診断画像用化合物
本発明は、病理学的画像診断用の、具体的には心血管疾患、さらに具体的にはアテローム性動脈硬化症を画像診断するための新規の化合物および組成物に関する。上記の化合物は、磁気共鳴画像ＭＲＩおよび核医学の分野において有用な造影剤である。前記化合物は、特に、シグナル構成物質と結合する特定のペプチド性ＭＭＰ阻害剤を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理学的画像診断用の、具体的には心血管疾患、さらに具体的にはアテローム性動脈硬化症を画像診断するための新規の化合物および組成物に関する。これらの化合物は、磁気共鳴画像ＭＲＩの分野だけでなく、核医学、Ｘ線、超音波、光画像等の他の画像分野においても有用な造影剤である。
【０００２】
これらの化合物は、少なくとも１種のシグナル部分に結合する少なくとも１種のターゲット部分を含む。
【背景技術】
【０００３】
ターゲット構成物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｎｔｉｔｙ）は、非病的状態および／または領域と比較して、疾病状態および／または領域で過剰もしくは過小発現する疾病状態および／または領域の少なくとも１種のマーカーをターゲットとすることが可能である。これらの化合物は、特異的化合物と呼ばれ、バイオベクターと称されるターゲット構成物質である。非常に多くのシグナル構成物質（ｓｉｇｎａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）／部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は、ＭＲＩのための常磁性金属イオンや核医学のための放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｉｄｅｓ）の鎖式（ｌｉｎｅａｒ）もしくは大環状キレートとして、既に知られている。上記のキレートは、ＥＰ ７１ ５６４号明細書、ＥＰ ４４８ １９１号明細書、国際公開第０２／４８１１９号パンフレット、米国特許第６，３９９，０４３号明細書、国際公開第０１／５１０９５号パンフレット、ＥＰ ２０３ ９６２号明細書、ＥＰ ２９２ ６８９号明細書、ＥＰ ４２５ ５７１号明細書、ＥＰ ２３０ ８９３号明細書、ＥＰ ４０５ ７０４号明細書、ＥＰ ２９０ ０４７号明細書、米国特許第６，１２３，９２０号明細書、ＥＰ ２９２ ６８９号明細書、ＥＰ ２３０ ８９３号明細書、米国特許第６，４０３，０５５号明細書、国際公開第０２／４００６０号パンフレット、米国特許第６，４５８，３３７号明細書、米国特許第６，２６４，９１４号明細書、米国特許第６，２２１，３３４号明細書、国際公開第９５／３１４４４号パンフレット、米国特許第５，５７３，７５２号明細書、米国特許第号５，３５８，７０４明細書に記載されている。一般的に使用されるキレートは、例えばＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ ＢＭＡ、ＤＴＰＡ ＢＯＰＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−四酢酸）、ＰＣＴＡおよびそれらの誘導体である。市販されている製品は、具体的には、例えば、Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）およびマグネビスト（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）（登録商標）である。上記のキレートに対する、およそ３〜１０ｍＭ−１ｓ−１ Ｇｄ−１あたりでの、水中での緩和能を用いて、ＭＲＩでシグナルを測定する。
【０００４】
特異的なアテローム性動脈硬化性損傷をターゲットとする新規の造影剤に対する深刻な必要性がなお存在する。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症は、現代社会において最も一般的な疾患である。非常に多様な臨床的に異なる疾患（例、心筋梗塞、脳卒中、腹部大動脈瘤および下肢虚血等）は、基本的にアテローム性動脈硬化症に関連する。それらの急性の症状発現のほとんどは、一般的な病原性の特徴（混合型血栓を伴うアテローム性動脈硬化プラークの破綻）を共有する。プラーク破綻は、致命的な急性心筋梗塞と症候性頚動脈損傷の約７０％を占め、脆弱性プラークの最終的な併発症である。脆弱性プラークには、急激に進行する可能性が高い、不安定プラーグのみならず血栓症を生じやすいプラークも含まれる。それらは、それらの表面上もしくは表面下の大型の脂質コア、薄いキャップおよびマクロファージの集積した炎症により、特徴付けられる。個々に対する急性虚血を発症するリスクは、脆弱性プラークの数により決まり、現在の課題は、上記のリスクを等級別に分類することである。
【０００６】
従来型の画像技法は、脆弱性プラーク、特に冠状動脈の脆弱性プラークを検出して特徴づけに貢献することは不可能である。血管造影法は、厳密には解剖学の画像ツールであり、冠状プラークの寸法や組成を評価することは不可能である。他の物理療法は、カテーテルによる療法であり、従って臨床適用範囲が限られている。血管内超音波は、プラークの形態構造に関していくつかの情報を提供するが、画像解像度および感度は、脆弱性プラークの沈着物を確実に識別するにはまだ不十分である。光コヒーレンストモグラフィーは、内膜壁とプラークとの間をより良好に描出するが、その透過度は低い。サーモグラフィーは、浅部炎症に非常に敏感であるのに対して、血管顕微鏡検査法は、脂質に富むプラークの検出や血栓の視覚化に使用されうる。しかしながら、両技法は、動脈壁の深部層を検査することやキャップの厚さを推定することは不可能である。
【０００７】
非常に有望な技法は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）技法である。頚動脈硬化のプラークにおいて、ＭＲＩは、プラーク内出血や繊維状キャップの破綻を視覚化できるだけでなく、管内血栓を検出し、それらの期を識別することが可能である。従って、ＭＲＩは、大脳虚血症状の兆候を最近発症した患者をリスク層別化するための、潜在的魅力を持つ診断ツールである。しかしながら、現在まで、ＭＲＩは、キャップの厚さの精確な測定や冠状アテローム性動脈硬化性の損傷の特徴付けのために十分である空間分解能を備えていない。
【０００８】
従って、予測診断に関して、プラークの生理学的特徴付け、さらにそれらの形態学的研究に対する必要性が存在する。ＭＲＩによる冠状動脈の脆弱性プラークを同定するための代替的な戦略は、特異的マーカーの検出に基づいた分子画像法を採用することでありうる。上記の１種のマーカーは、活動性のアテローム性動脈硬化性損傷で過剰発現し、線維性キャップの線維性コラーゲンを分解することによりプラークの不安定化を促進する、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、亜鉛含有のエンドプロテアーゼの群により代表される。従って、対照分子は、ＭＲＩではっきりと検出でき、ＭＭＰ活性を画像化し、脆弱性プラークを非侵襲で検出するのに有用であり、患者のリスク層別化を改善するだろう。
【０００９】
ヒト脆弱性プラーク内に蓄積するＭＭＰの量に関して、殆ど知られていないが、進行した頚動脈硬化症の損傷における組織のミリグラム当たりのＭＭＰ−８の過剰発現を報告している研究もある。これらのレベルは、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１３に対して得られたレベルと同様であると考えられた。ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＲＩの感度は、シンチグラフィーの画像技法と比較して、相対的に低いので、例えば、十分なシグナル強度を生み出すために、損傷において低い濃度のＭＭＰを補う必要性が存在する。大部分のＭＭＰを非選択的にターゲットとする化合物を使用して、上記の要件を達成しうる。それにより、局所的に高濃度の造影剤が許容されうる。本願特許出願人は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９に対して良好な親和力を有する（特に、ＭＭＰ−３は、損傷プラークで過剰発現する）バイオベクターを含む画像化化合物を目下調製したところである。
【００１０】
ＭＭＰターゲットのための具体的な化合物は、先行技術に記載されている。例えば、国際公開第０１／６０４１６号パンフレットは、鎖式もしくは大環状キレートのシグナル構成物質に結合したＭＭＰに対するターゲット構成物質を含む化合物を記載する。生物アッセイに関する本願特許出願人の知識によると、従来技術の上記化合物は、およそ５〜１０ｍＭｏｌ−１ｓ−１Ｇｄ−１あたりでのそれらの相対的に低い緩和能のためおよび／またはそれらの親和力もしくは選択性の不足のために、かなり満足のいくｉｎ ｖｉｖｏでの診断に対して十分に有効ではない。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでの画像診断に効果的に有効である新規の製品に対する深刻な必要性が依然として存在する。
【００１１】
驚くべきことに、本願特許出願人は、高い緩和能を有するかなり有望な化合物を評価する一方、シグナル構成物質に結合する特定のペプチド性ＭＭＰ阻害剤が、シグナル構成物質の相対的に低い緩和能にもかかわらず、診断画像にかなり良好な結果を得ることを示した。本願特許出願人により調製された化合物は、非特異的な対照化合物Ｄｏｔａｒｅｍと比べて、脆弱性プラークを伴う疾患の特異的診断に確実にかなり功を奏する。例証した化合物のＭＭＰに対する親和力を精製したＭＭＰでｉｎ ｖｉｖｏで試験し、さらに、ＷＨＨＬウサギ動脈およびヒト動脈内膜切除標本でｅｘ ｖｉｖｏで試験した。増加したＭＭＰ発現を示すアテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおいて、生体内分布を研究した。
【００１２】
高度な構造上の相違点を示すＭＭＰをターゲットとする非常に多くの分子が、先行技術に記載されており、それらは、以下に詳細に概説されている。
−現代医薬品化学（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、８，４２５−４７４
−Ｃｈｅｍ ｒｅｖ，１９９９年，９９，２７３５−２７７６
−ＤＤＴ。第１巻、第１号、１９９６年１月、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６−１７
−Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，２００１年、１２，９６４−９７１
【００１３】
１５０を超える米国特許もしくは米国特許出願が、ＭＭＰ阻害剤を論じ、さらにかなり多くが、ＭＭＰをターゲットとする構成物質も論じている。
【００１４】
本願特許出願人によりバイオベクターとして使用されるペプチド性ＭＭＰ阻害剤は、生化学および生物物理リサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）（第１９９巻、３、１９９４年、１４４２−１４４６頁）および米国特許第５，１００，８７４号明細書に記載され、本明細書に参照され組み込まれている。しかし、ＭＭＰに対する親和力もしくは選択性と同じか、それより高い親和力もしくは選択性を有すると知られている莫大な量の可能なＭＭＰターゲット構成物質および阻害剤のうちで、上記の特定のペプチド性ＭＭＰ阻害剤のシグナル構成物質への結合は、診断画像、具体的には心血管疾患診断に関して、記載も示唆もしていない。さらに、本願特許出願人の知識によると、治療分野におけるＭＭＰターゲット構成物質に関する臨床試験は、癌療法に主眼を置き、心血管領域にかかわっていない。
【発明の開示】
【００１５】
第一態様に従って、本発明は、式（Ｉ）
（ＰＥＰＴＩＤＥ）ｎ１−（ＬＩＮＫＥＲ）ｎ２−（ＳＩＧＮＡＬ）ｎ３
［式中、
１）ＰＥＰＴＩＤＥは、以下
ａ）式
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、
Ｘ１は、存在しないか、またはＸ１は、グリシンの残基であり、Ｘ２は、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンおよびアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３は、グルタミン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基であり、
アルファ−アミノ酸Ｘ１のカルボキシル基は、アルファ−アミノ酸Ｘ２のアミノ基と共にペプチド結合を形成し、アルファ−アミノ酸および酸Ｘ２のカルボキシル基は、アルファ−アミノ酸Ｘ３のアミノ基と共にペプチド結合を形成し、アルファ−アミノ酸Ｘ３のカルボキシル基は、アルファ−アミノ酸Ｘ４のアミノ基と共にペプチド結合を形成し、アルファ−アミノ酸Ｘ４のカルボキシル基は、−ＮＨＯＨと共にアミドを形成し、
前記アルファ−アミノ酸Ｘ１のアミノ基の水素原子は、アルキルもしくはアリール基から選択される、好ましくはアセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジルオキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−アミノベンゾイル（ＡＢｚ）、ｐ−アミノ−ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル（ＨＢｚ）、３−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオニル（ＨＰＰ）からなる群から選択されるＸ０基と置換されてもよい）のペプチド、
ｂ）特にａ）のペプチドに機能的に同等なペプチド、
ｃ）ａ）もしくはｂ）のペプチドに機能的に同等な（ＩＩ）のペプチドフラグメント
の群から選択され、
２）ＳＩＧＮＡＬは、医用画像のためのシグナル構成物質であり、
３）ＬＩＮＫＥＲは、最終的に存在しないが、ＰＥＰＴＩＤＥとＳＩＧＮＡＬ間の化学結合を表す］
の化合物と、
それらの薬学的塩と
を含む診断用薬に関する。
【００１６】
アミノ酸は、Ｄアミノ酸もしくはＬアミノ酸のどちらでもよい。
【００１７】
用語「ペプチド（ＩＩ）に機能的に同等なペプチド」とは、ペプチドがキレートに結合することができる化学構造と、診断化合物（Ｉ）の活性がＭＭＰに対する上記に例証した化合物の活性に相当するような、２０〜２００％の範囲内の、典型的には例証した化合物の活性の少なくとも８０％の生物活性とを有するペプチドを意味する。
【００１８】
ＭＭＰに対する活性は、ペプチドによってターゲットとされる各ＭＭＰに対して等しくてもよく、またはそれらのうちのいくつかだけに対して等しくてもよい。従って、ＭＭＰに対する活性は、上記化合物が心血管疾患／アテローム症の医用画像診断、具体的には脆弱性プラークの検出の観点から有用であるような、全体的なＭＭＰターゲット活性に関する。
【００１９】
具体的には、上記ペプチドは、ＭＭＰの活性を５０％まで抑制する濃度（ＩＣ５０）が１０μＭ未満であるように選択されるのが好ましい。ＩＣ５０が、０．５〜５μＭであるのが好ましい。しかしながら、さらに高いＩＣ５０を有するペプチドも、それらが、ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化において、特に詳細な説明で例証されるｅｘ ｖｉｖｏでの試験におけるプラークを視覚化できるいずれかのペプチドにおいて、良好な結果を効果的に付与するならば、本発明に含まれる。芳香族基を含むＸ０を有する化合物も、さらに本発明に含まれる。
【００２０】
一実施形態に従って、ＰＥＰＴＩＤＥは、ペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、Ｘ１は、存在しないか、またはＸ１は、グリシンであり、Ｘ２は、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３は、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４は、グリシン、アラニンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基である）である。
【００２１】
一実施形態に従って、ＰＥＰＴＩＤＥは、ペプチド
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、Ｘ１は、グリシンであり、Ｘ２は、プロリンであり、Ｘ３は、ロイシンであり、Ｘ４は、アラニンである）である。
【００２２】
一実施形態に従って、ＰＥＰＴＩＤＥは、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＢｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａから選択されるＸを有するＸ−ＮＨＯＨである。
【００２３】
特に、ＰＥＰＴＩＤＥｐ−アミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨは、プラーク画像化にかなり十分である。
【００２４】
ヒドロキサメートペプチド誘導体は、ペプチドＣＯ２Ｈ末端の代わりに、ＮＨＯＨが末端に存在する。
【００２５】
上記ペプチドは、以下の（Ａ）と（Ｂ）におおよそ分けることができるプロセスにより、実施される。
（Ａ）式Ｂｏｃ−Ｘ４−ＮＨＯＢｚｌの化合物を出発物質として使用するプロセスであり、該ペプチド鎖は、最初にＢｏｃ−Ｎ基側で延びて、基Ｘ３−Ｘ４−を形成し、それが基Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−を介して基Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−に変換され、そして最終的に、ヒドロキサム酸側のＯ−ベンジルは、除かれて所望の化合物を得るプロセスと、
（Ｂ）式Ｂｏｃ−Ｘ４−ＯＲ２の化合物を出発物質として使用して、対応するペプチド誘導体Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＯＲ２（Ｒ２に関して、メチルもしくはエチル基）を合成するプロセス
米国特許第５，１００，８７４号明細書は、上記のペプチド製剤を明確に記載し、それは、バッケム社（ＢＡＣＨＥＭ ｃｏｍｐａｎｙ）（ｗｗｗ．Ｂａｃｈｅｍ．ｃｏｍ）で入手可能である。
【００２６】
上記のプロセスにおいて、ペプチド合成化学において従来使用されてきた全ての手段を、ペプチド鎖の形成のためにアミノ酸を縮合するため、それらの構造で存在しうる保護基（アミノ基、イミノ基、カルボキシル基および／またはヒドロキシル基）で保護するため、およびそのような保護基を除去するための、特定の手段として採用してもよい。
【００２７】
薬学的塩に関して、
−錯体を塩化するのに適切な無機塩基の好適なカチオンは、特にアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（例、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム等）イオンを含む。
−有機塩基の好適なカチオンは、第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミン（例、エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグルカミン等）のイオンを含む。
−無機酸の好適なアニオンは、特に、ハロ酸のイオン（例、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン）または硫酸イオンのような他のイオンを含む。
−有機酸の好適なアニオンは、塩基性物質（例、アセタート、スクシナート、シトレート、フマレート、マレエート、オキサレート、トリフルオロアセタート等）を塩化するために薬学的技法において従来使用される酸のイオンを含む。
【００２８】
アミノ酸の好適なカチオンおよびアニオンは、例えば、タウリン、グリシン、リシン、アルギニンまたはオルニチンのイオン、或いはアスパラギン酸およびグルタミン酸のイオンを含む。
【００２９】
一実施形態に従って、ＳＩＧＮＡＬは、鎖式もしくは大環状キレートである。常磁性金属イオン（例、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩＩ）およびＭｎ（ＩＩ）等）を有する安定錯体を形成するように、磁気共鳴画像用造影剤のためのキレート（キレート化剤、キレート配位子）を選択する。それらの例として、ラセミ体もしくは光学的活性体の鎖式か環状のどちらかのポリアミノポリカルボン酸（エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル］−Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−Ｌ−グリシン（ＥＯＢ−ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−Ｌ−グルタミン酸（ＤＴＰＡ−ＧＬＵ）、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−Ｌ−リシン（ＤＴＰＡ−ＬＹＳ）等）、ＤＴＰＡモノ−もしくはビス−アミド誘導体（例、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［カルボキシメチル［（メチルカルバモイル）メチル］アミノ］エチル］グリシン（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）、４−カルボキシ−５，８，１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−酸（ＢＯＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸（ＨＰＤＯ３Ａ）２−メチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＭＣＴＡ）、（アルファ、アルファ’、アルファ’’、アルファ’’’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＭＡ）、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−３，６，９−三酢酸（ＰＣＴＡ）等）、または１個もしくはそれ以上のカルボン酸基が対応する塩、エステルまたはアミドの形態であるそれらの誘導体、或いは、１個もしくはそれ以上のカルボン酸基がホスホン酸基および／またはホスフィン酸基で置換される対応する化合物（例えば、４−カルボキシ−５，１１−ビス（カルボキシメチル）−１−フェニル−１２−［（フェニルメトキシ）メチル］−８−（ホスホノメチル）−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−酸、Ｎ，Ｎ’−［（ホスホノメチルイミノ）ジ−２，１−エタンジイル］ビス［Ｎ−１０（カルボキシメチル）グリシン］、Ｎ，Ｎ’−［（ホスホノメチルイミノ）ジ−２，１−エタンジイル］ビス［Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン］、Ｎ，Ｎ’−［（ホスフィノメチルイミノ）ジ−２，１−エタンジイル］ビス［Ｎ−（カルボキシメチル）グリシン］、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［メチレン（メチルホスホン）］酸、または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［メチレン（メチルホスフィン）］酸）の残基が挙げられる。使用可能なキレートは、ＤＯＴＡガドフルオリン（ｇａｄｏｆｌｕｏｒｉｎ）、ＤＯ３Ａ、ＨＰＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＨＥＴＡ、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ、Ｍ４ＤＯＴＡ、Ｍ４ＤＯ３Ａ、ＰＣＴＡおよびそれらの誘導体、２−ベンジル−ＤＯＴＡ、アルファ−（２−フェネチル）１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン−１−アセト−４，７，１０−トリス（メチル酢）酸、２ベンジル−シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸、２−ベンジル−６メチル−ＤＴＰＡ、および６，６”−ビス［Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル）−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２”−テルピリジン、Ｎ，Ｎ’−ビス−（ピリドキサール−５−ホスフェート）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＤＰＤＰ）およびエチルエチレンジニトリロテトラキス（メチルホスフィン）酸（ＥＤＴＰ）でありうる。
【００３０】
好適なキレート配位子、さらにその調製方法は、例えば、以下の特許文献、ＥＰ−Ａ−２３０，８９３号明細書、ＥＰ−Ａ−２５５，４７１号明細書、ＥＰ−Ａ−２９９，７９５号明細書、ＥＰ−Ａ−３２５，７６２号明細書、ＥＰ−Ａ−５６５，９３０号明細書、ＥＰ−Ａ−５９４，７３４号明細書、米国特許第Ａ−４，８８５，３６３号明細書、ＥＰ−Ａ−７７３，９３６号明細書、国際公開第Ａ−９４２６３１３号パンフレット、国際公開第Ａ−９４２６７５４号パンフレット、国際公開第Ａ−９４２６７５５号パンフレット、国際公開第Ａ−９５１９３４７号パンフレット、国際公開第Ａ−９７３１００５号パンフレット、国際公開第Ａ−９８０５６２５号パンフレット、国際公開第Ａ−９８０５６２６号パンフレット、国際公開第Ａ−９９３５１３３号パンフレット、国際公開第Ａ−９９３５１３４号パンフレット、および国際公開第Ａ−０１４６２０７号パンフレットに記載され、それらは、参照されて、本明細書に組み込まれている。
【００３１】
好適なキレート配位子は、ラセミ体もしくは光学的活性体の鎖式および大環状のポリアミノポリカルボン酸である。
【００３２】
（ＤＴＰＡ）、（ＤＯＴＡ）、（ＢＯＰＴＡ）、（ＤＯ３Ａ）、（ＨＰＤＯ３Ａ）、（ＤＯＴＭＡ）、（ＰＣＴＡ）およびそれらの誘導体が、最も好適である。
【００３３】
適切なキレートは、この記載に限定されず、画像診断において良好な効率を有する化合物（Ｉ）の他のキレートも、適切である。特に、ＳＩＧＮＡＬは、国際公開第０１／６０４１６号パンフレットおよび米国特許第６，２２１，３３４号明細書に詳細に記載される一般式もしくはそれらの誘導体のＳＩＧＮＡＬでありうる。
【００３４】
好適な常磁性金属イオンとして、遷移金属およびランタニド金属（つまり、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属）のイオンが挙げられる。特に、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｍ、およびＹｂのイオンが好ましく、それらのうちで、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｅｕ、Ｇｄ、およびＤｙのイオンがさらに好ましく、Ｇｄのイオンが最も好ましい。
【００３５】
核医学診断において、金属キレートは、特定の用途に選択される金属イオンを有する安定錯体を形成するように、選択される。診断用の放射性医薬品のためのキレート化剤もしくは結合基は、画像化可能なガンマ線もしくは陽電子放出を有する放射性同位体（例、９９Ｔｃ、９５Ｔｃ、１１１Ｉｎ、６２Ｃｕ、６０Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ等）を有する安定錯体を形成するように、選択される。
【００３６】
テクネチウム、銅およびガリウム同位体のためのキレート化剤は、好ましくはジアミンジチオール、モノアミン−モノアミドジチオール、トリアミド−モノチオール、モノアミン−ジアミド−モノチオール、ジアミンジオキシム、およびヒドラジンから選択される。キレート化剤は、一般的に、窒素、酸素および硫黄から選択されるドナー原子を伴って四座である。好適な試薬は、アミン窒素およびチオール硫黄ドナー原子とヒドラジン結合単位とを有するキレート化剤からなる。チオール硫黄原子およびヒドラジンは、放射性医薬品を合成する試薬の使用に先立ってか、または放射性医薬品の合成中に好ましくはその場でのどちらかで、置換されることが可能である保護基を有する場合もある。
【００３７】
１１１Ｉｎおよび８６Ｙのためのキレート化剤は、通常、環状および非環式のポリアミノカルボン酸（例、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、Ｄ０３Ａ、２ベンジル−ＤＯＴＡ、アルファ−（２−フェネチル）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａａｚａｚｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）１−アセト−４，７，１０−トリス（メチル酢）酸、２−ベンジルシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸、２−ベンジル−６−メチルＤＴＰＡ、および６，６”−ビス［Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”−テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２”−テルピリジン等）から選択される。
【００３８】
上式（Ｉ）において、ＰＥＰＴＩＤＥおよびＳＩＧＮＡＬが、スペーサーＬＩＮＫＥＲに直接に（ｎ２＝０）か、或いはスペーサーＬＩＮＫＥＲを介してのどちらかで一緒に結合することが可能である。上式（Ｉ）において、２つ以上のペプチドに結合するひとつのＭＲＩターゲット構成物質（検出可能な基）を有することが可能である。ひとつの実現化において、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝１である。別の実現化において、シグナルを増加させるために、数種のキレートを用いる。例えば、ｎ１＝ｎ２＝１かつｎ３＝２〜８であり、例えば、リンカーは、少なくとも２個のキレートに化学結合した因子（ｄｉｖｉｓｏｒ）（例、１，３，５トリアジン因子等）である。式（Ｉ）のＭＲＩ用化合物が、２つ以上のＭＲＩ検出可能な基（キレート）を含有する場合、前記検出可能基も、多数の結合部位を含有するスペーサーＬＩＮＫＥＲを介して、２つ以上のペプチドに結合することが可能である。数字ｎ１、ｎ２、ｎ３は、化学構造と一致するように、また診断活性が得られるように、選択される。
【００３９】
例えば、ＬＩＮＫＥＲは、ヘテロ原子（例、酸素、窒素、および硫黄等）で置換されて割り込まれることが可能であるアルキリデン、アルケニリデン、アルキニリデン、シクロアルキリデン、アリーリデン、またはアラルキリデン基からなる。好適な一実施形態において、前記スペーサーアームは、直鎖もしくは分岐鎖の脂肪族からなり、前記脂肪族は、スペーサーの反応部分を効果的に切り離し、理想的には、ＰＥＰＴＩＤＥ分子の空間配置は、ＭＲＩ検出可能な基の存在により影響されず、ＰＥＰＴＩＤＥは、そのＭＭＰターゲットによってさらに容易に認識される。前記鎖は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＮＲ−、−ＣＳ−等の基により、またはフェニレン基等の芳香族環により割り込まれる場合もあり、および−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲＲ１、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ１（式中、ＲおよびＲ１は、互いに独立して、水素原子もしくは有機基でありうる）等の置換基を有する場合もある。
【００４０】
さらに包括的には、適切なリンカー基として、これに限定しないで、アルキルおよびアリール基（置換アルキルおよびアリール基を含む）、ヘテロアルキル（特にオキソ基）およびヘテロアリール基（アルキルアミン基を含む）が、以下に規定するように、挙げられる。
【００４１】
アルキル基には、直鎖もしくは分岐鎖アルキル基が含まれ、直鎖アルキル基が好ましい。分岐鎖であるならば、１つもしくはそれ以上の位置で、特に明記しない限り、いずれかの位置で分岐されている。アルキル基は、約１〜約１５個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１５）を配置し、好適な一実施形態では約１〜約１０個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１０）を有し、Ｃ１〜Ｃ５が特に好ましい。しかし、いくつかの実施形態において、アルキル基が、それよりも大きい場合もある。シクロアルキル基（Ｃ５およびＣ６環）と、窒素、酸素、硫黄またはリンを有する複素環も、アルキル基の定義に含まれる。アルキルには、硫黄、酸素、窒素のヘテロ原子、および好適であるシリコーンを有するヘテロアルキルも含まれる。アルキルには、置換アルキル基が含まれる。
【００４２】
本明細書において、「アリール基」もしくは「芳香族基」、或いは同義の語句は、一般的に５〜１４個の炭素原子（それよりも大きい多環式環構造が作られることもあるが）を含有する芳香族の単環式もしくは多環式炭化水素部分と、それらの炭素環式ケトンもしくはチオケトン誘導体のいずれかとを意味する。上記芳香族炭化水素において、自由電子価を有する炭素原子は、芳香族環の一員である。芳香族基には、３個以上の原子が除去されたアリーレン基および芳香族基が含まれる。上記適用の目的上、芳香族には複素環式が含まれる。「複素環式」もしくは「ヘテロアリール」は、指示された炭素原子の１〜５個が、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選択されたヘテロ原子で置換された芳香族基（自由電子価を有する原子は、芳香族環の一員である）と、それらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体のいずれかとを意味する。従って、複素環式には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル（ｉｍｉｄｏｚｙｌ）等が含まれる。アルキル基に関して、アリール基が、１個の置換基で置換される場合もある。
【００４３】
使用可能なリンカー基として、ｐ−アミノベンジル、置換ｐ−アミノベンジル、ジフェニルおよび置換ジフェニル、アルキルフラン（例、ベンジルフラン等）、カルボキシ、および１〜１０の炭素鎖長の直鎖アルキル基が挙げられる。好適なリンカーとして、ｐ−アミノベンジル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、酢酸、プロピオン酸、アミノブチル、ｐ−アルキルフェノール、４−アルキルイミダゾール、カルボニル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、グリコール（例、ＰＥＧ等）が挙げられる。本明細書において、「エチレングリコール」もしくは「（ポリ）エチレングリコール」は、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−基を意味する。但し、エチレン基の各炭素原子は、上記の通り、Ｒで１個もしくは２個置換される（つまり、−（Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２）ｎ−）。酸素の代わりに他のヘテロ原子を有するエチレングリコール誘導体（つまり、−（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−もしくは−（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−、或いは置換基を有する）も、適切である。スクアレート（Ｓｑｕａｒａｔｅ）リンカーも使用可能である。
【００４４】
別の実施形態に従って、ＳＩＧＮＡＬは、キレートシグナル構成物質を運ぶことができるキャリアー脂質および／または高分子系である。数種のキャリアー系は、公知であり、すなわち脂質のナノ液滴（ナノ粒子のエマルション）が、国際公開第０３／０６２１９８号パンフレットなどに記載されており、参照されて組み込まれている。上記の特許文献は、アルファｖベータ３受容体をターゲットとするバイオベクターを運ぶナノ液滴による特殊な画像化の概念の検証を記載する。米国特許第６，４０３，０５６号明細書（参照され、組み込まれている）に記載されるような他の母体となる技法も、使用されうる。ひとつのナノ液滴には、通常、１００００〜１０００００キレートが含まれる。
【００４５】
多くのナノ粒子のエマルションを使用してもよい。例えば、Ｗ０９５／０３８２９は、薬剤が油滴内に分散もしくは可溶化し、油滴が配位子により特定の位置にターゲットとされるオイルエマルションを記載する。米国特許第５，５４２，９３５号明細書は、ガス入りパーフルオロカーボンマイクロスフェアを用いる部位特異的薬剤の輸送を記載する。ターゲット構成物質の輸送は、マイクロスフェアをターゲットに向かって進ませることにより、達成され、結果としてそれらの破綻をもたらす。低沸点のパーフルオロ化合物を用いて、気泡が形成できるような粒子を生成する。ナノ粒子が米国特許第５，９５８，３７１号明細書に記載されるような高沸点のパーフルオロカーボン液をベースとするエマルションを採用することは、可能である。上記の液状エマルションは、脂質および／または界面活性剤からなるコーティングで囲まれた相対的に高沸点のパーフルオロカーボンからなるナノ粒子を含有する。包囲しているコーティングは、ターゲット部分に直接結合でき、或いは、場合によりリンカーを介して、ターゲット部分に共有結合する中間成分を取り込むことが可能である。
【００４６】
可能性のあるエマルションは、コアとして高沸点パーフルオロカーボンと、外側のコーティングとを含有するナノ粒子系である。該外側のコーティングは、１種もしくはそれ以上の所望の成分の多様な複製をナノ粒子に結合させるための賦形剤を提供する脂質／界面活性剤の混合物である。基本粒子の構成およびそれらを含有するエマルションの形成は、外面に結合する成分にかかわらず、本願特許出願人の上記の特許文献、米国特許第５，６９０，９０７号明細書、同第５，７８０，０１０号明細書、同第５，９５８，３７１号明細書に記載されている。
【００４７】
有用なパーフルオロカーボンエマルションは、米国特許第６，６７６，９６３号明細書に記載され、その例として、パーフルオロカーボン化合物が、パーフルオロデカリン、パーフルオロオクタン、パーフルオロジクロロオクタン、臭化パーフルオロ−ｎ−オクチル、パーフルオロヘプタン、パーフルオロデカン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロモルホリン、パーフルオロトリプロピルアミン、パーフルオロトリブチルアミン、パーフルオロジメチルシクロヘキサン、パーフルオロトリメチルシクロヘキサン、パーフルオロジシクロヘキシルエーテル、パーフルオロ−ｎ−ブチルテトラヒドロフラン、およびこれらの化合物と構造上類似し部分的もしくは完全にハロゲン化した化合物（少なくとも数種のフッ素置換基を含む）もしくは部分的もしくは完全にフッ素化した化合物（パーフルオロアルキル化エーテル、ポリエーテルまたはクラウンエーテルを含む）であるパーフルオロカーボンエマルションが、挙げられる。
【００４８】
ナノ粒子上の外側コーティングを形成するために使用される脂質／界面活性剤（所望の成分を表面に結合させるために、結合配位子もしくは取り込み（ｅｎｔｒａｐ）試薬を含有していると思われる）として、通常、天然もしくは合成のリン脂質、脂肪酸、コレステロール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン等が挙げられ、それらには、ポリエチレングリコールを共役する脂質が含まれる。各種の市販されているアニオン性、カチオン性、およびノニオン性界面活性剤を利用することも可能であり、それらとして、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎｓ）、スパン（Ｓｐａｎｓ）、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎｓ）等が、挙げられる。数種の界面活性剤は、パーフルオロ化したアルカン酸（例、パーフルオロヘキサン酸およびパーフルオロオクタン酸等）、パーフルオロ化したアルキルスルホンアミド、アルキレン第四級アンモニウム塩等のようにそれ自体フッ素化される。さらに、パーフルオロ化したアルコールホスフェートエステルも利用することが可能である。外層に含まれるカチオン性脂質は、核酸（具体的にはアプタマー）などの取り込み配位子において有利である場合もある。
【００４９】
脂質／界面活性剤を被覆したナノ粒子は、コアを形成するフルオロカルボン脂質と、エマルションを形成するための水性媒体中での懸濁液の外層を形成する脂質／界面活性剤の混合物との混合液を微小流体にすることにより、通常、形成される。上記の手順において、脂質／界面活性剤がナノ粒子上に被覆される場合、それらを追加の配位子に既に結合する場合もあり、或いは、続いての結合のための反応性基を単に含有する場合もある。別の方法として、脂質／界面活性剤の層に含まれる成分を、補助材料の溶解性に基づいて、層内で単に可溶化してもよい。水性媒体中に脂質／界面活性剤の懸濁液を得るために、音波破砕もしくは他の技法が、必要とされうる。
【００５０】
通常、脂質／界面活性剤の外層中の少なくとも１種の材料は、追加の所望の成分を結合するのに有用であるリンカーもしくは官能基を含むか、或いは、エマルションが調製される時に、上記成分が、上記材料に既に結合されている場合もある。
【００５１】
ターゲットペプチドもしくは他の有機基（例、常磁性金属のためのキレート剤）を外層成分に共有結合させることによる結合に関して、様々な種類の結合および結合剤を採用してもよい。このような結合を形成する典型的な方法には、カルボジアミドを用いてのアミドの生成、または不飽和成分（マレイミド等）を用いてのスルフィド結合の形成が含まれる。他のカップリング剤として、例えば、グルタルアルデヒド、プロパンジアールもしくはブタンジアール、２−イミノチオラン塩酸塩、二官能基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン等）、ヘテロ二官能基の試薬（例、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）スクシンイミド、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、およびスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等）、ホモ型二官能基の試薬（例、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フェニレンジイソチオシアナート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニンｐ−ニトロフェニルエステル）、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、エリトリトールビスカーボネート等）および二官能基のイミドエステル（例、ジメチルアジポイミデートヒドロクロリド、スベルイミノ酸ジメチル、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートヒドロクロリド等）などが挙げられる。アシル化、スルホン化、還元的アミノ化等により、結合を達成することができる。所望の配位子を外層の１種もしくはそれ以上の成分に共有結合する多数の方法が、当技術分野では、公知である。その特性が適切ならば、配位子自体が、界面活性剤の層に含まれてもよい。例えば、配位子が、高親油性の部分を含有するならば、配位子自体が、脂質／界面活性剤のコーティング内に埋め込まれる。さらに、配位子が、コーティングに直接吸着できるならば、これもまた、その結果として配位子の結合をもたらすだろう。
【００５２】
ＰＥＰＴＩＤＥに対して十分に親水性が認められるならば、他の有用な被包系（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、例えば、単層もしくは多層の脂質系、リポソーム、サッカリドポリマーを用いてもよい。
【００５３】
他の実施形態に従って、ＳＩＧＮＡＬは、一般的に酸化鉄もしくは水酸化鉄を含む超小型の超常磁性粒子ＵＳＰＩＯなどの鉄をベースとした金属ナノ粒子である。上記の磁気粒子は、フェライト、殊にマグヘマイト（γＦｅ２Ｏ３）および磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、またはさらにコバルトの混合フェライト（Ｆｅ２ＣｏＯ４）もしくはマンガンの混合フェライト（Ｆｅ２ＭｎＯ４）を含むのが好ましい。
【００５４】
適切に被覆された強磁性もしくは超常磁性粒子の例は、例えば、米国特許第４，７７０，１８３号明細書、同第４，８２７，９４５号明細書、同第５，７０７，８７７号明細書、同第６，１２３，９２０号明細書、および同第６，２０７，１３４号明細書に記載される粒子であり、該粒子は、コーティング材料、つまり、ポリマー（例、多糖、炭水化物、ポリペプチド、オルガノシラン、タンパク質等、ゼラチン−アミノデキストラン、またはデンプンおよびポリ酸化アルキレン）を、それらが官能基化されて、粒子がスペーサーにまたは直接ＰＥＰＴＩＤＥに結合するような条件で、有する。
【００５５】
実現化において、粒子は、ホスフェート、ホスホネート、ビスホスホネートまたはｇｅｍ−ビスホスホネートコーティングで被覆される。好適な１種のｇｅｍ−ビスホスホネートコーティングは、ビスホスホネート部分が粒子に結合している式Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ３Ｈ２）２
（式中、
Ｘは、ＰＥＰＴＩＤＥと反応可能な化学官能基であり、
Ｌは、Ｘを官能基ｇｅｍ−ビスホスホネート−ＣＨ（ＰＯ３Ｈ２）２に結合させる有機基である）のｇｅｍ−ビスホスホネートコーティングである。
【００５６】
特に好適な一実施形態に従って、Ｌは、置換もしくは未置換の脂肪族基、さらに好ましくは基−（ＣＨ２）ｐ−を表し、式中、ｐは、１〜５の整数である。別の好適な実施形態に従って、Ｌは、基Ｌ１−ＣＯＮＨ−Ｌ２、さらに好ましくは基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−を表し、式中、ｎおよびｍは、０〜５の整数である。
【００５７】
式（Ｉ）のｇｅｍ−ビスホスホネート化合物のＸ末端は、ＰＥＰＴＩＤＥバイオベクター上に存在する基と反応して、共有結合を形成できるような方法で、選択される。上記のカップリングプロセスに関するさらなる情報のために、特に、バイオコンジュゲート・テクニック（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、グレッグＴ．ハーマンソン（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、１９９５年、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック社（Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照してもよい。
【００５８】
好適なＸ基として、特に以下の基が記載されている。
・−ＣＯＯＨ、
・−ＮＨ２、−ＮＣＳ、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＣＨＯ、アルキルピロカルボニル（−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−ａｌｋ）、アシルアジジル（ａｃｙｌａｚｉｄｙｌ）（−ＣＯ−Ｎ３）、イミノカーボネート（−Ｏ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２）、ビニルスルフリル（−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ２）、ピリジルジスルフリル（−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ）、ハロアセチル、マレイミジル、ジクロロトリアジニル、ハロゲン、
・基−ＣＯＯＨと−ＮＨ２が、特に好ましい。
【００５９】
本願特許出願人は、コーティングが、ホスホネートもしくはビスホスホネート、またはｇｅｍビスホスホネートを除くそれらの誘導体である化合物を研究してきた。
【００６０】
別の実施形態に従って、シグナル構成物質は、蛍光画像用の蛍光プローブである。近赤外線蛍光画像において、規定された帯域幅を有するフィルターライトもしくはレーザーを励起光源として用いる。励起光は、体組織を通って進む。励起光が、近赤外線蛍光分子（「造影剤」）に衝突すると、励起光は、吸収される。その後、蛍光分子は、励起光からスペクトル的に識別できる（僅かに長い波長）光（蛍光）を発する。
【００６１】
特に、ＭＭＰのターゲットとなっているフルオロクロムは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１５０６２号明細書に記載されている。酵素感受性の分子プローブは、合成されていて、それは６００〜９００ｎｍで蛍光活性化できる。これらのプローブは、米国特許第６，０８３，４８６号明細書に詳細に記載されている。蛍光プローブ（つまり、短波長で励起、長波長で発光）は、生物現象を研究するのに理想的に適しているので、蛍光顕微鏡検査法において、広く使われてきた。蛍光プローブを生存系に用いるならば、ヘモグロビン（＜５５０ｎｍ）もしくは水（＞１２００ｎｍ）などの生理学的に豊富な吸収体によって吸収量を最小限に抑えることにより、組織透過を最大にするように、その選択は、一般的に近赤外線スペクトル（６００〜１０００ｎｍ）に限定される。
【００６２】
通常、フルオロクロムは、８００±５０ｎｍで、発光するように設計されている。各種のＮＩＲＦ分子が、記載されおよび／または市販されている。その例として、以下が挙げられる：Ｃｙ５．５（イリノイ州アーリントンハイツのアマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．））；ＮＩＲ−１（日本、熊本県の同仁化学研究所（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｊａｐａｎ））；ＩＲＤ３８２（ＬＩ−ＣＯＲ、ネブラスカ州リンカーン（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒ．））；ラ・ホイヤ・ブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）（フロリダ州マイアミのダイアトロン社（Ｄｉａｔｒｏｎ， Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．））；ＩＣＧ（イリノイ州リンカーンシャーのアコーン社（Ａｋｏｒｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ，Ｉｌｌ．））；およびＩＣＧ誘導体（フランス、パリのセルブ・ラブ（Ｓｅｒｂ Ｌａｂｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ））。
【００６３】
量子ドット誘導体（ナノ結晶を含む無機フルオロフォア）を使用してもよい。
【００６４】
本発明の別の態様は、患者において、細胞外マトリックス分解と関連する心血管病理（例、アテローム性動脈硬化症、心不全、および再狭窄等）を画像化する方法を目的とする。上記態様は、以下を包含する。（１）心血管病理の位置を突き止めることができる本発明の常磁性金属の薬剤を注射もしくは点滴により患者に投与する。（２）磁気共鳴画像もしくは２次元ＣＴまたはＳＰＥＣＴガンマシンチグラフィ、或いは陽電子放射断層撮影もしくは超音波診断を用いて、患者を画像化する。
【００６５】
本発明は、さらに、本発明の製品を用いる診断画像および／またはプラークの形態学的解析および／または狭窄症の臨床試験を組み合わせた脆弱性プラークを評価する方法にも関する。
【００６６】
本発明は、さらに以下に関する。
−ａ）上記の診断用薬を患者に投与する段階と、ｂ）診断画像技法により、患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階を含む、患者において、マトリックスＭＭＰの存在を検出、画像化、またはモニターする方法。
−ａ）上記の診断用薬を患者に投与する段階とｃ）診断画像技法により、患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階を含む、患者において、ＭＭＰ活性に関連した病的異常を検出、画像化、またはモニターする方法。
−アテローム性動脈硬化症が、アテローム性冠動脈硬化症もしくは脳血管性のアテローム性動脈硬化症である上記の方法。
−上記の方法を実行して患者において活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、一過性脳虚血発作もしくは脳卒中に対して高リスクの患者を識別する方法。
−上記の方法により患者を画像化して活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、急性心臓虚血、心筋梗塞または心臓死に対する高リスクの患者を識別する方法。
【００６７】
本発明に係るＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）を、画像化するために、ＭＲＩに用いられる特定の技法で所望のコントラストを得るのに十分な量を患者に投与してもよい。一般的に、体重１Ｋｇ当たり約０．００１〜約５．０ミリモルのＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）の用量は、所望のコントラストを得るのに十分である。殆どのＭＲＩ適用に関して、画像化用の金属化合物の好適な用量は、体重１Ｋｇ当たり０．００１〜２．５ミリモルの範囲であろう。
【００６８】
本発明のＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）を、ＭＲＩによる診断法において使用する造影剤の製造のために採用することができ、上記診断法は、前記造影剤をヒトもしくは動物に投与し、前記ヒトもしくは動物の少なくとも一部分の画像を描出することを包含する。
【００６９】
前記使用に関して、本発明のＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）は、従来の製薬補助剤（例、乳化剤、安定剤、酸化防止剤、重量オスモル濃度調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤等）を用いて配合される場合もあり、また非経口投与（例えば、点滴もしくは注射注入）に適切な剤形である場合もある。
【００７０】
従って、本発明に係るＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）は、注射薬用に生理学的に許容できるキャリアー媒体（例、水等）に入れた従来型投与剤形（例、溶液、懸濁液、または分散液等）であってよい。
【００７１】
非経口的に投与可能な剤形（例えば、点滴液）は、無菌でかつ生理学的に許容できない薬剤を無添加であるのが望ましく、さらに、投与に際して刺激や他の悪影響を最小限に押さえるために、低い重量オスモル濃度を有するのが望ましい。上記の非経口的に投与可能な溶液は、注入可能な溶液で慣例的にされているように、調製できる。それらは、添加剤（例、酸化防止剤、安定剤、緩衝剤等）を含有する場合もあり、それらの添加剤は、ＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）の化学構造と適合し、それらの製造、保管、使用に干渉しない。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、上記の詳細な説明に記載されているだろう。
【００７３】
１）ガドリニウムキレートをベースにする化合物：調製および生物アッセイと画像化
造影剤
式ＩＩ ｐ−アミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨのヒトＭＭＰ阻害剤を、イソチオシアナートリンカーとの結合のために適切に１：１の割合で、官能基化されたＧｄ３＋キレート化剤（ＤＯＴＡ）上でグラフトして、化合物Ｂを得た。
【００７４】
０．４２ｇのＩｎｔ１、０．３４ｇのペプチドＡｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨＯＨ（バッケム社（Ｂａｃｈｅｍ）から）、２００μｍＬのトリエチルアミンを、２０ｍＬのＤＭＳＯ中に室温で溶かす。その溶液を３時間攪拌する。２００ｍＬのエーテルをその溶液に滴下する。沈殿物をエーテル、エタノール、ジクロロメタンで洗浄する。
分析：ＨＰＬＣ純度＝９２％；ＨＰＬＣ：カラム：シンメトリー（ＳＹＭＭＥＴＲＹ）Ｃ１８、５μｍ、１００Å、２５０＊４．６ｍｍ
【００７５】
上記の特異的な造影剤の化学純度は、９０％を上回った。さらに、化合物Ｂは、１２１０Ｄａの分子量を示し、参照化合物として用いた非特異的製品であるガドテル酸（Ｇｄ−ＤＯＴＡ、Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）ゲルベ社（ＧＵＥＲＢＥＴ）、フランス）とほぼ等しい緩和値を示した。化合物ＢのＭＭＰ阻害剤は、水可溶性のテトラペプチジルヒドロキサム酸（バッケム社（Ｂａｃｈｅｍ）から購入）（スイスのブデンドルフ、（Ｂｕｄｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からなる。
【００７６】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＭＰ抑制試験
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−３活性を抑制する化合物Ｂもしくは対応するペプチドヒドロキサメートの能力を、ヒト酵素でｉｎ ｖｉｔｒｏ試験した。反応は、基質のＭＭＰ開裂（実験条件に関しては表１を参照のこと）の後に生成された蛍光化合物の組成に基づいた。簡単に述べると、化合物Ｂもしくは上記ペプチドだけを、３種の異なる濃度で、緩衝剤含有ＭＭＰに添加して試験した。対照試料に関しては、造影剤もしくはペプチドを水で置き換えた。３７℃で３０分間の前培養後、蛍光測定（＝Ｆ１）で全化合物の干渉を検出するために、マイクロプレートリーダー（ジェミニ（Ｇｅｍｉｎｉ）ＸＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて、蛍光強度を測定した。次に、ＭＭＰ基質を加えて、酵素反応を開始し、混合液を再び３７℃で培養した。予定時間後、第二蛍光測定を実施した（＝Ｆ２）。シグナルＦ２からシグナルＦ１をサブトラクションして、酵素活性を測定し、その結果を対照の酵素活性の抑制率（パーセント）として、表した。
【００７７】
さらに、ＭＭＰの標準阻害剤として、ＴＩＭＰ−１もしくはＧＭ６００１を用いて、試験を実証した（表２参照）。
【００７８】
生体内分布アッセイ
動物：Ｇｄ−ＤＯＴＡと比べる場合、化合物Ｂの組織分布を完全なＣ５７ＢＩ／６系統のＡｐｏＥ−ＫＯマウスで実施した。Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ベルギーのルヴェン（Ｌｅｕｖｅｎ Ｂｅｌｇｉｕｍ））の動物実験ユニット（Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｕｎｉｔ）で、動物を繁殖させて収容し、食料と水を自由に摂取させた。
【００７９】
週齢１１〜１２のＡｐｏＥ−ＫＯマウスに、コレステロールが豊富な西洋タイプの食餌（Ｔｅｃｋｌａｄ、米国マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ））を４ヶ月与えた。このモデルのアテローム性動脈硬化症は、以下により十分に特徴付けられた。モデルは、心臓および大動脈弓に広範囲のアテローム性動脈硬化プラークがあり、そのプラークは、総管腔領域の３４％を占めていた。さらに、この動物モデルは、極度の脂質の汚染を示し、さらに、プラーク領域で、マクロファージ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−３の存在が、それぞれ１５％、１０〜２０％、２０〜４０％の割合で見られた。
【００８０】
生体内分布：ダイエット期間後、同じ性別で同体重の動物を用いた。尾静脈注射により、１００μモルＧｄ／ｋｇの臨床用量で、化合物ＢもしくはＧｄ−ＤＯＴＡを投与した（ｎ＝７／化合物）。投与の６０分後、動物に麻酔をかけ、眼底採血により血液を得た。全ての循環する残存造影剤を血管内から除去するために、ヘパリン添加の食塩水で、経心臓的灌流をマウスに施した。筋および各種の器官（腎臓、肝臓）を除去し、同様に、数種の動脈標本（大動脈弓、頚動脈、胸大動脈、腹大動脈および大腿動脈）も除去した。最後に、血液試料の部分標本を遠心分離機にかけて、採取した全試料に含有するＧｄ３＋を酸性で無機化した後、誘導結合プラズマ−質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）により、定量した。
【００８１】
Ｅｘ ｖｉｖｏでの磁気共鳴画像
標本の調製：ＬＤＬ受容体の遺伝子欠損のため、高コレステロール血症、続いてアテローム性動脈硬化症を患う、ワタナベ遺伝性高脂血症（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ）ウサギ（ＣＡＰ、Ｏｌｉｖｅｔ、フランス）に、深部麻酔をかけた。残った全ての血液を瀉血し、ウサギを死亡させた後、導出動脈の起始部を伴う大動脈弓、さらに胸部大動脈や腎臓の上部の腹部大動脈を含む動脈管系を１ブロックで除去し、全ての残存する血液を除去するために、ヘパリン添加のクレブス・リンガー重炭酸塩（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液（ｐＨ＝７．４）でフラッシュした後、動脈血標本を−２０℃で凍結させた状態に維持した。実験の目的上、該標本を徐々にその場で解凍した。
【００８２】
新鮮な頚動脈の試料を、頸動脈内膜剥離術を受ける患者（ｎ＝２１）から獲得した。標本は、一般的な頚動脈、内頚動脈および外頚動脈からなる。切除したプラークを氷のように冷たい食塩水中ですすぎ、それらを手術後２〜４時間のうちに使用した。
【００８３】
最終的に、ウサギとヒトの両方のアテローム性動脈硬化セグメントを造影剤と接触させ、ｅｘ ｖｉｖｏで画像化する前に、それらを正確に３．０ｍｍの厚さのセグメントに切断した。
【００８４】
Ｅｘ ｖｉｖｏ培養：全ての薄片を２４ウェルの培養プレートに沈着させた後、それらを、１．０ｍｌのクレブス・リンガー重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）、Ｇｄ−ＤＯＴＡもしくは化合物Ｂ（Ｇｄ濃度５×１０−４Ｍで）中で、３７℃で攪拌しながら培養した。１時間、３時間または１８時間の予め定めた培養後、ＷＨＨＬウサギ由来の薄片を直ちに画像化するか、或いは１０．０ｍｌのクレブス・リンガー重炭酸塩緩衝液中で３０分、１時間または３時間（各条件に対してｎ＝３）、毎時に媒体を取替えて、洗浄した。ヒト試料に関して、化合物の間で最も良好な分化を与えるプロトコル（つまり、培養期間１８時間、続いて３０分間の洗浄）だけを割り当てた。その後、全薄片を排出させ、ｅｘ ｖｉｖｏでの画像化のために調製した。さらに、損傷プラークと損傷していないプラーク標本に関して両方、プロトコルを割り当てた。
【００８５】
特異性試験：化合物Ｂの取り込みの特異性を追加的に試験するために、本発明者らは、化合物Ｂよりも１０倍高い濃度（つまり、５×１０−３Ｍ）でのヒドロキサメートペプチドで、前もって３０分間培養した一組の新規のＷＨＨＬウサギのアテローム性動脈硬化の薄片でｅｘ ｖｉｖｏでの１８時間の培養を繰り返した。既に記載した如く、試料を続いて３０分間洗浄した。
【００８６】
ｅｘ ｖｉｖｏでの画像化による造影剤の検出およびＧｄ定量化：ｅｘ ｖｉｖｏでのＭＲＩに関して、新規の２４ウェルプレートに大動脈薄片を移動し、室温で、半固体の寒天ゲル（０．８％ｍ／ｖ）に大動脈薄片を包埋した。２．３５ＴのＭＲＩ系（Ｂｉｏｓｐｅｃ、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）上で、７ｃｍ内径のバードケージ型コイルと２００ｍＴ／ｍ挿入傾斜を用いて、画像化を実施した。スクリーニングの解像度、短い継続時間と切片の部位の間に妥協点を有する、追従パラメーター（ＴＲ／ＴＥ／α＝２０ｍｓ／４．２ｍｓ／７５°、マトリックス２５６＊２５６＊１６、解像度２３５＊１７５＊１０００μｍ３、継続時間２１’４９”）で、３ＤのＴ１ｗＳＮＡＰ配列を獲得した。
【００８７】
最終的に、上記ゲルを大動脈セグメントから除去し、酸性で無機化した後、各々正確に秤量した試料に含有されるＧｄをＩＣＰ−ＭＳより、定量化した。
【００８８】
免疫組織化学：上記のｅｘ ｖｉｖｏでのスクリーニング試験を検証し、化合物Ｂに対して獲得したＭＲＩシグナルをターゲットとしたＭＭＰと相関させるために、本発明者らは、免疫組織化学解析を実施した。培養し洗浄したＷＨＨＬウサギおよびヒト由来の切片で、アッセイを実施した。ウサギに関して、ＭＭＰ−２（ポリクローナル抗体、ドイツのダルムシュタットのカルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））とＭＭＰ−９（モノクローナル抗体、米国サンディエゴのオンコジーン・リサーチ・プロダクト社（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ））を認識する抗体のみを購入し、検証した。ヒト切片における免疫組織化学解析に関して、ＭＭＰ−１（ウサギ抗ＭＭＰ−１ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＭＭＰ−２（ウサギ抗−ラットＭＭＰ−２ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＭＭＰ−３（ウサギ抗−ＭＭＰ−３ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＭＭＰ−７（ウサギ抗−ＭＭＰ−７ポリクローナル抗体、（米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））およびＭＭＰ−９（ヤギ抗−ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州サンタ・クルズのサンタ・クルズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））の検出のために、追従抗体を用いた。両方の場合において、製造者の説明書に従って、免疫組織化学解析を実施した。
【００８９】
統計的解析
データを平均±ＳＥＭで表した。次に、両側Ｐ値（グラフパッドインサート（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ）３）を用いて、一連のデータを対応のないノンパラメトリックのマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定と比較した。Ｐ＜０．０５で、差を有意とみなした。
【００９０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＭＰ抑制試験
化合物Ｂとその対応するペプチジルヒドロキサム酸のヒトＭＭＰ抑制活性の結果を表２に示す。両化合物は、１．０Ｅ−０５Ｍの濃度で、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２に有効であり、化合物Ｂは、上記ペプチドと比較した場合、増大した抑制活性を示す。対照的に、ＭＭＰ−３に関して２種のプロテアーゼ阻害剤に、非活性を示した。これらの実験値は、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３に関するペプチジルヒドロキサム酸の公表されるＩＣ５０値（ＩＣ５０を各々１．０Ｅ−０６Ｍと１．５Ｅ−０４Ｍとみなす）と完全に一致した。しかしながら、化合物Ｂと上記ペプチドに対して１．０Ｅ−０５Ｍの濃度で、酵素抑制率を既に実測した（ＩＣ５０は、３．０Ｅ−０５Ｍで報告されている）ように、結果は、ＭＭＰ−２に対して僅かに強かった。
【００９１】
生体内分布アッセイ
ＡｐｏＥ−ＫＯマウスの血漿、主器官および動脈標本における化合物Ｂとその参照化合物Ｇｄ−ＤＯＴＡの生体内分布を図１に示す。静脈注入後１時間、両種の造影剤は、肝臓の取り込みとは異なり、血漿、腎臓および筋肉蓄積において有意差を示さなかった。一般的に、化合物ＢとＤｏｔａｒｅｍ（著作権）の濃度は、排出器官である腎臓を除いて、主要器官において劣った（つまり、＜１％ＩＤ）。さらに、２種の造影剤を体内から直ちに除去した。血漿で判明される注入量のパーセントは、約１〜２％であった（血漿中での放出の半減期：１５分）
【００９２】
動脈標本での組織分布に関して、化合物Ｂは、Ｄｏｔａｒｅｍ（ｐ＜０．０１）と比較した場合３〜３．５倍の濃度で、動脈性の壁に優先的に蓄積したことが示される。さらに、化合物Ｂは、最も多くのアテローム性動脈硬化プラーク（頚動脈および大動脈弓）を含む動脈性領域に汚染の傾向を示したが、Ｄｏｔａｒｅｍ（著作権）では、示さなかった。
【００９３】
Ｅｘ ｖｉｖｏでの磁気共鳴画像
ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ由来の動脈薄片で、アッセイを実施した。１時間、３時間または１８時間の培養後、全ての切片は、参照化合物Ｇｄ−ＤＯＴＡで強いが広範囲の増大を示した。この結果は、３〜９ナノモル／切片（平均値）を得たＩＣＰ−ＭＳによる切片中のＧｄ測定量と一致した。しかしながら、Ｇｄ−ＤＯＴＡは、３０分間の最初の洗浄工程中に直ちに消滅した。この時点で、Ｇｄ濃度は、平均値で、０．８ナノモル／切片より低かった。
【００９４】
対照的に、化合物Ｂは、全培養（５〜１１ナノモル／切片の平均Ｇｄ濃度）後、強いがさらに描出した増大を示したが、上記造影剤は、培養期間が１時間を超える場合に、Ｇｄ−ＤＯＴＡのように速く溶出しなかった。事実、３時間もしくは１８時間培養した場合、３０分および１時間の洗浄後、１〜８ナノモル／切片の各平均Ｇｄ濃度に対応して、上記造影剤は、はっきりしたシグナルを示した（図２）。
【００９５】
さらに、遊離ペプチドでの予備培養に関する抑制率／競争の研究を実施した場合、本発明者らは、化合物Ｂにのみ極僅かな増強を見出した。このことは、抑制率／競争は有効であり、化合物Ｂは、そのターゲットに対して特異的であることを示唆した。最終的に、ｅｘ ｖｉｖｏスクリーニングに対するこのアテローム性動脈硬化モデルは、対象のＭＭＰを含有すると検証され、免疫組織化学解析により、ＭＭＰ−１に対して高い可能性とＭＭＰ−９の低い発現性が明らかにされた。
【００９６】
頚動脈の外科的切除を施したヒト由来の動脈薄片で実施したアッセイ：特異的造影剤と非特異的造影剤を識別できる事前の実験スクリーニング条件（例えば：１８時間の培養後、３０分洗浄）の如く、および造影剤を検出する２つの技法、つまり良好に相関するｅｘ ｖｉｖｏでのＭＲＩとＩＣＰ−ＭＳによるＧｄ定量化の如く、本発明者らは、アテローム変性のヒト切片に関する研究にそれらを採用した。その結果は、ｅｘ ｖｉｖｏでのＭＲＩおよびＧｄ定量化により例証されるように、特異的な化合物Ｂだけがアテローム変性のヒト切片を増大することが可能で、非特異的化合物Ｇｄ−ＤＯＴＡでは、不可能であることを示した。さらに、化合物Ｂは、脆弱性プラーク（免疫組織化学分析よりＭＭＰ−１、−２、−３、−７および−９に対して高い可能性を示した）と無症候性プラーク（低量のＭＭＰを含有する）を識別できる。化合物Ｂは、ヒトアテローム性動脈硬化プラークの炎症性の程度、つまり脆弱性を評価することを対象としうると結論付けることができる。
【００９７】
（表１）ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＭＰ抑制試験のための実験条件
【００９８】
（表２）蛍光分析により測定した、ヒトＭＭＰ−１、−２、および−３活性に関するプロテアーゼ阻害剤化合物Ｂおよびその対応するペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの効果。２通りの結果を得た。対照値のパーセント抑制率の平均として、結果を表す。
【００９９】
実施例２）酸化鉄の超常磁性粒子をベースとする化合物
副実施例２．８：硝酸系磁性流体（ｎｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）（サイズＰＣＳ＝３８ｎｍ）
【０１００】
副実施例２．９：硝酸系磁性流体（サイズＰＣＳ＝２３，３ｎｍ）
【０１０１】
化合物Ａ
【０１０２】
副実施例２．１０：（サイズＰＣＳ＝６７，９ｎｍ）
副実施例８＋化合物Ａ
【０１０３】
副実施例２．１１：（サイズＰＣＳ＝４０，３ｎｍ）
副実施例８＋化合物Ａ＋処理剤ｐＨ１１
【０１０４】
副実施例１２：（サイズＰＣＳ＝２５，６ｎｍ）
副実施例９＋化合物Ａ
【０１０５】
副実施例２．１８
副実施例１２＋化合物ＰＥＰＴＩＤＥ
【０１０６】
化合物Ａの調製
【０１０７】
１）ジエチル−１−［エトキシホスホリル］ビニルホスホネート
１３ｇ（０．４３３モル）のパラホルムアルデヒドと１０ｍｌ（０．０９７モル）のジエチルアミンを、２５０ｍｌのメタノール中に熱状態で溶かす。次に、２４ｇ（８．６７×１０−２モル）のジエチル［エトキシ（プロピル）ホスホリル］メチルホスホネートを加える。混合液を２４時間還流する。反応媒体を真空下で濃縮する。濃縮物を２５０ｍｌのトルエンで２回溶かした後、真空下で濃縮する。
【０１０８】
得られたオイルを１２５ｍｌのトルエン中に溶かす。０．１４ｇのパラ−トルエンスルホン酸を加えた。ディーン・スターク・トラップ（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ ｔｒａｐ）を用いて、混合液を２４時間還流し、その後、真空下で乾燥するまで濃縮する。
【０１０９】
生成物を５００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、２５０ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮する。
【０１１０】
粗生成物を６２５ｇのＭｅｒｃｋ Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）シリカゲル（４０〜６３μｍ）で精製する。溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン−５０／５０
１８．４ｇを７１％の収率で単離する。
マススペクトル：Ｍ／ｚ＝３０１．４（ＥＳ＋）理論値Ｍ＝３００．２
Ｃ１３スペクトル：（ｓ）１４８．８ｐｐｍ、（ｔ）１３４．８−１３１．５−１２８．２ｐｐｍ、（ｓ）６２．２ｐｐｍ、（ｓ）１６．７ｐｐｍ
Ｈ１スペクトル：（ｔ）６．９−６．８−６．６ｐｐｍ、（未分割のピーク）３．９ｐｐｍ、（ｔ）１．１５ｐｐｍ
【０１１１】
２）ジエチル２−［２．２−ビス（ジエチルホスホリル）エチル］マロネート
１．６ｇ（０．０１モル）のジエチルマロネート、０．０７ｇ（０．００１モル）のナトリウムエトキシドと３ｇ（０．０１モル）のジエチル［エトキシ（プロピル）ホスホリル］ビニルホスホネートを、１５ｍｌのエタノール中で、１５分間攪拌する。［ＴＬＣ：ＳｉＯ２、溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン−５０／５０−Ｒｆ＝０．６］。
【０１１２】
５ｍｌの飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液をエタノール溶液に加える。混合液を真空下で濃縮する。残渣を３０ｍｌのエチルアセタートで抽出し、５ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、蒸発乾燥させる。
【０１１３】
得られたオイルを２００ｇのＭｅｒｃｋ Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）シリカ（４０〜６３μｍ）で精製する。溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン−５０／５０
３．８ｇを収率８２％で単離する。
マススペクトル：Ｍ／ｚ４６０．９（ＥＳ＋）、理論値Ｍ＝４６０。
【０１１４】
３）４，４−ジホスホノブタン酸（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）
７ｇ（１５．７×１０−２モル）のジエチル２−［２．２−ビス（ジエチルホスホリル）エチル］マロネートを３５０ｍｌのＨＣＩ［５Ｎ］中で、８時間還流する。
【０１１５】
得られた茶色のオイルを６０ｇのシラン化シリカ６０（０．０６３〜０．２００ｍｍ）上で水溶出［ＨＰＬＣモニタリング］で精製する。
３．６ｇを収率９２％で単離する。
マススペクトル：Ｍ／ｚ ２４９（ＥＳ＋）、理論値Ｍ＝２４８
ＨＰＬＣ：カラム：ハイパーカーブ（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ）（登録商標）２５０× ４ｍｍ 検出：２０２ｎｍ
均一濃度（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の溶離液 ９９／１：０．０３４ Ｎ Ｈ２ＳＯ４／ＣＨ３ＣＮ
【０１１６】
副実施例２．８
３６ｇ（０．１８１モル）のＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏと２０ｍｌのＨＣｌ（３７％）を１５０ｍｌのＨ２Ｏに溶かした溶液を、３リットルの水と１４３ｍｌ（０．３０２モル）のＦｅＣｌ３（２７％）からなる混合液に導入する。２５０ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２５％）を力強く攪拌しながら導入する。混合液を３０分間攪拌する。磁気分離により液体を除去する。磁性流体を２リットルの水で続けて３回洗浄する。
【０１１７】
硝酸系磁性流体を２００ｍｌのＨＮＯ３［２Ｍ］と共に１５分間攪拌し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１１８】
硝酸系磁性流体を６００ｍｌの水と２００ｍｌのＦｅ（ＮＯ３）３［１Ｍ］で、３０分間還流する。浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１１９】
硝酸系磁性流体を２００ｍｌのＨＮＯ３［２Ｍ］で、１５分間還流し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２０】
硝酸系磁性流体を３リットルのアセトンで３回洗浄した後、４００ｍｌの水に溶かす。２５０ｍｌの最終体積を得るまで、溶液を真空下で蒸発させる。
【０１２１】
（表３）
【０１２２】
副実施例２．９
４５０ｍｌのＨ２Ｏ中に溶かした１０８ｇ（０．５４３モル）のＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏを４リットルの水と４２９ｍｌ（０．９０６モル）のＦｅＣｌ３（２７％）の溶液に導入する。７５０ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２５％）を素早く攪拌（１２００ｒｐｍ）しながら導入する。混合液を３０分間攪拌する。磁気分離により、液体を除去する。磁性流体を３リットルの水で、続けて２回洗浄する。
【０１２３】
硝酸系磁性流体を３リットルのＨＮＯ３［２Ｍ］と共に１５分間攪拌し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２４】
硝酸系磁性流体を１３００ｍｌの水と７００ｍｌのＦｅ（ＮＯ３）３［１Ｍ］で、３０分間（６００ｒｐｍ）還流する。浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２５】
硝酸系磁性流体を３リットルのＨＮＯ３［２Ｍ］と共に１５分間攪拌し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２６】
硝酸系磁性流体を３リットルのアセトンで３回洗浄した後、６００ｍｌの水に溶かす。２５０ｍｌの最終体積を得るまで、溶液を真空下で蒸発させる。
【０１２７】
この段階で、以下の性質を獲得する。
【０１２８】
（表４）
【０１２９】
処理
２００ｍｌの上記の溶液を、２，４リットルのＨＮＯ３中で４時間攪拌する。浮遊物を磁気分離により除去する。硝酸系磁性流体を３リットルのアセトンで２回洗浄した後、４００ｍｌの水に溶かす。２５０ｍｌの最終体積を得るまで、溶液を真空下で蒸発させる。
【０１３０】
（表５）
【０１３１】
副実施例２．１０〜２．１２：化合物ｇｅｍビスホスホネートによる磁気粒子（ｐ）の錯化の実施例
副実施例２．１０
５０ｍｌの副実施例２．８（４．８５Ｍ／Ｌ）を３リットルの水で希釈する。１．３ｇ（５．２４×１０−３モル）の実施例１からの化合物Ａを１００ｍｌの水に溶かした溶液を一滴ずつ導入する。３０分間攪拌を続ける。綿状の固まりを磁気分離により単離した後、３リットルの水で３回洗浄する。
【０１３２】
ＱＳ ＮａＯＨ［１Ｎ］を用いてｐＨ７．２にして７００ｍｌの水に再び溶解する。最終溶液を０．２２μｍの膜を通して濾過する。
鉄力価＝０．２５２Ｍ／Ｌ
Ｆｅ＝６１．７％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｐ＝１．２１％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｃ＝１．０４％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
［化合物Ａ／Ｆｅ］のグラフト度＝１．８６％モル／モル
【０１３３】
副実施例２．１１
５０ｍｌの副実施例２．８（４．７３Ｍ／Ｌ）を３リットルの水で希釈する。１．３ｇ（５．２４×１０−３モル）の実施例１からの化合物Ａを８０ｍｌの水に溶かした溶液を一滴ずつ導入する。３０分間攪拌を続ける。綿状の固まりを磁気分離により単離した後、３リットルの水で３回洗浄する。
【０１３４】
ＱＳ ＮａＯＨ［１Ｎ］を用いてｐＨを１１にして、７００ｍｌの水に再び溶解した後、ＱＳ ＨＣｌ［１Ｎ］を用いてｐＨを７．２に安定させる。最終溶液を０．２２μｍの膜を通して濾過する。
鉄力価＝０．２７９Ｍ／Ｌ
Ｆｅ＝６３．９％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｐ＝１．３８％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｃ＝１．０７％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
［化合物Ａ／Ｆｅ］のグラフト度＝１．９５％モル／モル
【０１３５】
副実施例２．１２
１００ｍｌの実施例２．９（２．７４２Ｍ／Ｌ）（ＰＣＳサイズ＝２１．３ｎｍ）を３リットルの水で希釈する。
【０１３６】
１．５ｇ（６．０３×１０−３モル）の実施例１からの化合物Ａを１００ｍｌの水に溶かした溶液を一滴ずつ導入する。３０分間攪拌を続ける。綿状の固まりを磁気分離により単離した後、３リットルの水で３回洗浄する。
【０１３７】
ＱＳ ＮａＯＨ［１Ｎ］を用いてｐＨを１１にして７００ｍｌの水に再び溶解した後、ＱＳ ＨＣｌ［１Ｎ］を用いてｐＨを７．２に安定させる。最終溶液を０．２２μｍの膜を通して濾過する。
鉄力価＝０．２８５Ｍ／Ｌ
Ｆｅ＝６２．９％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｐ＝１．３２％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｃ＝１．２２％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
［化合物Ａ／Ｆｅ］のグラフト度＝１．９０％モル／モル
【０１３８】
緩和能
水性溶液中で２０ＭＨｚ（０．４７Ｔ）、３７℃。
【０１３９】
（表６）
【０１４０】
実施例２．１８
副実施例２．１２の溶液１００ｍｌ（０．２８５Ｍ／Ｌ）を、ＰＡＬＬ（登録商標）３０ＫＤ攪拌セルを通して限外濾過する。２０２ｍｇの化合物Ｂからの化合物ＰＥＰＴＩＤＥアミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨを上記溶液に加える。ｐＨをＱＳ ＨＣｌ［０．１Ｎ］で６．１に調整する。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】１００％Ｃ５７ＢＩ／６系統（＊＊：Ｐ＜０．０１）のＡｐｏＥ−ＫＯマウスの血漿および主器官内の（左）と、動脈標本の血管壁（右）内の化合物Ｂ対Ｇｄ−ＤＯＴＡの生体内分布を示す。
【図２】対照のＤｏｔａｒｅｍ（右）と比較した化合物Ｂ（左）に関するＴ１ＭＲＩシグナルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理学的画像診断用の、具体的には心血管疾患、さらに具体的にはアテローム性動脈硬化症を画像診断するための新規の化合物および組成物に関する。これらの化合物は、磁気共鳴画像ＭＲＩの分野だけでなく、核医学、Ｘ線、超音波、光画像等の他の画像分野においても有用な造影剤である。
【０００２】
これらの化合物は、少なくとも１種のシグナル部分に結合する少なくとも１種のターゲット部分を含む。
【背景技術】
【０００３】
ターゲット構成物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｎｔｉｔｙ）は、非病的状態および／または領域と比較して、疾病状態および／または領域で過剰もしくは過小発現する疾病状態および／または領域の少なくとも１種のマーカーをターゲットとすることが可能である。これらの化合物は、特異的化合物と呼ばれ、バイオベクターと称されるターゲット構成物質である。非常に多くのシグナル構成物質（ｓｉｇｎａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）／部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は、ＭＲＩのための常磁性金属イオンや核医学のための放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｉｄｅｓ）の鎖式（ｌｉｎｅａｒ）もしくは大環状キレートとして、既に知られている。上記のキレートは、ＥＰ ７１ ５６４号明細書、ＥＰ ４４８ １９１号明細書、国際公開第０２／４８１１９号パンフレット、米国特許第６，３９９，０４３号明細書、国際公開第０１／５１０９５号パンフレット、ＥＰ ２０３ ９６２号明細書、ＥＰ ２９２ ６８９号明細書、ＥＰ ４２５ ５７１号明細書、ＥＰ ２３０ ８９３号明細書、ＥＰ ４０５ ７０４号明細書、ＥＰ ２９０ ０４７号明細書、米国特許第６，１２３，９２０号明細書、ＥＰ ２９２ ６８９号明細書、ＥＰ ２３０ ８９３号明細書、米国特許第６，４０３，０５５号明細書、国際公開第０２／４００６０号パンフレット、米国特許第６，４５８，３３７号明細書、米国特許第６，２６４，９１４号明細書、米国特許第６，２２１，３３４号明細書、国際公開第９５／３１４４４号パンフレット、米国特許第５，５７３，７５２号明細書、米国特許第号５，３５８，７０４明細書に記載されている。一般的に使用されるキレートは、例えばＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ ＢＭＡ、ＤＴＰＡ ＢＯＰＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−四酢酸）、ＰＣＴＡおよびそれらの誘導体である。市販されている製品は、具体的には、例えば、Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）およびマグネビスト（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）（登録商標）である。上記のキレートに対する、およそ３〜１０ｍＭ−１ｓ−１ Ｇｄ−１あたりでの、水中での緩和能を用いて、ＭＲＩでシグナルを測定する。
【０００４】
特異的なアテローム性動脈硬化性損傷をターゲットとする新規の造影剤に対する深刻な必要性がなお存在する。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症は、現代社会において最も一般的な疾患である。非常に多様な臨床的に異なる疾患（例、心筋梗塞、脳卒中、腹部大動脈瘤および下肢虚血等）は、基本的にアテローム性動脈硬化症に関連する。それらの急性の症状発現のほとんどは、一般的な病原性の特徴（混合型血栓を伴うアテローム性動脈硬化プラークの破綻）を共有する。プラーク破綻は、致命的な急性心筋梗塞と症候性頚動脈損傷の約７０％を占め、脆弱性プラークの最終的な併発症である。脆弱性プラークには、急激に進行する可能性が高い、不安定プラーグのみならず血栓症を生じやすいプラークも含まれる。それらは、それらの表面上もしくは表面下の大型の脂質コア、薄いキャップおよびマクロファージの集積した炎症により、特徴付けられる。個々に対する急性虚血を発症するリスクは、脆弱性プラークの数により決まり、現在の課題は、上記のリスクを等級別に分類することである。
【０００６】
従来型の画像技法は、脆弱性プラーク、特に冠状動脈の脆弱性プラークを検出して特徴づけに貢献することは不可能である。血管造影法は、厳密には解剖学の画像ツールであり、冠状プラークの寸法や組成を評価することは不可能である。他の物理療法は、カテーテルによる療法であり、従って臨床適用範囲が限られている。血管内超音波は、プラークの形態構造に関していくつかの情報を提供するが、画像解像度および感度は、脆弱性プラークの沈着物を確実に識別するにはまだ不十分である。光コヒーレンストモグラフィーは、内膜壁とプラークとの間をより良好に描出するが、その透過度は低い。サーモグラフィーは、浅部炎症に非常に敏感であるのに対して、血管顕微鏡検査法は、脂質に富むプラークの検出や血栓の視覚化に使用されうる。しかしながら、両技法は、動脈壁の深部層を検査することやキャップの厚さを推定することは不可能である。
【０００７】
非常に有望な技法は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）技法である。頚動脈硬化のプラークにおいて、ＭＲＩは、プラーク内出血や繊維状キャップの破綻を視覚化できるだけでなく、管内血栓を検出し、それらの期を識別することが可能である。従って、ＭＲＩは、大脳虚血症状の兆候を最近発症した患者をリスク層別化するための、潜在的魅力を持つ診断ツールである。しかしながら、現在まで、ＭＲＩは、キャップの厚さの精確な測定や冠状アテローム性動脈硬化性の損傷の特徴付けのために十分である空間分解能を備えていない。
【０００８】
従って、予測診断に関して、プラークの生理学的特徴付け、さらにそれらの形態学的研究に対する必要性が存在する。ＭＲＩによる冠状動脈の脆弱性プラークを同定するための代替的な戦略は、特異的マーカーの検出に基づいた分子画像法を採用することでありうる。上記の１種のマーカーは、活動性のアテローム性動脈硬化性損傷で過剰発現し、線維性キャップの線維性コラーゲンを分解することによりプラークの不安定化を促進する、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、亜鉛含有のエンドプロテアーゼの群により代表される。従って、対照分子は、ＭＲＩではっきりと検出でき、ＭＭＰ活性を画像化し、脆弱性プラークを非侵襲で検出するのに有用であり、患者のリスク層別化を改善するだろう。
【０００９】
ヒト脆弱性プラーク内に蓄積するＭＭＰの量に関して、殆ど知られていないが、進行した頚動脈硬化症の損傷における組織のミリグラム当たりのＭＭＰ−８の過剰発現を報告している研究もある。これらのレベルは、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１３に対して得られたレベルと同様であると考えられた。ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＲＩの感度は、シンチグラフィーの画像技法と比較して、相対的に低いので、例えば、十分なシグナル強度を生み出すために、損傷において低い濃度のＭＭＰを補う必要性が存在する。大部分のＭＭＰを非選択的にターゲットとする化合物を使用して、上記の要件を達成しうる。それにより、局所的に高濃度の造影剤が許容されうる。本願特許出願人は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９に対して良好な親和力を有する（特に、ＭＭＰ−３は、損傷プラークで過剰発現する）バイオベクターを含む画像化化合物を目下調製したところである。
【００１０】
ＭＭＰターゲットのための具体的な化合物は、先行技術に記載されている。例えば、国際公開第０１／６０４１６号パンフレットは、鎖式もしくは大環状キレートのシグナル構成物質に結合したＭＭＰに対するターゲット構成物質を含む化合物を記載する。生物アッセイに関する本願特許出願人の知識によると、従来技術の上記化合物は、およそ５〜１０ｍＭｏｌ−１ｓ−１Ｇｄ−１あたりでのそれらの相対的に低い緩和能のためおよび／またはそれらの親和力もしくは選択性の不足のために、かなり満足のいくｉｎ ｖｉｖｏでの診断に対して十分に有効ではない。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでの画像診断に効果的に有効である新規の製品に対する深刻な必要性が依然として存在する。
【００１１】
驚くべきことに、本願特許出願人は、高い緩和能を有するかなり有望な化合物を評価する一方、シグナル構成物質に結合する特定のペプチド性ＭＭＰ阻害剤が、シグナル構成物質の相対的に低い緩和能にもかかわらず、診断画像にかなり良好な結果を得ることを示した。本願特許出願人により調製された化合物は、非特異的な対照化合物Ｄｏｔａｒｅｍと比べて、脆弱性プラークを伴う疾患の特異的診断に確実にかなり功を奏する。例証した化合物のＭＭＰに対する親和力を精製したＭＭＰでｉｎ ｖｉｖｏで試験し、さらに、ＷＨＨＬウサギ動脈およびヒト動脈内膜切除標本でｅｘ ｖｉｖｏで試験した。増加したＭＭＰ発現を示すアテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおいて、生体内分布を研究した。
【００１２】
高度な構造上の相違点を示すＭＭＰをターゲットとする非常に多くの分子が、先行技術に記載されており、それらは、以下に詳細に概説されている。
−現代医薬品化学（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、８，４２５−４７４
−Ｃｈｅｍ ｒｅｖ，１９９９年，９９，２７３５−２７７６
−ＤＤＴ。第１巻、第１号、１９９６年１月、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６−１７
−Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，２００１年、１２，９６４−９７１
【００１３】
１５０を超える米国特許もしくは米国特許出願が、ＭＭＰ阻害剤を論じ、さらにかなり多くが、ＭＭＰをターゲットとする構成物質も論じている。
【００１４】
本願特許出願人によりバイオベクターとして使用されるペプチド性ＭＭＰ阻害剤は、生化学および生物物理リサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）（第１９９巻、３、１９９４年、１４４２−１４４６頁）および米国特許第５，１００，８７４号明細書に記載され、本明細書に参照され組み込まれている。しかし、ＭＭＰに対する親和力もしくは選択性と同じか、それより高い親和力もしくは選択性を有すると知られている莫大な量の可能なＭＭＰターゲット構成物質および阻害剤のうちで、上記の特定のペプチド性ＭＭＰ阻害剤のシグナル構成物質への結合は、診断画像、具体的には心血管疾患診断に関して、記載も示唆もしていない。さらに、本願特許出願人の知識によると、治療分野におけるＭＭＰターゲット構成物質に関する臨床試験は、癌療法に主眼を置き、心血管領域にかかわっていない。
【発明の開示】
【００１５】
第一態様に従って、本発明は、式（Ｉ）
（ＰＥＰＴＩＤＥ）ｎ１−（ＬＩＮＫＥＲ）ｎ２−（ＳＩＧＮＡＬ）ｎ３
［式中、
１）ＰＥＰＴＩＤＥは、以下
ａ）式
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、
Ｘ１は、存在しないか、またはＸ１は、グリシンの残基であり、Ｘ２は、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンおよびアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３は、グルタミン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基であり、
アルファ−アミノ酸Ｘ１のカルボキシル基は、アルファ−アミノ酸Ｘ２のアミノ基と共にペプチド結合を形成し、アルファ−アミノ酸および酸Ｘ２のカルボキシル基は、アルファ−アミノ酸Ｘ３のアミノ基と共にペプチド結合を形成し、アルファ−アミノ酸Ｘ３のカルボキシル基は、アルファ−アミノ酸Ｘ４のアミノ基と共にペプチド結合を形成し、アルファ−アミノ酸Ｘ４のカルボキシル基は、−ＮＨＯＨと共にアミドを形成し、
前記アルファ−アミノ酸Ｘ１のアミノ基の水素原子は、アルキルもしくはアリール基から選択される、好ましくはアセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジルオキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−アミノベンゾイル（ＡＢｚ）、ｐ−アミノ−ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル（ＨＢｚ）、３−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオニル（ＨＰＰ）からなる群から選択されるＸ０基と置換されてもよい）のペプチド、
ｂ）特にａ）のペプチドに機能的に同等なペプチド、
ｃ）ａ）もしくはｂ）のペプチドに機能的に同等な（ＩＩ）のペプチドフラグメント
の群から選択され、
２）ＳＩＧＮＡＬは、医用画像のためのシグナル構成物質であり、
３）ＬＩＮＫＥＲは、最終的に存在しないが、ＰＥＰＴＩＤＥとＳＩＧＮＡＬ間の化学結合を表す］
の化合物と、
それらの薬学的塩と
を含む診断用薬に関する。
【００１６】
アミノ酸は、Ｄアミノ酸もしくはＬアミノ酸のどちらでもよい。
【００１７】
用語「ペプチド（ＩＩ）に機能的に同等なペプチド」とは、ペプチドがキレートに結合することができる化学構造と、診断化合物（Ｉ）の活性がＭＭＰに対する上記に例証した化合物の活性に相当するような、２０〜２００％の範囲内の、典型的には例証した化合物の活性の少なくとも８０％の生物活性とを有するペプチドを意味する。
【００１８】
ＭＭＰに対する活性は、ペプチドによってターゲットとされる各ＭＭＰに対して等しくてもよく、またはそれらのうちのいくつかだけに対して等しくてもよい。従って、ＭＭＰに対する活性は、上記化合物が心血管疾患／アテローム症の医用画像診断、具体的には脆弱性プラークの検出の観点から有用であるような、全体的なＭＭＰターゲット活性に関する。
【００１９】
具体的には、上記ペプチドは、ＭＭＰの活性を５０％まで抑制する濃度（ＩＣ５０）が１０μＭ未満であるように選択されるのが好ましい。ＩＣ５０が、０．５〜５μＭであるのが好ましい。しかしながら、さらに高いＩＣ５０を有するペプチドも、それらが、ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化において、特に詳細な説明で例証されるｅｘ ｖｉｖｏでの試験におけるプラークを視覚化できるいずれかのペプチドにおいて、良好な結果を効果的に付与するならば、本発明に含まれる。芳香族基を含むＸ０を有する化合物も、さらに本発明に含まれる。
【００２０】
一実施形態に従って、ＰＥＰＴＩＤＥは、ペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、Ｘ１は、存在しないか、またはＸ１は、グリシンであり、Ｘ２は、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３は、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４は、グリシン、アラニンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基である）である。
【００２１】
一実施形態に従って、ＰＥＰＴＩＤＥは、ペプチド
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、Ｘ１は、グリシンであり、Ｘ２は、プロリンであり、Ｘ３は、ロイシンであり、Ｘ４は、アラニンである）である。
【００２２】
一実施形態に従って、ＰＥＰＴＩＤＥは、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＢｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａから選択されるＸを有するＸ−ＮＨＯＨである。
【００２３】
特に、ＰＥＰＴＩＤＥｐ−アミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨは、プラーク画像化にかなり十分である。
【００２４】
ヒドロキサメートペプチド誘導体は、ペプチドＣＯ２Ｈ末端の代わりに、ＮＨＯＨが末端に存在する。
【００２５】
上記ペプチドは、以下の（Ａ）と（Ｂ）におおよそ分けることができるプロセスにより、実施される。
（Ａ）式Ｂｏｃ−Ｘ４−ＮＨＯＢｚｌの化合物を出発物質として使用するプロセスであり、該ペプチド鎖は、最初にＢｏｃ−Ｎ基側で延びて、基Ｘ３−Ｘ４−を形成し、それが基Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−を介して基Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−に変換され、そして最終的に、ヒドロキサム酸側のＯ−ベンジルは、除かれて所望の化合物を得るプロセスと、
（Ｂ）式Ｂｏｃ−Ｘ４−ＯＲ２の化合物を出発物質として使用して、対応するペプチド誘導体Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＯＲ２（Ｒ２に関して、メチルもしくはエチル基）を合成するプロセス
米国特許第５，１００，８７４号明細書は、上記のペプチド製剤を明確に記載し、それは、バッケム社（ＢＡＣＨＥＭ ｃｏｍｐａｎｙ）（ｗｗｗ．Ｂａｃｈｅｍ．ｃｏｍ）で入手可能である。
【００２６】
上記のプロセスにおいて、ペプチド合成化学において従来使用されてきた全ての手段を、ペプチド鎖の形成のためにアミノ酸を縮合するため、それらの構造で存在しうる保護基（アミノ基、イミノ基、カルボキシル基および／またはヒドロキシル基）で保護するため、およびそのような保護基を除去するための、特定の手段として採用してもよい。
【００２７】
薬学的塩に関して、
−錯体を塩化するのに適切な無機塩基の好適なカチオンは、特にアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（例、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム等）イオンを含む。
−有機塩基の好適なカチオンは、第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミン（例、エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグルカミン等）のイオンを含む。
−無機酸の好適なアニオンは、特に、ハロ酸のイオン（例、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン）または硫酸イオンのような他のイオンを含む。
−有機酸の好適なアニオンは、塩基性物質（例、アセタート、スクシナート、シトレート、フマレート、マレエート、オキサレート、トリフルオロアセタート等）を塩化するために薬学的技法において従来使用される酸のイオンを含む。
【００２８】
アミノ酸の好適なカチオンおよびアニオンは、例えば、タウリン、グリシン、リシン、アルギニンまたはオルニチンのイオン、或いはアスパラギン酸およびグルタミン酸のイオンを含む。
【００２９】
一実施形態に従って、ＳＩＧＮＡＬは、鎖式もしくは大環状キレートである。常磁性金属イオン（例、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩＩ）およびＭｎ（ＩＩ）等）を有する安定錯体を形成するように、磁気共鳴画像用造影剤のためのキレート（キレート化剤、キレート配位子）を選択する。それらの例として、ラセミ体もしくは光学的活性体の鎖式か環状のどちらかのポリアミノポリカルボン酸（エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル］−Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−Ｌ−グリシン（ＥＯＢ−ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−Ｌ−グルタミン酸（ＤＴＰＡ−ＧＬＵ）、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−Ｌ−リシン（ＤＴＰＡ−ＬＹＳ）等）、ＤＴＰＡモノ−もしくはビス−アミド誘導体（例、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［カルボキシメチル［（メチルカルバモイル）メチル］アミノ］エチル］グリシン（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）、４−カルボキシ−５，８，１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−酸（ＢＯＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸（ＨＰＤＯ３Ａ）２−メチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＭＣＴＡ）、（アルファ、アルファ’、アルファ’’、アルファ’’’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＭＡ）、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−３，６，９−三酢酸（ＰＣＴＡ）等）、または１個もしくはそれ以上のカルボン酸基が対応する塩、エステルまたはアミドの形態であるそれらの誘導体、或いは、１個もしくはそれ以上のカルボン酸基がホスホン酸基および／またはホスフィン酸基で置換される対応する化合物（例えば、４−カルボキシ−５，１１−ビス（カルボキシメチル）−１−フェニル−１２−［（フェニルメトキシ）メチル］−８−（ホスホノメチル）−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−酸、Ｎ，Ｎ’−［（ホスホノメチルイミノ）ジ−２，１−エタンジイル］ビス［Ｎ−１０（カルボキシメチル）グリシン］、Ｎ，Ｎ’−［（ホスホノメチルイミノ）ジ−２，１−エタンジイル］ビス［Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン］、Ｎ，Ｎ’−［（ホスフィノメチルイミノ）ジ−２，１−エタンジイル］ビス［Ｎ−（カルボキシメチル）グリシン］、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［メチレン（メチルホスホン）］酸、または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［メチレン（メチルホスフィン）］酸）の残基が挙げられる。使用可能なキレートは、ＤＯＴＡガドフルオリン（ｇａｄｏｆｌｕｏｒｉｎ）、ＤＯ３Ａ、ＨＰＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＨＥＴＡ、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ、Ｍ４ＤＯＴＡ、Ｍ４ＤＯ３Ａ、ＰＣＴＡおよびそれらの誘導体、２−ベンジル−ＤＯＴＡ、アルファ−（２−フェネチル）１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン−１−アセト−４，７，１０−トリス（メチル酢）酸、２ベンジル−シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸、２−ベンジル−６メチル−ＤＴＰＡ、および６，６”−ビス［Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル）−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２”−テルピリジン、Ｎ，Ｎ’−ビス−（ピリドキサール−５−ホスフェート）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＤＰＤＰ）およびエチルエチレンジニトリロテトラキス（メチルホスフィン）酸（ＥＤＴＰ）でありうる。
【００３０】
好適なキレート配位子、さらにその調製方法は、例えば、以下の特許文献、ＥＰ−Ａ−２３０，８９３号明細書、ＥＰ−Ａ−２５５，４７１号明細書、ＥＰ−Ａ−２９９，７９５号明細書、ＥＰ−Ａ−３２５，７６２号明細書、ＥＰ−Ａ−５６５，９３０号明細書、ＥＰ−Ａ−５９４，７３４号明細書、米国特許第Ａ−４，８８５，３６３号明細書、ＥＰ−Ａ−７７３，９３６号明細書、国際公開第Ａ−９４２６３１３号パンフレット、国際公開第Ａ−９４２６７５４号パンフレット、国際公開第Ａ−９４２６７５５号パンフレット、国際公開第Ａ−９５１９３４７号パンフレット、国際公開第Ａ−９７３１００５号パンフレット、国際公開第Ａ−９８０５６２５号パンフレット、国際公開第Ａ−９８０５６２６号パンフレット、国際公開第Ａ−９９３５１３３号パンフレット、国際公開第Ａ−９９３５１３４号パンフレット、および国際公開第Ａ−０１４６２０７号パンフレットに記載され、それらは、参照されて、本明細書に組み込まれている。
【００３１】
好適なキレート配位子は、ラセミ体もしくは光学的活性体の鎖式および大環状のポリアミノポリカルボン酸である。
【００３２】
（ＤＴＰＡ）、（ＤＯＴＡ）、（ＢＯＰＴＡ）、（ＤＯ３Ａ）、（ＨＰＤＯ３Ａ）、（ＤＯＴＭＡ）、（ＰＣＴＡ）およびそれらの誘導体が、最も好適である。
【００３３】
適切なキレートは、この記載に限定されず、画像診断において良好な効率を有する化合物（Ｉ）の他のキレートも、適切である。特に、ＳＩＧＮＡＬは、国際公開第０１／６０４１６号パンフレットおよび米国特許第６，２２１，３３４号明細書に詳細に記載される一般式もしくはそれらの誘導体のＳＩＧＮＡＬでありうる。
【００３４】
好適な常磁性金属イオンとして、遷移金属およびランタニド金属（つまり、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属）のイオンが挙げられる。特に、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｍ、およびＹｂのイオンが好ましく、それらのうちで、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｅｕ、Ｇｄ、およびＤｙのイオンがさらに好ましく、Ｇｄのイオンが最も好ましい。
【００３５】
核医学診断において、金属キレートは、特定の用途に選択される金属イオンを有する安定錯体を形成するように、選択される。診断用の放射性医薬品のためのキレート化剤もしくは結合基は、画像化可能なガンマ線もしくは陽電子放出を有する放射性同位体（例、９９Ｔｃ、９５Ｔｃ、１１１Ｉｎ、６２Ｃｕ、６０Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ等）を有する安定錯体を形成するように、選択される。
【００３６】
テクネチウム、銅およびガリウム同位体のためのキレート化剤は、好ましくはジアミンジチオール、モノアミン−モノアミドジチオール、トリアミド−モノチオール、モノアミン−ジアミド−モノチオール、ジアミンジオキシム、およびヒドラジンから選択される。キレート化剤は、一般的に、窒素、酸素および硫黄から選択されるドナー原子を伴って四座である。好適な試薬は、アミン窒素およびチオール硫黄ドナー原子とヒドラジン結合単位とを有するキレート化剤からなる。チオール硫黄原子およびヒドラジンは、放射性医薬品を合成する試薬の使用に先立ってか、または放射性医薬品の合成中に好ましくはその場でのどちらかで、置換されることが可能である保護基を有する場合もある。
【００３７】
１１１Ｉｎおよび８６Ｙのためのキレート化剤は、通常、環状および非環式のポリアミノカルボン酸（例、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、Ｄ０３Ａ、２ベンジル−ＤＯＴＡ、アルファ−（２−フェネチル）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａａｚａｚｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）１−アセト−４，７，１０−トリス（メチル酢）酸、２−ベンジルシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸、２−ベンジル−６−メチルＤＴＰＡ、および６，６”−ビス［Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”−テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２”−テルピリジン等）から選択される。
【００３８】
上式（Ｉ）において、ＰＥＰＴＩＤＥおよびＳＩＧＮＡＬが、スペーサーＬＩＮＫＥＲに直接に（ｎ２＝０）か、或いはスペーサーＬＩＮＫＥＲを介してのどちらかで一緒に結合することが可能である。上式（Ｉ）において、２つ以上のペプチドに結合するひとつのＭＲＩターゲット構成物質（検出可能な基）を有することが可能である。ひとつの実現化において、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝１である。別の実現化において、シグナルを増加させるために、数種のキレートを用いる。例えば、ｎ１＝ｎ２＝１かつｎ３＝２〜８であり、例えば、リンカーは、少なくとも２個のキレートに化学結合した因子（ｄｉｖｉｓｏｒ）（例、１，３，５トリアジン因子等）である。式（Ｉ）のＭＲＩ用化合物が、２つ以上のＭＲＩ検出可能な基（キレート）を含有する場合、前記検出可能基も、多数の結合部位を含有するスペーサーＬＩＮＫＥＲを介して、２つ以上のペプチドに結合することが可能である。数字ｎ１、ｎ２、ｎ３は、化学構造と一致するように、また診断活性が得られるように、選択される。
【００３９】
例えば、ＬＩＮＫＥＲは、ヘテロ原子（例、酸素、窒素、および硫黄等）で置換されて割り込まれることが可能であるアルキリデン、アルケニリデン、アルキニリデン、シクロアルキリデン、アリーリデン、またはアラルキリデン基からなる。好適な一実施形態において、前記スペーサーアームは、直鎖もしくは分岐鎖の脂肪族からなり、前記脂肪族は、スペーサーの反応部分を効果的に切り離し、理想的には、ＰＥＰＴＩＤＥ分子の空間配置は、ＭＲＩ検出可能な基の存在により影響されず、ＰＥＰＴＩＤＥは、そのＭＭＰターゲットによってさらに容易に認識される。前記鎖は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＮＲ−、−ＣＳ−等の基により、またはフェニレン基等の芳香族環により割り込まれる場合もあり、および−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲＲ１、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ１（式中、ＲおよびＲ１は、互いに独立して、水素原子もしくは有機基でありうる）等の置換基を有する場合もある。
【００４０】
さらに包括的には、適切なリンカー基として、これに限定しないで、アルキルおよびアリール基（置換アルキルおよびアリール基を含む）、ヘテロアルキル（特にオキソ基）およびヘテロアリール基（アルキルアミン基を含む）が、以下に規定するように、挙げられる。
【００４１】
アルキル基には、直鎖もしくは分岐鎖アルキル基が含まれ、直鎖アルキル基が好ましい。分岐鎖であるならば、１つもしくはそれ以上の位置で、特に明記しない限り、いずれかの位置で分岐されている。アルキル基は、約１〜約１５個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１５）を配置し、好適な一実施形態では約１〜約１０個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１０）を有し、Ｃ１〜Ｃ５が特に好ましい。しかし、いくつかの実施形態において、アルキル基が、それよりも大きい場合もある。シクロアルキル基（Ｃ５およびＣ６環）と、窒素、酸素、硫黄またはリンを有する複素環も、アルキル基の定義に含まれる。アルキルには、硫黄、酸素、窒素のヘテロ原子、および好適であるシリコーンを有するヘテロアルキルも含まれる。アルキルには、置換アルキル基が含まれる。
【００４２】
本明細書において、「アリール基」もしくは「芳香族基」、或いは同義の語句は、一般的に５〜１４個の炭素原子（それよりも大きい多環式環構造が作られることもあるが）を含有する芳香族の単環式もしくは多環式炭化水素部分と、それらの炭素環式ケトンもしくはチオケトン誘導体のいずれかとを意味する。上記芳香族炭化水素において、自由電子価を有する炭素原子は、芳香族環の一員である。芳香族基には、３個以上の原子が除去されたアリーレン基および芳香族基が含まれる。上記適用の目的上、芳香族には複素環式が含まれる。「複素環式」もしくは「ヘテロアリール」は、指示された炭素原子の１〜５個が、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選択されたヘテロ原子で置換された芳香族基（自由電子価を有する原子は、芳香族環の一員である）と、それらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体のいずれかとを意味する。従って、複素環式には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル（ｉｍｉｄｏｚｙｌ）等が含まれる。アルキル基に関して、アリール基が、１個の置換基で置換される場合もある。
【００４３】
使用可能なリンカー基として、ｐ−アミノベンジル、置換ｐ−アミノベンジル、ジフェニルおよび置換ジフェニル、アルキルフラン（例、ベンジルフラン等）、カルボキシ、および１〜１０の炭素鎖長の直鎖アルキル基が挙げられる。好適なリンカーとして、ｐ−アミノベンジル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、酢酸、プロピオン酸、アミノブチル、ｐ−アルキルフェノール、４−アルキルイミダゾール、カルボニル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、グリコール（例、ＰＥＧ等）が挙げられる。本明細書において、「エチレングリコール」もしくは「（ポリ）エチレングリコール」は、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−基を意味する。但し、エチレン基の各炭素原子は、上記の通り、Ｒで１個もしくは２個置換される（つまり、−（Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２）ｎ−）。酸素の代わりに他のヘテロ原子を有するエチレングリコール誘導体（つまり、−（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−もしくは−（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−、或いは置換基を有する）も、適切である。スクアレート（Ｓｑｕａｒａｔｅ）リンカーも使用可能である。
【００４４】
別の実施形態に従って、ＳＩＧＮＡＬは、キレートシグナル構成物質を運ぶことができるキャリアー脂質および／または高分子系である。数種のキャリアー系は、公知であり、すなわち脂質のナノ液滴（ナノ粒子のエマルション）が、国際公開第０３／０６２１９８号パンフレットなどに記載されており、参照されて組み込まれている。上記の特許文献は、アルファｖベータ３受容体をターゲットとするバイオベクターを運ぶナノ液滴による特殊な画像化の概念の検証を記載する。米国特許第６，４０３，０５６号明細書（参照され、組み込まれている）に記載されるような他の母体となる技法も、使用されうる。ひとつのナノ液滴には、通常、１００００〜１０００００キレートが含まれる。
【００４５】
多くのナノ粒子のエマルションを使用してもよい。例えば、Ｗ０９５／０３８２９は、薬剤が油滴内に分散もしくは可溶化し、油滴が配位子により特定の位置にターゲットとされるオイルエマルションを記載する。米国特許第５，５４２，９３５号明細書は、ガス入りパーフルオロカーボンマイクロスフェアを用いる部位特異的薬剤の輸送を記載する。ターゲット構成物質の輸送は、マイクロスフェアをターゲットに向かって進ませることにより、達成され、結果としてそれらの破綻をもたらす。低沸点のパーフルオロ化合物を用いて、気泡が形成できるような粒子を生成する。ナノ粒子が米国特許第５，９５８，３７１号明細書に記載されるような高沸点のパーフルオロカーボン液をベースとするエマルションを採用することは、可能である。上記の液状エマルションは、脂質および／または界面活性剤からなるコーティングで囲まれた相対的に高沸点のパーフルオロカーボンからなるナノ粒子を含有する。包囲しているコーティングは、ターゲット部分に直接結合でき、或いは、場合によりリンカーを介して、ターゲット部分に共有結合する中間成分を取り込むことが可能である。
【００４６】
可能性のあるエマルションは、コアとして高沸点パーフルオロカーボンと、外側のコーティングとを含有するナノ粒子系である。該外側のコーティングは、１種もしくはそれ以上の所望の成分の多様な複製をナノ粒子に結合させるための賦形剤を提供する脂質／界面活性剤の混合物である。基本粒子の構成およびそれらを含有するエマルションの形成は、外面に結合する成分にかかわらず、本願特許出願人の上記の特許文献、米国特許第５，６９０，９０７号明細書、同第５，７８０，０１０号明細書、同第５，９５８，３７１号明細書に記載されている。
【００４７】
有用なパーフルオロカーボンエマルションは、米国特許第６，６７６，９６３号明細書に記載され、その例として、パーフルオロカーボン化合物が、パーフルオロデカリン、パーフルオロオクタン、パーフルオロジクロロオクタン、臭化パーフルオロ−ｎ−オクチル、パーフルオロヘプタン、パーフルオロデカン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロモルホリン、パーフルオロトリプロピルアミン、パーフルオロトリブチルアミン、パーフルオロジメチルシクロヘキサン、パーフルオロトリメチルシクロヘキサン、パーフルオロジシクロヘキシルエーテル、パーフルオロ−ｎ−ブチルテトラヒドロフラン、およびこれらの化合物と構造上類似し部分的もしくは完全にハロゲン化した化合物（少なくとも数種のフッ素置換基を含む）もしくは部分的もしくは完全にフッ素化した化合物（パーフルオロアルキル化エーテル、ポリエーテルまたはクラウンエーテルを含む）であるパーフルオロカーボンエマルションが、挙げられる。
【００４８】
ナノ粒子上の外側コーティングを形成するために使用される脂質／界面活性剤（所望の成分を表面に結合させるために、結合配位子もしくは取り込み（ｅｎｔｒａｐ）試薬を含有していると思われる）として、通常、天然もしくは合成のリン脂質、脂肪酸、コレステロール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン等が挙げられ、それらには、ポリエチレングリコールを共役する脂質が含まれる。各種の市販されているアニオン性、カチオン性、およびノニオン性界面活性剤を利用することも可能であり、それらとして、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎｓ）、スパン（Ｓｐａｎｓ）、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎｓ）等が、挙げられる。数種の界面活性剤は、パーフルオロ化したアルカン酸（例、パーフルオロヘキサン酸およびパーフルオロオクタン酸等）、パーフルオロ化したアルキルスルホンアミド、アルキレン第四級アンモニウム塩等のようにそれ自体フッ素化される。さらに、パーフルオロ化したアルコールホスフェートエステルも利用することが可能である。外層に含まれるカチオン性脂質は、核酸（具体的にはアプタマー）などの取り込み配位子において有利である場合もある。
【００４９】
脂質／界面活性剤を被覆したナノ粒子は、コアを形成するフルオロカルボン脂質と、エマルションを形成するための水性媒体中での懸濁液の外層を形成する脂質／界面活性剤の混合物との混合液を微小流体にすることにより、通常、形成される。上記の手順において、脂質／界面活性剤がナノ粒子上に被覆される場合、それらを追加の配位子に既に結合する場合もあり、或いは、続いての結合のための反応性基を単に含有する場合もある。別の方法として、脂質／界面活性剤の層に含まれる成分を、補助材料の溶解性に基づいて、層内で単に可溶化してもよい。水性媒体中に脂質／界面活性剤の懸濁液を得るために、音波破砕もしくは他の技法が、必要とされうる。
【００５０】
通常、脂質／界面活性剤の外層中の少なくとも１種の材料は、追加の所望の成分を結合するのに有用であるリンカーもしくは官能基を含むか、或いは、エマルションが調製される時に、上記成分が、上記材料に既に結合されている場合もある。
【００５１】
ターゲットペプチドもしくは他の有機基（例、常磁性金属のためのキレート剤）を外層成分に共有結合させることによる結合に関して、様々な種類の結合および結合剤を採用してもよい。このような結合を形成する典型的な方法には、カルボジアミドを用いてのアミドの生成、または不飽和成分（マレイミド等）を用いてのスルフィド結合の形成が含まれる。他のカップリング剤として、例えば、グルタルアルデヒド、プロパンジアールもしくはブタンジアール、２−イミノチオラン塩酸塩、二官能基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン等）、ヘテロ二官能基の試薬（例、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）スクシンイミド、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、およびスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等）、ホモ型二官能基の試薬（例、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フェニレンジイソチオシアナート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニンｐ−ニトロフェニルエステル）、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、エリトリトールビスカーボネート等）および二官能基のイミドエステル（例、ジメチルアジポイミデートヒドロクロリド、スベルイミノ酸ジメチル、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートヒドロクロリド等）などが挙げられる。アシル化、スルホン化、還元的アミノ化等により、結合を達成することができる。所望の配位子を外層の１種もしくはそれ以上の成分に共有結合する多数の方法が、当技術分野では、公知である。その特性が適切ならば、配位子自体が、界面活性剤の層に含まれてもよい。例えば、配位子が、高親油性の部分を含有するならば、配位子自体が、脂質／界面活性剤のコーティング内に埋め込まれる。さらに、配位子が、コーティングに直接吸着できるならば、これもまた、その結果として配位子の結合をもたらすだろう。
【００５２】
ＰＥＰＴＩＤＥに対して十分に親水性が認められるならば、他の有用な被包系（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、例えば、単層もしくは多層の脂質系、リポソーム、サッカリドポリマーを用いてもよい。
【００５３】
他の実施形態に従って、ＳＩＧＮＡＬは、一般的に酸化鉄もしくは水酸化鉄を含む超小型の超常磁性粒子ＵＳＰＩＯなどの鉄をベースとした金属ナノ粒子である。上記の磁気粒子は、フェライト、殊にマグヘマイト（γＦｅ２Ｏ３）および磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、またはさらにコバルトの混合フェライト（Ｆｅ２ＣｏＯ４）もしくはマンガンの混合フェライト（Ｆｅ２ＭｎＯ４）を含むのが好ましい。
【００５４】
適切に被覆された強磁性もしくは超常磁性粒子の例は、例えば、米国特許第４，７７０，１８３号明細書、同第４，８２７，９４５号明細書、同第５，７０７，８７７号明細書、同第６，１２３，９２０号明細書、および同第６，２０７，１３４号明細書に記載される粒子であり、該粒子は、コーティング材料、つまり、ポリマー（例、多糖、炭水化物、ポリペプチド、オルガノシラン、タンパク質等、ゼラチン−アミノデキストラン、またはデンプンおよびポリ酸化アルキレン）を、それらが官能基化されて、粒子がスペーサーにまたは直接ＰＥＰＴＩＤＥに結合するような条件で、有する。
【００５５】
実現化において、粒子は、ホスフェート、ホスホネート、ビスホスホネートまたはｇｅｍ−ビスホスホネートコーティングで被覆される。好適な１種のｇｅｍ−ビスホスホネートコーティングは、ビスホスホネート部分が粒子に結合している式Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ３Ｈ２）２
（式中、
Ｘは、ＰＥＰＴＩＤＥと反応可能な化学官能基であり、
Ｌは、Ｘを官能基ｇｅｍ−ビスホスホネート−ＣＨ（ＰＯ３Ｈ２）２に結合させる有機基である）のｇｅｍ−ビスホスホネートコーティングである。
【００５６】
特に好適な一実施形態に従って、Ｌは、置換もしくは未置換の脂肪族基、さらに好ましくは基−（ＣＨ２）ｐ−を表し、式中、ｐは、１〜５の整数である。別の好適な実施形態に従って、Ｌは、基Ｌ１−ＣＯＮＨ−Ｌ２、さらに好ましくは基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−を表し、式中、ｎおよびｍは、０〜５の整数である。
【００５７】
式（Ｉ）のｇｅｍ−ビスホスホネート化合物のＸ末端は、ＰＥＰＴＩＤＥバイオベクター上に存在する基と反応して、共有結合を形成できるような方法で、選択される。上記のカップリングプロセスに関するさらなる情報のために、特に、バイオコンジュゲート・テクニック（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、グレッグＴ．ハーマンソン（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、１９９５年、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック社（Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照してもよい。
【００５８】
好適なＸ基として、特に以下の基が記載されている。
・−ＣＯＯＨ、
・−ＮＨ２、−ＮＣＳ、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＣＨＯ、アルキルピロカルボニル（−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−ａｌｋ）、アシルアジジル（ａｃｙｌａｚｉｄｙｌ）（−ＣＯ−Ｎ３）、イミノカーボネート（−Ｏ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２）、ビニルスルフリル（−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ２）、ピリジルジスルフリル（−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ）、ハロアセチル、マレイミジル、ジクロロトリアジニル、ハロゲン、
・基−ＣＯＯＨと−ＮＨ２が、特に好ましい。
【００５９】
本願特許出願人は、コーティングが、ホスホネートもしくはビスホスホネート、またはｇｅｍビスホスホネートを除くそれらの誘導体である化合物を研究してきた。
【００６０】
別の実施形態に従って、シグナル構成物質は、蛍光画像用の蛍光プローブである。近赤外線蛍光画像において、規定された帯域幅を有するフィルターライトもしくはレーザーを励起光源として用いる。励起光は、体組織を通って進む。励起光が、近赤外線蛍光分子（「造影剤」）に衝突すると、励起光は、吸収される。その後、蛍光分子は、励起光からスペクトル的に識別できる（僅かに長い波長）光（蛍光）を発する。
【００６１】
特に、ＭＭＰのターゲットとなっているフルオロクロムは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１５０６２号明細書に記載されている。酵素感受性の分子プローブは、合成されていて、それは６００〜９００ｎｍで蛍光活性化できる。これらのプローブは、米国特許第６，０８３，４８６号明細書に詳細に記載されている。蛍光プローブ（つまり、短波長で励起、長波長で発光）は、生物現象を研究するのに理想的に適しているので、蛍光顕微鏡検査法において、広く使われてきた。蛍光プローブを生存系に用いるならば、ヘモグロビン（＜５５０ｎｍ）もしくは水（＞１２００ｎｍ）などの生理学的に豊富な吸収体によって吸収量を最小限に抑えることにより、組織透過を最大にするように、その選択は、一般的に近赤外線スペクトル（６００〜１０００ｎｍ）に限定される。
【００６２】
通常、フルオロクロムは、８００±５０ｎｍで、発光するように設計されている。各種のＮＩＲＦ分子が、記載されおよび／または市販されている。その例として、以下が挙げられる：Ｃｙ５．５（イリノイ州アーリントンハイツのアマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．））；ＮＩＲ−１（日本、熊本県の同仁化学研究所（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｊａｐａｎ））；ＩＲＤ３８２（ＬＩ−ＣＯＲ、ネブラスカ州リンカーン（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒ．））；ラ・ホイヤ・ブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）（フロリダ州マイアミのダイアトロン社（Ｄｉａｔｒｏｎ， Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．））；ＩＣＧ（イリノイ州リンカーンシャーのアコーン社（Ａｋｏｒｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ，Ｉｌｌ．））；およびＩＣＧ誘導体（フランス、パリのセルブ・ラブ（Ｓｅｒｂ Ｌａｂｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ））。
【００６３】
量子ドット誘導体（ナノ結晶を含む無機フルオロフォア）を使用してもよい。
【００６４】
本発明の別の態様は、患者において、細胞外マトリックス分解と関連する心血管病理（例、アテローム性動脈硬化症、心不全、および再狭窄等）を画像化する方法を目的とする。上記態様は、以下を包含する。（１）心血管病理の位置を突き止めることができる本発明の常磁性金属の薬剤を注射もしくは点滴により患者に投与する。（２）磁気共鳴画像もしくは２次元ＣＴまたはＳＰＥＣＴガンマシンチグラフィ、或いは陽電子放射断層撮影もしくは超音波診断を用いて、患者を画像化する。
【００６５】
本発明は、さらに、本発明の製品を用いる診断画像および／またはプラークの形態学的解析および／または狭窄症の臨床試験を組み合わせた脆弱性プラークを評価する方法にも関する。
【００６６】
本発明は、さらに以下に関する。
−ａ）上記の診断用薬を患者に投与する段階と、ｂ）診断画像技法により、患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階を含む、患者において、マトリックスＭＭＰの存在を検出、画像化、またはモニターする方法。
−ａ）上記の診断用薬を患者に投与する段階とｃ）診断画像技法により、患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階を含む、患者において、ＭＭＰ活性に関連した病的異常を検出、画像化、またはモニターする方法。
−アテローム性動脈硬化症が、アテローム性冠動脈硬化症もしくは脳血管性のアテローム性動脈硬化症である上記の方法。
−上記の方法を実行して患者において活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、一過性脳虚血発作もしくは脳卒中に対して高リスクの患者を識別する方法。
−上記の方法により患者を画像化して活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、急性心臓虚血、心筋梗塞または心臓死に対する高リスクの患者を識別する方法。
【００６７】
本発明に係るＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）を、画像化するために、ＭＲＩに用いられる特定の技法で所望のコントラストを得るのに十分な量を患者に投与してもよい。一般的に、体重１Ｋｇ当たり約０．００１〜約５．０ミリモルのＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）の用量は、所望のコントラストを得るのに十分である。殆どのＭＲＩ適用に関して、画像化用の金属化合物の好適な用量は、体重１Ｋｇ当たり０．００１〜２．５ミリモルの範囲であろう。
【００６８】
本発明のＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）を、ＭＲＩによる診断法において使用する造影剤の製造のために採用することができ、上記診断法は、前記造影剤をヒトもしくは動物に投与し、前記ヒトもしくは動物の少なくとも一部分の画像を描出することを包含する。
【００６９】
前記使用に関して、本発明のＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）は、従来の製薬補助剤（例、乳化剤、安定剤、酸化防止剤、重量オスモル濃度調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤等）を用いて配合される場合もあり、また非経口投与（例えば、点滴もしくは注射注入）に適切な剤形である場合もある。
【００７０】
従って、本発明に係るＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）は、注射薬用に生理学的に許容できるキャリアー媒体（例、水等）に入れた従来型投与剤形（例、溶液、懸濁液、または分散液等）であってよい。
【００７１】
非経口的に投与可能な剤形（例えば、点滴液）は、無菌でかつ生理学的に許容できない薬剤を無添加であるのが望ましく、さらに、投与に際して刺激や他の悪影響を最小限に押さえるために、低い重量オスモル濃度を有するのが望ましい。上記の非経口的に投与可能な溶液は、注入可能な溶液で慣例的にされているように、調製できる。それらは、添加剤（例、酸化防止剤、安定剤、緩衝剤等）を含有する場合もあり、それらの添加剤は、ＭＲＩ検出可能な種（Ｉ）の化学構造と適合し、それらの製造、保管、使用に干渉しない。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、上記の詳細な説明に記載されているだろう。
【００７３】
１）ガドリニウムキレートをベースにする化合物：調製および生物アッセイと画像化
造影剤
式ＩＩ ｐ−アミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨのヒトＭＭＰ阻害剤を、イソチオシアナートリンカーとの結合のために適切に１：１の割合で、官能基化されたＧｄ３＋キレート化剤（ＤＯＴＡ）上でグラフトして、化合物Ｂを得た。
【００７４】
０．４２ｇのＩｎｔ１、０．３４ｇのペプチドＡｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨＯＨ（バッケム社（Ｂａｃｈｅｍ）から）、２００μｍＬのトリエチルアミンを、２０ｍＬのＤＭＳＯ中に室温で溶かす。その溶液を３時間攪拌する。２００ｍＬのエーテルをその溶液に滴下する。沈殿物をエーテル、エタノール、ジクロロメタンで洗浄する。
分析：ＨＰＬＣ純度＝９２％；ＨＰＬＣ：カラム：シンメトリー（ＳＹＭＭＥＴＲＹ）Ｃ１８、５μｍ、１００Å、２５０＊４．６ｍｍ
【００７５】
上記の特異的な造影剤の化学純度は、９０％を上回った。さらに、化合物Ｂは、１２１０Ｄａの分子量を示し、参照化合物として用いた非特異的製品であるガドテル酸（Ｇｄ−ＤＯＴＡ、Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）ゲルベ社（ＧＵＥＲＢＥＴ）、フランス）とほぼ等しい緩和値を示した。化合物ＢのＭＭＰ阻害剤は、水可溶性のテトラペプチジルヒドロキサム酸（バッケム社（Ｂａｃｈｅｍ）から購入）（スイスのブデンドルフ、（Ｂｕｄｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からなる。
【００７６】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＭＰ抑制試験
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−３活性を抑制する化合物Ｂもしくは対応するペプチドヒドロキサメートの能力を、ヒト酵素でｉｎ ｖｉｔｒｏ試験した。反応は、基質のＭＭＰ開裂（実験条件に関しては表１を参照のこと）の後に生成された蛍光化合物の組成に基づいた。簡単に述べると、化合物Ｂもしくは上記ペプチドだけを、３種の異なる濃度で、緩衝剤含有ＭＭＰに添加して試験した。対照試料に関しては、造影剤もしくはペプチドを水で置き換えた。３７℃で３０分間の前培養後、蛍光測定（＝Ｆ１）で全化合物の干渉を検出するために、マイクロプレートリーダー（ジェミニ（Ｇｅｍｉｎｉ）ＸＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて、蛍光強度を測定した。次に、ＭＭＰ基質を加えて、酵素反応を開始し、混合液を再び３７℃で培養した。予定時間後、第二蛍光測定を実施した（＝Ｆ２）。シグナルＦ２からシグナルＦ１をサブトラクションして、酵素活性を測定し、その結果を対照の酵素活性の抑制率（パーセント）として、表した。
【００７７】
さらに、ＭＭＰの標準阻害剤として、ＴＩＭＰ−１もしくはＧＭ６００１を用いて、試験を実証した（表２参照）。
【００７８】
生体内分布アッセイ
動物：Ｇｄ−ＤＯＴＡと比べる場合、化合物Ｂの組織分布を完全なＣ５７ＢＩ／６系統のＡｐｏＥ−ＫＯマウスで実施した。Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ベルギーのルヴェン（Ｌｅｕｖｅｎ Ｂｅｌｇｉｕｍ））の動物実験ユニット（Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｕｎｉｔ）で、動物を繁殖させて収容し、食料と水を自由に摂取させた。
【００７９】
週齢１１〜１２のＡｐｏＥ−ＫＯマウスに、コレステロールが豊富な西洋タイプの食餌（Ｔｅｃｋｌａｄ、米国マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ））を４ヶ月与えた。このモデルのアテローム性動脈硬化症は、以下により十分に特徴付けられた。モデルは、心臓および大動脈弓に広範囲のアテローム性動脈硬化プラークがあり、そのプラークは、総管腔領域の３４％を占めていた。さらに、この動物モデルは、極度の脂質の汚染を示し、さらに、プラーク領域で、マクロファージ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−３の存在が、それぞれ１５％、１０〜２０％、２０〜４０％の割合で見られた。
【００８０】
生体内分布：ダイエット期間後、同じ性別で同体重の動物を用いた。尾静脈注射により、１００μモルＧｄ／ｋｇの臨床用量で、化合物ＢもしくはＧｄ−ＤＯＴＡを投与した（ｎ＝７／化合物）。投与の６０分後、動物に麻酔をかけ、眼底採血により血液を得た。全ての循環する残存造影剤を血管内から除去するために、ヘパリン添加の食塩水で、経心臓的灌流をマウスに施した。筋および各種の器官（腎臓、肝臓）を除去し、同様に、数種の動脈標本（大動脈弓、頚動脈、胸大動脈、腹大動脈および大腿動脈）も除去した。最後に、血液試料の部分標本を遠心分離機にかけて、採取した全試料に含有するＧｄ３＋を酸性で無機化した後、誘導結合プラズマ−質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）により、定量した。
【００８１】
Ｅｘ ｖｉｖｏでの磁気共鳴画像
標本の調製：ＬＤＬ受容体の遺伝子欠損のため、高コレステロール血症、続いてアテローム性動脈硬化症を患う、ワタナベ遺伝性高脂血症（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ）ウサギ（ＣＡＰ、Ｏｌｉｖｅｔ、フランス）に、深部麻酔をかけた。残った全ての血液を瀉血し、ウサギを死亡させた後、導出動脈の起始部を伴う大動脈弓、さらに胸部大動脈や腎臓の上部の腹部大動脈を含む動脈管系を１ブロックで除去し、全ての残存する血液を除去するために、ヘパリン添加のクレブス・リンガー重炭酸塩（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液（ｐＨ＝７．４）でフラッシュした後、動脈血標本を−２０℃で凍結させた状態に維持した。実験の目的上、該標本を徐々にその場で解凍した。
【００８２】
新鮮な頚動脈の試料を、頸動脈内膜剥離術を受ける患者（ｎ＝２１）から獲得した。標本は、一般的な頚動脈、内頚動脈および外頚動脈からなる。切除したプラークを氷のように冷たい食塩水中ですすぎ、それらを手術後２〜４時間のうちに使用した。
【００８３】
最終的に、ウサギとヒトの両方のアテローム性動脈硬化セグメントを造影剤と接触させ、ｅｘ ｖｉｖｏで画像化する前に、それらを正確に３．０ｍｍの厚さのセグメントに切断した。
【００８４】
Ｅｘ ｖｉｖｏ培養：全ての薄片を２４ウェルの培養プレートに沈着させた後、それらを、１．０ｍｌのクレブス・リンガー重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）、Ｇｄ−ＤＯＴＡもしくは化合物Ｂ（Ｇｄ濃度５×１０−４Ｍで）中で、３７℃で攪拌しながら培養した。１時間、３時間または１８時間の予め定めた培養後、ＷＨＨＬウサギ由来の薄片を直ちに画像化するか、或いは１０．０ｍｌのクレブス・リンガー重炭酸塩緩衝液中で３０分、１時間または３時間（各条件に対してｎ＝３）、毎時に媒体を取替えて、洗浄した。ヒト試料に関して、化合物の間で最も良好な分化を与えるプロトコル（つまり、培養期間１８時間、続いて３０分間の洗浄）だけを割り当てた。その後、全薄片を排出させ、ｅｘ ｖｉｖｏでの画像化のために調製した。さらに、損傷プラークと損傷していないプラーク標本に関して両方、プロトコルを割り当てた。
【００８５】
特異性試験：化合物Ｂの取り込みの特異性を追加的に試験するために、本発明者らは、化合物Ｂよりも１０倍高い濃度（つまり、５×１０−３Ｍ）でのヒドロキサメートペプチドで、前もって３０分間培養した一組の新規のＷＨＨＬウサギのアテローム性動脈硬化の薄片でｅｘ ｖｉｖｏでの１８時間の培養を繰り返した。既に記載した如く、試料を続いて３０分間洗浄した。
【００８６】
ｅｘ ｖｉｖｏでの画像化による造影剤の検出およびＧｄ定量化：ｅｘ ｖｉｖｏでのＭＲＩに関して、新規の２４ウェルプレートに大動脈薄片を移動し、室温で、半固体の寒天ゲル（０．８％ｍ／ｖ）に大動脈薄片を包埋した。２．３５ＴのＭＲＩ系（Ｂｉｏｓｐｅｃ、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）上で、７ｃｍ内径のバードケージ型コイルと２００ｍＴ／ｍ挿入傾斜を用いて、画像化を実施した。スクリーニングの解像度、短い継続時間と切片の部位の間に妥協点を有する、追従パラメーター（ＴＲ／ＴＥ／α＝２０ｍｓ／４．２ｍｓ／７５°、マトリックス２５６＊２５６＊１６、解像度２３５＊１７５＊１０００μｍ３、継続時間２１’４９”）で、３ＤのＴ１ｗＳＮＡＰ配列を獲得した。
【００８７】
最終的に、上記ゲルを大動脈セグメントから除去し、酸性で無機化した後、各々正確に秤量した試料に含有されるＧｄをＩＣＰ−ＭＳより、定量化した。
【００８８】
免疫組織化学：上記のｅｘ ｖｉｖｏでのスクリーニング試験を検証し、化合物Ｂに対して獲得したＭＲＩシグナルをターゲットとしたＭＭＰと相関させるために、本発明者らは、免疫組織化学解析を実施した。培養し洗浄したＷＨＨＬウサギおよびヒト由来の切片で、アッセイを実施した。ウサギに関して、ＭＭＰ−２（ポリクローナル抗体、ドイツのダルムシュタットのカルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））とＭＭＰ−９（モノクローナル抗体、米国サンディエゴのオンコジーン・リサーチ・プロダクト社（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ））を認識する抗体のみを購入し、検証した。ヒト切片における免疫組織化学解析に関して、ＭＭＰ−１（ウサギ抗ＭＭＰ−１ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＭＭＰ−２（ウサギ抗−ラットＭＭＰ−２ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＭＭＰ−３（ウサギ抗−ＭＭＰ−３ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＭＭＰ−７（ウサギ抗−ＭＭＰ−７ポリクローナル抗体、（米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））およびＭＭＰ−９（ヤギ抗−ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体、米国カリフォルニア州サンタ・クルズのサンタ・クルズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））の検出のために、追従抗体を用いた。両方の場合において、製造者の説明書に従って、免疫組織化学解析を実施した。
【００８９】
統計的解析
データを平均±ＳＥＭで表した。次に、両側Ｐ値（グラフパッドインサート（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ）３）を用いて、一連のデータを対応のないノンパラメトリックのマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定と比較した。Ｐ＜０．０５で、差を有意とみなした。
【００９０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＭＰ抑制試験
化合物Ｂとその対応するペプチジルヒドロキサム酸のヒトＭＭＰ抑制活性の結果を表２に示す。両化合物は、１．０Ｅ−０５Ｍの濃度で、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２に有効であり、化合物Ｂは、上記ペプチドと比較した場合、増大した抑制活性を示す。対照的に、ＭＭＰ−３に関して２種のプロテアーゼ阻害剤に、非活性を示した。これらの実験値は、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３に関するペプチジルヒドロキサム酸の公表されるＩＣ５０値（ＩＣ５０を各々１．０Ｅ−０６Ｍと１．５Ｅ−０４Ｍとみなす）と完全に一致した。しかしながら、化合物Ｂと上記ペプチドに対して１．０Ｅ−０５Ｍの濃度で、酵素抑制率を既に実測した（ＩＣ５０は、３．０Ｅ−０５Ｍで報告されている）ように、結果は、ＭＭＰ−２に対して僅かに強かった。
【００９１】
生体内分布アッセイ
ＡｐｏＥ−ＫＯマウスの血漿、主器官および動脈標本における化合物Ｂとその参照化合物Ｇｄ−ＤＯＴＡの生体内分布を図１に示す。静脈注入後１時間、両種の造影剤は、肝臓の取り込みとは異なり、血漿、腎臓および筋肉蓄積において有意差を示さなかった。一般的に、化合物ＢとＤｏｔａｒｅｍ（著作権）の濃度は、排出器官である腎臓を除いて、主要器官において劣った（つまり、＜１％ＩＤ）。さらに、２種の造影剤を体内から直ちに除去した。血漿で判明される注入量のパーセントは、約１〜２％であった（血漿中での放出の半減期：１５分）
【００９２】
動脈標本での組織分布に関して、化合物Ｂは、Ｄｏｔａｒｅｍ（ｐ＜０．０１）と比較した場合３〜３．５倍の濃度で、動脈性の壁に優先的に蓄積したことが示される。さらに、化合物Ｂは、最も多くのアテローム性動脈硬化プラーク（頚動脈および大動脈弓）を含む動脈性領域に汚染の傾向を示したが、Ｄｏｔａｒｅｍ（著作権）では、示さなかった。
【００９３】
Ｅｘ ｖｉｖｏでの磁気共鳴画像
ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ由来の動脈薄片で、アッセイを実施した。１時間、３時間または１８時間の培養後、全ての切片は、参照化合物Ｇｄ−ＤＯＴＡで強いが広範囲の増大を示した。この結果は、３〜９ナノモル／切片（平均値）を得たＩＣＰ−ＭＳによる切片中のＧｄ測定量と一致した。しかしながら、Ｇｄ−ＤＯＴＡは、３０分間の最初の洗浄工程中に直ちに消滅した。この時点で、Ｇｄ濃度は、平均値で、０．８ナノモル／切片より低かった。
【００９４】
対照的に、化合物Ｂは、全培養（５〜１１ナノモル／切片の平均Ｇｄ濃度）後、強いがさらに描出した増大を示したが、上記造影剤は、培養期間が１時間を超える場合に、Ｇｄ−ＤＯＴＡのように速く溶出しなかった。事実、３時間もしくは１８時間培養した場合、３０分および１時間の洗浄後、１〜８ナノモル／切片の各平均Ｇｄ濃度に対応して、上記造影剤は、はっきりしたシグナルを示した（図２）。
【００９５】
さらに、遊離ペプチドでの予備培養に関する抑制率／競争の研究を実施した場合、本発明者らは、化合物Ｂにのみ極僅かな増強を見出した。このことは、抑制率／競争は有効であり、化合物Ｂは、そのターゲットに対して特異的であることを示唆した。最終的に、ｅｘ ｖｉｖｏスクリーニングに対するこのアテローム性動脈硬化モデルは、対象のＭＭＰを含有すると検証され、免疫組織化学解析により、ＭＭＰ−１に対して高い可能性とＭＭＰ−９の低い発現性が明らかにされた。
【００９６】
頚動脈の外科的切除を施したヒト由来の動脈薄片で実施したアッセイ：特異的造影剤と非特異的造影剤を識別できる事前の実験スクリーニング条件（例えば：１８時間の培養後、３０分洗浄）の如く、および造影剤を検出する２つの技法、つまり良好に相関するｅｘ ｖｉｖｏでのＭＲＩとＩＣＰ−ＭＳによるＧｄ定量化の如く、本発明者らは、アテローム変性のヒト切片に関する研究にそれらを採用した。その結果は、ｅｘ ｖｉｖｏでのＭＲＩおよびＧｄ定量化により例証されるように、特異的な化合物Ｂだけがアテローム変性のヒト切片を増大することが可能で、非特異的化合物Ｇｄ−ＤＯＴＡでは、不可能であることを示した。さらに、化合物Ｂは、脆弱性プラーク（免疫組織化学分析よりＭＭＰ−１、−２、−３、−７および−９に対して高い可能性を示した）と無症候性プラーク（低量のＭＭＰを含有する）を識別できる。化合物Ｂは、ヒトアテローム性動脈硬化プラークの炎症性の程度、つまり脆弱性を評価することを対象としうると結論付けることができる。
【００９７】
（表１）ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＭＰ抑制試験のための実験条件
【００９８】
（表２）蛍光分析により測定した、ヒトＭＭＰ−１、−２、および−３活性に関するプロテアーゼ阻害剤化合物Ｂおよびその対応するペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの効果。２通りの結果を得た。対照値のパーセント抑制率の平均として、結果を表す。
【００９９】
実施例２）酸化鉄の超常磁性粒子をベースとする化合物
副実施例２．８：硝酸系磁性流体（ｎｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）（サイズＰＣＳ＝３８ｎｍ）
【０１００】
副実施例２．９：硝酸系磁性流体（サイズＰＣＳ＝２３，３ｎｍ）
【０１０１】
化合物Ａ
【０１０２】
副実施例２．１０：（サイズＰＣＳ＝６７，９ｎｍ）
副実施例８＋化合物Ａ
【０１０３】
副実施例２．１１：（サイズＰＣＳ＝４０，３ｎｍ）
副実施例８＋化合物Ａ＋処理剤ｐＨ１１
【０１０４】
副実施例１２：（サイズＰＣＳ＝２５，６ｎｍ）
副実施例９＋化合物Ａ
【０１０５】
副実施例２．１８
副実施例１２＋化合物ＰＥＰＴＩＤＥ
【０１０６】
化合物Ａの調製
【０１０７】
１）ジエチル−１−［エトキシホスホリル］ビニルホスホネート
１３ｇ（０．４３３モル）のパラホルムアルデヒドと１０ｍｌ（０．０９７モル）のジエチルアミンを、２５０ｍｌのメタノール中に熱状態で溶かす。次に、２４ｇ（８．６７×１０−２モル）のジエチル［エトキシ（プロピル）ホスホリル］メチルホスホネートを加える。混合液を２４時間還流する。反応媒体を真空下で濃縮する。濃縮物を２５０ｍｌのトルエンで２回溶かした後、真空下で濃縮する。
【０１０８】
得られたオイルを１２５ｍｌのトルエン中に溶かす。０．１４ｇのパラ−トルエンスルホン酸を加えた。ディーン・スターク・トラップ（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ ｔｒａｐ）を用いて、混合液を２４時間還流し、その後、真空下で乾燥するまで濃縮する。
【０１０９】
生成物を５００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、２５０ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮する。
【０１１０】
粗生成物を６２５ｇのＭｅｒｃｋ Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）シリカゲル（４０〜６３μｍ）で精製する。溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン−５０／５０
１８．４ｇを７１％の収率で単離する。
マススペクトル：Ｍ／ｚ＝３０１．４（ＥＳ＋）理論値Ｍ＝３００．２
Ｃ１３スペクトル：（ｓ）１４８．８ｐｐｍ、（ｔ）１３４．８−１３１．５−１２８．２ｐｐｍ、（ｓ）６２．２ｐｐｍ、（ｓ）１６．７ｐｐｍ
Ｈ１スペクトル：（ｔ）６．９−６．８−６．６ｐｐｍ、（未分割のピーク）３．９ｐｐｍ、（ｔ）１．１５ｐｐｍ
【０１１１】
２）ジエチル２−［２．２−ビス（ジエチルホスホリル）エチル］マロネート
１．６ｇ（０．０１モル）のジエチルマロネート、０．０７ｇ（０．００１モル）のナトリウムエトキシドと３ｇ（０．０１モル）のジエチル［エトキシ（プロピル）ホスホリル］ビニルホスホネートを、１５ｍｌのエタノール中で、１５分間攪拌する。［ＴＬＣ：ＳｉＯ２、溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン−５０／５０−Ｒｆ＝０．６］。
【０１１２】
５ｍｌの飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液をエタノール溶液に加える。混合液を真空下で濃縮する。残渣を３０ｍｌのエチルアセタートで抽出し、５ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、蒸発乾燥させる。
【０１１３】
得られたオイルを２００ｇのＭｅｒｃｋ Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）シリカ（４０〜６３μｍ）で精製する。溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン−５０／５０
３．８ｇを収率８２％で単離する。
マススペクトル：Ｍ／ｚ４６０．９（ＥＳ＋）、理論値Ｍ＝４６０。
【０１１４】
３）４，４−ジホスホノブタン酸（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）
７ｇ（１５．７×１０−２モル）のジエチル２−［２．２−ビス（ジエチルホスホリル）エチル］マロネートを３５０ｍｌのＨＣＩ［５Ｎ］中で、８時間還流する。
【０１１５】
得られた茶色のオイルを６０ｇのシラン化シリカ６０（０．０６３〜０．２００ｍｍ）上で水溶出［ＨＰＬＣモニタリング］で精製する。
３．６ｇを収率９２％で単離する。
マススペクトル：Ｍ／ｚ ２４９（ＥＳ＋）、理論値Ｍ＝２４８
ＨＰＬＣ：カラム：ハイパーカーブ（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ）（登録商標）２５０× ４ｍｍ 検出：２０２ｎｍ
均一濃度（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の溶離液 ９９／１：０．０３４ Ｎ Ｈ２ＳＯ４／ＣＨ３ＣＮ
【０１１６】
副実施例２．８
３６ｇ（０．１８１モル）のＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏと２０ｍｌのＨＣｌ（３７％）を１５０ｍｌのＨ２Ｏに溶かした溶液を、３リットルの水と１４３ｍｌ（０．３０２モル）のＦｅＣｌ３（２７％）からなる混合液に導入する。２５０ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２５％）を力強く攪拌しながら導入する。混合液を３０分間攪拌する。磁気分離により液体を除去する。磁性流体を２リットルの水で続けて３回洗浄する。
【０１１７】
硝酸系磁性流体を２００ｍｌのＨＮＯ３［２Ｍ］と共に１５分間攪拌し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１１８】
硝酸系磁性流体を６００ｍｌの水と２００ｍｌのＦｅ（ＮＯ３）３［１Ｍ］で、３０分間還流する。浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１１９】
硝酸系磁性流体を２００ｍｌのＨＮＯ３［２Ｍ］で、１５分間還流し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２０】
硝酸系磁性流体を３リットルのアセトンで３回洗浄した後、４００ｍｌの水に溶かす。２５０ｍｌの最終体積を得るまで、溶液を真空下で蒸発させる。
【０１２１】
（表３）
【０１２２】
副実施例２．９
４５０ｍｌのＨ２Ｏ中に溶かした１０８ｇ（０．５４３モル）のＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏを４リットルの水と４２９ｍｌ（０．９０６モル）のＦｅＣｌ３（２７％）の溶液に導入する。７５０ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２５％）を素早く攪拌（１２００ｒｐｍ）しながら導入する。混合液を３０分間攪拌する。磁気分離により、液体を除去する。磁性流体を３リットルの水で、続けて２回洗浄する。
【０１２３】
硝酸系磁性流体を３リットルのＨＮＯ３［２Ｍ］と共に１５分間攪拌し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２４】
硝酸系磁性流体を１３００ｍｌの水と７００ｍｌのＦｅ（ＮＯ３）３［１Ｍ］で、３０分間（６００ｒｐｍ）還流する。浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２５】
硝酸系磁性流体を３リットルのＨＮＯ３［２Ｍ］と共に１５分間攪拌し、浮遊物を磁気分離により除去する。
【０１２６】
硝酸系磁性流体を３リットルのアセトンで３回洗浄した後、６００ｍｌの水に溶かす。２５０ｍｌの最終体積を得るまで、溶液を真空下で蒸発させる。
【０１２７】
この段階で、以下の性質を獲得する。
【０１２８】
（表４）
【０１２９】
処理
２００ｍｌの上記の溶液を、２，４リットルのＨＮＯ３中で４時間攪拌する。浮遊物を磁気分離により除去する。硝酸系磁性流体を３リットルのアセトンで２回洗浄した後、４００ｍｌの水に溶かす。２５０ｍｌの最終体積を得るまで、溶液を真空下で蒸発させる。
【０１３０】
（表５）
【０１３１】
副実施例２．１０〜２．１２：化合物ｇｅｍビスホスホネートによる磁気粒子（ｐ）の錯化の実施例
副実施例２．１０
５０ｍｌの副実施例２．８（４．８５Ｍ／Ｌ）を３リットルの水で希釈する。１．３ｇ（５．２４×１０−３モル）の実施例１からの化合物Ａを１００ｍｌの水に溶かした溶液を一滴ずつ導入する。３０分間攪拌を続ける。綿状の固まりを磁気分離により単離した後、３リットルの水で３回洗浄する。
【０１３２】
ＱＳ ＮａＯＨ［１Ｎ］を用いてｐＨ７．２にして７００ｍｌの水に再び溶解する。最終溶液を０．２２μｍの膜を通して濾過する。
鉄力価＝０．２５２Ｍ／Ｌ
Ｆｅ＝６１．７％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｐ＝１．２１％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｃ＝１．０４％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
［化合物Ａ／Ｆｅ］のグラフト度＝１．８６％モル／モル
【０１３３】
副実施例２．１１
５０ｍｌの副実施例２．８（４．７３Ｍ／Ｌ）を３リットルの水で希釈する。１．３ｇ（５．２４×１０−３モル）の実施例１からの化合物Ａを８０ｍｌの水に溶かした溶液を一滴ずつ導入する。３０分間攪拌を続ける。綿状の固まりを磁気分離により単離した後、３リットルの水で３回洗浄する。
【０１３４】
ＱＳ ＮａＯＨ［１Ｎ］を用いてｐＨを１１にして、７００ｍｌの水に再び溶解した後、ＱＳ ＨＣｌ［１Ｎ］を用いてｐＨを７．２に安定させる。最終溶液を０．２２μｍの膜を通して濾過する。
鉄力価＝０．２７９Ｍ／Ｌ
Ｆｅ＝６３．９％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｐ＝１．３８％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｃ＝１．０７％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
［化合物Ａ／Ｆｅ］のグラフト度＝１．９５％モル／モル
【０１３５】
副実施例２．１２
１００ｍｌの実施例２．９（２．７４２Ｍ／Ｌ）（ＰＣＳサイズ＝２１．３ｎｍ）を３リットルの水で希釈する。
【０１３６】
１．５ｇ（６．０３×１０−３モル）の実施例１からの化合物Ａを１００ｍｌの水に溶かした溶液を一滴ずつ導入する。３０分間攪拌を続ける。綿状の固まりを磁気分離により単離した後、３リットルの水で３回洗浄する。
【０１３７】
ＱＳ ＮａＯＨ［１Ｎ］を用いてｐＨを１１にして７００ｍｌの水に再び溶解した後、ＱＳ ＨＣｌ［１Ｎ］を用いてｐＨを７．２に安定させる。最終溶液を０．２２μｍの膜を通して濾過する。
鉄力価＝０．２８５Ｍ／Ｌ
Ｆｅ＝６２．９％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｐ＝１．３２％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
Ｃ＝１．２２％ｍａｓｓ／ｍａｓｓ
［化合物Ａ／Ｆｅ］のグラフト度＝１．９０％モル／モル
【０１３８】
緩和能
水性溶液中で２０ＭＨｚ（０．４７Ｔ）、３７℃。
【０１３９】
（表６）
【０１４０】
実施例２．１８
副実施例２．１２の溶液１００ｍｌ（０．２８５Ｍ／Ｌ）を、ＰＡＬＬ（登録商標）３０ＫＤ攪拌セルを通して限外濾過する。２０２ｍｇの化合物Ｂからの化合物ＰＥＰＴＩＤＥアミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨを上記溶液に加える。ｐＨをＱＳ ＨＣｌ［０．１Ｎ］で６．１に調整する。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】１００％Ｃ５７ＢＩ／６系統（＊＊：Ｐ＜０．０１）のＡｐｏＥ−ＫＯマウスの血漿および主器官内の（左）と、動脈標本の血管壁（右）内の化合物Ｂ対Ｇｄ−ＤＯＴＡの生体内分布を示す。
【図２】対照のＤｏｔａｒｅｍ（右）と比較した化合物Ｂ（左）に関するＴ１ＭＲＩシグナルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
（ＰＥＰＴＩＤＥ）ｎ１−（ＬＩＮＫＥＲ）ｎ２−（ＳＩＧＮＡＬ）ｎ３ （Ｉ）
［式中、
１）ＰＥＰＴＩＤＥは、以下
ａ）Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、
Ｘ１は、存在しないか、またはＸ１はアルファ−アミノグリシンの残基であり、Ｘ２は、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンおよびアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３は、グルタミン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基であり、
前記アルファ−アミノ酸Ｘ１のアミノ基の水素原子は、アセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジルオキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−アミノベンゾイル（ＡＢｚ）、ｐ−アミノ−ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル（ＨＢｚ）、３−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオニル（ＨＰＰ）からなる群から選択されるＸ０基と置換されてもよい）、
ｂ）ａ）のペプチドに機能的に同等なペプチド、
ｃ）ａ）もしくはｂ）のペプチドに機能的に同等な（ＩＩ）のペプチドフラグメント
の群から選択され、
２）ＳＩＧＮＡＬは、医用画像のためのシグナル構成物質（ｓｉｇｎａｌ ｅｎｔｉｔｙ）であり、
３）ＬＩＮＫＥＲは、最終的に存在しないが、ＰＥＰＴＩＤＥとＳＩＧＮＡＬ間の化学結合を表す］
の化合物と、
それらの薬学的塩と
を含む診断用薬。
【請求項２】
Ｘ１が、存在しないか、またはＸ１が、グリシンであり、Ｘ２が、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３が、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４が、グリシン、アラニンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基である、請求項１に記載の診断用薬。
【請求項３】
ＰＥＰＴＩＤＥが、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＢｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａから選択されるＸを有するＸ−ＮＨＯＨである、請求項１に記載の診断用薬。
【請求項４】
ＰＥＰＴＩＤＥが、ｐ−アミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項５】
ＳＩＧＮＡＬが、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ ＢＭＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＨＥＴＡ、Ｍ４ＤＯＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＭＣＴＡ、ＰＣＴＡおよびそれらの誘導体から選択される大環状もしくは鎖式キレートである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項６】
ＳＩＧＮＡＬが、脂質ナノ粒子、リポソーム、ナノカプセルであり、前記ＳＩＧＮＡＬが、診断用の金属キレートのキャリアーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項７】
前記薬剤が、原子番号２１〜２９、４２〜４４、または５８〜７０、さらに具体的にはＧｄ、または放射性核種、通常、９９Ｔｃ、１１７Ｓｎ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ；１８８Ｒｅ、６０Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｒ、１６６Ｈｏの常磁性金属のイオンから選択される金属元素Ｍに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項８】
ＳＩＧＮＡＬが酸化鉄粒子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項９】
前記粒子が、ｇｅｍ−ビスホスホネートで被覆される、請求項８に記載の診断用薬。
【請求項１０】
心血管疾患／アテローム症の診断のための、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
心血管疾患／アテローム症の診断用の薬剤を調製するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
ペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨとＳＩＧＮＡＬの構成物質との結合を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。
【請求項１３】
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の診断用薬を患者に投与する段階と、ｂ）診断画像技法により、前記患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階を含む、患者において、マトリックスメタロプロテイナーゼの存在を検出、画像化、またはモニターする方法。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の診断用薬を患者に投与する段階と、ｃ）診断画像技法により、前記患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階とを含む、患者において、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性に関連する病的異常を検出、画像化、またはモニターする方法。
【請求項１５】
前記アテローム性動脈硬化症が、アテローム性冠動脈硬化症もしくは脳血管性のアテローム性動脈硬化症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法の実行を含む患者の活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、一過性脳虚血発作もしくは脳卒中に対して高リスクの患者を識別する方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法により、患者を画像化して活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、急性心臓虚血、心筋梗塞または心臓死に対する高リスクの患者を識別する方法。
【請求項１】
式
（ＰＥＰＴＩＤＥ）ｎ１−（ＬＩＮＫＥＲ）ｎ２−（ＳＩＧＮＡＬ）ｎ３ （Ｉ）
［式中、
１）ＰＥＰＴＩＤＥは、以下
ａ）Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨ（ＩＩ）
（式中、
Ｘ１は、存在しないか、またはＸ１はアルファ−アミノグリシンの残基であり、Ｘ２は、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンおよびアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３は、グルタミン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基であり、
前記アルファ−アミノ酸Ｘ１のアミノ基の水素原子は、アセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジルオキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−アミノベンゾイル（ＡＢｚ）、ｐ−アミノ−ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル（ＨＢｚ）、３−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオニル（ＨＰＰ）からなる群から選択されるＸ０基と置換されてもよい）、
ｂ）ａ）のペプチドに機能的に同等なペプチド、
ｃ）ａ）もしくはｂ）のペプチドに機能的に同等な（ＩＩ）のペプチドフラグメント
の群から選択され、
２）ＳＩＧＮＡＬは、医用画像のためのシグナル構成物質（ｓｉｇｎａｌ ｅｎｔｉｔｙ）であり、
３）ＬＩＮＫＥＲは、最終的に存在しないが、ＰＥＰＴＩＤＥとＳＩＧＮＡＬ間の化学結合を表す］
の化合物と、
それらの薬学的塩と
を含む診断用薬。
【請求項２】
Ｘ１が、存在しないか、またはＸ１が、グリシンであり、Ｘ２が、プロリン、ヒドロキシプロリン、チオプロリンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ３が、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の残基であり、Ｘ４が、グリシン、アラニンから選択されるアルファ−アミノ酸の残基である、請求項１に記載の診断用薬。
【請求項３】
ＰＥＰＴＩＤＥが、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＢｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、ＨＰＰ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａから選択されるＸを有するＸ−ＮＨＯＨである、請求項１に記載の診断用薬。
【請求項４】
ＰＥＰＴＩＤＥが、ｐ−アミノベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項５】
ＳＩＧＮＡＬが、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ ＢＭＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＨＥＴＡ、Ｍ４ＤＯＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＭＣＴＡ、ＰＣＴＡおよびそれらの誘導体から選択される大環状もしくは鎖式キレートである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項６】
ＳＩＧＮＡＬが、脂質ナノ粒子、リポソーム、ナノカプセルであり、前記ＳＩＧＮＡＬが、診断用の金属キレートのキャリアーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項７】
前記薬剤が、原子番号２１〜２９、４２〜４４、または５８〜７０、さらに具体的にはＧｄ、または放射性核種、通常、９９Ｔｃ、１１７Ｓｎ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ；１８８Ｒｅ、６０Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｒ、１６６Ｈｏの常磁性金属のイオンから選択される金属元素Ｍに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項８】
ＳＩＧＮＡＬが酸化鉄粒子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用薬。
【請求項９】
前記粒子が、ｇｅｍ−ビスホスホネートで被覆される、請求項８に記載の診断用薬。
【請求項１０】
心血管疾患／アテローム症の診断のための、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
心血管疾患／アテローム症の診断用の薬剤を調製するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
ペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＮＨＯＨとＳＩＧＮＡＬの構成物質との結合を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。
【請求項１３】
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の診断用薬を患者に投与する段階と、ｂ）診断画像技法により、前記患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階を含む、患者において、マトリックスメタロプロテイナーゼの存在を検出、画像化、またはモニターする方法。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の診断用薬を患者に投与する段階と、ｃ）診断画像技法により、前記患者内の前記診断用薬が集中する部位の画像を得る段階とを含む、患者において、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性に関連する病的異常を検出、画像化、またはモニターする方法。
【請求項１５】
前記アテローム性動脈硬化症が、アテローム性冠動脈硬化症もしくは脳血管性のアテローム性動脈硬化症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法の実行を含む患者の活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、一過性脳虚血発作もしくは脳卒中に対して高リスクの患者を識別する方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法により、患者を画像化して活動性のアテローム性動脈硬化症の程度を決めることにより、急性心臓虚血、心筋梗塞または心臓死に対する高リスクの患者を識別する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５２１２５４（Ｐ２００７−５２１２５４Ａ）
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６５９６（Ｐ２００６−５１６５９６）
【出願日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２２１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１２８４０
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９１０５２５０５）
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＥＲＢＥＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２２１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１２８４０
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９１０５２５０５）
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＥＲＢＥＴ
【Ｆターム（参考）】
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