診断用ＲＮＡの直接検出方法
【課題】 ＲＮＡ単離または精製の追加的ステップなしで、診断用ＲＮＡ種に基づいた迅速な細菌同定プロセスの提供。
【解決手段】 ＲＮＡ単離またはサンプルの精製を必要としないＲＮＡ検出方法。
【解決手段】 ＲＮＡ単離またはサンプルの精製を必要としないＲＮＡ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断用微生物学の分野に関する。より具体的には、ＲＮＡ精製または単離の必要性なしに、サンプルからの診断用標的ＲＮＡの迅速で感度の良い検出を可能にする方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
様々な臨床、食品、環境、またはその他の実験的サンプル中の細菌の存在をアッセイして、汚染物または病原体を同定することが望ましいことが多い。典型的にリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または場合によってはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である細菌ＲＮＡをアッセイして、細菌種の存在または不在を評価してもよい。いくつかの重要な細菌種では、細菌種に属する特定のＲＮＡ分子を検出できることにより、その他の細菌種の存在下でさえその検出を可能にする特異的プローブが開発されている。プローブをＲＴ−ＰＣＲアッセイ法においてプライマーとして使用して、そのＤＮＡへの逆転写と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応を使用したそのコピーＤＮＡ増幅を通じて、特異的ＲＮＡ分子を検出してもよい。細菌検出プロセス全体は、概して細菌の生育および細菌ＲＮＡの抽出と、それに続くＲＴ−ＰＣＲ反応および生成物検出を伴う。細菌の生育およびＲＮＡ調製ステップには時間がかかる。全体的な細菌検出プロセスを短縮して簡素化する試みがなされている。
【０００３】
細菌検出プロセスは、（非特許文献１）によって、多数の非標的細菌の存在下で標的細菌種の検出を可能にする高度に特異的なプローブの使用を通じて改善された。ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、各菌種からの異なるｍＲＮＡに特異的なプローブを使用して、有機廃棄物サンプル中にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が検出された。検出は抽出ＲＮＡ種の存在について高度に感度が良く、信頼できると述べられた。この報告では、細菌検出の改善は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの高感度および特異性のために、細胞播種と単離コロニーのさらなる識別が必要ないことである。しかしＲＮＡ調製プロセスの単純化はなされていない。リゾチーム処理、キット提供緩衝液中でのボルテックス、遠心分離、上清のカラムへの適用、および溶出をはじめとする複数ステップを伴うキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ−Ｍｉｎｉ ｋｉｔ）を使用して、細菌ＲＮＡが抽出された。
【０００４】
（非特許文献２）でも高感度のＲＴ−ＰＣＲアッセイが使用されて、細菌性魚類病原体が検出された。この報告において細菌検出になされた改善は、単一チューブＲＴ−ＰＣＲ−酵素ハイブリダイゼーション・アッセイを伴う高速大量処理システムの開発であった。ＲＮＡ調製プロセスの単純化はなされていない。この報告でアッセイされた細菌ＲＮＡは、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭ−ＰＣＲ抽出キット、またはこれもガラス繊維フィルターへの結合を伴う別の手順を使用して抽出され精製された。
【０００５】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、環境サンプルから直接溶解によって回収されたｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを増幅する方法が、（非特許文献３）で使用された。この報告では「直接溶解」とは、ＲＮＡ精製に先だって環境サンプルから細菌を単離し生育させるのとは対照的に、環境サンプルからのＲＮＡの直接精製を指す。ここでも溶解、フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、遠心分離、クロロホルム抽出、沈殿、乾燥、および再懸濁ステップを伴うＲＮＡ調製方法の単純化はなされなかった。
【０００６】
上述の方法はＲＮＡ種の検出のために有用であるが、なおも分析に先だってＲＮＡ種を精製し単離するための多段階プロセスの必要性に悩まされる。このようなプロセスは、分析に経費と時間を上乗せする。ＲＮＡ単離または精製の追加的ステップなしで、診断用ＲＮＡ種に基づいた迅速な細菌同定プロセスに対する必要性がなおも残る。出願人らは、ＲＮＡ単離またはサンプルの精製を必要としないＲＮＡ検出方法を提供することで、既述の問題を解決した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ブルチャー（Ｂｕｒｔｓｃｈｅｒ）およびヴェルツ（Ｗｕｅｒｔｚ）、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３年、６９：４６１８〜４６２７頁
【非特許文献２】ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）およびカールソン（Ｃａｒｓｏｎ）、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、２００３年、５４：１２７〜１３４頁
【非特許文献３】Ｓ．セレンスカ−ポーベル（Ｓｅｌｅｎｓｋａ−Ｐｏｂｅｌｌ）「分子微生物生態学マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９９５年、２．７．５／１〜２．７．５／１４、アカーマンズ，アントン（Ａｋｋｅｒｍａｎｓ，Ａｎｔｏｏｎ）Ｄ．Ｌ．、ヴァン・エリアス，ヤン・ディルク（Ｖａｎ Ｅｌｓａｓ，Ｊａｎ Ｄｉｒｋ）、デ・ブリュイン，フランス（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ，Ｆｒａｎｓ）Ｊ．編、出版社Ｋｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈ．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細菌細胞サンプルから診断用標的ＲＮＡを直接検出する方法を提供する。細菌細胞サンプルとＲＴ−ＰＣＲ反応組成物とを直接接触させ、次にそれを増幅された診断用標的ＤＮＡ生成物の生成および検出のために、サーモサイクリングに曝す。別の態様では、細菌細胞サンプルとＲＴ反応組成物とを直接接触させ、インキュベートしてｃＤＮＡ生成物を生成し、次にＰＣＲ組成物との接触が続き、次にそれを増幅された診断用標的ＤＮＡ生成物の生成および検出のために、サーモサイクリングに曝す。異なる態様では、ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ組成物との接触に先だって、細菌細胞サンプルを溶菌剤で処理する。さらに異なる態様では、ＰＣＲ増幅とのカップリングなしに、ＲＴ反応生成物それ自体を検出する。別の態様では、ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ組成物との接触に先だって、少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質を細菌細胞サンプルに添加する。全ての態様において、本発明はいかなるＲＮＡ精製ステップもなしに実施される。
【０００９】
場合により、細菌細胞を含有するサンプルを熱、酵素、溶菌性緩衝液および／または物理的剪断などの作用因子で前処理して、ＲＮＡの利用可能性を増強する。さらに別の態様では、作用因子がウィルス性エンドリシンであってもよい。本方法を食品加工状況において使用して、食品加工で使用される、または食品がそれと接触する表面の細菌を検出してもよい。
【００１０】
本方法について述べる説明書と、診断用標的ＲＮＡからのｃＤＮＡ生成物が直接検出されるか、または増幅されるかどうかによって、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ組成物のいずれかとを含む、細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するためのキットもまた提供される。ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ組成物は、次の要素のいずれかを含んでもよい。診断用標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１つのプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、ＲＮアーゼ阻害物質。
【００１１】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および付随する配列説明から、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００１２】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
配列番号：１は、Ｌｉｓ−Ｆプライマーの配列である。
配列番号：２は、Ｌｉｓ−Ｒプライマーの配列である。
配列番号：３は、１６Ｓ−３７３Ｆプライマーの配列である。
配列番号：４は、１６Ｓ−４３６−Ｒプライマーの配列である。
配列番号：５は、１６Ｓ−３９４Ｔタグの配列である。
配列番号：６は、１６Ｓ−２４５５Ｆプライマーの配列である。
配列番号：７は、１６Ｓ−２５２３Ｒプライマーの配列である。
配列番号：８は、１６Ｓ−２４７９Ｔプライマーの配列である。
配列番号：９は、１６Ｓ−１１０８Ｆプライマーの配列である。
配列番号：１０は、１６Ｓ−１１６９Ｒプライマーの配列である。
配列番号：１１は、１６Ｓ−１１２５Ｔプライマーの配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】細菌細胞サンプルからのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物のゲル電気泳動法分析を示す。
【図１Ｂ】細菌細胞サンプルからのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物のゲル電気泳動法分析を示す。
【図２】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＲＴ−ＰＣＲ反応セットのＣＴ値の比較を示す。
【図３】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＰＣＲ反応セットのＣＴ値の比較を示す。
【図４】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＲＴ−ＰＣＲ反応セットの導関数ピーク値の比較を示す。
【図５】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＰＣＲ反応セットの導関数ピーク値の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＲＮＡ精製プロセスを省略して、細菌サンプル中の診断用標的ＲＮＡを直接検出することで、サンプル中に存在する細菌タイプを同定してもよい方法について述べる。方法は、細胞の混合群を含有するサンプルからの診断用ＲＮＡ種の迅速な検出が必要な多様な用途において有用である。このような技術の特定の商業用途としては、医学および獣医学診断用分野ならびに食品媒介細菌病原体検出の分野が挙げられる。
【００１５】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、次の略語および定義を使用する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
定義
ここでの用法では、「細菌細胞」という用語は、分析または検出に適したＲＮＡを有するあらゆる原核生物細胞を意味する。本発明の細菌細胞は、生きていても、死んでいても、または破損していても、すなわち細胞壁または細胞膜に中断があってもよい。細菌は、そのあらゆる生活環形態、例えば栄養、静止、または胞子形態にあることができる。
【００１８】
ここでの用法では、「コロニー形成単位」または「ｃｆｕ」という用語は、寒天プレート上にコロニーを生じるサンプル中の細胞数を指す。ｃｆｕはまた、同様のアッセイ・サンプルとの比較で、サンプル中に期待されるコロニーを生じる細胞数を指してもよい。これは単にｃｆｕまたは細胞と称されるｃｆｕ相当数である。同様に細胞またはｃｆｕは、処理または溶解に先だってサンプル中に存在するｃｆｕ相当数も指す。
【００１９】
ここでの用法では「ＲＮＡ」という用語は、ＤＮＡ中に見られるデオキシリボース糖とは対照的にリボース糖を含んでなる核酸分子を指す。ここでの用法ではＲＮＡとは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ならびに調節機能を有する小型ＲＮＡ種をはじめとする、全種のＲＮＡ指す。「小型ＲＮＡ種」は特定の意味を有し、細菌においてハウスキーピングまたは調節役割がある非翻訳ＲＮＡを指す。「小型ＲＮＡ種」はｒＲＮＡでもｔＲＮＡでもない。
【００２０】
ここでの用法では、「ＲＮアーゼ阻害物質」という用語は、ほとんどの細菌細胞によって生成される内在性ＲＮアーゼなどのＲＮアーゼの作用を妨げる能力を有する化学物質またはその他の作用因子を指す。ＲＮアーゼは、ＲＮＡ中のヌクレオチドの開裂を触媒する酵素であるリボヌクレアーゼである。
【００２１】
ここでの用法では、「診断用標的ＲＮＡ」という用語は、特定の細菌の診断となるＲＮＡ分子または断片を指す。
【００２２】
ここでの用法では、「診断用標的ＤＮＡ生成物」という用語は、診断用標的ＲＮＡから転写された、または診断用標的ＲＮＡの転写ＤＮＡコピーをテンプレートとして使用して合成される、ＤＮＡ分子または断片を指す。
【００２３】
ここでの用法では、「逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応」または「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ＲＮＡ配列のコピーである配列によって、ＤＮＡ分子を合成し増幅する技術を指す。ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現の定量分析におけるようにＲＮＡ種を検出するのに有用であり、ならびにクローニング、ｃＤＮＡライブラリー構築、プローブ合成、および原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションにおけるシグナル増幅で使用するためのＲＮＡのＤＮＡコピーを製造するのに有用である。技術は、逆転写（ＲＴ）によるＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特定のｃＤＮＡ増幅の２つの部分からなる。逆転写酵素は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のテンプレートＲＮＡまたはＲＮＡ分子を使用してヌクレオチドの重合を触媒する、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２４】
ここでの用法では、「プライマー」という用語は、相補鎖合成がポリメラーゼによって触媒される条件下に置かれると、テンプレート鎖に沿った核酸合成または複製開始点として作用できる合成または自然発生オリゴヌクレオチドを指す。逆転写の文脈で、プライマーは核酸から構成され、ＲＮＡテンプレートを刺激する。ＰＣＲの文脈で、プライマーは核酸から構成され、ＤＮＡテンプレートを刺激する。
【００２５】
ここでの用法では、「ＲＴ−ＰＣＲ反応組成物」という用語は、診断用標的ＲＮＡ配列に対する特異性を有するプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに要する全ての要素を有する組成物を意味する。場合によりこれらの組成物は、ここで定義されるようなＲＮアーゼ阻害物質を含んでもよい。
【００２６】
ここでの用法では、「ＲＴ反応組成物」という用語は、逆転写酵素、標的ＲＮＡに相補的な核酸プライマー、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡ生成物を合成するのに要する全ての要素を有する組成物を意味し、検出染料またはプローブを含有してもよい。場合によりこれらの組成物は、ここで定義されるようなＲＮアーゼ阻害物質を含んでもよい。
【００２７】
ここでの用法では、「ＰＣＲ反応組成物」という用語は、核酸プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＤＮＡテンプレートを増幅するのに要する全ての要素を有する組成物を意味し、検出染料またはプローブを含有してもよい。場合によりこれらの組成物は、ここで定義されるようなＲＮアーゼ阻害物質を含んでもよい。
【００２８】
ここでの用法では、「増幅生成物」という用語は、プライマー誘導増幅反応中に生成される核酸断片を指す。プライマー誘導増幅の典型的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）またはストランド置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。
【００２９】
ここでの用法では、「ＲＮＡ精製」という用語は、その他の細胞構成要素からＲＮＡを単離するようにデザインされたプロセスを指し、これはまたＲＮＡ抽出とも称される。フェノール−クロロホルム抽出、カラムまたはフィルターへの結合、および沈殿などのステップを含んでもよい、いくつかの異なるＲＮＡ精製プロセスがある。
【００３０】
ここでの用法では、「溶解」という用語は、細胞ＲＮＡまたはＤＮＡへのアクセスまたはその放出を容易にする細胞壁の撹乱または変質を意味する。細胞壁の完全な中断または破損のいずれも溶解の概念の本質的要件でない。
【００３１】
ここでの用法では、「溶菌剤」という用語は、細菌細胞溶解に適した、あらゆる作用因子または条件、または作用因子または条件の組合わせを意味する。溶菌剤としては、酵素（リゾチーム、またはバクテリオファージ溶解酵素など）または化学薬品（クロロホルムなど）、中性洗剤、溶菌性緩衝液、熱が挙げられ、超音波処理、ビーズミル、フレンチプレスの使用などの物理的剪断手段を伴ってもよい。溶菌剤は、当該技術分野でよく知られている。
【００３２】
ここでの用法では、「サーモサイクリング」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲアッセイ中に使用される温度変化パターン全体を指す。このプロセスは一般的であり、当該技術分野でよく知られている。例えば前出のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、およびマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書およびマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，１９５号明細書を参照されたい。一般にＰＣＲサーモサイクリングは、高温での初期変性ステップ、続いてテンプレート変性と、プライマーアニーリングと、ポリメラーゼによるアニールされたプライマーの延長とを可能にするようにデザインされた温度サイクルの反復シリーズを含む。概してサンプルを最初に２〜５分加熱して、二本鎖ＤＮＡを変性させる。次に各サイクルのはじめに使用するサンプルおよび装置タイプ次第で、サンプルを２０〜６０秒変性させる。変性後、プライマーを約４０℃〜約２℃の低温で約２０〜６０秒、標的ＤＮＡにアニールさせる。ポリメラーゼによるプライマーの延長は、約６５℃〜約７２℃の範囲の温度で実施されることが多い。延長にかかる時間は、単位複製配列サイズと増幅に使用する酵素タイプに左右される。現行の大体の目安は、増幅する１ｋｂのＤＮＡあたり１分である。さらにアニーリングと延長ステップを組合わせて、二段階サイクリングをもたらすことができる。ＲＴ−ＰＣＲサーモサイクリング反応は、逆転写反応のために、約３０℃〜７０℃の範囲で約１０〜１５分の初期インキュベーションを含む。サーモサイクリングは、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲアッセイで使用される追加的温度シフトを含んでもよい。
【００３３】
ここでの用法では、「ＣＴ」、「サイクル閾値」、「Ｃｔ」、または「閾値サイクル」という用語は、その中で生成物形成に起因する蛍光の増大が背景シグナルを越える顕著なレベルに達する、サーモサイクリング中のサイクルを指す。
【００３４】
ここでの用法では、「Ｄｅｒ」または「導関数」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ生成物の解離における温度に対する蛍光の変化率の導関数を指し、それはまた導関数ピーク値とも称される。
【００３５】
ここでの用法では、「直接検出」という用語は、標的細菌からのＲＮＡの事前精製がない、診断用標的ＲＮＡ存在のアッセイを指す。
【００３６】
ここでの用法では、「食品加工状況」という用語は、そこで食品単独またはその他の材料との組合わせが操作されて、摂取可能な生成物または副産物のいずれかをもたらす形態にされる、現場内、中、上またはそのそばのあらゆる表面、ならびに現場それ自体を指す。このような状況としては、工業および施設食品加工工場が挙げられるが、これに限定されるものではない。摂取可能とは体内に取り込めることを意味し、摂食プロセスに限定されない。
【００３７】
ここでの用法では、「医学的状況」という用語は、病院、回復療養所、診断試験室、造影センター、および病棟をはじめとするがこれに限定されるものではない、そこで医療従事者が業務遂行する、現場内、中、上またはそのそばのあらゆる表面、ならびに現場それ自体を指す。
【００３８】
ここでの用法では、食品加工状況から採取されたサンプルおよび医学的状況から採取されたサンプルは、上述のようにこれらの状況から細菌を得るあらゆる方法を使用して、ランダムまたは非ランダムサンプリングのあらゆる方法によって得られた細菌内容物のあらゆる部分を指す。
【００３９】
細菌細胞供給源
本発明は、多様なサンプルに適用してもよい、細菌細胞検出のための改善された方法およびキットを提供する。細菌細胞は、生物学的、実験的、医療、農業、工業、環境、食品、または食品前駆物質起源のタイプのサンプル中に検出されてもよい。この一覧は例示的であり網羅的ではない。特に本発明は、疾患の原因物質であるまたはそれであることもある汚染物質または病原体の検出に応用してもよい。食品供給における細菌病原体の拡散および汚染の特別の懸念であることから、食品の加工、取り扱い、および調製領域サンプルが好ましい。
【００４０】
サンプルから検出アッセイのために細菌細胞を得ることは、液体サンプルの収集、固体または半固体サンプルの抽出、表面の拭き取り、またはさらに別の技術を手段としてもよい。既存の濃度がＲＴ−ＰＣＲ反応のための標的ＲＮＡを適切に提供するならば、細菌細胞を直接アッセイしてもよい。代案としては、遠心分離、免疫吸着またはその他の相互作用を通じた表面への結合、または濾過などの方法によって、細菌細胞を濃縮してもよい。さらに濃縮または直接アッセイに先だって、培養プレート上または液体培地中で細胞を生育させ、細菌細胞数を増大させてもよい。
【００４１】
本発明の文脈で適切な典型的な細菌は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、カンプロバクター（Ｃａｍｐｌｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）をはじめとするが、これに限定されるものではないグラム陰性およびグラム陽性細菌である。
【００４２】
本方法および本キットは、食品源、食品加工状況または環境または医学的状況における細菌を検出するのに特に有用である。本方法実施のために最も関心がある食品源としては、調理済みか否かに関わらず肉、魚、家禽などの生鮮食品、乳製品、果物およびこれらの混合物が挙げられる。さらに本方法は、食品が調製される、調製された、調製されるであろう表面の細菌を検出するのに有用である。さらに本方法は、特に医療機関内で疾患の原因を同定し最小化するため、病院、医療センター、回復および養護施設などにおいて、様々な表面の細菌を検出するために有用である。したがって本方法を通じて細菌を検出する
ためのサンプル源としては、食品が調製される、調製された、調製されるであろう表面に接触した物質、および上に列挙した供給源を得るための拭き取りまたはその他の方法などによって医学的状況で表面に接触した物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
標的ＲＮＡ
診断用標的ＲＮＡとしてアッセイされてもよいＲＮＡタイプとしては、細菌細胞のｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、転移−ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはその他のＲＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ｒＲＮＡ種としては、一群の関連細菌に特徴的な１つもしくはそれ以上の部分配列を含有してもよい５Ｓ、１６Ｓ、および２３Ｓポリヌクレオチドが挙げられる。特徴的な部分配列の存在はサンプル中の関心のある細菌タイプを同定し、すなわち検出する。特徴的配列の検出能は変化し、アッセイで検出される細菌の関連性のレベルに左右される。例えばサンプル中のあらゆるリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種の検出は、その部分配列がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のみを検出するのに必要な程度の微細な検出能を有さない、特徴的な部分配列に依存することもある。したがって特徴的な部分配列は、サンプル中の細菌全含有物に対してどの細菌が検出されるかで変化する同定能を有してもよい。このため本方法は広い適応性を有し、診断用標的ＲＮＡのための特定の同定能、または標的として使用されるあらゆるタイプのＲＮＡに限定されない。
【００４４】
所望の関連性のレベルで細菌を適切に区別するユニークな部分配列を含有するならば、その他のＲＮＡポリヌクレオチドを診断用標的ＲＮＡとして使用してもよい。例は、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ種から、ならびに１つもしくはそれ以上の特徴的な部分配列を含む細菌細胞中で生成されるあらゆるＲＮＡから同定できる。
【００４５】
プライマーは、当業者によってデザインされ、逆転写反応中のテンプレートとして標的ＲＮＡを使用したコピーＤＮＡの合成を刺激してもよい。当業者はまた、ＰＣＲ中のテンプレートとしてコピーＤＮＡを使用した標的ＲＮＡのユニークな部分配列の増幅のために、プライマー対をいかにデザインするかを理解する。ＰＣＲで同時に使用されるプライマーは、同様のハイブリダイゼーション融解温度を有すべきであることが、当該技術分野でよく知られている。
【００４６】
細菌細胞内の診断用標的ＲＮＡには、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応組成物がアクセスできるようにしなくてはならない。本発明の一態様では、標的ＲＮＡは、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応条件それ自体を通じてアクセスできるようになる。収集された後、細菌細胞サンプルを反応組成物に直接添加してもよく、次にそれにサーモサイクリングを施す。
【００４７】
代案としては、ＲＮＡ精製なしに、細胞を変性する多様な作用因子または手段でそれらを前処理してもよい。細胞を例えば熱、様々な化学薬品、酵素、中性洗剤および穏やかな物理的剪断への曝露によって前処理してもよい。この前処理は細胞溶解をもたらすことができる。
【００４８】
一態様では、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応組成物への接触に先だって、細菌細胞に溶菌剤を添加してもよい。細菌細胞のための溶菌剤の使用は、当業者によく知られている。溶菌剤としては、化学薬品、酵素、物理的剪断、浸透圧剤、および高温が挙げられるが、これに限定されるものではない。「溶菌性緩衝液」という用語は、少なくとも１つの溶菌剤を含有する緩衝液を意味する。
【００４９】
典型的な酵素的溶菌剤としては、リゾチーム、グルコラーゼ、ザイモロース、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、およびウィルス性エンドリシンとエクソリシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。ウィルス性エンドリシンおよびエクソリシンは、バクテリオファージまたはプロファージ細菌およびこれらの組合わせからのものである。
【００５０】
典型的なウィルス性エンドリシンとしては、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）バクテリオファージ（Ａ１１８およびＰＬＹ１１８）からのエンドリシン、バクテリオファージＰＭ２からのエンドリシン、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳＸからのエンドリシン、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＬｊ９２８、Ｌｊ９６５、およびバクテリオファージピアダ（Ｐｈｉａｄｈ）からのエンドリシン、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリオファージＣｐ−１からのエンドリシン（Ｃｐｌ−１）、およびストレプトコッカス・アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）バクテリオファージＢ３０の二官能性ペプチドグリカンリシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの最後の２つは、異なる細菌種特異性を有する。二成分、すなわちホリン−エンドリシン、スタフィロコッカス・ワーネリー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）ＭファージｖａｒｐｈｉＷＭＹの細胞溶解遺伝子ｈｏｌＷＭＹおよびｌｙｓＷＭＹについてもまた考察される。これらのエンドリシンの組合わせについてもまた考察される。ウィルス性溶解の考察については、特に、参照によって本願明細書に引用したレースナー（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ），ＭＪら、（１９９５年）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｌ ６１：１１５０〜１１５２頁を参照されたい。
【００５１】
物理的剪断を達成する典型的な溶菌剤としては、ジルコニア−シリカビーズ、超音波処理またはフレンチプレスが挙げられる。クロロホルムなどの化学薬品存在下におけるボルテックスなどの物理的剪断の組合わせが、細菌細胞を溶解するさらに別の溶解手段である。さらに上述のように、細胞の溶解において高温もまた効果的である。熱処理に加えた溶菌性緩衝液もまた溶解を改善することもある。
【００５２】
上の作用因子の多くは、サンプル中のどの細胞が溶解されるかに関して非選択的な傾向がある。その結果処理中に、試験サンプル中の混入生物体および天然細菌叢、ならびに検出標的細胞が溶解されることもある。この非特異性は媒質中に放出される細胞ＲＮアーゼの量を増大させ、検出する標的ＲＮＡの安定性および品質を大きく低下させることができる。
【００５３】
対照的に、標的細胞のみを特異的に溶解するウィルス性溶解活性を提供するウィルス性溶菌剤および人工材料は、特定の溶解を遂行する。これはこれらの溶菌剤を使用することで、サンプル中のＲＮアーゼ活性が最小化され、検出するＲＮＡ標的の残存および検出可能性が増強されることを意味する。重要なことには、特定の溶解が所望される応用において、エンドリシン活性を提供するウィルス性エンドリシンおよび人工材料は特に有用である。例えばサンプル内の特定の細菌細胞を溶解することが所望される場合、特定のウィルス性エンドリシンを使用してもよい。特定の細菌細胞を溶解するためのウィルス性エンドリシンの使用は、当該技術分野でよく知られている。細菌細胞の溶解におけるウィルス性エンドリシンの使用は、λエンドリシンを発現する遺伝子の誘導によって容易に溶解され、カリフォルニア州オレンジのザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの市販品である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＸＪａ ＡｕｔｏｌｙｓｉｓＴＭ株によって例示される。
【００５４】
本発明では、用いられる特定の細胞溶菌剤は限定されない。細菌細胞サンプルと共に溶菌剤を使用する場合、ＲＴ−ＰＣＲ検出のためにそのサンプル全体または一部を使用してもよい。サンプルの一部は、細菌細胞１個未満からの標的を含んでもよい。
【００５５】
ウィルス性エンドリシンを使用するほかに、熱による前処理もまた特に有用な場合もある。約５０℃から約１００℃未満の温度範囲におけるサンプルのインキュベーションが、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとしての細菌ＲＮＡのアクセス可能性を改善することもある。この加熱前処理は、インキュベーション温度次第で、約１分〜約６０分の範囲の時間であってもよく、１〜２０分の処理が典型的である。熱処理は、異なる温度における複数のインキュベーションを含んでもよい。熱処理は、下で述べるように、ＲＮアーゼ阻害物質の存在下または不在下であってもよい。特に有用な処理は、約５０℃においてＲＮアーゼ阻害物質の存在下で約５〜２０分、および約９５℃においてＲＮアーゼ阻害物質なしで約１〜５分またはＲＮアーゼ阻害物質ありで約１〜１０分である。
【００５６】
少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質を細菌細胞に添加してもよい。典型的に、阻害物質およびそれらの濃度は、いかなるプライマー誘導増幅プロセスおよび構成要素も妨げないように選択される。ＲＮアーゼ阻害物質は当業者に知られており、イソチオシアン酸グアニジニウムおよびピロ炭酸ジエチルなどの化学薬品と、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのスペラセルン（ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ）ＴＭ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＲＮアーゼブロック、ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害物質、およびタカラ・ミラス・バイオ（Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）からのブタ肝臓ＲＮアーゼ阻害物質などのタンパク質阻害物質と、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からの抗−ＲＮアーゼおよびパンベラ（ＰａｎＶｅｒａ）からのリボヌクレアーゼインヒブ（Ｉｎｈｉｂ）ＩＩＩなどの抗−ヌクレアーゼ抗体と、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）ＴＭおよびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＲＮＡ保護細菌試薬などの試薬が挙げられる。
【００５７】
アッセイ法
本方法では、逆転写単独によって、または逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって、細菌細胞の診断用標的ＲＮＡの存在が試験される。共に使用される場合、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応は、二段階で逐次に、または全反応組成物試薬を細菌細胞サンプルに添加して一段階で共に実施してもよい。
【００５８】
逆転写反応組成物中の細菌細胞サンプルのインキュベーションは、標的ＲＮＡからのコピーＤＮＡの合成を可能にする。ＲＴ組成物は、標的ＲＮＡにハイブリダイズしてコピーＤＮＡ合成を刺激するプライマーを含む。さらにＲＴ組成物は、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、逆転写酵素、および逆転写酵素緩衝液を含む。１つを超える標的ＲＮＡからＤＮＡコピーを作成することが所望ならば、１つを超えるプライマーが含まれてもよい。さらにＲＴ組成物は、ここで述べられるように場合によりＲＮアーゼ阻害物質を含有してもよい。
【００５９】
逆転写反応の生成物は直接検出してもよく、または逆転写されたテンプレートからの所望のＤＮＡセグメントの合成を開始する一対のプライマーを含むＰＣＲ組成物を含有する別の分析管に、この反応のサンプルを移してもよい。さらにＰＣＲ組成物は、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリメラーゼ緩衝液を含有する。複数セグメントのＤＮＡ合成が所望されるならば、１対を超えるプライマーが含まれてもよい。また第２のプライマー対として、元のＲＴ−ＰＣＲプライマート共にＤＮＡセグメントを増幅する単一の新しいプライマーが添加されてもよい。
【００６０】
使用される追加的逆転写酵素としては、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのＨＩＶ逆転写酵素、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）からのトランスクリプター逆転写酵素、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのサーモスクリプト（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。使用してもよい追加的ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、およびエピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）からのセキサーム（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲを二段階または一段階で実施するかどうかにかかわらず、ＲＴステップは最初に実施され、典型的に約３７℃〜約７０℃の温度での単一温度インキュベーションからなる。当業者には知られているように、異なるＲｔ酵素および異なるプライマーでは、異なる温度が適切である。引き続くＰＣＲ反応は、典型的に約９４℃〜約９６℃で約６〜約１５分の初期インキュベーションからなる。このステップはｃＤＮＡを変性させ、また熱活性化Ｔａｑポリメラーゼ酵素を活性化させるために使用される。次にこれにｃＤＮＡ標的増幅の複数サイクルが続く。
【００６２】
各サイクル中に、標的変性、プライマーアニーリング、およびプライマー延長の３つの操作が実施される。標的変性は、典型的に約９０℃を超える温度で起きる。プライマーアニーリング温度は、反応で使用される特定のプライマーの融解温度によって定まり、プライマー延長は、使用される熱安定性ポリメラーゼ次第で約６０℃〜約７２℃の範囲の温度で実施される。プライマーアニーリングおよび延長が同一温度で実施される場合、これは３つの各ステップが異なる温度で起きる３温度ＰＣＲに対して、２温度のＰＣＲである。増幅相が完了した後、全ての増幅生成物の合成を確実にするよう最終延長時間が典型的に追加される。
【００６３】
本発明はまた、本直接検出法を利用するキットも提供する。キットはＲＴ−ＰＣＲ組成物またはＲＴ−組成物を使用して本方法を実施し、それぞれＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ反応生成物のいずれかを得て生成物を増幅するための説明書を含む。代案としては、説明書は、そのさらなる増幅なしのＲＴ−生成物の直接検出に関わる。さらにキットは、サンプルとの接触時にそれぞれＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ反応混合物をもたらす、ＲＴ−ＰＣＲ組成物またはＲＴ組成物のいずれかを含有してもよい。
【００６４】
ＲＴおよびＲＴ−ＰＣＲ生成物の検出
本発明は検出法に関して限定されず、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応の生成物を検出するあらゆる方法によって使用されてもよい。
【００６５】
ＲＴ生成物検出
ＲＴ反応のｃＤＮＡ生成物を直接に検出する方法は、当業者によく知られており、ｃＤＮＡ生成物に組み込むか、または付着する標識を利用する。使用してもよいシグナル発生標識は当該技術分野でよく知られており、例えば蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、または発光部分または分子が挙げられる。
【００６６】
蛍光部分、特に核酸に付着して蛍光シグナルを放出できる蛍光染料が特に有用である。フルオレセイン、テキサスレッド、およびローダミンなどの多様な染料が当該技術分野で知られている。特に有用なのは、例えばどちらもイリノイ州アーリントンハイツのアマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））から市販される単反応性染料Ｃｙ３およびＣｙ５である。標識ＤＮＡを特異的に検出するより感度の良い方法は、ナイロン膜またはガラススライドなどのマトリックス中に固定化された標的ＤＮＡ配列分子に、生成物をハイブリダイズすることである。次にハイブリダイゼーション後のシグナルを適切なフィルター付きのレーザースキャナーでスキャンして、使用した特定染料を検出できる。これは当該技術分野、特にＤＮＡマイクロアレイ技術で良く知られている。
【００６７】
ＲＴ反応におけるその合成中に標識をｃＤＮＡに組み込んでもよく、またはそれをｃＤＮＡ生成物の合成後に付着してもよい。例えばＲＴ反応を標識プライマーと共に実施できる。１つのタイプの標識プライマーは、多数のシグナル発生分子を有する付着粒子を有する。染料−標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰなどの標識ヌクレオチドを使用した逆転写は、転写された核酸中に標識を組み込む。代案としては合成後カップリング反応を使用して、ｃＤＮＡ生成物を検出できる。
【００６８】
核酸に標識を付着することは当業者によく知られており、例えばニックトランスレーションによって、または例えば標識ＲＮＡでの末端標識によって、またはキナーゼでの核酸の処理と、それに続く例えばフルオロフォアなどの標識にサンプル核酸を連結する核酸リンカー付着によって行われてもよい。別の標識方法では、ＲＴ反応からのＤＮＡ生成物は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写反応へのカップリングによって増幅される。例えばＴ７プロモーター領域は、ＲＴ反応に使用されるプライマー中に組み込まれる。次にＴ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットを使用して大量のＲＮＡを発生させ、検出感度を増大できる。Ｔ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットは、テキサス州オースティン２１３０ウッドワードのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ（２１３０ Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））またはその他の販売元から購入できる。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲ検出
ＲＴ−ＰＣＲ生成物検出の方法は、ゲル電気泳動分離および臭化エチジウム染色、または生成物中の組み込まれた蛍光標識または放射標識の検出を含む。増幅生成物の検出に先だって分離ステップを必要としない方法もまた、使用してもよい。これらの方法は一般に、リアルタイムＰＣＲまたは均質な検出と称される。ほとんどのリアルタイム法は、サーモサイクリング中に蛍光変化をモニタリングして、増幅生成物の形成を検出する。これらの方法としては、カリフォルニア州フォスターシティ９４４０４のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４））からのタクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）二重標識プローブ、ティヤギ（Ｔｙａｇｉ）Ｓおよびクレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ＦＲ（１９９６年）著、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：３０３〜３０８頁の分子ビーコン、およびオレゴン州ユージーン９７４０２−０４６９のモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ ９７４０２−０４６９））からのＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの該均一法のいくつかは、増幅生成物の終点検出にも使用できる。このタイプの方法の例は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料解離曲線分析である。解離曲線分析では、蛍光モニタリングと組合わせた、概して約６０℃〜９０℃の温度での最後の緩慢な傾斜から、融点、ひいては増幅生成物の存在を検出できる（リリー（Ｒｉｒｉｅ）ら（１９９７年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４５：１５４〜６０）。
【実施例】
【００７０】
続く実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のためにのみ提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を見極められ、その精神と範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適合するように本発明の様々な変更および修正ができる。
【００７１】
一般方法：
実施例で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野で良く知られており、Ｊサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、ＥＦフリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９年、ＴＪシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、ＭＬベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬＷエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８４年、およびＦＭオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」グリーン Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９８７年で述べられている。細菌培養の維持および生育に適した材料および方法もまた、当該技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ｐゲアハルト（Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、ＲＧＥマレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ＲＮコスティロウ（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ＥＷネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ＷＡウッド（Ｗｏｏｄ）、ＮＲクリーグ（Ｋｒｉｅｇ）、およびＧＢフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９４年、またはＴＤブロック（Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、１９８９年。
【００７２】
細菌細胞の生育および維持のために使用した全ての試薬、制限酵素、および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントスイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
【００７３】
本願明細書で使用した略語の意味は次の通り。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味する。「ＯＤ６５０」は、６５０ｎｍで測定した光学濃度を意味し、「ＯＤ２６０／ＯＤ２８０」は２６０ｎｍで測定した光学濃度と２８０ｎｍで測定した光学濃度との比率を意味する。
【００７４】
次の酵素および試薬は、次の供給メーカーから購入した。
カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））：マルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（カタログ番号４３１１２３５）、ＲＮアーゼ阻害物質（２０Ｕ／μＬ）（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ１０× ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ）（カタログ番号Ｎ８０８−０１９０）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（カタログ番号Ｎ８０８−０１９０）。
インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））：ファストスタ
ート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号２０３２９３７）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（カタログ番号２０３２９３７）。
テキサス中ウッドランドのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））：オリゴヌクレオチド。
カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））：２％二重ＣｏｍｂアガロースＥ−ゲル（Ｃａｔ＃Ｇ６０１８−０２）、２％単一ＣｏｍｂアガロースＥ−ゲル（カタログ番号Ｇ５０１８−０２）、Ｅ−ゲル低量範囲定量的ＤＮＡラダー（カタログ番号１２３７３−０３１）。
カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））：ＲＮアーゼ−フリーＤＮＡ分解酵素セット（カタログ番号７９２５４）。
ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（カタログ番号Ａ３２９４）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（カタログ番号Ｄ８４１８）、カーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）（カタログ番号Ｐ５４１３）、トレハロース（カタログ番号Ｔ９５３１）。
ニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））：トリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）（カタログ番号２２１２９３）、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（カタログ番号２９７８１１）、リン酸緩衝液（カタログ番号２９２７８６）、脳心臓浸出物培地（ＢＨＩ）（カタログ番号２２０８３７）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭフレーザー・ブロス・ベース（カタログ番号２１１７６７）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭＵＶＭ変性リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）増菌ブロス（カタログ番号２２２３３０）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭパルカム（ＰＡＬＣＡＭ）培地ベース（カタログ番号２６３６２０）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭオックスフォード培地ベース（カタログ番号２２２５３０）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭフレーザー・ブロス・サプリメント（カタログ番号２１１７４２）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭオックスフォード抗菌剤サプリメント（カタログ番号２１１７６３）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭＤ／Ｅ中和ブロス（カタログ番号Ｂ０１２５６）。
ニューヨーク州のオグデンズバーグのオキソイド（Ｏｘｏｉｄ（Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ））：パルカム（ＰＡＬＣＡＭ）プラス・ブロス。
【００７５】
次の試験キットおよび試薬は、次の供給メーカーから購入した。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（カタログ番号７４１０６）、メリーランド州ハノーバーのフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ））からのＤＥＰＣ（ピロ炭酸ジエチル）処理水（カタログ番号Ｒ０６０１）。
【００７６】
全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、テキサス中ウッドランドのシグマ・ジェノシス社（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））によって合成された。ポリメラーゼ連鎖反応および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズからの（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００配列検出システム、およびマサチューセッツ州ウォルサムのＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））からのＰＴＣ−２５５ペルチェ・サーマル・サイクラーを使用して実施した。
【００７７】
遺伝的配列は、メリーランド州フレデリックのインフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ））からのベクターＮＴＩアドバンス９で分析した。配列はメリーランド州ベセズダの国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）からダウンロードした。プライマー配列は、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用して、ダウンロードした配列に対して位置合わせした。
【００７８】
実施例１
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞培養物およびｃｆｕ判定
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（菌株ＣＬＩＰ １１２６２）（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−６８０、）はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）をＢＨＩ培地で水分補給した。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の培養物をＴＳＡ上に播種して３５℃で生育させ、次に４℃で保存した。
【００７９】
ＴＳＡプレートからリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のコロニーを取り出して、ＴＳＢに入れた。ニュージャージー州エディソンのニューブ・ランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））からの培養振盪機（モデルＧ２４）に、ＴＳＢを含有する試験管を３１℃で１８時間入れた。細胞数推定のために、この培養物１ｍＬを取り出して、カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））からのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ−７５００分光光度計に入れた。吸光度を使用して細胞濃度を近似し、６００ｎｍで読み取った。参照として１．０の吸光度を使用し、約１．０×１０９細胞／ｍＬが示唆された。
【００８０】
原液中の細胞数を判定するため、１：１０希釈のために別の１ｍＬの培養物を９ｍＬのリン酸緩衝液に移して、希釈細胞サンプルを調製した。これを８回繰り返して、連続希釈物を得た。１：１０００００、１：１００００００、および１：１０００００００希釈物からそれぞれ１００μＬをＴＳＡ上に播種して、原液毎ｍＬあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を得た。イリノイ州シカゴのプレシジョン・サイエンティフィック・グループ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）からの重力対流培養器にＴＳＡプレートを３５℃で４８時間入れた。３０〜３００ｃｆｕを含有するプレートを使用し、ｃｆｕ数に希釈率を乗じて０．１で除して、プレートに入れた１００μＬを計上し、原液濃度を判定した。得られた値はｃｆｕ／ｍＬを表す。
【００８１】
実施例２
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ホールセルサンプル中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
この実施例では、細菌細胞上で前溶解ステップなしに、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の単一ステップＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。
【００８２】
実施例１に示すように、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞（３．６×１０８ｃｆｕｓ／ｍＬ）の一晩培養物を調製して希釈した。試験用細胞サンプルを調製するために、ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ・バイオピュア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｐｕｒ）チューブ（カタログ番号２２６０００４−４）に、１：１０００〜１：１０００００００００希釈物からの１ｍＬのアリコートを入れ、次にそれをニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｄ遠心分離器内で、高速（１３，２００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した。サンプルからリン酸緩衝液を除去した。
【００８３】
５μＬのＲＮアーゼ阻害物質（１００Ｕ）を４５μＬのＤＥＰＣ処理水に添加して、細胞希釈剤を調製した。この５０μＬの溶液をリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞ペレットを含有する各バイオピュア（Ｂｉｏｐｕｒ）チューブに添加した。各チューブをペンシルベニア州ウェストチェスターのＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））からのミニ・ボルテクサー（Ｍｉｎｉ Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）上で高速（速度１０）で１５秒間ボルテックスした。希釈細菌細胞を含有するチューブを即座に氷にのせた。
【００８４】
４５μｌを５０μｌの最終反応容積に添加すると次の最終濃度をもたらすように、ＲＴ−ＰＣＲのための原液反応ミックス（Ａ）を調製した。
１）１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ
２）２ｍＭ ＭｇＣｌ２
３）２００μＭヌクレオチド
４）２４μｇ ＢＳＡ
５）ＤＭＳＯ（最終濃度１％）中のオレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））からのＳＹＢＲグリーン（１０，０００×、カタログ番号Ｓ７５６７）の１：１０，０００希釈物
６）６００ｎＭの順方向プライマーＬｉｓ−Ｆ（５’ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴ３’、配列番号：１）および２μＭの逆方向プライマーＬｉｓ−Ｒ（５’ＡＡＧＣＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＡＴＣＣＴ３’、配列番号：２）。プライマー配列はゾマー（Ｓｏｍｅｒ）およびカシ（Ｋａｓｈｉ）（２００３年Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．６６：１６５８〜１６６５頁）からのもの。
７）２．５単位のファストスタート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび１．２５単位のマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（Ｒｔ）８）１．８６ｍＭのカーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）
９）３６０．５ｍＭのトレハロース
１０）２０単位のＲＮアーゼ阻害物質
ＰＣＲ反応では、Ｒｔ酵素を添加しなかったこと以外はＲＴ−ＰＣＲミックスと同様にして、第２の反応ミックス（Ｂ）を調製した。
【００８５】
反応をカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのマイクロアンプ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ）光学９６−ウェル反応プレート（カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）内で実施した。ＲＴ−ＰＣＲでは、４５μＬの反応ミックスＡをウェルに添加して、ＲＮＡおよびＤＮＡ双方の存在を判定した。ＰＣＲでは、４５μＬの反応ミックスＢをウェルに添加してＤＮＡのみの存在を判定した。
【００８６】
表１および２に列挙するように、各希釈細菌細胞サンプルの５μＬサンプルを反応ミックスに添加した。全反応は各希釈物について３連で行った。
【００８７】
キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）のＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・キットを使用して、１．０×１０８ｃｆｕを含有するサンプルを抽出し、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ＲＮＡの陽性対照サンプルを調製した。次にキット製造業者が述べるようにして抽出ＲＮＡをＤＮＡ分解酵素処理して、５０μＬのＤＥＰＣ処理水の最終容積にした。デラウェア州ロックランドののナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＤＥ））からのナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）分光光度計を使用して、ＲＮＡ濃度（１６ｎｇ ＲＮＡ／μｌ）を判定した。次にこの濃縮ＲＮＡを希釈して、対照反応あたり８０ｐｇ添加した。このＲＮＡ対照をＲＴ−ＰＣＲ反応の陽性対照として使用した。ＲＮＡはＤＮＡ分解酵素処理されたので、ＰＣＲ反応の陰性対照としても使用された。さらに陰性標的なし対照として５μＬのＤＥＰＣ処理水を使用した。
【００８８】
プレートをカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）光学接着カバー（カタログ番号４３１１９７１）で密封し、それをニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離器５８０４内で遠心分離した。次の条件を使用して、ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００内で、サンプルをサーマルサイクルにかけた。
５０℃で１０分間（ＲＴステップ）、
９５℃で６分間（Ｔａｑ活性化ステップ）、
９５℃で３０秒間（変性させるステップ）、
６６℃で１分間（アニールおよび延長ステップ）、
変性およびアニールステップの反復３４回、
６６℃で５分間、
解離プロトコル（融解曲線）。
サーモサイクリング中に、反応生成物形成のＣＴ値を判定した。反応に続いて、融解曲線分析およびアガロース・ゲル電気泳動法による分離の双方を使用して、生成物形成を分析した。ドイツ国のワットマン・バイオメトラ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｇｅｒｍａｎｙ））からの低電圧電源（モデル２５０ＥＸ）に接続され、６０Ｖで２０分作動する、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＥ−ゲルベース中の２％単一ＣｏｍｂアガロースＥ−ゲル（カタログ番号Ｇ５１００−０１）上で、サンプルを泳動した。ニューヨーク州ロチェスターのコダック・デジタル・サイエンス（Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））からのコダック（Ｋｏｄａｋ）イメージ・ステーション４４０ＣＦ上でＥ−ゲル画像をキャプチャして、次に観察し正しいサイズのＲＴ−ＰＣＲ生成物（４０２ｂｐ）の存在または不在を判定した。
【００８９】
低量範囲定量的ＤＮＡラダー（バンドは上から下に２０００ｂｐ、８００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、および１００ｂｐ）と並べて、細菌細胞サンプルのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応からの反応生成物を図１に示す。４０２ｂｐの予測反応生成物は、細菌細胞サンプルからのＲＴ−ＰＣＲ（レーン２〜５に見られる）およびＰＣＲ（レーン１２および１３、そして非常に薄くレーン１４に見られる）反応、精製されたＲＮＡ（レーン１）との対照ＲＴ−ＰＣＲ反応の双方で増幅された。
【００９０】
反応生成物形成はまた、ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００解離データでも見られた。解離プロトコルでは温度が上昇して増幅されたＤＮＡ鎖の分離が引き起こされ、変化する蛍光がもたらされる。ＤＮＡ鎖が溶解分離する温度領域に対してピークを生じ、存在する増幅ＤＮＡの量に比例するこの蛍光変化率の導関数を取る。誘導体ピーク値を増幅生成物存在の定性的測定として使用する。３００を超える導関数をＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲの結果としての生成物形成の陽性指標と見なした。表１および２のサンプル２〜５、および１２〜１４の高い導関数値は、サンプル１の対象と同じく増幅されたＤＮＡ生成物が存在したことを示唆した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
【表３】
【００９３】
ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００からのサイクル閾値（ＣＴ）データは、標的の存在量に反比例する。細胞なしおよび水サンプルからは、３２〜３４のＣＴ値が背景レベルであると判定された。表１および２のサンプル２〜５、１２および１３で示された２７以下のＣＴ値は、成功した増幅反応を示唆した。サンプル１４の３１．３９のＣＴ値もまた、背景よりやや下であった。生成物形成は、反応に添加された細胞数と正比例した。サンプル１２対２および１３対３を比較すると、ＰＣＲ対ＲＴ−ＰＣＲ反応中の同一細胞数について、およそ５のＣＴ値の違いを示した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の検出下限値は３．６×１０１細胞であり、一方ＰＣＲ反応の検出下限値は３．６×１０２細胞であった。これらの結果は、細菌細胞ＲＮＡがＲＮＡ精製または事前細胞溶解なしに、ＲＴ−ＰＣＲ検出のために容易に利用できたことを実証する。
【００９４】
実施例３
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のホールセルサンプルにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ標的検出の再現性
実施例１同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）培養物を一晩生育させて処理した。細胞サンプルを実施例２と全く同じ条件下で、２つの追加的実験で（異なる日に）試験した。
【００９５】
１、８、および１３日目に実施した実験からのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応のＣＴ値のプロットを図２および３に示す。実施した実験からの反応あたりの細胞数は、１日目に３．６×１０４〜３．６×１０−１、８日目に３．２×１０４〜３．２×１０−１、および１３日目に７．５×１０４〜７．５×１０−１の範囲に及んだ。プロットは、ＣＴ値が異なる実験間で接近して再現されたことを示す。同一反応の導関数ピークデータを図４および５に示す。これらのデータのプロットはまた、データが再現されたことを示した。双方のタイプのデータは、ＲＮＡがＲＮＡ抽出または事前細胞溶解なしにリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）細菌細胞から直接検出できることを示唆した。
【００９６】
実施例４
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ホールセルサンプル中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出のための前処理
実施例１と同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞を調製した。実施例２と同様に細胞サンプルを遠心分離して、ＲＮアーゼ阻害物質を含有する水に再懸濁した。この実施例では、５０μＬあたり１０５〜１００細胞の濃度範囲に及ぶ３組の細胞サンプルを調製した。１つの組は前処理なし対照として、試験に先だって氷上に保持した。第２のサンプルの組は、ペンシルベニア州ウェストチェスターのＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））からの５０℃熱ブロックに５分間のせて、次に試験に先だって氷上に保持した。第３のサンプルの組は、９５℃熱ブロックに１分間にのせて次に氷にのせた。この組を使用して細胞の高温熱処理の効果を評価した。実施例２と同様にＲＴ−ＰＣＲ試薬反応ミックス（Ｒｔあり）およびＰＣＲ試薬反応ミックス（Ｒｔなし）を調製した。各試験組からの５μＬをＲＴ−ＰＣＲ試薬反応ミックスに添加して、各試験組からの追加的５μＬをＰＣＲ試薬反応ミックスに添加した。ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応を三連で実施した。次に実施例２と同様に、試験反応をＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００内でサーマルサイクルにかけた。
【００９７】
この実験び融解曲線導関数ピークデータを次の表３および４に列挙する。表３および４に示された結果は、細胞前処理がＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲアッセイに悪影響を及ぼさなかったことを実証する。導関数ピーク値は前処理サンプルならびに対照中の生成物増幅を示した。実施例２と同様に、３００を超える導関数ピーク値から生成物形成が推測された。ＲＴ−ＰＣＲ反応中に２．５２×１０１細胞があるサンプル中に生成物を検出した一方、ＰＣＲ反応中に２．５２×１０２細胞があるサンプル中に生成物が検出され、実施例２と同様に細菌細胞ＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲ検出に容易に利用できることが示唆された。
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
実施例５
ＲＴ−ＰＣＲにおける直接１６Ｓ ｒＲＮＡ標的検出と単離ＲＮＡ標的検出との比較
実施例１および２と同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細菌細胞を調製して希釈した。次にキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・キット（ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・ハンドブック、２８頁、５６〜６０頁）ＲＮＡ抽出キットを使用して、これらの細胞からのＲＮＡを単離した。具体的には、ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｄ遠心分離器内で、各細胞サンプル希釈物からの１ｍＬを１０分間遠心分離（１３，２００ｒｐｍ）した。リン酸緩衝液を除去し、次にキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコル（ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・ハンドブック）に従って細菌細胞を１０分間溶解した。次に溶解サンプルをカラム内のキット・シリカ−ゲルベースの膜に添加して、ＲＮＡを結合させた。任意のＤＮＡ分解酵素処理は実施しなかった。５０μＬの水をカラムに添加して、ＲＮＡを膜から溶出した。溶出剤を再適用して膜から溶出し、溶液中のＲＮＡを濃縮した。次にこの回収されたＲＮＡを試験まで氷にのせた。
【０１０１】
比較のために、水およびＲＮアーゼ阻害物質中で希釈細菌細胞サンプルの２つの追加的シリーズを調製し、実施例４と同様に（５０℃で５分間または９５℃で１分間）前処理した。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）キットによって抽出された単離ＲＮＡ、および熱処理細胞を実施例２で詳述するようにＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応で分析した。
【０１０２】
ＣＴ値および融解曲線導関数値によって測定されたこれらの反応から得られたＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物をそれぞれ、表５、６、および７、８で報告する。ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ応答（ＣＴまたは融解曲線導関数値）のいずれにおいても直接細菌細胞検出法と比べて、精製ＲＮＡの利点は見られなかった。実際のところ、熱処理細菌細胞サンプルは、精製されたＲＮＡ、特に９５℃で１分間加熱されたものよりもやや良い（より低い）ＲＴ−ＰＣＲ ＣＴ値を有した。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
実施例６
直接標的ＲＮＡ検出のための熱前処理細胞サンプルに対するＲＮアーゼ阻害物質の効果
実施例１と同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞を生育させ、リン酸緩衝液中で１：１００００に希釈した。実施例２と同様に希釈細胞の１ｍＬアリコート１４個を取り出して調製し、サンプルの半数を４５：５の水：ＲＮアーゼ阻害物質（１００Ｕ）ミックス５０μＬに再懸濁し、もう半数はＲＮアーゼ阻害物質添加なしの水５０μＬのみに再懸濁した。全サンプルをボルテックスした。
【０１０８】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイに先だって、各サンプルの組（ＲＮアーゼ阻害物質ありおよびＲＮアーゼ阻害物質なし）からの１本のチューブをゼロ時間陽性対照として氷上に保持した。実施例４と同様に残りのチューブを５０℃熱ブロックにのせた。１分、２分、５分、１０分、１５分、および２０分の各時点で、各処理条件からの１本のチューブを熱ブロックから取り去って氷上にのせた。
【０１０９】
実施例２で述べられるように、４５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応混合物のアリコートを９６−ウェルプレートに入れた。各５０℃熱処理サンプルおよび対照から５μＬのサンプル３個を取り、４５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応混合物に添加して、実施例２で述べられるように反応をサーモサイクルにかけた。これらの反応のＣＴ値を表９に、融解曲線導関数ピーク値を表１０に示す。
【０１１０】
表９に示すように、５０℃で５分間のインキュベーション後、ＲＮアーゼ阻害物質ありのサンプルとＲＮアーゼ阻害物質なしのサンプルの間にＣＴ値の相違が見られた。ＲＮアーゼ阻害物質ありのサンプルのより小さいＣＴ値は、ＲＴ−ＰＣＲにとって利用可能性がより高い標的ＲＮＡの在を示唆した。したがってＲＮアーゼ阻害物質存在での５０℃で５分以上の処理は、ＲＴ−ＰＣＴアッセイにおける細菌細胞ＲＮＡの利用可能性を増大させる。
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
上述のようなＲＮアーゼ阻害物質ありまたはなしの細菌細胞サンプルを９５℃で同一時間加熱し、次に上記のようにＲＴ−ＰＣＲでアッセイした。これらの処理のＣＴ値および融解曲線導関数ピーク値のＲＴ−ＰＣＲ結果をそれぞれ表１１および１２に報告する。
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】
ＣＴ値は、ＲＮアーゼ阻害物質なしの９５℃で１〜５分の熱処理が、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＲＮＡテンプレート利用可能性を増大させることを示唆した（対照よりも低いＣＴ値）。ＲＮアーゼ阻害物質ありの９５℃で１〜１０分の処理は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＲＮＡテンプレートの利用可能性を増大させた。
【０１１７】
５０℃および９５℃での処理の双方における経時的ＲＴ−ＰＣＲ応答は、いくらかの経時的ＲＮＡ分解を示唆したが、導関数応答によって示唆されるように、ＲＮＡ増幅は、双方の処理条件下において試験した全時点で起きた。この結果は、ＲＴ−ＰＣＲ直接細菌細胞検出にＲＮアーゼ阻害物質は必要でないが、ＲＮアーゼ阻害物質が存在すれば、それは応答を増強できることを実証する。したがってＲＮアーゼ阻害物質ありまたはなしで、双方の熱処理下においてＲＮＡが検出されたが、ＲＮアーゼ阻害物質が存在するとより多くのＲＮＡが利用できた。
【０１１８】
実施例７
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
ニューヨーク州オグデンズバーグのオキソイド（Ｏｘｏｉｄ，Ｌｔｄ．（Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ））からの０．３％グルコース添加デミ−フレーザー培地プラス（カタログ番号ＣＭ０１５３）中でリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞を３７℃で生育させた。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上でプレートカウントを実施した。
【０１１９】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌの０．３％グルコース添加デミ−フレーザー培地にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）を接種して、３７℃で一晩インキュベートした。１００μｌの一晩培養物を新鮮な培地に移し、ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））からのウルトラ・スペック（Ｕｌｔｒａ Ｓｐｅｃ）３０００を使用してＯＤ６５０を測定した。培養物をＯＤ６５０が０．５（対数中期）に達するまで３７℃でインキュベートして、３３μｌの培養物をテキサス州オースティンのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））からの９６７μｌの氷冷ＰＢＳ（アンビオン・セル・トゥｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃＤＮＡ）キット、カタログ番号１７２２）に移した。ノースカロライナ州アシュビルのケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ））からのヘレウス・バイオフュージ・ピコ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｐｉｃｏ）内において、１３，０００ｒｐｍで１分の遠心分離によって細胞をペレット化して、次に１００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁した。細胞を氷冷ＰＢＳ中で１：１０に希釈し、次にテキサス州オースティンのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））からのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶菌性緩衝液（アンビオン・セル・トゥｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃＤＮＡ）キット、カタログ番号１７２２）中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに連続１：１０希釈を作成した。
【０１２０】
プレートカウントを実施するために、ＰＢＳ中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに別の連続１：１０希釈の組を作成した。およそ１０３および１０２細胞／ｍｌの希釈物から、１００μｌをＢＨＩ寒天プレート上に播種した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、プレートあたりのコロニー数を計数して希釈物あたりのｃｆｕを判定した。
【０１２１】
およそ１０５細胞／ｍｌ〜１０２細胞／ｍｌを含有するアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶菌性緩衝液中の各希釈物から、９０μｌの希釈細胞を０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブに移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１０分間、細胞をインキュベートした。下で述べられるように、得られた細胞サンプル溶解産物をＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１２２】
ＢＡＸ溶解法によるホールセル溶解産物調製
ペレット化した細胞を最初に１：１０でなく１：５に希釈し、次に上のように最終濃度およそ２×１０２細胞／ｍｌに１：１０連続希釈したこと以外は、上述のように培養物を生育させ調製した。同一培養物を使用して双方の希釈物および溶解産物の組を調製したので、双方の溶解法で上のプレートカウントを使用した。０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のデラウェア州ウィルミントンのデュポン・クアリコン（ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））からの１００μｌのＢＡＸ溶菌性緩衝液（リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属スクリーニング用ＢＡＸシステムＰＣＲアッセイ、カタログ番号１７７１０６１０）に、およそ２×１０６細胞／ｍｌ〜２×１０３細胞／ｍｌを含有するＰＢＳ中の各希釈物から５μｌの希釈細胞を添加した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内で、細胞を５５℃で１時間、次に９５℃で１０分間インキュベートした。得られた細胞サンプル溶解産物を下のＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１２３】
ＲＴ−ＰＣＲ
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの配列検出システム（ＳＤＳ）装置（モデル７９００）上、でリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのプライマー・エクスプレスｖ２．０ソフトウェアを使用して、標準設定を使用して、リアルタイムプライマーおよびプローブをデザインした。逆転写酵素ありまたはなし（＋または−Ｒｔ）の双方で、次のように２０μｌ反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの１０μｌのタクマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ ２×マスター・ミックス（＃４３２４０１８、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ含有）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．４μｌのＲＮアーゼ阻害物質（＃Ｎ８０８−０１１９、２０Ｕ／μｌ）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０１μｌのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（＃４３１１２３５）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．１μｌの１６Ｓ−３７３Ｆ １００μＭプライマー（５’ＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴ：配列番号：３）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．２μｌの１６Ｓ−４３６Ｒ １００μＭプライマー（５’ＴＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡ：配列番号：４）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０５μｌの１６Ｓ−３９４Ｔ １００μＭタクマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＡＭＲＡプローブ（＃４５００２５、６ＦＡＭ−ＡＣＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧ：配列番号：５）、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフＡＧ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの７．２４μｌの分子生物学等級水＃００３２００６．３０２）、および２μｌのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。Ｒｔなしで反応を実施し、溶解産物中に存在する検出可能量のＤＮＡを判定した。２つの最高濃度溶解産物のみをＲｔなしで使用した。
【０１２４】
反応を次のようなサーマルサイクルにかけた。５０℃で１０分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒＋６０℃で１分を４０サイクル。サーモサイクリングに先だって、その近接性のため３’ＴＡＭＲＡ染料によって、タクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）プローブの５’末端上の６−ＦＡＭリポーター染料蛍光を効果的にクエンチする。サーモサイクリング中に、ＰＣＲプライマー結合部位の１つの上流の増幅生成物の１本の鎖に、プロ
ーブが結合した。アンプリタク・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）（登録商標）によってＰＣＲプライマーが延長するに連れて、それはその５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を通じてプローブを切断する。プローブの開裂はリポーターとクエンチャー染料を分離し、リポーター染料蛍光の増大をもたらす。リポーター染料蛍光をＳＤＳ装置によって捕集する。７９００ ＳＤＳ装置は、リポーター蛍光のほとんどがクエンチされる最初の少数のサーマルサイクルからの背景蛍光に対して、蛍光の増大を比較する。次にソフトウェアが全サンプルについて、背景蛍光を顕著に越える点でＣＴ値を判定する。
【０１２５】
表１３に示されるＣＴ値は、精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従う。１：１０希釈シリーズにわたり標的ＲＮＡ量としてＣＴに用量反応または増大があり、またはＤＮＡが減少した。この結果は、サンプルが希釈されると、リポーター蛍光が装置によって判定される閾値に達するのにより長い時間がかかることを意味する。したがって溶解リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細菌細胞サンプルの直接アッセイは、精製された核酸サンプルから予期される検出と比較できるパターンで、ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出を示した。
【０１２６】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解データに見られるより低いＣＴ値は、ＢＡＸ溶解法と比較してこの溶解法が、増幅のためのＲＮＡテンプレートを提供するのにより効率的であったことを示唆する。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
（＋）Ｒｔ反応で観察される（−）Ｒｔ反応と比べてより低いＣＴ値は、これらの反応において高いコピーＲＮＡ数が検出されたことを示唆した。増幅生成物の倍増はＰＣＲ反応の各サイクル中に起きるので、（＋）と（−）Ｒｔ反応間のＣＴ値の差またはΔＣＴは、式：２^−ΔＣＴによって相関できる（ΔＣｔはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ユーザー広報＃２、１９９７年１２月による）。この式を使用して、（−）Ｒｔ反応におけるテンプレートＤＮＡコピー数に対する、（＋）Ｒｔ反応におけるテンプレートＲＮＡコピー数の差を計算した。値を表１４に示す。これらの計算値は、溶解細胞サンプル中のテンプレートＤＮＡよりもおよそ１００〜２００倍より多くのテンプレートＲＮＡコピーがあったことを示唆した。
【０１２９】
【表１５】
【０１３０】
この実施例は、ＲＮＡまたはＤＮＡ精製を要求しないここで述べられる溶解手順が、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な標的ＲＮＡレベルを発生させることを示す。
【０１３１】
実施例８
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
ニューヨーク州オグデンズバーグのオキソイド（Ｏｘｏｉｄ，Ｌｔｄ．（Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ））からの０．３％グルコース添加デミ−フレーザー培地プラス（カタログ番号ＣＭ０１５３）中でリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株ＤＤ１２８８細胞を３７℃で生育させた。ＤＤ１２８８はデラウェア州ウィルミントンのデュポン・クアリコン（ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））から得られた株であり、調理済み七面鳥から単離され、クック（Ｃｏｏｋ），Ｌ．Ｖ．著（「ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ微生物学試験室ガイドブック（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ）」）２００２年、第３版、３次改訂、ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｓｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／Ｆｒａｍｅ／ＦｒａｍｅＲｅｄｉｒｅｃｔ．ａｓｐ?ｍａｉｎ＝ｏｐ／ｏｐｈｓ
／ｏｐｈｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）で述べられるように、異なる寒天上でのその生育パターン、および生化学試験におけるその特性によってＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株として同定された。この実施例で述べられるように、その他のＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株を使用して、ホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出を実証してもよい。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上で、実施例１で述べられるようなプレートカウントを実施した。
【０１３２】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解法によるホールセル溶解産物の調製
実施例７でアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解法について述べたように、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）細胞を生育させ、収穫し、希釈して、プレートカウントを行った。およそ１０５細胞／ｍｌ〜１０２細胞／ｍｌを含有するアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶菌性緩衝液中の各希釈物から、９０μｌの希釈細胞を０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブに移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１０分間、細胞をインキュベートした。
【０１３３】
ＲＴ−ＰＣＲ
反応あたり２μｌのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙ
ｔｏｇｅｎｅｓ）細胞溶解産物サンプルを使用して、実施例７で述べられるようにしてリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。全反応を三連で実施した。
【０１３４】
実施例７と同様に反応をサーマルサイクルにかけ、ＣＴ値を表１５に示す。実施例７と同様に、ＣＴ値は精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従ったので、溶解細胞の直接アッセイが効果的だったことが実証された。精製なしでは、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１６Ｓ ｒＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲアッセイにおいてテンプレートとして機能するのに利用できた。データは、溶解産物希釈レベルが増大するに連れてＣＴ値の特徴的な増大を示し、反応中により低いｃｆｕを与えた。逆転写酵素を含む反応は、表１６にある計算された２＾−ΔＣＴ値によって示されるように、ＰＣＲのテンプレートとしての役割を果たす１６Ｓ配列の標的ＤＮＡコピーを顕著により多く含有した。
【０１３５】
【表１６】
【０１３６】
【表１７】
【０１３７】
実施例９
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した大腸菌（エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
ｃｏｌｉ）ホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。細胞をカリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ培地（カタログ番号Ｂ９９９４）上で３７℃で生育させた。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上で、プレートカウントを実施した。
【０１３８】
水溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌのＢＨＩに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。推定開始濃度３×１０９細胞／ｍｌに基づいて、ＢＨＩ培地中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに連続１：１０希釈を作成した。
【０１３９】
およそ１０３および１０２細胞／ｍｌの希釈物から１００μｌをＢＨＩ寒天プレート上に播種した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、コロニー数を計数して希釈物あたりのｃｆｕを判定した。
【０１４０】
０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からの５μｌ ２０Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害物質（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）添加９５μｌ蒸留脱イオン水に、およそ１０９細胞／ｍｌ〜１０５細胞／ｍｌを含有する各希釈物から５μｌの希釈細胞を移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１５分間、細胞をインキュベートした。フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。得られた細胞サンプル溶解産物を氷上で冷却し、次に下のＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの配列検出システム（ＳＤＳ）装置（モデル７９００）上でリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。逆転写酵素ありまたはなし（＋または−Ｒｔ）の双方で、次のように２０μｌ反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの１０μｌのタクマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ ２×マスター・ミックス（＃４３２４０１８）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．４μｌのＲＮアーゼ阻害物質（＃Ｎ８０８−０１１９、２０Ｕ／μｌ）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０１μｌのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（＃４３１１２３５）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．１μｌの１６Ｓ−２４５５Ｆ １００μＭプライマー（５’ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＡＡＧＡＧＴＴＣ：配列番号：６）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．２μｌの１６Ｓ−２５２３Ｒ １００μＭプライマー（５’ＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴ：配列番号：７）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０５μｌの１６Ｓ−２４７９Ｔ １００μＭ タクマン（ＴａｑＭａｎ） ＴＡＭＲＡプローブ（＃４５００２５、６ＦＡＭ−ＴＣＧＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣ：配列番号：８）、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフＡＧ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの７．２４μｌの分子生物学等級水＃００３２００６．３０２）、および２μｌのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。
【０１４２】
次の条件で反応をサーマルサイクラー内で実施した。５０℃で１０分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒＋６０℃で１分を４０サイクル。各サイクルからリアルタイム蛍光データを収集した。実施例７で述べられるようにして、タクマン（ＴａｑＭａｎ）５’−３’エキソヌクレアーゼアッセイを実施した。
【０１４３】
表１７に示されるＣＴ値は、精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従う。１：１０希釈シリーズにわたり標的ＲＮＡ量としてＣＴに用量反応または増大があり、またはＤＮＡが減少した。この結果は、サンプルが希釈されると、リポーター蛍光が、装置によって判定される閾値に達するのにより長い時間がかかることを意味する。したがって溶解大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞サンプルの直接アッセイは、精製された核酸サンプルから予期される検出と比較できるパターンで、ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出を示した。
【０１４４】
各溶解産物濃度で（＋）ＲＴデータに、（−）ＲＴデータと比べてより低いＣＴ値が観察された。このより低いＣＴ値は、（＋）ＲＴ反応中により大量の標的が存在することの現れである。これは溶解産物中に、１６Ｓ ｒＤＮＡと比べて１６Ｓｒ ＲＮＡのより多くのコピーが存在するという事実と良好に相関し、これらの反応中でＲＮＡが検出されたことの確証である。この結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＲＮＡ標的がいかなる精製ステップもなしに、細胞溶解産物から直接検出できることを示唆する。
【０１４５】
【表１８】
【０１４６】
実施例１０
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６Ａのホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０は、バージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。液体アンモニウム「ＢＴＺ」増殖培地中でメタンを炭素源として、細胞を３０℃で生育させた（表１８および１９参照）。イリノイ州ウィートンのウィートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ））からの共栓付きウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）ボトル内で、少なくとも８：１の気体／液体比を使用して（すなわち総容積８０ｍＬのウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）ボトル内に１０ｍＬの液体アンモニウム「ＢＴＺ」増殖培地）、血清中でメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａを生育させた。培養のための標準気相は、空気中に２５％メタンを含有した。
【０１４７】
【表１９】
【０１４８】
【表２０】
【０１４９】
水溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌのＢＴＺ培地にメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６Ａを接種し、３０℃で一晩インキュベートした。推定開始濃度３×１０９細胞／ｍｌに基づいて、最
終濃度およそ１０５細胞／ｍｌにＢＴＺ培地中で一連の１：１０希釈を作成した。
【０１５０】
０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からの５μｌ ２０Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害物質（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）添加９５μｌ蒸留脱イオン水に、およそ１０９細胞／ｍｌ〜１０５細胞／ｍｌを含有する各希釈物から５μｌの希釈細胞を移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１５分間、細胞をインキュベートした。フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。得られた細胞サンプル溶解産物を氷上で冷却し、次に下のＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１５１】
ＲＴ−ＰＣＲ
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの配列検出システム（ＳＤＳ）装置（モデル７９００）上でリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。逆転写酵素ありまたはなし（＋または−ＲＴ）の双方で、次のように２０μｌ反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの１０μｌのタクマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ ２×マスター・ミックス（＃４３２４０１８）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．４μｌのＲＮアーゼ阻害物質（＃Ｎ８０８−０１１９、２０Ｕ／μｌ）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０１μｌのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（＃４３１１２３５）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．１μｌの１６Ｓ−１１０８Ｆ １００μＭプライマー（５’ＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ：配列番号：９）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．２μｌの１６Ｓ−１１６９Ｒ １００μＭプライマー（５’ＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＴＴＴＡＴＣＡ：配列番号：１０）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０５μｌの１６Ｓ−１１２５Ｔ １００μＭ タクマン（ＴａｑＭａｎ） ＴＡＭＲＡプローブ（＃４５００２５、６ＦＡＭ−ＣＧＧＧＡＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧ：配列番号：１１）、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフＡＧ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの７．２４μｌの分子生物学等級水＃００３２００６．３０２）、および２μｌのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。
【０１５２】
次の条件で反応をサーマルサイクラー内で実施した。５０℃で１０分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒＋６０℃で１分を４０サイクル。各サイクルからリアルタイム蛍光データを収集した。実施例７で述べられるようにして、タクマン（ＴａｑＭａｎ）５’−３’エキソヌクレアーゼアッセイを実施した。
【０１５３】
表２０に示されるＣＴ値は、精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従う。１：１０希釈シリーズにわたり標的ＲＮＡ量としてＣＴに用量反応または増大があり、またはＤＮＡが減少した。この結果は、サンプルが希釈されると、リポーター蛍光が装置によって判定される閾値に達するのにより長い時間がかかることを意味する。したがって溶解メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ細菌細胞サンプルの直接アッセイは、精製された核酸サンプルから予期される検出と比較できるパターンで、ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出を示した。
【０１５４】
各溶解産物濃度で（＋）ＲＴデータに、（−）ＲＴデータと比べてより低いＣＴ値が観察された。このより低いＣＴ値は、ＲＮＡテンプレートからのＤＮＡの生成のために、（＋）ＲＴ反応中により大量の標的が存在することの現れである。より低いＣＴは溶解産物中に、１６Ｓ ｒＤＮＡと比べて１６Ｓ ｒＲＮＡのより多くのコピーが存在するという事実と良好に相関し、これらの反応中でＲＮＡが検出されたことの確証である。この結果は、別のグラム陰性細菌メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ株中でＲＮＡ標的がいかなる精製ステップもなしに、細胞溶解産物から直接検出できることを示唆する。
【０１５５】
【表２１】
【０１５６】
実施例１１
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したその他の細菌および牛挽肉存在下におけるリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
この実施例は、食品微小細菌叢およびマトリックス物質を含む、食品加工工場において遭遇する接触面をシミュレートする物質表面のリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ＣＬＩＰ１１２６２（ＡＴＣＣＢＡＡ−６８０）の存在の検出を実証する。
【０１５７】
カレントテクノロジーズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｃｒａｗｆｏｒｄｓ，ＩＮ））からのハイプ−ワイプ（Ｈｙｐｅ−Ｗｉｐｅ）ブリーチ入り消毒タオル（カタログ番号９１０３）で拭き、続いて滅菌水で洗浄して、１２０グリット３１６ステンレス鋼表面を滅菌した。表面にそれぞれ８個１インチ×１インチ正方形を含む２つの格子の印を付けた（レイアウトについては表２１および表２２参照）。
【０１５８】
【表２２】
【０１５９】
【表２３】
【０１６０】
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の単一コロニーをニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））からの８ｍｌ ＢＨＩチューブ（カタログ番号２２０８３７）内に接種し、定常期に達するまで３７℃で約１７時間インキュベートした。次に培養物をＢＨＩ中で連続希釈して最終濃度７．３×１０５細胞／ｍｌを得た。この希釈懸濁液５０μｌを塗布して、表面において１”×１”正方形内に３．６５×１０４細胞の細胞最終濃度を得た。細胞懸濁液をピペットで塗布し、ピペット先端を使用して、Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨと標識された調製ステンレス鋼表面格子の各１インチ×１インチ正方形上に穏やかに播種した。表面を室温で一晩（１８時間）乾燥させた。各格子中にＡ、Ｂ、ＥおよびＦと標識された対照正方形には、Ｌ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）を塗布しなかった。
【０１６１】
ニューカロライナ州ウィルミントンのＩＫＡワーク（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））からのウルトラ・ツラックス（Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ）Ｔ−２５ベーシック・ホモジナイザーで、オレゴン州ウィルソンビルのＰＭＬマイクロバイオロジカルズ（ＰＭＬ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，Ｏｒｅｇｏｎ））からの９０ｍｌのリン酸緩衝液（カタログ番号Ｂ８０９８）中で、４℃で保存されたおよそ１０ｇの市販の１０％脂肪赤味牛挽肉を均質化した。このホモジネートの１００μｌをピペットで表２１（食品処理表面）の各正方形に塗布した。サンプル収集に先だって、食品ホモジェネートを１時間乾燥させた。実施例１で述べられるような連続希釈およびトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）上への播種によって、食品ホモジェネート調製物の総プレートカウントを測定した。ＴＳＡプレートを３７℃で４８時間インキュベートした。牛挽肉ホモジェネートからの微生物のカウントは、微生物が１×１０４細胞／ｇのレベルで牛挽肉中に存在したことを示唆した。したがって各正方形に塗布された１００μｌのサンプルは、およそ１×１０２個の微生物を含有した。
【０１６２】
食品ホモジェネートを１時間乾燥させた後、滅菌済みパッケージで納入されるメイン州ギルフォードのピューリタン（Ｐｕｒｉｔａｎ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｉｎｅ））からの木製スティックに固着された綿棒（カタログ番号ＲＥＦ ２５−８０６ １ＷＣ）を使用して、表面の拭き取りによってサンプルを収集した。綿棒を中和ブロス（Ｄ／Ｅ中和ブロス）で、あらかじめ湿らせた。１”×１”セクション（約５ｃｍ２）の汚染面を精力的に拭き取って、サンプルを収集した（食品サンプルおよび対照の双方）。
【０１６３】
ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ参照法およびＲＴ−ＰＣＲの双方によって、綿棒を分析した。ＦＳＩＳ法では、各綿棒を１０ｍｌ＋／−０．５ｍｌのＵＶＭブロスと共にチューブに入れた。綿棒をチューブ内に入れたまま（キャップをするのに必要なら綿棒の末端を取り除く）ボルテックスして混合した。チューブを３０℃＋／−２℃で２２＋／−２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、１００μｌ＋／−２μｌのＵＶＭ培養物を取り出して、１０ｍｌ＋／−０．５ｍｌのフレーザーブロス（ＦＢ）に入れた。ＦＢを３７℃＋／−２℃で２６＋／−２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の存在を示す黒ずみについてＦＢを調べた。Ｌ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）処理格子正方形から収集した全ての綿棒サンプルは黒ずみを示し、表２３のＦＳＩＳ試験結果に「はい」と示され、Ｌ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）で処理しなかった全ての正方形は、黒ずみを示さず、陰性結果であった。
【０１６４】
【表２４】
【０１６５】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、各綿棒を１０ｍｌ＋／−０．５ｍｌのパルカム（Ｐａｌｃａｍ）プラス・ブロスに入れた。綿棒をチューブ内に入れたまま（キャップをするのに必要なら綿棒の末端を取り除く）ボルテックスして混合した。チューブを３７℃＋／−２℃で４８＋／−２時間インキュベートした。２４時間および４８時間目に、１ｍｌのアリコートを取り出して、ＲＴ−ＰＣＲによる試験のために培養物をサンプル採取した。７５度で１０分の熱処理によってアリコートを溶解した。実施例２で述べられるようにＲＴ−ＰＣＲを使用して溶解産物を試験した。
【０１６６】
２４および４８時間ＲＴ−ＰＣＲ結果をそれぞれ表２４および２５に示す。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）処理正方形から収集された全サンプルは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて双方の時点で、そしてＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ参照法（表２３）で陽性であった。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）処理のない正方形から収集された全サンプルは、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ法（表２３）で陰性であった。したがって混入細菌を含む食品マトリックスの存在は、熱溶解ＲＴ−ＰＣＲアッセイの正確さに影響しなかった。
【０１６７】
【表２５】
【０１６８】
【表２６】
【０１６９】
実施例１２
逆転写のみを使用した細菌のホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
ＰＣＲステップを施さずにＲＴ反応生成物を検出した。
【０１７０】
菌株および培地
実施例２で述べられるＬ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）をこの目的で使用する。細胞をカリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ培地（カタログ番号Ｂ９９９４）中で３７℃で生育させる。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上で、プレートカウントを実施する。
【０１７１】
水溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌのＢＨＩにＬ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）を接種して、３７℃で一晩インキュベートする。推定開始濃度３×１０９細胞／ｍｌに基づいて、ＢＨＩ培地中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに連続１：１０希釈を作成する。
【０１７２】
およそ１０９および１０２細胞／ｍｌの希釈物から、１００μｌをＢＨＩ寒天プレート上に播種する。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、コロニー数を計数して各希釈物あたりのｃｆｕを判定する。
【０１７３】
０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からの５μｌ ２０Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害物質（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）添加９５μｌ蒸留脱イオン水に、およそ１０９細胞／ｍｌ〜１０５細胞／ｍｌを含有する各希釈物から５μｌの希釈細胞を移す。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１５分間、細胞をインキュベートする。フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。得られた細胞サンプル溶解産物を氷上で冷却し、次に下の逆転写反応で即座に使用する。
【０１７４】
ＲＴ反応
逆転写を次の条件下で実施する。
１．ＲＴのための特異的プライマー（１〜６μｇ）を細胞溶解産物に添加する（５〜２０μｌ）。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）１６Ｓ ｒＲＮＡの検出のためのプライマーとしてＬｉｓ−Ｒプライマー（配列番号：２）を使用する。ＲＮアーゼおよびＤＮＡ分解酵素を含まない水で容積を２５μｌに調節する。
２．１４μｌの標識混合物を添加する。この混合物は、８μｌの５×酵素緩衝液、４μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）、および２μｌの２０×染料混合物を含有する。染料混合物は、それぞれ２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、ＩｍＭのｄＣＴＰ、そして１ｍＭのＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰを含有する。
３．混合物をアニーリングのために室温で１０分間インキュベートする。
４．１または１．４μｌ（２００〜３００単位）の逆転写酵素を添加して、使用酵素に適した温度で反応をインキュベートする。例えばスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ酵素では、インキュベーション温度は４２℃である。
５．ＤＮＡ精製キットでｃＤＮＡ精製を実施する。この目的のために、例えばキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲキットを使用してもよい。代案としては蛍光標識プライマーをＲＴ反応で使用して、未標識のｄＣＴＰのみを添加する。
【０１７５】
ｃＤＮＡ生成物の検出
いくつかの方法の一つによって、蛍光染料で標識されたｃＤＮＡＲＴ生成物を検出する。それは分光光度計で測定できる。例えばＣｙ３標識ＤＮＡ分子は、吸光係数１５０，０００Ｍ−１で波長５５０ｎｍで日常的に測定される一方、Ｃｙ５標識ＤＮＡは吸光係数２５０，０００Ｍ−１で６５０ｎｍで測定される。標識ＤＮＡを直接検出するより感度の良い方法は、ナイロン膜またはガラススライドなどのマトリックスに固定化された標的ＤＮＡ配列分子に生成物をハイブリダイズすることである。次にハイブリダイゼーション後のシグナルは、レーザースキャナーで適切にフィルターリングしてスキャンし、使用した特定の染料を検出できる。この方法は、当該技術分野、特にＤＮＡマイクロアレイ技術でよく知られている。
【０１７６】
ｃＤＮＡを検出する別の感度の良い方法は、多数のシグナル発生分子がある粒子に結合したプライマーを使用することである。代案としてはＲＴから発生するｃＤＮＡをＰＣＲでなく、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写のカップリングによって増幅できる。例えばＲＴ反応で使用されるプライマーに、Ｔ７プロモーター領域を組み込むことができる。次にＴ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットを使用して多量のＲＮＡを発生させ、検出感度を増大できる。Ｔ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットは、テキサス州オースティン２１３０ウッドワードのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ（２１３０ Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））またはその他の販売元から購入できる。述べられた方法によって、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞のＲＴ反応のｃＤＮＡ生成物が検出される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断用微生物学の分野に関する。より具体的には、ＲＮＡ精製または単離の必要性なしに、サンプルからの診断用標的ＲＮＡの迅速で感度の良い検出を可能にする方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
様々な臨床、食品、環境、またはその他の実験的サンプル中の細菌の存在をアッセイして、汚染物または病原体を同定することが望ましいことが多い。典型的にリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または場合によってはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である細菌ＲＮＡをアッセイして、細菌種の存在または不在を評価してもよい。いくつかの重要な細菌種では、細菌種に属する特定のＲＮＡ分子を検出できることにより、その他の細菌種の存在下でさえその検出を可能にする特異的プローブが開発されている。プローブをＲＴ−ＰＣＲアッセイ法においてプライマーとして使用して、そのＤＮＡへの逆転写と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応を使用したそのコピーＤＮＡ増幅を通じて、特異的ＲＮＡ分子を検出してもよい。細菌検出プロセス全体は、概して細菌の生育および細菌ＲＮＡの抽出と、それに続くＲＴ−ＰＣＲ反応および生成物検出を伴う。細菌の生育およびＲＮＡ調製ステップには時間がかかる。全体的な細菌検出プロセスを短縮して簡素化する試みがなされている。
【０００３】
細菌検出プロセスは、（非特許文献１）によって、多数の非標的細菌の存在下で標的細菌種の検出を可能にする高度に特異的なプローブの使用を通じて改善された。ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、各菌種からの異なるｍＲＮＡに特異的なプローブを使用して、有機廃棄物サンプル中にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が検出された。検出は抽出ＲＮＡ種の存在について高度に感度が良く、信頼できると述べられた。この報告では、細菌検出の改善は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの高感度および特異性のために、細胞播種と単離コロニーのさらなる識別が必要ないことである。しかしＲＮＡ調製プロセスの単純化はなされていない。リゾチーム処理、キット提供緩衝液中でのボルテックス、遠心分離、上清のカラムへの適用、および溶出をはじめとする複数ステップを伴うキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ−Ｍｉｎｉ ｋｉｔ）を使用して、細菌ＲＮＡが抽出された。
【０００４】
（非特許文献２）でも高感度のＲＴ−ＰＣＲアッセイが使用されて、細菌性魚類病原体が検出された。この報告において細菌検出になされた改善は、単一チューブＲＴ−ＰＣＲ−酵素ハイブリダイゼーション・アッセイを伴う高速大量処理システムの開発であった。ＲＮＡ調製プロセスの単純化はなされていない。この報告でアッセイされた細菌ＲＮＡは、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭ−ＰＣＲ抽出キット、またはこれもガラス繊維フィルターへの結合を伴う別の手順を使用して抽出され精製された。
【０００５】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、環境サンプルから直接溶解によって回収されたｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを増幅する方法が、（非特許文献３）で使用された。この報告では「直接溶解」とは、ＲＮＡ精製に先だって環境サンプルから細菌を単離し生育させるのとは対照的に、環境サンプルからのＲＮＡの直接精製を指す。ここでも溶解、フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、遠心分離、クロロホルム抽出、沈殿、乾燥、および再懸濁ステップを伴うＲＮＡ調製方法の単純化はなされなかった。
【０００６】
上述の方法はＲＮＡ種の検出のために有用であるが、なおも分析に先だってＲＮＡ種を精製し単離するための多段階プロセスの必要性に悩まされる。このようなプロセスは、分析に経費と時間を上乗せする。ＲＮＡ単離または精製の追加的ステップなしで、診断用ＲＮＡ種に基づいた迅速な細菌同定プロセスに対する必要性がなおも残る。出願人らは、ＲＮＡ単離またはサンプルの精製を必要としないＲＮＡ検出方法を提供することで、既述の問題を解決した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ブルチャー（Ｂｕｒｔｓｃｈｅｒ）およびヴェルツ（Ｗｕｅｒｔｚ）、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３年、６９：４６１８〜４６２７頁
【非特許文献２】ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）およびカールソン（Ｃａｒｓｏｎ）、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、２００３年、５４：１２７〜１３４頁
【非特許文献３】Ｓ．セレンスカ−ポーベル（Ｓｅｌｅｎｓｋａ−Ｐｏｂｅｌｌ）「分子微生物生態学マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９９５年、２．７．５／１〜２．７．５／１４、アカーマンズ，アントン（Ａｋｋｅｒｍａｎｓ，Ａｎｔｏｏｎ）Ｄ．Ｌ．、ヴァン・エリアス，ヤン・ディルク（Ｖａｎ Ｅｌｓａｓ，Ｊａｎ Ｄｉｒｋ）、デ・ブリュイン，フランス（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ，Ｆｒａｎｓ）Ｊ．編、出版社Ｋｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈ．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細菌細胞サンプルから診断用標的ＲＮＡを直接検出する方法を提供する。細菌細胞サンプルとＲＴ−ＰＣＲ反応組成物とを直接接触させ、次にそれを増幅された診断用標的ＤＮＡ生成物の生成および検出のために、サーモサイクリングに曝す。別の態様では、細菌細胞サンプルとＲＴ反応組成物とを直接接触させ、インキュベートしてｃＤＮＡ生成物を生成し、次にＰＣＲ組成物との接触が続き、次にそれを増幅された診断用標的ＤＮＡ生成物の生成および検出のために、サーモサイクリングに曝す。異なる態様では、ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ組成物との接触に先だって、細菌細胞サンプルを溶菌剤で処理する。さらに異なる態様では、ＰＣＲ増幅とのカップリングなしに、ＲＴ反応生成物それ自体を検出する。別の態様では、ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ組成物との接触に先だって、少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質を細菌細胞サンプルに添加する。全ての態様において、本発明はいかなるＲＮＡ精製ステップもなしに実施される。
【０００９】
場合により、細菌細胞を含有するサンプルを熱、酵素、溶菌性緩衝液および／または物理的剪断などの作用因子で前処理して、ＲＮＡの利用可能性を増強する。さらに別の態様では、作用因子がウィルス性エンドリシンであってもよい。本方法を食品加工状況において使用して、食品加工で使用される、または食品がそれと接触する表面の細菌を検出してもよい。
【００１０】
本方法について述べる説明書と、診断用標的ＲＮＡからのｃＤＮＡ生成物が直接検出されるか、または増幅されるかどうかによって、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ組成物のいずれかとを含む、細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するためのキットもまた提供される。ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ組成物は、次の要素のいずれかを含んでもよい。診断用標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１つのプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、ＲＮアーゼ阻害物質。
【００１１】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および付随する配列説明から、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００１２】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
配列番号：１は、Ｌｉｓ−Ｆプライマーの配列である。
配列番号：２は、Ｌｉｓ−Ｒプライマーの配列である。
配列番号：３は、１６Ｓ−３７３Ｆプライマーの配列である。
配列番号：４は、１６Ｓ−４３６−Ｒプライマーの配列である。
配列番号：５は、１６Ｓ−３９４Ｔタグの配列である。
配列番号：６は、１６Ｓ−２４５５Ｆプライマーの配列である。
配列番号：７は、１６Ｓ−２５２３Ｒプライマーの配列である。
配列番号：８は、１６Ｓ−２４７９Ｔプライマーの配列である。
配列番号：９は、１６Ｓ−１１０８Ｆプライマーの配列である。
配列番号：１０は、１６Ｓ−１１６９Ｒプライマーの配列である。
配列番号：１１は、１６Ｓ−１１２５Ｔプライマーの配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】細菌細胞サンプルからのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物のゲル電気泳動法分析を示す。
【図１Ｂ】細菌細胞サンプルからのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物のゲル電気泳動法分析を示す。
【図２】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＲＴ−ＰＣＲ反応セットのＣＴ値の比較を示す。
【図３】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＰＣＲ反応セットのＣＴ値の比較を示す。
【図４】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＲＴ−ＰＣＲ反応セットの導関数ピーク値の比較を示す。
【図５】細菌細胞サンプルを使用した、３つの異なるＰＣＲ反応セットの導関数ピーク値の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＲＮＡ精製プロセスを省略して、細菌サンプル中の診断用標的ＲＮＡを直接検出することで、サンプル中に存在する細菌タイプを同定してもよい方法について述べる。方法は、細胞の混合群を含有するサンプルからの診断用ＲＮＡ種の迅速な検出が必要な多様な用途において有用である。このような技術の特定の商業用途としては、医学および獣医学診断用分野ならびに食品媒介細菌病原体検出の分野が挙げられる。
【００１５】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、次の略語および定義を使用する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
定義
ここでの用法では、「細菌細胞」という用語は、分析または検出に適したＲＮＡを有するあらゆる原核生物細胞を意味する。本発明の細菌細胞は、生きていても、死んでいても、または破損していても、すなわち細胞壁または細胞膜に中断があってもよい。細菌は、そのあらゆる生活環形態、例えば栄養、静止、または胞子形態にあることができる。
【００１８】
ここでの用法では、「コロニー形成単位」または「ｃｆｕ」という用語は、寒天プレート上にコロニーを生じるサンプル中の細胞数を指す。ｃｆｕはまた、同様のアッセイ・サンプルとの比較で、サンプル中に期待されるコロニーを生じる細胞数を指してもよい。これは単にｃｆｕまたは細胞と称されるｃｆｕ相当数である。同様に細胞またはｃｆｕは、処理または溶解に先だってサンプル中に存在するｃｆｕ相当数も指す。
【００１９】
ここでの用法では「ＲＮＡ」という用語は、ＤＮＡ中に見られるデオキシリボース糖とは対照的にリボース糖を含んでなる核酸分子を指す。ここでの用法ではＲＮＡとは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ならびに調節機能を有する小型ＲＮＡ種をはじめとする、全種のＲＮＡ指す。「小型ＲＮＡ種」は特定の意味を有し、細菌においてハウスキーピングまたは調節役割がある非翻訳ＲＮＡを指す。「小型ＲＮＡ種」はｒＲＮＡでもｔＲＮＡでもない。
【００２０】
ここでの用法では、「ＲＮアーゼ阻害物質」という用語は、ほとんどの細菌細胞によって生成される内在性ＲＮアーゼなどのＲＮアーゼの作用を妨げる能力を有する化学物質またはその他の作用因子を指す。ＲＮアーゼは、ＲＮＡ中のヌクレオチドの開裂を触媒する酵素であるリボヌクレアーゼである。
【００２１】
ここでの用法では、「診断用標的ＲＮＡ」という用語は、特定の細菌の診断となるＲＮＡ分子または断片を指す。
【００２２】
ここでの用法では、「診断用標的ＤＮＡ生成物」という用語は、診断用標的ＲＮＡから転写された、または診断用標的ＲＮＡの転写ＤＮＡコピーをテンプレートとして使用して合成される、ＤＮＡ分子または断片を指す。
【００２３】
ここでの用法では、「逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応」または「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ＲＮＡ配列のコピーである配列によって、ＤＮＡ分子を合成し増幅する技術を指す。ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現の定量分析におけるようにＲＮＡ種を検出するのに有用であり、ならびにクローニング、ｃＤＮＡライブラリー構築、プローブ合成、および原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションにおけるシグナル増幅で使用するためのＲＮＡのＤＮＡコピーを製造するのに有用である。技術は、逆転写（ＲＴ）によるＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特定のｃＤＮＡ増幅の２つの部分からなる。逆転写酵素は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のテンプレートＲＮＡまたはＲＮＡ分子を使用してヌクレオチドの重合を触媒する、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２４】
ここでの用法では、「プライマー」という用語は、相補鎖合成がポリメラーゼによって触媒される条件下に置かれると、テンプレート鎖に沿った核酸合成または複製開始点として作用できる合成または自然発生オリゴヌクレオチドを指す。逆転写の文脈で、プライマーは核酸から構成され、ＲＮＡテンプレートを刺激する。ＰＣＲの文脈で、プライマーは核酸から構成され、ＤＮＡテンプレートを刺激する。
【００２５】
ここでの用法では、「ＲＴ−ＰＣＲ反応組成物」という用語は、診断用標的ＲＮＡ配列に対する特異性を有するプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに要する全ての要素を有する組成物を意味する。場合によりこれらの組成物は、ここで定義されるようなＲＮアーゼ阻害物質を含んでもよい。
【００２６】
ここでの用法では、「ＲＴ反応組成物」という用語は、逆転写酵素、標的ＲＮＡに相補的な核酸プライマー、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡ生成物を合成するのに要する全ての要素を有する組成物を意味し、検出染料またはプローブを含有してもよい。場合によりこれらの組成物は、ここで定義されるようなＲＮアーゼ阻害物質を含んでもよい。
【００２７】
ここでの用法では、「ＰＣＲ反応組成物」という用語は、核酸プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＤＮＡテンプレートを増幅するのに要する全ての要素を有する組成物を意味し、検出染料またはプローブを含有してもよい。場合によりこれらの組成物は、ここで定義されるようなＲＮアーゼ阻害物質を含んでもよい。
【００２８】
ここでの用法では、「増幅生成物」という用語は、プライマー誘導増幅反応中に生成される核酸断片を指す。プライマー誘導増幅の典型的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）またはストランド置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。
【００２９】
ここでの用法では、「ＲＮＡ精製」という用語は、その他の細胞構成要素からＲＮＡを単離するようにデザインされたプロセスを指し、これはまたＲＮＡ抽出とも称される。フェノール−クロロホルム抽出、カラムまたはフィルターへの結合、および沈殿などのステップを含んでもよい、いくつかの異なるＲＮＡ精製プロセスがある。
【００３０】
ここでの用法では、「溶解」という用語は、細胞ＲＮＡまたはＤＮＡへのアクセスまたはその放出を容易にする細胞壁の撹乱または変質を意味する。細胞壁の完全な中断または破損のいずれも溶解の概念の本質的要件でない。
【００３１】
ここでの用法では、「溶菌剤」という用語は、細菌細胞溶解に適した、あらゆる作用因子または条件、または作用因子または条件の組合わせを意味する。溶菌剤としては、酵素（リゾチーム、またはバクテリオファージ溶解酵素など）または化学薬品（クロロホルムなど）、中性洗剤、溶菌性緩衝液、熱が挙げられ、超音波処理、ビーズミル、フレンチプレスの使用などの物理的剪断手段を伴ってもよい。溶菌剤は、当該技術分野でよく知られている。
【００３２】
ここでの用法では、「サーモサイクリング」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲアッセイ中に使用される温度変化パターン全体を指す。このプロセスは一般的であり、当該技術分野でよく知られている。例えば前出のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、およびマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書およびマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，１９５号明細書を参照されたい。一般にＰＣＲサーモサイクリングは、高温での初期変性ステップ、続いてテンプレート変性と、プライマーアニーリングと、ポリメラーゼによるアニールされたプライマーの延長とを可能にするようにデザインされた温度サイクルの反復シリーズを含む。概してサンプルを最初に２〜５分加熱して、二本鎖ＤＮＡを変性させる。次に各サイクルのはじめに使用するサンプルおよび装置タイプ次第で、サンプルを２０〜６０秒変性させる。変性後、プライマーを約４０℃〜約２℃の低温で約２０〜６０秒、標的ＤＮＡにアニールさせる。ポリメラーゼによるプライマーの延長は、約６５℃〜約７２℃の範囲の温度で実施されることが多い。延長にかかる時間は、単位複製配列サイズと増幅に使用する酵素タイプに左右される。現行の大体の目安は、増幅する１ｋｂのＤＮＡあたり１分である。さらにアニーリングと延長ステップを組合わせて、二段階サイクリングをもたらすことができる。ＲＴ−ＰＣＲサーモサイクリング反応は、逆転写反応のために、約３０℃〜７０℃の範囲で約１０〜１５分の初期インキュベーションを含む。サーモサイクリングは、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲアッセイで使用される追加的温度シフトを含んでもよい。
【００３３】
ここでの用法では、「ＣＴ」、「サイクル閾値」、「Ｃｔ」、または「閾値サイクル」という用語は、その中で生成物形成に起因する蛍光の増大が背景シグナルを越える顕著なレベルに達する、サーモサイクリング中のサイクルを指す。
【００３４】
ここでの用法では、「Ｄｅｒ」または「導関数」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ生成物の解離における温度に対する蛍光の変化率の導関数を指し、それはまた導関数ピーク値とも称される。
【００３５】
ここでの用法では、「直接検出」という用語は、標的細菌からのＲＮＡの事前精製がない、診断用標的ＲＮＡ存在のアッセイを指す。
【００３６】
ここでの用法では、「食品加工状況」という用語は、そこで食品単独またはその他の材料との組合わせが操作されて、摂取可能な生成物または副産物のいずれかをもたらす形態にされる、現場内、中、上またはそのそばのあらゆる表面、ならびに現場それ自体を指す。このような状況としては、工業および施設食品加工工場が挙げられるが、これに限定されるものではない。摂取可能とは体内に取り込めることを意味し、摂食プロセスに限定されない。
【００３７】
ここでの用法では、「医学的状況」という用語は、病院、回復療養所、診断試験室、造影センター、および病棟をはじめとするがこれに限定されるものではない、そこで医療従事者が業務遂行する、現場内、中、上またはそのそばのあらゆる表面、ならびに現場それ自体を指す。
【００３８】
ここでの用法では、食品加工状況から採取されたサンプルおよび医学的状況から採取されたサンプルは、上述のようにこれらの状況から細菌を得るあらゆる方法を使用して、ランダムまたは非ランダムサンプリングのあらゆる方法によって得られた細菌内容物のあらゆる部分を指す。
【００３９】
細菌細胞供給源
本発明は、多様なサンプルに適用してもよい、細菌細胞検出のための改善された方法およびキットを提供する。細菌細胞は、生物学的、実験的、医療、農業、工業、環境、食品、または食品前駆物質起源のタイプのサンプル中に検出されてもよい。この一覧は例示的であり網羅的ではない。特に本発明は、疾患の原因物質であるまたはそれであることもある汚染物質または病原体の検出に応用してもよい。食品供給における細菌病原体の拡散および汚染の特別の懸念であることから、食品の加工、取り扱い、および調製領域サンプルが好ましい。
【００４０】
サンプルから検出アッセイのために細菌細胞を得ることは、液体サンプルの収集、固体または半固体サンプルの抽出、表面の拭き取り、またはさらに別の技術を手段としてもよい。既存の濃度がＲＴ−ＰＣＲ反応のための標的ＲＮＡを適切に提供するならば、細菌細胞を直接アッセイしてもよい。代案としては、遠心分離、免疫吸着またはその他の相互作用を通じた表面への結合、または濾過などの方法によって、細菌細胞を濃縮してもよい。さらに濃縮または直接アッセイに先だって、培養プレート上または液体培地中で細胞を生育させ、細菌細胞数を増大させてもよい。
【００４１】
本発明の文脈で適切な典型的な細菌は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、カンプロバクター（Ｃａｍｐｌｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）をはじめとするが、これに限定されるものではないグラム陰性およびグラム陽性細菌である。
【００４２】
本方法および本キットは、食品源、食品加工状況または環境または医学的状況における細菌を検出するのに特に有用である。本方法実施のために最も関心がある食品源としては、調理済みか否かに関わらず肉、魚、家禽などの生鮮食品、乳製品、果物およびこれらの混合物が挙げられる。さらに本方法は、食品が調製される、調製された、調製されるであろう表面の細菌を検出するのに有用である。さらに本方法は、特に医療機関内で疾患の原因を同定し最小化するため、病院、医療センター、回復および養護施設などにおいて、様々な表面の細菌を検出するために有用である。したがって本方法を通じて細菌を検出する
ためのサンプル源としては、食品が調製される、調製された、調製されるであろう表面に接触した物質、および上に列挙した供給源を得るための拭き取りまたはその他の方法などによって医学的状況で表面に接触した物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
標的ＲＮＡ
診断用標的ＲＮＡとしてアッセイされてもよいＲＮＡタイプとしては、細菌細胞のｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、転移−ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはその他のＲＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ｒＲＮＡ種としては、一群の関連細菌に特徴的な１つもしくはそれ以上の部分配列を含有してもよい５Ｓ、１６Ｓ、および２３Ｓポリヌクレオチドが挙げられる。特徴的な部分配列の存在はサンプル中の関心のある細菌タイプを同定し、すなわち検出する。特徴的配列の検出能は変化し、アッセイで検出される細菌の関連性のレベルに左右される。例えばサンプル中のあらゆるリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種の検出は、その部分配列がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のみを検出するのに必要な程度の微細な検出能を有さない、特徴的な部分配列に依存することもある。したがって特徴的な部分配列は、サンプル中の細菌全含有物に対してどの細菌が検出されるかで変化する同定能を有してもよい。このため本方法は広い適応性を有し、診断用標的ＲＮＡのための特定の同定能、または標的として使用されるあらゆるタイプのＲＮＡに限定されない。
【００４４】
所望の関連性のレベルで細菌を適切に区別するユニークな部分配列を含有するならば、その他のＲＮＡポリヌクレオチドを診断用標的ＲＮＡとして使用してもよい。例は、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ種から、ならびに１つもしくはそれ以上の特徴的な部分配列を含む細菌細胞中で生成されるあらゆるＲＮＡから同定できる。
【００４５】
プライマーは、当業者によってデザインされ、逆転写反応中のテンプレートとして標的ＲＮＡを使用したコピーＤＮＡの合成を刺激してもよい。当業者はまた、ＰＣＲ中のテンプレートとしてコピーＤＮＡを使用した標的ＲＮＡのユニークな部分配列の増幅のために、プライマー対をいかにデザインするかを理解する。ＰＣＲで同時に使用されるプライマーは、同様のハイブリダイゼーション融解温度を有すべきであることが、当該技術分野でよく知られている。
【００４６】
細菌細胞内の診断用標的ＲＮＡには、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応組成物がアクセスできるようにしなくてはならない。本発明の一態様では、標的ＲＮＡは、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応条件それ自体を通じてアクセスできるようになる。収集された後、細菌細胞サンプルを反応組成物に直接添加してもよく、次にそれにサーモサイクリングを施す。
【００４７】
代案としては、ＲＮＡ精製なしに、細胞を変性する多様な作用因子または手段でそれらを前処理してもよい。細胞を例えば熱、様々な化学薬品、酵素、中性洗剤および穏やかな物理的剪断への曝露によって前処理してもよい。この前処理は細胞溶解をもたらすことができる。
【００４８】
一態様では、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応組成物への接触に先だって、細菌細胞に溶菌剤を添加してもよい。細菌細胞のための溶菌剤の使用は、当業者によく知られている。溶菌剤としては、化学薬品、酵素、物理的剪断、浸透圧剤、および高温が挙げられるが、これに限定されるものではない。「溶菌性緩衝液」という用語は、少なくとも１つの溶菌剤を含有する緩衝液を意味する。
【００４９】
典型的な酵素的溶菌剤としては、リゾチーム、グルコラーゼ、ザイモロース、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、およびウィルス性エンドリシンとエクソリシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。ウィルス性エンドリシンおよびエクソリシンは、バクテリオファージまたはプロファージ細菌およびこれらの組合わせからのものである。
【００５０】
典型的なウィルス性エンドリシンとしては、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）バクテリオファージ（Ａ１１８およびＰＬＹ１１８）からのエンドリシン、バクテリオファージＰＭ２からのエンドリシン、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳＸからのエンドリシン、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＬｊ９２８、Ｌｊ９６５、およびバクテリオファージピアダ（Ｐｈｉａｄｈ）からのエンドリシン、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリオファージＣｐ−１からのエンドリシン（Ｃｐｌ−１）、およびストレプトコッカス・アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）バクテリオファージＢ３０の二官能性ペプチドグリカンリシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの最後の２つは、異なる細菌種特異性を有する。二成分、すなわちホリン−エンドリシン、スタフィロコッカス・ワーネリー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）ＭファージｖａｒｐｈｉＷＭＹの細胞溶解遺伝子ｈｏｌＷＭＹおよびｌｙｓＷＭＹについてもまた考察される。これらのエンドリシンの組合わせについてもまた考察される。ウィルス性溶解の考察については、特に、参照によって本願明細書に引用したレースナー（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ），ＭＪら、（１９９５年）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｌ ６１：１１５０〜１１５２頁を参照されたい。
【００５１】
物理的剪断を達成する典型的な溶菌剤としては、ジルコニア−シリカビーズ、超音波処理またはフレンチプレスが挙げられる。クロロホルムなどの化学薬品存在下におけるボルテックスなどの物理的剪断の組合わせが、細菌細胞を溶解するさらに別の溶解手段である。さらに上述のように、細胞の溶解において高温もまた効果的である。熱処理に加えた溶菌性緩衝液もまた溶解を改善することもある。
【００５２】
上の作用因子の多くは、サンプル中のどの細胞が溶解されるかに関して非選択的な傾向がある。その結果処理中に、試験サンプル中の混入生物体および天然細菌叢、ならびに検出標的細胞が溶解されることもある。この非特異性は媒質中に放出される細胞ＲＮアーゼの量を増大させ、検出する標的ＲＮＡの安定性および品質を大きく低下させることができる。
【００５３】
対照的に、標的細胞のみを特異的に溶解するウィルス性溶解活性を提供するウィルス性溶菌剤および人工材料は、特定の溶解を遂行する。これはこれらの溶菌剤を使用することで、サンプル中のＲＮアーゼ活性が最小化され、検出するＲＮＡ標的の残存および検出可能性が増強されることを意味する。重要なことには、特定の溶解が所望される応用において、エンドリシン活性を提供するウィルス性エンドリシンおよび人工材料は特に有用である。例えばサンプル内の特定の細菌細胞を溶解することが所望される場合、特定のウィルス性エンドリシンを使用してもよい。特定の細菌細胞を溶解するためのウィルス性エンドリシンの使用は、当該技術分野でよく知られている。細菌細胞の溶解におけるウィルス性エンドリシンの使用は、λエンドリシンを発現する遺伝子の誘導によって容易に溶解され、カリフォルニア州オレンジのザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの市販品である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＸＪａ ＡｕｔｏｌｙｓｉｓＴＭ株によって例示される。
【００５４】
本発明では、用いられる特定の細胞溶菌剤は限定されない。細菌細胞サンプルと共に溶菌剤を使用する場合、ＲＴ−ＰＣＲ検出のためにそのサンプル全体または一部を使用してもよい。サンプルの一部は、細菌細胞１個未満からの標的を含んでもよい。
【００５５】
ウィルス性エンドリシンを使用するほかに、熱による前処理もまた特に有用な場合もある。約５０℃から約１００℃未満の温度範囲におけるサンプルのインキュベーションが、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとしての細菌ＲＮＡのアクセス可能性を改善することもある。この加熱前処理は、インキュベーション温度次第で、約１分〜約６０分の範囲の時間であってもよく、１〜２０分の処理が典型的である。熱処理は、異なる温度における複数のインキュベーションを含んでもよい。熱処理は、下で述べるように、ＲＮアーゼ阻害物質の存在下または不在下であってもよい。特に有用な処理は、約５０℃においてＲＮアーゼ阻害物質の存在下で約５〜２０分、および約９５℃においてＲＮアーゼ阻害物質なしで約１〜５分またはＲＮアーゼ阻害物質ありで約１〜１０分である。
【００５６】
少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質を細菌細胞に添加してもよい。典型的に、阻害物質およびそれらの濃度は、いかなるプライマー誘導増幅プロセスおよび構成要素も妨げないように選択される。ＲＮアーゼ阻害物質は当業者に知られており、イソチオシアン酸グアニジニウムおよびピロ炭酸ジエチルなどの化学薬品と、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのスペラセルン（ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ）ＴＭ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＲＮアーゼブロック、ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害物質、およびタカラ・ミラス・バイオ（Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）からのブタ肝臓ＲＮアーゼ阻害物質などのタンパク質阻害物質と、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からの抗−ＲＮアーゼおよびパンベラ（ＰａｎＶｅｒａ）からのリボヌクレアーゼインヒブ（Ｉｎｈｉｂ）ＩＩＩなどの抗−ヌクレアーゼ抗体と、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）ＴＭおよびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＲＮＡ保護細菌試薬などの試薬が挙げられる。
【００５７】
アッセイ法
本方法では、逆転写単独によって、または逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって、細菌細胞の診断用標的ＲＮＡの存在が試験される。共に使用される場合、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応は、二段階で逐次に、または全反応組成物試薬を細菌細胞サンプルに添加して一段階で共に実施してもよい。
【００５８】
逆転写反応組成物中の細菌細胞サンプルのインキュベーションは、標的ＲＮＡからのコピーＤＮＡの合成を可能にする。ＲＴ組成物は、標的ＲＮＡにハイブリダイズしてコピーＤＮＡ合成を刺激するプライマーを含む。さらにＲＴ組成物は、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、逆転写酵素、および逆転写酵素緩衝液を含む。１つを超える標的ＲＮＡからＤＮＡコピーを作成することが所望ならば、１つを超えるプライマーが含まれてもよい。さらにＲＴ組成物は、ここで述べられるように場合によりＲＮアーゼ阻害物質を含有してもよい。
【００５９】
逆転写反応の生成物は直接検出してもよく、または逆転写されたテンプレートからの所望のＤＮＡセグメントの合成を開始する一対のプライマーを含むＰＣＲ組成物を含有する別の分析管に、この反応のサンプルを移してもよい。さらにＰＣＲ組成物は、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリメラーゼ緩衝液を含有する。複数セグメントのＤＮＡ合成が所望されるならば、１対を超えるプライマーが含まれてもよい。また第２のプライマー対として、元のＲＴ−ＰＣＲプライマート共にＤＮＡセグメントを増幅する単一の新しいプライマーが添加されてもよい。
【００６０】
使用される追加的逆転写酵素としては、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からのＨＩＶ逆転写酵素、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）からのトランスクリプター逆転写酵素、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのサーモスクリプト（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。使用してもよい追加的ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、およびエピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）からのセキサーム（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲを二段階または一段階で実施するかどうかにかかわらず、ＲＴステップは最初に実施され、典型的に約３７℃〜約７０℃の温度での単一温度インキュベーションからなる。当業者には知られているように、異なるＲｔ酵素および異なるプライマーでは、異なる温度が適切である。引き続くＰＣＲ反応は、典型的に約９４℃〜約９６℃で約６〜約１５分の初期インキュベーションからなる。このステップはｃＤＮＡを変性させ、また熱活性化Ｔａｑポリメラーゼ酵素を活性化させるために使用される。次にこれにｃＤＮＡ標的増幅の複数サイクルが続く。
【００６２】
各サイクル中に、標的変性、プライマーアニーリング、およびプライマー延長の３つの操作が実施される。標的変性は、典型的に約９０℃を超える温度で起きる。プライマーアニーリング温度は、反応で使用される特定のプライマーの融解温度によって定まり、プライマー延長は、使用される熱安定性ポリメラーゼ次第で約６０℃〜約７２℃の範囲の温度で実施される。プライマーアニーリングおよび延長が同一温度で実施される場合、これは３つの各ステップが異なる温度で起きる３温度ＰＣＲに対して、２温度のＰＣＲである。増幅相が完了した後、全ての増幅生成物の合成を確実にするよう最終延長時間が典型的に追加される。
【００６３】
本発明はまた、本直接検出法を利用するキットも提供する。キットはＲＴ−ＰＣＲ組成物またはＲＴ−組成物を使用して本方法を実施し、それぞれＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ反応生成物のいずれかを得て生成物を増幅するための説明書を含む。代案としては、説明書は、そのさらなる増幅なしのＲＴ−生成物の直接検出に関わる。さらにキットは、サンプルとの接触時にそれぞれＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ反応混合物をもたらす、ＲＴ−ＰＣＲ組成物またはＲＴ組成物のいずれかを含有してもよい。
【００６４】
ＲＴおよびＲＴ−ＰＣＲ生成物の検出
本発明は検出法に関して限定されず、ＲＴまたはＲＴ−ＰＣＲ反応の生成物を検出するあらゆる方法によって使用されてもよい。
【００６５】
ＲＴ生成物検出
ＲＴ反応のｃＤＮＡ生成物を直接に検出する方法は、当業者によく知られており、ｃＤＮＡ生成物に組み込むか、または付着する標識を利用する。使用してもよいシグナル発生標識は当該技術分野でよく知られており、例えば蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、または発光部分または分子が挙げられる。
【００６６】
蛍光部分、特に核酸に付着して蛍光シグナルを放出できる蛍光染料が特に有用である。フルオレセイン、テキサスレッド、およびローダミンなどの多様な染料が当該技術分野で知られている。特に有用なのは、例えばどちらもイリノイ州アーリントンハイツのアマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））から市販される単反応性染料Ｃｙ３およびＣｙ５である。標識ＤＮＡを特異的に検出するより感度の良い方法は、ナイロン膜またはガラススライドなどのマトリックス中に固定化された標的ＤＮＡ配列分子に、生成物をハイブリダイズすることである。次にハイブリダイゼーション後のシグナルを適切なフィルター付きのレーザースキャナーでスキャンして、使用した特定染料を検出できる。これは当該技術分野、特にＤＮＡマイクロアレイ技術で良く知られている。
【００６７】
ＲＴ反応におけるその合成中に標識をｃＤＮＡに組み込んでもよく、またはそれをｃＤＮＡ生成物の合成後に付着してもよい。例えばＲＴ反応を標識プライマーと共に実施できる。１つのタイプの標識プライマーは、多数のシグナル発生分子を有する付着粒子を有する。染料−標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰなどの標識ヌクレオチドを使用した逆転写は、転写された核酸中に標識を組み込む。代案としては合成後カップリング反応を使用して、ｃＤＮＡ生成物を検出できる。
【００６８】
核酸に標識を付着することは当業者によく知られており、例えばニックトランスレーションによって、または例えば標識ＲＮＡでの末端標識によって、またはキナーゼでの核酸の処理と、それに続く例えばフルオロフォアなどの標識にサンプル核酸を連結する核酸リンカー付着によって行われてもよい。別の標識方法では、ＲＴ反応からのＤＮＡ生成物は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写反応へのカップリングによって増幅される。例えばＴ７プロモーター領域は、ＲＴ反応に使用されるプライマー中に組み込まれる。次にＴ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットを使用して大量のＲＮＡを発生させ、検出感度を増大できる。Ｔ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットは、テキサス州オースティン２１３０ウッドワードのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ（２１３０ Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））またはその他の販売元から購入できる。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲ検出
ＲＴ−ＰＣＲ生成物検出の方法は、ゲル電気泳動分離および臭化エチジウム染色、または生成物中の組み込まれた蛍光標識または放射標識の検出を含む。増幅生成物の検出に先だって分離ステップを必要としない方法もまた、使用してもよい。これらの方法は一般に、リアルタイムＰＣＲまたは均質な検出と称される。ほとんどのリアルタイム法は、サーモサイクリング中に蛍光変化をモニタリングして、増幅生成物の形成を検出する。これらの方法としては、カリフォルニア州フォスターシティ９４４０４のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４））からのタクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）二重標識プローブ、ティヤギ（Ｔｙａｇｉ）Ｓおよびクレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ＦＲ（１９９６年）著、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：３０３〜３０８頁の分子ビーコン、およびオレゴン州ユージーン９７４０２−０４６９のモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ ９７４０２−０４６９））からのＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの該均一法のいくつかは、増幅生成物の終点検出にも使用できる。このタイプの方法の例は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料解離曲線分析である。解離曲線分析では、蛍光モニタリングと組合わせた、概して約６０℃〜９０℃の温度での最後の緩慢な傾斜から、融点、ひいては増幅生成物の存在を検出できる（リリー（Ｒｉｒｉｅ）ら（１９９７年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４５：１５４〜６０）。
【実施例】
【００７０】
続く実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のためにのみ提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を見極められ、その精神と範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適合するように本発明の様々な変更および修正ができる。
【００７１】
一般方法：
実施例で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野で良く知られており、Ｊサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、ＥＦフリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９年、ＴＪシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、ＭＬベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬＷエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８４年、およびＦＭオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」グリーン Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９８７年で述べられている。細菌培養の維持および生育に適した材料および方法もまた、当該技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ｐゲアハルト（Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、ＲＧＥマレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ＲＮコスティロウ（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ＥＷネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ＷＡウッド（Ｗｏｏｄ）、ＮＲクリーグ（Ｋｒｉｅｇ）、およびＧＢフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９４年、またはＴＤブロック（Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、１９８９年。
【００７２】
細菌細胞の生育および維持のために使用した全ての試薬、制限酵素、および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントスイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
【００７３】
本願明細書で使用した略語の意味は次の通り。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味する。「ＯＤ６５０」は、６５０ｎｍで測定した光学濃度を意味し、「ＯＤ２６０／ＯＤ２８０」は２６０ｎｍで測定した光学濃度と２８０ｎｍで測定した光学濃度との比率を意味する。
【００７４】
次の酵素および試薬は、次の供給メーカーから購入した。
カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））：マルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（カタログ番号４３１１２３５）、ＲＮアーゼ阻害物質（２０Ｕ／μＬ）（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ１０× ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ）（カタログ番号Ｎ８０８−０１９０）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（カタログ番号Ｎ８０８−０１９０）。
インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））：ファストスタ
ート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号２０３２９３７）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（カタログ番号２０３２９３７）。
テキサス中ウッドランドのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））：オリゴヌクレオチド。
カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））：２％二重ＣｏｍｂアガロースＥ−ゲル（Ｃａｔ＃Ｇ６０１８−０２）、２％単一ＣｏｍｂアガロースＥ−ゲル（カタログ番号Ｇ５０１８−０２）、Ｅ−ゲル低量範囲定量的ＤＮＡラダー（カタログ番号１２３７３−０３１）。
カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））：ＲＮアーゼ−フリーＤＮＡ分解酵素セット（カタログ番号７９２５４）。
ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（カタログ番号Ａ３２９４）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（カタログ番号Ｄ８４１８）、カーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）（カタログ番号Ｐ５４１３）、トレハロース（カタログ番号Ｔ９５３１）。
ニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））：トリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）（カタログ番号２２１２９３）、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（カタログ番号２９７８１１）、リン酸緩衝液（カタログ番号２９２７８６）、脳心臓浸出物培地（ＢＨＩ）（カタログ番号２２０８３７）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭフレーザー・ブロス・ベース（カタログ番号２１１７６７）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭＵＶＭ変性リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）増菌ブロス（カタログ番号２２２３３０）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭパルカム（ＰＡＬＣＡＭ）培地ベース（カタログ番号２６３６２０）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭオックスフォード培地ベース（カタログ番号２２２５３０）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭフレーザー・ブロス・サプリメント（カタログ番号２１１７４２）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭオックスフォード抗菌剤サプリメント（カタログ番号２１１７６３）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ＴＭＤ／Ｅ中和ブロス（カタログ番号Ｂ０１２５６）。
ニューヨーク州のオグデンズバーグのオキソイド（Ｏｘｏｉｄ（Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ））：パルカム（ＰＡＬＣＡＭ）プラス・ブロス。
【００７５】
次の試験キットおよび試薬は、次の供給メーカーから購入した。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（カタログ番号７４１０６）、メリーランド州ハノーバーのフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ））からのＤＥＰＣ（ピロ炭酸ジエチル）処理水（カタログ番号Ｒ０６０１）。
【００７６】
全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、テキサス中ウッドランドのシグマ・ジェノシス社（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））によって合成された。ポリメラーゼ連鎖反応および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズからの（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００配列検出システム、およびマサチューセッツ州ウォルサムのＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））からのＰＴＣ−２５５ペルチェ・サーマル・サイクラーを使用して実施した。
【００７７】
遺伝的配列は、メリーランド州フレデリックのインフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ））からのベクターＮＴＩアドバンス９で分析した。配列はメリーランド州ベセズダの国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）からダウンロードした。プライマー配列は、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用して、ダウンロードした配列に対して位置合わせした。
【００７８】
実施例１
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞培養物およびｃｆｕ判定
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（菌株ＣＬＩＰ １１２６２）（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−６８０、）はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）をＢＨＩ培地で水分補給した。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の培養物をＴＳＡ上に播種して３５℃で生育させ、次に４℃で保存した。
【００７９】
ＴＳＡプレートからリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のコロニーを取り出して、ＴＳＢに入れた。ニュージャージー州エディソンのニューブ・ランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））からの培養振盪機（モデルＧ２４）に、ＴＳＢを含有する試験管を３１℃で１８時間入れた。細胞数推定のために、この培養物１ｍＬを取り出して、カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））からのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ−７５００分光光度計に入れた。吸光度を使用して細胞濃度を近似し、６００ｎｍで読み取った。参照として１．０の吸光度を使用し、約１．０×１０９細胞／ｍＬが示唆された。
【００８０】
原液中の細胞数を判定するため、１：１０希釈のために別の１ｍＬの培養物を９ｍＬのリン酸緩衝液に移して、希釈細胞サンプルを調製した。これを８回繰り返して、連続希釈物を得た。１：１０００００、１：１００００００、および１：１０００００００希釈物からそれぞれ１００μＬをＴＳＡ上に播種して、原液毎ｍＬあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を得た。イリノイ州シカゴのプレシジョン・サイエンティフィック・グループ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）からの重力対流培養器にＴＳＡプレートを３５℃で４８時間入れた。３０〜３００ｃｆｕを含有するプレートを使用し、ｃｆｕ数に希釈率を乗じて０．１で除して、プレートに入れた１００μＬを計上し、原液濃度を判定した。得られた値はｃｆｕ／ｍＬを表す。
【００８１】
実施例２
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ホールセルサンプル中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
この実施例では、細菌細胞上で前溶解ステップなしに、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の単一ステップＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。
【００８２】
実施例１に示すように、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞（３．６×１０８ｃｆｕｓ／ｍＬ）の一晩培養物を調製して希釈した。試験用細胞サンプルを調製するために、ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ・バイオピュア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｐｕｒ）チューブ（カタログ番号２２６０００４−４）に、１：１０００〜１：１０００００００００希釈物からの１ｍＬのアリコートを入れ、次にそれをニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｄ遠心分離器内で、高速（１３，２００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した。サンプルからリン酸緩衝液を除去した。
【００８３】
５μＬのＲＮアーゼ阻害物質（１００Ｕ）を４５μＬのＤＥＰＣ処理水に添加して、細胞希釈剤を調製した。この５０μＬの溶液をリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞ペレットを含有する各バイオピュア（Ｂｉｏｐｕｒ）チューブに添加した。各チューブをペンシルベニア州ウェストチェスターのＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））からのミニ・ボルテクサー（Ｍｉｎｉ Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）上で高速（速度１０）で１５秒間ボルテックスした。希釈細菌細胞を含有するチューブを即座に氷にのせた。
【００８４】
４５μｌを５０μｌの最終反応容積に添加すると次の最終濃度をもたらすように、ＲＴ−ＰＣＲのための原液反応ミックス（Ａ）を調製した。
１）１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ
２）２ｍＭ ＭｇＣｌ２
３）２００μＭヌクレオチド
４）２４μｇ ＢＳＡ
５）ＤＭＳＯ（最終濃度１％）中のオレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））からのＳＹＢＲグリーン（１０，０００×、カタログ番号Ｓ７５６７）の１：１０，０００希釈物
６）６００ｎＭの順方向プライマーＬｉｓ−Ｆ（５’ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴ３’、配列番号：１）および２μＭの逆方向プライマーＬｉｓ−Ｒ（５’ＡＡＧＣＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＡＴＣＣＴ３’、配列番号：２）。プライマー配列はゾマー（Ｓｏｍｅｒ）およびカシ（Ｋａｓｈｉ）（２００３年Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．６６：１６５８〜１６６５頁）からのもの。
７）２．５単位のファストスタート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび１．２５単位のマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（Ｒｔ）８）１．８６ｍＭのカーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）
９）３６０．５ｍＭのトレハロース
１０）２０単位のＲＮアーゼ阻害物質
ＰＣＲ反応では、Ｒｔ酵素を添加しなかったこと以外はＲＴ−ＰＣＲミックスと同様にして、第２の反応ミックス（Ｂ）を調製した。
【００８５】
反応をカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのマイクロアンプ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ）光学９６−ウェル反応プレート（カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）内で実施した。ＲＴ−ＰＣＲでは、４５μＬの反応ミックスＡをウェルに添加して、ＲＮＡおよびＤＮＡ双方の存在を判定した。ＰＣＲでは、４５μＬの反応ミックスＢをウェルに添加してＤＮＡのみの存在を判定した。
【００８６】
表１および２に列挙するように、各希釈細菌細胞サンプルの５μＬサンプルを反応ミックスに添加した。全反応は各希釈物について３連で行った。
【００８７】
キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）のＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・キットを使用して、１．０×１０８ｃｆｕを含有するサンプルを抽出し、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ＲＮＡの陽性対照サンプルを調製した。次にキット製造業者が述べるようにして抽出ＲＮＡをＤＮＡ分解酵素処理して、５０μＬのＤＥＰＣ処理水の最終容積にした。デラウェア州ロックランドののナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＤＥ））からのナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）分光光度計を使用して、ＲＮＡ濃度（１６ｎｇ ＲＮＡ／μｌ）を判定した。次にこの濃縮ＲＮＡを希釈して、対照反応あたり８０ｐｇ添加した。このＲＮＡ対照をＲＴ−ＰＣＲ反応の陽性対照として使用した。ＲＮＡはＤＮＡ分解酵素処理されたので、ＰＣＲ反応の陰性対照としても使用された。さらに陰性標的なし対照として５μＬのＤＥＰＣ処理水を使用した。
【００８８】
プレートをカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）光学接着カバー（カタログ番号４３１１９７１）で密封し、それをニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離器５８０４内で遠心分離した。次の条件を使用して、ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００内で、サンプルをサーマルサイクルにかけた。
５０℃で１０分間（ＲＴステップ）、
９５℃で６分間（Ｔａｑ活性化ステップ）、
９５℃で３０秒間（変性させるステップ）、
６６℃で１分間（アニールおよび延長ステップ）、
変性およびアニールステップの反復３４回、
６６℃で５分間、
解離プロトコル（融解曲線）。
サーモサイクリング中に、反応生成物形成のＣＴ値を判定した。反応に続いて、融解曲線分析およびアガロース・ゲル電気泳動法による分離の双方を使用して、生成物形成を分析した。ドイツ国のワットマン・バイオメトラ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｇｅｒｍａｎｙ））からの低電圧電源（モデル２５０ＥＸ）に接続され、６０Ｖで２０分作動する、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＥ−ゲルベース中の２％単一ＣｏｍｂアガロースＥ−ゲル（カタログ番号Ｇ５１００−０１）上で、サンプルを泳動した。ニューヨーク州ロチェスターのコダック・デジタル・サイエンス（Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））からのコダック（Ｋｏｄａｋ）イメージ・ステーション４４０ＣＦ上でＥ−ゲル画像をキャプチャして、次に観察し正しいサイズのＲＴ−ＰＣＲ生成物（４０２ｂｐ）の存在または不在を判定した。
【００８９】
低量範囲定量的ＤＮＡラダー（バンドは上から下に２０００ｂｐ、８００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、および１００ｂｐ）と並べて、細菌細胞サンプルのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応からの反応生成物を図１に示す。４０２ｂｐの予測反応生成物は、細菌細胞サンプルからのＲＴ−ＰＣＲ（レーン２〜５に見られる）およびＰＣＲ（レーン１２および１３、そして非常に薄くレーン１４に見られる）反応、精製されたＲＮＡ（レーン１）との対照ＲＴ−ＰＣＲ反応の双方で増幅された。
【００９０】
反応生成物形成はまた、ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００解離データでも見られた。解離プロトコルでは温度が上昇して増幅されたＤＮＡ鎖の分離が引き起こされ、変化する蛍光がもたらされる。ＤＮＡ鎖が溶解分離する温度領域に対してピークを生じ、存在する増幅ＤＮＡの量に比例するこの蛍光変化率の導関数を取る。誘導体ピーク値を増幅生成物存在の定性的測定として使用する。３００を超える導関数をＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲの結果としての生成物形成の陽性指標と見なした。表１および２のサンプル２〜５、および１２〜１４の高い導関数値は、サンプル１の対象と同じく増幅されたＤＮＡ生成物が存在したことを示唆した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
【表３】
【００９３】
ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００からのサイクル閾値（ＣＴ）データは、標的の存在量に反比例する。細胞なしおよび水サンプルからは、３２〜３４のＣＴ値が背景レベルであると判定された。表１および２のサンプル２〜５、１２および１３で示された２７以下のＣＴ値は、成功した増幅反応を示唆した。サンプル１４の３１．３９のＣＴ値もまた、背景よりやや下であった。生成物形成は、反応に添加された細胞数と正比例した。サンプル１２対２および１３対３を比較すると、ＰＣＲ対ＲＴ−ＰＣＲ反応中の同一細胞数について、およそ５のＣＴ値の違いを示した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の検出下限値は３．６×１０１細胞であり、一方ＰＣＲ反応の検出下限値は３．６×１０２細胞であった。これらの結果は、細菌細胞ＲＮＡがＲＮＡ精製または事前細胞溶解なしに、ＲＴ−ＰＣＲ検出のために容易に利用できたことを実証する。
【００９４】
実施例３
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のホールセルサンプルにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ標的検出の再現性
実施例１同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）培養物を一晩生育させて処理した。細胞サンプルを実施例２と全く同じ条件下で、２つの追加的実験で（異なる日に）試験した。
【００９５】
１、８、および１３日目に実施した実験からのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応のＣＴ値のプロットを図２および３に示す。実施した実験からの反応あたりの細胞数は、１日目に３．６×１０４〜３．６×１０−１、８日目に３．２×１０４〜３．２×１０−１、および１３日目に７．５×１０４〜７．５×１０−１の範囲に及んだ。プロットは、ＣＴ値が異なる実験間で接近して再現されたことを示す。同一反応の導関数ピークデータを図４および５に示す。これらのデータのプロットはまた、データが再現されたことを示した。双方のタイプのデータは、ＲＮＡがＲＮＡ抽出または事前細胞溶解なしにリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）細菌細胞から直接検出できることを示唆した。
【００９６】
実施例４
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ホールセルサンプル中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出のための前処理
実施例１と同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞を調製した。実施例２と同様に細胞サンプルを遠心分離して、ＲＮアーゼ阻害物質を含有する水に再懸濁した。この実施例では、５０μＬあたり１０５〜１００細胞の濃度範囲に及ぶ３組の細胞サンプルを調製した。１つの組は前処理なし対照として、試験に先だって氷上に保持した。第２のサンプルの組は、ペンシルベニア州ウェストチェスターのＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））からの５０℃熱ブロックに５分間のせて、次に試験に先だって氷上に保持した。第３のサンプルの組は、９５℃熱ブロックに１分間にのせて次に氷にのせた。この組を使用して細胞の高温熱処理の効果を評価した。実施例２と同様にＲＴ−ＰＣＲ試薬反応ミックス（Ｒｔあり）およびＰＣＲ試薬反応ミックス（Ｒｔなし）を調製した。各試験組からの５μＬをＲＴ−ＰＣＲ試薬反応ミックスに添加して、各試験組からの追加的５μＬをＰＣＲ試薬反応ミックスに添加した。ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応を三連で実施した。次に実施例２と同様に、試験反応をＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００内でサーマルサイクルにかけた。
【００９７】
この実験び融解曲線導関数ピークデータを次の表３および４に列挙する。表３および４に示された結果は、細胞前処理がＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲアッセイに悪影響を及ぼさなかったことを実証する。導関数ピーク値は前処理サンプルならびに対照中の生成物増幅を示した。実施例２と同様に、３００を超える導関数ピーク値から生成物形成が推測された。ＲＴ−ＰＣＲ反応中に２．５２×１０１細胞があるサンプル中に生成物を検出した一方、ＰＣＲ反応中に２．５２×１０２細胞があるサンプル中に生成物が検出され、実施例２と同様に細菌細胞ＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲ検出に容易に利用できることが示唆された。
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
実施例５
ＲＴ−ＰＣＲにおける直接１６Ｓ ｒＲＮＡ標的検出と単離ＲＮＡ標的検出との比較
実施例１および２と同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細菌細胞を調製して希釈した。次にキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・キット（ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・ハンドブック、２８頁、５６〜６０頁）ＲＮＡ抽出キットを使用して、これらの細胞からのＲＮＡを単離した。具体的には、ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））からのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｄ遠心分離器内で、各細胞サンプル希釈物からの１ｍＬを１０分間遠心分離（１３，２００ｒｐｍ）した。リン酸緩衝液を除去し、次にキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコル（ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニ・ハンドブック）に従って細菌細胞を１０分間溶解した。次に溶解サンプルをカラム内のキット・シリカ−ゲルベースの膜に添加して、ＲＮＡを結合させた。任意のＤＮＡ分解酵素処理は実施しなかった。５０μＬの水をカラムに添加して、ＲＮＡを膜から溶出した。溶出剤を再適用して膜から溶出し、溶液中のＲＮＡを濃縮した。次にこの回収されたＲＮＡを試験まで氷にのせた。
【０１０１】
比較のために、水およびＲＮアーゼ阻害物質中で希釈細菌細胞サンプルの２つの追加的シリーズを調製し、実施例４と同様に（５０℃で５分間または９５℃で１分間）前処理した。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）キットによって抽出された単離ＲＮＡ、および熱処理細胞を実施例２で詳述するようにＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応で分析した。
【０１０２】
ＣＴ値および融解曲線導関数値によって測定されたこれらの反応から得られたＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物をそれぞれ、表５、６、および７、８で報告する。ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ応答（ＣＴまたは融解曲線導関数値）のいずれにおいても直接細菌細胞検出法と比べて、精製ＲＮＡの利点は見られなかった。実際のところ、熱処理細菌細胞サンプルは、精製されたＲＮＡ、特に９５℃で１分間加熱されたものよりもやや良い（より低い）ＲＴ−ＰＣＲ ＣＴ値を有した。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
実施例６
直接標的ＲＮＡ検出のための熱前処理細胞サンプルに対するＲＮアーゼ阻害物質の効果
実施例１と同様にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞を生育させ、リン酸緩衝液中で１：１００００に希釈した。実施例２と同様に希釈細胞の１ｍＬアリコート１４個を取り出して調製し、サンプルの半数を４５：５の水：ＲＮアーゼ阻害物質（１００Ｕ）ミックス５０μＬに再懸濁し、もう半数はＲＮアーゼ阻害物質添加なしの水５０μＬのみに再懸濁した。全サンプルをボルテックスした。
【０１０８】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイに先だって、各サンプルの組（ＲＮアーゼ阻害物質ありおよびＲＮアーゼ阻害物質なし）からの１本のチューブをゼロ時間陽性対照として氷上に保持した。実施例４と同様に残りのチューブを５０℃熱ブロックにのせた。１分、２分、５分、１０分、１５分、および２０分の各時点で、各処理条件からの１本のチューブを熱ブロックから取り去って氷上にのせた。
【０１０９】
実施例２で述べられるように、４５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応混合物のアリコートを９６−ウェルプレートに入れた。各５０℃熱処理サンプルおよび対照から５μＬのサンプル３個を取り、４５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応混合物に添加して、実施例２で述べられるように反応をサーモサイクルにかけた。これらの反応のＣＴ値を表９に、融解曲線導関数ピーク値を表１０に示す。
【０１１０】
表９に示すように、５０℃で５分間のインキュベーション後、ＲＮアーゼ阻害物質ありのサンプルとＲＮアーゼ阻害物質なしのサンプルの間にＣＴ値の相違が見られた。ＲＮアーゼ阻害物質ありのサンプルのより小さいＣＴ値は、ＲＴ−ＰＣＲにとって利用可能性がより高い標的ＲＮＡの在を示唆した。したがってＲＮアーゼ阻害物質存在での５０℃で５分以上の処理は、ＲＴ−ＰＣＴアッセイにおける細菌細胞ＲＮＡの利用可能性を増大させる。
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
上述のようなＲＮアーゼ阻害物質ありまたはなしの細菌細胞サンプルを９５℃で同一時間加熱し、次に上記のようにＲＴ−ＰＣＲでアッセイした。これらの処理のＣＴ値および融解曲線導関数ピーク値のＲＴ−ＰＣＲ結果をそれぞれ表１１および１２に報告する。
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】
ＣＴ値は、ＲＮアーゼ阻害物質なしの９５℃で１〜５分の熱処理が、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＲＮＡテンプレート利用可能性を増大させることを示唆した（対照よりも低いＣＴ値）。ＲＮアーゼ阻害物質ありの９５℃で１〜１０分の処理は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＲＮＡテンプレートの利用可能性を増大させた。
【０１１７】
５０℃および９５℃での処理の双方における経時的ＲＴ−ＰＣＲ応答は、いくらかの経時的ＲＮＡ分解を示唆したが、導関数応答によって示唆されるように、ＲＮＡ増幅は、双方の処理条件下において試験した全時点で起きた。この結果は、ＲＴ−ＰＣＲ直接細菌細胞検出にＲＮアーゼ阻害物質は必要でないが、ＲＮアーゼ阻害物質が存在すれば、それは応答を増強できることを実証する。したがってＲＮアーゼ阻害物質ありまたはなしで、双方の熱処理下においてＲＮＡが検出されたが、ＲＮアーゼ阻害物質が存在するとより多くのＲＮＡが利用できた。
【０１１８】
実施例７
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
ニューヨーク州オグデンズバーグのオキソイド（Ｏｘｏｉｄ，Ｌｔｄ．（Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ））からの０．３％グルコース添加デミ−フレーザー培地プラス（カタログ番号ＣＭ０１５３）中でリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞を３７℃で生育させた。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上でプレートカウントを実施した。
【０１１９】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌの０．３％グルコース添加デミ−フレーザー培地にリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）を接種して、３７℃で一晩インキュベートした。１００μｌの一晩培養物を新鮮な培地に移し、ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））からのウルトラ・スペック（Ｕｌｔｒａ Ｓｐｅｃ）３０００を使用してＯＤ６５０を測定した。培養物をＯＤ６５０が０．５（対数中期）に達するまで３７℃でインキュベートして、３３μｌの培養物をテキサス州オースティンのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））からの９６７μｌの氷冷ＰＢＳ（アンビオン・セル・トゥｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃＤＮＡ）キット、カタログ番号１７２２）に移した。ノースカロライナ州アシュビルのケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ））からのヘレウス・バイオフュージ・ピコ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｐｉｃｏ）内において、１３，０００ｒｐｍで１分の遠心分離によって細胞をペレット化して、次に１００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁した。細胞を氷冷ＰＢＳ中で１：１０に希釈し、次にテキサス州オースティンのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））からのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶菌性緩衝液（アンビオン・セル・トゥｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃＤＮＡ）キット、カタログ番号１７２２）中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに連続１：１０希釈を作成した。
【０１２０】
プレートカウントを実施するために、ＰＢＳ中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに別の連続１：１０希釈の組を作成した。およそ１０３および１０２細胞／ｍｌの希釈物から、１００μｌをＢＨＩ寒天プレート上に播種した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、プレートあたりのコロニー数を計数して希釈物あたりのｃｆｕを判定した。
【０１２１】
およそ１０５細胞／ｍｌ〜１０２細胞／ｍｌを含有するアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶菌性緩衝液中の各希釈物から、９０μｌの希釈細胞を０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブに移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１０分間、細胞をインキュベートした。下で述べられるように、得られた細胞サンプル溶解産物をＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１２２】
ＢＡＸ溶解法によるホールセル溶解産物調製
ペレット化した細胞を最初に１：１０でなく１：５に希釈し、次に上のように最終濃度およそ２×１０２細胞／ｍｌに１：１０連続希釈したこと以外は、上述のように培養物を生育させ調製した。同一培養物を使用して双方の希釈物および溶解産物の組を調製したので、双方の溶解法で上のプレートカウントを使用した。０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のデラウェア州ウィルミントンのデュポン・クアリコン（ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））からの１００μｌのＢＡＸ溶菌性緩衝液（リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属スクリーニング用ＢＡＸシステムＰＣＲアッセイ、カタログ番号１７７１０６１０）に、およそ２×１０６細胞／ｍｌ〜２×１０３細胞／ｍｌを含有するＰＢＳ中の各希釈物から５μｌの希釈細胞を添加した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内で、細胞を５５℃で１時間、次に９５℃で１０分間インキュベートした。得られた細胞サンプル溶解産物を下のＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１２３】
ＲＴ−ＰＣＲ
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの配列検出システム（ＳＤＳ）装置（モデル７９００）上、でリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのプライマー・エクスプレスｖ２．０ソフトウェアを使用して、標準設定を使用して、リアルタイムプライマーおよびプローブをデザインした。逆転写酵素ありまたはなし（＋または−Ｒｔ）の双方で、次のように２０μｌ反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの１０μｌのタクマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ ２×マスター・ミックス（＃４３２４０１８、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ含有）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．４μｌのＲＮアーゼ阻害物質（＃Ｎ８０８−０１１９、２０Ｕ／μｌ）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０１μｌのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（＃４３１１２３５）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．１μｌの１６Ｓ−３７３Ｆ １００μＭプライマー（５’ＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴ：配列番号：３）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．２μｌの１６Ｓ−４３６Ｒ １００μＭプライマー（５’ＴＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡ：配列番号：４）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０５μｌの１６Ｓ−３９４Ｔ １００μＭタクマン（ＴａｑＭａｎ）ＴＡＭＲＡプローブ（＃４５００２５、６ＦＡＭ−ＡＣＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧ：配列番号：５）、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフＡＧ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの７．２４μｌの分子生物学等級水＃００３２００６．３０２）、および２μｌのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。Ｒｔなしで反応を実施し、溶解産物中に存在する検出可能量のＤＮＡを判定した。２つの最高濃度溶解産物のみをＲｔなしで使用した。
【０１２４】
反応を次のようなサーマルサイクルにかけた。５０℃で１０分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒＋６０℃で１分を４０サイクル。サーモサイクリングに先だって、その近接性のため３’ＴＡＭＲＡ染料によって、タクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）プローブの５’末端上の６−ＦＡＭリポーター染料蛍光を効果的にクエンチする。サーモサイクリング中に、ＰＣＲプライマー結合部位の１つの上流の増幅生成物の１本の鎖に、プロ
ーブが結合した。アンプリタク・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）（登録商標）によってＰＣＲプライマーが延長するに連れて、それはその５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を通じてプローブを切断する。プローブの開裂はリポーターとクエンチャー染料を分離し、リポーター染料蛍光の増大をもたらす。リポーター染料蛍光をＳＤＳ装置によって捕集する。７９００ ＳＤＳ装置は、リポーター蛍光のほとんどがクエンチされる最初の少数のサーマルサイクルからの背景蛍光に対して、蛍光の増大を比較する。次にソフトウェアが全サンプルについて、背景蛍光を顕著に越える点でＣＴ値を判定する。
【０１２５】
表１３に示されるＣＴ値は、精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従う。１：１０希釈シリーズにわたり標的ＲＮＡ量としてＣＴに用量反応または増大があり、またはＤＮＡが減少した。この結果は、サンプルが希釈されると、リポーター蛍光が装置によって判定される閾値に達するのにより長い時間がかかることを意味する。したがって溶解リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細菌細胞サンプルの直接アッセイは、精製された核酸サンプルから予期される検出と比較できるパターンで、ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出を示した。
【０１２６】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解データに見られるより低いＣＴ値は、ＢＡＸ溶解法と比較してこの溶解法が、増幅のためのＲＮＡテンプレートを提供するのにより効率的であったことを示唆する。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
（＋）Ｒｔ反応で観察される（−）Ｒｔ反応と比べてより低いＣＴ値は、これらの反応において高いコピーＲＮＡ数が検出されたことを示唆した。増幅生成物の倍増はＰＣＲ反応の各サイクル中に起きるので、（＋）と（−）Ｒｔ反応間のＣＴ値の差またはΔＣＴは、式：２^−ΔＣＴによって相関できる（ΔＣｔはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ユーザー広報＃２、１９９７年１２月による）。この式を使用して、（−）Ｒｔ反応におけるテンプレートＤＮＡコピー数に対する、（＋）Ｒｔ反応におけるテンプレートＲＮＡコピー数の差を計算した。値を表１４に示す。これらの計算値は、溶解細胞サンプル中のテンプレートＤＮＡよりもおよそ１００〜２００倍より多くのテンプレートＲＮＡコピーがあったことを示唆した。
【０１２９】
【表１５】
【０１３０】
この実施例は、ＲＮＡまたはＤＮＡ精製を要求しないここで述べられる溶解手順が、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な標的ＲＮＡレベルを発生させることを示す。
【０１３１】
実施例８
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
ニューヨーク州オグデンズバーグのオキソイド（Ｏｘｏｉｄ，Ｌｔｄ．（Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ））からの０．３％グルコース添加デミ−フレーザー培地プラス（カタログ番号ＣＭ０１５３）中でリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株ＤＤ１２８８細胞を３７℃で生育させた。ＤＤ１２８８はデラウェア州ウィルミントンのデュポン・クアリコン（ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））から得られた株であり、調理済み七面鳥から単離され、クック（Ｃｏｏｋ），Ｌ．Ｖ．著（「ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ微生物学試験室ガイドブック（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ）」）２００２年、第３版、３次改訂、ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｓｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／Ｆｒａｍｅ／ＦｒａｍｅＲｅｄｉｒｅｃｔ．ａｓｐ?ｍａｉｎ＝ｏｐ／ｏｐｈｓ
／ｏｐｈｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）で述べられるように、異なる寒天上でのその生育パターン、および生化学試験におけるその特性によってＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株として同定された。この実施例で述べられるように、その他のＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株を使用して、ホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出を実証してもよい。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上で、実施例１で述べられるようなプレートカウントを実施した。
【０１３２】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解法によるホールセル溶解産物の調製
実施例７でアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶解法について述べたように、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）細胞を生育させ、収穫し、希釈して、プレートカウントを行った。およそ１０５細胞／ｍｌ〜１０２細胞／ｍｌを含有するアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）溶菌性緩衝液中の各希釈物から、９０μｌの希釈細胞を０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブに移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１０分間、細胞をインキュベートした。
【０１３３】
ＲＴ−ＰＣＲ
反応あたり２μｌのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙ
ｔｏｇｅｎｅｓ）細胞溶解産物サンプルを使用して、実施例７で述べられるようにしてリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。全反応を三連で実施した。
【０１３４】
実施例７と同様に反応をサーマルサイクルにかけ、ＣＴ値を表１５に示す。実施例７と同様に、ＣＴ値は精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従ったので、溶解細胞の直接アッセイが効果的だったことが実証された。精製なしでは、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１６Ｓ ｒＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲアッセイにおいてテンプレートとして機能するのに利用できた。データは、溶解産物希釈レベルが増大するに連れてＣＴ値の特徴的な増大を示し、反応中により低いｃｆｕを与えた。逆転写酵素を含む反応は、表１６にある計算された２＾−ΔＣＴ値によって示されるように、ＰＣＲのテンプレートとしての役割を果たす１６Ｓ配列の標的ＤＮＡコピーを顕著により多く含有した。
【０１３５】
【表１６】
【０１３６】
【表１７】
【０１３７】
実施例９
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した大腸菌（エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
ｃｏｌｉ）ホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。細胞をカリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ培地（カタログ番号Ｂ９９９４）上で３７℃で生育させた。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上で、プレートカウントを実施した。
【０１３８】
水溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌのＢＨＩに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。推定開始濃度３×１０９細胞／ｍｌに基づいて、ＢＨＩ培地中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに連続１：１０希釈を作成した。
【０１３９】
およそ１０３および１０２細胞／ｍｌの希釈物から１００μｌをＢＨＩ寒天プレート上に播種した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、コロニー数を計数して希釈物あたりのｃｆｕを判定した。
【０１４０】
０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からの５μｌ ２０Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害物質（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）添加９５μｌ蒸留脱イオン水に、およそ１０９細胞／ｍｌ〜１０５細胞／ｍｌを含有する各希釈物から５μｌの希釈細胞を移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１５分間、細胞をインキュベートした。フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。得られた細胞サンプル溶解産物を氷上で冷却し、次に下のＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの配列検出システム（ＳＤＳ）装置（モデル７９００）上でリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。逆転写酵素ありまたはなし（＋または−Ｒｔ）の双方で、次のように２０μｌ反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの１０μｌのタクマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ ２×マスター・ミックス（＃４３２４０１８）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．４μｌのＲＮアーゼ阻害物質（＃Ｎ８０８−０１１９、２０Ｕ／μｌ）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０１μｌのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（＃４３１１２３５）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．１μｌの１６Ｓ−２４５５Ｆ １００μＭプライマー（５’ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＡＡＧＡＧＴＴＣ：配列番号：６）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．２μｌの１６Ｓ−２５２３Ｒ １００μＭプライマー（５’ＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴ：配列番号：７）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０５μｌの１６Ｓ−２４７９Ｔ １００μＭ タクマン（ＴａｑＭａｎ） ＴＡＭＲＡプローブ（＃４５００２５、６ＦＡＭ−ＴＣＧＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣ：配列番号：８）、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフＡＧ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの７．２４μｌの分子生物学等級水＃００３２００６．３０２）、および２μｌのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。
【０１４２】
次の条件で反応をサーマルサイクラー内で実施した。５０℃で１０分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒＋６０℃で１分を４０サイクル。各サイクルからリアルタイム蛍光データを収集した。実施例７で述べられるようにして、タクマン（ＴａｑＭａｎ）５’−３’エキソヌクレアーゼアッセイを実施した。
【０１４３】
表１７に示されるＣＴ値は、精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従う。１：１０希釈シリーズにわたり標的ＲＮＡ量としてＣＴに用量反応または増大があり、またはＤＮＡが減少した。この結果は、サンプルが希釈されると、リポーター蛍光が、装置によって判定される閾値に達するのにより長い時間がかかることを意味する。したがって溶解大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞サンプルの直接アッセイは、精製された核酸サンプルから予期される検出と比較できるパターンで、ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出を示した。
【０１４４】
各溶解産物濃度で（＋）ＲＴデータに、（−）ＲＴデータと比べてより低いＣＴ値が観察された。このより低いＣＴ値は、（＋）ＲＴ反応中により大量の標的が存在することの現れである。これは溶解産物中に、１６Ｓ ｒＤＮＡと比べて１６Ｓｒ ＲＮＡのより多くのコピーが存在するという事実と良好に相関し、これらの反応中でＲＮＡが検出されたことの確証である。この結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＲＮＡ標的がいかなる精製ステップもなしに、細胞溶解産物から直接検出できることを示唆する。
【０１４５】
【表１８】
【０１４６】
実施例１０
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６Ａのホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
菌株および培地
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０は、バージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。液体アンモニウム「ＢＴＺ」増殖培地中でメタンを炭素源として、細胞を３０℃で生育させた（表１８および１９参照）。イリノイ州ウィートンのウィートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ））からの共栓付きウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）ボトル内で、少なくとも８：１の気体／液体比を使用して（すなわち総容積８０ｍＬのウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）ボトル内に１０ｍＬの液体アンモニウム「ＢＴＺ」増殖培地）、血清中でメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａを生育させた。培養のための標準気相は、空気中に２５％メタンを含有した。
【０１４７】
【表１９】
【０１４８】
【表２０】
【０１４９】
水溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌのＢＴＺ培地にメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６Ａを接種し、３０℃で一晩インキュベートした。推定開始濃度３×１０９細胞／ｍｌに基づいて、最
終濃度およそ１０５細胞／ｍｌにＢＴＺ培地中で一連の１：１０希釈を作成した。
【０１５０】
０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からの５μｌ ２０Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害物質（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）添加９５μｌ蒸留脱イオン水に、およそ１０９細胞／ｍｌ〜１０５細胞／ｍｌを含有する各希釈物から５μｌの希釈細胞を移した。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１５分間、細胞をインキュベートした。フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。得られた細胞サンプル溶解産物を氷上で冷却し、次に下のＲＴ−ＰＣＲ反応で即座に使用した。
【０１５１】
ＲＴ−ＰＣＲ
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの配列検出システム（ＳＤＳ）装置（モデル７９００）上でリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。逆転写酵素ありまたはなし（＋または−ＲＴ）の双方で、次のように２０μｌ反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの１０μｌのタクマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ ２×マスター・ミックス（＃４３２４０１８）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．４μｌのＲＮアーゼ阻害物質（＃Ｎ８０８−０１１９、２０Ｕ／μｌ）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０１μｌのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素（＃４３１１２３５）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．１μｌの１６Ｓ−１１０８Ｆ １００μＭプライマー（５’ＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ：配列番号：９）、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ））からの０．２μｌの１６Ｓ−１１６９Ｒ １００μＭプライマー（５’ＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＴＴＴＡＴＣＡ：配列番号：１０）、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの０．０５μｌの１６Ｓ−１１２５Ｔ １００μＭ タクマン（ＴａｑＭａｎ） ＴＡＭＲＡプローブ（＃４５００２５、６ＦＡＭ−ＣＧＧＧＡＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧ：配列番号：１１）、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフＡＧ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの７．２４μｌの分子生物学等級水＃００３２００６．３０２）、および２μｌのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。
【０１５２】
次の条件で反応をサーマルサイクラー内で実施した。５０℃で１０分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒＋６０℃で１分を４０サイクル。各サイクルからリアルタイム蛍光データを収集した。実施例７で述べられるようにして、タクマン（ＴａｑＭａｎ）５’−３’エキソヌクレアーゼアッセイを実施した。
【０１５３】
表２０に示されるＣＴ値は、精製標的ＲＮＡおよびＤＮＡ検出で予測されるパターンに従う。１：１０希釈シリーズにわたり標的ＲＮＡ量としてＣＴに用量反応または増大があり、またはＤＮＡが減少した。この結果は、サンプルが希釈されると、リポーター蛍光が装置によって判定される閾値に達するのにより長い時間がかかることを意味する。したがって溶解メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ細菌細胞サンプルの直接アッセイは、精製された核酸サンプルから予期される検出と比較できるパターンで、ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出を示した。
【０１５４】
各溶解産物濃度で（＋）ＲＴデータに、（−）ＲＴデータと比べてより低いＣＴ値が観察された。このより低いＣＴ値は、ＲＮＡテンプレートからのＤＮＡの生成のために、（＋）ＲＴ反応中により大量の標的が存在することの現れである。より低いＣＴは溶解産物中に、１６Ｓ ｒＤＮＡと比べて１６Ｓ ｒＲＮＡのより多くのコピーが存在するという事実と良好に相関し、これらの反応中でＲＮＡが検出されたことの確証である。この結果は、別のグラム陰性細菌メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ株中でＲＮＡ標的がいかなる精製ステップもなしに、細胞溶解産物から直接検出できることを示唆する。
【０１５５】
【表２１】
【０１５６】
実施例１１
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したその他の細菌および牛挽肉存在下におけるリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
この実施例は、食品微小細菌叢およびマトリックス物質を含む、食品加工工場において遭遇する接触面をシミュレートする物質表面のリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ＣＬＩＰ１１２６２（ＡＴＣＣＢＡＡ−６８０）の存在の検出を実証する。
【０１５７】
カレントテクノロジーズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｃｒａｗｆｏｒｄｓ，ＩＮ））からのハイプ−ワイプ（Ｈｙｐｅ−Ｗｉｐｅ）ブリーチ入り消毒タオル（カタログ番号９１０３）で拭き、続いて滅菌水で洗浄して、１２０グリット３１６ステンレス鋼表面を滅菌した。表面にそれぞれ８個１インチ×１インチ正方形を含む２つの格子の印を付けた（レイアウトについては表２１および表２２参照）。
【０１５８】
【表２２】
【０１５９】
【表２３】
【０１６０】
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の単一コロニーをニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））からの８ｍｌ ＢＨＩチューブ（カタログ番号２２０８３７）内に接種し、定常期に達するまで３７℃で約１７時間インキュベートした。次に培養物をＢＨＩ中で連続希釈して最終濃度７．３×１０５細胞／ｍｌを得た。この希釈懸濁液５０μｌを塗布して、表面において１”×１”正方形内に３．６５×１０４細胞の細胞最終濃度を得た。細胞懸濁液をピペットで塗布し、ピペット先端を使用して、Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨと標識された調製ステンレス鋼表面格子の各１インチ×１インチ正方形上に穏やかに播種した。表面を室温で一晩（１８時間）乾燥させた。各格子中にＡ、Ｂ、ＥおよびＦと標識された対照正方形には、Ｌ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）を塗布しなかった。
【０１６１】
ニューカロライナ州ウィルミントンのＩＫＡワーク（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））からのウルトラ・ツラックス（Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ）Ｔ−２５ベーシック・ホモジナイザーで、オレゴン州ウィルソンビルのＰＭＬマイクロバイオロジカルズ（ＰＭＬ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，Ｏｒｅｇｏｎ））からの９０ｍｌのリン酸緩衝液（カタログ番号Ｂ８０９８）中で、４℃で保存されたおよそ１０ｇの市販の１０％脂肪赤味牛挽肉を均質化した。このホモジネートの１００μｌをピペットで表２１（食品処理表面）の各正方形に塗布した。サンプル収集に先だって、食品ホモジェネートを１時間乾燥させた。実施例１で述べられるような連続希釈およびトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）上への播種によって、食品ホモジェネート調製物の総プレートカウントを測定した。ＴＳＡプレートを３７℃で４８時間インキュベートした。牛挽肉ホモジェネートからの微生物のカウントは、微生物が１×１０４細胞／ｇのレベルで牛挽肉中に存在したことを示唆した。したがって各正方形に塗布された１００μｌのサンプルは、およそ１×１０２個の微生物を含有した。
【０１６２】
食品ホモジェネートを１時間乾燥させた後、滅菌済みパッケージで納入されるメイン州ギルフォードのピューリタン（Ｐｕｒｉｔａｎ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｉｎｅ））からの木製スティックに固着された綿棒（カタログ番号ＲＥＦ ２５−８０６ １ＷＣ）を使用して、表面の拭き取りによってサンプルを収集した。綿棒を中和ブロス（Ｄ／Ｅ中和ブロス）で、あらかじめ湿らせた。１”×１”セクション（約５ｃｍ２）の汚染面を精力的に拭き取って、サンプルを収集した（食品サンプルおよび対照の双方）。
【０１６３】
ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ参照法およびＲＴ−ＰＣＲの双方によって、綿棒を分析した。ＦＳＩＳ法では、各綿棒を１０ｍｌ＋／−０．５ｍｌのＵＶＭブロスと共にチューブに入れた。綿棒をチューブ内に入れたまま（キャップをするのに必要なら綿棒の末端を取り除く）ボルテックスして混合した。チューブを３０℃＋／−２℃で２２＋／−２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、１００μｌ＋／−２μｌのＵＶＭ培養物を取り出して、１０ｍｌ＋／−０．５ｍｌのフレーザーブロス（ＦＢ）に入れた。ＦＢを３７℃＋／−２℃で２６＋／−２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の存在を示す黒ずみについてＦＢを調べた。Ｌ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）処理格子正方形から収集した全ての綿棒サンプルは黒ずみを示し、表２３のＦＳＩＳ試験結果に「はい」と示され、Ｌ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）で処理しなかった全ての正方形は、黒ずみを示さず、陰性結果であった。
【０１６４】
【表２４】
【０１６５】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、各綿棒を１０ｍｌ＋／−０．５ｍｌのパルカム（Ｐａｌｃａｍ）プラス・ブロスに入れた。綿棒をチューブ内に入れたまま（キャップをするのに必要なら綿棒の末端を取り除く）ボルテックスして混合した。チューブを３７℃＋／−２℃で４８＋／−２時間インキュベートした。２４時間および４８時間目に、１ｍｌのアリコートを取り出して、ＲＴ−ＰＣＲによる試験のために培養物をサンプル採取した。７５度で１０分の熱処理によってアリコートを溶解した。実施例２で述べられるようにＲＴ−ＰＣＲを使用して溶解産物を試験した。
【０１６６】
２４および４８時間ＲＴ−ＰＣＲ結果をそれぞれ表２４および２５に示す。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）処理正方形から収集された全サンプルは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて双方の時点で、そしてＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ参照法（表２３）で陽性であった。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）処理のない正方形から収集された全サンプルは、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ法（表２３）で陰性であった。したがって混入細菌を含む食品マトリックスの存在は、熱溶解ＲＴ−ＰＣＲアッセイの正確さに影響しなかった。
【０１６７】
【表２５】
【０１６８】
【表２６】
【０１６９】
実施例１２
逆転写のみを使用した細菌のホールセル溶解産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的の直接検出
ＰＣＲステップを施さずにＲＴ反応生成物を検出した。
【０１７０】
菌株および培地
実施例２で述べられるＬ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）をこの目的で使用する。細胞をカリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ培地（カタログ番号Ｂ９９９４）中で３７℃で生育させる。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））からのＢＨＩ寒天プレート（カタログ番号Ｂ１０１０）上で、プレートカウントを実施する。
【０１７１】
水溶解法によるホールセル溶解産物の調製
１０ｍｌのＢＨＩにＬ．イノキュラ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）を接種して、３７℃で一晩インキュベートする。推定開始濃度３×１０９細胞／ｍｌに基づいて、ＢＨＩ培地中で最終濃度およそ１０２細胞／ｍｌに連続１：１０希釈を作成する。
【０１７２】
およそ１０９および１０２細胞／ｍｌの希釈物から、１００μｌをＢＨＩ寒天プレート上に播種する。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、コロニー数を計数して各希釈物あたりのｃｆｕを判定する。
【０１７３】
０．５ｍｌ薄肉ＰＣＲチューブ内のカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からの５μｌ ２０Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害物質（カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）添加９５μｌ蒸留脱イオン水に、およそ１０９細胞／ｍｌ〜１０５細胞／ｍｌを含有する各希釈物から５μｌの希釈細胞を移す。カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００内において７５℃で１５分間、細胞をインキュベートする。フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。得られた細胞サンプル溶解産物を氷上で冷却し、次に下の逆転写反応で即座に使用する。
【０１７４】
ＲＴ反応
逆転写を次の条件下で実施する。
１．ＲＴのための特異的プライマー（１〜６μｇ）を細胞溶解産物に添加する（５〜２０μｌ）。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）１６Ｓ ｒＲＮＡの検出のためのプライマーとしてＬｉｓ−Ｒプライマー（配列番号：２）を使用する。ＲＮアーゼおよびＤＮＡ分解酵素を含まない水で容積を２５μｌに調節する。
２．１４μｌの標識混合物を添加する。この混合物は、８μｌの５×酵素緩衝液、４μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）、および２μｌの２０×染料混合物を含有する。染料混合物は、それぞれ２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、ＩｍＭのｄＣＴＰ、そして１ｍＭのＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰを含有する。
３．混合物をアニーリングのために室温で１０分間インキュベートする。
４．１または１．４μｌ（２００〜３００単位）の逆転写酵素を添加して、使用酵素に適した温度で反応をインキュベートする。例えばスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ酵素では、インキュベーション温度は４２℃である。
５．ＤＮＡ精製キットでｃＤＮＡ精製を実施する。この目的のために、例えばキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲキットを使用してもよい。代案としては蛍光標識プライマーをＲＴ反応で使用して、未標識のｄＣＴＰのみを添加する。
【０１７５】
ｃＤＮＡ生成物の検出
いくつかの方法の一つによって、蛍光染料で標識されたｃＤＮＡＲＴ生成物を検出する。それは分光光度計で測定できる。例えばＣｙ３標識ＤＮＡ分子は、吸光係数１５０，０００Ｍ−１で波長５５０ｎｍで日常的に測定される一方、Ｃｙ５標識ＤＮＡは吸光係数２５０，０００Ｍ−１で６５０ｎｍで測定される。標識ＤＮＡを直接検出するより感度の良い方法は、ナイロン膜またはガラススライドなどのマトリックスに固定化された標的ＤＮＡ配列分子に生成物をハイブリダイズすることである。次にハイブリダイゼーション後のシグナルは、レーザースキャナーで適切にフィルターリングしてスキャンし、使用した特定の染料を検出できる。この方法は、当該技術分野、特にＤＮＡマイクロアレイ技術でよく知られている。
【０１７６】
ｃＤＮＡを検出する別の感度の良い方法は、多数のシグナル発生分子がある粒子に結合したプライマーを使用することである。代案としてはＲＴから発生するｃＤＮＡをＰＣＲでなく、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写のカップリングによって増幅できる。例えばＲＴ反応で使用されるプライマーに、Ｔ７プロモーター領域を組み込むことができる。次にＴ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットを使用して多量のＲＮＡを発生させ、検出感度を増大できる。Ｔ７生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写キットは、テキサス州オースティン２１３０ウッドワードのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ（２１３０ Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））またはその他の販売元から購入できる。述べられた方法によって、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）細胞のＲＴ反応のｃＤＮＡ生成物が検出される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）診断用標的ＲＮＡを含んでなる少なくとも１つの細菌細胞の少なくとも一部を含んでなるサンプルを提供するステップと、
ｂ）サンプルとＲＴ−ＰＣＲ組成物とを接触させてＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を形成するステップと、
ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物をサーモサイクリングすることによって、診断用標的ＤＮＡ生成物が増幅されるステップと、
ｄ）（ｃ）の増幅された診断用標的ＤＮＡ生成物を検出するステップと
を含んでなるが、ただしいずれのステップもＲＮＡ精製を含まない、細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するための方法。
【請求項２】
ａ）診断用標的ＲＮＡを含んでなる少なくとも１つの細菌細胞の少なくとも一部を含んでなるサンプルを提供するステップと、
ｂ）診断用ＤＮＡ生成物がＲＮＡから転写される条件下で、サンプルとＲＴ反応組成物とを接触させてＲＴ反応混合物を形成するステップと、
ｃ）診断用標的ＤＮＡ生成物を検出するステップと
を含んでなるが、ただしいずれのステップもＲＮＡ精製を含まない、細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するための方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の後に、
診断用ＤＮＡ生成物とＰＣＲ組成物とを接触させてＰＣＲ反応混合物をもたらすステップと、
得られたＰＣＲ反応混合物をサーモサイクリングによって、診断用標的ＤＮＡ生成物が増幅されるステップをさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検出が、標識を診断用標的ＤＮＡ生成物に組み込むか、または付着させることを含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識が、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、および発光部分よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
サンプルと溶菌剤とを接触させるステップをさらに含んでなる請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
溶菌剤が溶菌性緩衝液および高温よりなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
溶菌剤が、化学薬品、酵素、および物理的剪断よりなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、リゾチーム、グルコラーゼ、ザイモロース、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、およびウィルス性エンドリシンよりなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウィルス性エンドリシンが、バクテリオファージまたはプロファージからのエンドリシン、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウィルス性エンドリシンが、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）バクテリオファージＡ１１８およびＰＬＹ１１８からのエンドリシン、バクテリオファージＰＭ２からのエンドリシン、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳＸからのエンドリシン、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＬｊ９２８、Ｌｊ９６５、およびバクテリオファージピアダ（Ｐｈｉａｄｈ）からのエンドリシン、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリオファージＣｐ−１からのエンドリシン（Ｃｐｌ−１）、ストレプトコッカス・アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）バクテリオファージＢ３０からの二官能性ペプチドグリカンリシン、スタフィロコッカス・ワーネリー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）ＭファージｖａｒｐｈｉＷＭＹの二成分細胞溶解遺伝子ｈｏｌＷＭＹおよびｌｙｓＷＭＹ、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
物理的剪断がジルコニア−シリカビーズまたはフレンチプレスによって生じる請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質をサンプルに添加するステップをさらに含んでなる請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質が、
（ｉ）胎盤リコンビナント５０ｋＤタンパク質、
（ii）ブタリコンビナントタンパク質胎盤ＲＮアーゼ、
（iii）ブタＲＮアーゼ、
（iv）抗ＲＮアーゼ抗体、
（ｖ）イソチオシアン酸グアニジニウム、
（vi）ピロ炭酸ジエチル、および
（vii）ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害物質
の１つもしくはそれ以上を含んでなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルが約５０℃〜約１００℃未満の範囲の温度に加熱される請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
診断用標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および小型ＲＮＡ種よりなる群から選択される請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｒＲＮＡが、５Ｓ ＲＮＡ、１６Ｓ ＲＮＡ、および２３ ＳＲＮＡよりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの細菌細胞が、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、カンプロバクター（Ｃａｍｐｌｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される属のメンバーである請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルが、食品、肉、生鮮食品、乳製品、果物、牛挽肉およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルが、食品加工状況から採取されるサンプルおよび医学的状況から採取されるサンプルよりなる群から選択される請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法を記述する説明書、およびＲＴ−ＰＣＲ組成物を含んでなり、
ＲＴ−ＰＣＲ組成物が、診断用標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１つのプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、ＲＮアーゼ阻害物質の要素の少なくとも１つを含んでなる細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するためのキット。
【請求項２２】
請求項２、３または４のいずれか一項に記載の方法を記述する説明書、およびＲＴ反応組成物を含んでなり、
ＲＴ組成物が、診断用標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１つの核酸プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、検出染料、検出プローブ、ＲＮアーゼ阻害物質の要素の少なくとも１つを含んでなる細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するためのキット。
【請求項１】
ａ）診断用標的ＲＮＡを含んでなる少なくとも１つの細菌細胞の少なくとも一部を含んでなるサンプルを提供するステップと、
ｂ）サンプルとＲＴ−ＰＣＲ組成物とを接触させてＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を形成するステップと、
ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物をサーモサイクリングすることによって、診断用標的ＤＮＡ生成物が増幅されるステップと、
ｄ）（ｃ）の増幅された診断用標的ＤＮＡ生成物を検出するステップと
を含んでなるが、ただしいずれのステップもＲＮＡ精製を含まない、細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するための方法。
【請求項２】
ａ）診断用標的ＲＮＡを含んでなる少なくとも１つの細菌細胞の少なくとも一部を含んでなるサンプルを提供するステップと、
ｂ）診断用ＤＮＡ生成物がＲＮＡから転写される条件下で、サンプルとＲＴ反応組成物とを接触させてＲＴ反応混合物を形成するステップと、
ｃ）診断用標的ＤＮＡ生成物を検出するステップと
を含んでなるが、ただしいずれのステップもＲＮＡ精製を含まない、細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するための方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の後に、
診断用ＤＮＡ生成物とＰＣＲ組成物とを接触させてＰＣＲ反応混合物をもたらすステップと、
得られたＰＣＲ反応混合物をサーモサイクリングによって、診断用標的ＤＮＡ生成物が増幅されるステップをさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検出が、標識を診断用標的ＤＮＡ生成物に組み込むか、または付着させることを含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識が、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、および発光部分よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
サンプルと溶菌剤とを接触させるステップをさらに含んでなる請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
溶菌剤が溶菌性緩衝液および高温よりなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
溶菌剤が、化学薬品、酵素、および物理的剪断よりなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、リゾチーム、グルコラーゼ、ザイモロース、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、およびウィルス性エンドリシンよりなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウィルス性エンドリシンが、バクテリオファージまたはプロファージからのエンドリシン、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウィルス性エンドリシンが、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）バクテリオファージＡ１１８およびＰＬＹ１１８からのエンドリシン、バクテリオファージＰＭ２からのエンドリシン、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳＸからのエンドリシン、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＬｊ９２８、Ｌｊ９６５、およびバクテリオファージピアダ（Ｐｈｉａｄｈ）からのエンドリシン、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリオファージＣｐ−１からのエンドリシン（Ｃｐｌ−１）、ストレプトコッカス・アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）バクテリオファージＢ３０からの二官能性ペプチドグリカンリシン、スタフィロコッカス・ワーネリー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）ＭファージｖａｒｐｈｉＷＭＹの二成分細胞溶解遺伝子ｈｏｌＷＭＹおよびｌｙｓＷＭＹ、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
物理的剪断がジルコニア−シリカビーズまたはフレンチプレスによって生じる請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質をサンプルに添加するステップをさらに含んでなる請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのＲＮアーゼ阻害物質が、
（ｉ）胎盤リコンビナント５０ｋＤタンパク質、
（ii）ブタリコンビナントタンパク質胎盤ＲＮアーゼ、
（iii）ブタＲＮアーゼ、
（iv）抗ＲＮアーゼ抗体、
（ｖ）イソチオシアン酸グアニジニウム、
（vi）ピロ炭酸ジエチル、および
（vii）ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害物質
の１つもしくはそれ以上を含んでなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルが約５０℃〜約１００℃未満の範囲の温度に加熱される請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
診断用標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および小型ＲＮＡ種よりなる群から選択される請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｒＲＮＡが、５Ｓ ＲＮＡ、１６Ｓ ＲＮＡ、および２３ ＳＲＮＡよりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの細菌細胞が、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、カンプロバクター（Ｃａｍｐｌｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される属のメンバーである請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルが、食品、肉、生鮮食品、乳製品、果物、牛挽肉およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルが、食品加工状況から採取されるサンプルおよび医学的状況から採取されるサンプルよりなる群から選択される請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法を記述する説明書、およびＲＴ−ＰＣＲ組成物を含んでなり、
ＲＴ−ＰＣＲ組成物が、診断用標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１つのプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、ＲＮアーゼ阻害物質の要素の少なくとも１つを含んでなる細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するためのキット。
【請求項２２】
請求項２、３または４のいずれか一項に記載の方法を記述する説明書、およびＲＴ反応組成物を含んでなり、
ＲＴ組成物が、診断用標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１つの核酸プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、検出染料、検出プローブ、ＲＮアーゼ阻害物質の要素の少なくとも１つを含んでなる細菌から診断用標的ＲＮＡを直接検出するためのキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−３４７０５（Ｐ２０１２−３４７０５Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４７１８９（Ｐ２０１１−２４７１８９）
【出願日】平成２３年１１月１１日（２０１１．１１．１１）
【分割の表示】特願２００７−５１５４２０（Ｐ２００７−５１５４２０）の分割
【原出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１１日（２０１１．１１．１１）
【分割の表示】特願２００７−５１５４２０（Ｐ２００７−５１５４２０）の分割
【原出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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