法に使用される任意の化合物の治療有効量を初めに細胞培養アッセイから推定できる。用量は動物モデルにおいて、細胞培養物中で測定したＩＣ50（すなわち、試験化合物濃度が症状の最大阻害の半数に達する）を含む循環血漿濃度範囲に達するように処方できる。かかる情報は、ヒトに有用な用量をより正確に測定するために使用できる。分化剤の代表的な投与量は少なくとも約０．０１〜３０００ｍｇ／日、例えば、少なくとも約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２、５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、もしくは３０００ｍｇ／ｋｇ／日、または３０００ｍｇ／ｋｇ／日超である。
【０１３５】
投与剤形および投与経路は、治療下の疾患もしくは障害、および治療中の具体的なヒトに応じて調整できる。薬剤用量を１日１回もしくは２回以上、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、または１年を超えて、対象に投与することができる。この治療は無制限に（該ヒトの生涯を通じてなど）継続できる。治療は定期的または不定期的間隔（一日おきに１回または週２回）で投与でき、投与量および投与タイミングは治療の全過程で調整できる。投与量は治療レジメンの全過程で一定量を維持することも、治療の全過程で増減することもできる。
【０１３６】
通常、投与量は、望ましくない副作用（中毒、過敏またはアレルギー反応など）を伴わずに予防と治療の両方のための意図した目的を促進する。個体の必要性は変化し得るが、製剤の最適な有効量範囲の決定は当該技術分野の技能範囲である。ヒトの用量は動物試験から容易に推定できる（Ｋａｔｏｃｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ２７ Ｉｎ：
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０）。通常、製剤の有効量を得るために要される投与量は、当業者により調整されることができ、いくつもの要因（レシピエントの年齢、健康、体調、体重、疾患もしくは障害の種類および程度、治療頻度、必要に応じた同時療法の性質、ならびに所望の効果（１つまたは複数）の性質および範囲など）に応じて変更される（Ｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ３， Ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ
＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９６）。
【０１３７】
治療の評価／検証
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、治療後およびこれらの観察記録後における対象中のＢＡＴ量またはＢＡＴ活性の評価を含み得る。これらの治療後の観察結果は対象の選択中に行なわれる観察結果と比較できる。いくつかの実施形態では、対象は増加したＢＡＴ値および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、対象は軽減した症状を示す。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、評価は、治療前および／または治療後の対象の体重もしくはＢＭＩ測定、ならびに治療前の対象の体重もしくはＢＭＩと治療後の体重もしくはＢＭＩとの比較を含み得る。成功の兆候は体重またはＢＭＩの低下として観察される。いくつかの実施形態では、この治療は、目標体重またはＢＭＩが得られるまで１回または複数回追加投与される。あるいは、胴回り測定（例えば、腰部、胸部、臀部、大腿部、または腕囲
）を用いることができる。
【０１３９】
これらの評価結果は、対象の将来の治療過程の決定に使用できる。例えば、治療は、変更せずに継続してもよいし、変更して継続してもよく（例えば、追加治療またはより積極的な治療）、または停止することもできる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＢＭＰ活性化細胞の１回または複数回の追加移植（例えば、褐色脂肪細胞分化を増加させるため、例えば、対象の肥満軽減を維持するまたはさらに軽減するため）を含む。
【０１４１】
スクリーニング方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はＢＡＴ前駆細胞を同定するためのスクリーニング方法を含む。これらの方法は、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の取得を含む。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、例えば、細胞表面マーカー発現、ＲＮＡとＤＮＡプロファイリング、およびプロテオミクスを評価することにより特性化される。代替的にまたは追加で、これらの細胞は本明細書に記載の分化方法を用いて処理できる。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞は、ＢＭＰ−７を単独または１つまたは複数の分化誘導カクテルと併用して用いて処理できる。次いで、細胞集団が１つまたは複数の成熟ＢＡＴ細胞またはＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞を含むことを確認するためにこれらの細胞を検討できる。次いで、これらの成熟ＢＡＴ細胞またはＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞を単離し、（例えば、細胞表面マーカー発現、ＲＮＡとＤＮＡプロファイリング、およびプロテオミクスを評価することにより）特性化することができる。観察結果を記録し、同様に処理したＳｃａ−１（＋）細胞を用いて行なった観察結果と比較する。いくつかの実施形態では、この観察結果を、未処理前駆細胞を用いて行なった観察結果と比較し、分化前後に存在するマーカーを測定する。次いで、反復した観察結果を測定し、ＢＡＴ細胞系統への分化能または指向能を有する細胞のプロファイル構築に用いる。次いでこのプロファイルを、異種の細胞集団由来のＢＡＴ前駆細胞を選択するために使用できる。
【０１４２】
キット
本発明はキットを特徴とする。いくつかの実施形態では、このキットは（１）１つまたは複数のＳｃａ−１（＋）前駆細胞；（２）１つまたは複数のＳｃａ−１（＋）前駆細胞の成熟ＢＡＴ細胞系統への分化もしくは指向を促進する能力を有する１つまたは複数のＢＭＰ；（３）これらの細胞を対象に投与するためのデバイス；（４）投与説明書；ならびに任意に（５）１つまたは複数の分化誘導カクテル、を含み得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、このキットは（１）１つまたは複数のＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞；（２）これらの細胞を対象に投与するためのデバイス；ならびに（３）投与説明書を含み得る。同一容器に見られる２つ以上（すべてを含む）の成分の実施形態が含まれる。
【０１４４】
キットを供給時、含有する組成物の異なる成分を分離した容器内に収容して使用直前に混合することができる。これらの成分を、このように別々に収容することにより、活性成分の機能を失わせずに長期間保存することができる。複数の生物活性剤が特定のキット内に含まれる場合、この生物活性剤は、（１）別々に収容して好適な（類似した、異なるが適合する）アジュバントもしくは賦形剤と使用直前に別々に混合してよい、（２）併せて収容して使用直前に併せて混合してよい、または（３）別々に収容して使用直前に併せて混合してよい。選択された化合物が混合後にも安定し続ける場合、これらの化合物は、使用の直前より前（例えば、数分前、数時間前、数日前、数ヶ月前、数年前、および製造時など）に一度に混合してよい。
【０１４５】
本発明の特定のキットに含まれる組成物は、異なる成分の寿命が最適に保存され、容器材料に吸収または改変されないような任意の種類の容器内で供給できる。これらの容器に適した材料としては、例えば、ガラス、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネートおよびポリスチレン）、セラミック、金属（例えば、アルミニウム）、合金、または類似試薬を保持するために典型的に使用される他の任意の材料を挙げ得る。代表的な容器として、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、注射器、などを挙げ得るが、これらに限定されない。
【０１４６】
上記のとおり、このキットは取扱説明書と供給することもできる。これらの説明書は、限定ではないが、印刷してもよいし、および／または読み取り可能な電子媒体（フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ジップディスク、ビデオカセット、録音テープ、およびフラッシュメモリデバイスなど）として供給してもよい。あるいは、説明書はインターネットウェブサイト上で公開してもよいし、ユーザーに電子メールで配布してもよい。
【０１４７】
このキットには、体重関連障害および肥満の治療もしくは予防のためのキットも含まれる。
本発明を下記の実施例において詳述するが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限しない。
【実施例１】
【０１４８】
骨形成タンパク質処理は、化学的および／またはホルモン性分化誘導物質不在下でＢＡＴ分化を促進する
野生型褐色前駆脂肪細胞および３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−３、−４、−５、−６、および−７による処理効果を下記の方法により分析した。
【０１４９】
サブコンフルエントな細胞を、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７のいずれかと１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。対照細胞培地はＢＭＰを含有しなかった。化学的もしくはホルモン性分化誘導物質またはチアゾリジンジオンには細胞を曝露しなかった。細胞を８日間培養した。次いで、細胞をオイルレッドＯ染色およびＲＮＡ抽出用に集めた。
【０１５０】
脂質蓄積について、オイルレッドＯ染色を用いて分析した。簡単に述べると、ろ過したオイルレッドＯ溶液（０．５％オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のイソプロピルアルコール溶液）で２時間、室温で細胞を染色した。
【０１５１】
図１Ａに示すとおり、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７により、対照細胞集団と比較して、野生型褐色前駆脂肪細胞における脂質蓄積の著しい増加が惹起され、これは増加したオイルレッドＯ蓄積によるこれら野生型褐色前駆脂肪細胞の濃色化した外観に示されている。対照的に、図１Ｂに示すとおり、３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞では、脂質蓄積の増加は観察されなかった。
【０１５２】
これらのデータにより、さまざまなＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７）は、化学的もしくはホルモン性分化誘導物質またはチアゾリジンジオンを含有しない増殖培地中でさえも、褐色前駆脂肪細胞における脂質蓄積の増加を促進する能力を有することが示唆される。脂質蓄積は、これらの細胞のＢＡＴ表現型への分化と一致するため、これらの結果は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７はＢＡＴ前駆細胞のＢＡＴ系列への分化を促進する能力を有することを示す。
【０１５３】
脱共役タンパク質−（ＵＣＰ−１）および細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）は、ＢＡＴ分化を確認するため一般に用いられる特異的マーカーである（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ３５：４９−５６， ２００３）。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７が褐色前駆脂肪細胞の成熟ＢＡＴ細胞への分化を促進するかどうかを分析するため、上記のとおり調製した細胞を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＵＣＰ−１およびＣＩＤＥＡの発現を評価した。
【０１５４】
野生型褐色前駆脂肪細胞をさまざまなＢＭＰの存在下で８日間培養した。次いで、細胞を取得し、ＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離した。ＵＣＰ−１を増幅するために用いたセンスおよびアンチセンスプライマーはＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ（カタログ番号ＰＰＭ０５１６４Ａ）から購入した。
【０１５５】
ＣＩＤＥＡを増幅するために用いたセンスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれ：
５’−ＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＡＣＧ−３’配列番号６；および
５’−ＴＡＣＴＡＣＣＣＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＣＴ−３’配列番号７である。
【０１５６】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを製造業者の説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）に従って用いて１μｇ ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、最終容積２５０μＬとなるように希釈した。５μＬの希釈ｃＤＮＡをＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）との２０μＬ ＰＣＲ反応に用いた。各プライマーを３００ｎＭの濃度で用いた。各試料においてＰＣＲ反応を二重に実行し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量した。
【０１５７】
図２Ａに示すとおり、ＢＭＰ−７で処理した細胞は対照細胞集団と比較してＵＣＰ−１とＣＩＤＥＡの著しい発現増加を示した。ＣＩＤＥＡ発現増加はＢＭＰ−２処理細胞でも観察された。
【０１５８】
これらの結果により、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−７は野生型褐色前駆脂肪細胞のＢＡＴへの分化を促進することが示唆される。
上の観察結果は、ウエスタンブロッティング法を用いても確認した。簡単に述べると、サブコンフルエントな褐色と白色前駆脂肪細胞を、対照培地または３．３ｎＭのＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７添加培地で１３日間培養した。
【０１５９】
ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７および対照で処理した褐色および白色前駆脂肪細胞から取得したタンパク質抽出体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分解し、ウエスタンブロッティング法を用いて分析した。最初にＵＣＰ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）特異抗体を用いて膜を調べた後、負荷対照としてβ−チューブリン特異抗体を用いて膜を除去し、再度調べた。
【０１６０】
図２Ｂに示すとおり、ＢＭＰ−７に曝露した褐色細胞集団内でＵＣＰ−１を特異的に上方制御した。ＵＣＰ−１上方制御は、ＢＭＰ−７もしくはＢＭＰ−６に曝露した白色細胞集団、または対照で処理した褐色細胞および白色細胞では観察されなかった。
【０１６１】
上記の観察に加えて、ＢＭＰ−７はミトコンドリア生合成の増加も促進した。
これらのデータにより、ＢＭＰ−７は重要な褐色脂肪細胞分化因子かつ熱産生の調節因子であることが示唆される。
【実施例２】
【０１６２】
幹細胞抗原−１陽性の褐色脂肪細胞前駆細胞の単離および特性化
候補の褐色脂肪前駆細胞を成獣マウス骨格筋から単離した。次いで、これらの細胞をＢＭＰ−７に曝露することによって、これらの単離細胞のＢＡＴ細胞への分化能を調査した。
【０１６３】
マウス肢の筋線維結合間質細胞由来の非筋原性前駆細胞の幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））およびＣＤ４５／Ｍａｃ−１陰性（Ｓｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−））集団を、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により精製した。簡単に述べると、動物を二酸化炭素、続いて頸椎脱臼で屠殺した。筋組織を前後の両肢から解離し、１５ｍＬ消化用緩衝液Ｉ（ＤＭＥＭ、０．２％ＩＩ型コラゲナーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０１−０１５）に集めた。試料を３７℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら９０分間消化した。３ｍＬウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して消化を停止した。組織切片を分離し、この組織切片を破壊せずに、Ｆ１０＋２０％ＦＢＳ培地で２回およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。組織をＰＢＳ中で細片化してインタクトな筋線維を得た。
【０１６４】
次いで、筋線維を沈殿により３〜４回洗浄して間質細胞を除去した。最終洗浄後、この上清を除去して最終容積３〜５ｍＬとした後、５〜６ｍＬ消化用緩衝液ＩＩ（Ｆ１０、０．０１２５％ＩＩ型コラゲナーゼ、０．０５％ディスパーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０５−０４１）を添加した。
【０１６５】
次いで、試料を穏やかに撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、この溶液に１．５ｍＬ ＦＢＳを添加して消化を停止した。試料を上下に約４回ピペッティングして、試料中に存在する筋線維結合細胞を解離した。次いで、試料を低速度で１分間遠心して未消化組織切片を除去した。次いで、上清を７０μｍのセルストレーナーでろ過した。遠心分離により細胞を集め、抗体染色のために低容積の選別培地（２％ＦＢＳのハンクス平衡緩衝塩溶液−ＨＢＳＳ）中で再懸濁した。
【０１６６】
選別培地中での１回の洗浄工程後、細胞をろ過網でろ過した。生死選択マーカーであるポビドンヨード（死細胞の検出に使用）およびカルセインブルー（生細胞の検出に使用）を添加後、ＰＥの負の選択（Ｍａｃ−１およびＣＤ４５の発現）およびＡＰＣの正の選択（Ｓｃａ−１発現）を用いた蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）に細胞を供した。すべての抗体を１：２００希釈で細胞懸濁液に添加し、氷上で２０分間インキュベートした。用いた抗体は、Ｓｃａ−１（ＡＰＣ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１７−５９８１−８２）、Ｍａｃ−１（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０１１２−８２）およびＣＤ４５（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０４５１−８２）に対する抗体などである。
【０１６７】
次いで、細胞を増殖培地（１０％ＦＢＳおよびグルタミン含有のＦ１０）中で再懸濁し、ラミニン／コラーゲンコーティングした細胞培養用２４ウェルプレート上の集密度２５．０００細胞／ウェルでプレートした。増殖期間中、細胞を５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、番号Ｆ０２９１）の連日添加により補充した。
【０１６８】
次いで、Ｓｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞を１０％ウシ胎児血清および３．３ｎＭ ＢＭＰ−７添加ＤＭＥＭに３日間曝露した。対照細胞はＢＭＰ−７なしで、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭに曝露した。次いで、細胞を脂肪細胞分化誘導培地に４日間曝露した。具体的には、２０ｎＭインスリンおよび１ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．５μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５ｍＭデキサメタゾン、および０．１２５ｍＭインドメタシン添加培地で融合細胞を４８時間処理することにより脂肪細胞分化を誘導した。この誘導期間後（２日目）、インスリンとＴ３添加
増殖培地に細胞を再置し、次いで増殖培地を隔日で変更した。次いで細胞をオイルレッドＯ染色固定して、定量ＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
【０１６９】
オイルレッドＯ染色を実施例１に記載のとおり実施した。
図３Ａと３Ｂに示すとおり、ＢＭＰ−７で処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）において、対照細胞集団と比較して脂質蓄積の著しい増加がそれぞれ示された。
【０１７０】
次いで、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化と脂肪細胞分化マーカーの両方の発現レベルを測定した。分析した脂肪細胞分化マーカーはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＡ４、ａＰ２）、および脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）である。褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化マーカーはＵＣＰ−１、ＣＩＤＥＡ、ＰＰＡＲγ活性化補助因子（ＰＧＣ）−１α、およびＰＧＣ−１βであった。
【０１７１】
定量ＲＴ−ＰＣＲを実施例１に記載のとおり実施した。ＰＰＡＲγ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣ−３’配列番号８；および
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧ−３’配列番号９である。
【０１７２】
ＦＡＢＡ、ａＰ２増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＧＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴ−３’配列番号１０；および
５’−ＣＴＧＴＣＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡＴＴＴ−３’配列番号１１である。
【０１７３】
ＦＡＳ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＧＡＧＧＡＣＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡ−３’配列番号１２；および
５’−ＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＧＴＣＴＧＴ−３’配列番号１３である。
【０１７４】
ＰＧＣ−１α増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡ−３’配列番号１４；および
５’−ＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡ−３’配列番号１５である。
【０１７５】
ＰＧＣ−１β増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧ−３’配列番号１６；および
５’−ＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＡＣＧ−３’配列番号１７である。
【０１７６】
図４Ａに示すとおり、脂肪細胞分化マーカー（ＰＰＡＲγ、ＦＡＢＰ４、ａＰ２、およびＦＡＳ）と褐色脂肪選択的マーカー（ＵＣＰ−１およびＣＩＤＥＡ）はいずれもＢＭＰ−７処理により著しく増加した。誘導最低値はＰＰＡＲγで観察され、これは対照に比し２倍の増加を示した。他のすべてのマーカーにおいて、対照に比し２倍超の増加が示された。最大増加はＣＩＤＥＡで観察され、これは対照に比し３．５倍の増加を示した。
【０１７７】
これらの観察結果により、ＢＭＰ−７処理はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞の生粋のＢＡＴ細胞への分化を促進することが示唆される。
ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞が熱産生能を有する成熟した褐色脂肪細胞に分化したことをさらに裏付けるため、ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞および未処理の対照細胞を環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）類似体ジブチリルｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）かβ３−アドレナリンアゴニストＣＬ３１６２４９（Ｓｉｇｍａ）のいずれかに曝露した。これらの化合物のそれぞれが寒冷誘発性熱産生の誘発を模倣し、したがって、熱産生に関与する遺伝子の
発現トリガーとなり、これは成熟した褐色脂肪細胞内で排他的に生じる。これらの化合物のいずれかが、褐色脂肪細胞を機能的に特性化し、褐色脂肪細胞を白色脂肪細胞と識別するために一般に用いられる。
【０１７８】
処理後、上記のとおり、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＵＣＰ−１発現を分析した。
図４Ｂに示すとおり、ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞集団において、対照細胞集団と比較して、ｃＡＭＰ後のＵＣＰ−１発現の約３００倍の増加が示された。この観察結果により、ＢＭＰ−７に曝露したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞は、熱産生プログラムを作動してカテコールアミン刺激に反応する完全な能力を有する生粋の褐色脂肪細胞に分化することが示唆される。
【０１７９】
これらのデータを総合して、ＢＭＰ−７はＳｃａ−１（＋）前駆細胞（特にＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞）の真の褐色脂肪細胞への分化を誘導できることが強く示唆される。
【実施例３】
【０１８０】
新規OLE_LINK2OLE_LINK3の褐色脂肪細胞前駆細胞OLE_LINK2OLE_LINK3の同定
本明細書に示す結果により、ＢＭＰはＳｃａ−１（＋）間葉前駆集団における褐色対白色脂肪の宿命を特定できることが実証される。Ｓｃａ−１発現は異種の前駆体貯留をマーキングする。実施例１と２に記載したマーカーの他に、Ｓｃａ−１（＋）細胞源を同定するため、ならびに褐色脂肪細胞前駆細胞の表面上のＳｃａ−１の他にこれらの細胞の同定もしくは精製に使用できるマーカーを同定するため、さまざまな供給源（筋肉、およびOLE_LINK5脂肪組織（OLE_LINK4肩甲骨間ＢＡＴ、皮下白色脂肪組織、および内臓白色脂肪組織OLE_LINK5OLE_LINK4など）など）からＳｃａ−１（＋）前駆体をＦＡＣＳにより単離した。次いで、単離Ｓｃａ−１（＋）細胞をＢＭＰ７に曝露して、細胞の成熟した褐色脂肪細胞への分化能を評価した。細胞表面マーカーにより、次いで細胞の褐色脂肪細胞への分化能を測定した。これら追加のＢＡＴ前駆細胞に特異的な細胞表面マーカーは褐色脂肪細胞前駆細胞の同定に使用できる。
【０１８１】
より具体的には、非造血Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞を骨格筋、骨髄、ならびに脂肪組織および蓄積脂肪（肩甲骨間ＢＡＴ、皮下白色脂肪組織、および内臓白色脂肪組織など）から下記のとおり単離した。
【０１８２】
骨格筋由来Ｓｃａ−１（＋）細胞
実施例１と２に用いた方法によりＳｃａ−１（＋）細胞を単離し、培養した。具体的には、動物を二酸化炭素、続いて頸椎脱臼で屠殺した。前後の両肢から筋組織を解離し、１５ｍＬ消化用緩衝液Ｉ（ＤＭＥＭ、０．２％ＩＩ型コラゲナーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０１−０１５）中に集めた。
【０１８３】
３７℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら９０分間消化した後、３ｍＬウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して消化を停止した。組織切片を分離し、この組織切片を破壊せずにＦ１０＋２０％ＦＢＳ培地で２回およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。組織をＰＢＳ中で細片化してインタクトな筋線維を得た。
【０１８４】
次いで、この筋線維を沈殿により３〜４回洗浄して間質細胞を除去した。最終洗浄後にこの上清を除去して最終容積３〜５ｍＬとした後、５〜６ｍＬ消化用緩衝液ＩＩ（Ｆ１０、０．０１２５％ＩＩ型コラゲナーゼ、０．０５％ディスパーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０５−０４１）を添加した。
【０１８５】
次いで、この試料を穏やかに撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートし、１．５ｍＬ ＦＢＳを添加して消化を停止した。この消化試料を上下に４回吸引して筋線維結合細胞を解離した後、低速度で１分間遠心して未消化組織切片を除去した。次いで、この上清を７０μｍのセルストレーナーでろ過した。遠心分離により細胞を集め、抗体染色のために低容積の選別培地（２％ＦＢＳハンクス緩衝塩溶液−ＨＢＳＳ）中で再懸濁した。
【０１８６】
すべての抗体を１：２００希釈でこれらの細胞懸濁液に添加し、氷上で２０分間インキュベートした。抗体はＳｃａ−１（ＡＰＣ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１７−５９８１−８２）、Ｍａｃ−１（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０１１２−８２）およびＣＤ４５（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０４５１−８２）を標的とした。選別培地中での１回の洗浄工程後、細胞をろ過網でろ過した。生死選択マーカーであるポビドンヨード（死細胞）とカルセインブルー（生細胞）を添加後、ＰＥの負の選択（Ｍａｃ−１およびＣＤ４５発現）およびＡＰＣの正の選択（Ｓｃａ−１発現）を用いた蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）に細胞を供した（図６Ａを参照されたい）。
【０１８７】
次いで、細胞を増殖培地（Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ， ２００８ Ｊａｎ；８２（１）：４４−５６に公開されている）中で再懸濁した。増殖培地は低グルコース含有の６０％ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）と４０％ＭＣＤＢ２０１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｍ６７７０）からなる。増殖培地を２％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１５１４０−１５５）、１ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｄ−４９０２）、０．１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ａ８９６０）、１×インスリン、トランスフェリン、セレニウム（ＩＴＳ）混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｉ３１４６）、および１×リノール酸アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｌ９５３０）を添加した。マトリゲルコーティングした細胞培養用２４ウェルプレート上の集密度２５．０００〜５０．０００細胞／ウェルで細胞をプレートした。この増殖培地も次の増殖因子を添加した：１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製、３１５−０９）、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＥＳＧＲＯ、ＥＳＧ１１０７）、１０ｎｇ／ｍＬ ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製、３１５−１８）および５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｆ０２９１）。この培地に新規の増殖因子を添加後、すべての培地を一日おきに変更した。増殖期間中、細胞に５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、番号Ｆ０２９１）を連日添加して補充した。
【０１８８】
下記のとおり、これらの単離細胞を対象に、ＢＭＰ７で処理後の褐色脂肪細胞生成能について試験した。簡単に述べると、既に記載されているように（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３４７９５−３４８０２， １９９９； Ｈａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４：１６６３−１６７０， １９８９）、単離Ｓｃａ−１（＋）細胞を脂肪細胞分化培地の存在下または不在下でＢＭＰ７と接触させた。より具体的には、細胞を９０〜９５％集密度で、または選別後の７日間の拡大後に取得した。翌日、すべての増殖因子を含む増殖培地に３．３ｎＭ ＢＭＰ−７を添加することにより前処理を開始した。加えて、前のようにｂＦＧＦを連日添加した。
【０１８９】
７２時間後、脂肪細胞分化を４８時間誘導した。脂肪細胞分化誘導カクテルのため、増殖培地を増殖因子なしで用いた。代わりに、次の化合物を添加した：５μｇ／μＬインスリン（Ｒｏｃｈｅ製、１１３７６４９７００１）、５０μＭインドメタシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｉ７３７８）、０．５μＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｉ５８７９）、１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｄ−４９
０２）、および１ｎＭ Ｔ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｔ６３９７）。脂肪細胞分化誘導から２日後、この培地を５μｇ／μＬインスリンと１ｎＭ Ｔ３含有培地と置換して最大７日のみ追加した。続いてオイルレッドＯ染色および定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて脂肪細胞分化について分析した。
【０１９０】
図５Ａ〜５Ｃ（図１提示のデータと一致）に示すとおり、マウス後肢骨格筋から単離したＳｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ７処理は脂質蓄積の著しい増加を促進した。これらの骨格筋由来細胞の細胞表面マーカープロファイリングをＢＭＰ７で処理前に実施した。図６Ａに示すとおり、これらの単離骨格筋細胞はＳｃａ−１陽性、ＣＤ４５陰性、およびＭａｃ−１陰性であった。図６Ｂ〜６Ｆに示すとおり、これらのＳｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞も細胞表面マーカーＣＤ２９／インテグリンβ１およびＣＤで３４陽性であった。対照的に、これらの細胞は細胞表面マーカーＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１およびＣＤ１１７／Ｃ−ｋｉｔ陰性であった。
【０１９１】
これらの観察結果により、Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞は骨格筋から単離できることが確認される。これらの観察結果により、単独で、または１つまたは複数のＣＤ２９もしくはＣＤ３４と併用した細胞表面マーカーであるＳｃａ−１の陽性同定により、Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞を同定および／または精製できることも支持される。Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞は、細胞表面でのＣＤ４５、Ｍａｃ−１、ＣＤ３１、およびＣＤ１１７の非発現によりさらに同定できる。
【０１９２】
これらのＳｃａ−１（＋）細胞の生粋の褐色脂肪細胞への分化能をさらに確認するために、実施例１と２に記載したとおり、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して、これらの骨格筋由来Ｓｃａ−１（＋）細胞における脂肪細胞分化および褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化マーカー発現レベルを分析した。実施例１と２に記載したマーカーの他に、ＰＲＤＭ−１６、ＡＴＰアーゼ、Ｐｒｅｆ−１、ＢＭＰＲ−１１Ａ、ＢＭＰＲ−１Ｂ、ＢＭＰＲ−２、およびＡＣＶＲ−１の発現レベルも検出された。上記のとおり、ＵＣＰ−１はＢＡＴの信頼性の高いマーカーである。同様に、ＰＲＤＭ−１６は褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化マーカーであり、ＵＣＰ−１はＢＡＴの同定に用いられる一般的なマーカーである。ＭＰＲ−１１Ａ、ＢＭＰＲ−１Ｂ、ＢＭＰＲ−２、およびＡＣＶＲ−１は脂肪細胞分化マーカーである。Ｐｒｅｆ−１は、脂肪細胞分化を確認するために使用できる脂肪細胞分化阻害物である。ＲＴ−ＰＣＴに用いられるプライマーを実施例２と以下に示す。ＵＣＰ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡＡＧ−３’配列番号１８
５’−ＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡ−３’配列番号１９である。
【０１９３】
ＰＲＤＭ−１６増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＡＧＣＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣ−３’配列番号２０
５’−ＧＣＧＴＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＧＴＧ−３’配列番号２１である。
【０１９４】
ＡＴＰアーゼ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣ−３’配列番号２２
５’−ＡＧＧＡＣＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴ−３’配列番号２３である。
【０１９５】
Ｐｒｅｆ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＧＴＡＣＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣ−３’配列番号２４
５’−ＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣ−３’配列番号２５である。
【０１９６】
ＢＭＰＲ−１Ａ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＡＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＣＣＣ−３’配列番号２６
５’−ＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＣＣ−３’配列番号２７である。
【０１９７】
ＢＭＰＲ−１Ｂ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴ−３’配列番号２８
５’−ＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＡ−３’配列番号２９である。
【０１９８】
ＢＭＰＲ−２増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡ−３’配列番号３０
５’−ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＡＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ−３’配列番号３１である。
【０１９９】
ＡＣＶＲ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３’配列番号３２
５’−ＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＴＣＣ−３’配列番号３３である。
【０２００】
図７に示すとおり、Ｓｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ７処理により、ＢＡＴ特異的マーカーＵＣＰ−１発現レベルの著しい増加に至った。さらに、これらの細胞におけるＵＣＰ−１発現は、これらの実験に用いた期間１２日間中、増加し続けた。ＢＡＴ特異的マーカーであるＰＲＤＭ−１６、ＣＩＤＥＡ、ＰＧＣ−１α、およびＰＧＣ−１β値の増加も、ＡＴＰアーゼの発現レベル増加として観察された。脂肪細胞分化マーカーであるＰＰＡＲγ、ａＰ２、ＦＡＳ、ＢＭＰＲ−１Ａ、およびＢＭＰＲ−２の発現レベル増加も観察された。対照的に、脂肪細胞分化阻害物Ｐｒｅｆ−１発現レベルの低下が観察された。
【０２０１】
これらの観察結果を総合して、ＢＭＰ７に曝露したＳｃａ−１（＋）細胞は単に脂肪細胞に分化するだけではなく、褐色脂肪細胞に特異的に分化することが確認される。実施例２に記載したとおり細胞をｃＡＭＰにも曝露したところ、図８に示すとおりこれらの細胞内のＵＣＰ−１発現はさらに著しく増加した。この観察結果により、Ｓｃａ−１（＋）細胞は熱産生プログラムを活性化することによりカテコールアミン刺激に反応する完全な能力を有する真の褐色脂肪細胞になることが再度支持される。
【０２０２】
脂肪組織由来のＳｃａ−１（＋）細胞
脂肪組織（OLE_LINK8OLE_LINK9肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）OLE_LINK8OLE_LINK9など）からＳｃａ−１（＋）細胞を単離し、上記の方法を用いて骨格筋由来Ｓｃａ−１（＋）細胞を培養した。次いで、単離細胞をＢＭＰ７に曝露した。これらの細胞のＢＡＴへの分化能を、オイルレッドＯ染色およびＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。
【０２０３】
図９に示すとおり、ＢＡＴおよびＳＱ−ＷＡＴ脂肪組織から単離したＳｃａ−１（＋）細胞は、ＢＡＴに分化することによりＢＭＰ７処理に反応した。対照的に、ＥＰＩ−ＷＡＴから単離したＳｃａ−１（＋）細胞はＢＭＰ７処理に反応しなかった。
【０２０４】
これらの視覚観察結果を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。Ｓｃａ−１（＋）は、肥満の遺伝的素因を有するマウスであるＣ５７Ｂｌ／６（Ｂ６）と肥満抵抗性マウスである１２９−Ｓ６（１２９）由来のＢＡＴ（OLE_LINK6OLE_LINK7ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴOLE_LINK6OLE_LINK7）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）源からも単離した。次いで、これらのマウスから単離した細胞を筋肉由来細胞に対する上記のとおりＢＭＰ７に曝露し、脂肪細胞分化マーカーであるＦＡＳマーカーとＢＡＴ特異的マーカーＵＣＰ−１を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。
【０２０５】
図１０Ａと１０Ｂに示すとおり、肥満素因を有する動物と肥満抵抗性動物の両方から取得したＢＡＴおよびＳＱ−ＷＡＴから単離したＳｃａ−１（＋）細胞において、ＦＡＳ値もＵＣＰ−１値も増加した。対照的に、いずれの動物のＥＰＩ−ＷＡＴから取得したＳｃａ−１（＋）細胞においてもＦＡＳ値は増加しないことが観察され、ＵＣＰ−１は検出不能であった。特に、肥満抵抗性１２９マウスのＢＡＴまたはＳＱ−ＷＡＴから単離したＳｃａ−１（＋）細胞においてＵＣＰ−１が高値で発現し、ＢＭＰ−７前処理はこれらの細胞内のＵＣＰ−１発現をさらに誘導した。
【０２０６】
これらの観察結果により、Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞は脂肪組織から単離でき、ＢＭＰ−７はＢＡＴマーカー発現を誘導できることが支持される。
【実施例４】
【０２０７】
肥満素因を有する動物モデルと肥満抵抗性動物モデルにおける筋肉常在Ｓｃａ−１（＋）細胞の生存可能性および機能の比較
肥満素因を有するＣ５７Ｂｌ／６（Ｂ６）および肥満抵抗性１２９−Ｓ６（１２９）マウスにおけるＳｃａ−１（＋）細胞数を、ＦＡＣＳおよび実施例３に記載の細胞単離方法を用いて評価した。
【０２０８】
図１１に示すとおり、Ｂ６と１２９における総Ｓｃａ−１（＋）細胞数はほぼ同じである。この観察結果により、肥満の遺伝的素因を有するか肥満抵抗性かは、Ｓｃａ−１（＋）細胞数に影響しないことが示唆される。
【０２０９】
Ｂ６と１２９マウスから単離した細胞がＢＭＰ７に反応する上で機能的な相違があるかどうかを調査するために、実施例３に記載したとおりに各動物からＳｃａ−１（＋）細胞を単離し、培養して、ＢＭＰ７に曝露した。ＢＡＴ特異的マーカーであるＵＣＰ−１と脂肪細胞分化マーカーであるＰＰＡＲγ値をＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。
【０２１０】
図１２Ａと１２Ｂに示すとおり、肥満抵抗性マウス（１２９）から単離したＳｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ７処理により、ＵＣＰ−１発現レベルは増加し、肥満素因を有する動物（Ｂ６）において観察された発現レベルよりも上回った。ＵＣＰ−１のベースライン値もOLE_LINK10OLE_LINK11、肥満抵抗性マウス（１２９）において肥満素因を有する動物（Ｂ６）OLE_LINK10OLE_LINK11よりも高かった。対照的に、ＰＰＡＲγ値は、肥満抵抗性マウス（１２９）と肥満素因を有する動物（Ｂ６）とで同等であった。
【０２１１】
これらの観察結果により、遺伝的背景は、Ｓｃａ−１（＋）細胞の褐色脂肪細胞分化の潜在的因子を決定することが示唆される。
【実施例５】
【０２１２】
ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞の非脂肪細胞系統への分化能
ＢＭＰで前処理した、あるいＢＭＰで前処理しない、骨原性および筋原性の分化培地の存在下において、Ｓｃａ−１（＋）細胞の異なる系統への分化能を調査した。具体的には、筋肉から単離したＳｃａ−１（＋）細胞を、ホルモンおよび化学物質含有の骨原性または筋原性誘導カクテルを用いて分化を誘導する前に、ＢＭＰ−７で前処理した（Ｐｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０３（５）：１６６２−８ ２００３）。骨格筋から単離してＢＭＰ７に曝露したＳｃａ−１（＋）細胞は骨原性または筋原性系統に分化しなかった。これらの観察結果から、ＢＭＰ７は具体的にＳｃａ−１（＋）細胞に対してＢＡＴ細胞へ分化する傾向を与えることが示唆される。これらのデータから、Ｓｃａ−１（＋）はＷＡＴかＢＡＴに分化可能な脂肪細胞であるが、Ｓｃａ−１（＋）をＢＭＰ７へ曝露すると、Ｓｃａ−１（＋）は機能的ＢＡＴ系統へ誘導されるというさらなる結論を
得ることができる。
【実施例６】
【０２１３】
ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞のインビボ移植
これらのＢＭＰで処理したインビボＳｃａ−１（＋）前駆細胞の褐色脂肪細胞対白色脂肪細胞への分化の方向付けを決定するため、遺伝子組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マウスから単離したＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞を、同じ遺伝背景を有するがＧＦＰを発現しないマウスの後肢および／または胸骨領域に注入した。
【０２１４】
このアプローチを用いて、移植した細胞の宿命を容易に追跡し、これらの移植した細胞がインビボで自己複製能および分化能を保有しているかどうかを決定する。
実施例３に記載した方法を用いて、ＧＦＰ発現マウスから細胞を単離し、培養した。次いで、これらの細胞を次のとおり移植した。非ＧＦＰレシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスの後肢筋肉および横腹領域周囲の皮下白色脂肪に約５×１０５細胞を直接注入した。移植から１０日後、ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）細胞は両注入部位においてＧＦＰ＋脂肪パッドに発展したことが落射蛍光法により測定された。
【０２１５】
図１３と図１４に示すとおり、ＢＭＰ７で処理して移植したＳｃａ−１（＋）細胞は、移植から１０日後にＳＱ−ＷＡＴ組織で検出された。さらに、ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞は移植から３０日後でも検出可能であった。
【０２１６】
これらのデータにより、ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞は細胞移植に耐え、移植後に生存し続けることができることが示唆される。
【実施例７】
【０２１７】
Ｓｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ３、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ７による処理
実施例３に記載した方法を用いて、骨格筋から単離したＳｃａ−１（＋）細胞をＢＭＰ３、ＢＭＰ４、またはＢＭＰ７のいずれかに曝露した。次いで、定量ＲＴ−ＰＣＲおよび実施例２と３に記載した方法を用いて、ＵＣＰ−１、ＣＩＤＥＡ、ＰＰＡＲγ、ＦＡＳ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、およびＭｙｏＤ値を評価した。
【０２１８】
Ｍｙｏｇｅｎｉｎ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＴＡＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣ−３’配列番号３４
５’−ＴＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＡＴＴＣＡＣＴＧ−３’配列番号３５である。
【０２１９】
ＭｙｏＤ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＧＧＴＴＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＧ−３’配列番号３６
５’−ＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＡ−３’配列番号３７である。
【０２２０】
ＡＣＶＲ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３’配列番号３８
５’−ＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＴＣＣ−３’配列番号３９である。
【０２２１】
図１５に示すとおり、ＢＭＰ７およびＢＭＰ４は、Ｓｃａ−１（＋）細胞内のＢＡＴ特異的マーカーであるＵＣＰ−１およびＣＩＤＥＡの発現増加を促進する。
これらのデータにより、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞のＢＡＴへの分化を促進するために、ＢＭＰ７の他にＢＭＰ４を使用できることが示唆される。
【実施例８】
【０２２２】
細胞移植
Ｓｃａ−１（＋）細胞は、スキャフォールド、マトリックス、または移植を促進するために細胞を取り付けることができるその他の構造体にも埋め込まれる。生成組織は、上記の褐色および白色脂肪特異的マーカーの一般的な組織学および免疫組織化学により分析される。移植関連の体重改変、グルコースおよび脂質代謝、ならびに全身エネルギーバランスに関して精密モニタリングが行なわれる。
【０２２３】
褐色脂肪細胞を生成する分化能が組織特異的かどうかを決定するために、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞を他の組織（骨格筋、前立腺、真皮、心血管系、乳腺、肝臓、新生児皮膚、頭蓋冠など）からも単離する。
【実施例９】
【０２２４】
分化を方向付けられた前駆脂肪細胞の特性化
異なるＢＭＰは複能性前駆細胞の褐色または白色脂肪細胞への分化の方向付けをトリガーする。具体的には、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４は白色脂肪細胞系統への分化を促進し、一方ＢＭＰ−７は褐色脂肪細胞系統への分化を促進する。
【０２２５】
ＢＭＰに曝露したＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、総合的ゲノム、および方向付けられた褐色前駆脂肪細胞、方向付けられた白色前駆脂肪細胞、および方向付けられていない幹細胞の間を識別する細胞プロファイルを生成する分子形跡および細胞表面マーカーを測定するプロテオミクスのアプローチを用いて特性化される。これらのプロファイルは、褐色脂肪細胞または白色脂肪細胞の生成能に基づいて細胞集団を同定かつ選択するのに用いられる。
【０２２６】
ゲノミクス的アプローチとしては、発現プロファイリングのためのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃマイクロアレイおよびプロテオミクス分析のための細胞培養中の安定同位体標識法（ＳＩＬＡＣ）の使用が挙げられる。マイクロＲＮＡはＢＭＰ処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞においても研究される。
【０２２７】
したがって、ＢＭＰに曝露したＳｃａ−１（＋）前駆細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびマイクロＲＮＡプロファイルを研究することにより、褐色脂肪細胞系統または白色脂肪細胞系統への分化能を有する前駆細胞集団の同定に有用な細胞プロファイルを作製する。
【実施例１０】
【０２２８】
糖尿病治療における褐色および白色前駆体の生理的関連性の分析
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞、およびこれらの細胞のＢＭＰ−７処理により生成した成熟した褐色脂肪細胞を肥満マウスに移植する。次いで、動物の体重、代謝、および／または糖尿病における変化を評価する試験を行なう。
【０２２９】
本明細書に記載の方法を用いて同定された細胞を、肥満発症に対する感受性が異なる実験動物モデルに注入する。適切な動物は肥満抵抗種１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ、肥満素因を有する種Ｃ５７ＢＬ／６、ｏｂ／ｏｂマウス、およびｄｂ／ｄｂマウスであり、このうち後者２種はそれぞれレプチンおよびレプチン受容体欠損である。体重増加および／または肥満についても、Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ｗｅｂｂ（Ｒｏｇｅｒｓ Ｐ． ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｇ．Ｐ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｎｕｔｒ． ４３：８３−８６， １９８０）により記載されている方法を用いて評価する。
【０２３０】
次いで、（１）脂肪、炭水化物、もしくはタンパク質含量もしくは比率の異なる食事効果、（２）医薬品（抗糖尿病薬ロシグリタゾンなど）による治療効果、および／または（３）対照動物（該細胞未投与）と実験動物（移植細胞を投与）の運動、の効果を検討する
実験を実施する。
【０２３１】
次いで、対照動物と実験動物を移植前後および試験全体を通して評価する。動物の体重（生きた動物を測量することにより）、血清グルコース（生きた動物内の血清グルコース値を測定することにより）、および／または血清インスリン（血清インスリン値を測定することにより）の変化を分析する試験を行なう。次いで、一部の動物を屠殺し、さらなる分析に用いる。他の動物は長期試験に用いる。他の動物は、空間行動、食物と液体の消費、温度、尿生成、代謝率および酸素と二酸化炭素交換の測定が可能な総合的実験動物モニタリング系（ＣＬＡＭＳ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ）を用いた代謝評価に使用する。
【０２３２】
他の実施形態
本発明は、本発明の詳細な説明と併せて記載しているが、上記の説明は例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲で定義された本発明の範囲を制限しないことが理解される。他の態様、利点、および修正は下記の特許請求の範囲内である。
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援の研究または開発）
合衆国政府は、国立衛生研究所に付与された認可番号Ｒ０１ ＤＫ０７７０９７のもとにある本発明において一定の権利を有する。
（発明の属する技術分野）
本開示は、肥満ならびに体重関連の疾患および障害を治療するための方法および組成物に関する。より具体的には、本開示は、細胞もしくは細胞集団内の褐色脂肪組織の脂肪細胞分化を調節する（例えば、増加させる）ための方法および組成物、ならびに褐色脂肪組織細胞系統への分化能もしくは指向能を有する細胞を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、他の障害（糖尿病、心疾患、および癌など）の発症および病因における役割を直接的間接的に介した主要な国際的健康問題である。肥満はエネルギー摂取量がエネルギー消費量を超過した際に発症し、通常、脂肪細胞または脂肪組織の異常蓄積に関連する。
【０００３】
脂肪組織は（筋肉および骨と同様に）中胚葉に由来し、白色脂肪細胞（ｗｈｉｔｅ ｆａｔ ｃｅｌｌ）（白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ：ＷＡＴ）細胞としても知られている）および／または褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ ｆａｔ ｃｅｌｌ）（褐色脂肪組織（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ：ＢＡＴ）細胞としても知られている）を増殖かつ分化させる分裂区画を含む。ＢＡＴ細胞とＷＡＴ細胞は共に間葉系幹細胞から生じ、それらは好適な生成合図に惹起された際に脂肪細胞系統に方向付けられるようになり、前駆脂肪細胞として方向が決定される。前駆脂肪細胞は、ＢＡＴ細胞またはＷＡＴ細胞への分化能を有するＷＡＴとＢＡＴの前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）もしくは前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の両方を含む。
【０００４】
最近、筋原性遺伝子の発現形跡が褐色脂肪前駆細胞内で（ただし、白色脂肪前駆細胞内ではない）同定され（非特許文献１）、ＢＡＴ前駆細胞はＷＡＴ前駆細胞とは異なり、両者は識別できることが示唆された。加えて、褐色脂肪細胞の蓄積がマウス（特に肥満抵抗性の種）の後肢筋束間に散見され（非特許文献２）、骨格筋はＢＡＴ細胞への分化能または指向能を有する前駆細胞を含み得ることが示唆された。
【０００５】
ＷＡＴ組織はトリグリセリド蓄積および脂肪酸放出の主要部位である。ＷＡＴは皮下に見られ、断熱、緩衝作用（衝撃および不快感に対する）、およびエネルギー蓄積に供する。平均的な痩身者はおよそ２００〜４００億個のＷＡＴ細胞を有する。肥満者は平均痩身者の最大１０倍のＷＡＴを有し得る。
【０００６】
ＢＡＴ細胞は豊富かつ多数のミトコンドリアを含有し（非特許文献３）、酸化的リン酸化反応、中間代謝、適応性熱産生、活性酸素種の生成、およびアポトーシスの中心部位を担う。ＢＡＴでは、ミトコンドリア生合成が褐色脂肪細胞への分化を伴うことが長らく知られている。過去十年間において、ミトコンドリア完全性の改変は各種ヒト疾患（肥満、糖尿病、癌、神経変性、および老化など）に関与し得ることがますます明白になっている（非特許文献４−６）。
【０００７】
ＢＡＴは脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）を発現させることによって熱産生エネルギー消費に関与する。ＢＡＴ依存性エネルギー消費は寒冷下での体温維持および／または食物エネルギー消耗を担う。そのため、欠陥ＢＡＴまたはＢＡＴ不足はしばしば肥満を合併する。マウスのＢＡＴアブレーションは、しばしばインスリン抵抗性の、高血糖症、高
脂質血症、および高コレステロール血症を合併する重度の肥満に至るという観察結果によって、全体のエネルギー恒常性におけるＢＡＴの重要性が強調された（非特許文献７−９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０４：４４０１−４４０６， ２００７
【非特許文献２】Ａｌｍｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０４：２３６６−２３７１， ２００７
【非特許文献３】Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ， Ｔｒａｙｈｕｒｎ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌｓ， Ｅｄｓ． （Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８６）
【非特許文献４】Ｄｕｃｈｅｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３ （Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ９６−１０２ （２００４）
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ６：３８９−４０２ （２００５）
【非特許文献６】Ｌｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７：３８４−３８７ （２００５）
【非特許文献７】Ｌｏｗｅｌｌ ａｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６（６４５７）：７４０−２ （１９９３）
【非特許文献８】Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ４４（１１）：１２６６−７３ （１９９５）
【非特許文献９】Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（１）：２１−９ （１９９６）。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）で処理した幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞が真のＢＡＴ細胞に分化するまたは真のＢＡＴ細胞を指向するという発見に少なくともある程度基づく。これらのＢＡＴ細胞は、ＢＡＴ細胞熱産生プログラムを作動することによりカテコールアミン刺激に反応する完全な能力を有する生粋のＢＡＴ細胞である。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「ＢＭＰで処理した」とは、その細胞のＢＭＰシグナル伝達（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達）レベルが人工的に増強されていることを意味する（「および／または」は列挙されているもののうちの少なくとも一つを指す、以下同じ）。「人工的に」増強されたとは、ＢＭＰシグナル伝達レベルが直接的なヒトの介入により増加したことを意味する。ＢＭＰシグナル伝達は、本明細書に記載の任意の方法、例えば、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物（例えば、ＢＭＰポリペプチド、ＢＭＰコード核酸、低分子、および／または抗体）で細胞を処理することにより増強できる。本明細書に記載の方法により活性化したＳｃａ−１（＋）細胞集団も本発明に包含される。これらの細胞は、自己由来、同種異系由来、または異種由来であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＢＭＰシグナル伝達を増加させるのに十分な量の化合物によりＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団を処理し（例えば、接触させ）、それによりＢＭＰで処理した細胞集団を産出することを含み得る。
【００１２】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、これらのＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団の対象への移植することを含み得る。ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細
胞は、直接移植することもでき、あるいはスキャフォールド、マトリックス、または細胞を取り付けることができるその他の移植可能なデバイス（例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできている担体が挙げられる）内で投与することもできる。通常、当該方法は、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団（対象中の褐色脂肪細胞分化を促進する、例えば、対象のＢＡＴ量を少なくとも１％、例えば、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超増加させるのに十分な数の細胞を含む）の移植を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、当該方法は、精製したＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団（例えば、少なくとも６０％、例えば、７０％、８０％、９０％または９０％超の細胞がＳｃａ−１（＋）前駆細胞である細胞集団）を提供すること；ならびに本明細書に記載の１つまたは複数のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７（つまりＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の発現、量もしくは活性を増加させる能力を有する化合物とこれらの細胞との接触させ、それによりＢＭＰで処理した細胞の生成することを含む。
【００１４】
ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達を増加させる化合物は、例えば、下記のうちの１つまたは複数であり得る：
（ａ）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異型、好ましくは活性（例えば、ＢＭＰＲ−Ｉおよび／またはＢＭＰＲ−ＩＩを活性化する）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体（例えば、本明細書に記載の成熟ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド、例えば、成熟ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド）；
（ｂ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の受容体への結合を増加させるまたは安定化することにより）活性を増加させるＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のペプチドまたはタンパク質アゴニスト、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７活性を活性化するＢＭＰＲ−Ｉおよび／またはＢＭＰＲ−ＩＩ；
（ｃ）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達活性（例えば、ＢＭＰＲ−Ｉおよび／またはＢＭＰＲ−ＩＩ結合活性、またはＳＭＡＤリン酸化活性）を模倣する低分子またはタンパク模倣物；
（ｄ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子のプロモーター領域との結合により）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の発現を増加させる低分子；
（ｅ）抗体、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７と結合する、ならびに、それらのＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７結合パートナー（例えば、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７受容体）との結合を安定化もしくは補助する抗体である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７と結合する抗体はモノクローナル抗体（例えば、ヒト化キメラまたはヒトモノクローナル抗体）である；あるいは
（ｆ）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードする核酸。この核酸はゲノム配列でもあり得るし、ｃＤＮＡ配列でもあり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のポリペプチドまたは核酸である。本明細書で使用される場合、「ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のポリペプチドまたは核酸」とは、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドまたは核酸、例えば、成
熟ヒトＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドもしくはその活性断片、または成熟ヒトＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドをコードする核酸もしくはその活性断片である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−２ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−２、例えば、成熟ＢＭＰ−２ポリペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸２８３〜３９６を含むＢＭＰ−２ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−４ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−４、例えば、成熟ＢＭＰ−４ポリペプチド、例えば、配列番号２のアミノ酸２９３〜４０８を含むＢＭＰ−４ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−５ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−５、例えば、成熟ＢＭＰ−５ポリペプチド、例えば、配列番号３のアミノ酸３２３〜４５４を含むＢＭＰ−４ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−６ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−６、例えば、成熟ＢＭＰ−６ポリペプチド、例えば、配列番号４のアミノ酸３７４〜５１３、配列番号４のアミノ酸３８２〜５１３、配列番号４のアミノ酸３８８〜５１３、または配列番号４のアミノ酸４１２〜５１３を含むＢＭＰ−６ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−７ポリペプチド（例えば、ヒトＢＭＰ−７、例えば、成熟ＢＭＰ−７ポリペプチド、例えば、配列番号５のアミノ酸２９３〜４３１を含むＢＭＰ−７ポリペプチド）である。このポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、化合物はＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドをコードする核酸、またはその生物学的に活性な断片もしくは類似体である。ＢＭＰ核酸は次を含み得る：ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７コード領域；プロモーター配列（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来のプロモーター配列）；エンハンサー配列；非翻訳調節配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来である５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来である３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列。別の実施形態では、内因性ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の発現レベルを増加させることにより（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の転写を増加させることによりまたはＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のｍＲＮＡの安定性を増加させることにより）ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７のタンパク質値は増加する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の転写は、例えば、正の制御因子（転写活性化因子のエンハンサーまたはＤＮＡ結合部位など）を添加して内因性ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子の調節配列を改変することにより；負の制御因子（転写リプレッサーのＤＮＡ結合部位など）を削除することにより、および／または内因性調節配列もしくはその因子を別の遺伝子のそれと置換することにより増加させ、それによって、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子コード領域のより効
率的な転写が可能となる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、当該核酸はＢＭＰ−７をコードするか、またはＢＭＰ−７の転写を増加させる。
いくつかの実施形態では、本発明はＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）前駆集団を特徴とする。いくつかの実施形態では、これらの細胞はＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド）の発現レベルを、安定的または一時的に増加させるために遺伝子組換えされている。これらの細胞は、例えば、培養した哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、これらの細胞は少なくとも１つの他のタンパク質（例えば、非ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチド、および／または第二（またはそれ以上の）ＢＭＰタンパク質）も同様に発現するように遺伝子組換えされている。発現したＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドは通常、幹細胞と同一種（例えば、ヒト細胞中で発現したヒトＢＭＰ）である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は不死化されており、例えば、培養物中で無制限に自己複製する能力を有する。
【００２３】
一態様では、本発明は、インビトロ細胞集団内における褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、本明細書に開示された細胞集団（幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））、ＣＤ４５陰性、Ｍａｃ−１陰性前駆細胞を含む）を取得すること；およびにインビトロ前駆細胞集団と、１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−４、−６、または−７の発現増加を促進する有効量の化合物とを、細胞集団中の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分な時間の間接触させること特徴を備えた細胞の数；または、細胞集団中ＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分なレベルで１つまたは複数のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を発現するよう細胞集団を遺伝子組換えすること、を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、対象中の褐色脂肪細胞分化を促進する方法を提供する。これらの方法は、治療が必要な対象を選択すること；幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））、ＣＤ４５陰性、Ｍａｃ１陰性前駆細胞を含む、本明細書に開示された細胞集団を取得すること；ならびにインビトロ前駆細胞集団と、１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−４、−６、または−７の発現増加を促進する有効量の化合物とを、これらの細胞集団中の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分な時間の間接触させること；またはこれらの細胞集団中のＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分なレベルで１つまたは複数のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を発現するよう細胞集団を遺伝子組換えすること；ならびに該細胞集団を対象へ投与することを含み、該方法は対象中のＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を効果的に増加させる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で作製された細胞集団、ならびにこれらの細胞集団と医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
さらなる一態様では、本発明は細胞送達系を提供する。これらの細胞送達系としては、本明細書に記載の方法により作製された１つまたは複数の細胞を含む貯蔵容器、医薬として許容可能な担体、ならびに送達デバイス（例えば、貯蔵容器と流体が接触する針またはカニューレ）が挙げられる。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、熱産生ＢＭＰで処理した幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））細胞集団を含む組成物を提供する。一部の場合では、これらの細胞は非ふるえ熱産生能を有する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「治療」とは任意の手段で疾患または障害の１つまたは複数の症状が緩和されるか、あるいは有益に改変されることを意味する。本明細書で使用される場合、特定の障害の症状の緩和とは、本発明の組成物および方法による治療に起因または関連し得る、永続的か一時的か、持続的か一過性かを問わない症状の任意の軽減を指す。
【００２８】
「有効量」および「治療に有効」という用語は、本明細書で使用される場合、一定期間使用される（急性もしくは慢性投与および断続的もしくは連続的投与など）１つまたは複数の本明細書に記載の組成物の、意図した効果または生理的転帰を得るための投与という脈絡において有効な量または濃度を指す。
【００２９】
本明細書全体で、「対象」という用語は、本発明の方法により治療を提供する動物、ヒトまたは非ヒト、齧歯類または非齧歯類について述べるために使用される。家畜と非家畜の適用が意図される。この用語は、哺乳類、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類（マウスおよびラットなど）、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含むが、これらに限定されない。典型的な対象としては、ヒト、家畜、および飼育ペット（ネコおよびイヌなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象（例えば、肥満のヒト対象）である。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳類、例えば、実験動物、愛玩動物、または食用動物（例えば、食用に飼育されたウシ、ブタ、またはヒツジ）である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「単離した」もしくは「精製した」ポリペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質は、タンパク質を得た細胞もしくは組織由来の細胞物質もしくはその他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成時の化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは選択されたタンパク質の調製物において、選択されないタンパク質または化学的前駆体が乾燥重量で約３０％未満（例えば、２０％、１０％、または５％未満）であることを意味する。このような選択されないタンパク質は本明細書で「汚染タンパク質」とも呼ぶ。単離した治療タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが組換え生産される場合、それらは実質的に培地を含まない、すなわち、培地成分がそのタンパク質調製物の約２０体積％未満（例えば、約１０体積％または５体積％未満）であり得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「肥満」とは、対象の体重が基準表により対象の理想体重を２０％以上（例えば、２５％、３０％、４０％、および５０％、または５０％超）超過する、対象の障害を指す。肥満は、ボディマス指数（ＢＭＩ）３０以上（例えば、３０〜３５および３５〜４０、または４０超）の個体も意味し得る。例えば、肥満（１度）と診断された対象のＢＭＩ範囲は３０〜３４．９である。肥満（２度）の対象のＢＭＩ範囲は３５．０〜３９．９である。肥満（３度）対象のＢＭＩは４０超である。
本明細書で使用される場合、「過体重」とは、ＢＭＩ範囲が２５．０〜２９．９である対象を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、自己複製能と、多くの異なる細胞系統への分化能の両方を有する（多能性である）。「前駆細胞」とは、幹細胞の表現型と類似した表現型を有する幹細胞の部分集合を指す。前駆細胞は自己複製能を有し、典型的には複能性である。
【００３３】
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発
明に用いるための方法および材料が本明細書に記載されており；他の、当該技術分野において周知である適切な方法および材料も使用できる。これらの材料、方法、および実施例は例証するためのみに用いられており、その制限を成すことは意図していない。本明細書で述べたすべての刊行物、特許出願、特許、データベースエントリー、およびその他の参考文献はそれらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】（図１Ａ）褐色前駆脂肪細胞を含むペトリ皿の一連の画像である。（図１Ｂ）白色前駆脂肪細胞の一連の画像である。示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いて細胞を処理し、オイルレッドＯを用いて染色して、脂質蓄積を評価した。対照細胞はＢＭＰに曝露しなかった。脂質蓄積は、濃く染色されて紅色がかった細胞により示されている。
【図２Ａ】定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した、示されたＢＭＰに曝露した褐色前駆脂肪細胞内の脱共役タンパク質（ＵＣＰ）と細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）の発現を示す棒グラフである。対照細胞はＢＭＰに曝露しなかった。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】ＵＣＰ−１とβ−チューブリンに特異的な抗体により調べた免疫ブロット画像である。β−チューブリンを負荷対照として示す。
【図３】オイルレッドＯ染色した、対照細胞（Ａ）とＢＭＰ−７曝露細胞（Ｂ）の写真を示す画像である。脂質蓄積は、濃く染色されて紅色がかった細胞により示されている。脂肪滴も両画像ではっきりと視認できる。
【図４】（図４Ａ）定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した、対照細胞とＢＭＰ−７曝露細胞内のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪酸結合タンパク質４（ａＰ２）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、ＣＩＤＥＡ、およびＵＣＰ−１発現を示す棒グラフである。結果を、対照細胞に対して増加した割合として表す。（図４Ｂ）対照細胞およびＢＭＰ−７曝露細胞におけるｃＡＭＰに誘導されたＵＣＰ−１発現を示す棒グラフである。ＵＣＰ−１処理単独を示す棒は、ｃＡＭＰ対照の棒として用いた。
【図５】（図５Ａ−Ｃ）骨格筋から単離し、ＢＭＰ７で処理して、脂質蓄積を評価するためにオイルレッドＯ（ＯＲＯ）で染色したＳｃａ−１（＋）細胞の画像である。対照細胞はＢＭＰに曝露しなかった。脂質蓄積は、濃く染色されて紅色がかった細胞により示されている。
【図６】（図６Ａ）ＦＡＣＳを用いて取得したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞集団を示す散布図である。（図６Ｂ〜６Ｃ）フローサイトメトリーを用いて評価したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞表面上のさまざまなマーカーの存在または不在を示す折れ線グラフである。矢印は染色された細胞を示す。
【図７】（図７Ａ−Ｎ）ＢＭＰ−７曝露細胞内で、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて経時的に検出されたマーカー値を示す折れ線グラフである。矢印はＢＭＰ７曝露細胞において観察された結果を示す。
【図８】対照細胞およびＢＭＰ−７曝露細胞においてｃＡＭＰに誘導されたＵＣＰ−１発現を示す棒グラフである。ＵＣＰ−１処理単独を示す棒は、ｃＡＭＰ対照の棒として用いた。
【図９】（図９Ａ−Ｆ）一連の６枚の顕微鏡写真である。９Ａ、９Ｃ、および９Ｅは、肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）（９Ａ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）（９Ｃ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）（９Ｅ）からそれぞれ単離したＢＭＰ７未処理のＳｃａ−１（＋）細胞を示す（対照）。９Ｂは肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）から単離した細胞を示し；９Ｄは皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）由来細胞であり、９Ｆは内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）由来細胞を示し、それぞれＢＭＰ７で処理した（ＢＭＰ７）。
【図１０Ａ】肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）から単離した細胞内の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ；Ａ）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）から単離した細胞内の脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１；Ｂ）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図１１】肥満抵抗性マウス（１２９）および肥満素因を有するマウス（Ｂ６）から単離した総Ｓｃａ−１（＋）細胞を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】肥満抵抗性マウス（１２９）および肥満素因を有するマウス（Ｂ６）から単離してＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞内のＵＣＰ−１発現レベルを示す棒グラフである。未処理細胞を対照として示す。
【図１２Ｂ】肥満抵抗性マウス（１２９）および肥満素因を有するマウス（Ｂ６）から単離してＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞内のＰＰＡＲγ発現レベルを示す棒グラフである。未処理細胞を対照として示す。
【図１３】（図１３Ａ−Ｄ）蛍光顕微鏡的画像である。１３Ａと１３Ｂは、ＢＭＰ７で処理して移植したＳｃａ−１（＋）緑色蛍光タンパク質細胞（移植後１０日間）を示す。移植細胞なしの対照画像を１３Ａと１３Ｃに示す。右図（図１３Ｂと１３Ｄ）に示した移植したＧＦＰ細胞の方が、より濃色の細胞に見える。
【図１４】（図１４Ａ−Ｆ）ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）緑色蛍光タンパク質細胞を移植した脂肪パッドの切片を示す顕微鏡的画像である。切片は非緑色蛍光タンパク質陽性レシピエントマウス由来である。緑色蛍光タンパク質陽性細胞は、注入から１０日後のレシピエントマウスにおいて落射蛍光法により検出された。元の倍率は２００倍である。
【図１５】（図１５Ａ−Ｆ）ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４またはビヒクル対照（Ｃ）で処理した筋肉由来Ｓｃａ−１（＋）細胞内のＵＣＰ−１、Ｃｉｄｅａ、ＰＰＡＲｇ、ＦＡＳ、ＭｙｏｇｅｎｉｎおよびＭｙｏＤ発現レベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、とりわけ、対象の肥満ならびに体重関連の疾患および障害（下記の病状など）を治療するために対象におけるＢＡＴ値および／または機能を増加させるのに有用な組成物および方法を提供する。これらの方法は、定義された前駆細胞（例えば、ＢＡＴ細胞への分化能を有する前駆細胞）の部分集合のＢＡＴ細胞系統への分化または指向を促進することを含む。より具体的には、本開示は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）で処理した場合に幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞がＢＡＴ細胞系統への分化能または指向能を有するという発見に少なくともある程度基づく。本明細書に記載のこれらの組成物および方法は、ＢＡＴの細胞数および／または機能を増加させ、および／またはＢＡＴ：ＷＡＴ細胞比率を増加させ、それにより、対象の肥満ならびに肥満関連の疾患および障害を治療するために使用できる。
【００３７】
本明細書に記載のいくつかの方法は、ＢＭＰシグナル伝達を増加させる薬剤で処理し、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞の移植を含む。通常、当該方法は、ＢＭＰシグナル伝達を増加させるのに十分な量の化合物による前駆細胞（例えば、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞）の処理（例えば、接触）、およびその後のＢＭＰ活性化Ｓｃａ−１（＋）細胞（例えば、少なくとも１つの細胞またはかかる細胞の集団）の対象への移植を含む。適切な薬剤としては、ＢＭＰ自体（例えば、組換えタンパク質）、またはＢＭＰをコードする核酸、および／またはＢＭＰシグナル伝達を増加させる薬剤（例えば、低分子、抗体および抗体断片、医薬品、ならびにその他の生物学的薬剤）を挙げることができる。いくつ
かの実施形態では、これらの細胞の処理として、ＢＭＰ２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドを発現するためのインビトロ細胞の遺伝子組換えが挙げられる。次いで、これらの細胞を対象に投与する。かかる遺伝子組換えされたＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団も本発明の範囲内に包含される。他の化合物は本明細書に記載されている。
【００３８】
細胞種
本明細書に記載の方法における使用に適した細胞としては、幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞（例えば、哺乳類Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞）が挙げられる。Ｓｃａ−１は１８ｋＤａグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー表面タンパク質であり、造血幹細胞と組織常在前駆細胞の両方において幹細胞マーカーとして役立つ。本開示において有用なＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、各種組織および臓器（例えば、骨格筋、前立腺、真皮、心血管系、乳腺、肝臓、新生児皮膚、頭蓋冠、骨髄、腸、および脂肪組織（例えば、脂肪組織蓄積）が挙げられるが、これらに限定されない）から単離できる。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞は骨格筋（例えば、骨格筋束）から単離する。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞は脂肪組織（例えば、脂肪蓄積）から単離する。
【００３９】
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は単能性、複能性、および多能性であり得、間葉源であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は非筋原性前駆細胞である。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は非多能性細胞から人工的に生成された（例えば、分化または部分的に分化した）多能性幹細胞であり得る。かかる細胞は当該技術分野において、誘導された多能性幹細胞として知られており、一般にｉＰＳまたはｉＰＳＣと略される（総説については、例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ９：７２５−７２９， ２００８を参照されたい）。
【００４０】
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は１つまたは複数の細胞表面発現マーカーの存在または不在を測定することにより同定できる。Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の同定に使用できる模範的な細胞表面マーカーは、Ｓｃａ−１、ＣＤ４５、Ｍａｃ−１、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、デスミン、ビメンチン、およびｃ−ｋｉｔが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）陽性細胞はＳｃａ−１を検出することにより同定できる。代替的にまたは追加で、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は追加の細胞表面マーカーを検出することにより同定できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において有用なＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４５および／またはＭａｃ−１陰性であり、例えば、細胞はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）、Ｓｃａ−１（＋）／Ｍａｃ−１、またはＳｃａ−１（＋）／Ｃｄ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ２９＋細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ２９＋／Ｃｄ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は１つまたは複数の次の細胞表面マーカー、すなわちＣＤ２９＋、ＣＤ３４＋、Ｃｄ４５（−）、Ｍａｃ−１（−）、およびＣＤ１１７（−）を有するＳｃａ−１（＋）細胞であり得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の同定後、例えば、細胞系の同一性をさらに特性化するおよび／または確認するために、追加の細胞表面マーカーをＳｃａ−１（＋）前駆細胞表面上で同定できる。例えば、Ｓｃａ−１（＋）細胞は、他のマーカー（例えば、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、デスミン、ビメンチン、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、およびｃ−ｋｉｔが挙
げられるが、これらに限定されない）の細胞表面上での発現を測定するために評価できる。
【００４３】
細胞集団を確定した細胞表面マーカー（例えば、Ｓｃａ−１）によりいったん同定後、かかる細胞集団を同定、単離、および濃縮する方法は日常的であり、当該技術分野において周知である。かかる方法としては、例えば、免疫磁気細胞選別機、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）、組織培養プレートとフラスコへの付着、もしくは所望の幹細胞の増殖に有利な条件下での培養、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。かかる方法を用いて、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞またはＳｃａ−１（＋）細胞集団を単離、精製、および／または濃縮（例えば、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞集団内の細胞の少なくとも６０％、例えば、７０％、８０％、９０％または９０％超がＳｃａ−１（＋）細胞であるように）できる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＳｃａ−１（＋）細胞を、同定、単離、および／または濃縮せずに取得できる。例えば、Ｓｃａ−１（＋）細胞は細胞寄託機関（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手できる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、単離したＳｃａ−１（＋）細胞、クローン、または集団は、より大きな細胞集団を得るために、標準的な細胞培養技術を用いて培養できる。
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞を液体窒素中で保存できる。液体窒素中で保存するための細胞調製に要される技術および液体窒素中でかかる細胞を保存する方法は、日常的であり、当該技術分野において周知である。
【００４６】
「初代細胞」という用語は、哺乳類組織源から単離した細胞懸濁液中に（プレートする前、すなわち、皿またはフラスコなどの組織増殖培養基質に取り付ける前に）存在する細胞、組織由来の外植片に存在する細胞（前者のいずれも初めてプレートした細胞）、およびこれらのプレートした細胞由来の細胞懸濁液を含む。「二次細胞」または「細胞株」という用語は、培養において続く全工程の細胞を指す。二次細胞とは、１回または複数回継代した二次細胞からなる細胞株である。
【００４７】
初代幹細胞および二次幹細胞は各種組織から取得でき、培養物中で維持および増殖できる細胞種を含む。初代細胞は好ましくはＢＭＰで処理した細胞を投与すべき個体または動物から取得する。しかしながら、初代細胞はドナー（例えば、レシピエント以外の個体、典型的には同一種、好ましくは免疫的に適合する個体）からも取得できる。かかる細胞を取得および培養する方法は当該技術分野において周知である。
【００４８】
当該方法は、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の、例えば、所望サイズのクローン細胞株か異種細胞株のいずれかを（例えば、ＢＭＰ活性化の前もしくは後に、個体に治療効果をもたらすのに十分な数、または安定した細胞系を確立するのに十分な数）産生するのに十分な二重測定期間を可能にすることを含み得る。トランスフェクトしないで代わりにＢＭＰで処理した場合、これらの細胞は対象に移植前にＢＭＰ不在下でしばらく、次いでＢＭＰ存在下でしばらく（例えば、１、２、３日、または３日超）培養できる。これらの細胞は、移植前に任意の汚染物質（ＢＭＰまたは増殖培地成分など）を除去するため、移植前に（例えば、等張ＰＢＳ中で）洗浄できる。必要な細胞数は可変であり、各種要因（トランスフェクトした細胞の使用、トランスフェクトした細胞中の外因性ＤＮＡの機能レベル、トランスフェクトした細胞の移植部位（例えば、使用できる細胞数は移植の解剖位置により制限される）、ならびに対象の年齢、表面積、および臨床病態が挙げられるが、これらに限定されない）に応じて変わる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰで処理した幹細胞集団は、少なくとも１０７、１０８、１０９、または１０９を超える細胞を含む。
【００４９】
ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞は、増強したＢＭＰシグナル伝達（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７シグナル伝達）レベルを有するＳｃａ−１（＋）細胞であり、ここでＢＭＰシグナル伝達レベルは直接的なヒトの介入により増加している。ＢＭＰシグナル伝達は、当該技術分野において周知であるか本明細書に記載の任意の方法により（例えば、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物（例えば、ＢＭＰポリペプチドまたは核酸）によるこれらの細胞の処理により）これらの細胞内で増強できる。本明細書に記載の方法により活性化した幹細胞集団も本発明内に包含される。任意に、ＢＭＰで処理した細胞集団は、例えば、保存または移植のために、医薬として許容可能な担体中で懸濁できる。本明細書で使用される場合、「医薬として許容可能な担体」という言葉は、これらの細胞の医薬としての投与および生存性と適合する、任意かつすべての溶媒、媒体、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、などを含むことを意図している。通常、これらの細胞は無菌状態で維持される。製薬的活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は周知である。活性化合物と適合しない従来の媒体または薬剤はいずれも除いた上で、かかる媒体を本発明の組成物に使用できる。補充的活性化合物もこの組成物に組み込むことができる。
【００５０】
当該細胞は自己由来、同種異系由来、または異種由来であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象からの幹細胞集団の取得（任意に、精製された幹細胞集団を取得するためのこの幹細胞の培養および／または濃縮）、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させてこの幹細胞を活性化させる薬剤による幹細胞の処理、および除去した対象と同じ対象の細胞の移植を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの細胞は同種異系由来または異種由来であり、必要に応じて、これらの細胞の拒絶反応を予防するために免疫抑制剤を投与できる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物に使用されるＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、１つまたは複数のＢＭＰ受容体（例えば、Ｉ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体）を発現する。
【００５２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物は、完全長のまたは切断されたＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ、ポリペプチド、およびペプチド）である。
【００５３】
ＢＭＰは形質転換増殖因子βスーパーファミリーメンバーであり、胚発育における複数の重要段階ならびに生涯にわたり関与する（Ｋｉｓｈｉｇａｍｉ ａｎｄ Ｍｉｓｈｉｎａ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ．Ｒｅｖ． １６：２６５−２７８ （２００５）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． ２２：２３３−２４１ （２００４）； Ｙａｍａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ９１：５１９−５３４ （２００４））。ＢＭＰは脂肪細胞発達における異なる２段階において役割を果たすことが示されている。まず、ＢＭＰ−２と４は、好適な条件下で、複能性間葉細胞および骨髄間質細胞の脂肪細胞への分化を刺激する（Ｂｕｔｔｅｒｗｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ２４：１６３Ｓ （１９９６）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４２：２９５−３０５ （１９９８）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８２：１８７−１９９ （２００１）； Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ．Ａ． １０１：９６０７−９６１１ （２００４））。加えて、ＢＭＰは方向付けられた白色前駆脂肪細胞への分化も刺激する（Ｓｏｔｔｉｌｅ ａｎｄ Ｓｅｕｗｅｎ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４７５：２０１−２０４ （２０００）； Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２３：７２３０−７２４２
（２００３））。しかしながら、他の試験では、ＢＭＰ−２は脂肪細胞への分化を抑制
し、ホメオボックス遺伝子であるＭｓｘ２を介して複能性間葉前駆体における骨形成を促進したことが示された（Ｉｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７９：３４０１５−３４０２２ （２００４）； Ｓ．Ｌ． Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８：４５９６９−４５９７７ （２００３））。
【００５４】
ＢＭＰは、ＳＭＡＤタンパク質またはｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を介して信号を送る特異的Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体複合体であるＲＩａ、ＲＩｂ、およびＲＩＩに結合する。ＢＭＰは多くの態様の組織発達および形態形成（胚形成中の骨形成、出生後の増殖、リモデリングおよび骨格再生のプロセスなど）における重要事象の重要な制御因子である。ヒト組織とマウス組織の両方における局在試験により、脂肪、心臓、肺、小腸、下肢芽および歯におけるさまざまなＢＭＰのｍＲＮＡ高レベルの発現およびタンパク質合成が実証されている。
【００５５】
ＢＭＰは骨および軟骨の障害または創傷の治療において臨床で用いられている。組換えＢＭＰの効果的な臨床的使用はＥｉｎｈｏｒｎ， Ｊ． Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ
Ｓｕｒｇｅｒｙ ８５Ａ：８２−８８ （２００３）、およびＳａｎｄｈｕ， Ｓｐｉｎｅ ２８（１５）：Ｓ６４−７３ （２００３）にて論じられている。ＢＭＰポリペプチド（例えば、成熟ＢＭＰポリペプチド）自体が実行可能な治療化合物である。なぜならＢＭＰは、標的細胞に取り込まれてそこで活性を発揮する、分泌された低級タンパク質であるからである。本明細書ではヒトタンパク質について記載しているが、処理した細胞の意図したレシピエントが別の種である場合、その種（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギ）由来の相同タンパク質も使用できることを当業者は理解するであろう。かかる相同タンパク質は、例えば、当該技術分野において周知である方法を用いて、例えば、標的種において同定された同族体のための使用可能なデータベース（例えば、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベース）を検索して同定できる。
【００５６】
本明細書に記載の、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および−７は褐色脂肪細胞への分化に関与し、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７を有するＳｃａ−１（＋）前駆細胞の処理は褐色脂肪細胞分化を促進する。したがって、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７は、脂肪関連障害（肥満など）および関連障害（糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖症、高脂質血症、および高コレステロール血症など）の治療上、診断上および創薬上の標的である。通常、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団の対象への移植を含む。
【００５７】
本明細書に記載の方法における使用に適したＢＭＰは以下を含む。
ＢＭＰ−２
ＢＭＰ−２は長さ３９６個のアミノ酸であり、ヒト染色体の２０ｐ１２に位置する。ヒトＢＭＰ−２のヌクレオチド配列とアミノ酸配列はＷｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（４８８５）：１５２８−１５３４ （１９８８）に開示されている。ＢＭＰ２は形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する。骨形成タンパク質は骨形成を誘導し、ＢＭＰ２は進行性骨化性（筋炎）線維異形成症の常染色体優性遺伝性疾患の候補遺伝子である。骨形成タンパク質２は、前筋原性細胞内の用量依存性ＰＡＸ３を発現させることによって筋形成を調節し、ＳＯＸ９を通してＳＨＭ管理下、中胚葉内で発現する。
【００５８】
ヒトＢＭＰ−２を以下に示す。アミノ酸３８〜２６８はＴＧＦβプロペプチドドメインであり、２９１〜３９６はＴＧＦβファミリーＮ末端ドメインである。アミノ酸２８３〜３９６は成熟ペプチドである。この配列はＷｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４ （１９８８）に説明されている。
【００５９】
１ ＭＶＡＧＴＲＣＬＬＡ ＬＬＬＰＱＶＬＬＧＧ ＡＡＧＬＶＰＥＬＧＲ ＲＫＦＡＡＡＳＳＧＲ ＰＳＳＱＰＳＤＥＶＬ ＳＥＦＥＬＲＬＬＳＭ
６１ ＦＧＬＫＱＲＰＴＰＳ ＲＤＡＶＶＰＰＹＭＬ ＤＬＹＲＲＨＳＧＱＰ ＧＳＰＡＰＤＨＲＬＥ ＲＡＡＳＲＡＮＴＶＲ ＳＦＨＨＥＥＳＬＥＥ
１２１ ＬＰＥＴＳＧＫＴＴＲ ＲＦＦＦＮＬＳＳＩＰ ＴＥＥＦＩＴＳＡＥＬ ＱＶＦＲＥＱＭＱＤＡ ＬＧＮＮＳＳＦＨＨＲ ＩＮＩＹＥＩＩＫＰＡ
１８１ ＴＡＮＳＫＦＰＶＴＲ ＬＬＤＴＲＬＶＮＱＮ ＡＳＲＷＥＳＦＤＶＴ ＰＡＶＭＲＷＴＡＱＧ ＨＡＮＨＧＦＶＶＥＶ ＡＨＬＥＥＫＱＧＶＳ
２４１ ＫＲＨＶＲＩＳＲＳＬ ＨＱＤＥＨＳＷＳＱＩ ＲＰＬＬＶＴＦＧＨＤ ＧＫＧＨＰＬＨＫＲＥ ＫＲＱＡＫＨＫＱＲＫ ＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰ
３０１ ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷ ＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹ ＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰ ＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴ ＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮ ＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣ
３６１ ＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳ ＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶ ＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶ ＥＧＣＧＣＲ （配列番号１）
ＢＭＰ−２の成熟形態は、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖、および４つの潜在的なジスルフィド架橋を含む。ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１２６４３；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：９２６を参照されたい。
【００６０】
ＢＭＰ−４
ＢＭＰ−４は軟骨および骨形成を誘導し、中胚葉誘導、歯の発達、肢形成および骨折修復において重要である。ＢＭＰ−４プレプロタンパク質配列を以下に示す。アミノ酸４１〜２７６はＴＧＦβプロペプチドドメインであり、３０２〜４０８はＴＧＦβファミリーＮ末端ドメインである。アミノ酸２９３〜４０８は成熟ペプチドである。この配列はＷｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４ （１９８８）に説明されている。
【００６１】
１ ＭＩＰＧＮＲＭＬＭＶ ＶＬＬＣＱＶＬＬＧＧ ＡＳＨＡＳＬＩＰＥＴ ＧＫＫＫＶＡＥＩＱＧ ＨＡＧＧＲＲＳＧＱＳ ＨＥＬＬＲＤＦＥＡＴ
６１ ＬＬＱＭＦＧＬＲＲＲ ＰＱＰＳＫＳＡＶＩＰ ＤＹＭＲＤＬＹＲＬＱ ＳＧＥＥＥＥＥＱＩＨ ＳＴＧＬＥＹＰＥＲＰ ＡＳＲＡＮＴＶＲＳＦ
１２１ ＨＨＥＥＨＬＥＮＩＰ ＧＴＳＥＮＳＡＦＲＦ ＬＦＮＬＳＳＩＰＥＮ ＥＡＩＳＳＡＥＬＲＬ ＦＲＥＱＶＤＱＧＰＤ ＷＥＲＧＦＨＲＩＮＩ
１８１ ＹＥＶＭＫＰＰＡＥＶ ＶＰＧＨＬＩＴＲＬＬ ＤＴＲＬＶＨＨＮＶＴ ＲＷＥＴＦＤＶＳＰＡ ＶＬＲＷＴＲＥＫＱＰ ＮＹＧＬＡＩＥＶＴＨ
２４１ ＬＨＱＴＲＴＨＱＧＱ ＨＶＲＩＳＲＳＬＰＱ ＧＳＧＮＷＡＱＬＲＰ ＬＬＶＴＦＧＨＤＧＲ ＧＨＡＬＴＲＲＲＲＡ ＫＲＳＰＫＨＨＳＱＲ
３０１ ＡＲＫＫＮＫＮＣＲＲ ＨＳＬＹＶＤＦＳＤＶ ＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰ ＧＹＱＡＦＹＣＨＧＤ ＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮ ＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬ
３６１ ＶＮＳＶＮＳＳＩＰＫ ＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡ ＩＳＭＬＹＬＤＥＹＤ ＫＶＶＬＫＮＹＱＥＭ ＶＶＥＧＣＧＣＲ （配列番号２）
ＢＭＰ−４の成熟形態は、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖を含む。変異型はＶ１５２がＡである形で存在する。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１２６４４；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：７２４７を参照されたい。
【００６２】
ＢＭＰ−５
ＢＭＰ−５プレプロタンパク質は、以下に示すとおり４５４個のアミノ酸タンパク質である。ＢＭＰ−５は軟骨および骨形成を誘導する。この配列はＣｅｌｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７， ９８４３−９８４７， １９９０に説明されている。
【００６３】
１ ＭＨＬＴＶＦＬＬＫＧ ＩＶＧＦＬＷＳＣＷＶ ＬＶＧＹＡＫＧＧＬＧ ＤＮＨＶＨＳＳＦＩＹ ＲＲＬＲＮＨＥＲＲＥ ＩＱＲＥＩＬＳＩＬＧ
６１ ＬＰＨＲＰＲＰＦＳＰ ＧＫＱＡＳＳＡＰＬＦ ＭＬＤＬＹＮＡＭＴＮ ＥＥＮＰＥＥＳＥＹＳ ＶＲＡＳＬＡＥＥＴＲ ＧＡＲＫＧＹＰＡＳＰ
１２１ ＮＧＹＰＲＲＩＱＬＳ ＲＴＴＰＬＴＴＱＳＰ ＰＬＡＳＬＨＤＴＮＦ ＬＮＤＡＤＭＶＭＳＦ ＶＮＬＶＥＲＤＫＤＦ ＳＨＱＲＲＨＹＫＥＦ
１８１ ＲＦＤＬＴＱＩＰＨＧ ＥＡＶＴＡＡＥＦＲＩ ＹＫＤＲＳＮＮＲＦＥ ＮＥＴＩＫＩＳＩＹＱ ＩＩＫＥＹＴＮＲＤＡ ＤＬＦＬＬＤＴＲＫＡ
２４１ ＱＡＬＤＶＧＷＬＶＦ ＤＩＴＶＴＳＮＨＷＶ ＩＮＰＱＮＮＬＧＬＱ ＬＣＡＥＴＧＤＧＲＳ ＩＮＶＫＳＡＧＬＶＧ ＲＱＧＰＱＳＫＱＰＦ
３０１ ＭＶＡＦＦＫＡＳＥＶ ＬＬＲＳＶＲＡＡＮＫ ＲＫＮＱＮＲＮＫＳＳ ＳＨＱＤＳＳＲＭＳＳ ＶＧＤＹＮＴＳＥＱＫ ＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ
３６１ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷ ＩＩＡＰＥＧＹＡＡＦ ＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬ ＮＡＨＭＮＡＴＮＨＡ ＩＶＱＴＬＶＨＬＭＦ ＰＤＨＶＰＫＰＣＣＡ
４２１ ＰＴＫＬＮＡＩＳＶＬ ＹＦＤＤＳＳＮＶＩＬ ＫＫＹＲＮＭＶＶＲＳ ＣＧＣＨ （配列番号３）
成熟ＢＭＰ−５タンパク質は配列番号３のアミノ酸３２３〜４５４であると考えられ、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖、および４つの潜在的なジスルフィド架橋を有する。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２２００３；Ｑ９Ｈ５４７；またはＱ９ＮＴＭ５；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２２４１２を参照されたい。
【００６４】
ＢＭＰ−６
ＢＭＰ−６は軟骨細胞分化の自己分泌刺激物であり、胚神経発達、および泌尿系、ならびに肝臓およびケラチノサイトの増殖および分化に関与する。ＢＭＰ−６ノックアウトマウスは生存可能であり、胸骨の骨化においてわずかな遅延を示す。ＢＭＰ−６（前駆体）は、５７ｋＤタンパク質、長さ５１３個のアミノ酸であり、ヒトの染色体６ｐ２４に局所する。ヒトＢＭＰ−６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は米国特許第５，１８７，０７６号に開示されている。ＢＭＰ−６は、切断された、測定分子量約１５Ｋｄの１３２個のアミノ酸成熟ポリペプチドを生じる前駆体分子として合成されると予測される。ＢＭＰ−６の成熟形態は、３つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖を含む。活性ＢＭＰ−６タンパク分子は二量体と思われる。ＢＭＰ−６の成熟形態の加工は、関連タンパク質ＴＧＦβの加工と類似の方法でＮ末端領域の二量化および除去に関与する（Ｇｅｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４１６２ （１９８８）； Ｄｅｒｎｙｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７０１ （１９８５））。ヒトＢＭＰ−６前駆体を以下に示す。成熟ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸３７４〜５１３を含むと考えられる。他の活性ＢＭＰ−６ポリペプチドとしては、配列番号４のアミノ酸３８２〜５１３、３８８〜５１３および４１２〜５１３を含むポリペプチドが挙げられる。
【００６５】
ＭＰＧＬＧＲＲＡＱＷ ＬＣＷＷＷＧＬＬＣＳ ＣＣＧＰＰＰＬＲＰＰ ＬＰＡＡＡＡＡＡＡＧ ＧＱＬＬＧＤＧＧＳＰ ＧＲＴＥＱＰＰＰＳＰ ６１
ＱＳＳＳＧＦＬＹＲＲ ＬＫＴＱＥＫＲＥＭＱ ＫＥＩＬＳＶＬＧＬＰ ＨＲＰＲＰＬＨＧＬＱ ＱＰＱＰＰＡＬＲＱＱ ＥＥＱＱＱＱＱＱＬＰ １２１
ＲＧＥＰＰＰＧＲＬＫ ＳＡＰＬＦＭＬＤＬＹ ＮＡＬＳＡＤＮＤＥＤ ＧＡＳＥＧＥＲＱＱＳ ＷＰＨＥＡＡＳＳＳＱ ＲＲＱＰＰＰＧＡＡＨ １８１
ＰＬＮＲＫＳＬＬＡＰ ＧＳＧＳＧＧＡＳＰＬ ＴＳＡＱＤＳＡＦＬＮ ＤＡＤＭＶＭＳＦＶＮ ＬＶＥＹＤＫＥＦＳＰ ＲＱＲＨＨＫＥＦＫＦ ２４１
ＮＬＳＱＩＰＥＧＥＶ ＶＴＡＡＥＦＲＩＹＫ ＤＣＶＭＧＳＦＫＮＱ ＴＦＬＩＳＩＹＱＶＬ ＱＥＨＱＨＲＤＳＤＬ ＦＬＬＤＴＲＶＶＷＡ ３０１
ＳＥＥＧＷＬＥＦＤＩ ＴＡＴＳＮＬＷＶＶＴ ＰＱＨＮＭＧＬＱＬＳ ＶＶＴＲＤＧＶＨＶＨ ＰＲＡＡＧＬＶＧＲＤ ＧＰＹＤＫＱＰＦＭＶ ３６１
ＡＦＦＫＶＳＥＶＨＶ ＲＴＴＲＳＡＳＳＲＲ ＲＱＱＳＲＮＲＳＴＱ ＳＱＤＶＡＲＶＳＳＡ ＳＤＹＮＳＳＥＬＫＴ ＡＣＲＫＨＥＬＹＶＳ ４２１
ＦＱＤＬＧＷＱＤＷＩ ＩＡＰＫＧＹＡＡＮＹ ＣＤＧＥＣＳＦＰＬＮ ＡＨＭＮＡＴＮＨＡＩ ＶＱＴＬＶＨＬＭＮＰ ＥＹＶＰＫＰＣＣＡＰ ４８１
ＴＫＬＮＡＩＳＶＬＹ ＦＤＤＮＳＮＶＩＬＫ ＫＹＲＮＭＶＶＲＡＣ ＧＣＨ （配列番号４）
ヒトＢＭＰ−６プロモーターは特性化されており（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９８， １３９５（３）：２４７−５１を参照されたい）、本明細書に記載の方法に使用できる。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２２００４； ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：１３００を参照されたい。
【００６６】
ＢＭＰ−６の投与、アンチセンス処理、および定量についてはＢｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３８， Ｎｏ．７ ２８２０−２８２８）に記載されている。
【００６７】
ＢＭＰ−７
ＢＭＰ−７もＴＧＦβスーパーファミリーに属する。ＢＭＰ−７は軟骨および骨形成を誘導し、上皮骨形成の現象に関与する骨誘導因子であり得る。ＢＭＰ−７はカルシウム調節および骨恒常性、ならびに成人腸組織内の抗炎症反応の調節において役割を果たす。ＢＭＰ−７配列を以下に示す：
１ ＭＨＶＲＳＬＲＡＡＡ ＰＨＳＦＶＡＬＷＡＰ ＬＦＬＬＲＳＡＬＡＤ ＦＳＬＤＮＥＶＨＳＳ ＦＩＨＲＲＬＲＳＱＥ ＲＲＥＭＱＲＥＩＬＳ
６１ ＩＬＧＬＰＨＲＰＲＰ ＨＬＱＧＫＨＮＳＡＰ ＭＦＭＬＤＬＹＮＡＭ ＡＶＥＥＧＧＧＰＧＧ ＱＧＦＳＹＰＹＫＡＶ ＦＳＴＱＧＰＰＬＡＳ
１２１ ＬＱＤＳＨＦＬＴＤＡ ＤＭＶＭＳＦＶＮＬＶ ＥＨＤＫＥＦＦＨＰＲ ＹＨＨＲＥＦＲＦＤＬ ＳＫＩＰＥＧＥＡＶＴ ＡＡＥＦＲＩＹＫＤＹ
１８１ ＩＲＥＲＦＤＮＥＴＦ ＲＩＳＶＹＱＶＬＱＥ ＨＬＧＲＥＳＤＬＦＬ ＬＤＳＲＴＬＷＡＳＥ ＥＧＷＬＶＦＤＩＴＡ ＴＳＮＨＷＶＶＮＰＲ
２４１ ＨＮＬＧＬＱＬＳＶＥ ＴＬＤＧＱＳＩＮＰＫ ＬＡＧＬＩＧＲＨＧＰ ＱＮＫＱＰＦＭＶＡＦ ＦＫＡＴＥＶＨＦＲＳ ＩＲＳＴＧＳＫＱＲＳ
３０１ ＱＮＲＳＫＴＰＫＮＱ ＥＡＬＲＭＡＮＶＡＥ ＮＳＳＳＤＱＲＱＡＣ ＫＫＨＥＬＹＶＳＦＲ ＤＬＧＷＱＤＷＩＩＡ ＰＥＧＹＡＡＹＹＣＥ
３６１ ＧＥＣＡＦＰＬＮＳＹ ＭＮＡＴＮＨＡＩＶＱ ＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴ ＶＰＫＰＣＣＡＰＴＱ ＬＮＡＩＳＶＬＹＦＤ ＤＳＳＮＶＩＬＫＫＹ
４２１ ＲＮＭＶＶＲＡＣＧＣ Ｈ （配列番号５）
アミノ酸１〜２９は潜在的なシグナル配列である；３０〜４３１はプレプロペプチドであり、２９３〜４３１は成熟タンパク質である。ＢＭＰ−７の成熟形態は、４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位／ポリペプチド鎖、および４つの潜在的なジスルフィド架橋を含む。ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１８０７５；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２０４１０を参照されたい。
【００６８】
本明細書に記載の組成物および方法は、１つまたは複数の上に示したＢＭＰ配列との同一性が少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％）であるアミノ酸配列の使用も意図する。本明細書で使用される場合、かかる配列もＢＭＰと呼ばれる。
【００６９】
２つの配列間の同一性の百分率を測定するため、これらの配列を最適比較目的で並べる（第一アミノ酸と第二アミノ酸の片方もしくは両方、または最適アライメントに要する核
酸配列にギャップを導入し、比較目的で非相同配列は無視できる）。比較目的で並べた基準配列の長さは少なくとも８０％である（いくつかの実施形態では、基準配列の長さの約８５％、９０％、９５％、または１００％を並べる）。次いで、対応位置のヌクレオチドまたは残基を比較する。第一配列の位置が、第二配列の対応位置と同じヌクレオチドまたは残基に占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の百分率は、これらの配列が共有する同一位置数の関数であり、２つの配列の最適アライメントのために導入を要するギャップ数、および各ギャップの長さが考慮される。
【００７０】
配列の比較および２つの配列間の同一性の百分率の測定は、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げることができる。例えば、２つのアミノ酸配列間の同一性の百分率はＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを用いて、ならびに１２ギャップペナルティ、４ギャップ延長ペナルティ、および５フレームシフトギャップペナルティを用いるブロッサム６２スコアリングマトリックス（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を用いて測定できる。
【００７１】
ＢＭＰは、組換え技術を用いてまたは化学合成を用いて生成できる。かかるポリペプチドを生成するための方法、およびかかるポリペプチド精製に要される方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ （ＣＳＨＬ
Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｔｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）を参照されたい。
【００７２】
ＢＭＰを修飾して、このタンパク質の薬物動態特性を改変することができる。例えば、かかる修飾は、より長い循環半減期、細胞取り込みの増大、標的組織への分布の改善、クリアランス低下および／または免疫原性低下をもたらし得る。ＢＭＰ治療活性の最適化に有用な多くのアプローチ（化学的修飾など）が当該技術分野において周知である。
【００７３】
発現系
ＢＭＰは組換えタンパク質として発現できる。組換えタンパク質において、発現系の選択は薬物動態特性に影響し得る。発現系間の翻訳後プロセスの相違により、分子サイズおよび電荷がさまざまな組換えタンパク質が生じ得、それは例えば、循環半減期、クリアランス率および免疫原性に影響し得る。このタンパク質の薬物動態特性は、好適な発現系選択（細菌性、ウイルス性、または哺乳類の発現系選択など）によって最適化される場合がある。治療タンパク質の発現系に有用な代表的な哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯＳ−１細胞系およびＣＶ−１細胞系である。
【００７４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞内でＢＭＰを発現させるために設計できる。例えば、本発明のタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳類細胞内で発現できる。適切な宿主細胞の詳細については、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ １９９０）で論じられている。あるいは、この組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写かつ翻訳できる。
【００７５】
化学的修飾
ＢＭＰは活性を維持しつつ薬物動態特性を向上させるために化学的に改変できる。このタンパク質を各種部分と共有結合させて、タンパク質の分子サイズおよび電荷を改変し、それによってこのタンパク質の薬物動態特性を改変することができる。この部分は好まし
くは非毒性および生体適合性である。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はタンパク質に共有結合できる（ペグ化）。各種ＰＥＧ分子が周知であり、および／または市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のカタログを参照されたい）。ペグ化によりタンパク質の安定性を向上でき、エピトープの立体的被覆により免疫原性を低下させることができ、および糸球体ろ過を減少することにより半減期を改善できる。（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｎｏ．６８０，
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ （１９９７）； Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ４０：４８５−５６３， ２００１）を参照されたい）。ＰＥＧ構築物として投与される治療タンパク質の例としては、Ａｄａｇｅｎ（商標登録）（ＰＥＧ−ＡＤＡ）およびＯｎｃｏｓｐａｒ（商標登録）（ペグ化アスパラギナーゼ）が挙げられる。別の実施形態では、このタンパク質はアミノ基を介して酸化デキストランに同様に結合できる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｃｕｒｒ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ． Ｈａｅｍａｔ．
Ｄｉｓ．， １：１−２２， ２００１を参照されたい）。さらに別の実施形態では、アルギニンオリゴマーのシクロスポリンＡへの共役により局所送達を促進できる（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ６：１２５３−１２５７， ２０００）。
【００７６】
さらに、このタンパク質は別のタンパク質に化学的結合して、例えば、（例えば、二機能性の架橋試薬を介して）担体タンパク質に架橋結合して長い循環半減期および改善された細胞取り込みを有する高分子量複合体を形成することが可能である。いくつかの実施形態では、この担体タンパク質は血清タンパク質（アルブミンなど）であり得る。別の実施形態では、この治療タンパク質は、（例えば、ヘテロ二機能性またはホモ二機能性の架橋試薬を介して）自身と架橋結合してホモ二量体、三量体、またはより高次の類似体を形成することが可能である（Ｓｔｙｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：１１８４−１１８８， １９９８を参照されたい）。この治療タンパク質の二量化もしくは三量化を通した分子量およびサイズの増加により、クリアランスを低下させることができる。
【００７７】
タンパク質剤形
タンパク質剤形は、最適化してもよい。例えば、ＢＭＰは担体系内で処方できる。この担体はコロイド系であり得る。このコロイド系はリポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。１つの実施形態では、この治療タンパク質は、タンパク質の完全性を維持しつつリポソームに封入される。当業者が理解するであろうように、リポソームを調製する各種方法がある。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｎａｌ．， ３３：３３７−４６２， １９８８； Ａｎｓｅｌｅｍ ｅｔ
ａｌ．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）を参照されたい）。リポソーム剤形はクリアランスを遅延化し、細胞取り込みを増大することができる（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．， ３４：９１５−９２３， ２０００を参照されたい）。
【００７８】
この担体はポリマー（例えば、生体分解性、生体適合性ポリマーマトリックス）でもあり得る。１つの実施形態では、この治療タンパク質はタンパク質の完全性を維持しつつポリマーマトリックスに埋め込むことができる。このポリマーは天然（ポリペプチド、タンパク質または多糖類など）でも、合成（ポリ（α−ヒドロキシ）酸など）でもよい。例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできている担体が挙げられる。１つの実施形態では、このポリマーはポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸／グリコ
ール酸共重合体（ＰＧＬＡ）である。この重合体マトリックスは各種形態およびサイズ（マイクロスフェアおよびナノスフェアなど）に調製および単離できる。ポリマー剤形は治療効果の持続時間を延長させることができる（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．， ３４：９１５−９２３， ２０００を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー剤形が臨床試験で用いられている（Ｋｏｚａｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｉｃｈ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２：５４８−５５２， １９９８を参照されたい）。
【００７９】
高分子マイクロスフェアの持続放出製剤の例は、ＰＣＴ国際公開特許第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号（いずれもＺａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号（Ｚａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＰＣＴ国際公開特許第００／３８６５１号（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号ならびにＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号では、塩凝集に対して安定したエリスロポエチン粒子を含有する重合体マトリックスについて述べられている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＢＭＰの細胞内への侵入を促進する細胞透過ペプチド配列（例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポルタン、またはｈＣＴ由来の細胞透過ペプチド）を含む、例えば、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ３：３１０−８， ２００１； Ｌａｎｇｅｌ， Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ ２００２）； Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｄｅｓ．， １１：３５９７−６１１， ２００５；およびＤｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ６２：１８３９−４９， ２００５を参照されたい。
【００８１】
ペプチド模倣物
いくつかの実施形態では、該ＢＭＰタンパク質はペプチド模倣物である（例えば、ペプチドまたは非ペプチドのペプチド模倣物のいずれか）。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成は当該技術分野において周知である。かかるペプチド模倣物としては、当該技術分野において周知である方法によりペプチド模倣物を産出するために修飾可能なＢＭＰが挙げられる。例えば、Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ， Ｗ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ （Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ １９９８）； Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ， Ｔｈｉｅｌｅ Ｖｅｒｌａｇ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００３）；およびＭａｙｏ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８：４５７４６， ２００３を参照されたい。一部の事例では、本明細書に開示されたペプチドおよび断片のこれらの修飾ペプチド模倣物バージョンは、非ペプチド模倣物ペプチドと比較して増強したインビボ安定性を示す。ペプチド模倣物の作製方法は、１つまたは複数（例えば、すべて）のＤ−アミノ酸エナンチオマーを有するペプチド配列中のアミノ酸の置換を含む。かかる配列は本明細書にて「レトロ」配列と呼ぶ。別の方法では、元のペプチドのアミノ酸残基のＮ末端からＣ末端までの順が修飾ペプチド模倣物におけるアミノ酸残基のＣ末端からＮ末端までの順になるように、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端の順が逆転する。かかる配列は「インベルソ」配列と呼ぶことができる。ペプチド模倣物はレトロとインベルソの両バージョン、すなわち、本明細書に開示されたペプチドの「レトロ−インベルソ」バージョンであり得る。Ｄ−アミノ酸からなる新規ペプチド模倣物はペプチド模倣物のアミノ酸残基のＮ末
端からＣ末端までの順が元のペプチドのアミノ酸残基のＣ末端からＮ末端までの順に相当するように配列できる。
【００８２】
ペプチド模倣物を作製するための他の方法としては、ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、アミノ酸の化学的に異なるが認識された機能的類似体、すなわち、人工アミノ酸類似体と置換することが挙げられる。人工アミノ酸類似体としては、β−アミノ酸、β−置換β−アミノ酸（「β３−アミノ酸」）、アミノ酸のリン類似体（α−アミノホスホン酸およびα−アミノホスフィン酸など）、および非ペプチド結合を有するアミノ酸が挙げられる。人工アミノ酸は、ペプチド模倣物（ペプトイドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドまたはエステル類似体）、β−ペプチド、環状ペプチド、オリゴウレアまたはオリゴカルバメートペプチド；または複素環分子など）の作製に使用できる。これらの配列は、例えば、アミノ末端のビオチニル化およびカルボキシ末端のアミド化により修飾できる。
【００８３】
本明細書に記載のペプチド（本明細書に記載の変異形態を含む）はいずれも、異種ポリペプチドをさらに含み得る。この異種ポリペプチドは、取り付いた（例えば、融合タンパク質として融合した）ペプチドの循環半減期を延長するポリペプチドであり得る。この異種ポリペプチドはアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたはその一部分）または免疫グロブリンの一部分（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）であり得る。この異種ポリペプチドはミトコンドリア透過性部分であり得る。
【００８４】
本開示は合成模倣化合物も意図する。当該技術分野において周知であるとおり、ペプチドは、カップリング剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）など）との反応により活性化したカルボキシル基にアミノ基を結合させることによって合成できる。活性化したカルボキシルに対する遊離アミノ基の攻撃は、ペプチド結合の形成およびジシクロヘキシル尿素の放出に至る。反応のために意図したアミノ基およびカルボキシル基以外の潜在的反応基を保護することが必要であり得る。例えば、活性化カルボキシル基を含む成分のα−アミノ基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基によりブロックできる。この保護基は続いてペプチドを希酸へ曝露することにより除去してインタクトなペプチド結合を残すことができる。この方法で、ペプチドは、不溶性マトリックス（ポリスチレンビードなど）に結合した成長ペプチド鎖にアミノ酸を段階的に添加する固体相方法によって容易に合成できる。まず、所望のペプチド配列のカルボキシル末端アミノ酸（アミノ保護基を有する）はポリスチレンビードに固定される。次いで、アミノ酸の保護基は除去される。次のアミノ酸（保護基を有する）をカップリング剤と共に添加する。この後、洗浄サイクルを行なう。このサイクルは必要に応じて反復する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示の模倣物は本明細書に記載のＢＭＰタンパク質相同配列を有するペプチドである。これらの模倣物としては、Ｌ−アミノ酸がそれらのＤ−異性体に置換されたペプチドが挙げられるが、これに限定されない。配列の相同性、およびより重要なことに統計的に有意な類似性を検討するための一般的な方法の１つは、Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎにより記載されたアルゴリズムを用いたモンテカルロ解析を用いてＺ値を得ることである。この解析によれば、６を超えるＺ値は有意である可能性を示し、１０を超えるＺ値は統計的に有意であるとみなされる（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ
Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ８５：２４４４−２４４８， １９８８； Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７：１４３５−１４４１， １９８５）。より一般的には、本明細書に記載のＢＭＰおよび上記の模倣物は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２１：５０２０−５０３１， １９８２； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ
Ｗｅｌｌｉｎｇｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ），
８２：５１３１−５１３５， １９８５； Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２８９：４４−６６， １９９７またはＧｕｙ ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２８９：６７−８３， １９９７によって記載されているティーバッグ（ｔｅａ−ｂａｇ）法またはペプチド固相合成法など、任意の周知の方法を用いて、または市販されている自動化シンセサイザーを用いて合成できる。
【００８６】
標的ペプチド
いくつかの実施形態では、ＢＭＰおよび／またはＢＭＰアゴニストはインビトロおよび／またはインビボＳｃａ−１（＋）細胞を標的とできる。具体的な細胞種および組織に対して化合物を標的とする方法は、当該技術分野において周知である。例えば、具体的な細胞もしくは組織に対するペプチドならびにその他の治療薬を標的とする組成物および方法は、意図した標的細胞もしくは組織（例えば、抗体もしくは抗体の抗原結合断片、ならびに短い親和性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）に独特もしくは特異的な抗原もしくはマーカーを標的とできる材料の使用を含む。いくつかの実施形態では、かかる材料はＳｃａ−１および／またはＣＤ２９に対して特異的であり得る。
【００８７】
一例として、ＢＭＰまたはＢＭＰアゴニストおよびＳｃａ−１標的部分（例えば、抗Ｓｃａ−１抗体またはその抗原結合断片）に結合したナノ粒子を使用できる。このＢＭＰと標的部分は、同じナノ粒子上にもあり得るし、異なるナノ粒子上にもあり得る。いくつかの実施形態では、この組成物は、ＢＭＰおよび離れている標的部分（例えば、Ｓｃａ−１標的部分に結合したナノ粒子）を含む。
【００８８】
多くの生体適合性ナノ粒子が当該技術分野において周知である（例えば、有機または無機ナノ粒子など）。リポソーム、デンドリマー、カーボンナノ材料および重合体ミセルは有機ナノ粒子の例である。量子ドットも使用できる。無機ナノ粒子としては、金属性ナノ粒子、例えば、Ａｕ、Ｎｉ、ＰｔおよびＴｉＯ２ナノ粒子が挙げられる。磁気ナノ粒子（例えば、デキストランまたはＰＥＧ分子で囲まれた１０〜２０ｎｍのＦｅ２＋および／またはＦｅ３＋核を有する球形ナノ結晶）も使用できる。いくつかの実施形態では、例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６（１）：８３−９０ （２００８）；米国特許第７０６０１２１号；同第７２３２４７４号；および米国特許公開第２００８／０１６６７０６号に記載されているようにコロイド金ナノ粒子が用いられる。適切なナノ粒子、および多機能性ナノ粒子の構築および使用方法については、例えば、Ｓａｎｖｉｃｅｎｓ ａｎｄ Ｍａｒｃｏ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２６（８）：４２５−４３３ （２００８）にて論じられている。
【００８９】
すべての実施形態において、このナノ粒子は官能基を介して本明細書に記載のＢＭＰおよび標的部分に取り付いている（結合している）。いくつかの実施形態では、このナノ粒子は官能基を含むポリマーに結合しており、また、互いに分散した金属酸化物を保つために役立つ。このポリマーは、合成ポリマー（ポリエチレングリコールまたはシランが挙げられるが、これらに限定されない）、天然ポリマー、もしくは合成ポリマーか天然ポリマーのいずれかの誘導体、またはこれらの組み合わせであり得る。有用なポリマーは親水性である。いくつかの実施形態では、ポリマー「コーティング」とは磁気金属酸化物周囲の連続的フィルムではなく、金属酸化物に取り付け、金属酸化物を囲む拡張ポリマー鎖の「メッシュ」または「曇状物」である。このポリマーは、多糖類および誘導体（デキストラン、プラナン、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、および／または還元したカルボキシメチルデキストランなど）を含有し得る。この金属酸化物は、互いに接触し、またはこのポリマーによって個々に封入または包囲される１つまたは複数の結晶集合体であり得る。
【００９０】
他の実施形態では、このナノ粒子は非重合体の官能基組成物に結合している。結合ポリ
マーなしで安定化した、機能的ナノ粒子を合成する方法は周知であり、これも本発明の範囲内である。かかる方法は、例えば、Ｈａｌｂｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ８０ （５−６）：３７９−９０， １９９８に記載されている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、このナノ粒子の全体サイズは直径約１〜１００ｎｍ未満（例えば、約２５〜７５ｎｍ、例えば、約４０〜６０ｎｍ、または約５０〜６０ｎｍ）である。いくつかの実施形態でのこのポリマー成分は、例えば、厚さ約５〜２０ｎｍ、または２０ｎｍ超のコーティング形態中にあり得る。このナノ粒子の全体サイズは約１５〜２００ｎｍ（例えば、約２０〜１００ｎｍ、約４０〜６０ｎｍ；または約６０ｎｍ）である。
【００９２】
抗体
いくつかの実施形態では、例えば、細胞を選択的に標的とするために、抗体を用いて、Ｓｃａ−１（＋）細胞またはＳｃａ−１（＋）細胞含有組織にＢＭＰを標的化できる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、このＢＭＰタンパク質は、（例えば、細胞内の）１つまたは複数のＢＭＰの発現および／または活性を増加させる抗体の代わりにまたはそれらと併せて使用できる。
【００９４】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全長の２本鎖免疫グロブリン分子ならびにその抗原結合部分および断片（合成変異型を含む）を指す。典型的な完全長の抗体は、２本の重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨと略す）、および２本の軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬと略す）を含む。抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、完全長の抗体の特異的な標的結合能を保持する１つまたは複数の断片を指す。抗原結合断片の例としては：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６ （１９８９））；ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬとＶＨは、別々の遺伝子にコードされるが、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６， １９８８；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３， １９８８を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を用いて結合できる。かかる単鎖抗体も「抗原結合断片」という用語に含まれる。
【００９５】
抗体および抗体断片の産生については、当該技術分野において詳述されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５， １９８６は、ヒト抗体ＣＤＲとマウス抗体ＣＤＲとの置換について開示している。Ｍａｒｘ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：４５５−４５６， １９８５では、マウス可変領域とヒト定常領域を有するキメラ抗体について論じられている。Ｒｏｄｗｅｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９９−１００， １９８９では、抗体ＣＤＲ情報から得られた低分子量認識素子について論じられている。Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３０５２：３６−３９， １９９１では、遺伝子組換えされたモノクローナル抗体（Ｆｖ断片誘導体、単鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体およびヒト化齧歯類抗体など
）について論じられている。Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７， １９８８はラット超可変領域が移植されたヒト抗体について開示している。Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６， １９８８はヒト抗体上へのマウス抗原結合部位の移植について教示している。
【００９６】
低分子薬物
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＭＰタンパク質の発現または活性を促進する薬物（例えば、低分子薬物）を提供する。いくつかの実施形態では、かかる低分子薬物は、本明細書に記載の薬物スクリーニング方法を用いて同定できる。好ましい実施形態では、本発明の低分子薬物は、細胞内のＢＭＰ活性および／または発現の増加を促進する。いくつかの実施形態では、低分子薬物は下記の薬物スクリーンを用いて同定される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰアゴニストは米国特許第７，４８２，３２９号に開示された分子、またはそのペプチド模倣物である。
ＢＭＰ核酸
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞由来は、（例えば、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に、あるいはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列なしでＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７、またはそのアゴニストをコードする）異種ヌクレオチド配列を含む外因性核酸とトランスフェクトして、一時的にまたは安定して、長期間にわたりコードした産物を産生することができる。異種アミノ酸は調節配列（例えば、プロモーター）でもあり得、内因性ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７配列の発現（例えば、構成的もしくは誘導可能な発現または上方制御）を惹起する。外因性核酸配列は、例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（かかる内容は参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、相同組換えによって初代細胞または二次細胞に導入できる。このトランスフェクトした細胞は、選択可能な表現型を付与してそれらの同定および単離を促進する選択可能なマーカーをコードするＤＮＡを含むこともできる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＢＭＰシグナル伝達を増加させる化合物としては、例えば、ＢＭＰ核酸（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７コード配列またはその活性断片）、および任意の：プロモーター配列、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来のプロモーター配列；エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来の５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７遺伝子由来または別の遺伝子由来の３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列；またはＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７の発現を増加させる別の配列が挙げられる。
【００９９】
本明細書に記載の核酸、例えば、本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子構築物に組み込むことができる。本明細書に記載の方法は、特定の細胞種、例えば、幹細胞（例えば、多能性間葉系幹細胞）内の本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７ポリペプチドのインビトロのトランスフェクションおよび発現のために、かかる発現ベクターを使用できる。ＢＭＰ核酸配列を含む発現構築物は、任意の有効な担体（例えば、成分遺伝子をインビボ細胞に効果的に送達する能力を有する任意の製剤または組成物）中に投与できる。アプローチとしては、ウイルスベクター（組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１など）、または組換え細菌もしくは真核生物プラスミドへの遺
伝子挿入が挙げられる。ウイルスベクターは細胞に直接トランスフェクトし；プラスミドＤＮＡは、裸でまたは、例えば、カチオンリポソーム（リポフェクトアミン）または誘導体化（例えば、共役抗体）、ポリリシン共役体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープもしくは他のそのような細胞内担体の補助によるか、遺伝子構築物の直接注入もしくはインビボで行なわれるＣａＰＯ４沈殿によって、送達できる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターは１つまたは複数のＢＭＰ核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有するウイルスベクターである。細胞のウイルスベクター感染には、高い割合の標的細胞が核酸を取り込むことができるという利点がある。さらに、（例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡにより）ウイルスベクター内でコードされた分子はウイルスベクター核酸を組み込む細胞内で効率よく発現する。
【０１０１】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボ外因性遺伝子移入のための組換え遺伝子送達系として、特にヒトに使用できる。これらのベクターは細胞内への遺伝子の有効な送達を提供し、この移入された核酸は安定して宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれる。複製欠陥レトロウイルスのみ産生する特殊細胞系（「パッケージング細胞」と呼ぶ）の開発は遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性を高め、欠陥レトロウイルスは遺伝子療法目的の遺伝子移入における使用のために特性化される（Ｈｕ ａｎｄ Ｐａｔｈａｋ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５２：４９３−５１１ （２０００）； Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ２０８：２２９−３１８ （２００６）で論評されている）。複製欠陥のあるレトロウイルスはウイルス粒子中にパッケージングでき、標準的な技術を用いて、ヘルパーウイルスを用いて標的細胞を感染させるために使用できる。組換えレトロウイルスを産出するため、およびかかるウイルスを用いたインビトロもしくはインビボ細胞感染のためのプロトコールは、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， （１９８９）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４、およびその他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に周知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。同種指向性レトロウイルスと両種性レトロウイルス系の両方の調製に適したパッケージングウイルス系統の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、ΨＡｍ、ｐＡ１２およびＰＡ３１７が挙げられる（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ． ａｌ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：５−１４ （１９９０）を参照されたい）。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボでの多くの異なる細胞種（上皮細胞など）への各種遺伝子導入に用いられている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８ （１９８５）； Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４ （１９８８）； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８ （１９８８）； Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５ （１９９０）； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１−８ （１９９０）； Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３ （１９９１）； Ｆｅｒｒｙ
ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１ （１９９１）； Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５４：１８０２−１８０５ （１９９１）； ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４ （１９９２）； Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７ （１９９２）； Ｄａｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５ （１９９２）；
Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５ （１９９３）； Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２ （２０００）；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ国際公開特許第８９／０７１３６号；ＰＣＴ国際公開特許第８９／０２４６８号；ＰＣＴ国際公開特許第８９／０５３４５号；およびＰＣＴ国際公開特許第９２／０７５７３号を参照されたい）。
【０１０２】
本明細書の方法に有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを用いる。複製欠陥アデノウイルスの生成は、アデノウイルスのゲノムを、該ゲノムが関心の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶解性ウイルスの生活環における複製能が不活性化されるように操作することにより成し遂げられた。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６ （１９８８）； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４ （１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５ （１９９２）を参照されたい。アデノウイルス種Ａｄタイプ５ ｄｌ３２４またはその他のアデノウイルス種（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、またはＡｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞を感染させることができず、多種多様の細胞種（上皮細胞など）を感染させるために使用できるという点で、特定の状況において有利であり得る（前述のＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２））。さらに、このウイルス粒子は比較的安定していて精製と濃度を受け入れることができ、上述したように、感染力スペクトルに影響を及ぼすように修飾できる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれず、エピソームのままである。このため、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組み込まれるインサイチュ法での挿入突然変異の結果生じ得る潜在的な問題を回避する。その上、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの収容能は、他の遺伝子送達ベクターと比較して高い（最大８キロベース（ｋｂ））（前述のＢｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．； Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ
Ｇｒａｈａｍ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７ （１９８６）。加えて、３０ｋｂ超のトランス遺伝子を含み得る特別な高容量アデノウイルス（ＨＣ−Ａｄ）ベクターが作製されている（Ｋｏｃｈａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
１０：２４５１−９ （１９９９））。
【０１０３】
核酸の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製と生殖生活環のために、ヘルパーウイルスとして別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど）を要する天然の欠陥ウイルスである（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ３８：８１９−４５ （２００４）； Ｄａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ２１：５８３−９３ （２００８）で論評されている）。アデノ随伴ウイルスは、自身のＤＮＡを非分裂細胞に組み込み得る数少ないウイルスの１つでもあり、高頻度の安定した一体化を示し、それによって長期間発現することができる（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８ （１９８９）；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３ （１９８９）； Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７：３４９−３５６ （１９９２）； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３６：７６７−７７３ （２００４）を参照されたい）。３００塩基対程の短いＡＡＶを含有するベクターをパッケージングおよび一体化することができる。外因性ＤＮＡのための空間は約４ｋｂに制限されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０ （１９８５）に記載されているようなＡＡＶベクターを、細胞へＤＮＡを導入するために使用できる。多くの異なる血清型由来のＡ
ＡＶベクターを用いて、各種核酸が異なる細胞種に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０ （１９８４）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１ （１９８５）； Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２：３２−３９ （１９８８）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９ （１９８４）；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０ （１９９３）； Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４３８−４５ （１９９８）； Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３４２８−３２ （２０００）； Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：３８５２−８ （２０００）； Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１−８０１ （２００２）； Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． １１：８７５−８８ （２００５）； Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １５：８５８−６３． （２００８）を参照されたい）。
【０１０４】
上に例証したようなウイルス移入方法の他に、非ウイルス法も、本明細書に記載の核酸化合物の発現を惹起するために使用できる（かかる方法の総説については、Ｎｉｉｄｏｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：１６４７−５２ （２００２）を参照されたい）。典型的には非ウイルス遺伝子移入方法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳類細胞によって使用されている通常の機序に基づいている。いくつかの実施形態では、非ウイルスの遺伝子送達系は、標的細胞による対象遺伝子取り込みのためのエンドサイトーシス経路に基づき得る。この種の代表的な遺伝子送達系としては、リポソーム由来系、共役ポリカチオン（ポリアミンおよびポリリシンなど）、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。他の実施形態としては、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１８９６−９０５ （２０００）； Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１８６７−７４ （２０００）； Ｍｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１６：１３１−１３５ （２００１）；またはＦｅｎｓｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３４６：３６−７１ （２００２）に記載されているようなプラスミド注入系が挙げられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰは裸ＤＮＡ構築物および／またはＤＮＡベクターに基づく構築物を用いて発現できる。
裸ＤＮＡ構築物およびかかる構築物の治療的使用は当業者に周知である（例えば、Ｃｈｉａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．，３：９３−１０１， ２００８； Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ８：９１１−９２２，
２００８； Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １７：１１６５−１１７６， ２００８を参照されたい）。典型的には、裸ＤＮＡ構築物としては、１つまたは複数の治療核酸（例えば、ＢＭＰをコードするＤＮＡ）およびプロモーター配列が挙げられる。裸ＤＮＡ構築物はＤＮＡベクター（一般にｐＤＮＡと呼ばれる）であり得る。裸ＤＮＡは典型的には染色体ＤＮＡに組み込まれない。通常、裸ＤＮＡ構築物は、脂質、ポリマー、もしくはウイルス性タンパク質の存在を必要としないか、または併用されない。かかる構築物として、１つまたは複数の本明細書に記載の非治療成分も挙げ得る。
【０１０６】
ＤＮＡベクターは当該技術分野において周知であり、典型的には環状二本鎖ＤＮＡ分子である。ＤＮＡベクターのサイズ範囲は通常３〜５キロベースペアである（例えば、挿入
された治療核酸を含む）。裸ＤＮＡのように、ＤＮＡベクターは、標的細胞中の１つまたは複数の治療タンパク質の送達および発現に使用できる。ＤＮＡベクターは染色体ＤＮＡに組み込まれない。
【０１０７】
通常、ＤＮＡベクターは、標的細胞中の複製を可能とする少なくとも１つのプロモーター配列を含む。ＤＮＡベクターの取り込みは、このＤＮＡベクターを例えば、カチオン脂質と一体化させてＤＮＡ複合体を形成することにより促進（例えば、改善）される場合がある。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介してＤＮＡベクターを標的細胞に導入できる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、標的細胞への外来核酸（例えば、ＤＮＡ）導入のために当該技術分野で認識されている各種技術（リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法など）を指すことを意図する。
【０１０９】
本明細書に記載の発現構築物を生成するために要するすべての分子生物学的技術が、当業者によって理解されるであろう標準的な技術である。詳細な方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， （１９８９）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４およびその他の標準的な実験室マニュアルにも見出し得る。改変ＢＭＰアミノ酸配列（例えば、本明細書に示された野生型ＢＭＰ配列との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、および９９％であるアミノ酸配列）をコードするＤＮＡは、例えば、部位指向突然変異誘発技術を用いて生成できる。
【０１１０】
剤形
通常、ＢＭＰポリペプチドまたは核酸が使用される場合、このポリペプチドまたは核酸は対象（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、またはヒツジ）と同種由来である。
【０１１１】
本明細書に記載のＢＭＰ化合物は、例えば、担体系内で、当該細胞集団との接触における使用に適した任意の手段で処方できる。この担体はコロイド系であり得る。このコロイド系はリポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質はタンパク質の完全性を維持しつつリポソームに封入される。当業者が理解するであろうとおり、各種のリポソーム調製方法がある。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ
ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ａｎａｌ， ３３：３３７−４６２ （１９８８）， ＬＩＰＯＳＯＭＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ａｎｓｅｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３を参照されたい）。リポソームはサイズおよび置換がさまざまな各種リン脂質から調製でき、低毒性（コレステロールなど）の追加成分も含んでよい。このリポソームは各種形状およびサイズで処方および単離できる。さらに、一部をリポソーム表面に取り付けてこの担体の薬物動態特性をさらに向上させることができる。この一部は、リン脂質またはコレステロール分子に取り付けてよく、この一部が表面上に組み込まれる割合はリポソームの安定性および薬物動態特性を最適化するために調節してよい。１つの実施形態では、表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加したリポソームが含まれる。リポソーム剤形はクリアランスを遅延化して細胞取り込みを増大できる。（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ， ３４（７／８）：９１５−９２３ （２０００）を参照されたい）。
【０１１２】
この担体はポリマー（例えば、生体分解性、生体適合性ポリマーマトリックス）でもあり得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質はタンパク質の完全性を維持しつつポ
リマーマトリックス中に埋め込むことができる。このポリマーは天然（ポリペプチド、タンパク質または多糖類など）でも、合成（ポリ（α−ヒドロキシ）酸など）でもよい。例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできている担体が挙げられる。いくつかの実施形態では、このポリマーはポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＧＬＡ）である。この重合体マトリックスは各種剤形およびサイズ（マイクロスフェアおよびナノスフェアなど）に調製および単離できる。ポリマー剤形は治療効果の持続時間を延長させることができる（Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ， ３４（７／８）：９１５−９２３ （２０００）を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー剤形が臨床試験で用いられている（Ｋｏｚａｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｉｃｈ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：５４８−５５２ （１９９８）を参照されたい）。
【０１１３】
高分子マイクロスフェアの持続放出製剤の例は、ＰＣＴ国際公開特許第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号（いずれもＺａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号（Ｚａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＰＣＴ国際公開特許第００／３８６５１号（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号および同第５，７１６，６４４号ならびにＰＣＴ国際公開特許第９６／４００７３号では、塩凝集に対して安定したエリスロポエチン粒子を含有する重合体マトリックスについて述べられている。
【０１１４】
分化方法
本明細書に記載するのは、１つまたは複数のＢＭＰによるＳｃａ−１（＋）前駆細胞集団の接触により成熟ＢＡＴ細胞または成熟ＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞を生成するための方法である。１つまたは複数のＢＭＰの量（例えば、濃度または用量）および処理時間は、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞集団内のＢＡＴ細胞もしくは成熟ＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞の数を増加させるのに十分である。当業者は周知の方法を用いて、ＢＭＰの量も処理時間も決定できる。いくつかの実施形態では、このＢＭＰはＢＭＰ−７である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰの量は、例えば、０．１〜５０ｎＭ／ＢＭＰを含み得る。
いくつかの実施形態では、治療期間は、例えば、１〜２日間、１〜３日間、１〜４日間、１〜５日間、および１〜５日間超であり得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞を、例えば、いずれの分化誘導段階も経ずに、１つまたは複数のＢＭＰ単独に接触させる。あるいは、Ｓｃａ−１（＋）細胞を、第一溶液（１つまたは複数のＢＭＰを含む）、および第二溶液（１つまたは複数の化学的もしくはホルモン性分化誘導物質および／またはチアゾリジンジオン類を含む）を用いて処理する。Ｓｃａ−１（＋）細胞を、これらの第一溶液と第二溶液に連続的に（例えば、第一溶液の後に第二溶液、または第二溶液の後に第一溶液）または同時に曝露することができる。第一溶液と第二溶液の両溶液の量、処理時間、および第一溶液と第二溶液の使用順について、当業者は周知の方法を用いて容易に決定できる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、第二溶液（１つまたは複数の化学的もしくはホルモン性分化誘導物質および／またはチアゾリジンジオン類を含む）は、骨原性、軟骨形成、筋原性、または脂肪細胞分化溶液である。代表的な分化溶液については、当該技術分野において記載されている（Ｋｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３４７９５−３４８０２， １９９９； Ｈａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４：１６６３−１６７０， １９８９）。本明細書に記載
の細胞のＢＡＴ系統への分化または指向を促進するため、細胞をチアゾリジンジオンを用いて処理できる。代替的にまたは追加で、本明細書に記載の細胞は脂肪細胞分化誘導カクテル（インスリン、デキサメタゾン、トリヨードチロニン、イソブチルメチルキサンチン、および０．１２５ｍＭインドメタシン含有）を用いて、例えば、既に記載されているように（Ｋｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３４７９５−３４８０２， １９９９）処理できる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、分化処理は細胞集団内の１つまたは複数のマーカーの存在および／または不在を測定することにより評価される。
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＢＭＰで処理した細胞または細胞集団内の脂肪細胞分化量の検討を含む。脂肪細胞分化は、１つまたは複数の、例えば、脂質蓄積を（例えば、オイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を用いて）測定することにより検討できる。オイルレッドＯ染色は細胞内の中性脂肪を染色するために用いられる。染色量は直接、細胞内の脂質量に比例し、分光光度法で測定できる。脂質蓄積量は分化パラメーターとして測定される。代替的にまたは追加で、脂肪細胞分化は１つまたは複数の脂肪細胞分化マーカー（例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４、ａＰ２）、および／または脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）から選択される）を測定することによって検討できる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞または細胞集団内のＢＡＴ脂肪細胞分化量の検討を含む。ＢＡＴ分化は１つまたは複数の、例えば、１つまたは複数のＢＡＴ特異的マーカー（脱共役タンパク質（ＵＣＰ）、細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＰＰＡＲγ活性化補助因子（ＰＧＣ）−１α、および／またはＰＰＡＲγ活性化補助因子（ＰＧＣ）−１βおよび／またはＰＲＤＭ−１６など）；ＢＡＴ形態（例えば、視覚的、例えば、細胞の顕微鏡検査）；またはＢＡＴ熱力学（例えば、シトクロム酸化酵素活性、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ酵素単位、またはＢＡＴ熱産生に関与するその他の酵素）を測定することによって検討できる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞内の脂肪細胞分化阻害物である前脂肪細胞因子（ｐｒｅｆ）−１値の検討を含むことができ、ここでｐｒｅｆ−１値低下（例えば、適切な未処理対照細胞または処理前の同一細胞内のｐｒｅｆ−１値と比較して）は、これらの細胞がＢＡＴに分化したことを示す。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、当該方法は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）もしくはその類似体（ジブチリルｃＡＭＰなど）、またはβ３−アドレナリンアゴニストＣＬ３１６２４９により細胞を処理して、これらの細胞の熱産生活性化能を評価することを含む。インビボ寒冷誘発性熱産生は、交感神経系およびＢＡＴ内β３アドレナリン受容体の活性化に関与するシグナル伝達カスケードに媒介される。これらの事象は、細胞質ｃＡＭＰ値の増加に至り、次いで、成熟した褐色脂肪細胞内の熱産生に関与する遺伝子の発現をトリガーする。分化した細胞が真の褐色脂肪細胞になるかどうかを決定するために、細胞浸透性ｃＡＭＰ類似体ジブチリルｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）またはβ３−アドレナリンアゴニストＣＬ３１６２４９（Ｓｉｇｍａ）で処理した分化した脂肪細胞における熱産生遺伝子（ＵＣＰ−１など）発現を測定できる。これらの方法は、成熟した褐色脂肪細胞内の熱産生に関与する１つまたは複数の遺伝子発現の評価（例えば、測定）を含む。代表的な遺伝子としては、ＵＣＰ−１、ＣＩＤＥＡ、ＰＧＣ−１、ＰＲＤＭ１６、ならびにミトコンドリアの生合成と機能に関与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子の１つまたは複数の発現を示す細胞は成熟ＢＡＴ細胞および／または成熟した褐色脂肪細胞の特徴を備える細胞として同定される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＷＡＴへの分化の検討、例えば、ＷＡＴ特異的
マーカー（１つまたは複数のレジスチンなど）、ＴＣＦ２１、レプチンおよび／または核内受容体相互作用性タンパク質１（ＲＩＰ１４０）、および／またはＷＡＴ形態の検討を含む。
【０１２３】
ＷＡＴとＢＡＴは、日常的な技術（例えば、ＷＡＴもしくはＢＡＴに特異的な形態的変化、またはＷＡＴ特異的もしくはＢＡＴ特異的マーカーの検討）により識別できる。例えば、ＢＡＴ細胞は、脱共役タンパク質（ＵＣＰ）（例えば、ＵＣＰ−１）発現により同定できる。
【０１２４】
治療方法
本明細書に記載の方法および組成物は肥満および体重関連障害の治療に有用である。通常、当該方法は、有効量のＢＭＰで処理した細胞を、かかる治療が必要な対象（例えば、かかる治療が必要であると診断されている対象）へ投与することを含む。
【０１２５】
対象の選択
いくつかの実施形態では、当該方法は、治療が必要な対象（例えば、過体重または肥満対象、例えば、ボディマス指数（ＢＭＩ）２５〜２９もしくは３０もしくは３０超または体重関連障害を有する対象）を同定することおよびＢＭＰで処理した有効量の細胞の対象への投与を含む。本明細書に記載の方法による治療が必要な対象は、対象の体重またはボディマス指数に基づいて選択できる。いくつかの実施形態では、当該方法は、対象の：体重、脂肪組織蓄積、脂肪組織形態、インスリン値、インスリン代謝、グルコース値、熱産生能、および寒冷感受性のうち１つまたは複数の検討を含む。いくつかの実施形態では、対象の選択は、対象におけるＢＡＴの量または活性の評価およびこれらの観察記録を含み得る。
【０１２６】
この検討は化合物の投与前、投与中、および／または投与後に実施できる。例えば、この検討は投与の少なくとも１日、２日、４日、７日、１４日、２１日、３０日、またはそれ以上前および／または後に実施できる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞は、治療のために選択される対象から取得できる。
細胞療法
本明細書に記載の方法は、（例えば、本明細書に記載の）ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団を治療すべき対象へ移植することを含み得、ここで前記ＢＭＰで処理した幹細胞集団またはそれらの子孫（すなわち、娘細胞）は褐色脂質を生成する。いったん移植後、Ｓｃａ−１（＋）細胞は通常、対象中で脂質を生成し、ＢＡＴを生成する。
【０１２８】
これらの細胞療法の方法は、対象の、例えば、肥満およびインスリン抵抗性の治療において、またはミトコンドリア欠損関連疾患（例えば、糖尿病、癌、神経変性、および老化）を治療するために有用である。
【０１２９】
ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団（例えば、本明細書に記載の分化方法を用いて処理したＳｃａ−１（＋）細胞）を移植する方法は当該技術分野において周知である（例えば、対象へ細胞を導入できるように構成された送達系の使用など）。通常、送達系は、細胞集団（ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞など）を含む貯蔵容器、およびこの貯蔵容器と接する流体中の針を含み得る。典型的には、スキャフォールド、マトリックス、または細胞が取り付くことができるその他の移植可能なデバイスと共に、あるいはそれらなしで、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団は医薬として許容可能な担体中にある（例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組み合わせでできて
いる担体が挙げられる）。かかる送達系も本発明の範囲内である。通常、かかる送達系は無菌で維持する。さまざまな投与経路およびさまざまな投与部位（例えば、腎臓被膜下、皮下、中枢神経系（髄腔内など）、血管内、肝内、内臓内、腹腔内（大網内など）、筋肉内移植）を使用できる。通常、これらの細胞は対象の皮下に移植される。いくつかの実施形態では、移植する、ＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞集団は、少なくとも１０７、１０８、１０９、または１０９を超える細胞を含む。
【０１３０】
免疫的に相性がよくない細胞を用いる場合、これらの細胞の拒絶反応を阻害するのに十分な投与量の免疫抑制化合物（例えば、薬剤または抗体）をレシピエント対象に投与できる。免疫抑制剤の投与量範囲は当該技術分野において周知である。例えば、Ｆｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４９ （１９９２）； Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４１ （１９９２）； Ｗｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５５６ （１９９２）を参照されたい。投与量は要因（疾患状態、個体の年齢、性別、および体重など）に応じて変更してよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＢＭＰで処理した細胞に加えて１つまたは複数の他の化合物（例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイドＸ受容体α（ＲｘＲα）、インスリン、Ｔ３、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、レチノイン酸、別のＢＭＰタンパク質（例えば、ＢＭＰ−１またはＢＭＰ−３）、ビタミンＡ、レチノイン酸、インスリン、糖質コルチコイドもしくはそのアゴニスト、Ｗｉｎｇｌｅｓｓタイプ（Ｗｎｔ）（例えば、Ｗｎｔ−１）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、またはその他の増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））の接触、投与もしくは発現を含む。他の実施形態では、化合物は、異種ポリペプチド配列（例えば、第二ＢＭＰタンパク質）と結合してキメラ分子もしくは融合タンパク質を形成する本明細書に記載のＢＭＰ−２、−４、−５、−６、および／または−７タンパク質またはその一部であり得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、第二治療、例えば、肥満または関連障害（糖尿病など）のための第二治療と併用した化合物の投与を含む。例えば、第二治療はインスリン、オルリスタット、フェンジメトラジン、および／またはフェンテルミンであり得る。
【０１３２】
インビボ療法
いくつかの実施形態では、本開示は、インビボ治療方法を提供する。かかる方法は、上記のとおり対象を選択すること、対象へのＢＭＰシグナル伝達を増加させる１つまたは複数の化合物を対象へ投与することを含み、ここで各化合物は対象中のＳｃａ−１（＋）細胞を特異的に標的とする。かかる方法に使用できる化合物としては、例えば、Ｓｃａ−１（＋）細胞を特異的に標的とするＢＭＰおよびＢＭＰアゴニストが挙げられる。かかる化合物は細胞表面上のＳｃａ−１（＋）および／またはＣＤ２９受容体に特異的に結合できる。
【０１３３】
有効量
本明細書に記載の化合物および医薬組成物の毒性および治療有効性は、培養物または実験動物における細胞のいずれかを用いてＬＤ50（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ50（集団の５０％にとって治療的に効果的な用量）を測定する標準的な製薬手順により決定できる。中毒作用と治療効果間の用量比率は治療指標であり、ＬＤ50／ＥＤ50比率として表すことができる。高い治療指標を示すポリペプチドまたはその他の化合物が好ましい。
【０１３４】
細胞培養アッセイおよびさらなる動物試験から得られるデータを、ヒトに用いる投与量範囲の策定に使用できる。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ50を含み、ヒトの聴力能に対する有害作用がほとんどまたはまったくない循環濃度範囲内である。この投与量は、使用する投与形態および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変更してよい。本明細書に記載の方法に使用される任意の化合物の治療有効量を初めに細胞培養アッセイから推定できる。用量は動物モデルにおいて、細胞培養物中で測定したＩＣ50（すなわち、試験化合物濃度が症状の最大阻害の半数に達する）を含む循環血漿濃度範囲に達するように処方できる。かかる情報は、ヒトに有用な用量をより正確に測定するために使用できる。分化剤の代表的な投与量は少なくとも約０．０１〜３０００ｍｇ／日、例えば、少なくとも約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２、５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、もしくは３０００ｍｇ／ｋｇ／日、または３０００ｍｇ／ｋｇ／日超である。
【０１３５】
投与剤形および投与経路は、治療下の疾患もしくは障害、および治療中の具体的なヒトに応じて調整できる。薬剤用量を１日１回もしくは２回以上、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、または１年を超えて、対象に投与することができる。この治療は無制限に（該ヒトの生涯を通じてなど）継続できる。治療は定期的または不定期的間隔（一日おきに１回または週２回）で投与でき、投与量および投与タイミングは治療の全過程で調整できる。投与量は治療レジメンの全過程で一定量を維持することも、治療の全過程で増減することもできる。
【０１３６】
通常、投与量は、望ましくない副作用（中毒、過敏またはアレルギー反応など）を伴わずに予防と治療の両方のための意図した目的を促進する。個体の必要性は変化し得るが、製剤の最適な有効量範囲の決定は当該技術分野の技能範囲である。ヒトの用量は動物試験から容易に推定できる（Ｋａｔｏｃｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ２７ Ｉｎ：
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０）。通常、製剤の有効量を得るために要される投与量は、当業者により調整されることができ、いくつもの要因（レシピエントの年齢、健康、体調、体重、疾患もしくは障害の種類および程度、治療頻度、必要に応じた同時療法の性質、ならびに所望の効果（１つまたは複数）の性質および範囲など）に応じて変更される（Ｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ３， Ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ
＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９６）。
【０１３７】
治療の評価／検証
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、治療後およびこれらの観察記録後における対象中のＢＡＴ量またはＢＡＴ活性の評価を含み得る。これらの治療後の観察結果は対象の選択中に行なわれる観察結果と比較できる。いくつかの実施形態では、対象は増加したＢＡＴ値および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、対象は軽減した症状を示す。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、評価は、治療前および／または治療後の対象の体重もしくはＢＭＩ測定、ならびに治療前の対象の体重もしくはＢＭＩと治療後の体重もしくはＢＭＩとの比較を含み得る。成功の兆候は体重またはＢＭＩの低下として観察される。いくつかの実施形態では、この治療は、目標体重またはＢＭＩが得られるまで１回または複数回追加投与される。あるいは、胴回り測定（例えば、腰部、胸部、臀部、大腿部、または腕囲
）を用いることができる。
【０１３９】
これらの評価結果は、対象の将来の治療過程の決定に使用できる。例えば、治療は、変更せずに継続してもよいし、変更して継続してもよく（例えば、追加治療またはより積極的な治療）、または停止することもできる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＢＭＰ活性化細胞の１回または複数回の追加移植（例えば、褐色脂肪細胞分化を増加させるため、例えば、対象の肥満軽減を維持するまたはさらに軽減するため）を含む。
【０１４１】
スクリーニング方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はＢＡＴ前駆細胞を同定するためのスクリーニング方法を含む。これらの方法は、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞の取得を含む。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、例えば、細胞表面マーカー発現、ＲＮＡとＤＮＡプロファイリング、およびプロテオミクスを評価することにより特性化される。代替的にまたは追加で、これらの細胞は本明細書に記載の分化方法を用いて処理できる。いくつかの実施形態では、Ｓｃａ−１（＋）細胞は、ＢＭＰ−７を単独または１つまたは複数の分化誘導カクテルと併用して用いて処理できる。次いで、細胞集団が１つまたは複数の成熟ＢＡＴ細胞またはＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞を含むことを確認するためにこれらの細胞を検討できる。次いで、これらの成熟ＢＡＴ細胞またはＢＡＴ細胞の特徴を備える細胞を単離し、（例えば、細胞表面マーカー発現、ＲＮＡとＤＮＡプロファイリング、およびプロテオミクスを評価することにより）特性化することができる。観察結果を記録し、同様に処理したＳｃａ−１（＋）細胞を用いて行なった観察結果と比較する。いくつかの実施形態では、この観察結果を、未処理前駆細胞を用いて行なった観察結果と比較し、分化前後に存在するマーカーを測定する。次いで、反復した観察結果を測定し、ＢＡＴ細胞系統への分化能または指向能を有する細胞のプロファイル構築に用いる。次いでこのプロファイルを、異種の細胞集団由来のＢＡＴ前駆細胞を選択するために使用できる。
【０１４２】
キット
本発明はキットを特徴とする。いくつかの実施形態では、このキットは（１）１つまたは複数のＳｃａ−１（＋）前駆細胞；（２）１つまたは複数のＳｃａ−１（＋）前駆細胞の成熟ＢＡＴ細胞系統への分化もしくは指向を促進する能力を有する１つまたは複数のＢＭＰ；（３）これらの細胞を対象に投与するためのデバイス；（４）投与説明書；ならびに任意に（５）１つまたは複数の分化誘導カクテル、を含み得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、このキットは（１）１つまたは複数のＢＭＰで処理したＳｃａ−１（＋）細胞；（２）これらの細胞を対象に投与するためのデバイス；ならびに（３）投与説明書を含み得る。同一容器に見られる２つ以上（すべてを含む）の成分の実施形態が含まれる。
【０１４４】
キットを供給時、含有する組成物の異なる成分を分離した容器内に収容して使用直前に混合することができる。これらの成分を、このように別々に収容することにより、活性成分の機能を失わせずに長期間保存することができる。複数の生物活性剤が特定のキット内に含まれる場合、この生物活性剤は、（１）別々に収容して好適な（類似した、異なるが適合する）アジュバントもしくは賦形剤と使用直前に別々に混合してよい、（２）併せて収容して使用直前に併せて混合してよい、または（３）別々に収容して使用直前に併せて混合してよい。選択された化合物が混合後にも安定し続ける場合、これらの化合物は、使用の直前より前（例えば、数分前、数時間前、数日前、数ヶ月前、数年前、および製造時など）に一度に混合してよい。
【０１４５】
本発明の特定のキットに含まれる組成物は、異なる成分の寿命が最適に保存され、容器材料に吸収または改変されないような任意の種類の容器内で供給できる。これらの容器に適した材料としては、例えば、ガラス、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネートおよびポリスチレン）、セラミック、金属（例えば、アルミニウム）、合金、または類似試薬を保持するために典型的に使用される他の任意の材料を挙げ得る。代表的な容器として、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、注射器、などを挙げ得るが、これらに限定されない。
【０１４６】
上記のとおり、このキットは取扱説明書と供給することもできる。これらの説明書は、限定ではないが、印刷してもよいし、および／または読み取り可能な電子媒体（フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ジップディスク、ビデオカセット、録音テープ、およびフラッシュメモリデバイスなど）として供給してもよい。あるいは、説明書はインターネットウェブサイト上で公開してもよいし、ユーザーに電子メールで配布してもよい。
【０１４７】
このキットには、体重関連障害および肥満の治療もしくは予防のためのキットも含まれる。
本発明を下記の実施例において詳述するが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限しない。
【実施例１】
【０１４８】
骨形成タンパク質処理は、化学的および／またはホルモン性分化誘導物質不在下でＢＡＴ分化を促進する
野生型褐色前駆脂肪細胞および３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−３、−４、−５、−６、および−７による処理効果を下記の方法により分析した。
【０１４９】
サブコンフルエントな細胞を、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７のいずれかと１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。対照細胞培地はＢＭＰを含有しなかった。化学的もしくはホルモン性分化誘導物質またはチアゾリジンジオンには細胞を曝露しなかった。細胞を８日間培養した。次いで、細胞をオイルレッドＯ染色およびＲＮＡ抽出用に集めた。
【０１５０】
脂質蓄積について、オイルレッドＯ染色を用いて分析した。簡単に述べると、ろ過したオイルレッドＯ溶液（０．５％オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のイソプロピルアルコール溶液）で２時間、室温で細胞を染色した。
【０１５１】
図１Ａに示すとおり、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７により、対照細胞集団と比較して、野生型褐色前駆脂肪細胞における脂質蓄積の著しい増加が惹起され、これは増加したオイルレッドＯ蓄積によるこれら野生型褐色前駆脂肪細胞の濃色化した外観に示されている。対照的に、図１Ｂに示すとおり、３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞では、脂質蓄積の増加は観察されなかった。
【０１５２】
これらのデータにより、さまざまなＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７）は、化学的もしくはホルモン性分化誘導物質またはチアゾリジンジオンを含有しない増殖培地中でさえも、褐色前駆脂肪細胞における脂質蓄積の増加を促進する能力を有することが示唆される。脂質蓄積は、これらの細胞のＢＡＴ表現型への分化と一致するため、これらの結果は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７はＢＡＴ前駆細胞のＢＡＴ系列への分化を促進する能力を有することを示す。
【０１５３】
脱共役タンパク質−（ＵＣＰ−１）および細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）は、ＢＡＴ分化を確認するため一般に用いられる特異的マーカーである（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ３５：４９−５６， ２００３）。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７が褐色前駆脂肪細胞の成熟ＢＡＴ細胞への分化を促進するかどうかを分析するため、上記のとおり調製した細胞を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＵＣＰ−１およびＣＩＤＥＡの発現を評価した。
【０１５４】
野生型褐色前駆脂肪細胞をさまざまなＢＭＰの存在下で８日間培養した。次いで、細胞を取得し、ＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離した。ＵＣＰ−１を増幅するために用いたセンスおよびアンチセンスプライマーはＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ（カタログ番号ＰＰＭ０５１６４Ａ）から購入した。
【０１５５】
ＣＩＤＥＡを増幅するために用いたセンスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれ：
５’−ＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＡＣＧ−３’配列番号６；および
５’−ＴＡＣＴＡＣＣＣＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＣＴ−３’配列番号７である。
【０１５６】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを製造業者の説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）に従って用いて１μｇ ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、最終容積２５０μＬとなるように希釈した。５μＬの希釈ｃＤＮＡをＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）との２０μＬ ＰＣＲ反応に用いた。各プライマーを３００ｎＭの濃度で用いた。各試料においてＰＣＲ反応を二重に実行し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量した。
【０１５７】
図２Ａに示すとおり、ＢＭＰ−７で処理した細胞は対照細胞集団と比較してＵＣＰ−１とＣＩＤＥＡの著しい発現増加を示した。ＣＩＤＥＡ発現増加はＢＭＰ−２処理細胞でも観察された。
【０１５８】
これらの結果により、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−７は野生型褐色前駆脂肪細胞のＢＡＴへの分化を促進することが示唆される。
上の観察結果は、ウエスタンブロッティング法を用いても確認した。簡単に述べると、サブコンフルエントな褐色と白色前駆脂肪細胞を、対照培地または３．３ｎＭのＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７添加培地で１３日間培養した。
【０１５９】
ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７および対照で処理した褐色および白色前駆脂肪細胞から取得したタンパク質抽出体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分解し、ウエスタンブロッティング法を用いて分析した。最初にＵＣＰ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）特異抗体を用いて膜を調べた後、負荷対照としてβ−チューブリン特異抗体を用いて膜を除去し、再度調べた。
【０１６０】
図２Ｂに示すとおり、ＢＭＰ−７に曝露した褐色細胞集団内でＵＣＰ−１を特異的に上方制御した。ＵＣＰ−１上方制御は、ＢＭＰ−７もしくはＢＭＰ−６に曝露した白色細胞集団、または対照で処理した褐色細胞および白色細胞では観察されなかった。
【０１６１】
上記の観察に加えて、ＢＭＰ−７はミトコンドリア生合成の増加も促進した。
これらのデータにより、ＢＭＰ−７は重要な褐色脂肪細胞分化因子かつ熱産生の調節因子であることが示唆される。
【実施例２】
【０１６２】
幹細胞抗原−１陽性の褐色脂肪細胞前駆細胞の単離および特性化
候補の褐色脂肪前駆細胞を成獣マウス骨格筋から単離した。次いで、これらの細胞をＢＭＰ−７に曝露することによって、これらの単離細胞のＢＡＴ細胞への分化能を調査した。
【０１６３】
マウス肢の筋線維結合間質細胞由来の非筋原性前駆細胞の幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））およびＣＤ４５／Ｍａｃ−１陰性（Ｓｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−））集団を、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により精製した。簡単に述べると、動物を二酸化炭素、続いて頸椎脱臼で屠殺した。筋組織を前後の両肢から解離し、１５ｍＬ消化用緩衝液Ｉ（ＤＭＥＭ、０．２％ＩＩ型コラゲナーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０１−０１５）に集めた。試料を３７℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら９０分間消化した。３ｍＬウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して消化を停止した。組織切片を分離し、この組織切片を破壊せずに、Ｆ１０＋２０％ＦＢＳ培地で２回およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。組織をＰＢＳ中で細片化してインタクトな筋線維を得た。
【０１６４】
次いで、筋線維を沈殿により３〜４回洗浄して間質細胞を除去した。最終洗浄後、この上清を除去して最終容積３〜５ｍＬとした後、５〜６ｍＬ消化用緩衝液ＩＩ（Ｆ１０、０．０１２５％ＩＩ型コラゲナーゼ、０．０５％ディスパーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０５−０４１）を添加した。
【０１６５】
次いで、試料を穏やかに撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、この溶液に１．５ｍＬ ＦＢＳを添加して消化を停止した。試料を上下に約４回ピペッティングして、試料中に存在する筋線維結合細胞を解離した。次いで、試料を低速度で１分間遠心して未消化組織切片を除去した。次いで、上清を７０μｍのセルストレーナーでろ過した。遠心分離により細胞を集め、抗体染色のために低容積の選別培地（２％ＦＢＳのハンクス平衡緩衝塩溶液−ＨＢＳＳ）中で再懸濁した。
【０１６６】
選別培地中での１回の洗浄工程後、細胞をろ過網でろ過した。生死選択マーカーであるポビドンヨード（死細胞の検出に使用）およびカルセインブルー（生細胞の検出に使用）を添加後、ＰＥの負の選択（Ｍａｃ−１およびＣＤ４５の発現）およびＡＰＣの正の選択（Ｓｃａ−１発現）を用いた蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）に細胞を供した。すべての抗体を１：２００希釈で細胞懸濁液に添加し、氷上で２０分間インキュベートした。用いた抗体は、Ｓｃａ−１（ＡＰＣ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１７−５９８１−８２）、Ｍａｃ−１（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０１１２−８２）およびＣＤ４５（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０４５１−８２）に対する抗体などである。
【０１６７】
次いで、細胞を増殖培地（１０％ＦＢＳおよびグルタミン含有のＦ１０）中で再懸濁し、ラミニン／コラーゲンコーティングした細胞培養用２４ウェルプレート上の集密度２５．０００細胞／ウェルでプレートした。増殖期間中、細胞を５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、番号Ｆ０２９１）の連日添加により補充した。
【０１６８】
次いで、Ｓｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞を１０％ウシ胎児血清および３．３ｎＭ ＢＭＰ−７添加ＤＭＥＭに３日間曝露した。対照細胞はＢＭＰ−７なしで、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭに曝露した。次いで、細胞を脂肪細胞分化誘導培地に４日間曝露した。具体的には、２０ｎＭインスリンおよび１ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．５μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５ｍＭデキサメタゾン、および０．１２５ｍＭインドメタシン添加培地で融合細胞を４８時間処理することにより脂肪細胞分化を誘導した。この誘導期間後（２日目）、インスリンとＴ３添加
増殖培地に細胞を再置し、次いで増殖培地を隔日で変更した。次いで細胞をオイルレッドＯ染色固定して、定量ＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
【０１６９】
オイルレッドＯ染色を実施例１に記載のとおり実施した。
図３Ａと３Ｂに示すとおり、ＢＭＰ−７で処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）において、対照細胞集団と比較して脂質蓄積の著しい増加がそれぞれ示された。
【０１７０】
次いで、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化と脂肪細胞分化マーカーの両方の発現レベルを測定した。分析した脂肪細胞分化マーカーはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＡ４、ａＰ２）、および脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）である。褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化マーカーはＵＣＰ−１、ＣＩＤＥＡ、ＰＰＡＲγ活性化補助因子（ＰＧＣ）−１α、およびＰＧＣ−１βであった。
【０１７１】
定量ＲＴ−ＰＣＲを実施例１に記載のとおり実施した。ＰＰＡＲγ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣ−３’配列番号８；および
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧ−３’配列番号９である。
【０１７２】
ＦＡＢＡ、ａＰ２増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＧＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴ−３’配列番号１０；および
５’−ＣＴＧＴＣＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡＴＴＴ−３’配列番号１１である。
【０１７３】
ＦＡＳ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＧＡＧＧＡＣＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡ−３’配列番号１２；および
５’−ＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＧＴＣＴＧＴ−３’配列番号１３である。
【０１７４】
ＰＧＣ−１α増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡ−３’配列番号１４；および
５’−ＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡ−３’配列番号１５である。
【０１７５】
ＰＧＣ−１β増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧ−３’配列番号１６；および
５’−ＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＡＣＧ−３’配列番号１７である。
【０１７６】
図４Ａに示すとおり、脂肪細胞分化マーカー（ＰＰＡＲγ、ＦＡＢＰ４、ａＰ２、およびＦＡＳ）と褐色脂肪選択的マーカー（ＵＣＰ−１およびＣＩＤＥＡ）はいずれもＢＭＰ−７処理により著しく増加した。誘導最低値はＰＰＡＲγで観察され、これは対照に比し２倍の増加を示した。他のすべてのマーカーにおいて、対照に比し２倍超の増加が示された。最大増加はＣＩＤＥＡで観察され、これは対照に比し３．５倍の増加を示した。
【０１７７】
これらの観察結果により、ＢＭＰ−７処理はＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞の生粋のＢＡＴ細胞への分化を促進することが示唆される。
ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞が熱産生能を有する成熟した褐色脂肪細胞に分化したことをさらに裏付けるため、ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞および未処理の対照細胞を環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）類似体ジブチリルｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）かβ３−アドレナリンアゴニストＣＬ３１６２４９（Ｓｉｇｍａ）のいずれかに曝露した。これらの化合物のそれぞれが寒冷誘発性熱産生の誘発を模倣し、したがって、熱産生に関与する遺伝子の
発現トリガーとなり、これは成熟した褐色脂肪細胞内で排他的に生じる。これらの化合物のいずれかが、褐色脂肪細胞を機能的に特性化し、褐色脂肪細胞を白色脂肪細胞と識別するために一般に用いられる。
【０１７８】
処理後、上記のとおり、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＵＣＰ−１発現を分析した。
図４Ｂに示すとおり、ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）細胞集団において、対照細胞集団と比較して、ｃＡＭＰ後のＵＣＰ−１発現の約３００倍の増加が示された。この観察結果により、ＢＭＰ−７に曝露したＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞は、熱産生プログラムを作動してカテコールアミン刺激に反応する完全な能力を有する生粋の褐色脂肪細胞に分化することが示唆される。
【０１７９】
これらのデータを総合して、ＢＭＰ−７はＳｃａ−１（＋）前駆細胞（特にＳｃａ−１（＋）／ＣＤ４５（−）／Ｍａｃ−１（−）前駆細胞）の真の褐色脂肪細胞への分化を誘導できることが強く示唆される。
【実施例３】
【０１８０】
新規OLE_LINK2OLE_LINK3の褐色脂肪細胞前駆細胞OLE_LINK2OLE_LINK3の同定
本明細書に示す結果により、ＢＭＰはＳｃａ−１（＋）間葉前駆集団における褐色対白色脂肪の宿命を特定できることが実証される。Ｓｃａ−１発現は異種の前駆体貯留をマーキングする。実施例１と２に記載したマーカーの他に、Ｓｃａ−１（＋）細胞源を同定するため、ならびに褐色脂肪細胞前駆細胞の表面上のＳｃａ−１の他にこれらの細胞の同定もしくは精製に使用できるマーカーを同定するため、さまざまな供給源（筋肉、およびOLE_LINK5脂肪組織（OLE_LINK4肩甲骨間ＢＡＴ、皮下白色脂肪組織、および内臓白色脂肪組織OLE_LINK5OLE_LINK4など）など）からＳｃａ−１（＋）前駆体をＦＡＣＳにより単離した。次いで、単離Ｓｃａ−１（＋）細胞をＢＭＰ７に曝露して、細胞の成熟した褐色脂肪細胞への分化能を評価した。細胞表面マーカーにより、次いで細胞の褐色脂肪細胞への分化能を測定した。これら追加のＢＡＴ前駆細胞に特異的な細胞表面マーカーは褐色脂肪細胞前駆細胞の同定に使用できる。
【０１８１】
より具体的には、非造血Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞を骨格筋、骨髄、ならびに脂肪組織および蓄積脂肪（肩甲骨間ＢＡＴ、皮下白色脂肪組織、および内臓白色脂肪組織など）から下記のとおり単離した。
【０１８２】
骨格筋由来Ｓｃａ−１（＋）細胞
実施例１と２に用いた方法によりＳｃａ−１（＋）細胞を単離し、培養した。具体的には、動物を二酸化炭素、続いて頸椎脱臼で屠殺した。前後の両肢から筋組織を解離し、１５ｍＬ消化用緩衝液Ｉ（ＤＭＥＭ、０．２％ＩＩ型コラゲナーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０１−０１５）中に集めた。
【０１８３】
３７℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら９０分間消化した後、３ｍＬウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して消化を停止した。組織切片を分離し、この組織切片を破壊せずにＦ１０＋２０％ＦＢＳ培地で２回およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。組織をＰＢＳ中で細片化してインタクトな筋線維を得た。
【０１８４】
次いで、この筋線維を沈殿により３〜４回洗浄して間質細胞を除去した。最終洗浄後にこの上清を除去して最終容積３〜５ｍＬとした後、５〜６ｍＬ消化用緩衝液ＩＩ（Ｆ１０、０．０１２５％ＩＩ型コラゲナーゼ、０．０５％ディスパーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、番号１７１０５−０４１）を添加した。
【０１８５】
次いで、この試料を穏やかに撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートし、１．５ｍＬ ＦＢＳを添加して消化を停止した。この消化試料を上下に４回吸引して筋線維結合細胞を解離した後、低速度で１分間遠心して未消化組織切片を除去した。次いで、この上清を７０μｍのセルストレーナーでろ過した。遠心分離により細胞を集め、抗体染色のために低容積の選別培地（２％ＦＢＳハンクス緩衝塩溶液−ＨＢＳＳ）中で再懸濁した。
【０１８６】
すべての抗体を１：２００希釈でこれらの細胞懸濁液に添加し、氷上で２０分間インキュベートした。抗体はＳｃａ−１（ＡＰＣ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１７−５９８１−８２）、Ｍａｃ−１（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０１１２−８２）およびＣＤ４５（ＰＥ標識；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、番号１２−０４５１−８２）を標的とした。選別培地中での１回の洗浄工程後、細胞をろ過網でろ過した。生死選択マーカーであるポビドンヨード（死細胞）とカルセインブルー（生細胞）を添加後、ＰＥの負の選択（Ｍａｃ−１およびＣＤ４５発現）およびＡＰＣの正の選択（Ｓｃａ−１発現）を用いた蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）に細胞を供した（図６Ａを参照されたい）。
【０１８７】
次いで、細胞を増殖培地（Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ， ２００８ Ｊａｎ；８２（１）：４４−５６に公開されている）中で再懸濁した。増殖培地は低グルコース含有の６０％ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）と４０％ＭＣＤＢ２０１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｍ６７７０）からなる。増殖培地を２％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１５１４０−１５５）、１ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｄ−４９０２）、０．１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ａ８９６０）、１×インスリン、トランスフェリン、セレニウム（ＩＴＳ）混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｉ３１４６）、および１×リノール酸アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｌ９５３０）を添加した。マトリゲルコーティングした細胞培養用２４ウェルプレート上の集密度２５．０００〜５０．０００細胞／ウェルで細胞をプレートした。この増殖培地も次の増殖因子を添加した：１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製、３１５−０９）、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＥＳＧＲＯ、ＥＳＧ１１０７）、１０ｎｇ／ｍＬ ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製、３１５−１８）および５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｆ０２９１）。この培地に新規の増殖因子を添加後、すべての培地を一日おきに変更した。増殖期間中、細胞に５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、番号Ｆ０２９１）を連日添加して補充した。
【０１８８】
下記のとおり、これらの単離細胞を対象に、ＢＭＰ７で処理後の褐色脂肪細胞生成能について試験した。簡単に述べると、既に記載されているように（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３４７９５−３４８０２， １９９９； Ｈａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４：１６６３−１６７０， １９８９）、単離Ｓｃａ−１（＋）細胞を脂肪細胞分化培地の存在下または不在下でＢＭＰ７と接触させた。より具体的には、細胞を９０〜９５％集密度で、または選別後の７日間の拡大後に取得した。翌日、すべての増殖因子を含む増殖培地に３．３ｎＭ ＢＭＰ−７を添加することにより前処理を開始した。加えて、前のようにｂＦＧＦを連日添加した。
【０１８９】
７２時間後、脂肪細胞分化を４８時間誘導した。脂肪細胞分化誘導カクテルのため、増殖培地を増殖因子なしで用いた。代わりに、次の化合物を添加した：５μｇ／μＬインスリン（Ｒｏｃｈｅ製、１１３７６４９７００１）、５０μＭインドメタシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｉ７３７８）、０．５μＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｉ５８７９）、１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｄ−４９
０２）、および１ｎＭ Ｔ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｔ６３９７）。脂肪細胞分化誘導から２日後、この培地を５μｇ／μＬインスリンと１ｎＭ Ｔ３含有培地と置換して最大７日のみ追加した。続いてオイルレッドＯ染色および定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて脂肪細胞分化について分析した。
【０１９０】
図５Ａ〜５Ｃ（図１提示のデータと一致）に示すとおり、マウス後肢骨格筋から単離したＳｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ７処理は脂質蓄積の著しい増加を促進した。これらの骨格筋由来細胞の細胞表面マーカープロファイリングをＢＭＰ７で処理前に実施した。図６Ａに示すとおり、これらの単離骨格筋細胞はＳｃａ−１陽性、ＣＤ４５陰性、およびＭａｃ−１陰性であった。図６Ｂ〜６Ｆに示すとおり、これらのＳｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞も細胞表面マーカーＣＤ２９／インテグリンβ１およびＣＤで３４陽性であった。対照的に、これらの細胞は細胞表面マーカーＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１およびＣＤ１１７／Ｃ−ｋｉｔ陰性であった。
【０１９１】
これらの観察結果により、Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞は骨格筋から単離できることが確認される。これらの観察結果により、単独で、または１つまたは複数のＣＤ２９もしくはＣＤ３４と併用した細胞表面マーカーであるＳｃａ−１の陽性同定により、Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞を同定および／または精製できることも支持される。Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞は、細胞表面でのＣＤ４５、Ｍａｃ−１、ＣＤ３１、およびＣＤ１１７の非発現によりさらに同定できる。
【０１９２】
これらのＳｃａ−１（＋）細胞の生粋の褐色脂肪細胞への分化能をさらに確認するために、実施例１と２に記載したとおり、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して、これらの骨格筋由来Ｓｃａ−１（＋）細胞における脂肪細胞分化および褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化マーカー発現レベルを分析した。実施例１と２に記載したマーカーの他に、ＰＲＤＭ−１６、ＡＴＰアーゼ、Ｐｒｅｆ−１、ＢＭＰＲ−１１Ａ、ＢＭＰＲ−１Ｂ、ＢＭＰＲ−２、およびＡＣＶＲ−１の発現レベルも検出された。上記のとおり、ＵＣＰ−１はＢＡＴの信頼性の高いマーカーである。同様に、ＰＲＤＭ−１６は褐色脂肪細胞に特異的な脂肪細胞分化マーカーであり、ＵＣＰ−１はＢＡＴの同定に用いられる一般的なマーカーである。ＭＰＲ−１１Ａ、ＢＭＰＲ−１Ｂ、ＢＭＰＲ−２、およびＡＣＶＲ−１は脂肪細胞分化マーカーである。Ｐｒｅｆ−１は、脂肪細胞分化を確認するために使用できる脂肪細胞分化阻害物である。ＲＴ−ＰＣＴに用いられるプライマーを実施例２と以下に示す。ＵＣＰ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡＡＧ−３’配列番号１８
５’−ＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡ−３’配列番号１９である。
【０１９３】
ＰＲＤＭ−１６増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＡＧＣＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣ−３’配列番号２０
５’−ＧＣＧＴＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＧＴＧ−３’配列番号２１である。
【０１９４】
ＡＴＰアーゼ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣ−３’配列番号２２
５’−ＡＧＧＡＣＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴ−３’配列番号２３である。
【０１９５】
Ｐｒｅｆ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＧＴＡＣＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣ−３’配列番号２４
５’−ＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣ−３’配列番号２５である。
【０１９６】
ＢＭＰＲ−１Ａ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＡＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＣＣＣ−３’配列番号２６
５’−ＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＣＣ−３’配列番号２７である。
【０１９７】
ＢＭＰＲ−１Ｂ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴ−３’配列番号２８
５’−ＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＡ−３’配列番号２９である。
【０１９８】
ＢＭＰＲ−２増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡ−３’配列番号３０
５’−ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＡＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ−３’配列番号３１である。
【０１９９】
ＡＣＶＲ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３’配列番号３２
５’−ＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＴＣＣ−３’配列番号３３である。
【０２００】
図７に示すとおり、Ｓｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ７処理により、ＢＡＴ特異的マーカーＵＣＰ−１発現レベルの著しい増加に至った。さらに、これらの細胞におけるＵＣＰ−１発現は、これらの実験に用いた期間１２日間中、増加し続けた。ＢＡＴ特異的マーカーであるＰＲＤＭ−１６、ＣＩＤＥＡ、ＰＧＣ−１α、およびＰＧＣ−１β値の増加も、ＡＴＰアーゼの発現レベル増加として観察された。脂肪細胞分化マーカーであるＰＰＡＲγ、ａＰ２、ＦＡＳ、ＢＭＰＲ−１Ａ、およびＢＭＰＲ−２の発現レベル増加も観察された。対照的に、脂肪細胞分化阻害物Ｐｒｅｆ−１発現レベルの低下が観察された。
【０２０１】
これらの観察結果を総合して、ＢＭＰ７に曝露したＳｃａ−１（＋）細胞は単に脂肪細胞に分化するだけではなく、褐色脂肪細胞に特異的に分化することが確認される。実施例２に記載したとおり細胞をｃＡＭＰにも曝露したところ、図８に示すとおりこれらの細胞内のＵＣＰ−１発現はさらに著しく増加した。この観察結果により、Ｓｃａ−１（＋）細胞は熱産生プログラムを活性化することによりカテコールアミン刺激に反応する完全な能力を有する真の褐色脂肪細胞になることが再度支持される。
【０２０２】
脂肪組織由来のＳｃａ−１（＋）細胞
脂肪組織（OLE_LINK8OLE_LINK9肩甲骨間ＢＡＴ（ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴ）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）OLE_LINK8OLE_LINK9など）からＳｃａ−１（＋）細胞を単離し、上記の方法を用いて骨格筋由来Ｓｃａ−１（＋）細胞を培養した。次いで、単離細胞をＢＭＰ７に曝露した。これらの細胞のＢＡＴへの分化能を、オイルレッドＯ染色およびＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。
【０２０３】
図９に示すとおり、ＢＡＴおよびＳＱ−ＷＡＴ脂肪組織から単離したＳｃａ−１（＋）細胞は、ＢＡＴに分化することによりＢＭＰ７処理に反応した。対照的に、ＥＰＩ−ＷＡＴから単離したＳｃａ−１（＋）細胞はＢＭＰ７処理に反応しなかった。
【０２０４】
これらの視覚観察結果を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。Ｓｃａ−１（＋）は、肥満の遺伝的素因を有するマウスであるＣ５７Ｂｌ／６（Ｂ６）と肥満抵抗性マウスである１２９−Ｓ６（１２９）由来のＢＡＴ（OLE_LINK6OLE_LINK7ＢＡＴ）、皮下白色脂肪組織（ＳＱ−ＷＡＴOLE_LINK6OLE_LINK7）、および内臓白色脂肪組織（ＥＰＩ−ＷＡＴ）源からも単離した。次いで、これらのマウスから単離した細胞を筋肉由来細胞に対する上記のとおりＢＭＰ７に曝露し、脂肪細胞分化マーカーであるＦＡＳマーカーとＢＡＴ特異的マーカーＵＣＰ−１を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。
【０２０５】
図１０Ａと１０Ｂに示すとおり、肥満素因を有する動物と肥満抵抗性動物の両方から取得したＢＡＴおよびＳＱ−ＷＡＴから単離したＳｃａ−１（＋）細胞において、ＦＡＳ値もＵＣＰ−１値も増加した。対照的に、いずれの動物のＥＰＩ−ＷＡＴから取得したＳｃａ−１（＋）細胞においてもＦＡＳ値は増加しないことが観察され、ＵＣＰ−１は検出不能であった。特に、肥満抵抗性１２９マウスのＢＡＴまたはＳＱ−ＷＡＴから単離したＳｃａ−１（＋）細胞においてＵＣＰ−１が高値で発現し、ＢＭＰ−７前処理はこれらの細胞内のＵＣＰ−１発現をさらに誘導した。
【０２０６】
これらの観察結果により、Ｓｃａ−１（＋）ＢＡＴ前駆細胞は脂肪組織から単離でき、ＢＭＰ−７はＢＡＴマーカー発現を誘導できることが支持される。
【実施例４】
【０２０７】
肥満素因を有する動物モデルと肥満抵抗性動物モデルにおける筋肉常在Ｓｃａ−１（＋）細胞の生存可能性および機能の比較
肥満素因を有するＣ５７Ｂｌ／６（Ｂ６）および肥満抵抗性１２９−Ｓ６（１２９）マウスにおけるＳｃａ−１（＋）細胞数を、ＦＡＣＳおよび実施例３に記載の細胞単離方法を用いて評価した。
【０２０８】
図１１に示すとおり、Ｂ６と１２９における総Ｓｃａ−１（＋）細胞数はほぼ同じである。この観察結果により、肥満の遺伝的素因を有するか肥満抵抗性かは、Ｓｃａ−１（＋）細胞数に影響しないことが示唆される。
【０２０９】
Ｂ６と１２９マウスから単離した細胞がＢＭＰ７に反応する上で機能的な相違があるかどうかを調査するために、実施例３に記載したとおりに各動物からＳｃａ−１（＋）細胞を単離し、培養して、ＢＭＰ７に曝露した。ＢＡＴ特異的マーカーであるＵＣＰ−１と脂肪細胞分化マーカーであるＰＰＡＲγ値をＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。
【０２１０】
図１２Ａと１２Ｂに示すとおり、肥満抵抗性マウス（１２９）から単離したＳｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ７処理により、ＵＣＰ−１発現レベルは増加し、肥満素因を有する動物（Ｂ６）において観察された発現レベルよりも上回った。ＵＣＰ−１のベースライン値もOLE_LINK10OLE_LINK11、肥満抵抗性マウス（１２９）において肥満素因を有する動物（Ｂ６）OLE_LINK10OLE_LINK11よりも高かった。対照的に、ＰＰＡＲγ値は、肥満抵抗性マウス（１２９）と肥満素因を有する動物（Ｂ６）とで同等であった。
【０２１１】
これらの観察結果により、遺伝的背景は、Ｓｃａ−１（＋）細胞の褐色脂肪細胞分化の潜在的因子を決定することが示唆される。
【実施例５】
【０２１２】
ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞の非脂肪細胞系統への分化能
ＢＭＰで前処理した、あるいＢＭＰで前処理しない、骨原性および筋原性の分化培地の存在下において、Ｓｃａ−１（＋）細胞の異なる系統への分化能を調査した。具体的には、筋肉から単離したＳｃａ−１（＋）細胞を、ホルモンおよび化学物質含有の骨原性または筋原性誘導カクテルを用いて分化を誘導する前に、ＢＭＰ−７で前処理した（Ｐｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０３（５）：１６６２−８ ２００３）。骨格筋から単離してＢＭＰ７に曝露したＳｃａ−１（＋）細胞は骨原性または筋原性系統に分化しなかった。これらの観察結果から、ＢＭＰ７は具体的にＳｃａ−１（＋）細胞に対してＢＡＴ細胞へ分化する傾向を与えることが示唆される。これらのデータから、Ｓｃａ−１（＋）はＷＡＴかＢＡＴに分化可能な脂肪細胞であるが、Ｓｃａ−１（＋）をＢＭＰ７へ曝露すると、Ｓｃａ−１（＋）は機能的ＢＡＴ系統へ誘導されるというさらなる結論を
得ることができる。
【実施例６】
【０２１３】
ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞のインビボ移植
これらのＢＭＰで処理したインビボＳｃａ−１（＋）前駆細胞の褐色脂肪細胞対白色脂肪細胞への分化の方向付けを決定するため、遺伝子組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マウスから単離したＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞を、同じ遺伝背景を有するがＧＦＰを発現しないマウスの後肢および／または胸骨領域に注入した。
【０２１４】
このアプローチを用いて、移植した細胞の宿命を容易に追跡し、これらの移植した細胞がインビボで自己複製能および分化能を保有しているかどうかを決定する。
実施例３に記載した方法を用いて、ＧＦＰ発現マウスから細胞を単離し、培養した。次いで、これらの細胞を次のとおり移植した。非ＧＦＰレシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスの後肢筋肉および横腹領域周囲の皮下白色脂肪に約５×１０５細胞を直接注入した。移植から１０日後、ＢＭＰ−７処理したＳｃａ−１（＋）細胞は両注入部位においてＧＦＰ＋脂肪パッドに発展したことが落射蛍光法により測定された。
【０２１５】
図１３と図１４に示すとおり、ＢＭＰ７で処理して移植したＳｃａ−１（＋）細胞は、移植から１０日後にＳＱ−ＷＡＴ組織で検出された。さらに、ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞は移植から３０日後でも検出可能であった。
【０２１６】
これらのデータにより、ＢＭＰ７で処理したＳｃａ−１（＋）細胞は細胞移植に耐え、移植後に生存し続けることができることが示唆される。
【実施例７】
【０２１７】
Ｓｃａ−１（＋）細胞のＢＭＰ３、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ７による処理
実施例３に記載した方法を用いて、骨格筋から単離したＳｃａ−１（＋）細胞をＢＭＰ３、ＢＭＰ４、またはＢＭＰ７のいずれかに曝露した。次いで、定量ＲＴ−ＰＣＲおよび実施例２と３に記載した方法を用いて、ＵＣＰ−１、ＣＩＤＥＡ、ＰＰＡＲγ、ＦＡＳ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、およびＭｙｏＤ値を評価した。
【０２１８】
Ｍｙｏｇｅｎｉｎ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＣＴＡＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣ−３’配列番号３４
５’−ＴＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＡＴＴＣＡＣＴＧ−３’配列番号３５である。
【０２１９】
ＭｙｏＤ増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＧＧＴＴＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＧ−３’配列番号３６
５’−ＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＡ−３’配列番号３７である。
【０２２０】
ＡＣＶＲ−１増幅に用いたセンスおよびアンチセンスマーカーはそれぞれ：
５’−ＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３’配列番号３８
５’−ＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＴＣＣ−３’配列番号３９である。
【０２２１】
図１５に示すとおり、ＢＭＰ７およびＢＭＰ４は、Ｓｃａ−１（＋）細胞内のＢＡＴ特異的マーカーであるＵＣＰ−１およびＣＩＤＥＡの発現増加を促進する。
これらのデータにより、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞のＢＡＴへの分化を促進するために、ＢＭＰ７の他にＢＭＰ４を使用できることが示唆される。
【実施例８】
【０２２２】
細胞移植
Ｓｃａ−１（＋）細胞は、スキャフォールド、マトリックス、または移植を促進するために細胞を取り付けることができるその他の構造体にも埋め込まれる。生成組織は、上記の褐色および白色脂肪特異的マーカーの一般的な組織学および免疫組織化学により分析される。移植関連の体重改変、グルコースおよび脂質代謝、ならびに全身エネルギーバランスに関して精密モニタリングが行なわれる。
【０２２３】
褐色脂肪細胞を生成する分化能が組織特異的かどうかを決定するために、Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞を他の組織（骨格筋、前立腺、真皮、心血管系、乳腺、肝臓、新生児皮膚、頭蓋冠など）からも単離する。
【実施例９】
【０２２４】
分化を方向付けられた前駆脂肪細胞の特性化
異なるＢＭＰは複能性前駆細胞の褐色または白色脂肪細胞への分化の方向付けをトリガーする。具体的には、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４は白色脂肪細胞系統への分化を促進し、一方ＢＭＰ−７は褐色脂肪細胞系統への分化を促進する。
【０２２５】
ＢＭＰに曝露したＳｃａ−１（＋）前駆細胞は、総合的ゲノム、および方向付けられた褐色前駆脂肪細胞、方向付けられた白色前駆脂肪細胞、および方向付けられていない幹細胞の間を識別する細胞プロファイルを生成する分子形跡および細胞表面マーカーを測定するプロテオミクスのアプローチを用いて特性化される。これらのプロファイルは、褐色脂肪細胞または白色脂肪細胞の生成能に基づいて細胞集団を同定かつ選択するのに用いられる。
【０２２６】
ゲノミクス的アプローチとしては、発現プロファイリングのためのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃマイクロアレイおよびプロテオミクス分析のための細胞培養中の安定同位体標識法（ＳＩＬＡＣ）の使用が挙げられる。マイクロＲＮＡはＢＭＰ処理したＳｃａ−１（＋）前駆細胞においても研究される。
【０２２７】
したがって、ＢＭＰに曝露したＳｃａ−１（＋）前駆細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびマイクロＲＮＡプロファイルを研究することにより、褐色脂肪細胞系統または白色脂肪細胞系統への分化能を有する前駆細胞集団の同定に有用な細胞プロファイルを作製する。
【実施例１０】
【０２２８】
糖尿病治療における褐色および白色前駆体の生理的関連性の分析
Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞、およびこれらの細胞のＢＭＰ−７処理により生成した成熟した褐色脂肪細胞を肥満マウスに移植する。次いで、動物の体重、代謝、および／または糖尿病における変化を評価する試験を行なう。
【０２２９】
本明細書に記載の方法を用いて同定された細胞を、肥満発症に対する感受性が異なる実験動物モデルに注入する。適切な動物は肥満抵抗種１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ、肥満素因を有する種Ｃ５７ＢＬ／６、ｏｂ／ｏｂマウス、およびｄｂ／ｄｂマウスであり、このうち後者２種はそれぞれレプチンおよびレプチン受容体欠損である。体重増加および／または肥満についても、Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ｗｅｂｂ（Ｒｏｇｅｒｓ Ｐ． ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｇ．Ｐ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｎｕｔｒ． ４３：８３−８６， １９８０）により記載されている方法を用いて評価する。
【０２３０】
次いで、（１）脂肪、炭水化物、もしくはタンパク質含量もしくは比率の異なる食事効果、（２）医薬品（抗糖尿病薬ロシグリタゾンなど）による治療効果、および／または（３）対照動物（該細胞未投与）と実験動物（移植細胞を投与）の運動、の効果を検討する
実験を実施する。
【０２３１】
次いで、対照動物と実験動物を移植前後および試験全体を通して評価する。動物の体重（生きた動物を測量することにより）、血清グルコース（生きた動物内の血清グルコース値を測定することにより）、および／または血清インスリン（血清インスリン値を測定することにより）の変化を分析する試験を行なう。次いで、一部の動物を屠殺し、さらなる分析に用いる。他の動物は長期試験に用いる。他の動物は、空間行動、食物と液体の消費、温度、尿生成、代謝率および酸素と二酸化炭素交換の測定が可能な総合的実験動物モニタリング系（ＣＬＡＭＳ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ）を用いた代謝評価に使用する。
【０２３２】
他の実施形態
本発明は、本発明の詳細な説明と併せて記載しているが、上記の説明は例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲で定義された本発明の範囲を制限しないことが理解される。他の態様、利点、および修正は下記の特許請求の範囲内である。
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ細胞集団における褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させる方法であって、
幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞を含むの細胞集団を取得すること；ならびに以下のいずれか
前記インビトロ前駆細胞集団を１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７の発現増加を促進する有効量の化合物と、前記細胞集団中の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の前記特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分な時間接触させること；または
前記細胞集団中ＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分なレベルで１つまたは複数のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を発現するように前記細胞集団を遺伝子組換えすること、
を含む方法。
【請求項２】
０．１〜１００ｎＭインスリンと０．１〜１０ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．１〜５μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．１〜５０ｍＭデキサメタゾン、および０．０１〜１０ｍＭインドメタシンを含有する第１の細胞増殖培地において前記前駆細胞集団を培養すること；および
インスリンとＴ３を含有する第２の細胞増殖培地において前記前駆細胞集団を培養すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイドＸ受容体、α（ＲｘＲα）、インスリン、Ｔ３、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ビタミンＡ、レチノイン酸、インスリン、糖質コルチコイドもしくはそのアゴニスト、Ｗｉｎｇｌｅｓｓタイプ（Ｗｎｔ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ならびに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のうちの１つまたは複数と、前記前駆細胞集団を接触させることをさらに含む、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆細胞集団が骨格筋、前立腺組織、真皮組織、心血管系組織、乳腺組織、肝組織、新生児皮膚、頭蓋冠、骨髄、腸組織、脂肪組織、および脂肪組織蓄積から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記前駆細胞集団が骨格筋から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記前駆細胞集団が、少なくとも６０％のＳｃａ−１（＋）前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物がＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７アゴニストのうちの１つまたは複数である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物がＢＭＰ−７またはＢＭＰ−４アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞が、未処理Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞と比較して、脱共役タンパク質−（ＵＣＰ−１）および細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）を高値で発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の細胞増殖培地が、２０ｎＭインスリンおよび１ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．５μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５ｍＭデキサメタゾン、および０．１２５ｍＭインドメタシンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞集団。
【請求項１２】
請求項１１の細胞集団と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
医薬として許容可能な担体中に請求項１１に記載の細胞集団を含む貯蔵容器と、前記貯蔵容器と流体が接触する送達デバイスとを含む、細胞送達システム。
【請求項１４】
対象中の褐色脂肪細胞分化を促進する方法であって、
治療が必要な対象を選択すること；および
請求項１−９のいずれか一項に記載の方法により取得した細胞集団を前記対象に投与すること；を含み、
前記方法は対象におけるのＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を効果的に増加させる方法。
【請求項１５】
幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞を含む前記細胞集団が、治療のために選択される対象から取得される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、肥満または体重関連障害の治療を必要とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、脂肪蓄積低下、体重減少、およびインスリン感受性増加のうちの少なくとも一つを必要とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が前記対象中の褐色脂肪細胞分化を効果的に増加させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が食用動物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
インビトロ細胞集団における褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させる方法であって、
幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞を含むの細胞集団を取得すること；ならびに以下のいずれか
前記インビトロ前駆細胞集団を１つまたは複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７の発現増加を促進する有効量の化合物と、前記細胞集団中の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞の前記特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分な時間接触させること；または
前記細胞集団中ＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を増加させるのに十分なレベルで１つまたは複数のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を発現するように前記細胞集団を遺伝子組換えすること、
を含む方法。
【請求項２】
０．１〜１００ｎＭインスリンと０．１〜１０ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．１〜５μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．１〜５０ｍＭデキサメタゾン、および０．０１〜１０ｍＭインドメタシンを含有する第１の細胞増殖培地において前記前駆細胞集団を培養すること；および
インスリンとＴ３を含有する第２の細胞増殖培地において前記前駆細胞集団を培養すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイドＸ受容体、α（ＲｘＲα）、インスリン、Ｔ３、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ビタミンＡ、レチノイン酸、インスリン、糖質コルチコイドもしくはそのアゴニスト、Ｗｉｎｇｌｅｓｓタイプ（Ｗｎｔ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ならびに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のうちの１つまたは複数と、前記前駆細胞集団を接触させることをさらに含む、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆細胞集団が骨格筋、前立腺組織、真皮組織、心血管系組織、乳腺組織、肝組織、新生児皮膚、頭蓋冠、骨髄、腸組織、脂肪組織、および脂肪組織蓄積から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記前駆細胞集団が骨格筋から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記前駆細胞集団が、少なくとも６０％のＳｃａ−１（＋）前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物がＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７アゴニストのうちの１つまたは複数である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物がＢＭＰ−７またはＢＭＰ−４アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞が、未処理Ｓｃａ−１（＋）前駆細胞と比較して、脱共役タンパク質−（ＵＣＰ−１）および細胞死誘導ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）を高値で発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の細胞増殖培地が、２０ｎＭインスリンおよび１ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．５μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５ｍＭデキサメタゾン、および０．１２５ｍＭインドメタシンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞集団。
【請求項１２】
請求項１１の細胞集団と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
医薬として許容可能な担体中に請求項１１に記載の細胞集団を含む貯蔵容器と、前記貯蔵容器と流体が接触する送達デバイスとを含む、細胞送達システム。
【請求項１４】
対象中の褐色脂肪細胞分化を促進する方法であって、
治療が必要な対象を選択すること；および
請求項１−９のいずれか一項に記載の方法により取得した細胞集団を前記対象に投与すること；を含み、
前記方法は対象におけるのＢＡＴ細胞の特徴を備えた細胞の数を効果的に増加させる方法。
【請求項１５】
幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１（＋））前駆細胞を含む前記細胞集団が、治療のために選択される対象から取得される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、肥満または体重関連障害の治療を必要とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、脂肪蓄積低下、体重減少、およびインスリン感受性増加のうちの少なくとも一つを必要とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が前記対象中の褐色脂肪細胞分化を効果的に増加させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が食用動物である、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５２３３５７（Ｐ２０１１−５２３３５７Ａ）
【公表日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０８６３９（Ｐ２０１１−５０８６３９）
【出願日】平成２１年５月６日（２００９．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４３０２９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３７６１３
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５０６１９９９０５）ジョスリン ダイアビーティス センター インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月６日（２００９．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４３０２９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３７６１３
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５０６１９９９０５）ジョスリン ダイアビーティス センター インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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