診断アッセイ
【課題】本発明は、従来技術に関する問題、特に同種抗体および自己抗体を検出するための既存の方法に関する問題を克服しようとする。
【解決手段】本発明は、血液型抗原のミモトープ、血液型抗原のミモトープを同定するための方法、および前記ミモトープを用いる血液型抗原に対する抗体を同定するための方法に関する。本発明のさらなる態様によれば、試料中の血液型抗原に対する抗体を検出するための方法が提供される。その方法は、前記血液型抗原のミモトープと、試験される試料とを反応させる工程、試料とミモトープとの間のいずれかの反応を検出する工程を含み、ここで、試料とミモトープとの間の反応は、血液型抗原に対する抗体の存在を示す。
【解決手段】本発明は、血液型抗原のミモトープ、血液型抗原のミモトープを同定するための方法、および前記ミモトープを用いる血液型抗原に対する抗体を同定するための方法に関する。本発明のさらなる態様によれば、試料中の血液型抗原に対する抗体を検出するための方法が提供される。その方法は、前記血液型抗原のミモトープと、試験される試料とを反応させる工程、試料とミモトープとの間のいずれかの反応を検出する工程を含み、ここで、試料とミモトープとの間の反応は、血液型抗原に対する抗体の存在を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液型抗原のミモトープ、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液型抗原は、赤血球表面の膜タンパク質に存在する。２９の血液型系（Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、ＧｌｏｂｏｓｉｄｅおよびＧＩＬ）のうち１つを除いて全てをコードする遺伝子は、クローニングされ、配列決定され、アミノ酸配列が推定され、膜構造が予測される。
【０００３】
Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、ＤｕｆｆｙおよびＫｉｄｄ血液系などのうち、Ｒｈｅｓｕｓ抗原は最も複雑であり、２つの高い相同遺伝子である、ＲＨＤおよびＲＨＣＥの生成物である。抗原は、抗体結合に利用できる６個の細胞外ループを有すると予測される。
【０００４】
Ｒｈｅｓｕｓ抗原のうち、最も一般に発現される、ＲｈＤポリペプチドは、その最も近い等価物であるＲｈＣｃＥｅポリペプチドと３６アミノ酸異なる。両方は、Ｒｈｅｓｕｓ関連糖タンパク質（ＲＡＧ）ポリペプチドと同時に発現される。
【０００５】
ＲＨＣＥ遺伝子産物は４つの対立形質に存在し、各々の対立遺伝子は、組み合わせて、すなわち、Ｃｅ、ｃｅ、ｃＥまたはＣＥの２つの抗原の発現を決定する。ＲｈＣ抗原は、ループ２における１つのアミノ酸がＲｈｃとは異なり（Ｓｅｒ１０３Ｐｒｏ）、そしてＥ／ｅに関して、単一の外表面アミノ酸の相違はループ４に予測される（Ｐｒｏ２２６Ａｌａ）。
【０００６】
Ｋｅｌｌタンパク質は、単一の膜を通り抜ける構造であり、Ｋ／ｋ対立遺伝子は、細胞外領域に単一のアミノ酸変化（Ｍｅｔ１９３Ｔｈｒ）を生じる一塩基変異多型（ＳＮＰ）の結果である。
【０００７】
Ｄｕｆｆｙタンパク質は、Ｎ末端が細胞外である３つの細胞外ループを有すると予測され、Ｆｙａ／Ｆｙｂ対立遺伝子は、Ｎ末端領域にアミノ酸置換（Ａｓｐ４２Ｇｌｙ）を引き起こすＳＮＰの結果である。
【０００８】
Ｋｉｄｄ糖タンパク質は、細胞内Ｎ末端およびＣ末端を有する１０個の膜貫通ドメインを有すると予測される。Ｊｋａ／Ｊｋｂ多型は、第４の細胞外ループにおいて単一のアミノ酸置換（Ａｓｐ２８０Ａｓｎ）を引き起こすＳＮＰによる。
【０００９】
抗体に結合する抗原上の免疫学的決定基は、Ｂ細胞エピトープと定義される。なぜなら、それらは、Ｂリンパ球の表面膜免疫グロブリン受容体によって認識されるからである。これらのエピトープは、直線状、すなわち、タンパク質配列由来のアミノ酸の連続的な伸長または立体構造であってもよく、隣接しないアミノ酸の空間的に並んだ位置に依存する。血液型抗原のＢ細胞エピトープ構造の研究は、ほとんどがＲｈＤ抗原に限定され、今まで、３０を越えるエピトープが血清学的に同定されている。
【００１０】
単一アミノ酸置換は、関与する予測されたループが直線状の配列においていくらか離れていても、１つより多いエピトープに影響を与え得、ＲｈＤ Ｂ細胞エピトープが立体構造であるという結論が出される。
【００１１】
Ｃ／ｃおよびＥ／ｅ上のＢ細胞エピトープは、少数であると推定されるが、立体構造であるように思われる。なぜなら、抗原性はＲＡＧポリペプチドの同時発現を必要とするからである。
【００１２】
Ｋ／ｋ多型は、Ｋ対立遺伝子の抗原性の原因となり得る糖タンパク質部位を破壊すると推定され、エピトープ決定基も立体構造であると予想される。
【００１３】
血液型抗原は、輸血された赤血球の破壊を引き起こし得る同種抗体の生成物を含み得る。従って、輸血された血液に対する反応は、輸血された赤血球の受容者が、それらの破壊を生じるこれらの赤血球に対する抗体を有する場合に生じ得る。熱、低血圧、吐き気および嘔吐、ならびに腰痛および胸の痛みを含む、即時反応が生じ得、反応の重篤度は関与する抗体のクラスおよび量に依存する。
【００１４】
血液型抗原に対する同種抗体はまた、妊婦の胎盤を通過し、新生児溶血性疾患（ＨＤＮＢ）を生じ得る。新生児溶血性疾患（ＨＤＮＢ）は、母が幼児の赤血球上の抗原に対して感受性のある場合に生じ得、これらの抗原に対するＩｇＧ抗体を作製する。これらの抗体は胎盤を通過し、胎児の赤血球と反応して、それらの破壊を生じ得る。ＲｈＤは最も一般的に関与する抗原である。
【００１５】
血液型抗原はまた、自己免疫性溶血性貧血などの自己免疫疾患に関与する自己抗体の生成物を含み得る。この自己免疫疾患に対する誘因はまだ知られておらず、従って、いかなる時にも生じる場合があり、自分の身体の赤血球細胞を攻撃する特異性のある広範なＲｈ群の身体産生自己抗体を生じる。
【００１６】
同種抗体産生に関連する最も重要な血液型は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、およびＫｉｄｄである。
【００１７】
輸血された赤血球を破壊し得るか、またはＨＤＮＢを引き起こすために胎盤を通過し得る同種抗体を検出するため、あるいは自己抗体を検出するための現在の方法は、供血者の赤血球試薬に頼っている。それらは、有効期間が短く、供血者間の抗原発現においてかなり変化する。ヒトの血液製剤の使用はまた、安全性の関与、例えば、ウイルス感染の潜在的な移入に関することを導く。ヒトの試薬を使用する場合に必要とされる厳密な試験およびスクリーニングは、試料間の不整合性とともに、同種抗体を検出するための試薬の利用可能性を遅らせ、そして、適した試薬を得る費用を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明は、従来技術に関する問題、特に同種抗体および自己抗体を検出するための既存の方法に関する問題を克服しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の態様によれば、血液型抗原のミモトープを提供する。
【００２０】
用語「ミモトープ」とは、天然ペプチドのエピトープを模倣できるペプチドをいう。通常、このようなペプチドは合成ペプチドである。これに関して、「合成ペプチド」は、生物系において天然に発現されるよりむしろ、合成される任意のペプチドを含む。合成は、ファージディスプレイ、Ｆ−ｍｏｃ化学あるいは生物系もしくは非生物系または環境における外来ペプチドを発現または合成するための任意の他の手段などの組み換え技術によってなされてもよい。
【００２１】
従って、本発明は、血液型抗原に対して引き起こされる抗体に結合できる新規のペプチドを提供する。これらのペプチドは、必ずしもヒトの血液などの天然源由来ではなく、従って、健康上のリスク、保存の問題およびそれらの関連する変動性をもたらさない。
【００２２】
簡便には、血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、ＧｌｏｂｏｓｉｄｅまたはＧＩＬから選択される。
【００２３】
ミモトープの推定アミノ酸構造は、それが模倣する抗原のアミノ酸構造に必ずしも対応していなくてもよい。実際に、本研究において、同定された多数の血液型ミモトープは、それらが模倣する天然抗原のアミノ酸配列とは広範に異なるアミノ酸配列を有することが発見された。
【００２４】
多くの血液型抗原のエピトープは構造が複雑であると考えられているため、イムノパニングによって本発明において同定された合成ペプチドが、特定の様式で天然抗原に対して引き起こされた抗体に結合できることは驚くべきことである。この発見は、合成血液型ミモトープが、それらの対応する抗原に対して引き起こされた抗体に特異的に結合することを可能にする三次構造を担い、維持することを示唆する。
【００２５】
簡便には、ミモトープは合成される。これにより、ヒトの血液試薬を用いることに関連する問題、例えば、汚染の潜在的リスク、および感染、保存に関する困難性、ドナーの識別、変動性およびスクリーニングが取り除かれる。費用に関連するこれらの問題も、合成ミモトープの使用により減少されるだろう。合成ミモトープの使用はまた、使用するために利用可能である試薬に対するより程度の高い制御を提供し、不足が決して起こらないことを確実にし、試薬についての不必要な待機を回避できる。
【００２６】
本研究を通して、多数の血液型抗原のミモトープが同定された。血液型ミモトープとして簡便に同定されたペプチドのいくつかは、表２〜５に同定され、ペプチド断片、免疫反応性類似体またはそれらの誘導体を含む。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、血液型抗原のミモトープを同定するための方法が提供され、その方法は、ランダムファージディスプレイライブラリーと、血液型抗原に対する抗体とを接触させること、およびファージディスプレイライブラリーにおけるペプチドに対する抗体の結合を検出することを含み、ここで、ペプチドに対する抗体の結合は、ペプチドが血液型抗原のミモトープであることを示す。
【００２８】
好ましくは、血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、ＧｌｏｂｏｓｉｄｅまたはＧＩＬである。これらは、同種抗体および自己抗体の産生に関連する血液型抗原である。
【００２９】
ミモトープが結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製物であってもよい。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該分野において周知である。
【００３０】
７量体、１２量体、および１５量体のペプチドを含むランダムファージディスプレイライブラリーが、天然血液型抗原に対して引き起こされる抗体に結合できるペプチドを同定するために使用された。抗体に結合されたペプチドの同定および配列決定により、潜在的な血液型抗原ミモトープの同定が可能になった。その後のＥＬＩＳＡによるこれらのペプチドの解析、続く、ＳＰＯＴによるこれらのペプチドの合成および膜に結合したＳＰＯＴの解析により、ペプチド抗体結合の強度および特異性を確認した。これにより、模倣される天然抗原とは構造的に異なる合成ペプチドが首尾よく、天然の血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合できることが確認され、それにより、問題となる血液型抗原の有効なミモトープが示される。例えば、ミクロスフェアビーズまたは超常磁性ビーズ上でのミモトープの固定化は、天然の血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合するミモトープの能力に影響を与えなかった。従って、記載される方法は、臨床環境、例えば、同種抗体または自己抗体の産生に関連する疾患の診断において使用され得る血液型抗原の合成ミモトープを同定するための効果的および有効な方法を示す。
【００３１】
ファージ−ペプチドに対する抗体の結合は、任意の適切な手段によって検出され得、そのような手段は当業者に公知である。使用され得る結合の型の例は、実施例に記載される。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、試料中の血液型抗原に対する抗体を検出するための方法が提供される。その方法は、前記血液型抗原のミモトープと、試験される試料とを反応させる工程、試料とミモトープとの間のいずれかの反応を検出する工程を含み、ここで、試料とミモトープとの間の反応は、血液型抗原に対する抗体の存在を示す。
【００３３】
簡便には、上記の特定された方法を実施する前に、ミモトープは、固体支持体に固定化される。ミクロスフェアビーズまたは超常磁性ビーズなどの固体支持体上のミモトープの固定化は、ミモトープが天然の血液型に対して引き起こされる抗体に特異的に結合する能力に影響を与えなかった。これに関して、その方法は、固体支持体上に血液型抗原のミモトープを固定すること、固定されたミモトープと、試験される試料とを接触させること、ミモトープに対する試料の結合を検出することを含み、ここで、ミモトープに対する試料の結合は、ミモトープによって模倣された血液型抗原に対する抗体の存在を示す。
【００３４】
簡便には、血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、またはＧＩＬである。
【００３５】
これに関して、多くの天然の血液型抗原のエピトープが、高次構造であると考えられるならば、本明細書に同定される合成ミモトープは、固体支持体に結合される場合でさえ、天然の血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合する三次構造を示すことができることは驚くべきことである。固体支持体は、目的のための任意の適切な支持体を含んでもよいが、簡便には、膜、スライドガラスまたはビーズ（ガラス、ポリスチレンなど）を含む。支持体への結合は、例えば、ポリスチレンミクロスフェアビーズの表面に結合されるＮｉ−ＮＴＡ基を用いること、または超常磁性ポリスチレンビーズを用いることなどの任意の適切な手段によってなされてもよい。ポリヒスチジンタグが、支持体への結合を促進するためにミモトープのＣ末端またはＮ末端に導入されてもよい。より小さいバックグランドを有し、首尾よく剥がれ、再びプローブできる膜、例えば、ＩＮＴＡＶＩＳ ＡＧ膜が好ましい。
【００３６】
従って、本発明は、血液型抗原に対して引き起こされる、生物学的試料における抗体を効果的に同定する方法を提供する。合成ミモトープの使用は、ヒト試薬の使用に関して確認されている問題を取り除く。これにより、抗体検出における一貫性が向上し、血液型抗原に対して引き起こされる抗体をスクリーニングするための既存の技術と比べて、ほとんど費用をかけないか、または余分な費用をかけずに、より稀少な抗体の検出を可能にする。ヒトの血液製剤の使用を回避することもまた、安全性を高め、ヒトの血液製剤を使用する場合に必要とされる厳密な試験を回避し、使用のために利用可能な試薬の一貫性を向上する。これにより、使用のために試薬を調達し、清浄する費用が減少する。従って、記載される方法は、既存の検出方法より信頼性があり、安全かつ都合が良く、生物学的試料における血液型抗原に対する抗体の検出を、より迅速に、より安く、かつより実施しやすくする。
【００３７】
検出される抗体は、血液型抗原に対する同種抗体または自己抗体であってもよい。従って、記載される方法は、同種抗体または自己抗体の産生に関与する血液製剤に対する疾患または反応を検出および診断する改良された方法を提供する。そのような疾患としては、赤血球輸血（ＨＴＲ）に対する溶血反応、新生児溶血性疾患および自己免疫性溶血性貧血が挙げられる。
【００３８】
簡便には、抗体は同種抗体であり、これはＨＴＲまたは新生児溶血性疾患の危険性の信頼性があり、かつ安全な診断を可能にする。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、試料中の血液型抗原に対する抗体の存在を検出するための装置が提供される。固体支持体（膜、スライドガラス、マイクロアレイチップ、またはビーズ（複数も含む）など）を含む装置は、その支持体に固定される血液型抗原のミモトープの配列を有するか、または各々の固体支持体上に１つのミモトープを有し、複数の固体支持体が提供される。
【００４０】
配列は、単一のＲｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、またはＧＩＬ抗原ミモトープを含んで構築されてもよい。あるいは、配列は、同じ診断配列で配置される複数の血液型由来のミモトープを有する、血液型ミモトープの任意の組み合わせを含んで開発されてもよい。配列の構成および設計は、装置の意図される目的に依存してもよく、必要とされる場合、オーダーメイドの配列が開発されてもよい。特定の目的のために必要とされる配列は、試薬の利用可能性を考慮する必要もなく、迅速に、信頼性があり、かつ費用効果的に構築され得る。
【００４１】
配列の構築に関して、固体膜支持体に結合するペプチドのための異なる種類および長さのスペーサーが使用されてもよい。例えば、アミノ−ＰＥＧスペーサーまたは限定された数のアミノ酸残基が、固体支持体に対してミモトープペプチド配列を結合するために使用されてもよい。
【００４２】
簡便には、抗体は同種抗体である。従って、装置は、ヒトの血液型試薬の使用を必要とせずに、血液型抗原に対して同種抗体を産生する疑いのある患者から得られる血液の試料中の同種抗体を検出するために使用され得る。血液型試薬の必要性の除去は、簡便には、血液型試料中の抗体の検出のための試薬の利用可能性を増加する。
【００４３】
本明細書に記載される抗原捕捉系はまた、抗体検出の感受性および正確性を増加でき、従って、血液型の検出についての既存の方法より改良された方法を提供する。
【００４４】
バイオパニングによって選択されるファージ−ペプチドは、最初に抗体を同定するために使用される抗体に特異的に結合することを示すことによって、本明細書に記載される実験により、診断試薬として選択されたファージ−ペプチドの潜在的価値が確認される。
【００４５】
本研究において同定されたミモトープは、適切な固相に結合する場合、血液型抗原に対する抗体を検出するためのスクリーニング試薬として使用され得る。
【００４６】
これに関して、ミモトープは、同種抗体または自己抗体の産生に関連する疾患などの血液型抗原に関連する疾患を診断するために使用され得る。
【００４７】
本明細書において同定され、記載されるミモトープのさらなる潜在的使用は、そのミモトープと一緒に形成される配列の使用とともに当業者にとって明らかであろう。
【００４８】
ここで、本発明は、添付の図面を参照して、例示のみとして記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】アッセイした２０個のＦｙｂファージ−ペプチドのうち１４個に対する抗Ｆｙｂ抗体（ＬＭ４４７）の結合を確認する、ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。２０個のＦｙｂペプチドミモトープを複製して合成した。結合実験により、膜支持体で合成した場合、Ｆｙｂペプチドミモトープが、抗Ｆｙｂ抗体を認識し、結合する能力を確認した。
【図３】アッセイした１９個のＦｙａファージ−ペプチドのうち１６個に対する抗Ｆｙａ抗体（ＬＭ４８７）の結合を確認する、ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の３７個のＦｙａペプチドミモトープを膜で合成し、抗Ｆｙａ抗体（ＬＭ４８７）に結合するそれらの能力を試験した。
【図５】抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体、ＬＭ４４７およびＬＭ４８７とのＦｙａペプチドミモトープの相互ハイブリダイゼーションの結果を示す。一連のＦｙａおよびペプチドミモトープを複製して合成し、２つのモノクローナルとの膜のハイブリダイゼーションにより、抗体特異的および交差反応性ペプチドミモトープを同定した。
【図６】アミノ酸置換実験の結果を示す。一連の１６個の合成ペプチドをＳＰＯＴにより複製して合成した。これらの配列は、ＦｙｂコンセンサスＩ配列に由来し、アミノ酸置換により生成した。合成ペプチドミモトープを、抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体に結合するそれらの能力について試験した。
【図７】抗ＲｈＤ抗体により選択されたペプチドミモトープのサブセットとモノクローナル抗体Ｔ１０とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。４０個のペプチド（ＲｈＤ４１−ＲｈＤ８０）を合成して、陽性信号を１１個のスポット（スポット１−３、８、１７、２７、２８、３１、３７、３９および４０；ペプチド配列についての表を参照のこと）で観測した。
【図８】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の２８個のＲｈＤペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成して、ポリクローナル抗ＲｈＤ抗血清調製物との膜のハイブリダイゼーションにより、抗体反応性ペプチドを同定した。
【図９】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の３６個のＲｈＥペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成した。モノクローナル抗体Ｅ０００２との膜のハイブリダイゼーションにより、抗体特異的ペプチドミモトープを同定した。
【図１０】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の１６個のＲｈｅペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成した。モノクローナル抗体ｅ０００２との膜のハイブリダイゼーションにより、抗体特異的ペプチドミモトープを同定した。
【図１１】ポリスチレンＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズに固定されたペプチドミモトープＦｙｂ１６に結合する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合を示す。信号強度は、固定されたペプチドミモトープに対して結合されたモノクローナル抗体の量と一致する。
【図１２】ポリスチレンＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズに固定されたペプチドミモトープＲｈＤ１２に結合している抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合を示す。信号強度は、固定されたペプチドミモトープに結合されたモノクローナル抗体の量と一致する。
【図１３】改変されたゲル凝集アッセイにおいて超常磁性ポリスチレンビーズに固定されたペプチドミモトープＲｈＤ１２に対する抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合を示す。チャンバ１：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたペプチドミモトープＲｈＤ１２のみ；チャンバ２：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＲｈＤ１２＋抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）；チャンバ３：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＲｈＤ１２＋抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）。
【図１４】改変されたゲル凝集アッセイにおいて超常磁性ポリスチレンビーズに固定されたペプチドミモトープＦｙｂ１６に対する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合を示す。チャンバ１：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたペプチドミモトープＦｙｂ１６のみ；チャンバ２：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＦｙｂ１６＋抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）；チャンバ３：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＦｙｂ１６＋抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（方法論）
血液型抗原のミモトープの同定を、一連の血液型抗原特異的モノクローナル抗体（３×抗ＲｈＤ、３×ＲｈＥ、２×Ｒｈｅ、１×Ｆｙａ、１×Ｆｙｂ）およびＲｈＤポリクローナル調製物を有する４つのファージ−ペプチドライブラリーのバイオパニングを用いて開始した。合計で、４９０個のファージを選択して、ＤＮＡ塩基配列決定およびＥＬＩＳＡによって最初に特徴付けた。ＤＮＡ塩基配列解析により、２９５個の固有のファージ−ペプチド配列を同定し、それをＳＰＯＴ技術によって膜で合成した。ペプチド／抗体反応の特異性を、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴアッセイによって試験し、特定のＲｈＤ、ＲｈＥ、Ｒｈｅ、ＦｙａおよびＦｙｂ抗体を検出できる８４個のペプチドを同定した。
【００５１】
（バイオパニング）
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．から供給される３つの異なるファージライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．７およびＰｈ．Ｄ．１２は、それぞれ、直線状の７量体および１２量体のペプチドを示し、Ｐｈ．Ｄ．Ｃ７Ｃは、それらの末端でジスルフィド架橋を強いられる７量体のペプチドを示す）および直線状の１５量体のライブラリー（親切にもＰｒｏｆ．Ｇｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉによって提供された）を、１０個の異なるモノクローナル抗体およびポリクローナル調製物を用いてバイオパニング実験に使用した（表１）。
【００５２】
表１：バイオパニングにおいて使用した抗体
【００５３】
【表１】
【００５４】
記載した全てのモノクローナル抗体を、培養上清から精製した。ポリクローナル抗ＲｈＤ調製物を、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅから得た。
【００５５】
各標的抗体／ライブラリーの組み合わせに関して、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ４平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）の個別のウェルを、１５０μｌのＥＬＩＳＡコーティングバッファー（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の５μｇの抗体でコーティングした。プレートを密閉して、４℃で一晩インキュベートした。結合していない抗体を捨てて、３５０μｌのブロッキングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３／３％の脱脂粉乳）を各ウェルに加えた。プレートを密閉して、４℃で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去して、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。１００μｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中の約２×１０１１のプラーク形成単位（ｐｆｕ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。結合したファージを、１００μｌの０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ／ＢＳＡ、ｐＨ２．２（１ｍｇ／ｍｌ）で１０分間インキュベートすることによって溶出し、次いで１５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和した。ラウンド１の溶出液のアリコートを除去し、滴定した。溶出したファージの残りを、３７℃で４．５時間、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５３８細胞の感染によって増幅させた。培養液を、４℃で１０，０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離した。上清を回収し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のポリエチレングリコール８０００；２．５ＭのＮａＣｌ）を加え、次いで４℃で一晩インキュベートした。ＰＥＧ沈殿したファージを、４℃で１０，０００ｒｐｍにて１５分間、遠心分離した。上清を除去し、ファージペレットを２００μｌのＴＢＳに再懸濁した。パニングの２つのさらなるラウンドを開始し、約２×１０１１ｐｆｕのラウンド２またはラウンド３の増幅させた溶出液を注入ファージとして使用した。ラウンド３の溶出液を滴定したが、増幅しなかった。個々のプラークを増幅させ、ＤＮＡ配列解析の前にＰＣＲ増幅に供した。続いて、ペプチド抗体結合の特異性を、ファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴ技術の両方を用いて決定した。
【００５６】
（ファージ培養）
個々のファージクローンを、ラウンド３の滴定プレートからランダムに選択し、１ｍｌ容積の１：１００希釈の、Ｌ−Ｂｒｏｔｈで増殖するＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５３８の一晩培養液中で増幅させた。培養液を３７℃で４．５時間インキュベートし、次いで１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ファージ上清を、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ塩基配列決定およびファージＥＬＩＳＡによるさらなる解析のために回収した。
【００５７】
（ＰＣＲ増幅）
選択されたファージクローンの各々において示されるペプチド配列を決定するために、ペプチド配列をコードするＤＮＡ挿入物をＰＣＲによって得た。ＰＣＲ増幅を、１倍のバッファー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、４００μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１μｌのファージ培養液上清ならびに各々０．５μＭの適切なフォワードおよびリバースプライマーを含む２５μｌの最終溶液で実施した。プライマー１２ＭＥＲ１Ｆｏｒ：５−ＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣ−３および１２ＭＥＲ２Ｒｅｖ：５−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３を、Ｃ７Ｃ、直線状の７量体および１２量体のファージ／ペプチドの増幅について使用した。プライマーＦｕｓｅ５Ｆｏｒ１：５’−ＡＣＣＧＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＣ−３’およびＦｕｓｅ５Ｒｅｖ１：５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧ−３’を、１５量体のファージ／ペプチドの増幅について使用した。ＰＣＲを、以下の条件：１分間９５℃で変性；１分間５５℃でアニーリング；および３分間７２℃で伸長の下で熱サイクラー（Ｔｅｃｈｇｅｎｅ、モデルＦＴＧｅｎｅ２Ｄ；Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で実施した。３０サイクル後、伸長を７２℃でさらに９分間続けた。ＰＣＲ産物を、配列解析のためにＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。
【００５８】
（配列解析）
ファージペプチドのヌクレオチド配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて得た。プライマー１２ＭＥＲ２Ｒｅｖを、Ｃ７Ｃ、直線状の７量体および１２量体のＰＣＲ産物のランダムペプチド配列を決定するために使用した。プライマーＦｕｓｅ５Ｒｅｖ１を、１５量体のＰＣＲ産物のために使用した。アミノ酸配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いてヌクレオチド配列から推定した。
【００５９】
（ファージＥＬＩＳＡ）
回収したファージ−ペプチドが、それらの選択において使用された抗体と反応する能力を、捕捉ＥＬＩＳＡによって確認した。適切なモノクローナル抗体の１０μｇ／ｍｌのストックを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー中で調製して、１５０μｌのアリコートを、Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、次いで４℃で一晩インキュベートした。結合していない抗体を捨てて、ウェルを、４℃で１時間、３５０μｌのブロッキングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３／３％の脱脂粉乳）でブロックした。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１００μｌの選択されたファージ培養液上清を、室温で１時間、適切なウェルに加えた。結合していないファージを除去し、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。抗Ｍ１３に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１：５０００希釈である、二次抗体を、ブロッキングバッファー中で調製して、１００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。反応を起こすために、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（Ｓｉｇｍａ）の２００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーによって４５０ｎｍでの吸光度を測定した。０．１より大きいＯＤ４５０信号を陽性とみなした。
【００６０】
（ＳＰＯＴ合成）
ペプチドミモトープを、Ｆ−ｍｏｃ化学を用いてＳＰＯＴ法（Ｆｒａｎｋ；１９９２）により合成した。ペプチドをアミノ−ＰＥＧ誘導体化セルロース膜（Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ）に固定し、別個のスポットとして合成した。合成を、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓプロトコルに従って、それぞれのアミノ酸の手動でのピペット操作により、Ｃ末端からＮ末端までのペプチド鎖の段階的な伸長により行った。Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ膜を用いた場合、インキュベート時間を変更した。最後のアミノ酸の添加後、ペプチドの末端残基および側鎖を脱保護して、膜をメタノールで洗浄し、空気乾燥し、次いで使用前に−２０℃で保存した。
【００６１】
（ＳＰＯＴ膜のスクリーニング）
膜を５０ｍｌのファルコンチューブに入れ、ＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０／５％の脱脂粉乳中で穏やかに攪拌しながら４℃で一晩ブロックした。一次（１°）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の２μｇ／ｍｌの希釈を、ＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０／５％の脱脂粉乳中で調製し、その後、スパイラルローターで、室温で１時間、膜とともにインキュベートした。２０ｍｌのＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を用いて各々５分間の４回の洗浄後、膜を、室温で１時間、ＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０／５％の脱脂粉乳中で調製した１／５０００希釈の二次（２°）抗体とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識したラビット抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、マウス抗Ｆｙａ（ＬＭ４８７）および抗Ｆｙｂ（ＬＭ４４７）１°抗体の検出のために使用し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ヒト１°抗体の検出のために使用した。２０ｍｌのＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を用いて各々５分間の４回の洗浄後、膜をブロットして過剰な流体を取り除いた。結合した抗体を化学発光によって検出した。ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合して、２分間膜上で重ね合わせた。化学発光基質を除去し、膜をブロットして過剰な流体を取り除いた。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への曝露後、連続した短いインキュベート時間（５秒〜１０分）の間、陽性スポットを視覚化した。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（Ｄｕｆｆｙ抗原エピトープを模倣するファージ−ペプチドの同定）
抗Ｆｙａ（ＬＭ４８７）および抗Ｆｙｂ（ＬＭ４４７）特異的モノクローナル抗体を、Ｄｕｆｆｙ糖タンパク質（Ｃｏｌｌｉｇａｎら、１９９８）上のエピトープ由来の抗原性ペプチドを用いて開発した。これらの抗体を、天然Ｄｕｆｆｙ抗原を模倣したペプチドについてのファージラブラリーをパニング（ｐａｎ）するために使用した。各々のパニング実験の最後の３ラウンドからのクローンを、増幅およびＤＮＡ配列決定のためにランダムに選択した。ファージ−ペプチドによってコードされたアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列データから推定した。
【００６３】
４つのファージ−ペプチドライブラリーの各々のバイオパニングを、抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）を用いて行い、各々のライブラリーからの特定の配列の複数のコピーの同定を得た。合計で、１００の固有のＦｙｂペプチドミモトープを同定した（表２／ペプチドＦｙｂ１−７１およびＦｙｂ８８−１１６を参照のこと）。同定された配列のどれも、ＬＭ４４７抗体の開発に使用した１４量体の免疫ペプチド（ＰＤＧＤＹＤＡＮＬＥＡＡＡＰ；ＣＰｅｐ７５）に似ていなかった。しかしながら、これらの「Ｆｙｂ」ペプチドミモトープのアミノ酸配列の解析により、２つのコンセンサス配列：
コンセンサス１：Ｍ（Ｆ／Ｙ）ＱＰＤ（Ｎ／Ｐ）（Ｐ／Ｌ）（Ｔ／Ｐ）Ｔ（Ｋ／Ｌ）（Ｎ／Ｑ）（Ｐ／Ｖ／Ａ／Ｓ）
コンセンサス２：Ｄ（Ｈ／Ｍ／Ｖ）ＨＹＴ（Ｓ／Ｎ）ＮＴＤＰＬ（Ｈ／Ｎ／Ｒ）（Ａ／Ｐ／Ｖ）Ｐ
を同定した。
【００６４】
各々のコンセンサス配列内の特定の位置は、限定した数のアミノ酸を有した（括弧に示される）。これらは、選択されたＦｙｂペプチドミモトープの全集団内で同程度で生じた。
【００６５】
表２：Ｆｙｂペプチド
【００６６】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【００６７】
抗Ｆｙａモノクローナルである、ＬＭ４８７を用いるバイオパニングにより、合計で３７の固有のペプチド配列を同定した（表３／ＦｙａペプチドＦｙａ１−３７を参照のこと）。Ｆｙａ多型と同一の配列を含む、少数の「Ｆｙａ」ファージ−ペプチドは、オリジナルの１４量体の免疫ペプチド（ＰＤＧＤＹＧＡＮＬＥＡＡＡＰ；ＣＰｅｐ１１８）内に存在し、これによって、血液型抗原模倣物を同定するためのアプローチとしてファージディスプレイの使用が立証された。これらの「Ｆｙａ」ペプチドミモトープのアミノ酸配列の配列解析により、２つの推定コンセンサス配列：
コンセンサスＩ：ＹＮＹＱＳＹＰＮＰＦＰＶ
コンセンサスＩＩ：ＧＩ（Ａ／Ｓ）（Ｅ／Ｄ）（Ｄ／Ｇ）ＤＹＧＡＬＳＷ
も同定した。
【００６８】
しかしながら、「Ｆｙｂ」の結果と対照的に、これらの「Ｆｙａ」ペプチドミモトープ配列の多くは、上記の同定したコンセンサス配列のいずれとも一致しなかった。
【００６９】
表３：Ｆｙａペプチド
【００７０】
【表３−１】
【表３−２】
【００７１】
このデータは、ファージ−ペプチドが、その模倣したＤｕｆｆｙ抗原エピトープを同定したことを示す。Ｆｙａ多型と同一の配列を含むファージ−ペプチド（ペプチドＦｙａ１５およびＦｙａ２０）に結合した抗Ｆｙａ抗体および抗Ｆｙｂ抗体が、ペプチドミモトープを選択したことにより、血液型抗原模倣物を同定する有効な手段としてファージディスプレイの使用を確認した。
【００７２】
（実施例２）
（複合体ＲｈＤ抗原エピトープを模倣するファージ−ペプチドの同定）
ＲｈＤ抗原エプトープを模倣するファージ−ペプチドを、３つのモノクローナル抗Ｄｓ（Ｔ１０、Ｔ２２およびＴ２７）を用いて同定した。この限定した数のモノクローナル抗体を有する４つのファージ−ペプチドライブラリーのバイオパニングにより、８０個のＲｈＤペプチドミモトープを選択した（表４／ペプチドＲｈＤ１−８０を参照のこと）。さらに、ポリクローナル抗ＲｈＤ調製物を用いるバイオパニングにより、さらなる２５個のＲｈＤペプチドミモトープを同定した（表４／ペプチドＲｈＤ８１−１０５を参照のこと）。ペプチドＲｈＤ５２を、Ｔ１０およびポリクローナル抗ＲｈＤ調製物の両方を用いて選択した。
【００７３】
表４：ＲｈＤペプチド
【００７４】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【００７５】
（実施例３）
（ＲｈＥｅ抗原エピトープを模倣するファージ−ペプチドの同定）
３つの抗ＲｈＥモノクローナル抗体（１×ＩｇＧ、２×ＩｇＭ；表１を参照のこと）を用いてバイオパニングを行い、４つのファージ−ペプチドライブラリーの各々からの多くの配列の複数のコピーの同定を得た。配列相同性もまた、異なるライブラリーから選択したファージ−ペプチドの間で確認した。ペプチドＲｈＥ１８およびＲｈＥ２４を、抗体Ｅ０００２およびＥ０００３を用いて選択し、ペプチドＲｈＥ１９を、抗体Ｅ０００１およびＥ０００２を用いて選択した。これらの結果は、クラスに関わらず、同じエピトープに対して引き起こされる抗体が、同一のペプチド配列を有するいくつかのファージを同定することを示す。合計で３６の固有のＲｈＥペプチドミモトープを同定した（表５；ペプチドＲｈＥ１−３６を参照のこと）。２つの抗Ｒｈｅモノクローナル抗体（２×ＩｇＭ；表１を参照のこと）を用いるバイオパニングにより、１７の固有のＲｈｅペプチドミモトープを同定した（表５；ペプチドＲｈｅ１−１７を参照のこと）。
【００７６】
表５：ＲｈＥ／ｅ
【００７７】
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【００７８】
（実施例４）
（オリジナルのＤｕｆｆｙモノクローナル抗体に対する合成ペプチドの特異的結合）
バイオパニングによって選択されたファージ−ペプチドの関連性を免疫学的研究において試験した。最初に、２０の「Ｆｙｂ」ファージ（ペプチドＦｙｂ１−１３、Ｆｙｂ２０−２１、Ｆｙｂ２４−２８；配列の詳細について表２を参照のこと）を、ファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴ解析の両方による調査のために選択して、合成ペプチドがオリジナルのモノクローナル抗体に特異的に結合できることを確認した。
【００７９】
ファージＥＬＩＳＡの結果により、抗Ｆｙｂモノクローナル、ＬＭ４４７の結合を確認した。このモノクローナル抗体の１０μｇ／ｍｌストックを、ＥＬＩＳＡ含有バッファーにおいて調製し、１５０μｌのアリコートをＩｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、次いで、４℃で一晩インキュベートした。結合していない抗体を捨てて、ウェルを４℃で１時間、３５０μｌのブロッキングバッファーでブロックした。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１００μｌの選択したファージ培養液上清を、室温で１時間、適切なウェルに加えた。結合していないファージを除去し、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。抗Ｍ１３に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１：５０００希釈である、二次抗体を、ブロッキングバッファー中で調製して、１００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。反応を起こすために、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（Ｓｉｇｍａ）の２００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。４５０ｎｍでの吸光度値により、アッセイした２０のファージのうち１４（ペプチドＦｙｂ１、Ｆｙｂ２、Ｆｙｂ４−５、Ｆｙｂ７−１３、Ｆｙｂ２５、２７および２８）の結合を確認した（図１を参照のこと）。
【００８０】
２０のＦｙｂペプチドミモトープを、ＳＰＯＴにより複製して合成した。抗Ｆｙｂ抗体（ＬＭ４４７）を用いる結合実験により、抗体が、試験した２０のペプチド配列のうち２つ（ペプチドＦｙｂ１２およびＦｙｂ１３）に首尾よく結合したことが示された（図２）。結合は、ペプチドＣＰｅｐ７５を用いたスポット２１にも観察された（アッセイについての陽性コントロール）。ペプチドＦｙｂ１、Ｆｙｂ７、Ｆｙｂ９およびＦｙｂ１１は、ペプチドＦｙｂ１２およびＦｙｂ１３と等しい強さのファージＥＬＩＳＡ信号を生成するにもかかわらず、これらの４つのペプチドは、ＳＰＯＴとして合成した場合、抗Ｆｙｂ抗体（ＬＭ４４７）と反応しなかった。
【００８１】
１９の「Ｆｙａ」ファージ−ペプチドクローン（ペプチドＦｙａ１−１８およびＦｙａ２５；配列の詳細について表３を参照のこと）のファージＥＬＩＳＡ解析により、ＬＭ４８７抗体のＦｙａファージ−ペプチドに対する特異的結合を確認した。図３は、１９のうち３つのみ（ペプチドＦｙａ２、Ｆｙａ１４およびＦｙａ１８）が抗体に結合しなかったことを示す。これらの１９のペプチドは、ＳＰＯＴとして合成した３７（ペプチドＦｙａ１−３７）の中のものであり、膜と抗Ｆｙａ抗体とのハイブリダイゼーション後、強い陽性信号をペプチドＦｙａ１５（スポット１５）のみで観察した（図４）。
【００８２】
これらの結果は、ファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴの両方により並行して試験した場合のＦｙｂファージ−ペプチドについて得た観察を反映した。陽性ファージＥＬＩＳＡ信号は、対応するペプチドミモトープが合成されて、ＳＰＯＴハイブリダイゼーションにより試験された場合に陽性信号を自動的に保証しなかった。さらに、配列解析により、陽性または陰性ペプチドのいずれの間にも明らかな配列相同性は確認されなかった。
【００８３】
ＦｙａおよびＦｙｂファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴアッセイの両方から得られた結果により、ペプチドの存在状態が抗体結合において重要であることが示唆される。ファージコート中で融合タンパク質の一部を形成するペプチドは、ＳＰＯＴにより膜で合成された場合、異なる構造を取り得る。取り囲むタンパク質がなければ、抗体認識はその後に影響を与え得る。従って、ＳＰＯＴによって解析するためのファージ−ペプチドクローンを選択するために単純にＥＬＩＳＡを用いることよりむしろ、それらの選択において最初に使用されるモノクローナル抗体を用いるＳＰＯＴ解析の前に、潜在的な診断ペプチドを見落とさないことを確実にするために、バイオパニングによって選択された全てのファージ−ペプチド（Ｆｙｂ、Ｆｙａ、ＲｈＤおよびＲｈＥｅ）を、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けた。
【００８４】
（交差反応性ペプチドを同定するための相互ハイブリダイゼーション）
一連の４４個のペプチドを複製して合成した（図５）。スポット１−３７はＦｙａペプチドミモトープ（Ｆｙａ１−３７）であり、スポット３８−４０はそれぞれペプチドＦｙａ１７、Ｆｙａ２５およびＦｙａ３５の写しであり、スポット４１−４４はコントロールペプチドであった（スポット４１は、抗Ｆｙｂ抗体を生成するために使用した免疫ペプチド［Ｃｐｅｐ７５］であり；スポット４２は、無関係の１２量体［Ｃｐｅｐ７６］であり；スポット４３は、抗Ｆｙａ抗体を生成するために使用した免疫ペプチド［ＣＰｅｐ１１８］であり、スポット４４は、Ｆｙｂペプチドミモトープ［Ｆｙｂ１］であった）。抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体との並行した膜のハイブリダイゼーションにより、多くのペプチド（ペプチドスポット１５、２０および４３）のＦｙａ特異性を確認したが、抗Ｆｙｂ抗体に結合できるペプチド（スポット３６および４１）および両方の抗体との交差反応性を示すさらなるペプチド（スポット３）も同定した。スポット４３および４１で観測した信号は、これらの２つのペプチドがそれぞれ抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体についての陽性コントロールとして含まれるため、予想外ということではなかった。
【００８５】
（アミノ酸置換によるコンセンサス配列由来合成Ｆｙｂペプチドミモトープの生成）
１００の固有の「Ｆｙｂ」ペプチドミモトープ（Ｆｙｂ１−７１およびＦｙｂ８８−１１６）の配列解析により、２つのコンセンサス配列を同定した。コンセンサス１：Ｍ（Ｆ／Ｙ）ＱＰＤ（Ｎ／Ｐ）（Ｐ／Ｌ）（Ｔ／Ｐ）Ｔ（Ｋ／Ｌ）（Ｎ／Ｑ）（Ｐ／Ｖ／Ａ／Ｓ）は、同程度で生じる限定した数の残基を有する一連の位置（アミノ酸２、６、７、８、１０、１１および１２）を含む。一連の１６のペプチドミモトープ（ペプチドＦｙｂ７２−８７；表２を参照のこと）を、２、６、８および１２位でのアミノ酸置換を用いてＳＰＯＴにより合成した。試験時に、これらのコンセンサス配列由来のペプチドミモトープのうち２つ（ペプチドＦｙｂ８４；スポット１３およびペプチドＦｙｂ８５；スポット１４）は、抗Ｆｙｂ抗体ＬＭ４４７に結合できることを証明した（図６を参照のこと）。これら２つの合成したペプチドミモトープ配列の解析により、１２位で単一のアミノ酸の相違を確認した。しかしながら、これら２つの配列について観測された信号強度は、このアッセイについて使用した陽性コントロールである、ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット１７）を用いて達成されたものより著しく低かった。この結果により、ペプチドミモトープもまた、単純にバイオパニングによってではなく、アミノ酸置換実験によって人工的に生成され得ることが示された。
【００８６】
（実施例５）
（ＳＰＯＴにより決定された合成Ｒｈペプチドに対する抗体の特異的結合）
ＲｈＤ、ＲｈＥおよびＲｈｅペプチドミモトープ（表４および５を参照のこと）を、ＳＰＯＴにより合成して、膜のハイブリダイゼーションを適切な抗体を用いて行った（表１）。図７〜１０は、ペプチドミモトープの選択に最初に使用される抗体と特異的に反応するペプチドミモトープの例を示す。
【００８７】
図７は、抗ＲｈＤ抗体の選択されたペプチドミモトープのサブセットと、モノクローナル抗体Ｔ１０とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。４０のペプチド（ＲｈＤ４１−ＲｈＤ８０）を合成し、陽性信号を１１のスポット（スポット１−３、８、１７、２７、２８、３１、３７、３９および４０；ペプチド配列について表を参照のこと）において観察した。
【００８８】
さらなる２８のＲｈＤペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成した。ペプチドミモトープＲｈＤ８１−１０５（スポット１−２５）を、ポリクローナル抗ＲｈＤ調製物を用いて最初に選択し、ペプチドＲｈＤ６８、ＲｈＤ７１およびＲｈＤ７９（スポット２６−２８）を、抗ＲｈＤ抗体Ｔ１０を用いるバイオパニングによって同定した。ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット２９）およびＣＰｅｐ７６（スポット３０）を、陰性コントロールとしてアッセイに含んだ。図８により、ポリクローナル抗ＲｈＤによって認識された一連の１１のペプチド（スポット３、５、６、１２、１４、１６、２４、２６−２８および３０；ペプチド配列について表を参照のこと）を確認した。この一連のペプチドは、Ｔ１０を用いて最初に選択した３つのペプチド（スポット２６−２８）を含む。この結果により、個々のモノクローナル抗体（例えばＴ１０）を用いて同定されたペプチドは、ポリクローナル抗体が引き起こされる抗原のエピトープを模倣することが強く示唆された。
【００８９】
図９は、３６のＲｈＥペプチドミモトープと抗ＲｈＥモノクローナル抗体Ｅ０００２とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット３７）およびＣＰｅｐ７６（スポット３８）を、陰性コントロールとしてアッセイに含んだ。抗体の特異的結合を、４つのスポット（スポット１８：ペプチドミモトープＲｈＥ１８；スポット１９：ＲｈＥ１９；スポット２４：ＲｈＥ２４およびスポット２５：ＲｈＥ２５）を用いて達成した。
【００９０】
図１０は、１６のＲｈｅペプチドミモトープと抗Ｒｈｅモノクローナル抗体ｅ０００２とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット１７）およびＣＰｅｐ７６（スポット１８）を、陰性コントロールとしてアッセイに含んだ。強い陽性信号を２つのスポット（スポット１０および１３；ペプチド配列について表を参照のこと）で観察した。さらに３つの弱い、陽性スポットもまた記録した（スポット８、１１および１６）が、これらの信号は、陰性コントロールとしてアッセイに含んだコントロールペプチドＣＰｅｐ７６（スポット１８）で達成したものと同じ強さのみであった。
【００９１】
全体的に、Ｒｈペプチドミモトープで達成した結果は、ＦｙａおよびＦｙｂペプチドならびにＦｙａおよびＦｙｂモノクローナル抗体を用いて得られたものに匹敵した。ＳＰＯＴ解析により、Ｒｈペプチドの認識抗体と特異的に反応するＲｈペプチドを同定した。
【００９２】
（実施例６）
（ミクロスフェアビーズに結合された合成ペプチドミモトープに対する抗体の特異的結合）
ペプチドミモトープが、天然の血液型抗原に対して引き起こされた抗体に特異的に結合できるというさらなる確認を、ポリスチレンＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）上のペプチドミモトープの固定化後に行った。
【００９３】
ペプチドミモトープ（例えばＦｙｂ１６；ＲｈＤ１２）を、６個のヒスチジンアミノ酸からなるＣ末端標識で合成した。６×Ｈｉｓの標識化ペプチドミモトープのストック溶液（４μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ／０．１％のＢＳＡ中で調製した。ペプチドを、以下のようにビーズの表面に付着させたＮｉ−ＮＴＡ基を用いてビーズ上に固定化した。５０μｌ容量の４μｇ／ｍｌペプチドストック（Ｆｙｂ１６またはＲｈＤ１２）を、等量のＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（それぞれ、ビーズ５０またはビーズ５２）と混合した。４℃で一晩、混合しながらインキュベートした後、ビーズ／ペプチド混合物を９００μｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈した。ビーズ／ペプチド混合物を２分間ボルテックスし、次いで１０μｌ容量を９６ウェル、丸底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルにアリコートした。１０μｌ容量の試験モノクローナル抗体（ＬＭ４４７：抗ＦｙｂまたはＴ２７：抗ＲｈＤ）をＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、反応容量をＰＢＳ／１％ＢＳＡで６０μｌまで埋め合わせた。プレートを暗所において９０分間室温でインキュベートし、次いで１０μｌ容量（２００ｎｇ）のヒツジ抗マウスＩｇＧに結合したフィコエリトリン（ＬＭ４４７：抗Ｆｙｂモノクローナル抗体を含むウェルに加えた）またはヤギ抗ヒトＩｇＭに結合したフィコエリトリン（Ｔ２７：抗ＲｈＤモノクローナル抗体を含むウェルに加えた）をウェルに加えた。プレートを暗所においてさらに９０分間室温でインキュベートした。プレートを簡単にボルテックスし、次いでＬｕｍｉｎｅｘ１００アナライザー（Ｌｕｍｉｎｅｘ）にかけた。結合したモノクローナル抗体の確認を、フィコエリトリン蛍光色素信号の検出により測定した。信号強度は、固定化したペプチドミモトープに結合されたモノクローナル抗体の量と一致する。
【００９４】
結果を図１１および１２に記載し、ペプチドミモトープＦｙｂ１６に対する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合およびペプチドミモトープＲｈＤ１２に対する抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合を示す。
【００９５】
（実施例７）
（超常磁性ビーズに結合された合成ペプチドミモトープに対する抗体の特異的結合）
ペプチドミモトープが抗体に特異的に結合する能力を、改変されたゲル凝集アッセイにおいて、超常磁性ポリスチレンビーズ（ＴＡＬＯＮ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてさらに試験した。
【００９６】
５０μｌ容量の磁性ビーズを７００μｌのＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ）に加えた。室温で５分間混合後、磁性ビーズをＭａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離した。上清を捨てて、ビーズを７００μｌのＴＢＳ中で５分間洗浄した。ビーズを、ＭＰＣマグネットを用いてバッファーから再び分離し、次いで７００μｌのＴＢＳに再懸濁した。ペプチドミモトープ（例えばＦｙｂ１６；ＲｈＤ１２）を、６個のヒスチジンアミノ酸からなるＣ末端標識を用いて合成した。６×Ｈｉｓの標識化ペプチドミモトープのストック溶液（１００μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中で調製した。
【００９７】
５０μｌ容量の希釈したＴＡＬＯＮビーズを、５０μｌ容量の希釈したＨｉｓ標識化ペプチドミモトープ（例えばＲｈＤ１２）および１００μｌの試験ヒトモノクローナル抗体（例えばＴ２７：抗ＲｈＤ）と一緒に、ＮａＣｌゲルカード（ＩＤ Ｍｉｃｒｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｄｉａｍｅｄ）の反応チャンバに置いた。ゲルカードを、Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ−ＩＤ（ＤｉａＭｅｄ）において１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートの後、カードを、ＩＤ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ２４Ｓ（ＤｉａＭｅｄ）において１０分間遠心分離した。抗体陽性反応を、ゲルマトリクスの表面上のビーズの層により視覚化した。陰性反応において、凝集していないビーズをゲルマトリクスに通し、ペレットを形成させた。
【００９８】
マウスモノクローナル抗体（例えば、ＬＭ４４７：抗Ｆｙｂモノクローナル抗体）の結合を試験するために、１μｌ容量のヒツジ抗マウスＩｇＧを、ＮａＣｌゲルカードの反応チャンバに最初に加え、室温で１０分間、ゲルマトリクスで平衡化させ、その後、５０μｌ容量の希釈したＴＡＬＯＮビーズ、５０μｌ容量の希釈したＨｉｓ標識化ペプチドミモトープ（例えばＦｙｂ１６）および１００μｌの試験マウスモノクローナル抗体（例えばＬＭ４４７：抗Ｆｙｂ）を加えた。ゲルカードを、ＩＤ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＤｉａＭｅｄ）において１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、カードを、ＩＤ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＤｉａＭｅｄ）において１０分間遠心分離した。再び、反応を視覚的に計測した。
【００９９】
これらの実施例により、合成ペプチドミモトープが、固体支持体に結合した場合でさえ、天然血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合できることが示される。これらの実施例において、使用した固体支持体はポリスチレンＮｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズまたは超常磁性ポリスチレンビーズであるが、合成ペプチドミモトープが、任意の適切な支持体に固定される場合に、天然血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合できることも推測される。
【０１００】
この結果は図１３および１４に確認され、それにより、ペプチドミモトープＲｈＤ１２に対する抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合およびペプチドミモトープＦｙｂ１６に対する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合が示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液型抗原のミモトープ、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液型抗原は、赤血球表面の膜タンパク質に存在する。２９の血液型系（Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、ＧｌｏｂｏｓｉｄｅおよびＧＩＬ）のうち１つを除いて全てをコードする遺伝子は、クローニングされ、配列決定され、アミノ酸配列が推定され、膜構造が予測される。
【０００３】
Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、ＤｕｆｆｙおよびＫｉｄｄ血液系などのうち、Ｒｈｅｓｕｓ抗原は最も複雑であり、２つの高い相同遺伝子である、ＲＨＤおよびＲＨＣＥの生成物である。抗原は、抗体結合に利用できる６個の細胞外ループを有すると予測される。
【０００４】
Ｒｈｅｓｕｓ抗原のうち、最も一般に発現される、ＲｈＤポリペプチドは、その最も近い等価物であるＲｈＣｃＥｅポリペプチドと３６アミノ酸異なる。両方は、Ｒｈｅｓｕｓ関連糖タンパク質（ＲＡＧ）ポリペプチドと同時に発現される。
【０００５】
ＲＨＣＥ遺伝子産物は４つの対立形質に存在し、各々の対立遺伝子は、組み合わせて、すなわち、Ｃｅ、ｃｅ、ｃＥまたはＣＥの２つの抗原の発現を決定する。ＲｈＣ抗原は、ループ２における１つのアミノ酸がＲｈｃとは異なり（Ｓｅｒ１０３Ｐｒｏ）、そしてＥ／ｅに関して、単一の外表面アミノ酸の相違はループ４に予測される（Ｐｒｏ２２６Ａｌａ）。
【０００６】
Ｋｅｌｌタンパク質は、単一の膜を通り抜ける構造であり、Ｋ／ｋ対立遺伝子は、細胞外領域に単一のアミノ酸変化（Ｍｅｔ１９３Ｔｈｒ）を生じる一塩基変異多型（ＳＮＰ）の結果である。
【０００７】
Ｄｕｆｆｙタンパク質は、Ｎ末端が細胞外である３つの細胞外ループを有すると予測され、Ｆｙａ／Ｆｙｂ対立遺伝子は、Ｎ末端領域にアミノ酸置換（Ａｓｐ４２Ｇｌｙ）を引き起こすＳＮＰの結果である。
【０００８】
Ｋｉｄｄ糖タンパク質は、細胞内Ｎ末端およびＣ末端を有する１０個の膜貫通ドメインを有すると予測される。Ｊｋａ／Ｊｋｂ多型は、第４の細胞外ループにおいて単一のアミノ酸置換（Ａｓｐ２８０Ａｓｎ）を引き起こすＳＮＰによる。
【０００９】
抗体に結合する抗原上の免疫学的決定基は、Ｂ細胞エピトープと定義される。なぜなら、それらは、Ｂリンパ球の表面膜免疫グロブリン受容体によって認識されるからである。これらのエピトープは、直線状、すなわち、タンパク質配列由来のアミノ酸の連続的な伸長または立体構造であってもよく、隣接しないアミノ酸の空間的に並んだ位置に依存する。血液型抗原のＢ細胞エピトープ構造の研究は、ほとんどがＲｈＤ抗原に限定され、今まで、３０を越えるエピトープが血清学的に同定されている。
【００１０】
単一アミノ酸置換は、関与する予測されたループが直線状の配列においていくらか離れていても、１つより多いエピトープに影響を与え得、ＲｈＤ Ｂ細胞エピトープが立体構造であるという結論が出される。
【００１１】
Ｃ／ｃおよびＥ／ｅ上のＢ細胞エピトープは、少数であると推定されるが、立体構造であるように思われる。なぜなら、抗原性はＲＡＧポリペプチドの同時発現を必要とするからである。
【００１２】
Ｋ／ｋ多型は、Ｋ対立遺伝子の抗原性の原因となり得る糖タンパク質部位を破壊すると推定され、エピトープ決定基も立体構造であると予想される。
【００１３】
血液型抗原は、輸血された赤血球の破壊を引き起こし得る同種抗体の生成物を含み得る。従って、輸血された血液に対する反応は、輸血された赤血球の受容者が、それらの破壊を生じるこれらの赤血球に対する抗体を有する場合に生じ得る。熱、低血圧、吐き気および嘔吐、ならびに腰痛および胸の痛みを含む、即時反応が生じ得、反応の重篤度は関与する抗体のクラスおよび量に依存する。
【００１４】
血液型抗原に対する同種抗体はまた、妊婦の胎盤を通過し、新生児溶血性疾患（ＨＤＮＢ）を生じ得る。新生児溶血性疾患（ＨＤＮＢ）は、母が幼児の赤血球上の抗原に対して感受性のある場合に生じ得、これらの抗原に対するＩｇＧ抗体を作製する。これらの抗体は胎盤を通過し、胎児の赤血球と反応して、それらの破壊を生じ得る。ＲｈＤは最も一般的に関与する抗原である。
【００１５】
血液型抗原はまた、自己免疫性溶血性貧血などの自己免疫疾患に関与する自己抗体の生成物を含み得る。この自己免疫疾患に対する誘因はまだ知られておらず、従って、いかなる時にも生じる場合があり、自分の身体の赤血球細胞を攻撃する特異性のある広範なＲｈ群の身体産生自己抗体を生じる。
【００１６】
同種抗体産生に関連する最も重要な血液型は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、およびＫｉｄｄである。
【００１７】
輸血された赤血球を破壊し得るか、またはＨＤＮＢを引き起こすために胎盤を通過し得る同種抗体を検出するため、あるいは自己抗体を検出するための現在の方法は、供血者の赤血球試薬に頼っている。それらは、有効期間が短く、供血者間の抗原発現においてかなり変化する。ヒトの血液製剤の使用はまた、安全性の関与、例えば、ウイルス感染の潜在的な移入に関することを導く。ヒトの試薬を使用する場合に必要とされる厳密な試験およびスクリーニングは、試料間の不整合性とともに、同種抗体を検出するための試薬の利用可能性を遅らせ、そして、適した試薬を得る費用を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明は、従来技術に関する問題、特に同種抗体および自己抗体を検出するための既存の方法に関する問題を克服しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の態様によれば、血液型抗原のミモトープを提供する。
【００２０】
用語「ミモトープ」とは、天然ペプチドのエピトープを模倣できるペプチドをいう。通常、このようなペプチドは合成ペプチドである。これに関して、「合成ペプチド」は、生物系において天然に発現されるよりむしろ、合成される任意のペプチドを含む。合成は、ファージディスプレイ、Ｆ−ｍｏｃ化学あるいは生物系もしくは非生物系または環境における外来ペプチドを発現または合成するための任意の他の手段などの組み換え技術によってなされてもよい。
【００２１】
従って、本発明は、血液型抗原に対して引き起こされる抗体に結合できる新規のペプチドを提供する。これらのペプチドは、必ずしもヒトの血液などの天然源由来ではなく、従って、健康上のリスク、保存の問題およびそれらの関連する変動性をもたらさない。
【００２２】
簡便には、血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、ＧｌｏｂｏｓｉｄｅまたはＧＩＬから選択される。
【００２３】
ミモトープの推定アミノ酸構造は、それが模倣する抗原のアミノ酸構造に必ずしも対応していなくてもよい。実際に、本研究において、同定された多数の血液型ミモトープは、それらが模倣する天然抗原のアミノ酸配列とは広範に異なるアミノ酸配列を有することが発見された。
【００２４】
多くの血液型抗原のエピトープは構造が複雑であると考えられているため、イムノパニングによって本発明において同定された合成ペプチドが、特定の様式で天然抗原に対して引き起こされた抗体に結合できることは驚くべきことである。この発見は、合成血液型ミモトープが、それらの対応する抗原に対して引き起こされた抗体に特異的に結合することを可能にする三次構造を担い、維持することを示唆する。
【００２５】
簡便には、ミモトープは合成される。これにより、ヒトの血液試薬を用いることに関連する問題、例えば、汚染の潜在的リスク、および感染、保存に関する困難性、ドナーの識別、変動性およびスクリーニングが取り除かれる。費用に関連するこれらの問題も、合成ミモトープの使用により減少されるだろう。合成ミモトープの使用はまた、使用するために利用可能である試薬に対するより程度の高い制御を提供し、不足が決して起こらないことを確実にし、試薬についての不必要な待機を回避できる。
【００２６】
本研究を通して、多数の血液型抗原のミモトープが同定された。血液型ミモトープとして簡便に同定されたペプチドのいくつかは、表２〜５に同定され、ペプチド断片、免疫反応性類似体またはそれらの誘導体を含む。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、血液型抗原のミモトープを同定するための方法が提供され、その方法は、ランダムファージディスプレイライブラリーと、血液型抗原に対する抗体とを接触させること、およびファージディスプレイライブラリーにおけるペプチドに対する抗体の結合を検出することを含み、ここで、ペプチドに対する抗体の結合は、ペプチドが血液型抗原のミモトープであることを示す。
【００２８】
好ましくは、血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、ＧｌｏｂｏｓｉｄｅまたはＧＩＬである。これらは、同種抗体および自己抗体の産生に関連する血液型抗原である。
【００２９】
ミモトープが結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製物であってもよい。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該分野において周知である。
【００３０】
７量体、１２量体、および１５量体のペプチドを含むランダムファージディスプレイライブラリーが、天然血液型抗原に対して引き起こされる抗体に結合できるペプチドを同定するために使用された。抗体に結合されたペプチドの同定および配列決定により、潜在的な血液型抗原ミモトープの同定が可能になった。その後のＥＬＩＳＡによるこれらのペプチドの解析、続く、ＳＰＯＴによるこれらのペプチドの合成および膜に結合したＳＰＯＴの解析により、ペプチド抗体結合の強度および特異性を確認した。これにより、模倣される天然抗原とは構造的に異なる合成ペプチドが首尾よく、天然の血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合できることが確認され、それにより、問題となる血液型抗原の有効なミモトープが示される。例えば、ミクロスフェアビーズまたは超常磁性ビーズ上でのミモトープの固定化は、天然の血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合するミモトープの能力に影響を与えなかった。従って、記載される方法は、臨床環境、例えば、同種抗体または自己抗体の産生に関連する疾患の診断において使用され得る血液型抗原の合成ミモトープを同定するための効果的および有効な方法を示す。
【００３１】
ファージ−ペプチドに対する抗体の結合は、任意の適切な手段によって検出され得、そのような手段は当業者に公知である。使用され得る結合の型の例は、実施例に記載される。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、試料中の血液型抗原に対する抗体を検出するための方法が提供される。その方法は、前記血液型抗原のミモトープと、試験される試料とを反応させる工程、試料とミモトープとの間のいずれかの反応を検出する工程を含み、ここで、試料とミモトープとの間の反応は、血液型抗原に対する抗体の存在を示す。
【００３３】
簡便には、上記の特定された方法を実施する前に、ミモトープは、固体支持体に固定化される。ミクロスフェアビーズまたは超常磁性ビーズなどの固体支持体上のミモトープの固定化は、ミモトープが天然の血液型に対して引き起こされる抗体に特異的に結合する能力に影響を与えなかった。これに関して、その方法は、固体支持体上に血液型抗原のミモトープを固定すること、固定されたミモトープと、試験される試料とを接触させること、ミモトープに対する試料の結合を検出することを含み、ここで、ミモトープに対する試料の結合は、ミモトープによって模倣された血液型抗原に対する抗体の存在を示す。
【００３４】
簡便には、血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、またはＧＩＬである。
【００３５】
これに関して、多くの天然の血液型抗原のエピトープが、高次構造であると考えられるならば、本明細書に同定される合成ミモトープは、固体支持体に結合される場合でさえ、天然の血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合する三次構造を示すことができることは驚くべきことである。固体支持体は、目的のための任意の適切な支持体を含んでもよいが、簡便には、膜、スライドガラスまたはビーズ（ガラス、ポリスチレンなど）を含む。支持体への結合は、例えば、ポリスチレンミクロスフェアビーズの表面に結合されるＮｉ−ＮＴＡ基を用いること、または超常磁性ポリスチレンビーズを用いることなどの任意の適切な手段によってなされてもよい。ポリヒスチジンタグが、支持体への結合を促進するためにミモトープのＣ末端またはＮ末端に導入されてもよい。より小さいバックグランドを有し、首尾よく剥がれ、再びプローブできる膜、例えば、ＩＮＴＡＶＩＳ ＡＧ膜が好ましい。
【００３６】
従って、本発明は、血液型抗原に対して引き起こされる、生物学的試料における抗体を効果的に同定する方法を提供する。合成ミモトープの使用は、ヒト試薬の使用に関して確認されている問題を取り除く。これにより、抗体検出における一貫性が向上し、血液型抗原に対して引き起こされる抗体をスクリーニングするための既存の技術と比べて、ほとんど費用をかけないか、または余分な費用をかけずに、より稀少な抗体の検出を可能にする。ヒトの血液製剤の使用を回避することもまた、安全性を高め、ヒトの血液製剤を使用する場合に必要とされる厳密な試験を回避し、使用のために利用可能な試薬の一貫性を向上する。これにより、使用のために試薬を調達し、清浄する費用が減少する。従って、記載される方法は、既存の検出方法より信頼性があり、安全かつ都合が良く、生物学的試料における血液型抗原に対する抗体の検出を、より迅速に、より安く、かつより実施しやすくする。
【００３７】
検出される抗体は、血液型抗原に対する同種抗体または自己抗体であってもよい。従って、記載される方法は、同種抗体または自己抗体の産生に関与する血液製剤に対する疾患または反応を検出および診断する改良された方法を提供する。そのような疾患としては、赤血球輸血（ＨＴＲ）に対する溶血反応、新生児溶血性疾患および自己免疫性溶血性貧血が挙げられる。
【００３８】
簡便には、抗体は同種抗体であり、これはＨＴＲまたは新生児溶血性疾患の危険性の信頼性があり、かつ安全な診断を可能にする。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、試料中の血液型抗原に対する抗体の存在を検出するための装置が提供される。固体支持体（膜、スライドガラス、マイクロアレイチップ、またはビーズ（複数も含む）など）を含む装置は、その支持体に固定される血液型抗原のミモトープの配列を有するか、または各々の固体支持体上に１つのミモトープを有し、複数の固体支持体が提供される。
【００４０】
配列は、単一のＲｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、またはＧＩＬ抗原ミモトープを含んで構築されてもよい。あるいは、配列は、同じ診断配列で配置される複数の血液型由来のミモトープを有する、血液型ミモトープの任意の組み合わせを含んで開発されてもよい。配列の構成および設計は、装置の意図される目的に依存してもよく、必要とされる場合、オーダーメイドの配列が開発されてもよい。特定の目的のために必要とされる配列は、試薬の利用可能性を考慮する必要もなく、迅速に、信頼性があり、かつ費用効果的に構築され得る。
【００４１】
配列の構築に関して、固体膜支持体に結合するペプチドのための異なる種類および長さのスペーサーが使用されてもよい。例えば、アミノ−ＰＥＧスペーサーまたは限定された数のアミノ酸残基が、固体支持体に対してミモトープペプチド配列を結合するために使用されてもよい。
【００４２】
簡便には、抗体は同種抗体である。従って、装置は、ヒトの血液型試薬の使用を必要とせずに、血液型抗原に対して同種抗体を産生する疑いのある患者から得られる血液の試料中の同種抗体を検出するために使用され得る。血液型試薬の必要性の除去は、簡便には、血液型試料中の抗体の検出のための試薬の利用可能性を増加する。
【００４３】
本明細書に記載される抗原捕捉系はまた、抗体検出の感受性および正確性を増加でき、従って、血液型の検出についての既存の方法より改良された方法を提供する。
【００４４】
バイオパニングによって選択されるファージ−ペプチドは、最初に抗体を同定するために使用される抗体に特異的に結合することを示すことによって、本明細書に記載される実験により、診断試薬として選択されたファージ−ペプチドの潜在的価値が確認される。
【００４５】
本研究において同定されたミモトープは、適切な固相に結合する場合、血液型抗原に対する抗体を検出するためのスクリーニング試薬として使用され得る。
【００４６】
これに関して、ミモトープは、同種抗体または自己抗体の産生に関連する疾患などの血液型抗原に関連する疾患を診断するために使用され得る。
【００４７】
本明細書において同定され、記載されるミモトープのさらなる潜在的使用は、そのミモトープと一緒に形成される配列の使用とともに当業者にとって明らかであろう。
【００４８】
ここで、本発明は、添付の図面を参照して、例示のみとして記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】アッセイした２０個のＦｙｂファージ−ペプチドのうち１４個に対する抗Ｆｙｂ抗体（ＬＭ４４７）の結合を確認する、ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。２０個のＦｙｂペプチドミモトープを複製して合成した。結合実験により、膜支持体で合成した場合、Ｆｙｂペプチドミモトープが、抗Ｆｙｂ抗体を認識し、結合する能力を確認した。
【図３】アッセイした１９個のＦｙａファージ−ペプチドのうち１６個に対する抗Ｆｙａ抗体（ＬＭ４８７）の結合を確認する、ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の３７個のＦｙａペプチドミモトープを膜で合成し、抗Ｆｙａ抗体（ＬＭ４８７）に結合するそれらの能力を試験した。
【図５】抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体、ＬＭ４４７およびＬＭ４８７とのＦｙａペプチドミモトープの相互ハイブリダイゼーションの結果を示す。一連のＦｙａおよびペプチドミモトープを複製して合成し、２つのモノクローナルとの膜のハイブリダイゼーションにより、抗体特異的および交差反応性ペプチドミモトープを同定した。
【図６】アミノ酸置換実験の結果を示す。一連の１６個の合成ペプチドをＳＰＯＴにより複製して合成した。これらの配列は、ＦｙｂコンセンサスＩ配列に由来し、アミノ酸置換により生成した。合成ペプチドミモトープを、抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体に結合するそれらの能力について試験した。
【図７】抗ＲｈＤ抗体により選択されたペプチドミモトープのサブセットとモノクローナル抗体Ｔ１０とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。４０個のペプチド（ＲｈＤ４１−ＲｈＤ８０）を合成して、陽性信号を１１個のスポット（スポット１−３、８、１７、２７、２８、３１、３７、３９および４０；ペプチド配列についての表を参照のこと）で観測した。
【図８】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の２８個のＲｈＤペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成して、ポリクローナル抗ＲｈＤ抗血清調製物との膜のハイブリダイゼーションにより、抗体反応性ペプチドを同定した。
【図９】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の３６個のＲｈＥペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成した。モノクローナル抗体Ｅ０００２との膜のハイブリダイゼーションにより、抗体特異的ペプチドミモトープを同定した。
【図１０】ＳＰＯＴハイブリダイゼーション実験の結果を示す。一連の１６個のＲｈｅペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成した。モノクローナル抗体ｅ０００２との膜のハイブリダイゼーションにより、抗体特異的ペプチドミモトープを同定した。
【図１１】ポリスチレンＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズに固定されたペプチドミモトープＦｙｂ１６に結合する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合を示す。信号強度は、固定されたペプチドミモトープに対して結合されたモノクローナル抗体の量と一致する。
【図１２】ポリスチレンＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズに固定されたペプチドミモトープＲｈＤ１２に結合している抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合を示す。信号強度は、固定されたペプチドミモトープに結合されたモノクローナル抗体の量と一致する。
【図１３】改変されたゲル凝集アッセイにおいて超常磁性ポリスチレンビーズに固定されたペプチドミモトープＲｈＤ１２に対する抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合を示す。チャンバ１：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたペプチドミモトープＲｈＤ１２のみ；チャンバ２：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＲｈＤ１２＋抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）；チャンバ３：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＲｈＤ１２＋抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）。
【図１４】改変されたゲル凝集アッセイにおいて超常磁性ポリスチレンビーズに固定されたペプチドミモトープＦｙｂ１６に対する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合を示す。チャンバ１：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたペプチドミモトープＦｙｂ１６のみ；チャンバ２：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＦｙｂ１６＋抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）；チャンバ３：ビーズ＋Ｈｉｓ−標識されたＦｙｂ１６＋抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（方法論）
血液型抗原のミモトープの同定を、一連の血液型抗原特異的モノクローナル抗体（３×抗ＲｈＤ、３×ＲｈＥ、２×Ｒｈｅ、１×Ｆｙａ、１×Ｆｙｂ）およびＲｈＤポリクローナル調製物を有する４つのファージ−ペプチドライブラリーのバイオパニングを用いて開始した。合計で、４９０個のファージを選択して、ＤＮＡ塩基配列決定およびＥＬＩＳＡによって最初に特徴付けた。ＤＮＡ塩基配列解析により、２９５個の固有のファージ−ペプチド配列を同定し、それをＳＰＯＴ技術によって膜で合成した。ペプチド／抗体反応の特異性を、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴアッセイによって試験し、特定のＲｈＤ、ＲｈＥ、Ｒｈｅ、ＦｙａおよびＦｙｂ抗体を検出できる８４個のペプチドを同定した。
【００５１】
（バイオパニング）
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．から供給される３つの異なるファージライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．７およびＰｈ．Ｄ．１２は、それぞれ、直線状の７量体および１２量体のペプチドを示し、Ｐｈ．Ｄ．Ｃ７Ｃは、それらの末端でジスルフィド架橋を強いられる７量体のペプチドを示す）および直線状の１５量体のライブラリー（親切にもＰｒｏｆ．Ｇｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉによって提供された）を、１０個の異なるモノクローナル抗体およびポリクローナル調製物を用いてバイオパニング実験に使用した（表１）。
【００５２】
表１：バイオパニングにおいて使用した抗体
【００５３】
【表１】
【００５４】
記載した全てのモノクローナル抗体を、培養上清から精製した。ポリクローナル抗ＲｈＤ調製物を、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅから得た。
【００５５】
各標的抗体／ライブラリーの組み合わせに関して、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ４平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）の個別のウェルを、１５０μｌのＥＬＩＳＡコーティングバッファー（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の５μｇの抗体でコーティングした。プレートを密閉して、４℃で一晩インキュベートした。結合していない抗体を捨てて、３５０μｌのブロッキングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３／３％の脱脂粉乳）を各ウェルに加えた。プレートを密閉して、４℃で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去して、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。１００μｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中の約２×１０１１のプラーク形成単位（ｐｆｕ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。結合したファージを、１００μｌの０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ／ＢＳＡ、ｐＨ２．２（１ｍｇ／ｍｌ）で１０分間インキュベートすることによって溶出し、次いで１５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和した。ラウンド１の溶出液のアリコートを除去し、滴定した。溶出したファージの残りを、３７℃で４．５時間、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５３８細胞の感染によって増幅させた。培養液を、４℃で１０，０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離した。上清を回収し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のポリエチレングリコール８０００；２．５ＭのＮａＣｌ）を加え、次いで４℃で一晩インキュベートした。ＰＥＧ沈殿したファージを、４℃で１０，０００ｒｐｍにて１５分間、遠心分離した。上清を除去し、ファージペレットを２００μｌのＴＢＳに再懸濁した。パニングの２つのさらなるラウンドを開始し、約２×１０１１ｐｆｕのラウンド２またはラウンド３の増幅させた溶出液を注入ファージとして使用した。ラウンド３の溶出液を滴定したが、増幅しなかった。個々のプラークを増幅させ、ＤＮＡ配列解析の前にＰＣＲ増幅に供した。続いて、ペプチド抗体結合の特異性を、ファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴ技術の両方を用いて決定した。
【００５６】
（ファージ培養）
個々のファージクローンを、ラウンド３の滴定プレートからランダムに選択し、１ｍｌ容積の１：１００希釈の、Ｌ−Ｂｒｏｔｈで増殖するＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５３８の一晩培養液中で増幅させた。培養液を３７℃で４．５時間インキュベートし、次いで１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ファージ上清を、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ塩基配列決定およびファージＥＬＩＳＡによるさらなる解析のために回収した。
【００５７】
（ＰＣＲ増幅）
選択されたファージクローンの各々において示されるペプチド配列を決定するために、ペプチド配列をコードするＤＮＡ挿入物をＰＣＲによって得た。ＰＣＲ増幅を、１倍のバッファー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、４００μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１μｌのファージ培養液上清ならびに各々０．５μＭの適切なフォワードおよびリバースプライマーを含む２５μｌの最終溶液で実施した。プライマー１２ＭＥＲ１Ｆｏｒ：５−ＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣ−３および１２ＭＥＲ２Ｒｅｖ：５−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３を、Ｃ７Ｃ、直線状の７量体および１２量体のファージ／ペプチドの増幅について使用した。プライマーＦｕｓｅ５Ｆｏｒ１：５’−ＡＣＣＧＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＣ−３’およびＦｕｓｅ５Ｒｅｖ１：５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧ−３’を、１５量体のファージ／ペプチドの増幅について使用した。ＰＣＲを、以下の条件：１分間９５℃で変性；１分間５５℃でアニーリング；および３分間７２℃で伸長の下で熱サイクラー（Ｔｅｃｈｇｅｎｅ、モデルＦＴＧｅｎｅ２Ｄ；Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で実施した。３０サイクル後、伸長を７２℃でさらに９分間続けた。ＰＣＲ産物を、配列解析のためにＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。
【００５８】
（配列解析）
ファージペプチドのヌクレオチド配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて得た。プライマー１２ＭＥＲ２Ｒｅｖを、Ｃ７Ｃ、直線状の７量体および１２量体のＰＣＲ産物のランダムペプチド配列を決定するために使用した。プライマーＦｕｓｅ５Ｒｅｖ１を、１５量体のＰＣＲ産物のために使用した。アミノ酸配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いてヌクレオチド配列から推定した。
【００５９】
（ファージＥＬＩＳＡ）
回収したファージ−ペプチドが、それらの選択において使用された抗体と反応する能力を、捕捉ＥＬＩＳＡによって確認した。適切なモノクローナル抗体の１０μｇ／ｍｌのストックを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー中で調製して、１５０μｌのアリコートを、Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、次いで４℃で一晩インキュベートした。結合していない抗体を捨てて、ウェルを、４℃で１時間、３５０μｌのブロッキングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３／３％の脱脂粉乳）でブロックした。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１００μｌの選択されたファージ培養液上清を、室温で１時間、適切なウェルに加えた。結合していないファージを除去し、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。抗Ｍ１３に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１：５０００希釈である、二次抗体を、ブロッキングバッファー中で調製して、１００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。反応を起こすために、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（Ｓｉｇｍａ）の２００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーによって４５０ｎｍでの吸光度を測定した。０．１より大きいＯＤ４５０信号を陽性とみなした。
【００６０】
（ＳＰＯＴ合成）
ペプチドミモトープを、Ｆ−ｍｏｃ化学を用いてＳＰＯＴ法（Ｆｒａｎｋ；１９９２）により合成した。ペプチドをアミノ−ＰＥＧ誘導体化セルロース膜（Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ）に固定し、別個のスポットとして合成した。合成を、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓプロトコルに従って、それぞれのアミノ酸の手動でのピペット操作により、Ｃ末端からＮ末端までのペプチド鎖の段階的な伸長により行った。Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ膜を用いた場合、インキュベート時間を変更した。最後のアミノ酸の添加後、ペプチドの末端残基および側鎖を脱保護して、膜をメタノールで洗浄し、空気乾燥し、次いで使用前に−２０℃で保存した。
【００６１】
（ＳＰＯＴ膜のスクリーニング）
膜を５０ｍｌのファルコンチューブに入れ、ＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０／５％の脱脂粉乳中で穏やかに攪拌しながら４℃で一晩ブロックした。一次（１°）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の２μｇ／ｍｌの希釈を、ＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０／５％の脱脂粉乳中で調製し、その後、スパイラルローターで、室温で１時間、膜とともにインキュベートした。２０ｍｌのＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を用いて各々５分間の４回の洗浄後、膜を、室温で１時間、ＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０／５％の脱脂粉乳中で調製した１／５０００希釈の二次（２°）抗体とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識したラビット抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、マウス抗Ｆｙａ（ＬＭ４８７）および抗Ｆｙｂ（ＬＭ４４７）１°抗体の検出のために使用し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ヒト１°抗体の検出のために使用した。２０ｍｌのＴＢＳ／０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を用いて各々５分間の４回の洗浄後、膜をブロットして過剰な流体を取り除いた。結合した抗体を化学発光によって検出した。ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合して、２分間膜上で重ね合わせた。化学発光基質を除去し、膜をブロットして過剰な流体を取り除いた。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への曝露後、連続した短いインキュベート時間（５秒〜１０分）の間、陽性スポットを視覚化した。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（Ｄｕｆｆｙ抗原エピトープを模倣するファージ−ペプチドの同定）
抗Ｆｙａ（ＬＭ４８７）および抗Ｆｙｂ（ＬＭ４４７）特異的モノクローナル抗体を、Ｄｕｆｆｙ糖タンパク質（Ｃｏｌｌｉｇａｎら、１９９８）上のエピトープ由来の抗原性ペプチドを用いて開発した。これらの抗体を、天然Ｄｕｆｆｙ抗原を模倣したペプチドについてのファージラブラリーをパニング（ｐａｎ）するために使用した。各々のパニング実験の最後の３ラウンドからのクローンを、増幅およびＤＮＡ配列決定のためにランダムに選択した。ファージ−ペプチドによってコードされたアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列データから推定した。
【００６３】
４つのファージ−ペプチドライブラリーの各々のバイオパニングを、抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）を用いて行い、各々のライブラリーからの特定の配列の複数のコピーの同定を得た。合計で、１００の固有のＦｙｂペプチドミモトープを同定した（表２／ペプチドＦｙｂ１−７１およびＦｙｂ８８−１１６を参照のこと）。同定された配列のどれも、ＬＭ４４７抗体の開発に使用した１４量体の免疫ペプチド（ＰＤＧＤＹＤＡＮＬＥＡＡＡＰ；ＣＰｅｐ７５）に似ていなかった。しかしながら、これらの「Ｆｙｂ」ペプチドミモトープのアミノ酸配列の解析により、２つのコンセンサス配列：
コンセンサス１：Ｍ（Ｆ／Ｙ）ＱＰＤ（Ｎ／Ｐ）（Ｐ／Ｌ）（Ｔ／Ｐ）Ｔ（Ｋ／Ｌ）（Ｎ／Ｑ）（Ｐ／Ｖ／Ａ／Ｓ）
コンセンサス２：Ｄ（Ｈ／Ｍ／Ｖ）ＨＹＴ（Ｓ／Ｎ）ＮＴＤＰＬ（Ｈ／Ｎ／Ｒ）（Ａ／Ｐ／Ｖ）Ｐ
を同定した。
【００６４】
各々のコンセンサス配列内の特定の位置は、限定した数のアミノ酸を有した（括弧に示される）。これらは、選択されたＦｙｂペプチドミモトープの全集団内で同程度で生じた。
【００６５】
表２：Ｆｙｂペプチド
【００６６】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【００６７】
抗Ｆｙａモノクローナルである、ＬＭ４８７を用いるバイオパニングにより、合計で３７の固有のペプチド配列を同定した（表３／ＦｙａペプチドＦｙａ１−３７を参照のこと）。Ｆｙａ多型と同一の配列を含む、少数の「Ｆｙａ」ファージ−ペプチドは、オリジナルの１４量体の免疫ペプチド（ＰＤＧＤＹＧＡＮＬＥＡＡＡＰ；ＣＰｅｐ１１８）内に存在し、これによって、血液型抗原模倣物を同定するためのアプローチとしてファージディスプレイの使用が立証された。これらの「Ｆｙａ」ペプチドミモトープのアミノ酸配列の配列解析により、２つの推定コンセンサス配列：
コンセンサスＩ：ＹＮＹＱＳＹＰＮＰＦＰＶ
コンセンサスＩＩ：ＧＩ（Ａ／Ｓ）（Ｅ／Ｄ）（Ｄ／Ｇ）ＤＹＧＡＬＳＷ
も同定した。
【００６８】
しかしながら、「Ｆｙｂ」の結果と対照的に、これらの「Ｆｙａ」ペプチドミモトープ配列の多くは、上記の同定したコンセンサス配列のいずれとも一致しなかった。
【００６９】
表３：Ｆｙａペプチド
【００７０】
【表３−１】
【表３−２】
【００７１】
このデータは、ファージ−ペプチドが、その模倣したＤｕｆｆｙ抗原エピトープを同定したことを示す。Ｆｙａ多型と同一の配列を含むファージ−ペプチド（ペプチドＦｙａ１５およびＦｙａ２０）に結合した抗Ｆｙａ抗体および抗Ｆｙｂ抗体が、ペプチドミモトープを選択したことにより、血液型抗原模倣物を同定する有効な手段としてファージディスプレイの使用を確認した。
【００７２】
（実施例２）
（複合体ＲｈＤ抗原エピトープを模倣するファージ−ペプチドの同定）
ＲｈＤ抗原エプトープを模倣するファージ−ペプチドを、３つのモノクローナル抗Ｄｓ（Ｔ１０、Ｔ２２およびＴ２７）を用いて同定した。この限定した数のモノクローナル抗体を有する４つのファージ−ペプチドライブラリーのバイオパニングにより、８０個のＲｈＤペプチドミモトープを選択した（表４／ペプチドＲｈＤ１−８０を参照のこと）。さらに、ポリクローナル抗ＲｈＤ調製物を用いるバイオパニングにより、さらなる２５個のＲｈＤペプチドミモトープを同定した（表４／ペプチドＲｈＤ８１−１０５を参照のこと）。ペプチドＲｈＤ５２を、Ｔ１０およびポリクローナル抗ＲｈＤ調製物の両方を用いて選択した。
【００７３】
表４：ＲｈＤペプチド
【００７４】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【００７５】
（実施例３）
（ＲｈＥｅ抗原エピトープを模倣するファージ−ペプチドの同定）
３つの抗ＲｈＥモノクローナル抗体（１×ＩｇＧ、２×ＩｇＭ；表１を参照のこと）を用いてバイオパニングを行い、４つのファージ−ペプチドライブラリーの各々からの多くの配列の複数のコピーの同定を得た。配列相同性もまた、異なるライブラリーから選択したファージ−ペプチドの間で確認した。ペプチドＲｈＥ１８およびＲｈＥ２４を、抗体Ｅ０００２およびＥ０００３を用いて選択し、ペプチドＲｈＥ１９を、抗体Ｅ０００１およびＥ０００２を用いて選択した。これらの結果は、クラスに関わらず、同じエピトープに対して引き起こされる抗体が、同一のペプチド配列を有するいくつかのファージを同定することを示す。合計で３６の固有のＲｈＥペプチドミモトープを同定した（表５；ペプチドＲｈＥ１−３６を参照のこと）。２つの抗Ｒｈｅモノクローナル抗体（２×ＩｇＭ；表１を参照のこと）を用いるバイオパニングにより、１７の固有のＲｈｅペプチドミモトープを同定した（表５；ペプチドＲｈｅ１−１７を参照のこと）。
【００７６】
表５：ＲｈＥ／ｅ
【００７７】
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【００７８】
（実施例４）
（オリジナルのＤｕｆｆｙモノクローナル抗体に対する合成ペプチドの特異的結合）
バイオパニングによって選択されたファージ−ペプチドの関連性を免疫学的研究において試験した。最初に、２０の「Ｆｙｂ」ファージ（ペプチドＦｙｂ１−１３、Ｆｙｂ２０−２１、Ｆｙｂ２４−２８；配列の詳細について表２を参照のこと）を、ファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴ解析の両方による調査のために選択して、合成ペプチドがオリジナルのモノクローナル抗体に特異的に結合できることを確認した。
【００７９】
ファージＥＬＩＳＡの結果により、抗Ｆｙｂモノクローナル、ＬＭ４４７の結合を確認した。このモノクローナル抗体の１０μｇ／ｍｌストックを、ＥＬＩＳＡ含有バッファーにおいて調製し、１５０μｌのアリコートをＩｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、次いで、４℃で一晩インキュベートした。結合していない抗体を捨てて、ウェルを４℃で１時間、３５０μｌのブロッキングバッファーでブロックした。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１００μｌの選択したファージ培養液上清を、室温で１時間、適切なウェルに加えた。結合していないファージを除去し、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。抗Ｍ１３に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１：５０００希釈である、二次抗体を、ブロッキングバッファー中で調製して、１００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。反応を起こすために、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（Ｓｉｇｍａ）の２００μｌのアリコートを各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベートの後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。４５０ｎｍでの吸光度値により、アッセイした２０のファージのうち１４（ペプチドＦｙｂ１、Ｆｙｂ２、Ｆｙｂ４−５、Ｆｙｂ７−１３、Ｆｙｂ２５、２７および２８）の結合を確認した（図１を参照のこと）。
【００８０】
２０のＦｙｂペプチドミモトープを、ＳＰＯＴにより複製して合成した。抗Ｆｙｂ抗体（ＬＭ４４７）を用いる結合実験により、抗体が、試験した２０のペプチド配列のうち２つ（ペプチドＦｙｂ１２およびＦｙｂ１３）に首尾よく結合したことが示された（図２）。結合は、ペプチドＣＰｅｐ７５を用いたスポット２１にも観察された（アッセイについての陽性コントロール）。ペプチドＦｙｂ１、Ｆｙｂ７、Ｆｙｂ９およびＦｙｂ１１は、ペプチドＦｙｂ１２およびＦｙｂ１３と等しい強さのファージＥＬＩＳＡ信号を生成するにもかかわらず、これらの４つのペプチドは、ＳＰＯＴとして合成した場合、抗Ｆｙｂ抗体（ＬＭ４４７）と反応しなかった。
【００８１】
１９の「Ｆｙａ」ファージ−ペプチドクローン（ペプチドＦｙａ１−１８およびＦｙａ２５；配列の詳細について表３を参照のこと）のファージＥＬＩＳＡ解析により、ＬＭ４８７抗体のＦｙａファージ−ペプチドに対する特異的結合を確認した。図３は、１９のうち３つのみ（ペプチドＦｙａ２、Ｆｙａ１４およびＦｙａ１８）が抗体に結合しなかったことを示す。これらの１９のペプチドは、ＳＰＯＴとして合成した３７（ペプチドＦｙａ１−３７）の中のものであり、膜と抗Ｆｙａ抗体とのハイブリダイゼーション後、強い陽性信号をペプチドＦｙａ１５（スポット１５）のみで観察した（図４）。
【００８２】
これらの結果は、ファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴの両方により並行して試験した場合のＦｙｂファージ−ペプチドについて得た観察を反映した。陽性ファージＥＬＩＳＡ信号は、対応するペプチドミモトープが合成されて、ＳＰＯＴハイブリダイゼーションにより試験された場合に陽性信号を自動的に保証しなかった。さらに、配列解析により、陽性または陰性ペプチドのいずれの間にも明らかな配列相同性は確認されなかった。
【００８３】
ＦｙａおよびＦｙｂファージＥＬＩＳＡおよびＳＰＯＴアッセイの両方から得られた結果により、ペプチドの存在状態が抗体結合において重要であることが示唆される。ファージコート中で融合タンパク質の一部を形成するペプチドは、ＳＰＯＴにより膜で合成された場合、異なる構造を取り得る。取り囲むタンパク質がなければ、抗体認識はその後に影響を与え得る。従って、ＳＰＯＴによって解析するためのファージ−ペプチドクローンを選択するために単純にＥＬＩＳＡを用いることよりむしろ、それらの選択において最初に使用されるモノクローナル抗体を用いるＳＰＯＴ解析の前に、潜在的な診断ペプチドを見落とさないことを確実にするために、バイオパニングによって選択された全てのファージ−ペプチド（Ｆｙｂ、Ｆｙａ、ＲｈＤおよびＲｈＥｅ）を、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けた。
【００８４】
（交差反応性ペプチドを同定するための相互ハイブリダイゼーション）
一連の４４個のペプチドを複製して合成した（図５）。スポット１−３７はＦｙａペプチドミモトープ（Ｆｙａ１−３７）であり、スポット３８−４０はそれぞれペプチドＦｙａ１７、Ｆｙａ２５およびＦｙａ３５の写しであり、スポット４１−４４はコントロールペプチドであった（スポット４１は、抗Ｆｙｂ抗体を生成するために使用した免疫ペプチド［Ｃｐｅｐ７５］であり；スポット４２は、無関係の１２量体［Ｃｐｅｐ７６］であり；スポット４３は、抗Ｆｙａ抗体を生成するために使用した免疫ペプチド［ＣＰｅｐ１１８］であり、スポット４４は、Ｆｙｂペプチドミモトープ［Ｆｙｂ１］であった）。抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体との並行した膜のハイブリダイゼーションにより、多くのペプチド（ペプチドスポット１５、２０および４３）のＦｙａ特異性を確認したが、抗Ｆｙｂ抗体に結合できるペプチド（スポット３６および４１）および両方の抗体との交差反応性を示すさらなるペプチド（スポット３）も同定した。スポット４３および４１で観測した信号は、これらの２つのペプチドがそれぞれ抗Ｆｙａおよび抗Ｆｙｂモノクローナル抗体についての陽性コントロールとして含まれるため、予想外ということではなかった。
【００８５】
（アミノ酸置換によるコンセンサス配列由来合成Ｆｙｂペプチドミモトープの生成）
１００の固有の「Ｆｙｂ」ペプチドミモトープ（Ｆｙｂ１−７１およびＦｙｂ８８−１１６）の配列解析により、２つのコンセンサス配列を同定した。コンセンサス１：Ｍ（Ｆ／Ｙ）ＱＰＤ（Ｎ／Ｐ）（Ｐ／Ｌ）（Ｔ／Ｐ）Ｔ（Ｋ／Ｌ）（Ｎ／Ｑ）（Ｐ／Ｖ／Ａ／Ｓ）は、同程度で生じる限定した数の残基を有する一連の位置（アミノ酸２、６、７、８、１０、１１および１２）を含む。一連の１６のペプチドミモトープ（ペプチドＦｙｂ７２−８７；表２を参照のこと）を、２、６、８および１２位でのアミノ酸置換を用いてＳＰＯＴにより合成した。試験時に、これらのコンセンサス配列由来のペプチドミモトープのうち２つ（ペプチドＦｙｂ８４；スポット１３およびペプチドＦｙｂ８５；スポット１４）は、抗Ｆｙｂ抗体ＬＭ４４７に結合できることを証明した（図６を参照のこと）。これら２つの合成したペプチドミモトープ配列の解析により、１２位で単一のアミノ酸の相違を確認した。しかしながら、これら２つの配列について観測された信号強度は、このアッセイについて使用した陽性コントロールである、ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット１７）を用いて達成されたものより著しく低かった。この結果により、ペプチドミモトープもまた、単純にバイオパニングによってではなく、アミノ酸置換実験によって人工的に生成され得ることが示された。
【００８６】
（実施例５）
（ＳＰＯＴにより決定された合成Ｒｈペプチドに対する抗体の特異的結合）
ＲｈＤ、ＲｈＥおよびＲｈｅペプチドミモトープ（表４および５を参照のこと）を、ＳＰＯＴにより合成して、膜のハイブリダイゼーションを適切な抗体を用いて行った（表１）。図７〜１０は、ペプチドミモトープの選択に最初に使用される抗体と特異的に反応するペプチドミモトープの例を示す。
【００８７】
図７は、抗ＲｈＤ抗体の選択されたペプチドミモトープのサブセットと、モノクローナル抗体Ｔ１０とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。４０のペプチド（ＲｈＤ４１−ＲｈＤ８０）を合成し、陽性信号を１１のスポット（スポット１−３、８、１７、２７、２８、３１、３７、３９および４０；ペプチド配列について表を参照のこと）において観察した。
【００８８】
さらなる２８のＲｈＤペプチドミモトープをＳＰＯＴにより合成した。ペプチドミモトープＲｈＤ８１−１０５（スポット１−２５）を、ポリクローナル抗ＲｈＤ調製物を用いて最初に選択し、ペプチドＲｈＤ６８、ＲｈＤ７１およびＲｈＤ７９（スポット２６−２８）を、抗ＲｈＤ抗体Ｔ１０を用いるバイオパニングによって同定した。ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット２９）およびＣＰｅｐ７６（スポット３０）を、陰性コントロールとしてアッセイに含んだ。図８により、ポリクローナル抗ＲｈＤによって認識された一連の１１のペプチド（スポット３、５、６、１２、１４、１６、２４、２６−２８および３０；ペプチド配列について表を参照のこと）を確認した。この一連のペプチドは、Ｔ１０を用いて最初に選択した３つのペプチド（スポット２６−２８）を含む。この結果により、個々のモノクローナル抗体（例えばＴ１０）を用いて同定されたペプチドは、ポリクローナル抗体が引き起こされる抗原のエピトープを模倣することが強く示唆された。
【００８９】
図９は、３６のＲｈＥペプチドミモトープと抗ＲｈＥモノクローナル抗体Ｅ０００２とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット３７）およびＣＰｅｐ７６（スポット３８）を、陰性コントロールとしてアッセイに含んだ。抗体の特異的結合を、４つのスポット（スポット１８：ペプチドミモトープＲｈＥ１８；スポット１９：ＲｈＥ１９；スポット２４：ＲｈＥ２４およびスポット２５：ＲｈＥ２５）を用いて達成した。
【００９０】
図１０は、１６のＲｈｅペプチドミモトープと抗Ｒｈｅモノクローナル抗体ｅ０００２とのハイブリダイゼーション後の結果を示す。ペプチドＣＰｅｐ７５（スポット１７）およびＣＰｅｐ７６（スポット１８）を、陰性コントロールとしてアッセイに含んだ。強い陽性信号を２つのスポット（スポット１０および１３；ペプチド配列について表を参照のこと）で観察した。さらに３つの弱い、陽性スポットもまた記録した（スポット８、１１および１６）が、これらの信号は、陰性コントロールとしてアッセイに含んだコントロールペプチドＣＰｅｐ７６（スポット１８）で達成したものと同じ強さのみであった。
【００９１】
全体的に、Ｒｈペプチドミモトープで達成した結果は、ＦｙａおよびＦｙｂペプチドならびにＦｙａおよびＦｙｂモノクローナル抗体を用いて得られたものに匹敵した。ＳＰＯＴ解析により、Ｒｈペプチドの認識抗体と特異的に反応するＲｈペプチドを同定した。
【００９２】
（実施例６）
（ミクロスフェアビーズに結合された合成ペプチドミモトープに対する抗体の特異的結合）
ペプチドミモトープが、天然の血液型抗原に対して引き起こされた抗体に特異的に結合できるというさらなる確認を、ポリスチレンＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）上のペプチドミモトープの固定化後に行った。
【００９３】
ペプチドミモトープ（例えばＦｙｂ１６；ＲｈＤ１２）を、６個のヒスチジンアミノ酸からなるＣ末端標識で合成した。６×Ｈｉｓの標識化ペプチドミモトープのストック溶液（４μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ／０．１％のＢＳＡ中で調製した。ペプチドを、以下のようにビーズの表面に付着させたＮｉ−ＮＴＡ基を用いてビーズ上に固定化した。５０μｌ容量の４μｇ／ｍｌペプチドストック（Ｆｙｂ１６またはＲｈＤ１２）を、等量のＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（それぞれ、ビーズ５０またはビーズ５２）と混合した。４℃で一晩、混合しながらインキュベートした後、ビーズ／ペプチド混合物を９００μｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈した。ビーズ／ペプチド混合物を２分間ボルテックスし、次いで１０μｌ容量を９６ウェル、丸底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルにアリコートした。１０μｌ容量の試験モノクローナル抗体（ＬＭ４４７：抗ＦｙｂまたはＴ２７：抗ＲｈＤ）をＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、反応容量をＰＢＳ／１％ＢＳＡで６０μｌまで埋め合わせた。プレートを暗所において９０分間室温でインキュベートし、次いで１０μｌ容量（２００ｎｇ）のヒツジ抗マウスＩｇＧに結合したフィコエリトリン（ＬＭ４４７：抗Ｆｙｂモノクローナル抗体を含むウェルに加えた）またはヤギ抗ヒトＩｇＭに結合したフィコエリトリン（Ｔ２７：抗ＲｈＤモノクローナル抗体を含むウェルに加えた）をウェルに加えた。プレートを暗所においてさらに９０分間室温でインキュベートした。プレートを簡単にボルテックスし、次いでＬｕｍｉｎｅｘ１００アナライザー（Ｌｕｍｉｎｅｘ）にかけた。結合したモノクローナル抗体の確認を、フィコエリトリン蛍光色素信号の検出により測定した。信号強度は、固定化したペプチドミモトープに結合されたモノクローナル抗体の量と一致する。
【００９４】
結果を図１１および１２に記載し、ペプチドミモトープＦｙｂ１６に対する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合およびペプチドミモトープＲｈＤ１２に対する抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合を示す。
【００９５】
（実施例７）
（超常磁性ビーズに結合された合成ペプチドミモトープに対する抗体の特異的結合）
ペプチドミモトープが抗体に特異的に結合する能力を、改変されたゲル凝集アッセイにおいて、超常磁性ポリスチレンビーズ（ＴＡＬＯＮ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてさらに試験した。
【００９６】
５０μｌ容量の磁性ビーズを７００μｌのＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ）に加えた。室温で５分間混合後、磁性ビーズをＭａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離した。上清を捨てて、ビーズを７００μｌのＴＢＳ中で５分間洗浄した。ビーズを、ＭＰＣマグネットを用いてバッファーから再び分離し、次いで７００μｌのＴＢＳに再懸濁した。ペプチドミモトープ（例えばＦｙｂ１６；ＲｈＤ１２）を、６個のヒスチジンアミノ酸からなるＣ末端標識を用いて合成した。６×Ｈｉｓの標識化ペプチドミモトープのストック溶液（１００μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中で調製した。
【００９７】
５０μｌ容量の希釈したＴＡＬＯＮビーズを、５０μｌ容量の希釈したＨｉｓ標識化ペプチドミモトープ（例えばＲｈＤ１２）および１００μｌの試験ヒトモノクローナル抗体（例えばＴ２７：抗ＲｈＤ）と一緒に、ＮａＣｌゲルカード（ＩＤ Ｍｉｃｒｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｄｉａｍｅｄ）の反応チャンバに置いた。ゲルカードを、Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ−ＩＤ（ＤｉａＭｅｄ）において１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートの後、カードを、ＩＤ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ２４Ｓ（ＤｉａＭｅｄ）において１０分間遠心分離した。抗体陽性反応を、ゲルマトリクスの表面上のビーズの層により視覚化した。陰性反応において、凝集していないビーズをゲルマトリクスに通し、ペレットを形成させた。
【００９８】
マウスモノクローナル抗体（例えば、ＬＭ４４７：抗Ｆｙｂモノクローナル抗体）の結合を試験するために、１μｌ容量のヒツジ抗マウスＩｇＧを、ＮａＣｌゲルカードの反応チャンバに最初に加え、室温で１０分間、ゲルマトリクスで平衡化させ、その後、５０μｌ容量の希釈したＴＡＬＯＮビーズ、５０μｌ容量の希釈したＨｉｓ標識化ペプチドミモトープ（例えばＦｙｂ１６）および１００μｌの試験マウスモノクローナル抗体（例えばＬＭ４４７：抗Ｆｙｂ）を加えた。ゲルカードを、ＩＤ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＤｉａＭｅｄ）において１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、カードを、ＩＤ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＤｉａＭｅｄ）において１０分間遠心分離した。再び、反応を視覚的に計測した。
【００９９】
これらの実施例により、合成ペプチドミモトープが、固体支持体に結合した場合でさえ、天然血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合できることが示される。これらの実施例において、使用した固体支持体はポリスチレンＮｉ−ＮＴＡミクロスフェアビーズまたは超常磁性ポリスチレンビーズであるが、合成ペプチドミモトープが、任意の適切な支持体に固定される場合に、天然血液型抗原に対して引き起こされる抗体に特異的に結合できることも推測される。
【０１００】
この結果は図１３および１４に確認され、それにより、ペプチドミモトープＲｈＤ１２に対する抗ＲｈＤモノクローナル抗体（Ｔ２７）の特異的結合およびペプチドミモトープＦｙｂ１６に対する抗Ｆｙｂモノクローナル抗体（ＬＭ４４７）の特異的結合が示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３１１のうちの少なくとも１つあるいはそれらのペプチド断片、それらの免疫反応性類似体もしくは誘導体、またはそれらの交差反応性配列から選択されるミモトープ。
【請求項２】
試料中の血液型抗原に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）前記血液型抗原のミモトープと、試験される前記試料とを反応させる工程と、
ｂ）前記試料と前記ミモトープとの間のいずれかの反応を検出する工程と、
を含み、
ｃ）前記試料と前記ミモトープとの間の反応は、前記血液型抗原に対する抗体の存在を示す、方法。
【請求項３】
工程ａ）の前に前記ミモトープが、固体支持体に固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体は、膜、スライドガラスまたはビーズから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は同種抗体である、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
同種抗体または自己抗体の産生に関与する血液製剤に対する疾患または反応を診断する方法であって、前記方法は、血液型抗原のミモトープを使用して、前記疾患に関連する抗体を同定することを含む、方法。
【請求項７】
前記疾患は、ＨＴＲ、新生児溶血性疾患または自己免疫性溶血性貧血である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記診断する方法は、請求項２〜５のいずれかに記載の請求項６または７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、またはＧＩＬ抗原ミモトープから選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料中の血液型抗原に対する抗体の存在を検出するための装置であって、前記装置は、血液型抗原のミモトープの配列を含む、装置。
【請求項１１】
前記ミモトープは、固体支持体に固定される、請求項１０に記載の装置。
【請求項１】
配列番号１〜３１１のうちの少なくとも１つあるいはそれらのペプチド断片、それらの免疫反応性類似体もしくは誘導体、またはそれらの交差反応性配列から選択されるミモトープ。
【請求項２】
試料中の血液型抗原に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）前記血液型抗原のミモトープと、試験される前記試料とを反応させる工程と、
ｂ）前記試料と前記ミモトープとの間のいずれかの反応を検出する工程と、
を含み、
ｃ）前記試料と前記ミモトープとの間の反応は、前記血液型抗原に対する抗体の存在を示す、方法。
【請求項３】
工程ａ）の前に前記ミモトープが、固体支持体に固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体は、膜、スライドガラスまたはビーズから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は同種抗体である、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
同種抗体または自己抗体の産生に関与する血液製剤に対する疾患または反応を診断する方法であって、前記方法は、血液型抗原のミモトープを使用して、前記疾患に関連する抗体を同定することを含む、方法。
【請求項７】
前記疾患は、ＨＴＲ、新生児溶血性疾患または自己免疫性溶血性貧血である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記診断する方法は、請求項２〜５のいずれかに記載の請求項６または７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記血液型抗原は、Ｒｈｅｓｕｓ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、ＡＢＯ、ＭＮＳ、Ｐ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｉｅｇｏ、Ｙｔ、Ｘｇ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ−Ｒｏｄｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｂｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、ＪＭＨ、Ｉ、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、またはＧＩＬ抗原ミモトープから選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料中の血液型抗原に対する抗体の存在を検出するための装置であって、前記装置は、血液型抗原のミモトープの配列を含む、装置。
【請求項１１】
前記ミモトープは、固体支持体に固定される、請求項１０に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５２３９６３（Ｐ２０１０−５２３９６３Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０１５９３（Ｐ２０１０−５０１５９３）
【出願日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２００
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２０００６
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５０９２７３５５８）ザ コモン サービシズ エージェンシー フォー ザ スコティッシュ ヘルス サービス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２００
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２０００６
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５０９２７３５５８）ザ コモン サービシズ エージェンシー フォー ザ スコティッシュ ヘルス サービス (1)
【Ｆターム（参考）】
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